PT983342E - Meio de cultura com extracto de grãos de soja comofonte de amiinoácido e não complexos proteicos de fonteanimal - Google Patents
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Description
DESCRIÇÃO EPÍGRAFE: "MEIO DE CULTURA COM EXTRACTO DE GRÃOS DE SOJA COMO FONTE DE AMINOÁCIDO E NÃO COMPLEXOS PROTEICOS DE FONTE ANIMAL" A presente invenção relaciona-se com o uso dum meio de cultura de bactérias patogénicas, obtenção de factores imunogénicos a partir das bactérias cultivadas e preparação de vacinas que usam os factores imunogénicos.
As vacinas bacterianas são produzidas por cultura de bactérias patogénicas num meio, isolamento de factores imunogénicos e preparação de vacinas baseadas nos factores imunogénicos isolados. Estes métodos estão descritos em Bacterial Vaccines, 1984, Ed. Rene Germanier Academic Press e Bacterial Vaccines em Advances in Biotechnology Processes, Vol. 13, 1990, Ed. A. Mizrahi, Wiley-Liss. Nos métodos convencionais, as bactérias patogénicas são cultivadas em meios com material proteico de origem animal. Estes compostos são usados acreditando-se que alguns factores de crescimento, essenciais para o crescimento de bactérias patogénicas, apenas estavam presentes nos compostos de origem animal tais como sangue, infusão de coração e cérebro, carne, etc. Por exemplo, C. tetani cresce em meio com uma infusão de coração e uma digestão enzimática de caseína; C. diphtheriae requer uma infusão de carne; H. pylori cresce em meio com peptamina e triptona; e Haemophilus influenzae cresce em meio com proteose-peptonas. A World Health Organisation apresenta números de séries 800 (1990) 1 e 814 (1991) que indicam que para crescer Haemophilus influenza, Corynehacterium diphtheriae, Clostridium tetani e Bordetella pertussis, são necessários meios que compreendem compostos de origem animal. A necessidade de material proteico de origem animal nos meios aumenta a preocupação sobre possíveis contaminações dos meios. Em particular, a preocupação de que os meios possam estar contaminados com o agente causador da encefalopatia espongiforme bovina (BSE) ou outros agentes infecciosos e prejudiciais, o que restringe a utilidade de quaisquer factores derivados dessas culturas, especialmente para as aplicações terapêuticas.
Surpreendentemente, foi descoberto que os materiais proteicos de origem não animal são capazes de sustentar o crescimento de bactérias patogénicas e permitir a produção de factores imunogénicos pelas bactérias. A WO 94/09115 revela um meio de cultura que não contém componentes animais complexos para a produção de Streptococcus pneumoniae e o isolamento do polissacárido capsular pneumocócico que pode ser usado para preparar vacinas. O extracto de levedura e a peptona de soja são usados em vez de material proteico derivado de animais. A EP-A-0540897 revela um método para a cultura de Heliobacter pylori num meio em que o sangue ou os seus derivados é substituído por ciclodextrinas, metilcelulose ou as suas misturas. No entanto, os materiais proteicos derivados de animais tais como triptona e peptamina também estão presentes. A US-A-5,494,808 relata sobre um meio sintético para a fermentação de Neisseria meningitidis.
Os meios de cultura para Haemophilus influenzae estão descritos em Pienta, P. et al (ATCC "Bactéria and Bacteriophages" 2 19th Edition, 1996, Rockville, US ISBN: 0-930009-59-2) e Herriott, R.M. et al. ("Defined médium for growth of Haemophilus-influenze", J. Bacteriol., vol. 101, No. 2, Feb 1970, 513-516, US) .
No pedido de patente DD 294 502-A, é revelado um processo para a preparação de hidrolisados de soja e o uso de hidrolisados de soja na cultura de microrganismos para fímbrias. O hidrolisado de soja é preparado por cultura em meio com farinha de soja com estirpes de Streptomyces. O hidrolisado de soja é usado como uma fonte de carbono devido à elevada percentagem de polissacáridos presentes e contém menos de 20% por peso seco de proteína. O uso de material proteico de origem não animal, tal como proteínas de grãos de soja, sementes de algodão, batata, etc., como um constituinte do meio para a cultura de bactérias patogénicas, remove completamente o risco de contaminação derivada de animais, tal como a BSE, ser transmitida a seres humanos em qualquer terapêutica subsequente ou aplicações profilácticas.
Outra vantagem associada com o uso de materiais proteicos derivados de vegetais é a redução dos custos da produção desses materiais e o aumento da consistência dos materiais (o material proteico não derivado de animais é mais uniforme na sua composição do que os materiais derivados de animais). A presente invenção fornece um processo tal como descrito na reivindicação 1.
Qualquer meio padrão para a cultura de bactérias pode ser usado como base para o meio, desde o meio não contenha material proteico derivado de animais.
Preferivelmente, o meio compreende uma fonte de carbono e energia, uma fonte de nitrogénio, sais essenciais e, 3 opcionalmente, um agente de selecção, tal como um antibiótico, para seleccionar os microrganismos a serem cultivados. 0 meio pode ser um meio sólido ou liquido. Exemplos de meios padrão líquidos que podem formar a base do meio incluem Brucella Broth (Caldo de Brucella) (sem triptona e peptamina) , meio de Watson (sem casamino-ácidos), meio de Mueller Miller (sem infusão de coração e hidrolisado de caseína), meio CL (sem casamino-ácidos) e meio de Franz A. Os meios sólidos padrão podem ser preparados a partir de qualquer um dos meios líquidos através da adição de um agente solidificante tal como agar. 0 termo "cultura" como aqui usado significa a manutenção de, e preferivelmente o crescimento de, bactérias. 0 crescimento bacteriano é aqui definido como o aumento da biomassa bacteriana. 0 termo "bactéria patogénica", como aqui usado, significa qualquer bactéria que está envolvida na patogénese de uma doença. As bactérias patogénicas preferidas incluem Helicobacter pylori, Haemophilus influenzae, Corynebacterium diphtheriae e Neisseria meningitidis, Bordetella pertussis e Clostridium tetani. 0 termo "factor imunogénico", como aqui usado, significa qualquer factor que é capaz de estimular o sistema imunitário de um ser humano ou animal. Tais factores imunogénicos incluem proteínas antigénicas e especialmente factores virulentos e seus fragmentos. Os factores virulentos são definidos com estando associados com a virulência duma bactéria e inclui estes factores com a citotoxina vacuolar VacA produzida por Helicobacter pylori. Outros factores virulentos são descritos por Rappuoli, R. et al., European Journal of Gastroenterology and Hepatology of Helicobacter pylori infection. Proceedings of an interdisciplinary meeting (Génova, June 18-19, 1993) J.J. Misiewicz, Ed. (CS Current Science), pp S76-S78. 0 factor 4 imunogénico pode ser destoxifiçado ou tratado geneticamente através dum processo por toxóide. Os métodos para destoxificar geneticamente e factores imunogénicos por toxóide são bem conhecidos pelos especialistas na arte e incluem aqueles descritos por Rappuoli, R., Vaccine, 12, 579-581, (1994). 0 termo "material proteico", como aqui usado, significa proteínas e produtos de degradação de proteínas incluindo aminoácidos livres. Preferivelmente, o material proteico é um hidrolisado de proteína.
Os materiais proteicos não derivados de animais como aqui usados significam materiais proteicos derivados a partir de fontes de não mamíferos, tais como vegetais, aves, peixes, leveduras, fungos, algas e microrganismos. 0 material proteico não derivado de animais aqui usado é uma composição de proteínas derivada a partir de grãos de soja.
Exemplos de composições de proteínas derivadas de grãos de soja são Hysoy (Quest), Amisoy (Quest), N-Z soy (Quest) e Soytone (Difco).
As composições de proteínas derivadas de grãos de soja podem ser preparadas por digestão enzimática da farinha de soja ou isolado de soja usando enzimas padrão tais como papaína. Por exemplo, a N-Z soy é uma composição de proteína solúvel feita pela digestão enzimática dum isolado de soja e Hysoy é uma digestão papaica da farinha de soja. As composições de proteína derivadas de grãos de soja também podem ser obtidas por hidrólise ácida dum isolado de soja. Por exemplo, o Amisoy é uma fonte de aminoácidos e péptidos produzido por hidrólise ácida de um isolado de soja. 0 material proteico não derivado de animais no meio da presente invenção pode compreender dois ou mais materiais 5 proteicos diferentes não derivados de animais, tais como uma mistura de composições de proteína derivadas de grãos de soja tais como Hysoy, Amisoy, soja N-Z e Soytone.
Os materiais proteicos derivados de animais incluem composições de proteína tais como soro fetal bovino (FCS), albumina de soro bovino (BSA), proteose-peptonas, casaminoácidos, triptona, peptamina e hidrolisados de caseína. 0 meio compreende pelo menos 20% do peso seco de um material proteico não derivado de animais, mais preferivelmente, pelo menos 30% do peso seco de um material proteico não derivado de animais e mais preferivelmente pelo menos 50% do peso seco de um material proteico não derivado de animais.
Surpreendentemente, descobriu-se que a cultura de bactérias patogénicas usando o meio aqui descrito resulta no crescimento aumentado das bactérias e um rendimento aumentado dos factores imunogénicos quando comparado com a cultura de bactérias patogénicas num meio com material proteico derivado de animais.
Um meio para a cultura de bactérias patogénicas para produzir um factor imunogénico pode ser feito através da adição de material proteico suficiente não derivado de animais a um meio padrão para a cultura de bactérias, que não compreende material proteico derivado de animais, de modo que o meio para a cultura de bactérias patogénicas compreende pelo menos 20% por peso seco de material proteico não derivado de animais, e não compreende material proteico derivado de animais.
Exemplos de meios padrão líquidos incluem Brucella Broth (Caldo de Brucella) (sem triptona e peptamina), meio de Watson (sem casamino-ácidos), meio de Mueller Miller (sem infusão de coração e hidrolisado de caseína), meio CL (sem casamino-ácidos) e meio de Franz A. Os meios sólidos padrão podem ser preparados a 6 partir de qualquer um dos meios líquidos através da adição de um agente solidificante tal como agar.
As bactérias patogénicas são Haemophilus influenzae. A presente invenção fornece um processo para preparar um factor imunogénico de uma bactéria patogénica que compreende os passos de por em cultura a bactéria no meio e opcionalmente purificar o factor imunogénico a partir do meio.
Preferivelmente, as bactérias patogénicas são postas em cultura no meio da presente invenção durante pelo menos 6 horas, mais preferivelmente pelo menos 36 horas, e o mais preferível pelo menos 72 horas sob condições adequadas para a produção do factor imunogénico.
As condições de cultura adequadas para a produção do factor imunogénico, incluindo a duração da cultura, irão variar dependendo da bactéria que está em cultura. No entanto, um especialista na arte pode facilmente determinar as condições de cultura necessárias para a produção do factor imunogénico seguindo protocolos padrão, tais como aqueles descritos nas séries Methods in Microbiology, Academic Press Inc., e, se necessário, realizando várias experiências padrão para determinar as condições de cultura adequadas. 0 factor imunogénico pode ser isolado a partir da cultura bacteriana usando várias técnicas padrão incluindo aquelas descritas por Manetti, R. et al., Infect. Immun., 63, 4476-4480, (1995). A presente invenção também fornece um processo para a produção de uma vacina que compreende a preparação de um factor imunogénico de uma bactéria patogénica através do processo da reivindicação 1 e produzindo o referido factor, opcionalmente por toxóide, em associação com um transportador farmaceuticamente 7 aceitável. Os métodos adequados para produzir uma vacina são descritos por Rappuoli, R., New and improved vaccines against Diphtheria and Tetanus. (1990), 251-268, New Generation of Vaccines, Ed. G.C. Woodrow, M.M Levine, Mareei Dekker Inc. New York.
As vacinas preparadas pelo processo da presente invenção irão requerer a adição de adjuvantes quando são usadas. Os adjuvantes adequados estão descritos em Gupta, R. K. et al., Vaccine, 13, 1263-1276, (1995).
As vacinas preparadas pelo processo da presente invenção podem ser usadas para vacinar um indivíduo contra uma infecção bacteriana. As infecções bacterianas preferidas contra as quais podem ser vacinados incluem gastrite tipo B, meningite bacteriana, difteria, tétano e tosse convulsa.
As vacinas preparadas pelo processo da presente invenção podem ser fornecidas como uma composição farmacêutica que compreende a vacina da presente invenção numa mistura com um transportador farmaceuticamente aceitável e adjuvantes como mencionado acima.
As vacinas preparadas pelo processo da presente invenção podem ser administradas por via oral ou parentérica, incluindo administração intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutânea, transdérmica, aérea (aerossol), rectal e tópica.
Para administração oral, os compostos da invenção, geralmente, irão ser fornecidos na forma de comprimidos ou cápsulas ou como um solução aquosa ou suspensão.
Os comprimidos para uso oral podem incluir os ingredientes activos (o componente de vacina) misturados com os excipientes farmaceuticamente aceitáveis tais como diluentes inertes, agentes desagregantes, agentes de ligação, agentes lubrificantes, agentes 8 adoçantes, agentes aromatizantes, agentes corantes e conservantes. Os diluentes inertes adequados incluem carbonato de sódio e cálcio, fosfato de sódio e cálcio e lactose, enquanto o amido de milho e o ácido alginico são agentes desagregantes adequados. Os agentes de ligação podem incluir amido e outros agentes bem conhecidos, enquanto o agente lubrificante, se presente, irá geralmente ser estearato de magnésio, ácido esteárico ou talco. Se desejado, os comprimidos podem ser revestidos com um material tal como monoestearato de gliceril ou diestearato de gliceril, para retardar a absorção no tracto gastrointestinal.
As cápsulas para uso oral incluem cápsulas duras nas quais o ingrediente activo é misturado com um diluente sólido, e cápsulas moles onde o ingrediente activo é misturado com água ou um óleo tal como óleo de amendoim, parafina liquida ou azeite.
Para uso intramuscular, intraperitoneal, subcutâneo e intravenoso, os compostos, geralmente, irão ser fornecidos em soluções ou suspensões aquosas estéreis, tamponadas para um pH apropriado e isotonicidade. Os veiculos aquosos adequados incluem solução de Ringer e cloreto de sódio isotónico. As suspensões aquosas de acordo com a invenção podem incluir agentes de suspensão tais como derivados de celulose, alginato de sódio, polivinil-pirrolidona e goma tragacanta, e um agente humidificante tal como lecitina. Os conservantes adequados para suspensões aquosas incluem p-hidroxibenzoato de etilo e n-propilo.
As vacinas preparadas pelo processo da presente invenção também podem ser apresentadas como formulações de lipossomas. A presente invenção é agora descrita com referência aos exemplos seguintes e às figuras nas quais: 9 A Figura 1 apresenta as cinéticas de crescimento de H. pylori CCUG 17874 em BB com Triptona e peptamina. A Figura 2 apresenta as cinéticas de crescimento de H. pylori CCUG 17874 em BB simplificado com Soytone. A Figura 3 apresenta as cinéticas de crescimento de H. pylori CCUG 17874 em BB simplificado com Hysoy. A Figura 4 apresenta uma imunotransferência de VacA em que a linha 1 é um marcador de peso molecular, linha 2 VacA padrão de 750ng, linha 3 VacA padrão de 500ng, linha 4 VacA padrão de 400ng, linha 5 VacA padrão de 150ng, linha 6 VacA padrão de 20ng, linha 7 VacA produzida no fim da fermentação, linha 8 VacA produzida após 48 horas de cultura, linha 9 VacA produzida após 30 horas de cultura, linha 10 VacA produzida após 23 horas de cultura. A Figura 5 apresenta uma imunotransferência de VacA em que a linha 1 é um marcador de peso molecular, linha 2 VacA padrão de 750ng, linha 3 VacA padrão de 500ng, linha 4 VacA padrão de 400ng, linha 5 VacA padrão de 150ng, linha 6 VacA padrão de 20ng, linha 7 VacA produzida no fim da fermentação, linha 8 VacA produzida após 31,5 horas de cultura, linha 9 VacA produzida após 30 horas de cultura, linha 10 VacA produzida após 24 horas de cultura. A Figura 6 apresenta uma imunotransferência de VacA em que a linha 1 é um marcador de peso molecular, linha 2 VacA padrão de 750ng, linha 3 VacA padrão de 500ng, linha 4 VacA padrão de 400ng, linha 5 VacA padrão de 20ng, linha 6 VacA produzida no fim da fermentação, linha 7 VacA produzida após 48 horas de cultura,
linha 8 VacA produzida após 31 horas de cultura, linha 9 VacA produzida após 24,5 horas de cultura, linha 10 VacA padrão de 150ng. 10 A Figura 7 apresenta a cinética de crescimento de H. influenzae b em meio de Franz simplificado com Soytone ou proteose-peptona. A Figura 8 apresenta a cinética de crescimento de N. meningitidis C em meio de Watson com Casaminoácidos ou Amisoy.
Exemplos
Exemplo I 0 Exemplo I não está incluído dentro do âmbito invenção e está incluído apenas com o fim de comparação. A Helicobacter pylori é uma bactéria microaeróbia gram negativa encurvada isolada há cerca de 10 anos e está associada com a gastrite do tipo B em seres humanos. Esta bactéria coloniza a mucosa gástrica humana e estabelece uma infecção crónica que pode resultar em úlceras gástrica e duodenal (Blaser, M.J., (1990), J. Infect. Dis., 161, 629-633) e pode ser um factor de risco para o desenvolvimento de carcinoma gástrico (Parsonnet, J. et al., (1991), New Engl. J. Med., 325, 1127-1131). A longo termo, a infecção e as doenças podem ser prevenidas e tratadas por vacinação. Actualmente, os factores graves envolvidos na adesão bacteriana, colonização e virulência foram identificados. Um dos factores de maior interesse envolvido na doença é a vacuolização da citotoxina (VacA) que causa vacuolização massiva em várias linhas celulares de mamíferos (Leunk, R.D., (1991), Rev. Infect. Dis., 13 (suppl.8), S683-S689) . Os vacúolos também têm sido observados no epitélio gástrico de pacientes com gastrite crónica (Tricottet, V. et al., (1986), Ultrastruct. Pathol., 10, 113-117). Esta proteína tem mostrado causar ulceração em ratinhos (Telford, J.L. et al., 11 (1994), J. Exp. Med., 179, 1653-1658) e é uma candidata a vacina. A citotoxina purificada é uma proteína de 87-94 kD que pode ser purificada em quantidades muito pequenas a partir do sobrenadante da cultura bacteriana.
Materiais e métodos
Estirpe bacteriana.
Foi usada a Helicobacter pylori CCUG 17874 (estirpe tipo, Cultura de Colecção, Universidade de Goteborg).
Meios e suplementos.
Brucella Broth (triptona 10 g l”1, peptamina lOg l”1, dextrose lg l”1, extracto de levedura 2g 1_1, cloreto de sódio 5g l-1 e dissulfureto de sódio O.lg l-1) (BB) (Difco) suplementado com 2g. 1_1 de (2,6 di-O-metil)-b-ciclodextrina (CD) (Teíjin Lim. Tokyo, Japan) e 20 mg/L de estreptomicina foi usada como meio líquido para efeitos de comparação. Foram usados Hysoy ou Soytone numa concentração de 10 g/L em vez de triptona e peptamina presente em BB.
Conservação.
As alíquotas congeladas para inoculo foram preparadas a partir de frascos culturas de 2 X 108 CFU ml-1 diluída de 1:2 com uma solução composta por glicerol a 40%, soro fetal bovino (FCS) (HyClone, Logan, Utah) a 20% e CD 0,4%. A suspensão obtida foi distribuída em frascos de 3 ml e armazenada a -80°C e usados como frascos congelados de partida para comparação com novos frascos congelados preparados substituindo FCS por Soytone a 20%. 12
Crescimento em meio líquido.
As culturas iniciais foram realizadas em frascos Erlenmeyer de 500 ml com 100 ml de meio líquido. As culturas foram inoculadas com 3 ml de bases congelados e incubados a 36°C durante 36 horas com agitação (100 rpm, 2,5 cm de oscilação) num ambiente microaeróbio. Os frascos foram colocados dentro de jarras anaeróbicas onde foram usados envelopes BBL Campy Pak (Becton Dickinson) para gerar as condições adequadas. Estas culturas foram depois usadas para inocular frascos de 1000 ml com 250 ml de meio e incubadas nas mesmas condições acima mencionadas e usadas para inocular os biorreactores.
Vasos de cultura e condições de crescimento.
As fermentações em batch (descontínuas) foram realizadas em biorreactores de 7 litros (MBR Bioreactors AG, 8620 Wetzikon, CH) com 5L de meio. Todas as culturas foram crescidas a 36°C. Os valores de pH não foram controlados. A tensão oxigénio dissolvido (DOT) foi mantida automaticamente no nível programado (3%) através dum procedimento de dois passos. Primeiro, a taxa de fluxo de ar foi aumentada de 0,1 até 0,5 1 l”1 min”1 para satisfazer o aumento da carência de O2 da cultura. Se forem necessários outros aumentos, estes podem ser obtidos através do fornecimento de O2 puro até um máximo de 0,4 1 l”1 min”1. Durante as primeiras 12 horas de crescimento, foi mantido um fluxo constante de N2 e C02 igual a 0,2 1 l”1 min”1 e 0,02 1 l”1 min”1 respectivamente. A velocidade de agitação foi mantida a 130 rpm. O veio do agitador foi equipado com duas turbinas Rhuston com um diâmetro de 7 cm e 0 diâmetro do biorreactor foi de 17 cm. 13
Fornecimento de glucose.
Foi adicionada uma solução de glucose a 50% no tempo 0 para dar uma concentração final de 5 g/L. Outra adição de 5 g/L foi feita quando a DO estava no intervalo de 2-3.
Determinação da biomassa. O crescimento foi monitorizado por densidade óptica a 590 nm contra um branco de água (espectrofotómetro Perkin Elmer 35), percurso de luz de 1 cm. As verificações da pureza das amostras foram feitas por coloração Gram.
Análise da proteína VacA.
Em pontos de tempo determinado durante a fermentação, as amostras da cultura foram centrifugadas (Biofuge A, Heareus) a 8300 x g por 10 min. Os sobrenadantes foram precipitados com ácido tricloroacético e submetidos a SDS-Page a 9% usando um aparelho BioRad Mini Protean II. As proteínas foram transferidas para filtros de nitrocelulose (Schleicher & Schuell) e depois incubadas durante a noite com anti-soros policlonais desencadeados contra a proteína VacA (Telford, J.L. et al., (1994), J. Exp. Med., 179, 1653-1658). Após a incubação durante 2 horas com um anticorpo secundário conjugado com armorácia peroxidase (Sigma), as bandas imunorreactivas foram visualizadas por coloração com 4-cloro-naftol.
Resultados O Brucella Broth é um meio complexo composto por triptona 10 g l-1, peptamina 10 g l”1, dextrose 1 g l-1, extracto de levedura 2 g l-1, cloreto de sódio 5 g 1_1 e dissulfureto de sódio 0,1 g l-1. Este meio tem sido descrito em muitos artigos como capaz de 14 suportar o crescimento de H. pylori apenas quando suplementado com derivados sanguíneos (Cover, T.L. and Blaser, M.J. (1992), J. Biol. Chem., 267, 10570-10575; Shahamat, M. et al., (1991), J. Clin. Microbiol., 29, 2835-2837; Buck, G.E. and Smith, J.S. (1987), J. Clin. Microbiol., 25, 597-599; and Morgan, D.R. et al., (1987), J. Clin. Microbiol., 25, 2123-2125). Uma simplificação substancial do meio de crescimento de H. pylori foi obtida recentemente quando foi descoberto que as ciclodextrinas podem ser usadas em vez de derivados sanguíneos (Olivieri, R. et al., (1993), J. Clin. Microbiol., 31, 160-162). O crescimento de H. pylori usando este meio simplificado e fornecido com glucose está relatado na Figura 1. Os fornecimentos de glucose foram usados para garantir que a fonte de carbono e energia estava sempre presente no meio.
Quando a H. pylori foi posta em cultura nestas condições, a produção de VacA no meio foi medida como descrito acima. Os resultados estão apresentados na Figura 5 e Figura 6. O uso de Soytone e Hysoy no meio de crescimento deu os resultados relatados nas Figuras 2 e 3 respectivamente. A produção de VacA é relatada na Figura 5 quando Soytone foi usado e na Figura 6 quando Hysoy foi usado.
Os resultados apresentados mostram as melhorias do meio de crescimento e condições de fermentação do crescimento de Helicobacter pylori e na produção da citotoxina de vacuolização (VacA).
Exemplo II
As Haemophilus influenzae são bactérias menores, não móveis, gram negativas que são a maior causa de meningite bacteriana em crianças. Estes microrganismos são primeiramente mais invasivos 15 do que toxigénicos. São habitantes do tracto respiratório (comensais ou patogénicos) e têm cápsulas de polissacáridos anti-fagocitose.
Materiais e métodos
Estirpe bacteriana
Haemophilus influenzae B ATCC 10211
Meios e Suplementos A preparação dos meios envolve o uso de diferentes soluções como se segue:
Quantidade por litro
Preparaçao do "meio de Franz A' Componente
Agua purificada Ácido glutâmico Na2HP0412H20 KC1 NaCl NH4C1 Água purificada NaOH 3N
800 mL 1,6 g +/- 0,01 g 5,03 g +/-0,05 g 0,892 g +/-0,008 g 6,005 g +/-0,06 g 1,25 g +/- 0,01 g Q.b. para 1,0 litro o necessário para pH = 8,2.
Os componentes acima são dissolvidos com mistura. O NaOH 3N é usado para o pH da solução ser de pH = 8,2 16
Preparação de Soytone ultrafiltrado
Componente Quantidade por litro
Soytone 33,3 g +/-0,03 g Água purificada Q.b. para 1,0 litro
Esta solução foi ultrafiltrada através dum aparelho TFF de 30 kD.
Proteose-peptona ultrafiltrada
Componente Quantidade por litro
Proteose-peptona 33,3 g +/-0,03 g Água purificada Q.b. para 1,0 litro
Esta solução foi ultrafiltrada através dum aparelho TFF de 30 kD.
Preparação de YE ultrafiltrada
Componente Quantidade por litro
Extracto de levedura 100 g +/-0,02 g Água purificada Q.b. para 1,0 litro O extracto de levedura usado foi HY YEST disponível na Quest. A solução foi ultrafiltrada através dum aparelho TFF de 10 kD.
Solução de Glucose a 50%
Componente Quantidade por litro glucose (anidra) 500 g +/-5 g Água purificada Q.b. para 1,0 litro 17
Solução de NAD a 0,1 % Componente
Quantidade por litro NAD TRIS Água purificada HC1 37% 1,0 g +/ — 0, 005g 1,21 g +/-0,01 g Q.b. para 1,0 litro o necessário para pH 7,4 ± 0,2
Solução de Hemina a 0,4%
Componente Quantidade por litro
Hemina 4 g+/-0,02g
NaOH 0,2N Q.b. para 1,0 litro A hemina usada é preferivelmente sintetizada quimicamente. A hemina sintetizada quimicamente está comercialmente disponível na
Fluka.
Foram misturados 550 ml de Franz A com 450 ml de soytone ou Proteose-Peptona ultrafiltradas para obter 1 litro de meio Hib basal que foi esterilizado por autoclave a 121°C durante 30 minutos.
Após arrefecimento, foram adicionadas as soluções de glucose a 10 ml/L, de YE 20 ml/L, de NAD 2 ml/L, esterilizadas por filtração, (com as adições atrás mencionadas) e o meio chamou-se "meio de Hib Completo".
Crescimento em meios líquidos
Os frascos de agitação não reflectores pré-aquecidos (500/150) foram inoculados, cada um, com 1,0 mL de um frasco de base de trabalho. Os frascos de agitação foram colocados numa incubadora com agitação (1 polegada de oscilação) a 35 + /- Io C a 150 rpm durante 6 horas. 18
Após 6 horas, a quantidade apropriada do frasco de agitação foi transferida para dentro de um frasco de agitação não reflectores de 2 L litros com 0,5 L de "meio de Hib completo" pré-aquecido. O frasco de agitação foi colocado num incubador com agitação (1 polegada de oscilação) a 35 +/- Io C a 200 rpm durante 9 horas, depois o conteúdo foi transferido para dentro duma inoculação estéril e depois o inoculo transferido para o fermentador.
Vasos de cultura e condições de crescimento
As fermentações em batch foram realizadas em biorreactores de 30 litros (MBR Bioreactors AG, 8620 Wetzikon, CH) com 20 L de meio.
As culturas foram crescidas a 35°C e 2 psi de pressão de retorno. O pH foi controlado a 7,3 com NaOH 3 N. A taxa de agitação inicial foi programada para um mínimo de 150 rpm e o botão de arejamento a 10 L/minuto. A DOT foi mantida a 35% por controlo de rpm num intervalo de 150-400, depois suplementada com oxigénio se necessário. Foi adicionado um anti-espuma manualmente para controlar a formação de espuma. A concentração residual de glucose foi detectada e quando estava perto de 2 g/L, foram adicionados 0,2 litros de solução de glucose.
Determinação da biomassa. O crescimento foi monitorizado por densidade óptica a 590 nm contra um branco de água (espectrofotómetro Perkin Elmer 35), percurso de luz de 1 cm. As verificações da pureza das amostras foram feitas por coloração Gram. 19
Análise de Hib PS.
Esta análise foi realizada por electroforese imuno Rocket como descrito por Weeke, B., Scand. J. Immunol. 2, 37-46, (1973).
Resultados
As curvas de crescimento obtidas com Soytone e com Proteose-peptona são comparadas na Figura 7. 0 rendimento de Hib PS foi 600 mg/L e 150 mg/L nos meios com Soytone e Proteose-peptona respectivamente. Embora as curvas de crescimento sejam muito semelhantes para os dois meios, existe um aumento de quatro vezes no rendimento de Hib PS quando se usa Soytone. O uso do meio de cultura com o material proteico derivado de vegetais conduz a um aumento no rendimento de polissacáridos, tais como Hib PS, quando comparado com o uso de um meio de cultura com material proteico derivado de animais.
Exemplo III O Exemplo III não está incluído dentro do âmbito invenção e está incluído apenas com o fim de comparação.
As C. diphtheriae são microrganismos do tipo bastonete, gram positivas, que se dispõem em paliçadas. A lisogenização da C. diphtheriae por um bacteriófago causa a síntese de uma toxina potente cuja expressão é regulada pela concentração de ferro.
Materials e métodos
Estirpe bacteriana C. diphtheriae CN 2000 20
Meios e suplementos A preparação dos meios envolve o uso de diferentes soluções como se segue:
e Casaminoácidos Quantidade g/L 800 ml 20 g/L 10 g/L Q.b. para 1 L (CAA) A. Extracto de levedura (YE) Ultrafiltrados
Componente Água purificada Extracto de levedura Casaminoácidos Água purificada
Esta solução foi ultrafiltrada através de um aparelho TFF de 10 kD e o permeado adicionado ao vaso de desferrização. A.A Extracto de Levedura (YE) e Soytone Ultrafiltrados
Componente
Quantidade g/L
800 ml 20 g/L 10 g/L Q.b. para 1 L
Agua purificada Extracto de levedura Soytone Água purificada
Esta 10 kD e o solução foi ultrafiltrada através de um aparelho permeado adicionado ao vaso de desferrização. TFF de 21 A.B Extracto de Levedura Ultrafiltrado
Componente Quantidade g/L Água purificada 800 ml
Extracto de levedura 30 g/L
Água purificada Q.b. para 1 L
Esta solução foi ultrafiltrada através de um aparelho TFF de 10 kD e o permeado adicionado ao vaso de desferrização. A.l Desferrização
Os componentes seguintes foram introduzidos num vaso com agitação
Componente Quantidade
Solução UF (YE + CAA) KH2P04 CaCl2'2H20, 50% (m/v) L-triptofano, 1% (m/v) NaOH 3N 1 L 5 g/L 2 mL/L 5 mL/L (0,05 g/L) (suficiente para corrigir o pH para 7,4) UF indica que a solução é ultrafiltrada.
Aquecer a solução a 100 °C, com agitação. Manter a 100 °C durante 1 minuto, depois arrefecer o meio para 37 °C. A filtração pode começar logo abaixo de 37 °C. Após a filtração, o meio é descrito como "meio CY base com CAA". 22 A.l.A Desferrização
Os componentes seguintes foram introduzidos num vaso com agitação
Componente
Solução UF(YE+Soytone) KH2P04
CaCl2'2H20, 50% (m/v) L-triptofano, 1% (m/v) NaOH 3N
Quantidade
TT
5 g/L 2 mL/L 5 mL/L (0,05 g/L) (suficiente para corrigir 0 pH para 7,4)
Aquecer a solução a 100°C, com agitação. Manter a 100 °C durante 1 minuto, depois arrefecer o meio para 37 °C. A filtração pode começar logo abaixo de 37 °C. Após a filtração, o meio é descrito como "meio CY base com Soytone". A.l.B Desferrização
Os componentes seguintes agitação
Componente Solução UF (YE) KH2PO4
CaCl2'2H20, 50% (m/v) L-triptofano, 1% (m/v) NaOH 3N foram introduzidos num vaso com Quantidade
1 L
5 g/L
2 mL/L 5 mL/L (0,05 g/L) (suficiente para corrigir 0 pH para 7,4)
Aquecer a solução a 100 °C, com agitaçao. Manter a 100 °C durante 1 minuto, depois arrefecer 0 meio para 37 °C. A filtração 23 pode começar logo abaixo de 37 °C. Após a filtração, o meio é descrito como "meio CY base apenas com YE". B. Solução de "suplementos"
Bl) Solução A
Componente MgS04'7H20 Beta-alanina Ácido nicotinico Ácido pimélico CuS04
Quantidade por litro 225 g 1.15 g 1.15 g 0,075 g 0,50 g
ZnS04'7H20 0, 40 g
MnCl2'4H20 0,15 g
HC1 37% 30 mL
Agua purificada Q.b. para 1,0 litro
B2) Solução B
Componente Quantidade por litro
Água purificada 800 mL L-cistina 200 g
HC1 37% 200 mL
As soluções são misturadas individualmente durante 10 minutos. Após a dissolução, são misturadas e filtradas 20 mL da Solução A e 10 mL da Solução B através dum filtro de 0,2 microns. A solução é armazenada a 4 °C protegida da luz. 24
Esterilização dos Frascos
Uma vez desferrados, os meios filtrados (A. ou A.l.A ou A.l.B) são carregados para dentro dos frascos. Esterilizar os frascos durante 25 minutos a 121 °C.
Ajustamentos pós-esterilização
1. Adição de “Maltose a 50%" 30 ml/L
2. Adição de “Suplementos" 3,0 ml/L
Meios com 1 + 2 acima: “Meio CY completo com CAA ou com
Soytone ou com apenas YE"
Crescimento em meios líquidos
Os frascos de agitação não reflectores de 500 ml cada um com 100 ml de meio foram inoculados com 1,0 mL de um frasco de base de trabalho.
Os frascos de agitação foram colocados numa incubadora com agitação (1 polegada de oscilação) a 35 +/- 1°C C a 100 rpm durante 5 horas. Após 5 horas, a agitação é aumentada para 250 rpm durante 43 horas. O processo tem duas fases distintas: 1) crescimento exponencial, e 2) fase de produção. A transição a partir das duas fases é gradual e é marcada por reduções na taxa de crescimento celular e carência de oxigénio.
Determinação da biomassa. O crescimento foi monitorizado por densidade óptica a 590 nm contra um branco de água (espectrofotómetro Perkin Elmer 35), percurso de luz de 1 cm. As verificações da pureza das amostras foram feitas por coloração Gram. 25
Resultados
Após 48 horas de incubação, a DO e a Lf/ml nos frascos foram: meio com CAA. DO = 7,5 Lf/ml = 50 meio com Soytone. DO = 7,87 Lf/ml = 60 meio apenas com YE DO = 8,07 Lf/ml = 60
Exemplo IV 0 Exemplo IV não está incluído dentro do âmbito invenção e está incluído apenas com o fim de comparação.
As Neisseria meningitidis são cocos não móveis gram negativos, a maior parte cresce geralmente aos pares e ocasionalmente em tétradas ou aglomerados. Têm cápsulas polissacáridas anti- -fagocíticas que são a base para os serogrupos.
Materiais e métodos
Estirpes bacterianas
Neisseria meningitidis. Cll
Meios e suplementos A preparação dos meios envolve o uso de diferentes soluções como se segue:
Preparação do "meio de Franz"
Preparação do Meio de Inoculo do Frasco de Agitaçao 26
Componente
Quantidade por litro
Água purificada 800 mL Ácido glutâmico 1,6 g
Na2HP042H20 15,5 g KC1 NH4C1 0,09 g 1,25 g Água purificada Q.b. para 1,0 litro
NaOH 3N o necessário para pH = 7,6
Dissolver os componentes acima com agitação. Esterilizar por autoclave a 121 °C, 30 minutos. Após o arrefecimento, foram adicionados "Glucose a 50%" e "Suplementos de Men C" como abaixo. "Glucose a 50%"
10 mL/L + /- 0,3 mL "Suplementos de Fermentação 20 mL/L +/- 0,3 mL de Men C"
Com a adiçao das soluções de glucose e de suplementos, o meio pode ser chamado de "meio Completo de Franz". Preparação do fermentador de 20 L A. Os componentes seguintes devem ser introduzidos num vaso de mistura e dissolvidos para criar 20 L de meio base de Watson com CAA:
Componente
Quantidade por litro
Agua purificada 800 mL Ácido glutâmico 1 g +/-0,01 g
Na2HP042H20 KC1 3,25 g +/-0,03 g 0,09 g +/—0,001 g 27
Casaminoácidos Água purificada NaOH 3N 10 g + /-0,1 g Q.b. para 1,0 litro o necessário para pH = 7,6 A.A Os componentes seguintes devem ser introduzidos num vaso de mistura e dissolvidos para criar 20 L de meio base de Watson com Amisoy:
Componente Água purificada Ácido glutâmico Na2HP042H20 KC1 Amisoy Água purificada NaOH 3N
Quantidade por litro 800 mL 1 g +/ — 0,01 g 3,25 g +/-0,03 g 0,09 g +/-0,001 g 10 g +/ — 0,1 g Q.b. para 1,0 litro o necessário para pH = 7,6 B. Esterilização do Fermentador
Esterilizar o fermentador durante 25 minutos a 121 °C. Após a esterilização, configurar as condições seguintes: temperatura, 35 °C; arejamento a 10 L/minuto; agitação a 150 rpm, e pressão de retorno a 0,2 bar. Após o arrefecimento do fermentador para 35 °C, e tomar uma amostra para medir o pH, ajustar a calibração da sonda de pH do fermentador e depois ajustar o pH do meio para 7,6. C. Ajustamentos pós-esterilização
1. Adicionar "Glucose a 50%" 10 ml/L 2. Adicionar "Suplemento de Men C" 20 ml/L Meio com 1+2 acima: "meio Completo de Watson" 28 A. Solução de "Glucose a 50%"
Componente Quantidade por litro glucose (anidra) 500 g +/-5 g Água purificada Q.b. para 1,0 L Esta solução é esterilizada por autoclave a 121 °C durante 30 minutos. B. Solução de "suplementos de Men C" B.l YE Ultrafiltrado
Componente Quantidade
Água purificada Q.b. para 1 L
Extracto de levedura 125 g/L
Esta solução é ultrafiltrada através dum aparelho TFF de 10 kD. O retentado é rejeitado após o permeado pretendido ter sido recolhido, e o permeado é adicionado ao vaso com o suplemento. B. 2
Componente Quantidade por litro de UF YE
MgS047H20 30 g +/-0,5 g L-cisteina-HCl 1,5 g +/-0,2 g
Adicionar os químicos a 1 L de UF YE, misturar durante 10 minutos, esterilizado por filtração através dum filtro de 0,2 micron e transferir para o fermentador.
C. NaOH 3 N
NaOH 3 N = 12 % (m/v) NaOH = 120 g/L de NaOH 29 D. Anti-espuma A anti-espuma usada é Dow Corning 1510. É esterilizada por autoclave a 121 °C durante 30 minutos
Crescimento em meios líquidos
Um frasco de 500 mililitros é inoculado com 1,0 mL dum frasco de base de trabalho. O frasco de agitação contém 150 mL do "meio de Franz" completo. O frasco de agitação inoculado é colocado numa incubadora com agitação (1 polegada de oscilação) a 35 +/-1 °C C a 150 rpm. Após 10 horas, o frasco tem uma amostragem asséptica. A densidade óptica deve ser entre 1,3-3,3 (a 590 nm) se assim for, os quatro frascos de agitação de 2 L são cada um inoculados com o volume apropriado a partir do frasco de agitação de 150 mL.
Cada frasco de agitação de 2 L contém 0,2 L do "meio Completo de Franz" pré-aquecido.
Os frascos de agitação são colocados numa incubadora com agitação (1 polegada de oscilação) a 35 +/-1 °C C a 200 rpm. Após 10 horas, os conteúdos de cada frasco de agitação são transferidos para dentro do jarro de inoculação estéril e inoculam o fermentador.
Vaso de cultura e condições de crescimento
As fermentações em batch foram realizadas em biorreactores de 30 litros (MBR Bioreactors AG, 8620 Wetzikon, CH) com 20 L de meio.
As culturas foram crescidas a 35°C e 14xl03 N/m2 (2 psi) de pressão de retorno. O pH foi controlado a 7,3 com NaOH 3 N. A taxa de agitação inicial foi programada para um mínimo de 150 rpm e o botão de arejamento a 10 L/minuto. A DOT foi mantida a 35% 30 por controlo de rpm num intervalo de 150-400, depois suplementada com oxigénio se necessário. Foi adicionado um anti-espuma manualmente para controlar a formação de espuma. A concentração residual de glucose foi detectada e quando estava em torno de 2 g/L, foram adicionados 0,2 litros de solução de glucose.
Determinação da biomassa. O crescimento foi monitorizado por densidade óptica a 590 nm contra um branco de água (espectrofotómetro Perkin Elmer 35), percurso de luz de 1 cm. As verificações da pureza das amostras foram feitas por coloração Gram.
Análise de MenC PS.
As estimativas quantitativas dos polissacáridos foram realizadas por análise do conteúdo em ácido siálico de acordo com o método relatado em Biochimica and Biophysica Acta (1957), 21, 610, por Lars Svennerholm.
Resultados
As curvas de crescimento obtidas com Amisoy e com Casaminoácidos são comparadas na Figura 8. O rendimento de MenC PS foi 307 mg/L e 345 mg/L nos meios com Amisoy e Casaminoácidos respectivamente. As curvas de crescimento e produção de PS são bastante semelhantes usando os dois meios.
Exemplo V O Exemplo V não está incluído dentro do âmbito invenção e está incluído apenas com o fim de comparação. 31 0 Clostridium tetani é um bacilo delgado que mede 2 μηι de comprimento e 0,3-0,5 μιη de largura. Geralmente existe na forma de uma célula filamentosa bastante longa. Quando se formam os esporos, o bacilo assume a aparência característica de baquetas. É um organismo móvel, gram positivo, mas a sua coloração gram pode variar ou mesmo negativa em culturas mais velhas. O Clostridium tetani é um anaeróbio estrito e produz duas exotoxinas. Uma dessas, a espasmina do tétano, é uma neurotoxina responsável pelo quadro clinico completo da doença.
Materiais e métodos
Estirpe bacteriana
Clostridium tetani Harvary Y-VI-3.
Meios
As culturas de enriquecimento relatado abaixo expresso em g/L: Componente N-Z Soy Glucose
Extracto de levedura NaCl L-Cisteína
Tioglicolato de sódio Agar PH = 7,1 foram preparadas usando o meio
Quantidade g/L 15, 0 5.5 5, 0 2.5 0,5 0,5 0, 75 32
Os meios de produção foram preparados como modificações do meio de Mueller-Miller descrito em WHO/VSQ/GEN/94 (1990). Neste meio, são usados infusão de coração e carne e solução de caseína, no meio modificado relatado abaixo, expresso em g/L, foram usados Hysoy e Soytone em vez da infusão de coração e carne e solução de caseína:
Componente Quantidade g/L
Glucose-H20 12,1 NaCl 2,5 Na2HP04-12H20 2,5 kh2po4 0,15 MgS04-7H20 0,15 Solução de aminoácidos 17,5 ml Solução de vitamina 4,2 ml NaOH 5M 4,0 ml FeS04-7 H20 (sol. a 1%) 4,0 ml Derivados de soja 20.0 PH = 7,3
Esterilizado por autoclave a 120°C durante 20 min
Solução de aminoácidos:
Componente
28,51 g/L 0,142 g/L 14,25 g/L 131,6 ml/L L-Tirosina
Uracil- L-Cisteína- HC1 37% 33
Solução de vitaminas:
238,1 mg/L 59.7 mg/L 59.7 mg/L 59.7 mg/L 0, 73 mg/L 256,4 ml/L
Componente Pantitenato de Ca Tiamina Piridoxina Riboflavina Biotina Etanol
Crescimento em meios líquidos
Dois tubos de 25 ml, com 15 ml de meio de enriquecimento, foram inoculados com 0,5 ml cada frasco de enriquecimento de trabalho e incubados a 35°C durante 29 h em jarras de anaerobiose onde foi usado um kit de produção gás (OXOID). Uma segunda série de tubos foi inoculada com 1,5 ml dos primeiros tubos e incubados nas mesmas condições relatadas acima durante 24 h. 7 ml destas culturas foram usados para inocular tubos de 100 ml com 75 ml do mesmo meio. Estes tubos foram incubados nas mesmas condições relatadas acima durante 24 h. O conteúdo total destes tubos foi usado para inocular copos de 5000 ml com 2500 ml do meio de produção.
Determinação da biomassa O crescimento foi monitorizado por densidade óptica a 590 nm contra um branco de água (espectrofotómetro Pharmacia), percurso de luz de 1 cm. As verificações da pureza das amostras foram feitas por coloração Gram. 34
Resultados
Após 186 horas de incubação, a DO e a Lf/ml nos copos foram:
Meio com Hysoy Meio com Soytone Meio com infusão coração e solução DO = DO = de carne e DO = de caseína 1,08 Lf/ml = 60 0, 74 Lf/ml = 60 1,236 Lf/ml = 60
Exemplo VI 0 Exemplo VI não está incluído dentro do âmbito invenção e está incluído apenas com o fim de comparação. A Bordetella pertussis é um cocobacilo gram negativo de cerca de 0.5 μιτι de diâmetro e 0,5 a 2 fim de comprimento. As suas necessidades nutricionais são simples, e não utiliza açúcares. É extremamente sensível a ácidos gordos e sobrevive com dificuldade sem factores de protecção.
Materiais e métodos
Estirpe bacteriana
Bordetella pertussis 9K/129G (Pizza, M., et al. (1989) Science, 246, 497-500).
Meios
As culturas de enriquecimento e produção foram preparadas usando meio CL (Imaizumi, A., et al. (1983) Infection and Immunity, 41 (3), 1138-1143) relatado abaixo expresso em g/L: Componente Quantidade g/L L-glutamato de sódio 10,7 L-prolina 0,24 35
NaCl 2,5 KH2P04 0,5 KC1 0,2
MgCl2 - 6H20 0,1
CaCl2 0,02
Tris 6,1 1 L-Cisteina* 0,04
FeS04 - 7 H20* 0,01
Niacina* 0,004
Glutationa reduzida* 0,15 Ácido ascórbico* 0,4
Casaminoácido 10,0
Dimetil-B- 1.0 ciclodextrina pH ajustado para 7,6 com HC1. * esterilizado por filtração e depois adicionado assepticamente ao meio autoclavado. O meio modificado com 10 g/1 de N-Z soy em vez de
Casaminoácido.
Crescimento em meios líguidos
Os frascos de agitação não reflectores de 500 ml, cada um com 100 ml de meio CL ou o modificado, foram inoculados com 3,0 mL de um frasco de base de trabalho.
Os frascos de agitação foram colocados numa incubadora com agitação (1" de oscilação) a 35 +/- 1°C C a 100 rpm durante 12 horas. Após 12 horas, a agitação foi aumentada para 250 rpm durante mais 16 horas. 36
Determinação da biomassa 0 crescimento foi monitorizado por densidade óptica a 590 nm contra um branco de água (espectrofotómetro Pharmacia), percurso de luz de 1 cm. As verificações da pureza das amostras foram feitas por coloração Gram.
Análise de PT
Esta análise foi realizada por ELISA (Nencioni, L., et al. (1990) Infect. Immun., 58, 1306-1315.
Resultados
Após 28 horas de incubação, a DO e a PT (mg/L) nos frascos foram:
Meio com CAA. DO = 2,31 PT = 2,4 mg/L
Meio com NZ-soy. DO = 1,99 PT = 2,25 mg/L
Lisboa, 4 de Dezembro de 2007 37
Claims (2)
- REIVINDICAÇÕES 1. Um processo para preparar um factor imunogénico de uma bactéria patogénica, caracterizado por compreender os passos de: a) cultivar Haemophilus influenzae num meio gue compreende pelo menos 20% por peso seco de um material proteico não derivado de animais e gue não compreende material proteico derivado de animais, caracterizado por o material proteico não derivado de animais ser uma composição de proteína derivada de grãos de soja; e b) opcionalmente purificar o factor imunogénico a partir do meio.
- 2. Um processo para a produção de uma vacina, caracterizado por compreender a preparação de um factor imunogénico de uma bactéria patogénica, através do processo da reivindicação N°.l, e produzindo o referido factor, opcionalmente destoxifiçado, em associação com um transportador farmaceuticamente aceitável. Lisboa, 4 de Dezembro de 2007 1
Applications Claiming Priority (2)
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