PT99408A - Processo para a preparacao de uma composicao para regular o crescimento do cabelo compreendendo um factor de crescimento sobrenadante derivado de celula epitelial - Google Patents

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FEV. 1992

1 PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM COMPOSIÇÃO PARA REGULAR 0 ORESCIMEITO D0 CABELO COMPREEEDEIDO UM PACTOR DE CRESCI· MEMDO SOBREIÍADAME DERIVADO DE CÉLULA SPITELIAL 5

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30 CAMPO táCHIOO A presente invenção diz respeito a novas composições que regalam o crescimento do cabelo* EBCHICAS AUIECEDamS DA IITVEUQÃO A sociedade em geral continua a ligar um estigma a perca de cabelo* 0 desejo de ter uma cabeça cheia de cabelo saudável tem resultado numa variedade de aproximação a"oura" de calvície. A investigação do bolbo capilar encontra-se entre a variedade de estudos de crescimento do cabelo que tem sido referido na literatura especializada. Existem duas caracteristicas essenciais do folículo capilar « Estas incluem os epitálios e um compartimento dérmico especializado chamado papila dármica. Os epitálios dão origem às células de rais (atem cell) epidérmicas que por sua vez dão origem a bainha da raiz exterior, dando origem à célula matriz, que dá origem à bainha de raiz interior e fibra de cabelo. 0 tamanho da papila dármica está relacionado com o tamanho do folioulo capilar , e o tamanho do folículo está relacionado com o comprimento do cabelo produzido. Por exemplo, folículos de cabelo terminais no couro cabeludo em indivíduos cabeludos são mais compridos e produzem cabelo comprido e espesso. Estes folículos contêm papilas dermicas grandes. Em contraste, os folículos lanu-ginosos vulgarmente observados num couro cabeludo careca são pequenos e produzem cabelo curto e fino. Estes folículos lanuginosos contêm papilas dárraicas pequenas. Observações semelhantes que dizem respeito ao relacionamento entre o tamanho da papila e o folículo capilar , e em ultima a-nálise com o crescimento do cabelo, têm sido feitas com a-nimais oom pelo, Oa factores específicos que regulam o tamanho da papila dármica podem em última análise regular o 2' 35 1 63971 Gase 4276 crescimento de cabelo· 0 Pedido de Patente Europeia n2 0*215*274, Sisinger, atribuído ao Memorial Hospital para Cancro e Doeaaj-ças Congéneres, publicado em 25 de Março de 1987, expãe a 5 sonieação das células epidérmicas para extrair os materiais intracelulares* fambém são expostos métodos para melhorar o sarar de feridas, regenerar a epiderme, e melhorar o crescimento de cabelo através da aplicação de um extracto de célula epidérmica.

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Eisinger, M·, S* Sadan, I*A* Silver e R*B* Plick, (Março, 1988) "Growth Regulation of Skin Cells by Epidermal Cell- Derived Pactors: Implicações para Sarar ]?e-ridas", Procedures of the lational Ácademv of Sciences* 15

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Vol* 85, pp* 1937-1941, expõe um factor de crescimento derivado de célula epidérmica derivado por sonieação das células epidérmicas ou de um sobrenadante isento de células* 0 factor tem as seguintes características: 1) é directamen-te mitogénico para células epidérmicas; 2) não é directamen-te mitogénico para células 323; 3) inibe directamente a a-ctividade metabólica de fibroblasto; e 4) tem um peso molecular aproximado de 1000 daltons. 0 Pedido de Patente Mundial 89/07425, Sa-ekier, Wood, Iírishnan e Wigginton, atribuído a Genethics Ldt·, publicado em 24 de Agosto de 1989, reivindica um unguento, loção, pomada ou gel contendo células epiteliais de âmnio e extractos de tais células epiteliais dispersos num veículo farmaeéuticamente aceitável. *07245 expõe além disso que uma tal composição pode ser usada para estimular o folículo capilar e crescimento de cabelo* Ob.iectivos da Presente Invenção 1 um obgeotivo da presente invenção fornecer composições para regular o crescimento de cabelo. i também um ob^ectivo da presente invenção fornecer composições para regular o crescimento do cabelo que são adequadas para aplicação tópica*

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ij E também umdbjectivo da presente invenção fornecer composições para regular o crescimento de cabelo que são adequadas para aplicação através.de uma injecção cutanea· E também um objectivo da presente invenção fornecer métodos para regular o crescimento de cabelo que compreendem a aplicaçãora pele ou pelo de um mamifero de uma composição tépica. Ξ também um objectivo da presente invenção fornecer métodos para regular o crescimento de cabelo que compreendem a injecção cutanea de uma composição. SUMÁRIO DA IMSROÁO A presente invenção diz respeito a uma composição para regular o crescimento de cabelo compreendendo uma quantidade segura e eficiente de um sobrenadante derivado a partir de uma cultura de células epiteliais, de preferencia células epiteliais prolif erativas , que compreendem um factor estimulador de crescimento com caracteristicas de mitogenicidade para células da papila dérraica, mitogeni-cidade para células 3T3, falta de mitogenicidade para células epidérmicas, e um peso molecular superior a cerca de 3.000 daltons; e um veículo farmaeeutieamente aceitavel. DESCRIGÁO DETALHADA DA IiWMCflO Sal como é aqui usada, "mitogenicidade" significa a capacidade para estimular crescimento (mitose) nas células. (Dal como é aqui usado, "regular o crescimea-to de cabelo" significa induzir a formação de um maior número de madeixas de cabelo, e/ou aumentar o diâmetro da madeixa de cabelo, e/ou alongar a madeixa de cabelo, e/ou evitar, retardar, ou controlar & processo de perca de cabelo. (Dal como é aqui usado, "células prolifera^ vas" significa células sofrendo mitose. (Dal como é aqui usado, "células epiteliais" refere-se às células que cobrem todas as superfícies desco- -4- 35 10

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bertas, cutaneas, mucoses, e serosas, Incluindo as glândulas e outras estruturas delas derivadas, por exemplo, corneei , esofágica, epider.e ncis. e células epiteliais de folí-culos pilosos, mas não incluindo células epiteliais de âmnio, Tais células podem ser células nSo -malignas normais), ou células transformadas/imortalizadas♦ Tal cooio é aqui usado, “células epiteliais . de folículos pilosos »» refere-se a células epiteliais que envolvem a papila dérmica no folículo piloso , por exemplo, células base, bainha da raiz exterior, células matriz, células de bainha de raiz interior. Tais células podem ser células não-maligsee:normais, ou células transformadas/imor talizadas. Tal como é aqui usado, “células epidérmicas refere-se a células epiteliais na epiderme. Tais células po dem ser células não-malignas normais, ou células transfor-madas/imortalizadas. Tal como é aqui usado, “epiderme** refere-se à camada celular contínua estratificada queratinizante que abrange todo o organismo e termina em orifícios corporais nas áunç8es mucocutaneas, mas não incluindo as células epiteliais do foliculo piloso * Tal como é aqui usado "aplicação tópica" sl gnifica colocar directamente ou espalhar sobre a pele exterior. Tal como é aqui usado, “células transformadas" refere-se a células que se converteram espontaneamente a um estado de crescimento ilimitado, isto é, adquirirem a capacidade de crescer através de um número infinito de divi s8es em cultura. Tal como é aqui usado, "células imortalizadas" refere-se a células que foram alteradas por meios quí micos e/ou meios recombinantes tais que a célula tem a capacidade de crescer através de um número indefinido de divi s8es em cultura. -5 35 1 5 10 > 15

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Tal Gomo é aqui usado, "ináecção cutanea" significa a introdução de uma substância imediatamente por de baixo ou para dentro da pele por uma agulha hipodérmica« Tal como é aqui usado, todas as percentagem são eia peso a não ser que seja especificado o contrario. As composições da presente invenção compreendem um factor de crescimento derivado de célula epite-lial que estimula a actividade de mitogéniea dà célula da papila dérmica e aumenta o crescimento de cabelo. Além da respectiva mitogenieidade das células da papila dérmica,outras características do factor de crescimento incluem 1) mitogenieidade para células 3T3, 2) uma falta de mitogeni-cidade para células epidérmicas, 3) um peso molecular superior a cerca de 3*000 daltons, 4) sensibilidade a quimotri-psina, e 5) retém 9C% até 40$ de mitogenieidade para células da papila dérmica a seguir à exposição a temperaturas de 5020 e 1002C, respectivamente, durante uma hora. 0 factor de crescimento de cabelo derivado de célula a ser utilizado na presente invenção pode ser obtido através da cultura de células epiteliais em meio nutriente seguido da separação do sobrenadante de tais culturas, centrifugando o sobrenadante para remover células e fragmentos de células, e concentrando e dialisando o sobrenadante para isolar substâncias que tem um peso molecular aparente de cerca de 3*000 D. 0 concentrado isento de células assim obtido contém o factor de crescimento de cabelo derivado de célula epitelial tendo um peso molecular aparente de cerca de 3*000 D* Este factor de crescimento de cabelo é então incorporado nas composições de acordo com a invenção juntamer-te com um veículo adequado. Alternativamente, o concentradc isento de células a seguirvà dialise, pode ser seco, de preferencia por criodessecagem, antes da incorporação nas composições de acordo com a invenção. Embora o factor de crescimento de cabelo 6- 35 10

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fi fi A I 2ÊfíÉV. 1992/7 tenha um peso molecular aparente de cerca de 3*000 D. julga-se que certos fragmentos derivados do factor de crescimento de cabelo podem também mostrar actividade na regulação do crescimento de cabelo. De acordo com uma concretização preferida da invenção, o sobrenadante de cultura de célula epitelial isento de células é concentrado em pelo menos 40 até 50 vezes, de preferencia pelo menos 100 vezes, para fornecer um concentrado contendo o factor de crescimento de cabelo» te4 do um nivel de proteína não superior a 10 mg/ml, de preferência 2 até 3 mg/ml* A quantidade de factor de crescimento de cabelo a ser incorporado com um veículo adequado em composições para utilização tópica pode variar largamente, mas em geral, uma quantidade expressa como proteína a partir de cerca de 0,00001$ até cerca de 20$, de preferência a par tir de cerca de 0,001% até cerca de 10%, de maior preferência de cerca de 0,01% ate cerca de 5% por peso da composição fornecerá uma dose adequada de factor de crescimento para a pele a seguir à aplicação tópica. A quantidade de factor de crescimento de ce * belo a ser incorporada com o veiculo adequado em composições para injecções cutaneas pode variar largamente, mas em geral, uma quantidade expressa como uma proteína de a partir de cerca de 0,00001% até cerca de 10%, de preferência a partir de cerca de 0,001% até cerca de 10%, de maior preferência a partir de cerca de 0,01% ató cerca de 10%, por peso da composição, fornecerá uma dose adequada de fac-> tor de crescimento de cabelo para a área de alvo a seguir à injecçSo cutanea. Os exemplos que se seguem pretendem ilustrar o processo para obtenção do factor de estimulação de crescimento quando aplicada a uma amostra particular* Eles não pretendem limitar o invento. -7 35 1 5

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BXB1PLQ I Preparação do Factor de Estimulação de Crescimento Derivadc de célula Epidérmica As células epidérmicas de prepúcio humano são preparadas de acordo com o método de S. $. Boyce e R. G. Ham (J Tissue Culture Meth 9, 83-93» 1985) com as seguintes modificações. Apos o tratamento do prepúcio com col^ge-nase, a epiderme é colocada em 0,0125$ de tripsina em solução salina tamponada com Hepes. A epiderme é então triturada para libertar células epidérmicas individuais. As células epidérmicas crescem num meio de cultura de célula de KGM (Clonetics;/ 3001). As células epidérmicas são subcul-tivadas usando 3,0 Unidades/ml de dispase a 3720 até que as células se separem da superfície. KGM é então adicionado numa razão volumétrica de 5:1 em relação à dispase. A suspensão das células é então transferida para um tubo cénico e centrifugada a 200 x G durante 5 minutos. As células são ressuspensas com KGM fresco para formação de placas. As células são desenvolvidas para a passagem ^2 na qual são enxaguados e o meio de cultura mudado para 'Meio Basal de Queratinocitos'(meio que não contém extracto de pituitária nem oa factores de crescimento que se seguem, normalmente presentes no meio de cultura, incluindo, hidrocortisona, insulina, e factor de crescimento epidérmico; KBM Olonetics 3^3101). As células epidérmicas são incubadas neste meio até cerca de 48 horas momento no qual o meio cultura é decantado. Este meio ('Meio Definido Condicionado*) é então centri-fugado a 100.000 x G durante 30 minutos. 0 meio é fraccio-nado e concentrado através de ultrafiltração usando um filtro Amicon Centricon-3 tendo uma seleeção (cutoff) de peso molecular de cerca de 3.000D. 0 retido, tendo um peso molecular maior do que cerca de 3.000 D, conterá toda a activi-dade do factor de crescimento tal como determinado no ensaio do mitogéneo de célula da papila dérmica abaixo, em que não haverá aetividade no filtrado que contém material -8- 35 1 5

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tendo um peso molecular menor do que cerca de 3.000 D. Métodos alternativos para fraccionamento e concentração do meio condicionado podem incluir a diálise do meio contra uma membrana tendo uma selecção específica de peso molecular, seguida da liofilização do meio, e fina Imente a reconstituição do meio num tampão adequado. EXEMPLO II Preparação do ffactor Estimulante de Crescimento Derivado de célula Epitelial de Polículo Humano Os folículos capilares são obtidos a partii de biópsias de couro oabeludo. Os folículos são cuidadosa-mente dissecados e imersos no Meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) tamponado 'eé®-HEPES 25MM (ácido Μ-2-hidro-xietilpiperazino-lF-Z-etanossulfónico) e complementado com antibióticos tal como descrito por H-J Stark et al (Diffe-rentiations 236-248, 1987). Os folículos são transferidos para uma placa de cultura de tecido de 35 mm contendo o acima mencionado meio. 0 meio é então aspirado e os folículos cobertos com 0,1# de tripsina (1:250) e 0,02# de EDTA em solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem cálcio ou magnésio e incubado durante 10 minutos a 3720. É obtido uma unica suspensão de células pipetando vigorosamente os folículos em DMEM suplementado com 10# de soro de vitelo acabado de nascer. Caso seja necessário, os folículos são sequer-cialmente tratados outra vez com tripsina. A suspensão de células é colhida e centrifugada a 200 x 6 durante 10 minutos. As células são enxaguadas mais uma vez em DMEM sem soro. As células epiteliais são desenvolvidas num meio de cultura de célula de KGM (cloneticsi £3001)· células epiteliais são subcultivadas usando 3,0 Unidades/ml de dispase a 372C ate as células se soltarem da superfície. KGM e então adicionado numa razão volumétrica de 5:1 em relação à dispa se. A suspensão de células é então transferida para um tubc cónico e centrifugada a 200 x G durante 5 minutos. As células são ressuspensas com KGM fresoo para formação de pla- -9- 35 1 5 10 > 15

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cas. As células desenvolvem-se para a passagem £2 altura em que as células são enxaguadas e o meio de cultura mudado para *Meio Definido* (meio que não contém extracto de pituitária nem os factores de crescimento seguintes, normal-mente presentes no meio da cultura, incluindo hidrocortiso-na, insulina, e factor de crescimento epidérmico; KBM Clo-netics ^3101). As células epiteliais são incubadas neste meio até cerca de 48 horas altura em que o meio de cultura é decantado· Este meio (*Meio Definido Condicionado*) é então centrifugado a 100.000 x G durante uma hora. 0 meio é fraccionado e concentrado através de ultrafiltração usando um filtro Amicon Centricon-3 tendo uma seleoção de peso molecular de 3.000 D. 0 retido tendo um peso moleoular maior do que 3.000 conterá todas a actividade do factor de crescimento tal como está abaixo determinada no ensaio do mito-géneo de célula da papila dérmica, onde não haverá actividade no filtrado que contém o material tendo um peso molecular menor do que 3.000 D. létodos alternativos para fraccionar e concentrar o meio condicionado podem incluir a diálise do meie contra uma membrana tendo uma seleoção específica de peso molecular, seguido da liofilização do meio, e finalmeate a reconstituição do meio em cultura adequada. EXEMPLO III Ensaio do Hitogéneo de célula da Papila Dérmioa A. Preparação de células da Papila Dérmica do Couro Cabeludo Humano As células da papila dérmioa do couro cabeludo humano (PDh) são preparadas usando um procedimento modificado de metodologias existentes (A.G. Messenger, Br J Dermatol 110. 685-689, 1984; e 0. A. B. Jahoda e S, p, oii-ver, Br J Dermatol 105. 623-627, 1981; e G. A. B. Jahoda e R. F. Oliver, J Embryol Exp Morph 79, 211-224, 1984). A pele do couro cabeludo humano é obtida a partir de uma cirurgia de redução do couro cabeludo e colocada em Meio de —10 35 10 15

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Eagle modificado por Dulbecco estéril e gelado/E-l2 (1:1) contendo 20% de soro de feto de vitelo e antibióticos, nas 48 horas após cirurgia, a pela é dissecada, a gordura removida, e folículos de cabelo individuais colhidos e colocados em meio Chang gelado (Hana Biological ^$101-058) contefif-do 10% de soro de vitela definido de Hyclone (Hyclone Lab Φ A-2151-L); (*Chang Completo*). Cortam-se os bulbos e são microdissecados para obter a papila dérmica. São colhidas dez papilas dérmicas deste modo, transferidas para um tubo conico estéril contendo 2 ml de meio Chang completo, e cen-| trifugadas a 200 x G durante 5 minutos. 0 meio é aspirado e as papilas dérmicas são ressuspensas em 2 ml de Chang completo contendo Cologenase Tipo I? a 65 Unidades/ml. A colo-genase é preparada com uma reserva de lmg/ml em solução salina tamponada com fosfato. Após 30 minutos a 372C num banho de agua em agitação, as papilas dérmicas são colhidas por centrifugação a 200 x G durante 5 minutos. 0 grão de pa pila é enxaguado uma vez em Chang completo e é transferido para um único alvéolo (2,0 cm2) de uma placa de 24 alvéolos (Linbro Φ 76-033-05) contendo 0,5 ml de Chang completo e incubado a 372C numa atmosfera humidificada contendo 5% de C02. Logo que se observe o crescimento a partir do transplante (geralmente três dias), o meio de cultura é substituído três vezes por semana, A medida que as células se tornam confluentes, as células são removidas com 0,25% de tripsina em Solução de Sal Equilibrada de Dulbecco e são transferidos para um frasco de cultura de células T-25 de 25 cm2 (Passagem 4 1) oontendo 5 ml de Chang completo. As células PDh da Passagem Φ 3 são usadas nos ensaios promotores de crescimento. Cada passagem representa um aumento três vezes aproximado em número de células da papila dérmica· B. Ensaio do Mitogéneo de célula da Panila Dérmica 0 método que se segue é uma medida de acti- 11- 35 1 5 10 ) 15

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FEV. 199- &ir4 vidade mitótica das células da papila dérmica e pode ser usado para detectar factores de crescimento (Μ· B. Sporn e A. B. Roberts, lature 332. 217-219* 1988). células da papila dérmica humana são plaqueadas para 20 - 40$ de confluência em mistura 1:1 de Chang Completo e Meio de Eagle modificado por Dulbecco ('DISM* rico em glucose) contendo 15$ de soro de feto de vitelo e antibióticos (*DMBM* Completo), Io dia seguinte o meio é mudado para DMBM Completo. Io dia seguinte o meio é mudado para DMBI contendo 0,5$ de soro de vitelo fetal. Durante as últimas quatro horas de uma incubação de 24 horas, as células são incubadas com (metil-3-Η)--timidina. Este ponto representa a aotividade mitótica de linha base das células da papila dérmica. is células radio--marcadas são então solubilizadas numa solução contendo 0,1$ de dodecilsulfato de sódio, EDTA 0,05mM, e Tris l,0mM pH 8,0. 0 ADI radio-marcado precipitavel por acido triclo-roacético e etanol é determinado e normalizado para o teor total de ADI celular na amostra (0. Lebarca e ií. Paigen, Analyt 3iochem 102, 344-351, 1980). As células da papila dérmica que permanecem são então expostas a (a) DMSM Completo fresco (controlo positivo) (b) DMSM fresco contendo 0,5$ de soro de feto de vitelo (controlo negativo), (c) mistura 1:1 de DMBM fresco contendo 0,5$ de soro de vitelo fetal e Meio Definido Condicionado, ou (d) mistura 1:1 de DUM fresco contendo 0,5$ de soro de vitelo fetal e Meio Simulado Condicionado. 0 meio usado em (c) e (d) é ajustado para uma concentração final de soro de vitelo fetal de 0,5$ e CaCl2 1,0 nM antes de se adicionar às células PDh. Durante as últimas quatro horas de uma incubação de 24 horas as células são incubadas com (metil-3-H)-timidina. As células são processadas ADI radio- -marcado precipitavel por acido e etanol tal como acima des crito para a medição da linha base. Os resultados mostram que o Meio Definido Condicionado induz um aumento significativo em incorporação —12— 35 1 5 10 ) 15

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de timiding em relação ao controlo simulado· EXEMPLO IV Ensaio de Mitogéneo de célula 313 0 ensaio de mitogéneo de célula 3Ϊ3 é baseado no ensaio descrito por Scher, C. D., et al. lature 281, 390-392, 1979; Gohen, S. e Carpenter, G. Proc lat Acad Sei, USA 72, 1317-1320, 1975; e Gospodarowicz, D 3? Biol Chem 250, D J Biol Chem 250, 2515-2520, 1975. As células 3T3 de Balb/c são plaqueadas e crescem numa placa de cultura de tecido de 24 alvéolos em Meio de Bagle modificado por Dulbecco (DMEM +10$ de soro de vitelo acabado de nascer. 0 meio é mudado tres vezes por semana até à confluência, altura em que o meio é mudado para DMEM + 0,5$ de soro. Apés a mudança do meio uma vez durante as 48 horas seguintes os alvéolos são divididos em grupos de alvéolos triplicados. Ho Grupo I, M -timidina é adicionada durante as últimas 4 horas do período de 48 horas e subsequentemente processada para a incorporação de timidina no ADI celular ('Controlo de Linha Base no Momento 2ero'). Io Grupo II, o meio é mudado para DMEM + 0,5$ de soro e as células incubadas por mais 24 horas, radio-marcadas e pro--cessadas tal como descrito ('Controlo legativo'). Io Grupo III, o meio é mudado para DMEM + 10$ de soro e as células incubadas por mais 24 horas, radio-marcadas e processadas tal como descrito ('Controlo de Soro Positivo*)· Io Grupo IV, o meio é mudado para uma mistura 1:1 de DMEM + 0,5$ de soro e Meio Definido Condicionado. Antes de misturar os dois meios, o meio condicionado e ajustado para 0,5$ de soro e CaClg ltiiM. Ao fim das 24 horas de incubação, as células são radio-marcadas e processadas tal como descrito. Io Grupo V, o meio é mudado para uma mistura 1:1 de DMEM + 0,5$ de soro e meio simulado. Antes de misturar os dois meios, o meio simulado é ajustado para 0,5% de soro e CaClg lnM. Ao fim das 24 horas de incubação, as células são radio-marcadas e processadas tal como &駣rito. -13- 35 10

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Os dados daí resultantes mostrarão que o Meio Definido Condicionado induz um aumento significativo na incorporação de timidina em relação ao controlo simulado. ΕΧΒΜΡΙΟ V Ensaio do Mitogéneo na célula Enitelial As células epiteliais do prepucio humano e meio condicionado são preparados tal como préviamente descrito. Para o ensaio de mitogeneo, as células epiteliais na passagem Φ 1 são separadas com dispase plaqueadas a 10-25% de confluência era cada placa de 8 alvéolos (8 cm2) em meio KGM completo. 0 meio e mudado tres vezes por semana ate que se atinja aproximadamente 70% de confluência. As células são mantidas neste meio durante cinco dias adióionais para reduzir a actividade mitogénea e causar depleção do meio da respectiva actividade do factor de crescimento. Durante as últimas quatro horas desta incubação, (met 11-½)-timidina é adicionada a um conjunto de três alvéolos ('actividade mitó-tica de linha base). Ho fim do período de incubação de quatro horas, as células são enxaguadas e solubilizadas numa solução contendo 0,1% de dodecil sulfato de sódio. EDTA, 0,05mM e Uris 1,0 bM pH 8,0. 0 ADIí radio-mareado precipitã-vel por ácido tricloroacético e etanol/éter é determinado e normalizado para o teor total de ADH celular na amostra. Para as células que permanecem, após a incubação de cinco dias, o meio ('meio velho') é removido e guardado. A um con junto de três alvéolos é novamente adicionado o meio velho ('controlo negativo'). A um segundo conjunto de alvéolos é adicionado KGM fresco ('controlo positivo*). A um terceiro conjunto de alvéolos, uma mistura 1:1 de meio velho e meio definido condicionado é adicionada ('teste'). A um quarto conjunto de alvéolos uma mistura 1:1 de meio velho e meio condicionado simulado é adicionada ('controlo simulado')· Durante as últimas quatro horas de uma incubação de 24 horas, as células são incubadas e radio-marcadas com timidina 14- 35 10 15

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 20 25 30 63971 Case 4276 a JWA/ * - a/ κ t i 26. FEV. 1991 tal como acima descrito· Os resultados daí resultantes mostrarão que o Meio Definido Condicionado não contem factores que são mitogénicos às células epiteliais humanas relativamente ao controlo simulado. BXBMPLO VI Sensibilidade às Proteases A. Sensibilidade à Protease: (Tripsina 0 meio condicionado derivado a partir das células epidérmicas do prepúcio é preparado tal como previa mente descrito, 0 meio é tratado com tripsina tipo III (Sigma T-8253) numa concentração final que pode ir até 100 jag/ml a 372C durante cerca de quatro horas.· E então adicionado inibidor de tripsina de soja tipo I-S (Sigma Y-9003) para uma concentração final de 1 mg/ml. A mistura é então centrifugada a 20000 G durante trinta minutos, decantada, esterilizada por filtragem. Este meio é testado no ensaio do mitogéneo da célula da papila dérmica. Os dados mostram que a actividade de mitogenieidade do meio condicionado não e afectada pelo tratamento com tripsina em relação a um cor trolo que é tratado identicamente mas sem tripsina. B* Sensibilidade à Proteaset Qulmotripsina 0 meio condicionado derivado a partir de ce lulas epidérmicas do prepúcio é preparado tal oorno anterior-mente descrito. 0 meio é tratado oom quimotripsina tipo I-S (Sigma 07762) numa concentração final que pode ir até 100/tg/ml a 3720 durante até cerca de cinco horas. 0 inibidor de tripsina de soja tipo I-S (Sigma Y-9003) é então adi oionado para uma concentração final de 1 mg/ml. A mistura então centrifugada a 20000 G durante trinta minutos, decantada e esterilizada por filtragem. 3ste meio é testado no + + 0· ensaio do mitogeneo da célula da papila dermica· Os dados mostram que a actividade de mitogenieidade do Bieio condicio)-nado decresceu significativamente no que diz respeito ao controlo que é tratado identicamente mas sem quimotripsina. -15- 35 10 ) 15

Mod. 71 - 20.000 εκ. - 90/08 20 > 25 30 63971 Case 4276 Λ\) Imml % EXEMPLO VII Sensibilidade ao Calor 0 meio condicionado derivado das células e-pidermicas do prepáoio é preparado tal como anteriormente descrito· 0 meio é dividido em aliquotas e aquecido em banho de água a 5020, 6020, 7020» 8020, ou 1oo2C durante trir ta minutos. 0 meio também é mantido num banho de gelo durai; te trinta minutos. Após este período, o meio é centrifuga-do a 20000 G durante trinta minutos, decantado, e esterilizado por filtragem. Sste meio é testado no ensaio do mito-géneo da célula da papila dérmica. Os resultados mostram que ha um declíneo linear da actividade do factor de crescimento de cerca de 90% até cerca de 40% após o meio condicionado ser aquecido entre cerca de 502C e cerca de 8020.  actividade do factor de crescimento permanece a cerca de 40% entre cerca de 80% e cerca de 1Q02G. Composições Reguladoras do Crescimento do Cabelo à presente invenção diz respeito a composições para regular o crescimento de cabelo compreendendo uma quantidade segura e efectiva de um factor de crescimento de cabelo derivado de célula epitelial tendo as caraeterísti-cas de mitogenicidade para células da papila dérmica, rnito-genicidade para células 323» uma falta de mitogenicidade ρε ra células epidérmicas, e um peso molecular maior do que cerca de 3.000 daltons; e um veiculo farmacêuticamente sceá tável. Tal como é aqui usado, "quantidade segura e efectiva" significa uma quantidade de composto ou composiç-So suficiente para induzir significativamente uma modificação positiva na condição a ser tratada» mas suficientemente baá xa para evitar sérios efeitos secundários ( a uma razão be-nefício/risoo razoável), dentro do âmbito de um parecer íntegro. 0 Veículo Àa composições da presente invenção compreendem um veículo farmacêuticamente aceitável sólido, semi- -16- 35 1 5

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% -sólido ou líquido para permitir aos factores estimulantes de crescimento a atingirem o alvo desejado com uma concentração apropriada. (Dal como é aqui usado, "veículo farma-ceuticamente aoeitavel" significa uma substancia enchimento diluente que é adequada para a administração a um humano ou animal inferior. 0 veículo em si pode ser inerte ou pode possuir beneficios fisiologicos ou farmacêuticos proprios. A natureza do veículo será determinada através do método es colhido para a administração da composição. 0 método de a-dministração da composição do factor estimulante de crescimento pode abranger desde métodos internos, tal como injec-ção, até métodos tópicos externos.

Um método preferido de administração dos factores de estimulação de crescimento é através de uma in-jecção cutãnea. 0 veículo para facilitar tal administração seria compreendido de preferencia por água ou uma solução salina.

Um método mais preferido de administração dos factores de crescimento é através da aplicação tópica. A aplicação tópica é de preferencia alcançada com composições nas formas de pulverizações, tonicos, cremes, loções, champôs, e similares. Composições tópicas da presente invenção podem ser formuladas como líquidos, por exemplo como uma loção, creme, champô, condicionador ou leite. lais composições líquidas podem ser formuladas para utilização em conjunção com um aplicador como um aplicador de esfera, ou um aparelho pulverizador como uma lata aerosol contendo prope-lente, ou um recipiente adaptado cora uma bomba para distribuir o produto líquido. Alternativamente, as composições da invenção podem ser sólidas ou semi-sólidas, por exemplo"barras", crem.es ou geles. (Dais composições solidos ou semi-sólidos podem ser formulados para serem usadas em conjunção com um aplicador adequado ou simplesmente um tubo, ou garrafa, ou -17- 35 10

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como um teci cio impregnado de liquido, com um pano de limpeza. Λ selecção de um veículo para este fim a-presenta uma vasta gama de possibilidades dependendo da for|-ma de produto desejada da composição. Veículos adequados pof-dem ser classificados tal como depois aqui descritos* 0 termo "veículo topico" refere-se a substancias que podem actuar como diluentes, dispersantes, ou solventes para os factores estimulantes de crescimento que assim asseguram que possam ser aplicados a, e mesmo distribuídos sobre, o alvo seleccionado a uma concentração apropriada. 0 veículo á de preferencia um que possa ajudar a pej-netração dos factores estimulantes de crescimento na pele para alcançar de imediato a zona circunvizinha do folículo do cabelo. Veículos tópicos úteis nas composições do assunto da invenção podem induir agua como veículo, e/ou pelo menos um veículo cosmóticamente aceitável sem ser agua. Veículos úteis em composições tópicas de acordo com a invenção podem incluir lipossomas, redes de látex, micrófagos e várias formas de microencapsulação dos factores estimuladores de crescimento. Geralmente, o veículo ou ó orgânico por natureza ou uma emulsão aquosa e capaz de levar os factores estimulantes de crescimento a dispersarem-se ou dissolvereral--se nele. 0 veículo pode incluir emolientes farmaceuticamen|-te aceitáveis, aumentadores de penetração na pele, agentes corantes, fragâncias, emulsionantes, agentes espessantes, solventes. Segue-se uma descrição mais detalhada das composições tópicas preferidas: 1 1. Loções As loções podem compreender uma quantidade efectiva (de preferencia a partir de cerca de 0,01$ atá cer|-ca de 10$, de maior preferencia a partir de cerca de 0,1$ até cerca de 1$) dos factores estimuladores de crescimento; -18- 35 1 5

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% a partir de 1% ate 50%, de preferencia a partir de % até 15%, de um emolientej o equilíbrio sendo agua, um álcool Og ou Qy ou uma mistura de água e de álcool· São conheci-dos vários emolientes# Exemplos de tais emolientes são os seguintes: a# (5leos hidrocarbonetos e ceras* Exemplos são oleo mineral, vaselina, parafina, cerasina, ozoquerite, cera microcristalina, polietileno, e "per-hidroesqualeno”. b# dleos de silicone, como os dimetilpoli-siloxanos, metilfenilpolisiloxanos, copolímeros glicol-si-licone solúveis em água e em álcool e fluídos de silicone voláteis como o ciclometicano. c# Gorduras triglicerido e óleos tais como aqueles derivados de recursos marinhos, animais e vegetais# Exemplos incluiem óleo castor, óleo de açafroa, óleo de semente de algodão, óleo de milho, óleo de azeitona, óleo de figado de bacalhau, óleo de amêndoa, óleo de abacate, óleo de palma, óleo de sésamo, e óleo de soja* d. Esteres acetoglicerido, como por exemple monogliceridos acetilados. e. Gliceridos etoxilados, como por exemplo mono-estearato de glicerilo etoxilado. f# Esteres alquílicos de ácidos gordos tendo de 10 a 20 átomos carbonos. Esteres metílicos, isopropí-lico e butílico de ácidos gordos são úteis aqui. Os exemplos incluem laurato de hexilo, laurato de iso-hexilo, pal-mitato de iso-hexilo, paImitaio de isopropilo, miristato d€ isopropilo, oleato de decilo, oleato de isodecilo, esteara-to de hexadecilo, estearato de decilo, isoestearato de isopropilo, adipato de diisopropilo, adipato de di—iso-hexilo, adipato de di-hexilodecilo, sebacato de di-isopropilo, lactato de laurilo, lactato de miristilo e lactato de eeti-lo# g. Esteres alcenílicos de ácidos gordas tendo de 10 ató 20 átomos de carbono# Exemplos deles incluem -19- 35 10 15

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26 FEI/I92 miristato oleilico, estearato oleilico, e oleato oleilico. h. icidos gordos tendo de 8 a 22 átomos de carbono. Exemplos adequados inèlaiôm ácidos pelargonico, lauríco, mirístico, palmítico, esteárico, iso-esteárico, bi droxi-esteárico, oleíco, linoleíeo, ricinoleíco, araquidó-aico, beénico, e erúcico. i. Álcoois gordos teado de 8 até 22 de átomos de carbono. Álcoois laurilico, miristírico, cetílico, hexadecílico, estearílico, iso-estearílico, bidroxi-estearí lico, oleilico, ricinoleílico, beenílieo, erucílico e 2--octildodecílico são exemplos de álcoois gordos satisfatá-rico.* j. Éteres de álcool gordo. Álcoois gordos etoxilados de 8 ate 20 átomos de carbono incluem álcoois laurilico, cetílico, estearílico, iso-estearílico, oleilico e de colesterol teado ligados a eles desde 1 atá 50 grupos de óxido de etileao ou de 1 atá 50 grupos de óxido de propi leno, ou misturas deles* k. Esteres eter tais como ésteres de ácido gordo de álcoois gordos etoxilados. l. Lanolinas e derivados. Lanolina, óleo de lanolina, cera de lanolina, álcoois de lanolina, ácidos gort-dos de lanolina, lanolato de isopropilo, lanolina etoxilada álcoois de lanolina etoxilado, colesterol etoxilado, álcooi de lanolina propoxilada. lanolina acetilada, álcoois de lanolina acetilada, linoleato de álcoois de lanolina, acetato de ricinoleato de álcoois de lanolina, acetato de esteres--álcoois etoxilados, bidrogenolise de lanolina, lanolina hi drogenada etoxilada, lanolina de sorbitol etoxilada, e bases de absorção de lanolina semi-sólida e líquida são ilustrativos de emolientes derivados de lanolina. m. Álcoois poli-bidricos e derivados de poli éter. Propileno glicol, dipropileno gliool, polipropile* no glicol (P.M. 2.000-4.000), polioxipropileno-polióxieti* leno glicóis, polioxietileno-polioxipropileno glicóis, gli- -20- 35 1 5 10 15

Mod. 71 - 20.000 esc. - 90(08 20 J 25 30 63971 Case 4276 / 1/ FEV.19 1 i % cerol, glicerol etoxilado, glicerol propoxilado, sorbitol, sorbitol etoxilado, hidroxipropil sorbitol, polietileno gli-ool (P.M. 200-6.000), metoxipolietileno glicéis 350, 550, 750, 2.000, 5*000, homopolímeros poli(oxido de etileao) (P.M. 100.000-5.000.000). Polialquileno glicéis e derivados, hexileno glicol (2-metil-2,4-peatanodiol), 1,3-butileno gli-col, 1,2,6-hexanotriol, eto-hexadiol USP (2-etil-l,3-hexa-nodiol) glicol vieiaal C15G18, e derivados polioxipropile-no de trimetilolpropáno são exemplos deles. a. Esteres de álcool poli-hídrico. Moao- e di-ésteres de ácido gordo de etileaoglicol, moao- e di~ésteres de ácido gordo de dietileaoglicol, moao- e di-ésteres de ácido gordo de polietileaoglicol (P.l. 200-6.000), moao-e di-ésteres de acido gordo de propilenoglieol, moao-oleato de polipropileaoglicol 2000, moao-estearato de polipropile-aoglicol 2000, moao-estearato de polipropileaoglicol etoxi-lado, moao- e di-ésteres de ácido gordo de glioerilo, poli--esteres de ácido gordo de glicerol, moao-estearato de glicerilo etoxilado, moao-estearato de 1,3-butileaoglicol, di--estearato de 1,3-butileaoglicol, éster de ácido gordo de polioxietilenoglicol, ésteres de acido gordo de sorbitaao e ésteres de ácido gordo de polioxietilenosorbitano são ésteres de álcool poli-hidrico satisfatórios. o. Esteres de cera como por exemplo estea-rato de cera de abelhas, espermacete, miristato miristili-co, estearato estearílico. p. Derivados de cera de abelha, por exemplo, polioxietilenossorbital de cera de abelha. Estes são produtos de reacção de cera de abelha com sorbitol etoxilado variando o teor de oxido de etileao formando uma mistura de ésteres-éter. q. Geras vegetais incluindo ceras de carnaúba e caadelilha. r. Posfolípidos tais como leticiaa e deriva dos. 35 *21 10 j 15

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A o y //xrn.m s. Ssteroles. Colesteroles, ésteres de aeid gordo de colesterol são exemplos deles* t* Amidas tais como amidas de ácido gordo, amidas de ácido gordo etoxiladoa, aleanoamidas de ácido gorj-duroso sólido* As loções de preferência compreendem ainda desde 1$ atá 10$, de maior preferência desde 2$ até 5%, de um emulsionante* Os emulsionantes podem ser não iónicos, aniónicos ou catiánicos* Exemplos de emulsionantes não io-nicos satisfatórios incluem álcoois gordos tendo de 10 ate 20 de átomos de carbono, álcoois gordos tendo de 10 até 20 átomos de carbono condensados com 2 até 20 mole de óxido de etileno ou óxido de propileno, alquil fenóis com de 6 ate 12 átomos de carbono na cadeia alquilo condensados com de 2 até 20 mole de óxido etileno, mono- e di-esteres de acido gordo de óxido de etileno mono- e di-ésteres de ácido de e-tileno glicol em que a porção ácido gordo contém desde 20 átomos de carbono, dietileno glicol, polietileno glicóis, de peso molecular de 200 atá 6*000, propileno glicéis de peso molecular de 200 até 3*000, glioerol, sorbitol, sorbi-tano polioxietileno-sorbitol, polietileno sorbitano e ésteres de cera hidrofílioos. Emulsionantes aniónicos adequados incluem os sabões de ácido gordo, como por exemplo, sabões de ácido, potássio e trietanolamina, em que a porção ácido gordo contém desde 10 ate 20 átomos de carbono. Outros emul sionantes aniónicos adequados incluem, os alquilsulfatos de metal alcalino, amónio ou de amónio substiiuido, alquil a-rilsufonatos, sulfonatos de alquiletoxi éter tendo de 10 até 30 átomos de carbono na porção alquilo. Os sulfonatos de alquiletoxi éter contêm desde 1 até 50 unidades de oxido de etileno. Emulsionantes cationicos satisfatórios são os compostos de amónio quaternário, morfolinio e piridínio. Alguns dos emolientes descritos nos parágrafos anteriores também têm propriedades emulsionantes. Quando uma loção é formulada contendo um tal emoliente, um emulsionante adiciof- —22* 35 1 1 5 10 15

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63971 Case 4276 nal aão é necessário, embora possa ser incluído na composição. 0 equilíbrio da loção ou um álcool C2 ou ou uma mistura de água e de álcool. As loçSes são formuladas misturando simplesmente todos os componentes em conjunto. De preferência o composto da presente invenção é dissolvido na mistura. Podem ser incluídos componentes opcionais convencionais. Um tal aditivo é um agente espessante num nível a partir de 1$ até 10$ da composição. Exemplos de a- gentes espessantes adequados incluem: polímeros de oarboxi-polimetileno reticulados, celulose de etilo, polietileno glicois, goma alcantira, goma "kharaya", gomas de xantana e bentonite, bidroxietilo celulose, e hidroxipropil celulose. 2. Gremes

Os oremes compreendem uma quantidade efecti-va (de preferência de cerca de 0,01$ até cerca de 10$, de maior preferência desde cerca de 1$ até cerca de 5$) dos factores estimuladores de crescimento; desde 5$ até 50$, de preferência desde 10$ até 25$, de um emoliente; sendo o e-quilibrio água. Os emolientes acima descritos podem também ser usados nas composiçães de crsme. Opcionalmente a formação do creme contém um emulsionante adequado tal como descrito anteriormente. Quando um emulsionante é incluído, está na composição a um nível desde 3$ até 50$, de preferência desde 5$ até 20$. 3. SolucSes A forma de solução compreende uma quantidads efectiva (de preferência desde cerca de 0,01$ até cerca de 10$, de maior preferência desde cerca de 0,1$ até cerca de 1$ dos factores estimuladores de crescimento; sendo o equi líbrio água e/ou um solvente orgânico adequado. Materiais orgânicos adequados úteis como solventes ou uma parte de um sistema solvente são os seguintes: propileno glicol, polietileno glicol, (P.M. 200-600), polipropileno glicol (P.M. 425-2025), glicerina, esteres de sorbitol, 1,2,6-b.exano t ri o L, -23- 35 1 5 10> 15

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// %

etanol, isopropanol, tartarato de dietilo, butanodxol, e suas misturas. (Dais sistemas solventes podem também conter água.

Estas composições na forma de solução podem ser aplicadas à pele tal como estão, ou então podem sei formuladas para um aerosol e aplicadas à pele como lima pulverização. As composições de aerosol compreendem ainda desde 50(1 ate 80$, de preferencia desde 30$ ate 50$ de um propulsiona dor adequado. Exemplos de tais propulsionadores sãc os hidrocarbonetos de baixo peso molecular clorados, fluo-rados e clorofluorados. Óxido nitroso, dióxido de carbono, butano, e propano são também usados como gases propulsiona-dores. Estes propulsionadores são usados num nível suficiente para expulsar os conteúdos dos recipientes. 4# Geles

As composições de gel podem ser formuladas simplesmente através da mistura de um agente espessante a-dequado às composições de solução anteriormente descritas. Exemplos de agentes espessantes adequados foram anteriormenj-te descritos no que diz respeito às loções· As composições de gel compreendem uma quantidade efectiva (de preferencia desde cerca de 0,01$ ate cerca de 10$, de maior preferencia desde cerca de 1$ até cerca de 5%) dos factores estimuladores de crescimento; des de 5$ até 75$, de preferencia desde 10$ até 50$, de ura solj-vente orgânico como previamente descrito; desde 0,5$ até 20$, de preferência desde 1$ até 10$ do agente espessante; sendo o equilíbrio água. 5. sólidos

As composições de formas sólidas têm utilização como composições tipo-barra com o fim de serem aplicadas ao couro cabeludo ou outras partes do corpo. (Tais composições compreendem uma quantidade efectiva (de preferência desde cerca de 0,1$ até cerca de 10$, de maior preferência desde cerca de 1% até cerca de 5$) dos factores 24 35 1 1

,·% I 63971 Case 4276 5

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Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 20 estimuladores de crescimento, e desde 50$ até 98$ de preferência desde 60$ até 90$ dos emolientes anteriormente descritos. Esta composição pode ainda compreender desde 1$ até 20$, de preferência desde 5$ até 15$, de um agente espessar-te adequado, e opcionalmente emulsionantes e agua. Agentes espessantes anteriormente descritos no que dia respeito a loçães são aqui adequadas. Intensificadores de Penetração A presença de intensificador de penetração pode potenciar o benefício do factor estimulador de crescimento melhorando a respectiva assimilação através da stra-tum corneum no seu local de acção nas imediações próximas do folículo de cabelo próximo da papila dérmica· 0 intensificador de penetração pode confor-memente funcionar numa variedade de maneiras. Pode, por e-xemplo, melhorar a distribuição do promotor de crescimento de cabelo na superfície da pele. Alternativamente, pode aumentar a respectiva divisão para a pele a partir da composição quando aplicada tópicamente, ajudando assim a sua passagem para o seu local de acção. Outros mecanismos que aumentam o benefício dos factores estimuladores de crescimen to podem também estar envolvidos. J 25 30

Exemplos de intensificadores de penetração incluem, mas não são limitados as 1-dodecilazaeiclo-heptan--2-ono em combinação com certos dióis Cy-C^ ou uma azaei-cloalldLl-2-ono substituída na posição 1 (ver U.S· Patente 4.557.934, Cooper, concedida a 10 de Dezembro de 1985); uma combinação binária de um diol C^-C^ e um "composto de de-sordenação do envelope celular" (ver U.S. Patente 4.552.872, Cooper, Loomans e Pwzi, concedida em 12 de lovembro de 1985); uma combinação binária de iT-(2-hidroxietil)pirrolidona e un "composto de desordenação do envelope celular" (ver U.S.Patente 4*537.776, Cooper, concedida em 27 de Agosto de 1985), um composto compreendendo álcool laurilico, sebacato di-isc-propílico, sebacate, di-butílico, adipate dioctílico, dipe- -25- 35 1 5 10 > 15

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A

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f: ,7

;í

largonato de propileno glicol, myristate etílico, laurato butílico, miristate butílico, palraitato, isopropílico, álcool oleílico, sebacate dietílico, sebacate dioctílico, aze-late dioctílico, laurato hexílico, caprato etílico, esteara-to butílico, isoestearato isopropílico, pelargonato 2-etil-hexílieo," benzoato butílico, benzoato benzílico, salicilato benzílico, ftalato di-butílico e/ou laurato etílico (ver U.S. Patente 4·299·826, Luedders, concedida em 10 de Itfovem-bro de 1981); um éster de açúcar em combinação com um de sulfóxido ou fosfina (ver U.S. Patente 4.150.114, Smith, concedida em 17 de Abril de 1979; U.S. Patente 4*148,917, Smith, concedida em 10 de Abril de 1979; U.S. Patente 4.148.887, Smith concedida em 10 de Abril de 1979, U.S. Patente 4.148.874, Smith, concedida em 10 de Abril de 1979; U.S. Patente 4.130.667, Smith, 19 de Dezembro de 1978; U.S. Patente 4.130.643, Smith, concedida em 19 de Dezembro de 1978; U.S. Patente 4.046.886, Smith, concedida em 6 de Dezembro de 1977; U.S. Patente 3.952.099, Smith, concedida em 20 de Abril de 1976; U.S. Patente 3.952.099, Smith, concedida em 20 de Abril de 1976; U.S. Patente 3*896.238, Smith, concedida em 22 de Julho de 1975); um veículo compreendendo sulfóxidos alifaticos (Ver U.S. Patente 3.953.599, MacMil-lan e Lyness, concedida em 27 de Abril de 1976; U.S. Patente 3.903.256, MacMillan e Lyness, concedida era 2 de Setembro de 1975; U.S. Patente 3*839.566, MacMillan e Lyness, concedida em 1 de Outubro de 1974; U.S. Patente 3.678.156, MacMillan e Lyness, concedida em 18 de Julho de 1972,); um veículo compreendendo uma combinação binária de um diol G^-G^ ou triol G^-Og e um composto lípido polar álcool G-jg ou C18 específico (Yer Pedido de Patente Europeia 249*397. Kasting, Smith, Massaro e Snyder, publicada em 16 de Dezembro de 1987); um veiculo compreendendo um diol QyC^, estér de diol ou éter de diol e um composto de desordenação do envelope celular (Yer Pedido de Patente Europeia 095 813, Cooper, publicada em 7 de Dezembro de 1983; Pedido de Paten- -26- 35 10 15

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i a

te Europeia 043 738, Wickett, Cooper e Loomais, publicado em 13 de Janeiro de 1932); um veículo compreendendo um al-canol primário Cg-C^ e uai de propano- ou butano diol (Yer Pedido de Patente Europeia 013 459» Wckett, Cooper e Loo-mans, publicado em 23 de Julho de 1980); Outros Estimuladores de Crescimento de Cabelo A composição de acordo com a invenção também pode opcionalmente compreender outros estimulantes de crescimento de cabelo capazes de funcionar de formas diferentes para aumentar o benefício dos factores estimuladores de crescimento. Exemplos de outras substancias que elas próprias possuem a capacidade de regular o crescimento de cabelo incluem, mas não são limitados a elas, minoxidilo, aci do retinóico, diazóxido, gly-his-lys (também conhecido como factor da célula de fígado) e respectivos derivados de metal de transição, ciclosporina, anti-inflamatorios, blo-queadores do canal de cálcio, anti-bacterianos, agentes tenl-sio-activos não iénicos, mucopolisacaridos, antiandrogéneos inibidores de glycosidase, e inibidores de glicosaminogli-canase. Agentes Estabilizadores de Proteínas 0 factor de crescimento é proteico, e por isso o seu proprio benefício em promover o crescimento de cabelo pode ser mantido ou melhorado incluindo um agente de estabilização de proteína na composição de acordo com a invenção. Gom um exemplo deste efeito, deve-se notar que a pej-le-contém proteases naturais que podem pelo menos degradar parcialmente o promotor de crescimento de cabelo. Por isso, a presença de um agente estabilizador de proteína como um inibidor de protease ou uma proteina secundaria que competi|-rá com o promotor de crescimento de cabelo para degradação através das proteases de pele naturais, pode proteger o prcj-motor de crescimento de cabelo até atingir as imediaçães próximas do bulbo do cabelo. Exemplos de agentes estabilizadores de pro -27- 35 1 1 5

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o 63971 Case 4276 teínas correspondentes incluem glicerol, ácido etilenodia-minotetraacético, ceisteína,<rt p-macroglobulina soro, e outros inibidores de proteinase.

Outros Ingredientes A composição de acordo com a invenção pode conter outros ingredientes sem ser aqueles já mencionados, dependendo na forma do produto pretendido. E, por exemplo, possível incluir antisepticos, conservantes, anti-oxidantes, agentes corantes, sabões e detergentes. A composição de acordo com a invenção pode também ser utilizada como um veículo de larga variedade de ingredientes cosmética e farmacêuticamente activos, particularmente ingredientes que tem alguns benefícios efectivos quando aplicados à pele para além da promoção do crescimento de cabelo. A composição de acordo com a invenção pode também opcionalmente compreender um perfume em quantidade suficiente para tornar a composição aceitável ao consumido! e agradável de usar. Geralmente, o perfume formará desde 0,01% até 0,1% em peso da composição.

Uso das Composições para Induzir. Manter ou Aumentar o Crescimento de Gabelo A invenção também prevê para o uso dos factores de crescimento de cabelo isolados a partir de células epiteliais cultivadas no tratamento da calvície. Os seguintes métodos de utilização podem ser usados para reverter, travar, ou evitar o começo da calvície.

As composições de acordo com a invenção são de preferencia pretendidas para aplicação por injecção cu-tãnea. A quantidade da composição e a frequência da injecçã cutâneo pode variar largamente, dependendo das necessidades pessoais. Gomo um exemplo de aplicação por injecção cutanea, sugere-se que uma composição adequada para injecção cutanea compreendendo os factores estimuladores de crescimento seja injeetada de preferencia desde uma vez por dia até uma vez -28' 35 1 63971 Case 4276

de seis em seis meses, de maior preferencia desde três vezes por semana até uma vez por mês, e de maior preferencia desde uma vez por semana ate duas vezes por mês. A composi 5

10 J 15 ção para injecção cutanea conterá desde cerca de 4pg/kg a-fé cerca 4 >ug/kg, dos factores estimuladores de crescimento por dose, de preferência desde cerca de 400 pg/kg até cerca de 4/ig/kg» de maior preferência desde cerca de 2 ng/kg até cerca de 3/Ug/kg, e de maior preferência desde cerca de 50 ng/kg até cerca de 0,3 /ig/kg. 0 período de in-jecçães seria ao longo de um período desde cerca de um mês até cerca de dez anos, de preferência de cerca de três meses até cerca de dois anos, de preferência de cerca de três meses até cerca de dois anos, de maior preferência desde cerca de seis meses até cerca de um ano, resultando assim na regulação de crescimento de canelo.

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Um método de maior preferencia da aplicação das composiçSes de acordo com a presente invenção envolve a aplicação tópica ao couro cabeludo de um sujeito liumano para regular o crescimento de cabelo, particularmente onde a cabeça já esta calva, ou onde esiste evidência que pode sugerir que uma pessoa se tornara calva (isto é, perca de cabelo), A quantidade da composição e a frequência de aplicação ao cabelo e/οιι couro cabeludo pode variar largamente, dependendo das necessidades pessoais, mas é sugerido como um exemplo que a aplicação tópica abrange desde cerca de 1 até cerca de 10 vezes diárias, de preferência desde cerca de 2 até cerca de 6 vezes diárias, de maior preferência de, de cerca de 3 até cerca de 4 vezes diárias, e de maior preferência uma vez por dia. A composição para aplicação topi- Φ O f O Ga conterá desde cerca de 1 ng/em ate cerca de 1 mg/cm dc íactor estimulador de crescimento por dose, de preferência Q / O desde cerca de 100 ng/em ate cerca de 0,9 mg/crn , de maior preferência de cerca de 0,5 pg/era2 atá cerca de 0,7 mg/cn/\ Λ ' 2 ' " e de maior preferencia desde cerca de 10 )ug/cm ate cerca de 0,5 mg/cm^. 0 período de aplicação tópica seria de pre-

i t 5 10) 15

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 20 ) 25 63971 Case 4276 /r*. s ' · -1 / if "1 | ?rTFV.199# tí ferenoia por uai perioclo de cerca de um mas ate cerca de de2 anos, de maior preferencia desde cerca de três meses ate cerca de dois anos, de maior preferência ainda desde cerca de seis meses até cerca de ura ano, daí resultando na regulação do crescimento de cabelo. Os exemplos que se seguem descrevem e demou tram ainda as concretizaçães preferidas dentro do alcance da presente invenção. Os exemplos são dados únicamente para fins de ilustração, e não são para serem interpretados como limitaçães da presente invenção uma vez que muitas varia-çães dela são possíveis sem se afastar do seu espírito e alcance.

Exemplos VIII-X ilustram um tónico de acordo com a invenção que é adequado para aplicação tópica ao couro cabeludo afim de promover 0 crescimento de cabelo. A loção tem a seguinte formulação. Exemplo ¥111 Exemplo IX Exemplo X Eactor de crescimento (&P/P) (SâP/P) (#P/P) cabelo 0.1 ^ 1.0 10.0 Etanol 10.0 15.0 15.0 Glicerol 1*0 2.0 3.0 Perfume 0.2 0.2 0.2 Agua qs qs qs 0 tónico ó aplicado ao couro cabeludo numa dose de um ml, uma vez por dia. À medida que 0 efeito se torna perceptível, pode-se reduzir a frequência da aplicação. 30

Exemplos XI-XIII ilustram uma loção que pode ser usada topicamente no tratamento de calvície ou cabeças masculinas ou femininas, com formação de calvície

Exemplo XI Exemplo XII Exemplo XIII (%P/P) (SP/P) (JSP/P) 0.4 15.0 15.0

Hidroxietil celuiose 0.4 Etanol absoluto 15.0 -30- 35 63971 Case 4276 // A / ' * Λ í! ti \f*mÍ Propano-1,2-diol 30,6 Butano-1,3-diol 33.4 33.4 — Benzoato parametilico 0.2 0.2 0,2 Factor de crescimento de cabelo 1.0 0.1 5.0 Perfume 0.5 0.5 0.5 Agua qs qs qs Λ locgo e aplicada ao couro cabeludo numa dose de ura ml, uma Tez por dia. Ã medida que o efeito se torna peroeptível, pode-se reduzir a frequência de aplicação.

Ssemplo II? ilustra uma emulsão de água-em--oleo contendo um factor de crescimento de cabelo de acordo com a invenção. Ξsemplo II? (tfP/P) fase Oleosa

Mono-oleato de sorbitauo 20.0

Quaternium-18 liectorite 5,0

Parafina Liquida 75.0

Fase Aquosa

Promotor de crescimento de cabelo 1,0

Goma de lantana 1,0

Conservante 0,3

Perfume 0,2

Cloreto de sódio (solução \% P/P) qs A emulsão foi preparada tirando 10 partes em volume da fase do oleo e a ela juntando devagar com agitação 90 partes em volume da fase aquosa. 0 enemplo I? ilustra um creme de óleo-era--agua contendo um factor de crescimento de cabelo de acordo com a invenção.

Exeraplo I? (&P/P)

Fase Oleosa 31-

Mod. 71 -20.000 ex. - 90/08 63971 Case 4276 1 Álcool eetearílico Óleo silicone, fluido 200 Líyristato isopropílieo Bsteai'oil-2-lactilato de Sodio 5 Pase Aquosa Propilenoglicol Citrato de Sodio Pactor de crescimento de cabelo Perftuae 10 Agua Purificada 15 20 ) 25 30

2,02.0 5.00.2 0.10.1 qs até 100 0 creme foi preparado misturando a fase do óleo e aquecendo-o para 652C. Combina-se a fase aquosa e a-quece-la para 7020. Junta-se a fase aquosa à fase oleosa com agitagSo adequada. Mistura-se com agitaçSo adequada enquanto arrefece.

Os seguintes exemplos XVI-XVIII ilustram champôs a serem utilizados para lavar o cabelo e o couro ca beludo, e para regular o crescimento do cabelo no couro cabeludo.

Sulfonato de éter laurílico de sodio (2 EQ) : 215¾ AD Ácido lauril dimetilaminoacético betaina: 30$ AD Dietanolamino de ácido gordo de coco 01et-3fosfato (Ácido CRODAPOS Ή 3 Croda Poliamina de sebo PEG-15 (POLYQUARI H ® EenRel): 50$ activo Conservante, matéria corante, sal Pactor de crescimento de cabelo Perfume Agua

Exemplo XVI {% P/P) 41.4 4 1.5 1 1.5 0.58 10.0 qs até 100 -32· 35 1 63971 Case 4276

íí)I ,

:6. FEV.19S

Mod. 71 - 20.000 ex. - 50/08 5 10 ) 15 20

Sulfato de éter laurílico de sódio Exemnlo XVII (% P/P) 12 100% m ^ POLYQUART II 50%activo Ácido CRODAPOS 13® 2.5 2.5 Factor de crescimento de cabelo S.O Sulfato de zinco - 5 Perfume qs Água até-100 Sulfato laurílico de mono-et anela mina j Exemplo XVIII {% P/P) 20 100% AD P0LYQUAR1 : 50 aotivo 3 Ácido CRODAFOS 13® 1.7 Dietanolamida de coco 5 Pactor de crescimento de cabelo 10 Perfume qs Água até 100 pH ajustado para 6,5 J 25 0 champô e aplicado ao couro cabeludo numa dose de ura ml. 0 champô, é friccionado no couro cabeludo e depois retirado por enzaguamento. 0 champô é aplicado de no vo ao couro cabeludo, friccionado no couro cabeludo e retirado por enxaguamento. 30

Os exemplos XIX-XXVII ilustram loçSes de a-cordo com a invenção, cada uma contendo um intensifieador de actividade que pode ser usada topicamente no tratamento de calvície ou cabeças masculinas ou femininas com formaçSo de calvície, afim de regular o crescimento de cabelo. ώΛ.1

emolo XIX (%

Minoxidil P/P) 0.5

Exemplo (% P/P) 2.0

IxemoloXXE (% P/P) 5.0 35

Btanol absoluto 20.0 20.0 20.0 -33- 1 63971 Case 4276

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J 15 20 ) 25

Propileno Glicol 30.0 30.0 30.0 Pactor de crescimento de cabelo 5.0 1.0 0.1 Perfume 0.2 0.2 0.2 Agua qs qs qs Exemplo ΙΠΙ Exemplo ΧΣΙΙΙ Exemplo H IV P/P) P/P) 3 P/P) Cu IIíEster Gly-his-lys- -n~octílico 0.1 1.0 5.0 Etanol absoluto 20.0 20.0 20.0 Propileno glicol 30.0 30.0 30.0 Pactor de crescimento de cabelo 5.0 2.0 0.5 Perfume 0.2 0.2 0.2 Agua qs qs qs Exemolo ZTV Exemplo OTI ExemploXXVII (SSP/P) {% P/P) (ss P/P) Furildioxima 0.1 1.0 5.0 Etanol absoluto 20.0 20.0 20.0 Propileno glicol 30.0 30.0 30.0 Pactor de crescimento de cabelo 10.0 3.0 1.0 Perfume 0.2 0.2 0.2 iCgua qs qs qs Os exemplos ZXVIII e íUíXíL que s e seguem i- lustram formas injectaveis de factor de crescimento de cabe M» lo para promover o crescimento do cabelo no couro cabeludo* 30

Exemplo OTIII Exemplo 2SIX (% P/P) Promotor de crescimento (3 p/p) de cabelo 0.1 0.1

Solução de Ringer qs —

Solução de Ringer lectosa — qs

Embora concretiBaçães particulares do pro-posito da invenção tenha sido descritas sera óbvio para os -34- 35 63971 Case 4276 técnicos na arte que varias alterações e modificações do proposito da invenção podem ser feitas sem se afastar do es pírito e âmbito da invenção. Pretende-se abranger nas reivindicações apensas, todas essas modificações que estejam dentro do âmbito da invenção.

26 FEV.199P

Lisboa, xk mu ιαα;;

Por ΪΗΕ PROCTER & GAMBLE COMPAIY 10 ) 15

EMG.® MÂNUEl Adjunio do AOFI Eng." VOCSQ Itfle Arco ete Conceição, 3-1.'1 - «VJ9 USBOA

Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 20

J 25 30 -35- 35

Claims (4)

1 63971 Case 4276 5 10 J 15 Mod. 71 - 20.000 ex. - 90/08 20 η λ /Γ-

- RSIYIIDICAÇÕBS-II.- Processo para a preparação de uma composição para regular o crescimento de cabelo, caracterizado por compreenderí a. ura sobrenadante derivado de uma cultura de células epiteliais que compreende de cerca de 0,00001 a cerca de 20% em peso de um factor estimulante de crescimento, tendo o factor as seguintes característioas: 1. mitogenicidade para células da papila dér- mica, ii. mitogenicidade para células 3ΐ3· iii. perda de mitogenicidade para células epidérmicas , e iv. um peso molecular superior a cerca 3.000 daltons; e b. um veículo farmaceuticamente aceitável. 21·- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o factor estimulante de crescimento ter a característica adicional da actividade do ensaio da mitogene da célula da papila dérmica diminuída seguida do J 25 tratamento com dquimotripsina tipo 1-S numa concentração final superior a cerca de 100 yug/ml a cerca de 372 durante cerca de 5 horas. 30

31·- Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2 caracterizado por o factor estimulante de crescimento ter a característica adicional de reter desde cerca de 40$ até cerca de 90$ da actividade do ensaio de. mitogene da célula da papila dérmica seguida de tratamento de aquecimento de cerca de 502 ate cerca de 1002C.

42.- Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por a composição compreender desde cerca de 0,01$ atécerca de 10$ do factor estimulante de crescimento e o veículo ser um veículo tópico.

51·- Processo de acordo com a reivindicação —36— 35 1 1 5 10

63971 1 Case 4276 4 caractarizado por as células serem células epiteliais de folículos de cabelo. 6§.- Processo de acordo com a reivindica ç-3 c 4 caracterisado por as células serem células epidérmicas. 7ã·- Processo de acordo com a reivindicaç-3c 1 caracterisado por o veículo ser um veículo injectével. 8â,~ Processo de acordo com a reivindicaç3c 4 caracterizado por o veiculo topico compreender desde cerca de 1/5 ate cerca de 50% de ura emoliente. 9§*~ Processo de acordo com a reivindicaç3c 1 caracterizado por compreender adicionalmente uma quantidade segura e efectiva de minosidilo. Lisboa, 26 ftV,i992- Por ΪΗΒ PROCTER & GAMBIS GOMAM 15 Mod. 71 · 20.003 ex. - 90/08 25 30

Adjunto to ACPI Eng,° Vasco Leite Arco tio Conceição, 3-l.c 1100 LISBOA -37- 35