PT97397B

PT97397B - Processo para a preparacao de penicilina g acilase e de genes que a codificam

Info

Publication number: PT97397B
Application number: PT97397A
Authority: PT
Inventors: Wilhelmus Johannes Quax
Original assignee: Gist Brocades Nv
Priority date: 1990-04-18
Filing date: 1991-04-18
Publication date: 1998-08-31
Also published as: EP0453047A1; DE69110952D1; JPH04228073A; IE68078B1; EP0453047B1; DE69110952T2; IE911294A1; DK0453047T3; PT97397A; ES2077151T3; US5168048A; ATE124724T1; US5695978A; KR0152667B1; KR910018550A

Description

ÂMBITO TÉCNICO

Esta invenção refere-se a um gene que codifica a penicilina G acilase, a penicilina G acilase codificada por es. te gene e a um processo para a preparação desta enzima.

ANTECEDENTES E LITERATURA RELEVANTE

A penicilina G acilase (benzllpenicilina amido hidrolase, também designada por penicilina amidase; EC 3.5.1.11) é uma enzima utilizada comercialmente para hidrolisar a penicili na G ou a 3-desacetoxicefalosporina G para ãcido fenilacêtico e ãcido 6-aminopenicilânico (6-ΑΡΆ) ou ãcido 7-aminodesacetoxicefa losporãnico (7-ADCA), respectivamente, e os seus intermediários mais importantes para a produção industrial de penicilinas e cefalosporinas semisintêticas. Esta enzima também catalisa a reacção inversa, isto ê, a N-acilação de 6-APA e 7-ADCA com ésteres orgânicos para produzir os compostos correspondentes N-acetilados de penicilina e 3-cefem, respectivamente. Ver as revisões de Vandamme, E.J., em: Microbial Enzymes and Bioconversions, e E.H. Rose (Ed.), Economic Microbiology 5^, 467-552 (1980); e P.B.Maha1 jan, Appl. Biochem. Biotechnol. 1, 83-86 (1982).

Têm sido proporstos vários tipos de microorganismos na literatura como estirpes que produzem Penicilina G aci lase úteis para a desacilação da penicilina G e 3-desacetoxicefa losporina G. Exemplos desses microorganismos produtores de acila se são certas estirpes das espécies Escherichia coli, Kluyvera citrophila e Proteus rettgeri deve ter-se em conta que alguma da actividade da penicilina F acilase foi descrita em fracções de células inteiras de Alcaligenes faecalis (C.A. Claveridge e col.

, Nature 4733, 237-238 (1960). Contudo, não foi descrita ate ago ra uma enzima ou enzimas responsáveis por esta actividade de A. faecalis

A utilização dos processos de ADN recombinantes têm permitido um aumento dos níveis de produção das penicili^ nas G acilases comercialmente utilizadas (Mayer e col., Adv. Bio technol. 1, 83-86 (1982) e alargou a compreensão do processamento destas enzimas (Schumacher e col., Nucleic Acids Res. 14,57135727 (1986), Verificou-se que a penicilina G acilase de E. coli era produzida como uma grande proteína precursora, que foi ainda processada para a proteína madura periplãsmica constituindo uma subunidade pequena (<£) e uma grande ( β) . A clonação e a sequenci ação do gene da acilase de Kluyvera citrophila revelou uma harmo nia coerente com o gene da acilase de E. coli (J.L. Barbero e col., Gene £9, 69-80 (1986)). Também para o gene da penicilina G acilase de Proteus rettgeri foi descrita uma subunidade pequena e uma grande (G.O. Daumy e col., Gene 49., 69-80 (1986); pedido de patente Espanhola No. 8602933).

RESUMO DA INVENÇÃO

Num dos aspectos da invenção ê proporcionado um gene que codifica a penicilina G acilase que tem essencialmen te a estrutura dada na Figura 1. O gene ê preferivelmente obtido de A. faecalis.

Noutro aspecto da invenção ê proporcionado um vector compreendendo o referido gene. Também ê proporcionado um sistema hospedeiro que compreende uma ou mais copias do referido gene.

A invenção proporciona ainda o referido gene de penicilina G acilase sob o controlo de um regulão compreenden do sequências de regulação de transcrição e/ou translacção em que as referidas sequências reguladoras são substituídas por outras sequências de regulação de transcrição e/ou translacção. Es_ tas últimas sequências de regulação podem ser obtidas a partir do mesmo ou de outro organismo.

A presente invenção proporciona ainda um vectoi compreendendo este gene de penicilina G acilase, manipulado em relação âs sequências de regulação tal como acima indicado, e um hospedeiro compreendendo o referido vector. A enzima de penicili na G acilase, resultante da expressão do referido gene tem uma estabilidade surpreendentemente boa e uma elevada actividade específica.

Em ainda outro aspecto da invenção ê proporcio nada a referida enzima de penicilina G acilase numa forma isolada. Quando utilizada em processos de acilação ou desacilação em grande escala ela é preferivelmente utilizada na forma imobiliza da.

A presente invenção proporciona ainda um processo para a preparação da penicilina G acilase por fermentação de um hospedeiro transformado codificando a referida enzima, e a recuperação da penicilina G acilase na forma isolada.

Estas e outras realizações serão descritas e seguir com maior detalhe.

Breve descrição das figuras

Figura 1: mapa físico da região do gene de A. faecalis penicilina G acilase. É representada a inserção de pAFl.

Figura 2: Estrutura do plasmídeo pMcTNde

Figura 3: Estrutura do plasmídio pMCTAFlA

Figura 4: Estrutura do promotor tac

Figura 5: Estrutura do promotor trp

Figura 6: Estrutura do plasmídio pKTAFA

Figura 7: Estrutura do promotor p78

Figura 8: Estrutura do promotor pf3

- 3 u..^7’?^rRgg; ........ ,_r ,x'>

Breve descrição das Listas de Sequências

Lista de sequências 1: Sequências de nucleêtidos do gene de peni cilina G acilase de A. faecalis e sequência derivada de aminoãci dos da nova enzima pac..

Lista de sequências 2: Sequência de nucleêtidos do promotor tac Lista de sequências 3: Sequências de nucleotidos do promotor trp Lista de sequências 4: Sequência de nucleotidos do promotor p78 Lista de sequências 5: Sequência de nucleotidos do promotor pf3

Realizações especificas

A nova enzima penicilina G acilase de Alcalige nes faecalis (pac) pode ser isolada de forma conhecida: por exem pio, faz-se a cultura de uma estirpe de A. faecalis num meio de cultura adequado, consistindo por exemplo de extracto de fungo numa solução tamponada, em particular um tampão de fosfato a um valor de pH de cerca de 6 a 8, em particular cerca de 7, opcional mente na presença do indutor KPA. Pode ser utilizada qualquer es tirpe de A. faecalis. A enzima ê em seguida purificada por um pro cesso conhecido, de preferência em duas fases, a primeira com, por exemplo, uma celulose esterifiçada e posteriormente a aplica ção de por exemplo, cromatografia de gel, aplicando em particular hidroxiapatite.

A enzima purificada pode ser submetida a uma análise de sequência de aminoãcidos dos fragmentos de pêptidos, preferivelmente no terminal NE^-de cada uma das subunidades. A partir da sequência de aminoãcidos determinada pode ser derivada uma sonda de ADN para detectar a sequência de genes. Foi estabelecido pela primeira vez que a actividade hidrolisante da penici lina de A. faecalis reside na penicilina acilase purificada, que parece ser um heterodxmero com duas subunidades de 26 kD e 59 kD de tamanho.

gene de A. faecalis pac pode ser identificado a partir do ADN cromossêmico de forma conhecida. 0 gene possui essencialmente uma estrutura como a que se mostra na Figura 1. Deve entender-se que todos os genes homólogos que podem hibridi- 4 τ Τ

...jX α»*¹ zar com a sequência referida na Figura 1 e que codificam uma enzima com essencialmente a mesma estrutura estão englobados nesta invenção. A seguinte equação, que foi derivada da analise da influência de diferentes factores na estabilidade do híbrido: Tm = = 81 + 16,6 (lOg 10 Ci) + 0,4 (% G + C) - 600/n - 1,5% de incoerência (Ausubel et col., supra)em que

n = comprimento da cadeia mais pequena da sonda

Ci = força iõnica (M)

G + C = composição de base, pode ser utilizada para determinar o nível de homologia que pode ser detectado utilizando as técnicas de hibridação de ADN-ADN.

Assim o termo essencialmente com a estrutura pretende englobar sequências que podem incluir mutações conserva tivas, em que a sequência codifica o mesmo aminoácido, mas que podem diferir atê 35% na sequência de ADN de acordo com a equação anterior, mais particularmente atê 10%.

Uma comparação da homologia da sequência de aminoacidos da nova enzima A. faecalis pac com a sequência de ami noãcidos publicada de E. coli penicilina G acilase (Schumacher e col., supra) revelou uma homologia global de apenas 43%. Além disso, a homologia da sequência de aminoácidos conhecida da enzi ma de Kluyvera citrophila pac (Barbero e col., supra) ê também de apenas 44%.

gene de A. faecalis pac pode ser expresso em

E. coli com a ajuda do seu prõprio promotor e/ou do promotor indutível tac ou trp (ver Figuras 4 e 5). Os resultados da produção de penicilina G acilase são surpreendentemente bons. Utilizando este gene pac com o promotor tac a produção ê tão elevada como a que se obtem com a estirpe original de A. faecalis, enquanto que no último caso ê necessário uti-lizar fenil acetato de potássio como indutor. A estirpe E. coli com o gene A. faecalis tac sob o controlo do promotor trp mostra, sem qualquer indução, uma produção de penicilina G acilase de até cinco vezes maior do que as estirpes acima mencionadas. Em ambas as estirpes a dependência da indução utilizando um indutor de fenil acetato de potã ssio, que ê caro, pode agora ser evitada.

Para se obter uma estirpe de produção com apenas ADN homólogo, foi desenvolvida a transformação na própria A. faecalis. A transformação em ADN com sucesso em A. faecalis pode ser adequadamente conseguida por dois processos diferentes. Em primeiro lugar, pode ser obtida a transferência de conjugação de plasmídeos com uma larga gama de hospedeiros de E. coli para A. faecalis. Em segundo lugar, pode ser utilizada a electroporação de A. faecalis com plasmídeos baseados no replicão RSF 1010 (pul sador de genes BIORAD).

Após clonação do gene de A. faecalis podem ser utilizadas diferentes sequências de transcrição. Em primeiro lugar, o gene pac de A. faecalis pode ser clonado em A. faecalis sob o controlo do seu próprio promotor. A produção de penicilina G acilase ê muito melhorada quando comparada com a estirpe de A. faecalis sem genes pac extra e pouco dependente da indução por fenil acetato de potássio. Em segundo lugar, a utilização do pro motor E. coli trp, independentemente de qualquer indutor, conduz a uma quantidade semelhantemente elevada de penicilina G acilase Em terceiro lugar, por aplicação dos dois elementos de expressão derivados de Pseudomonas aeruginosa fago pf3, promotores pf3 e p78, (Luiten tese de PhD, Nijmegen (1986)), a produção de penici lina G acilase ê um pouco inferior do que a que se consegue com a estirpe de A. faecalis com genes pac extra sob o controlo de si própria ou do promotor de E. coli trp, mas ê ainda melhorada quando comparada com a estirpe de A. faecalis sem genes pac extra e ê muito menos dependente da indução por fenil acetato de potássio.

A técnica anterior não ensina a utilização de A. faecalis para produzir penicilina G acilase na forma isolada. Também não foram referidos na técnica anterior até agora as propriedades superiores da nova enzima A. faecalis penicilina G aci lase relacionadas com as de E. coli ou a utilização de processos de ADN recombinante para aumentar e facilitar a produção de peni cilina G acilase a partir de A. faecalis.

A penicilina G acilase, produzida com o auxílio do gene A. faecalis pac, clonada em particular num microorganismo gram-negativo, de preferência num microorganismo Alcaligenes ou Escherichia, mais preferivelmente em A. faecalis, é pro

-- -,». ·-.

,,χ duzida em quantidades surpreendentemente elevadas. Alem disso, a estabilidade e especialmente a actividade específica do gene de penicilina G acilo ê muito superior â das penicilinas acilases até agora conhecidas.

É também proporcionada uma preparação purifica da de A. faecalis, que revela uma maior actividade específica desta enzima no substrato preferido de penicilina G de qualquer das penicilinas acilases atê agora conhecidas. Além disso a preparação purificada ê utilizada para determinar a termoestabilida de de A. faecalis penicilina G acilase em comparação com a E. co li penicilina acilase. A estabilidade de A. faecalis penicilina G acilase é significativamente superior â da E. coli penicilina G acilase, permitindo uma utilização prolongada em condições industriais.

fios processos industriais, ê utilizada de preferência na forma imobilizada a penicilina G acilase, e também a proporcionada pela presente invenção. 0 veículo em que ela é imo bilizada compreende tipocamente gelatina opcionalmente recticula da com chitosano, óxido de alumínio, óxido de silício, resinas de permuta iónica ou pérolas de acrilato, como por exemplo Euper . , R git .

Os seguintes exemplos ilustram melhor a presen te invenção.

MATERIAIS E PROCESSOS

Clonação e detecção dos genes de acilase

Foram seguidas as técnicas gerais de clonação da forma descrita por Maniatis e col. (1982 e 1989, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory ou Ausubel e col. (1987, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons Inc. New York) ou B. Perbal (1988, A Practical Guide to Molecular Cio ning, 2a. edição, John Wiley and Sons Inc., Nova Iorque).

Estes livros de texto descrevem em detalhe os protocolos para a construção e propagação das moléculas de rADN, es procedimentos para preparar bibliotecas de genes e os protoco los para efectuar a mutação de ADN de forma dirigida a locais ou cfeatórias. As enzimas utilizadas para as manipulações de ADN fo7 ram adquiridas e utilizadas de acordo com as instruções dos fornecedores comerciais. Os plasmídeos e hospedeiros de clonação de E. coli foram obtidos de colecções de culturas públicas como por exemplo a Phabagen Collection (Utreque).

Meios

Os meios selectivos para a fenilaeetil L-leuci na (fal) foram preparados da forma jã descrita (Garcia e col., ibid). As placas mínimas são as seguintes: M63 de agar mínimo, 2 g/1 de glicose, 1 mg/1 de tiamina, 10 mg/1 de L-prolina e o anti biõtico adequado (50 jug/ml de cloroanfenicol (cap) ou 25 /<g/ml de ampicílina (amp.) Os transformantes de E. coli HB101 (Leu ) que cresciam exclusivamente na presença da acil L-leucina são considerados como contendo um gene de acilase.

Meio E* mínimo:

g/1 de agar Difco, elementos de esporos

0.2 g/1 de MgSO^. 711^0, 10 g/1 de KH^PC^, 3.5 g/1 de Na (nh₄)hpo₄,

1.6 g/1 de citrato de sódio.

meio 4xLBC:

Extracto de levedura 20 g/1, bactotriptona 40 g/1, NaCl 10 g/1, casaminoãcidos 4 g/1, basildon 0.25 g/1 (antiespu mante 86-013, Basildon Chemical Corporation), pH 7.0.

Meio (Alcaligenes faecalis):

Extracto de levedura 15 g/1, Νη₂ΗΡΟ₄.2Η₂Ο 4.5 g/1, KE^PC^

3.4 g/1, pH 7.0 (no caso de indução: potássio ãcido fenil acético (KPA) 1.0 g/1)

Meio 2xTY:

g/1 de bactotriptona, 10 g/1 de extracto de levedura, 5 g/1 de NaCl.

A fenilacetilleucina foi adquirida de LGSS, Transferbureau Nijmegen.

A A. faecalis estirpe ATCC 19018 (também deposi tada como nctc 415) foi utilizada como estirpe dadora para, o gene de A. faecalis pac, e como hospedeiro para plasmídeos recombinan8

tes.

As estirpes JM101, WK6 e HB1O1 de E. coli (Pha bagen, Utreque) foram utilizadas como hospedeiros para os plasmí deos recombinentes.

Exemplo 1

Purificação e caracterização de A.faecalis penicilina acilase

A A. faecalis, estirpe ATCC 19018, foi cultiva da num meio AF. As células foram recolhidas por centrifugação e ressuspensas no seguinte tampão: Tris 0,1 M pH 8,0; EDTA 0,2 mM; lisozima 0,02 mg/ml e incubadas durante 2 horas a 30°C. Foram re movidos os resíduos celulares por centrifugação.

A penicilina G acilase (pac) foi purificada em duas fases. A primeira fase foi efectuada com carboximetil celulose (CM-52 Whatman). A segunda consistia na eliminação das proteínas de contaminação restantes através de cromatografia de gel de hodroxiapatite (Biogel HTP de Biorad). A pac pura resultante mostrou ser constituida por duas subunidades não idênticas. A subunidade pequena (Λ-) e a grande (/3) foram submetidas a uma anã lise de aminoácidos de terminal NH2. O resultado obtido foi o se guinte:

subunidade (26 KDa) NH -Q-X-Q-X-V-E-V-M-X-T

Aà subunidade (59 KDa) NH₂“S-N-L-W-S-T-X-P-E-X-VExemplo 2

Clonação do gene de A. faecalis penicilina aci lase

Foi isolado o ADN cromossômico de A. faecalis (ATCC 19018) e parcialmente digerido com Sau3A. As fracções que variavam de 4 kb atê 7 kb foram purificadas ligadas ao vector pACYl84, que foi digerido com BamHI. O ADN foi transformado em E. coli HB101 e colocado em placas de fal (ver os processos). Podiam ser identificados dois clones positivos pAFl e pAF2. Es• tes clones foram também ensaiados com resultados positivos na . técnica de sobreposição de Serratia marcescens (Meevootison, V.

e col., Appl. Microbiol. Biotechnol, 25, 372-378 (1987). A inser ção de 6,4 kb do plasmídio pAFl é apresentada na Figura 1. A localização do gene foi determinada com o auxílio de um oligonucle õtido concebido na sequência do terminal NI^ da subunidade- /3 de A. faecalis pac.

Foi utilizado o seguinte oligonucleõtido como sonda de hibridização na inserção de pAFl:

AGC AAC CTG TGG AGC A/C C/G C TGC CCG GAG TGC GT

A partir da posição do sinal de hibridização no mapa de restrição foi determinada a orientação do gene de A. faecalis pac (Figura 1).

Exemplo 3

Determinação da sequência de A. faecalis penicilina acilase subclone de 3,9 kb de Sau3A-NdeI da inserção de 6,4 kb, revelou ter a actividade pac, enquanto que o fragmento de 3,1 kb de Sau3A-Sphl era inactivo (Figura 1). A sequência de ADN da inserção de 3,9 kb foi determinada por sequenciação de desoxi dos fragmentos adequados em pTZ18R a pTZ19R (Pharmacia).

A sequência de ADN codificante e a sequência de aminoãcidos derivada para A. faecalis pac ê mostrada na Lista de sequências 1.

A partir da sequência de aminoãcidos derivada pode concluir-se que o A. faecalis pac ê codificado como uma cadeia única e grande de polipéptidos que sofre o processamento em duas subunidades diferentes designadas por oC e β . No ponto 5’ do precursor apre senta-se uma sequência de sinal típica responsável pela translocação da enzima para o periplasma.

Exemplo 4

Expressão de penicilina acilase em E. coli

Foi digerido o plasmídio pAFl com Sall e foi purificado um fragmento de 4,8 kb. 0 fragmento foi ligado a um vector pMCT-Nde linearizado com Sall. Este último vector foi cons truido a partir do plasmídio pMc5-8 (EP-A-0351029) por inserção de um fragmento contendo o promotor tac seguido de um local RBS e um local de clonação Ndel (Figura 2). 0 plasmídio resultante

pMcTAFlA (Figura 3) obtidç apõs transformação em E. coli HB101 exprime pac sob o controlo do'seu próprio promotor e/ou do promo tor tac que pode ser induzido (De Boer e col., Proc. Natl. Acad. Sei., 80, 21 (1983).

Para melhorar ainda mais o nível de expressão de pac foram clonados dois fortes promotores de E. coli numa fusão precisa do codão de partida de acilase. Para efectuar isto, construiu-se um local Ndel no codão de partida ATG utilizando a técnica de mutagênese dirigida a locais de oligonucleõtidos (Stari ssens e col., 1989) do plasmídio pMcTAFlA resultando o plasmídio pMcTAFlANde. Este plasmídio foi digerido com Ndel e recirculariza do resultando no posicionamento correcto do promotor tac em fren te do gene de acilase (plasmídio pMcAFtac). Para inserir outro plasmídio promotor foi digerido pMcTAFlNde com EcoRI e Ndel e o maior fragmento foi purificado com gel de agarose. Os fragmentos do promotor de triptofano foram inseridos neste fragmento de Eco RI-Ndel de pMcTAFlANde utilizando 6 oligonucleõtidos sintéticos.

As sequências de ADN destes promotores são representadas nas Listas de Sequências 2 e 3, respectivamente, e as estruturas destes promotores são representadas nas Figuras 4 e 5, respectivamente.

Estas construções de promotores foram transformadas em Έ, coli HB101 e .ensaiadas para a expressão em pac. A Ta bela 1 mostra os resultados obtidos quando comparados com o nível de expressão de A. faecalis ATCC 19018. A indução do promotor tac com isopropiltio- I³ -galactõsido (IPTG) e do promotor trp com acido indol acrílico (IAA) foi também ensaiada.

Tabela 1: Expressão de pac em E. coli

Estirpe

KPA IAA IPTG PAC Unidades*

A. faecalis ATCC 19018

A. faecalis ATCC 19018 + pMcAFtac pMcAFtac pMcAFtrp pMcAFtrp

0.1 + 17

* unidades relativas fom A. faecalis ATCC 19018 no meio com KPA normalizado a 1,0.

A E. coli HB101 contendo vãrios plasmídios foi cultivada em meio 4XLBC durante 24 horas. Foi cultivada a A. faecalis em meio AF durante 24 horas.

Exemplo 5

Expressão de penicilina acilase em A. faecalis

Para permitir a transferência estável da infor mação genética para A. faecalis tiveram de ser procurados um sis tema de transformação de ADN e um vector de clonação estável. Ve rificou-se com surpresa que a coerência triparental do plasmídio pK248 (Bagdasarian e col.,Gene 16, 237-247 (1981)) em A. faeca lis era possível por aplicação de uma técnica jã descrita (Fried man e col., Gene 18, 289-296 (1982) cop as seguintes modificações -E. coli MC1061 contendo plasmídio auxiliar pRK2013 (Figurski & Helinski, Proc. Natl. Acad. Sei. 76, 1648 (1979)) ê misturado com E.coli HB101 (pKT248) e e a estirpe recipiente de A. faecalis em placas de ãgar 2xTY.

- As placas são incubadas a 30°C durante a noite para per mitir a conjugação.

- As placas de conjugação são replicadas para placas de ãgar selectivas contendo um meio E* mínimo incluindo citrato, elementos de esporos e a fase de antibióticos selectivos (50 /g/ /ml) e de cap (25 /'g/ml. É feita a incubação a 30°C durante a noite. Devido aos marcadores auxotróficos as estirpes de E. coli são escolhidas contra eles para este efeito. As colónias de A. faecalis são posteriormente dispersas em placas de 2xTY contendo 300 /ÇL/ml de estreptomicina.

A subclonação do gene de A. faecalis pac foi feita no local único Sall do plasmídio pKT248. O fragmento ThlII-Hpal do plasmídio pAFl foi isolado e introduzido com polimerase de Klenov. O local Sall de pKT248 linearizado foi também tornado Elgo na extremidade e o plasmídio pKTAFA (Figura 6) foi obtido * após transformação em E. coli HB101 e selecção em placas de fal.

*_ Após isolamento este plasmídio foi transferido para a A. faecalis utilizando a técnica de coerência triparental da forma acima dejs crita. A estirpe obtida foi cultivada em frascos agitados com meio de cultura de A. faecalis e comparados com a estirpe original. Como se pode observar na Tabela 2 a produção de pac na estirpe com pkTAFA ê muito aumentada. Alem disso pode observar-se gue mesmo na ausência do indutor KPA pode ser obtida uma elevada produção. Isto permite a omissão do indutor KFA que ê caro, a partir de meios industriais de fermentação.

Para ensaiar os promotores heterõlogos em fren te do gene tac o fragmento de EcoRI-SalI de pMcAFtrp, pMcAFpf3 e pMcAFp78, respectivamente, foram subclonados em EcoRI, Sall vector linearizado pJRD215 (Davison e col., Gene 51, 275-280 (1987)) Todas as três construções de promotores foram obtidas em E. coli

HB101 como pJRDAFtrp, pJRDAFpf3 e pJRDAFp78 e posteriormente
transferidas para A. faecalis ATCC 19018. A tes plasmídios foi ensaiada na presença ou la 2). Tabela 2: Produção de pac em transformantes	expressão de pac des ausência de KPA (Tabe de A. faecalis
Estirpe	KPA	IAA	PAC Unidades*
pKT248	-	-	0.1
pKT248	+	-	1
pKTAFA	-	-	18
pKTAFA	+	-	22
pJRDAFtrp pJRDAFtrp	-	+	1?
pJRDAFpf3			5
pJRDAFpf3	+	-	8
pJRDAFp78	-	-	3
pJRDAFp78	+		5

* unidades relativas com A. faecalis ATCC 19018 no meio com KPA normalizado a 1,0.

Todos os plasmídios foram transferidos por coe rência triparental para A. faecalis ATCC 19018. Os promotores p78 e pf3 são seleccionados do fago pf3 (Luiten, supra). As sequências de ADN destes promotorés são apresentadas nas Listas de

Sequências 4 e 5, respectivamente, e a estrutura destes promotores nas Figuras 7 e 8, respectivamente.

Exemplo 6

Estabilidade de A. faecalis penicilina acilase

A A. faecalis penacilase e .E. coli foram ensai adas para determinar a termoestabilidade utilizando o seguinte protocolo: soluções de enzima são incubadas a vãrias temperaturas durante 5 minutos numa solução de fosfato de sódio 100 mM, pH 7,5. A actividade residual foi medida a 35°C com 50 mM penici lina G como substrato. As temperaturas com 100%, 50% e 0% activi dade residual após 5 minutos foram também determinadas. A partir da Tabela 2 pode concluir-se que a enzima de A. faecalis é signi ficativamente mais estãvel do que a enzima de E. coli.

	100%	50%	0%
A. faeealis	45°C	58.0°C	66°C
E. coli 5K	40°C	54.8°C	60°C

A preparação de enzima de E. coli 5K foi obtida a partir de Produktions Gesellschaft fur Biotechnologie Braun schweig (Mayer et al., supra).

Claims

REIVINDICAÇÕES

Processo para a preparação de penicilina G aci lase caracterizado por se efectuar a cultura de um hospedeiro transformado que compreende um vector que contêm um ou mais genes que codificam a penicilina G acilase e que possuem essencial mente a sequência de nucleótidos representada na Lista de Sequên cia 1

TIPO DE SEQUÊNCIAt nucleétido com a proteína correspondente COMPRIMENTO DA SEQUÊNCIA: 2U5I pares base NUMERO DE BANDASj única

TOPOLOGIA: linearx,

TIPO DE MOLÉCULA: genémica

ORGANISMO: Alcaligenes faecalis

CARACTERÍSTICAS: de péptido com 1 a pb

PROPRIEDADES: gene codificando a penicilina acilase

ATG CAG AAA GGG CTT GTT CGT ACC GGG CTT GTG GCC GCT GGT TTG ATC 48

Met Gin Lys Gly Leu Vai Arg Thr Gly Leu Vai Ala Ala Gly Leu Ile ¹ 5.10 ₁₅

TTG Leu GGT TGG GCG GGG GCA CCG ACC Pro Thr CAC GCG CAA GTG CAG TCG GTA Gin Ser Vai 30 GAG Glu Gly Trp Ala Gly Ala 20 His 25 Ala Gin Vai GTG ATG CGG GAC AGT TAT GGC GTG CCG CAC GTC TTT GCC GAC AGC CAC Vai Met Arg Asp Ser Tyr Gly Vai Pro His Vai Phe Ala Asp Ser His 35 40 45 TAT GGC TTG TAT TAC GGC TAT GGT TAT GCG GTC GCC CAA GAC CGT CTG Tyr Gly Leu Tyr Tyr Gly Tyr Gly Tyr Ala Vai Ala Gin Asp Arg Leu 50 55 60 TTC CAG ATG GAC ATG GCG CGT CGC TCC TTT GTC GGC ACA ACC GCC GCC Phe Gin Met Asp Met Ala Arg Arg Ser Phe Vai Gly Thr Thr Ala Ala 65 70 75 80 GTC TTA GGC CCT GGT GAG CAA GAT GCC TAC GTC AAG TAC GAC ATG CAG Vai Leu Gly Pro Gly Glu Gin Asp Ala Tyr Vai Lys Tyr Asp Met Gin 85 90 95 GTG CGG CAG AAC TTC ACC CCG GCT TCC ATA CAG CGG CAG ATC GCG GCC Vai Arg Gin Asn Phe Thr Pro Ala Ser Ile Gin Arg Gin Ile Ala Ala 100 105 110 TTG TCC AAG GAT GAG CGC GAT ATT TTT CGT GGC TAT GCC GAT GGC TAT Leu Ser Lys Asp Glu Arg Asp Ile Phe Arg Gly Tyr Ala Asp Gly Tyr 115 120 125 AAC GCC TAT CTG GAG CAG GTG CGG CGT CGC CCT GAG TTG CTG CCC AAA Asn Ala Tyr Leu Glu Gin Vai Arg Arg Arg Pro Glu Leu Leu Pro Lys 130 135 140 GAA TAT GTG GAT TTT GAT TTC CAG CCC GAG CCG CTG ACC GAC TTT GAT Glu Tyr Vai Asp Phe Asp Phe Gin Pro Glu Pro Leu Thr Asp Phe Asp 145 150 155 160 GTG GTC ATG ATC TGG GTG GGC TCC ATG GCC AAT CGC TTC TCC GAC ACG Vai vai Met Ile Trp Vai Gly Ser Met Ala Asn Arg Phe Ser Asp Thr 165 170 175

AAT CTG GAA GTG ACG GCA CTG GCC ATG CGT CAG TCT CTG GAG AAA CAG Asn Leu Glu Vai 180 Thr Ala Leu Ala Met 185 Arg Gin Ser Leu Glu 190 Lys Gin CAC GGC CCG GAA CGA GGC CGT GCC TTG TTT GAT GAG CTG CTG TGG ATC His Gly Pro 195 Glu Arg Gly Arg Ala 200 Leu Phe Asp Glu Leu 205 Leu Trp Ile AAT GAC ACA ACA GCT CCC ACT ACG GTT CCG GCC CCC GCT GCC GAG CAC Asn Asp 210 Thr Thr Ala Pro Thr 215 Thr Vai Pro Ala Pro 220 Ala Ala GlU His AAG CCG CAG GCA CAA GCA GGG ACG CAG GAT CTG GCT CAT GTT TCC TCG Lys 225 Pro Gin Ala Gin Ala 230 Gly Thr Gin Asp Leu 235 Ala His Vai Ser Ser 240 CCA GTA CTG GCT ACC GAG CTA GAG CGC CAG GAC AAG CAC TGG GGC GGC Pro Vai Leu Ala Thr 245 Glu Leu Glu Arg Gin 250 Asp Lys His Trp Gly 255 Gly

144

192

240

288

336

384

432

480

528

576

624

672

720

768

CGT GGC CCG Arg Gly Pro GAC TTC GCG CCC AAG GCT AGC AAC CTG TGG AGC ACT CGC 816 Asp Phe 260 Ala Pro Lys Ala 265 Ser Asn Leu Trp Ser Thr Arg 270 CCC GAG CGA GTG CAG GAG GGC TCG ACC GTA CTG ATC AAC GGC CCA CAG 864 Pro Glu Arg Val Gin Glu Gly Ser Thr Val Leu Ile Asn Gly Pro Gin 275 280 285 TTT GGC TGG TAC AAC CCG GCC TAC ACC TAT GGC ATT GGC TTG CAT GGC 912 Phe Gly Trp Tyr Asn Pro Ala Tyr Thr Tyr Gly Ile Gly Leu His Gly 290 295 300 GCC GGC TTC GAT GTG GTG GGT AAT ACG CCT ΤΊΤ GCC TAT CCG ATC GTA 960 Ala Gly Phe Asp Val Val Gly Asn Thr Pro Phe Ala Tyr Pro Ile Val 305 310 315 - 320 CTG ΊΊΤ GGC ACC AAT AGC GAG ATT GCC TGG GGG GCG ACT GCT GGC CCG 1008 Leu Phe Gly Thr Asn Ser Glu Ile Ala Trp Gly Ala Thr Ala Gly Pro 325 330 335 CAA GAT GTG GTG GAC ATA TAT CAG GAA AAA TTG AAC CCC TCG CGT GCC 1056 Gin Asp Val Val Asp Ile Tyr Gin Glu Lys Leu Asn Pro Ser Arg Ala 340 345 350 GAT CAG TAC TGG TTC AAC AAT GCC TGG CGC ACG ATG GAG CAG CGC AAG 1104 Asp Gin Tyr Trp Phe Asn Asn Ala Trp Arg Thr Met Glu Gin Arg Lys 355 360 365 GAA CGT ATC CAG GTA CGC GGT CAG GCT GAT CGG GAA ATG ACG ATC TGG 1152 Glu Arg Ile Gin Val Arg Gly Gin Ala Asp Arg Glu Met Thr Ile Trp 370 . 375 380 CGC ACC GTG CAC GGC CCT GTG ATG CAG TTT GAT TAC GAT CAG GGC GCG 1200 Arg Thr Val His Gly Pro Val Met Gin Phe Asp Tyr Asp Gin Gly Ala 385 390 395 400 GCG TAC AGC AAG AAA CGC AGC TGG GAT GGC TAT GAG GTG CAG TCC TTG 1248 Ala Tyr Ser Lys Lys Arg Ser Trp Asp Gly Tyr Glu Val Gin Ser Leu 405 410 415 CTA GCC TGG TTG AAC GTG GCC AAG GCC CGC AAC TGG ACG GAG TTT CTG 1296 Leu Ala Trp Leu Asn Val Ala Lys Ala Arg Asn Trp Thr Glu Phe Leu 420 425 430 GAT CAA GCC AGC AAG ATG GCG ATT TCG ATC AAC TGG TAC TAC GCC GAC 1344 Asp Gin Ala Ser Lys Met Ala Ile Ser Ile Asn Trp Tyr Tyr Ala Asp 435 440 445 AAG CAC GGC AAT ATT GGT TAT GTC TCG CCG GCC TTC CTG CCC CAG CGT 1392 Lys His Gly Asn Ile Gly Tyr Val Ser Pro Ala Phe Leu Pro Gin Arg 450 455 460 CCT GCC GAT CAG GAC ATC CGT GTC CCT GCC AAG GGG GAT GGC AGC ATG 1440 Pro Ala Asp Gin Asp Ile Arg Val Pro Ala Lys Gly Asp Gly Ser Met 465 470 475 480 GAG TGG CTG GGC ATC AAG AGT TTC GAC GCG ATT CCC AAA GCC TAC AAT 1488 Glu Trp Leu Gly Ile Lys Ser Phe Asp Ala Ile Pro Lys Ala Tyr Asn 485 490 495

CCA CCC CAG GGC TAT CTG GTC AAC TGG AAC AAC AAG CCT GCG CCG GAC 1536 Pro Pro Gin Gly 500 Tyr Leu Vai Asn Trp 505 Asn Asn Lys Pro Ala Pro 510 Asp AAA ACC AAT ACG GAT ACT TAC TAT TGG ACC TAT GGC GAC CGC ATG AAT 1584 Lys Thr Asn Thr Asp Thr Tyr Tyr Txp Thr Tyr Gly Asp Arg Met Asn 515 520 525 GAA CTG GTC AGT CAG TAC CAG CAG AAA GAC CTC TTC AGT GTG CAG GAG 1632 Glu Leu Vai Ser Gin Tyr Gin Gin Lys Asp Leu Phe Ser Vai Gin Glu 530 535 540 ATC TGG GAG TTC ÃAT CAA AAA GCC TCC TAT AGC GAT GTG AAC TGG CGC 1680 Ile Trp Glu Phe Asn Gin Lys Ala Ser Tyr Ser Asp Vai Asn Trp Arg 545 550 555 560 TAC TTC CGC CCA CAT CTG GAA AAG CTG GCG CAA CAG CTG CCG GCC GAC 1728 Tyr Phe Arg Pro His Leu Glu Lys Leu Ala Gin Gin Leu Pro Ala Asp 565 570 575 GAT AGC AGC AAG GCG GCG CTG ACG ATG TTG CTC GCC TGG GAT GGA ATG 1776 Asp Ser Ser Lys Ala Ala Leu Thr Met Leu Leu Ala Trp Asp Gly Met 580 585 590 GAA CAG GAT CAG GGA GGG CAA AAT GCC GGA CCG GCG CGG GTG CTC TTC 1824 GlU Gin Asp Gin Gly Gly Gin Asn Ala Gly Pro Ala Arg Vai Leu Phe 595 600 605 AAG ACC TGG CTG GAA GAA ATG TAC AAG CAG GTC TTG ATG CCG GTG GTG 1872 Lys Thr Trp Leu Glu Glu Met Tyr Lys Gin Vai Leu Met Pro Vai Vai 610 615 620

CCT Pro 625 GAA TCG CAT His CGC GCC ATG TAT AGC CAG ACT GGT TTT GCC ACG CAG 1920 GlU Ser Arg Ala Met 630 Tyr Ser Gin Thr Gly 635 Phe Ala Thr Gin 640 CAA GGT CCC AAC CCC GGT TCC ATC AAC TTG AGC ATG GGC ACC AAG GTC 1968 Gin Gly Pro Asn Pro Gly Ser 645 Ile Asn Leu Ser Met 650 Gly Thr Lys Vai 655 TTG TTG CGT GCC TTG GTG CTG GAA GCC CAT CCC GAT CCC AAG CGT GTG 2016 Leu Leu Arg Ala 660 Leu Vai Leu Glu Ala 665 His Pro Asp Pro Lys Arg Vai 670 AAT GTC TTT GGT GAG CGT TCG TCT CAG GAA ATC ATG CAC ACA GCT TTG 2064 Asn Vai Phe 675 Gly Glu Arg Ser Ser 680 Gin Glu Ile Met His 685 Thr Ala Leu CAA AAT GCG CAG GCC CGC TTG AGC CAG GAG CAG GGC GCT CAG ATG GCG 2112 Gin Asn 690 Ala Gin Ala Arg Leu 695 Ser Gin Glu Gin Gly 700 Ala Gin Met Ala CGC TGG ACC ATG CCG ACC TCC GTG CAT CGT TTC AGC GAC AAG AAC TTC 2160 Arg 705 Trp Thr Met Pro Thr Ser 710 Vai His Arg Phe Ser 715 Asp Lys Asn Phe 720 ACG GGA ACC CCG CAG ACG ATG CCT GGC AAT ACC TTT GCC TTT ACC GGC 2208 Thr Gly Thr Pro Gin Thr Met 725 Pro Gly Asn Thr Phe 730 Ala Phe Thr Gly 735

TAT CAG AAT CGA GGC ACG GAA AAT AAC CGC GTG GTG TTT GAT GCC AAG 2256 Tyr Gin Asn Arg Gly Thr Glu Asn Asn Arg Vai Vai Phe Asp Ala Lys 740 745 750 GGC GTG GAG TTC TGC GAC GCC ATG CCG CCC GGC CAA AGC GGT TTC ACC 2304 Gly Vai Glu Phe cys Asp Ala Met Pro Pro Gly Gin Ser Gly Phe Thr 755 760 765 GAC CGC AAT GGA GTG CGC AGC CCG CAT TAT GAG GAT CAG CTG AAG TTG 2352 Asp Arg Asn Gly Vai Arg Ser Pro His Tyr Glu Asp Gin Leu Lys Leu 770 775 780 ... TAC GAG AAC TTC GAG TGC AAG ACG ATG GAT GTG ACG CAT GCG GAC ATT 2400 Tyr Glu Asn Phe Glu cys Lys Thr Met Asp Vai Thr His Ala Asp Ile 785 790 795 800 CGT CGT AAT GCG CAA AGC AGC ACG'ATG CTG TTG ATT CAG CCT CAG CCT 2448 Arg Arg Asn Ala Gin Ser Ser Thr Met Leu Leu Ile Gin Pro Gin Pro 805 810 815

2451

TAA

End e recuperar-se em seguida a forma isolada de penicilina G acilase.

- 2^a Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o vector utilizado conter um gene que e isolado de Alcaligenes faecalis.

- 3^a Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por o vector utilizado conter o gene sob o controlo de um regulão que compreende as sequências de transcrição e/ou translacção, eÉh que um ou mais das referidas sequências de regulação foram substituídas por outras sequências de transcrição e/ou translacção obtidas, respectivamente, do mesmo ou de ou tro organismo.

- 4^a Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por as sequências de transcrição do gene de penicili na G acilase serem substituídos pelo promotor trp.

- 5^a Processo de acordo com as reivindicações anteriores caracterizado por o hospedeiro transformado ser um microorganismo gram-negativo.

- 6^a Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o microorganismo pertencer ao gênero Alcaligenes ou Escherichia.

- 7^a -