[go: up one dir, main page]

PT97117A - Processo para a preparacao de derivados polipeptidicos e de composicoes imunogenicas que os contem - Google Patents

Processo para a preparacao de derivados polipeptidicos e de composicoes imunogenicas que os contem Download PDF

Info

Publication number
PT97117A
PT97117A PT97117A PT9711791A PT97117A PT 97117 A PT97117 A PT 97117A PT 97117 A PT97117 A PT 97117A PT 9711791 A PT9711791 A PT 9711791A PT 97117 A PT97117 A PT 97117A
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
asn
asr
lys
giu
glu
Prior art date
Application number
PT97117A
Other languages
English (en)
Inventor
Ulrich Certa
Maria Guttinger
Hugues Matile
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of PT97117A publication Critical patent/PT97117A/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
    • C07K14/445—Plasmodium
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/20—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans from protozoa
    • C07K16/205—Plasmodium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/35—Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

F. HOFFMANN-LA ROCHE, AG "Processo para a preparação de derivados polipeptídicos e de composições imunogênicas que os contêm" A malária ê causada nos seres humanos por quatro espê cies de Plasmodium, nameadamente pelô P. £alciparum, pelo P. vivax, pelo P ovale e pelo IV malariae. De acordo com um relatório de 1986 da Organização Mundial da Saúde (OMS) existem no mundo quase 10© milhões de casos de infecções por malária. Destes casos, cerca de um milhão, habitualmente casos de crianças infectadas pelo P. falciparum, conduzem a um desfecho fatal. A malária continua a disseminar-se devido ao aparecimento de parasitas resistentes aos fármacos e de mosquitos vectores resistentes aos insectici-das. Deste modo, na índia, as autoridades sanitárias, referiram 100 000 casos de malária era 1962 mas em 1980 existiam já 3 milhões de casos, a maioria deles causados por P^ vivax (vide' Bru ce-Chwatt, Essential Malariology, Londres, Heinemann, 2-_ed., 1986). Nos últimos anos têm-se desenvolvido novos métodos na esperança de que seja brevemente possível produzir vacinas anti-ma lãria que sejam capazes de se opôr â disseminação crescente da malária (Scaife, Genetic Engineering, 1_ (1988) 57-90) . 0 ciclo natural de vida do IV falciparum ê constituído por três fases diferentes. Na primeira fase os mosquitos ao ali-mentarem-se introduzem esporozóitos na corrente sanguínea dos ver tebrados. Estes esporozóitos migram através da corrente sanguí- nea para o fígado e penetram nos hepatõcitos do hospedeiro. Na segunda fase, estes esporozoitos desenvolvem-se dando origem aos merozôitos. Estes merozôitos, por sua vez, passam através de diversos ciclos de multiplicação nos eritrõcitos do hospedei ro, aí originando, então, os gametõcitos. Os gametõcitos que representam a fase sexual dos parasitas são novamente recebidos pelos mosquitos quando se alimentam. Apôs fertilização no intestino do insecto os gametõcitos transformam-se em esporozõi-tos que, depois, migram até âs glândulas salivares do insecto. Pode dar-se início a um novo ciclo.
Deste modo, as vacinas contra a fornia esporozoítica do Plasmôdium falciparum são a primeira linha de defesa contra a infecção pela malária. Nos últimos anos as chamadas proteínas CS dos esporozoitos de várias espécies de Plasmôdium foram intensivamente investigadas e ensaiou-se a sua utilização em vacinas (Nussenzweig et al., Adv. immunol., 45 (1989) 283-334). Apesar dos ensaios de vacinação com a proteína CS ou com os seus derivados dar origem a uma protecção parcial contra subsequentes infecções pela malária, ainda não ê possível falar em termos de uma importante descoberta no desenvolvimento de uma vacina contra a malária, utilizável de um modo genérico (Her-ring et al., Nature, 328 (1987) 257-259). Por isso o objectivo da presente invenção era descobrir novos antigenes esporozoíti-cos que pudessem ser utilizados na sua forma nativa ou modifica da para se produzirem novas vacinas anti-malária.
No presente pedido de patente de invenção descreve-se um novo antigene esporozoítico de peso molecular aparente superior a 200 Kdalton (KDá) com a sequência de aminoãcidos N-termi nal (I) seguinte: / ( 1 Met Asn Lys val 1 Asn Ala Val His Lys 10 1 Ile Asn Ala Val Asp < 5 i Lys 16 Vai Asn Ala val Asn Lys Val Asn Ser Val Asn Lys Leu Asn Val 31 vai Asn Lys Asn Val Leu Ser Lys Leu Asn Ala Val Tyr" Lys 46 Vai Asn Ser Val His Lys Met Asn Ala Val Asn Lys Val Asn Ala 61 Vai Asn Lys val Asn Ala val Asn Lys val Asn Val Val Asn Lys 76 Lys Asp Ile Leu Asn Lys Leu Asn Ala Lsu Tyr Lys Met Asn Ala 91 Vai Tyr Lys Met Asn Ala Leu Asn Lys Val Ser Ala Val Asn Lys 106 Vai Ser Ala val Asn Lys Val Ser Ala val Asn Lys Met Gly Ala 121 Val Asn Arg val Asn Gly Val Asn Lys val Asn Glu Val Asn Glu 136 Vai Asn Glu val Asn Glu Val Asn Met val Asn Glu Val Asn Glu 151 Leu Asn Glu val Asn Asn val Asn Ala Val Asn Glu Val Asn Ser 166 Val Asn Glu Val Asn Glu Met Asn Glu val Asn Lys Val Asn Glu 181 Leu Asn Glu Val Asn Glu Val Asn Asn val Asn Glu Val Asn Asn 196 val Asn Val Met Asn Asn Val Asn Glu Met Asn Asn Met Asn GxU 211 Met Asn Asn Val Asn Val Val Asn Glu Val Asn Asn Val Asn Glu 226 val Asn Asn Val Asn Glu Met Asn Asn Val Asn Glu Met Asn Asn 241 Met Asn Glu Met Asn Asn Val Asn val Val Asn Glu val Asn Asn 256 val Asn Glu Met Asn Asn « ééém Asn Glu Leu Asn Glu Val Asn Glu 271 Val Asn Asn val Asn Glu Val Asn Asp Val Asn Val Val Asn Glu 286 Val Asn Asn Val Asn Glu Met Asn Asn Met Asn Glu Leu Asn Glu 301 Val Asn Gly Val Asn Glu Val Asn Asn Asn Glu Ile His Glu 316 Met Asn Asn Ile Asn Glu val Asn Asn Thr Asn Glu Val Asn Asn 331 Thr Asn Glu Ile Tyr Glu Met Asn Asn Met Asn Asp Val Asn Asn 346 Thr Asn Glu Ile Asn Val Val Asn Ala Val Asn Glu Val Asn Lys 361 val Asn Asp Ser Asn Asn Ser Asn Asp Ala Asn Glu Gly Asn Asn 376 Ala Asn Tyr Ser Asn Asp Ser Ser Asn ***& Asn Asn Asn Ser 391 Ser Ser Thr Asn Asn Ser Asn Asn Asn Thr Ser Cys Ser Ser Gin 406 Asn Λ Thr Thr Ser Ser Glu Asn Asn Asp Ser Leu Glu Asn Lys 421 Arg Asn Glu Glu Asp Glu Asp Glu Glu Asp Asp Gin Lys Asp Thr 436 Gin Lys Glu Lys Asn Asn Leu Glu Gin Glu Asp Met Ser Pro Tyr 451 Glu Asp Arg Asn Lys Asn Asp Glu Lys Asn Ile Asn Glu Gin Asp 466 Lys Fhe His Leu Ser Asn Asp Leu Gly Lys Ile Tyr Asp Thr Tyr 481 Asn Gin Gly Asp Glu Val Val Val Ser Lys Asn Lys Asp Lys Leu 496 Glu Lys KiS Leu Asn Asp Tyr Lys Ser Tyr Tyr Tyr Leu Ser Lys 511 Ala Thr Leu Met Asp Lys Ile Gly Glu Ser Gin Asn "Asn Asn Asn 526 Tyr Asn Val Cys Asn Ser Asn Glu Leu Gly Thr Asn Glu Ser Ile 541 Lys Thr Asn Ser Asp Gin Asn Asp Asn val Lys Glu Lys Asn Asp 556 Ser Asn Ile Fhe Met Lys Met Ile Ile Ile Ile Arg Leu Met Ile 571 Met Ile Ile Met Ile Met Ile Ile Ile Trp Tyr Leu Lys Ile Leu 586 Gin Asp Lys Ile Ile Trp Arg Asn Lys Lys Val Glu Lys Thr Ser 601 Asn Ile Leu Asn Asn Fhe ASP Asn Asn Gly Asn Asp Asn Asp Asn 616 Asp Asn Asp Asp Asn Asn Asp Asn Asp Asn Asn Asn Asn Asn Asn 631 Met Asn Asn Gin Tyr Asn Tyr Gin Glu Asn Asn Ile Asn * Asn 646 Typ Asn Ile Leu Tyr Thr Fro Ser Asn Cys Gin Ile Gin Asn Asn 661 Ser Tyr Met Asn * Asn Glu Met Tyr Gin Pro Leu Tyr Asn nMx * 676 Tyr Pro Ser Asn Arg ile Gin Glu Asn Ser Thr Ile Asn Asn Asn 691 :ie Ile Asn Asp Ser Fro Tyr Met Asn Asn Asp Asn Ψ· Asn 706 Asn * ♦ Fhe Ile Ser Gly Met Asn
Esta sequência de aminoãcidos contêm 713 resíduos ami noâcidos com a seguinte'composição airiinoacidã;:Ala (19)tArg (6) , Asn (219) , Asp (37), Cys (3), Gin (15), Glu (65), Gly (10), His (5), Ile (34) , Leu (26), Lys (48), Met (34), Phe (4), Pro (5), Ser (39), Thr (27), Trp (2), Tyr (23) and Vai (92) . O peso molecular calculado para esta porção N-terminal do novo antigene esporozoíti co é de 81281 Da. Os possíveis sítios de glicosilação estão localizados nas posições 32, 260, 308, 323, 329, 344, 362, 365, 377, 380, 387, 388, 394, 398, 399, 406, 414, 537, 554, 659, 684, 693, 702, 705 da sequência de aminoãcidos (I).
As caracteristicas essenciais da sequência de aminoãci dos (I) são: a) a frequência de ocorrência de resíduos de aspara gina na sequência e b) a ocorrência repetida da metade N-termi-nal de uma sequência constituída por três resíduos aminoãcidos (NXY) na qual o símbolo N representa asparagina e os símbolos X e Y representam qualquer aminoácido. O resíduo aminoãcido X que surge imediatamente apõs o resíduo de asparagina encontra-se de preferência carregado e dã-se especial preferência aos resíduos aminoãcidos de ãcido glutâmico e de lisina. O resíduo aminoácido Y que se encontra na terceira posição ê, de preferência, um resíduo aminoãcido hidrõfobo, dando-se especial preferência aos resíduos aminoãcidos de valina e de metionina. A sequência (NXY) repete-se aproximadamente 103 vezes na sequência de aminoãcidos (I). São exemplos das sequências a que se dã especial preferência (NXY) AsnGluVal, AsnLysVal e AsnGluMet. Serã evidente para o especialista que a sequência (NXY)n também engloba as permutações da sequência, o que significa que (YNK)n e (XYN) também se encontram englobadas. Ã medida que o numero n de repetição das sequências NXY, YNX e XYN nos polipéptidos aumenta, estas tornam-se imunologicamente pouco distinguíveis. Podem mencionar-se como exemplos os pêptidos (AsnGluVal)4, (ValAsnGlu) ^ e (GluVal-Asn)^. Comparando as seguintes sequências destes pêptidos AsnGluValAsnGluValAsnGluValAsnGluVal GluValAsnGluValAsnGluValAsnGluValAsn ValAsnGluValAsnGluValAsnGluValAsnGlu verifica-se claramente que estes pêptidos são idênticos um ao ou tro, excepto nos aminoacidos terminais. 0 gene que codifica o novo antigene esporozoítico con têm a seguinte sequência nucleotidica (1) que codifica a sequên cia de aminoacidos N-terminal (I):
3 | 20 I 30 1 40 50 50 1 I GAATTCCTCG í TGATCATATG 1 AGATATAGTT t - - * sjA 1 UAA a A * · · s? a TCAAAGAAGA 51 121 wA\-AA GAGAAGAAAC Λ X A * ttaataaaat TTTATATAAG « « ·. «A ΛΑX A * * ΛΑΑ· 1.λΑΓ^λλλλλ ÃLaaI * a. AAUA** Á W sj * wwAÃaLÂa \J A A ΑλΛ A * ~ Λ * w- .Â.WA* · 181 UUUA1 a ^ Λ 4. a CCAAAAAGAT * mmi cn A A «Awiju a A a TAGTAAACCA AATATTAACC TCTTACGAAT 241 UljtA A VJUAUA a VJVJAUU a * * * gaatcattcg TTAAGTTATA % MUMMt *JUAUAi··Α AGAAAAGATA 301 A A * *AAw a ww TATACATCTA CTAAAAGTGT TGTGGAAAAT TTTAGAAATA » /·% m a nuAAunnuA 361 /"•mm·* m W + *AWU»WAA mm* mri « /"* * * AUA A UAAU a x a uaaLaua AAATATTAAT GAACCTAATC * fmmr* % ^ A A a « AUrtA WU 421 TCAAAATAAT AAAAACAATA GAAAAACTAA TAATGATAAT ACATTGAAAC AAAATCA7CG CAAAAATAAA A7AAATCGGG GATCAAAAGG TAGAAAGACG AACATAATGT CACAAATTAA AATAAAATGT GAAGAAAGTA GTAGTTCAAA CGAGTAATGA AGAAAATAAT ATATCAACTG ATAAAAATAT 481 541 601 651 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381 1441 1501 1561 1621 1681 1741 1801 1861 1921 1981 2041 2101 2161 2221 2281 2341 2401 2461 2521 2581 2641 2701 2761 2821 2881 2941 3001 3061 ATGi
AATTCAAAGG ACACAAGAAC ATTCTTCGGT GAATAACATG TGTGAATAAG TAAGTTGAAT AAATGCTGTA TGTGAATAAG TAAGGTGAGT GGGTGCTGTA GGTGAATGAA TGCAGTGAAT GAATGAGCTA GATGAATAAT TGAAGTGAAT GAATAATATG GATGAATAAT TGATGTCAAT AAATGAGGTG TATAAATGAG TAATATGAAT GAATAAGGTG TTCAAATGAT TAATACATCG AAATAAAAGA AAAAAACAAT AAAAAATATT TACATATAAC TTTGAATGAT AGAATCACAA ATCCATAAAG ATTTATGAAA AATATGGTAT AACAAGCAAT TGATAATAAT AGAAAATAAT AAACAATTCA AAATCGTATT GAATAACGAC • *·.Λ^Λ.Λ
ATAAGTACAT TTATATCAAA - aAaTAaGua AGGTAAATGC TGAATAAGGT AGAAGGATAT ATGCTTTGAA TGAATAAGAT AGGTGAATGA ATAATGTCAA TGAATAAGGT ATGTGAATGT ATGTAGTGAA TGAATGAGAT ATGTAAATGA ATGAGGTGAA TGAATGAGCT AGATGAATAA ATGAGATGAA TTAATGAAGT ACGCAAATTA ACTCAAATAA ATTCATTAGA CACAAAAAGA AAAATGATGA AAATATATGA TAGAAAAGCA ACAAAATTGG GAACTAATGA ATTCCAACAT TAATGATAAT AAGTGGAGAA ATGATAATGA ATAATTATCA GCCAAATCCA CATATCCTTC CACCTTACAT
AATAAGGTGA TTGAATGCTT vjw * w * sjãA * λ AATAGGGTGA iWAAiAiUU GAAGTGAATA AATGAGGTGA GTGAATGAGA
AATGAGATGA ACGAATGAGC GTAGTGAACG AATGGGGTAA GTGAATAATA OAUAAAA AATGATTCAA TCAAGCAATA TGTAGTTCAC aatgaagaag TTAGAACAGG AATGAACAAG CAAGGAGATG TACAAGAGTT AATAATAACA nwtAA * · w * u ATGATAATTA TTAAAGATTC ATTTTAAACA GATAATGATA ATTAACACAA *Λιλ*\.»λλ*λ CAAGAAAATT AACACCACTA
AAAATCTAGG GGCACATCTG CAAACATAAT TCTATAAATA TTCCAAAAGA TAAATTACTA TTTAATAAAA AAGATATTAA TTATGAAGAG GGAAATAGTT TTGTAATACA AATAATAAAA AGGAGAT7AT AAAATTTAGC AAACAGTTT ATGTCGATAA AACAGATAGA ACAATTAATA AGTCCAATAA CGTGAATAAT ATTAATAGTG ATGCTGTACA TAAGATAAAT GCTGTGGATA TGAATAAGGT AAATGTTGTG AATAAGACGA AGGTGAATTC TG7ACATAAG ATGAATGCTG ATGCTGTAAA TAAGGTAAAT GTCGTGAATA TGTATAAGAT GAATGCTGTG TATAAAATGA AGGTGAGTGC TGTGAATAAG GTGAGTGCTG ATGGAGTAAA CAAGGTGAAT GAGGTGAATG TGAATGAAGT AAATGAGTTA AATGAGGTGA G7GTGAACGA GGTTAATGAA ATGAATGAGG ATGAAGTGAA TAATGTCAAT GAGGTGAATA TGAATAATAT GAATGAGATG AATAATGTCA AGGTGAATAA TGTGAATGAG ATGAATAATG ATAATGTCAA TGTAGTGAAT GAAGTGAATA TAAATGAGG7 GAATGAAGTG AATAATGTGA AAGTGAATAA TGTAAATGAG ATGAATAATA ATGAAGTGAA TAATACGAAT GAGATACATG CGAATGAGGT GAATAATACG AATGAGATAT ATACGAATGA GATAAATGTG GTGAATGCGG ATAATTCAAA TGATGCAAAT GAAGGAAATA CAAATAATAA CACATCAAGC AGCACAAATA AGAACACCAC AACTAGCAGC GAAAATAATG ATGAAGATGA AGAAGACGAC CAAAAAGATA AAGATATGAG TCCATACGAA GATAGAAATA ATAAATTTCA TTTATCAAAT GATTTGGGAA AAGTTGTTGT ATCTAAGAAT AAGGACAAAT ATTATTATTT ATCTAAAGCA ACACTCATGG ACTATAATGT ATGTAATTCA AATGAACTTG ATCAGAATGA TAATGTAAAA GAAAAAAATG TAATTCGTCT TATGATAATG ATCATAATGA TTCAAGACAA GATAATATGG AGAAACAAAA ATTTCGATAA TAATGGTAAT GATAATGATA ATAATAATAA TAATAATATG AATAATCAAT ATTATAACAT TTTGTACACT CCTTCTAAT7 CAAATGAAAT GTACCAACCA TTATATAATA CTACTATAAA TAACAACATT ATTAATGATT ATAACACCTT CATTTCTGGT ATGAATTC •i'*' -ν A presente Invenção refere-se tanto aos novos antige-nes de esporozõitos de Plasmòdiurn como aos seus derivados especialmente polipéptidos que coincidem pelo menos no epítope espe cífico com o antigene do esporozoito de Piasmodium com a sequên cia de aminoãcidos N-terminal (I). Define-se um epítope específico como um determinante imunogênico num polipéptido, que ê produzido por uma configuração molecular específica de uma sequência parcial do polipéptido. Os polipéptidos preferenciais contém a repetição sequencial de NXY ou as suas permutações YNX e XYN. Por este motivo, os polipéptidos particularmente preferidos contém a sequência (NXY)n, (YNX)n ou (XYN)n em que n representa um número compreendido entre 3 e 120. A presente invenção também se refere a polipéptidos, tal como anteriormente se definiu, os quais se encontram covalentemente ligados a um outro pé£ tido na extremidade amino e/ou na extremidade C. Os pêptidos de fusão deste tipo podem representar-se de acordo com a formula ge ral
A-B, B-C ou A-B-C em que o símbolo B representa um polipéptido que coincide pelo menos no epítope específico com o antigene do esporozoito do Piasmodium com a sequência de aminoãcidos (I). Os pêptidos adicionais A e/ou C podem em principio ser quaisquer pêptidos mas são preferencialmente pêptidos de afinidade ou pêptidos com epítopes de células T. A expressão pêptido de afinidade diz respeito aos pêptidos que contém uma sequência de aminoãcidos que se liga de um modo preferencial ao material de suporte cromatogrãfico de afi nidade. São exemplos desses pêptidos de afinidade os pêptidos que contém pelo menos dois, de preferência seis, resíduos de histidi-
V \ na. Estes péptidos de afinidade ligam-se selectiyamente a resinas de quelato de ácido nitrilotriacêtico/nlquel (ver, por exem pio, o pedido de patente de invenção europeia, Publicação N°. 253 303). Os polipêptidos de fusão que contêm esses péptidos de afinidade podem separar-se selectivamente utilizando resinas de quelato de acido nitrilotriacético/niquêl, a partir de outros polipêptidos (ver por exemplo, pedidos de patente de invenção èlu ropeia com os números de publicação 282042 e 309746). O péptido de afinidade pode encontrar-se acoplado à extremidade C ou â extremidade N do polipiptido B anteriormente definido mas dã-se preferência ao acoplamento na extremidade N, por exemplo quando o codão de paragem natural do antigene esporozoítico de Plasmo-dium também i utilizado na expressão do polipêptido, de acordo com a presente invenção. Por um pêptido com epítope de célula T, entendem-se os péptidos que actuam nas células T e deste modo con tribuem para a cooperação das células T e B na resposta imunolõ-gica ao antigene da malária. Dã-se especial preferência aos epí-topes universais das células T, tal como se referiu, por exemplo no pedido de patente de invenção europeia com o número de publicação 343 460.
Um exemplo de um polipêptido de fusão de acordo com a presente invenção e que possui a fórmula geral
A-B-C é o polipêptido com a sequência de aminoãcidos (II) .../... : ο 1 Mgf Ar? VJ*/ Ser HiS His His His HiS HiS Gly Ser V al Asn Ser 1 5 Val Asn Lys Glu Asn Asn Met Asn Lys Vai Asn Ala Vai HiS Lys 21 :ΐβ Asn Ala Val Asp Lys val Asn Ala Val Asn Lys Val Asn Ser 46 Val Asn Lys Leu Asn Val Val Asn Lys mV «. Asn Val Leu Ser Lys 51 Leu Asn Ala Val • T «, Lys Val Asn Ser val His Lys Met A.sn Ala 76 Val Asn Lys Val Asn Ala Val Asn Lys Val Asn Ala Val Asn Lys 91 Val Asn Val Val Asn Lys Lys Asp Ile Leu Asn Lys Leu Asn Ala 105 Leu Tyr Lys Met Asn Ala Val * V Λ. • Lys Met Asn Ala Leu Asn Lys 121 val Ser Ala Val Asn Lys Val Ser Ala val Asn Lys val Ser Ala •25 Val Asn Lys Met Gly Ala Val Asn Arg Val Asn Gly val Asn Lys '51 Val Asn Glu Val Asn /-* sji U Val Asn Glu Val Asn Glu Val r.z Met 155 Val Asn Glu Val Asn Glu Leu Asn Glu val Asn Asn Val % m r.*.· Ala 181 val Asn Glu Val Asn Ser Val Asn Glu val Asn Glu Met Asn Glu 136 vai Asn Lys val Asn Glu Leu Asn Glu Val Asn -j«U Val Asn Asn 211 Val Asn Glu Val Asn Asn Val Asn Val Met Asn Asn Val Asn m * , * 225 Met Asn Asn Met Asn Glu Met Asn Asn Val Asn val Val Asn ··* 241 Val Asn Asn Val Asn Glu val Asn Asn Val Asn Glu Met Asn Asn 255 Val Asn Glu Met Asn Asn Met Asn Glu Met Asn •Asn Val Asn val 271 val Asn Glu Val Asn Asn val Asn Glu Met Asn Asn ΤΪ1Γ Asn Glu 256 Leu Asn Glu val Asn Glu Val Asn Asn Val Asn Glu Val Asn Asp 201 val Asn Val Val Asn Glu Val Asn Asn Val Asn Glu Met Asn Asn 316 Ket Asn Glu Leu Asn Glu Val Asn Gly Val Asn Glu val Asn Asn 221 mV «·> Asn Glu :ie His Glu Ket Asn Asn lie Asn Glu val Asn Asn 246 Tiir Asn Glu Val Asn Asn mU « Asn Glu Ile Tyr Glu Met Asn Asn 251 Met Asn Asp Val Asn Asn mU«- Asn Glu Ile Asn val val Asn Ala 276 Val Asn Glu val Asn Lys val Asn ASp Ser Asn Asn Ser Asn Asp 221 Ala Asn Glu Gly Asn Asn Ala Asn *>* Ser Asn Asp Ser Ser Asn 406 mw· Asn Asn Asn Ser Ser Ser mV ψφ Asn Asn Ser Asn Asn Asn 421 mV m Ser Cys Ser Ser Gin Asn * mV ·» Ser Ser Glu Asn Asn 435 ASP Ser Leu Glu Asn Lys Arg Asn Glu Glu Asp Glu Asp Glu Glu 451 AS? Asp Gin Lys Asp mw«* 4 Gin Lys Glu Lys Asn Asn Leu Glu Gin 466 Glu Asp Met Ser ?ro Tyr Glu Asp Arg Asn Lys Asn Asp Glu Lys 481 Asn Ile Asn Gly Ile Arg Arg ?ro Ala Ala Lys Leu Asn Λ ί ·* V,
Este polipéptido contem 493 aminoãcidos em que a porção A ê constituída pelos resíduos aminoãcidos 1 a 21, a parte B é constituída pelos resíduos aminoãcidos 22 a 483 e a parte C ê constituída pelos resíduos aminoãcidos 484 a 493. 0 polipeptido tem um peso molecular estimado em 55239 Daltons. A parte A é um péptido de afinidade com seis resíduos de histidina. A parte B corresponde â parte N-terminal do antigene esporozoítico da presente invenção e contém os resíduos aminoãcidos 1 a 462 da se- » quência de aminoãcidos (I). A parte C i qualquer péptido codificado por uma sequência vector. A presente invenção também se refere a polipéptidos e a polipéptidos de fusão derivados das sequências de aminoãcidos anteriormente indicadas, por adições, eliminações ou inserções, desde que estes polipéptidos sejam ainda capazes de suscitar uma resposta imunitária aos parasitas da malária, na fase de circmie porozõito, de preferência, contra o antigene esporozoítico com a sequência de aminoãcidos N-terminal (I) do P. falciparum. A presente invenção também se refere a ADNs que codificam um polipép-tido, de acordo com a presente invenção, e a vectores microbianos susceptíveis de se replicarem que contêm um ADN deste tipo especialmente vectores de expressão, isto ê vectores microbianos replicáveis nos quais um ADN que codifica um polipéptido, de 0 acordo com a presente invenção, se une a uma sequência de contro lo de expressão, de tal modo que o polipeptido codificado pelo ADN pode exprimir-se em microrganismos. Além disso, a presente invenção refere-se a microrganismos que contêm um vector repli-cãvel deste tipo, ou um vector de expressão deste tipo e a processos para a preparação destes vectores e microrganismos. Além disso, a presente invenção refere-se a processos para a prepara- ção de polipéptidos e â sua utilização para imunização de mamíferos contra a malária.
Dado que determinadas substituições na sequência de aminoãcidos de um polipéptido não têm qualquer efeito na estrutura espacial ou na actividade -biológica do polipéptido/ ê pos sível que a sequência de aminoãcidos dos pólipéptidos, de acordo com a presente invenção, possam diferir das sequências de aminoãcidos anteriormente apresentadas, são exemplos dessas subs tituições aminoãcidas: Ala/Ser, Val/Ile, Asp/glu, Thr/Ser, Ala/ /GlY, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/ /Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu e vice-versa (vide Doolit tle, in The Proteins, Nova Iorque ed. Neurath, H. e Hill, R. L., Academic Press, 1979).
Os polipéptidos de acordo com a presente invenção podem encontrar-se ligados de um modo covalente a um material veicular ou podem encontrar-se adsorvidos nesse material. Os materiais veiculares adequados são os compostos polimêricos sintéticos ou naturais, tais como, por exemplo, os copolímeros de um ou mais aminoãcidos (por exemplo, poli-lisina) ou açúcares (por exemplo, polissacarídeos). Outros materiais veiculares adequados são os polipéptidos naturais, tais como as hemociananinas (por exemplo KLH = hemocianina de molusculo, "Keyhold Limpet haemocya nin") proteínas do soro (por exemplo gama-globulina, albuminas do soro) e toxóides (por exemplo o toxóide "diphteria" ou o to-xoide "tetanus"). Outros materiais veiculares adequados são do conhecimento do especialista. A ligação covalente dos polipéptidos, de acordo com a presente invenção, aos materiais veiculares pode efectuar-se por
-li- 4 •s* um método conhecido, por exemplo formando directamente uma ligação peptídica ou uma ligação éster entre os grupos carboxilo, amino ou hidroxilo livres dos polipéptidos e os grupos correspondentes do material veicular ou indirectamente utilizando rea gentes convencionais bifuncionais, tais como, por exemplo, este res m-maleimidobenzoil-N-hidroxi-succinimídicos (MBS) ou 4-(p--maleimido-fenil)-butirato de succinimidilo (SMPB). Podem obter -se comercialmente estes e outros reagentes bifuncionais, por exemplo na Pierce Chemical Company, Rockford, Illiniois, USA. Também ê possível utilizar dialcanais tal como, por exem pio, glutaraleído (Avrairteas, immunochem. , (5 (1969) 43-52) .
Pode separar-se o material veicular ao qual se encontram ligados os polipéptidos, dos polipéptidos não ligados e, se se considerar adequado, dos reagentes em excesso utilizando métodos conhecidos (por exemplo, diálise ou cromatografia em coluna).
Podem preparar-se os polipéptidos da presente invenção, especialmente, os que possuem menos de 50 resíduos aminoã-cidos, por métodos convencionais de síntese de pêptidos em fase líquida ou, de preferência, em fase sólida pelo método de Merri-field (J. Am. Chem. Soe., 85 (1963) 2149-2154) ou utilizando au tros métodos equivalentes da técnica anterior. A síntese de fase sólida inicia-se com o aminoãcido C--terminal do pêptido que se pretende sintetizar, que é ligado numa forma protegida a rim material de suporte adequado. Pode pre parar-se o material de partida acoplando um aminoãcido ao grupo amino protegido através de uma ponte de éster benzílico a um material de suporte clorometilado ou hidroximetilado ou formando
- .. uma ligação amida com um material de suporte benzidrilamina (BHA), metilbenzidrilamina (MBHA) ou álcool benziloxibenzilico. Estes materiais de suporte encontram-se comercialmente disponí_ veis e a sua preparação e utilização são bem conhecidas.
Os métodos gerais para a protecção e remoção dos grupos protectores dos aminoãcidos que se podem utilizar na presen te invenção encontram-se descritos em The Peptides, Vol.2, pp. 1-284 (editado por E. Gross e J. Meienhofer, Nova Iorque Acade-mic Press, 1979). Os grupos protectores englobam, por exemplo, os grupos 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc), tert-butiloxicarbo nilo (Boc), benzilo (Bzl), t-butilo (But), 2-clorobenziloxicar-bonilo (2C1-Z),diclorobenzilo (Dcb) e 3,4-dimetilbenzilo (Dmb).
Após remoção do grupo protector de o(-amino do amoniã-cido C-terminal ligado ao suporte, ligam-se os aminoãcidos protegidos, passo a passo, de acordo com a sequência pretendida. É possível sintetizar um polipêptido completo de acordo com este método. Em alternativa é possível construir pequenos pêptidos que depois se unem uns aos outros para formar o polipêptido pre tendido. Os agentes de ligação adequados pertencem â técnica an terior dando-se particular preferência â diciclo-hexilcarbodi-imida (DCC).
Colocam-se os aminoãcidos ou os pêptidos protegidos em excesso num recipiente de reacção para a síntese em fase sólida e pode efectuar-se a reacção de acoplamento em dimetilfor-mamida (DMF) ou em cloreto de metileno (Cí^-C^) ou numa mistura dos dois. No caso de se verificar um acoplamento incompleto, repete-se a reacção de acoplamento, antes de se remover o grupo protector de oi~and.no extremidade N, para o acoplamento do aminoãcido seguinte. Pode determinar-se, de um modo específico e preferencial/ a realização de cada passo de acoplamento de acordo com o método da ninidrina. As reacçóes de acoplamento e os passos de lavagem podem ser efectuados automaticamente.
Pode clivar-se o pêptido do material de suporte median te métodos conhecidos na química dos péptidosr tal como, por exemplo/ fazendo reagir fluoreto de hidrogénio (HF) na presença de p-cresol em sulfureto de dimetilo a 0°C durante 1 hora, seguido possivelmente por uma segunda reacção com HF na presença de £-cresol a 0°C durante 2 horas. Os pêptidos clivados dos materiais de suporte clorometilados ou hidroximetilados são pépti dos com uma extremidade C livre; os pêptidos clivados dos supor tes benzidrilamina ou metilbenzidrilamina são pêptidos com extremidade C amidada.
Por outro lado os pêptidos da presente invenção também podem ser preparados utilizando métodos de tecnologia de ADN recombinante (Maniatis et al. iri Molecular Cloning - A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Pode sintetizar-se, por exemplo, um fragmento de ADN que codifique um polipéptido deste tipo, de acordo com métodos químicos convencionais, utili^ zando, por exemplo, o método do fosfotriester tal como descrito por Narang et al. in Meth. Enzymol., 68 (1979) 90-108 ou utilizando o método do fosfodiéster (Brown et al., Meth. Enzymol., 68 (1979) 109-151). Estes dois métodos têm como consequência a síntese inicial de oligonucleétidos relativamente longos que se ligam uns aos outros de um modo pré-determinado. A sequência nu-cleotídica do fragmento de ADN pode ser idêntica â sequência nu-cleotídica que codifica o polipéptido natural no Plasmodium para sita. Uma vez degenerado o código genético, existe, por outro la -15- do, a possibilidade de que uma sequência nucleotídica parcial ou completamente diferente codifique o mesmo polipiptido. É possível, quando se considerar adequado, seleccionar as sequências nu cleotídicas dos codões preferencialmente utilizados pelo organiss mo hospedeiro que se utilizam para a expressão do polipêptido (Grosjean et al., Gene, 18 (1982), 199-209). No entanto, ê neces sãrio assegurar nesta ligação que o fragmento de ADN obtido deste modo não contenha sequências parciais que impeçam a construção do vector de expressão, por exemplo, por introdução de sítios de clivagem de enzimas de restrição indesejados ou que evitem a expressão do polipêptido. O fragmento de ADN que codifica o antigene do esporo-zSito do Plasítiodium de acordo com a presente invenção ou que codifica a parte B da sequência do polipêptido de fusão de_..aeordo com a presente invenção também pode ser obtido por clivagem do ADN genõmico de uma estirpe do Plasmodium com uma ou mais andonu cleases de restrição adequadas, por exemplo EcoRI. Isolaram-se 3 fragmentos com o comprimento de 1,5 a 6 x 10 pares de bases e incorporaram-se num vector adequado, por exemplo no vector gtll do bacteriõfagoX· O vector gtll foi descrito por Young et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80 (1983), 1194-1198 e pode obter-se na American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA ou em outras instituições. Pode embalar -se o ADN recombinante do bacteriõfago, in vitro, em revestimentos de proteínas de bacteriêfagos. Os bacteriõfagos infecciosos obtidos segundo esta via são introduzidos em células hospedeiras adequadas, por exemplo na coli Y1088 que contêm o plasmídeo pMC9 (que pode ser obtido na ATCC). Efectuou-se o rastreio de cer ca de 100000 bacteriõfagos recombinantes para se descobrirem os bacteriófagos que reagiam com uma sonda adequada. As sondas ade quadas deste tipo são oligonucleõtidos que correspondem a uma sequência parcial que codifica um polipeptido, de acordo com a presente invenção, de ADN genómico, ou anticorpos que reconhecem o antigene do esporo.zõito produzido pelos fagos -gtll. O modo segundo o qual se seleccionam e utilizam estas sondas ê do conhecimento do especialista. Efectua-se a replicação dos bacte riõfagos que contêm os fragmentos de ADN necessários e isola-se o ADN. Depois, podem incorporar-se os fragmentos de ADN dentro do vector microbiano replicãvel, de preferência dentro de um vector de expressão que proporciona os sinais de expressão necessários e o qual, quando necessário codifica as sequências parciais A e/ou C dos polipiptidos de fusão, anteriormente mencionados. Um vector de expressão preferencial é o vector pDS56/ RBSII,6xHis que se encontra descrito nos exemplos. Podem também preparar-se os polipéptidos da presente invenção após uma adaptação adequada da sequência nucleotídica noutros vectores de ex pressão adequados. Exemplos de vectores de expressão deste tipo encontram-se descritos no pedido de patente de invenção europeia, publicação N°. 186069, que foi publicado a 2 de Julho de 1986. O especialista terá conhecimentos de outros vectores de expressão adequados.
Introduz-se, então, o vector de expressão que contêm um fragmento de ADN com a sequência de ADN que codifica um poli-pêptido de acordo com a presente invenção no organismo hospedeiro adequado. Os organismos hospedeiros adequados são os microrganismos, por exemplo, células de levedura ou células bacteria-nas que são capazes de exprimir o polipéptido codificado pelos -17- ( / vectores de expressão. Os organismos hospedeiros preferenciais são a E. coli SG13009. Outros organismos hospedeiros adequados são a E. coli Ml5 (designados por DZ291 por Villarejo et al. em J. Bacteriol., 120 (1974) 466-474), E. coli 294, E. coli RR1 e E.coli W3110, que podem ser todas obtidas na ATCC, DSM ou em ou tras instituições. O modo segundo o qual os polipétidos de acordo com a presente invenção se exprimem depende do vector de expressão utilizado e do organismo hospedeiro. Os organismos hospedeiros que contêm o vector de expressão são normalmente propagados sob condições óptimas para o crescimento dos organismos hospedeiros. Próximo do fim da fase de crescimento exponencial quando o nume ro de células por unidade de tempo decresce, a expressão do po-lipéptido da presente invenção é induzida, isto é, o ADN que co difica o polipêptido ê transcrito e o mAFN ê transferido para a proteína. Também se pode efectuar a indução adicionando um indu tor ou um desrepressor ao meio do crescimento ou alterando os parâmetros físicos, alterando,por exemplo, a temperatura, Controla-se a expressão nos vectores de expressão utilizados na presente invenção, pelo repressor lac que se liga a uma sequência de controlo. Remove-se o repressor por adição de isopropil--b-D-tiogalactopiranósido (IPTG) e este induz a síntese do polipêptido. Outros sistemas de indução sao do conhecimento do es pecialista. O sinal AUG de início de transferência, que correspon de ao codão ATG ao nível do ADN faz com que todos os polipépti-dos sintetizados num organismo hospedeiro procariótico possuam um resíduo de metionina na extremidade N. Em determinados siste mas de expressão, cliva-se este resíduo N-terminal de metioni-na. Verificou-se, no entanto, que a presença ou a ausência de metionina na extremidade N não possui praticamente qualquer efeito sobre a actividade biológica do polipéptido (vidê Win-nacker, em Gene und Klone (Genes e Clones), página 255, Verlag Chemie, Weinheim, FRG, 1985. Nos casos em que existe uma interferência da metionina da extremidade N pode clivar-se esse resíduo de metionina utilizando uma peptidase especifica para a metionina N-terminal Miller et al. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84,(1987) 2718-2722) descreveram o isolamento de uma peptidase deste tipo a partir Salmonella typhimurium. A presente invenção refere-se, assim, a polipétidos com ou sem o resíduo de metionina na extremidade N.
Os polipêptidos produzidos nos organismos hospedeiros podem ser segregados fora das células de acordo com mecanismos específicos de transporte ou podem ser isolados por ruptura da célula. Pode efectuar-se a ruptura da célula de acordo com meios de tratamento mecânicos (Charm et al., Meth. Enzymol., 22,(1971) 476-556), meios de tratamento enzimãtico (tratamento com lisõzi-ma) ou meios de tratamento químicos (tratamento com agentes detergentes, tratamento com ureia ou com cloridrato de guanidina, etc.) ou por uma associação destes meios.
Podem então purificar-se os polipêptidos, de acordo com a presente invenção, segundo métodos conhecidos tais como, por exemplo, por centrifugação a velocidades diferentes, por pre cipitação com sulfato de amónio, diãlise (sob condições de pres são atmosférica ou de pressão reduzida) por focalização isoelêc-trica preparatória, por electroforese preparatória em gel ou, de acordo, com diversos métodos cromatogrãficos, tais como filtração em gel, cromatografia líquida de alta resolução (HPLC), croma-tografia de permuta iónica, cromatografia de fase inversa e cromatografia de afinidade (por exemplo sobre Sefarose Azul CL--68 sobre anticorpos monoclonais que são dirigidos contra o po-lipêptido e que se ligam a um veículo ou a resinas de quelatos metálicos).
Os polipéptidos da presente invenção podem encontrar--se na forma de multímeros, especialmente na forma de dímeros, tal como se indica através do diagrama na Fig. 8A. Também se po dem formar multímeros quando se produzem os polipéptidos em organismos hospedeiros procariõticos devido, especialmente, â for mação de pontes de dissulfureto entre os resíduos de cisteína. A presente invenção também se refere a composições imunogénicas que contêm um polipêptido, de acordo da presente invenção, e um adjuvante adequado. Os adjuvantes adequados para utilização nos seres humanos e animais são do conhecimento do especialista (Warren et al., Ann, Rev. immunol.,4,(1986) 369--388; Morein, Nature, 332,(1988) 287-288; Klausner, BIO/TECHNO-LOGY, 6_, (1988) 773-777 e Bromford, Parasitology Today, 5_, (1989) 41-46). Os polipéptidos e as composições imunogénicas de acordo com a presente invenção podem encontrar-se sob a forma de liofilizados para reconstituição com água esterilizada ou com uma solução salina de preferência uma solução de cloreto de sódio. A introdução dos polipéptidos e das composições imuno genicas, de acordo com a presente invenção, em mamíferos activa o seu sistema imunológico e faz com que os anticorpos se lancem contra o antigene do esporo.zóito do Plasmodium de acordo com a presente invenção. Estes anticorpos podem ser isolados a partir do soro. A presente invenção também se refere a anticorpos deste tipo. Os anticorpos de acordo com a presente invenção reagem com os parasitas da malária e podem, por isso, ser utilizados pa ra uma imunização passiva ou para fins de diagnóstico. Os anticorpos contra os polipiptidos, de acordo com a presente invenção, podem ser produzidos em macacos, coelhos, cavalos, cabras, porcos-da-índia, ratazanas, ratos, vacas, carneiros, etc., mas também podem ser produzidos em seres humanos. Pode utilizar-se, con forme necessário, os anti-soros ou os anticorpos purificados. Po dem purificar-se os anticorpos mediante métodos conhecidos, por exemplo por precipitação com sulfato de amónio. Também é possível produzirem-se anticorpos monoclonais que se dirigem contra o polipéptido da presente invenção, de acordo com o método desenvolvido por KÕhler et al. (Nature, 256, (1975) 495-497). Também se podem utilizar os anticorpos policlonais ou monoclonais para a purificação por cromatografia de afinidade dos polipéptidos da presente invenção ou dos seus equivalentes naturais.
Podem utilizar-se os polipéptidos, de acordo com a pre sente invenção, e as composições imunogênicas, para imunizar mamíferos contra a malária. 0 modo de administração, a dosagem e o numero de injecções podem ser optimizados de acordo com o parecer do especialista e de acordo com o método conhecido. Usualmen te, administram-se diversas injecções durante um determinado intervalo de tempo, para se obter um alto título de anticorpos con tra os parasitas de malária, o que significa contra os antigenes do esporozóito do Plasmodium da presente invenção.
As figuras e o exemplo pormenorizado que se seguem con tribuem para explicar melhor a presente invenção. No entanto, não -21- / se pretende dar a ideia de que a presente invenção se limita apenas aos exemplos ou âs figuras.
Legenda das Figuras
Fig. 1 Sequência de aminoãcidos da parte N-terminal do antige-ne do esporozõito de IV falciparum = sequência de aminoãcidos (I)
Fig. 2 Sequência nucleotídica do gene de IV falciparum que codifica o antigene do esporozõito = a sequência nucleotídica (1)
Fig. 3 Sequência de aminoãcidos da proteína de fusão com a sequência de aminoãcidos (II)
Fig. 4 cartografia parcial dos enzimas de restrição dos vecto-res NXY, NXY-L, NXY-H, M13-NXY e pDS-NXY. O vector NXY contém os nucleõtidos de 1-3088 da sequência nucleotídica (1) no fago lamb da gtll. As barras negras definem a região de código que se ini cia, presumivelmente, com o codão de iniciação ATG na posição 948-950 da sequência nucleotídica (1). Isolou-se um fragmento EcoRI de 1 kb (nucleõtidos de 1-1084) e um fragmento EcoRI de 2 kb (nucleõtidos de 1085-3088) a partir do vector NXY e integraram-se nos vectores M13 mpl8. Isto originou a formação a partir do vector NXY, do vector NXY-L contendo o fragmento EcoRI de 1 kb e o vector NXY-H contendo o fragmento de EcoRI de 2 kb. O vec tor M13-NXY corresponde ao vector M13 mpl8 que contêm os nucleõ tidos de 1-3088 da sequência nucleotídica (1). Este vector contém, deste modo, o mesmo ADN que o vector NXY. O vector pDS-NXY contêm o fragmento Asei de 1413 pares de bases (nucleõtidos 922- -2332 da sequência nucleotídica (1)) proveniente de M13-NXY, o qual após ter sido submetido a complementarização das suas extremidades salientes com Klenow polimerase foi tratado com li-gantes BamHI (10-mero) e clonado em pDS56/RBSII, 6xHis. 0 sentido correcto do promotor é determinado pela analise de restrição. As células de coli transformadas com pDS-NXY produzem, apôs indução, o antigene do esporozõito do Plasmodium recombi-nante de fórmula geral A-B-C com a sequência indicada na Fig. 3. A sequência de aminoãcidos desta proteína é codificada pelos nucleôtidos 922 a 2332 da sequência nucleotídica (1).
Fig. 5 Representação gráfica da distribuição dos aminoãcidos carregados positivamente (metade superior do eixo das ordenadas) e carregados negativamente (metade inferior do eixo das ordenadas) na sequência de aminoãcidos (I). A numeração dos aminoãcidos (abcissas) corresponde â da Fig. 1. Construiu-se o gráfico com o auxílio de um programa PC/gene "NOVOTNY" (Genofit SA. Genebra, Suíça).
Fig. 6 Representeção gráfica dos domínios hidrófobos da protejí na, na sequência de aminoãcidos (I) calculados pelo método de Kyte et al., J. Mol. Biol., 157, (1982) 105-132. Os numeros superiores a -5 (ordenadas) indicam os domínios hidrófobos. A numeração dos aminoãcidos (abcissas) corresponde à numeração indi cada na Fig. 1.
Fig. 7 Epítopes potenciais das células B na sequência de amino ãcidos (I). Os numeros indicados superiores a zero (ordenadas) representam a presença de possíveis epítopes de células B. Efec tuou-se o cálculo, de acordo com o método de Hopp et al., Proc.
Natl. Acad. Sei., 78, (1981) 3824-3828. A numeração dos amino-ãcidos (abeissas) corresponde â numeração indicada na Pig. 1.
Fig. 8 (A) Modelo da possível formação de dímeros por duas mo léculas de antigene esporozoítico, de acordo com a presente invenção, através da interaeção intermolecular entre as regiões carregadas positivamente e carregadas negativamente da sequência de aminoãcidos N-terminal do antigene do esporozéito do Plas-modium, de acordo com a presente invenção (ver também Fig. 5). (B) indica as regiões com diferentes propriedades na sequência de aminoãcidos (I) de acordo com os cálculos efectuados em computador (ver Figs. 5 a 7). + = domínio carregado positivamente; - = domínio carregado negativamente; glyc = potencial região de N-glicosilação; ag = região antigênica (o que significa uma maior probabilidade da presença de epítopes de células B; tm = possível sequência de transmembrana.
Fig. 9 A) Analise de ADN genõmico digerido com SspI a partir de 9 diferentes isolados de P^_ falciparum (Gentz e outros, EMBO J. 7, (1988) 225-230). Ensaiaram-se os seguintes isolados: pista 1 = T9/96.2; pista 2 = 13; pista 3 = CPG-1; pista 4 = 542; pis ta 5 = Kl; pista 6 = MAD20; pista 7 = R053; pista 8 = T9/94; pis ta 9 = RO-59. B) Análise de ADN genõmico digerido com Dral- (pistas 1 e 3) e com HindIII- (pistas 2 e 3) de duas espécies diferentes de Plas-modium (P. falciparum, pistas 1 e 2; berghei, pistas 3 e 4).
Fig. 10 Sequência nucleotídica do plasmídeo pDS56/RBSII, 6xHis.
As abreviaturas, tampões e meios indicados no presente pedido de patente de invenção e os métodos 1 a 15 utilizados -24 ( nos exemplos correspondem aos descritos no pedido de patente de invenção europeia, publicação N?.309 746, páginas 13 a 20. EXemplo
Isolamento de um gene do esporozoito de P. falciparum a partir de um banco genético de expressão genõmica, utilizando anticorpos
Preparação de um soro imunizado contra os esporozoitos de P. ^ falciparum
Isolaram-se os esporozoitos de P^ falciparum, isolado NF54, de acordo com métodos convencionais a partir de mosquitos
Anopheles stephensis infectados. Imunizou-se um coelho com duas semanas de intervalo, administrando-se em cada uma das ocasiões 6 - 10 destes esporozoitos em adjuvante completo de Freund. Obteve--se o imuno-soro de um modo habitual.
Construção do banco de genes de expressão de P. falciparum
Cultivaram-se as células de IV falciparum (isolado Kl) ) por métodos convencionais (Trager et al., Science, 193, (1976) 673-675), em 10 placas de cultura e depois lavaram-se num meio de cultura contendo saponina a 0,1%. Efectuou-se uma suspensão dos parasitas lavados em 2 ml de EDTA 10 mM (pH 8,0), 0,5% (p/v) de SDS. Apés a adição de 50 mg de proteinase K (Merck), incubou -se a mistura a 65°C durante 10 minutos e, depois, adicionou-se 2 ml de fenol (saturado com Tris/HCL 1 M (pH 8,0)). Misturaram--se as fases por agitação e separaram-se novamente por centrifu gação (10 minutos a 6000 RPM, a 20°C). Repetiu-se a extracção com fenol, duas vezes jã não se deveria observar uma interfase). Precipitou-se o ADN na fase aquosa tal como no método 1, lavou-se com etanol e secou-se. Dissolveu-se o ADN em 2 ml de água e efec-tua-se a sua ruptura, mecanicamente, isto ê, foi forçado 80 ve zes através de uma seringa com uma agulha de 0,5 x 16 mm. Depois adicionou-se 0,2 volume de 5 x tampão EcoRI-metilase (Tris/ HCl 50 mM (pH 7,5), NaCl 0,25 M, EDTA 50 mM,β-mercaptoetanol 25 mM, S-adenosilmetionina 0,4 mM) . Metilou-se 10 pg de ADN com 50 unidades de EcoRI metilase (New England Biolabs Beverly. Massachusetts. USA) a 37^C durante 30 minutos. Extraiu-se uma vez o ADN com fenol tal como se descreveu anteriormente e precipitou-se de acordo com o método 1. Dissolveu-se o ADN em 200 pl de tampão polimerase T4 e apôs a adição de 50 pl de dATP 5: mM, dCTP 5 mM, dGTP 5 mM e dTTP 5 mM, assim como de 10 unidades de polimerase T4, incubou-se a 37°C durante 30 minutos. Extraiu -se novamente o ADN com fenol e precipitou-se, de acordo com o método 1.
Dissolveu-se o ADN em 50 pl de tampão ADN ligase T4 e apôs a adição de 0,01 unidades de DO260 âe a<^aPtaâores oligonu-cleotídicos EcoRI fosforilados (New England Biolabs) e 2 pl de ADN ligase T4 (12 unidades de Weiss) ligou-se a 14°C, durante a noite. Efectuou-se a precipitação do ADN de acordo com o método 1, dissolveu-se em 20 r1 de 1 x tampão de carga em gel de ADN e fraccionou-se num gel de agarose a 0,8% (p/v) (método 2). Isolaram- se os fragmentos de ADN com um comprimento de 2 a 6 Kb (1 Kb = 1000 nucleôtidos) de acordo com o método 3. Dissolveu--se o ADN resultante em 50 pl de agua e apôs a adição de 6 pl de 10 x tampão ligase, 2 p1 de extremidades receptoras do bac-teriôfago lambda desfosforiladas (Promega Biotech., Madison -26-
/ Λ
Wl. USA) e de 6 unidades Weiss de ADN ligase T4, ligou-se a 14°C durante a noite.
Precipitou-se o ADN (método 1) e dissolveu-se em 5 p 1 de agua. Apõs a adição de 20 pl de extracto para embalagem (Genofit S.A., Genebra, Suiça), embalou-se o ADN em partículas do bacteriõfago lambda a 20°C durante 2 horas de acordo com as instruções do fornecedor. Após a adição de 500 p1 de tampão SM e de 50 pl de clorofórmio o banco de genes encontrava-se pronto para o ensaio com os anticorpos.
Ensaio de anticorpos num banco de genes
Incubou-se E. coli Y1090 em 3 ml de meio LB contendo 40 pg/ml de ampicilina, num caldo em agitação a 37°C durante a noite. Na manhã seguinte sedimentaram-se as células (10 minutos a 7000 x g, a 20°C) e efectuou-se a sua suspensão em 1 ml de tampão SM. A esta suspensão celular adicionaram-se 10 partículas de fagos infecciosos, provenientes do banco de genes, e incubou-se â temperatura ambiente durante 30 minutos. Adicionaram-se então 60 ml de uma solução de agar a 0,8% (p/v) em meio LB que tinha sido equilibrado a 42°C e misturou-se cui dadosamente. Distribuiu-se o agar mole com as células infectadas sobre 6 placas de LB-agar (135 mm de diâmetro) contendo 40 pg/ml de ampicilina e incubaram-se a 42°C durante 5 horas. Mer gulhou-se um filtro de nitrocelulose numa solução de IPTG 100 mM e, apõs secagem, colocou-se em cada um dos discos e incubou -se a 37°C durante a noite.
No dia seguinte marcou-se a posição do filtro relati -27- vamente ao disco e armazenou-se o filtro marcado, em 1 TBS. Co locou-se na plãca um novo filtro de nitrocelulose tragado numa solução de IPTG 100 mM, marcou-se e incubou-se sobre as placas, a 37°C durante 4 horas. Agitaram-se os dois conjuntos de filtros em 1 x TBS durante 10 minutos e depois incubaram-se em 1 x TBS, 20% de FCS (soro de feto de vitela) durante 20 minutos. Diluiram-se os anti-soros de coelho específicos para os esporo zõitos, a 1:1000 com 1 x TBS/20% de FCS e incubaram-se os dois conjuntos de filtros num caldo em agitação â temperatura ambien te durante 1 hora. Depois, lavaram-se três vezes os filtros em 1 x TBS, 0,1% de Tritorí^ X-100 durante 10 minutos, em cada uma das vezes e num banho agitado seguindo-se-lhe a incubação com 5 125 pd de / I ./-proteína A (Amersham, Aylesbury, GB: Catálogo o N 1M. 144) em 1 x TBS, 0,1% de albumina de soro de bovino isen ta de protease durante 1 hora. Lavaram-se novamente os filtros, tal como anteriormente se referiu, e depois secaram-se à temperatura ambiente. Expuseram-se os filtros a uma película de raios X Kodak XAR durante a noite. As placas que apresentavam uma reac ção positiva em ambas as placas foram identificadas com o auxílio das marcas na película e foram recolhidas das caixas de Pe-tri com base nas marcações. Colocou-se novamente a solução com o bacteriõfago em diversas diluições em agar mole de acordo com o método 4 e identificaram-se novamente, individualmente,as pia cas positivas tal como anteriormente descrito. Recolheu-se uma placa positiva que se designará daqui em diante por NXY, desenvolveram-se os bacteriõfagos lambda de acordo com o método 5 e isolou-se o ADN.
Dissolveram-se 10 jug do ADN de NXY em 490 jul de tam- -28 pão polimerase T4 e efectuou-se a sua digestão com 50 unidades O ^ de EcoRI a 37 C durante 1 hora. Efectuou-se a precipitação do ADN (método 1) e fraccionou-se num gel de agarose a 0,8% (p/v) (método 2), como controlo, efectuou-se a digestão de 10 ^ig de ADN de gtll com EcoRI e analisou-se. Encontravam-se presentes dois fragmentos EcoRI (de 2,0 e de 1,0 kb) apenas nas pistas com o ADN de NXY. Isolaram-se os fragmentos de EcoRI (método 3) e dissolveram-se em 50 pl de agua. Para se efectuar a clona gem, misturaram-se 50 ng de enzima EcoRI, de ADN de M13 mpl8 desfosforilado (Pharmacia Uppsala, SE: método 6) com 10 jil de cada um dos fragmentos de EcoRI dissolvidos a partir do ADN de NXY e adicionaram-se 2 jul de 10 x tampão ligase, 6 jil de água e 6 unidades Weiss de ADN ligase T4 e ligaram-se os ADNs â temperatura ambiente durante 1 hora. Transformaram-se as células competentes TG-1 de E. coli (Amersham) com o ADN ligado (método 7). Isolaram-se duas placas de cada cultura e amplificaram--se e isolou-se ADN suficiente para se determinar a sua sequên cia (método 8). Determinou-se a sequência do ADN de acordo com o método 9. Designaram-se os clones de M13 mpl8 que continham os fragmentos de EcoRI, por NXY-L (o fragmento de 1 kb) e por NXY-H (o fragmento de 2,0 kb) .
Introdução de eliminaçSes para determinação da sequência
Digeriu-se completamente 1 pg de ADN de NXY-L e de NXY-H com BamHI e PstI. Decorrida uma hora, efectuou-se a preci pitação dos ADNs (método 1) e dissolveu-se o sedimento em 100 jil de Tris/HCL 66 mM (pH 8,0) e MgC^ 6,6 mM. Adicionaram-se 10 unidades de exonuclease III e depois incubou-se a mistura a -29-
37°C. Recolheram-se amostras de 30 jil decorridos 1, 3 e 6 minu tos e i ádidioriQu-se 3 ^al de EDTA 0,5 M. Precipitaram-se as amostras de acordo com o método 1. Dissolveram-se os ADNs em 50 jil de tampão nuclease SI (acetato de potássio 0,3 M, sulfato de zinco 10 mM, 5% de glicerol (v/v). Adicionaram-se 10 unidades do nuclease SI e depois incubou-se a mistura â temperatura ambiente durante 30 minutos. Extrairam-se uma vez as amostras com fenol e éter e depois precipitaram-se de acordo com o mêto do 1. Dissolveram-se os ADns em tampão HIN e incubaram-se com 5 unidades de polimerase Klenow a 37°C, durante 2 minutos. Adicio nou-se 1 jil de dATP, dCTP, dTTP e dGTP 0,25mM e, depois, incubou-se a mistura durante mais 2 minutos. A adição de 5 jil de 10 x tampão ligase e de 400 unidades de ADN ligase T4 seguiu-se a ligação, â temperatura ambiente durante a noite. Transformaram-se, então, as células de E. coli com o ADN, de acordo com o método 7. Analisou-se a sequência de ADN de acordo com os métodos 8 e 9.
Análise da Sequência da Proteína NXY )
Analisou-se a sequência das proteínas (I: Fig. 1) derivada da sequência do ácido nucleico (1; Fig. 2) quanto ã distribuição de carga (Fig. 5) hidrofobicidade (Fig. 6) e quanto â presença de possíveis epítopes de células B(Fig. 7). Verificou--se que a sequência de aminoãcidos (I) possuia, iniciando-se na extremidade N, um cacho de cargas positivas seguido de um cacho de cargas negativas. A estes seguiam-se os resíduos aminoãcidos que podiam ser N-glicosilados (Fig. 8B) seguidos de uma região que continha potenciais epítopes imunogénicos de células B. Uma . .,.00-
sequência típica de transmembrana (Figuras 6 e 8B) encontrava--se situada na parte C-terminal da sequência de aminoãcidos (I) e podia servir para ancorar a proteína â membrana do esporozói to. Isto parece ser possível com base nesta análise de sequência de aminoãcidos em que as regiões carregadas, incluindo o domínio imunogênico, se encontram expostas na superfície dos esporozói-tos e, deste modo, se encontram expostas ao sistema imunitário.
Esta hipótese e suportada pelo reconhecimento do antigene do esporo zóito, de acordo com a presente invenção, pelos soros humanos dos indivíduos expostos à malária (ver adiante), A figura 8A indica um modo segundo o qual dois polipéptidos, de acordo com a presente invenção, podem formar dímeros através da extremidade N, carregada. No caso de uma imunização com NXY, esta formação dimêrica pode também conduzir a uma ligação directa dos polipéptidos, de acordo com a presente invenção, que contêm a parte N-terminal da sequência de aminoãcidos (I) para o antigene esporozoítico natural do Plasmodium da presente invenção e que conseguem, através desta reacção, impedir ou mesmo inibir a invasão dos hepatócitos.
Análise do gene NXY do parasita da malária P. berghei
Infectaram-se os ratos por via intravenosa com P. ber£ hei (isolado de Anka). Recolheu-se o sangue dos ratos a uma pa-rasitêmia de 40%. Isolaram-se os parasitas a partir do sangue, de acordo com o método de Trager et al., Science 193,(1976) 673--675.
Preparou-se um banco de genes do genoma do Plasmodium berghei, tal como se descreveu anteriormente para o isolado Kl
dé E. falciparum. Depois, colocou-se este banco de genes lambda de £* berghei,tal como anteriormente se referiu (2 x 10 partículas de bacteriôfago sobre duas caixas de Petri com 135 mm de diâmetro). Decorridas cinco horas, quando as placas se tornaram visiveis, removeram-se as caixas de Petri da incubadora onde se encontravam, a 37°C e, armazenaram-se no frigirífico durante a noite. Colocaram-se, então, filtros de nylon PALL (FALL, Basileia, Suiça) sobre as caixas frias e marcou-se a posição relativa dos filtros sobre as caixas de Petri com uma caneta de pon ta de feltro. Decorridos 5 minutos levantaram-se cuidadosamente os filtros das placas e colocaram-se com o lado que continha as placas voltado para cima, sobre papel Watmann 3 MM que tinha si do previamente impregnado com uma solução alcalina (hidróxido de sódio 0,5 N e Tris 0,5M) . Decorridos alguns minutos, colocaram-se os filtros sobre novo papel Watmann 3 MM impregnado com a solução alcalina. Depois secaram-se rapidamente os filtros so bre papel de filtro 3 MM e colocaram-se duas vezes durante 5 mi nutos sobre papel Watmann 3 MM que tinha sido previamente impregnado com NaCl 1,5 M, Tris/HCl 0,5 M (pH 8,0). Depois secaram-se os filtros ao ar livre e colocaram-se a 80°C, no vácuo durante 90 minutos. Preparou-se uma sonda de P. falciparum, isolando o fragmento de EcoRI de 2 kb do clone NXY-H (métodos 1, 2 e 3) e marcou-se esta sonda radioactivamente (método 11). Obte ve-se um clone positivo (PB-B) utilizando esta sonda de P. falciparum que se isolou (métodos 4 e 12) e se analisou. Propagou--se o clone PB-B de acordo com o método 5 e isolou-se o ADN que se digeriu com EcoRI (método 2). Isolou-se um fragmento de 400 pb que não se encontrava presente no ADN de controlo (lambda gtll) que se clonou em M13 mp!8 e que se sequenciou (métodos 6, 7, 8 e 9). Os primeiros 47 aminoãcidos após o codão de iniciação ATG que eram codificados pelo ADN PB-B eram idênticos aos aminoãcidos correspondentes do antigene do esporizõito de P. falciparum com a sequência de aminoãcidos (I) N-terminal. Esta homologia sequencial i excepcional. Deste modo, por exemplo, existe uma pequeníssima homologia sequencial no caso de sequências repetitivas do antigene CS do circunsporozõito em diversas espécies de Plasmodium.
Preparação de Um polipéptido, de acordo com a presente invenção, na E. coli
Clivaram-se parcialmente 5 jag de ADN de NXY com 10 unidades de EcoRI a 37°C durante 2 minutos. Isolou-se o fragmento de 3 kb resultante, de acordo com os métodos 2 e 3 e introduziu-se no sítio de clivagem EcoRI de M13 mpl8 (método 6). Designou-se o subclone por M13-NXY.
Isolou-se um fragmento Asei específico para o P. falciparum a partir do clone M13-NXY, de acordo com os métodos de 1 a 3, tal como se segue. Digeriram-se 6 jig de ADN de Ml3-NXY com 30 unidades de Asei em 100 pl de 1 x tampão polimerase T4 a 37°C durante uma hora. Efectuou-se a precipitação do ADN (método 1) e fraccionou-se sobre um gel de agarose 0,8% (p/v) (método 2) e isolou-se um fragmento de 1 400 pb (método 3). Preenche ram-se as extremidades com polimerase Klenow, tal como anterior mente se descreveu. Voltou a efectuar-se nova suspensão do fraçf mento em 20 pl de água e apos a adição de 10 pmoles de um adaptador oligonucleotídico BamHI fosforilado (10-mero: CCGGATCCGG; New England Biolabs), 2,5 ul de 10 x tampão ligase e 6 unidades
Weiss de ADN ligase T4, ligou-se a 14°C durante a noite. Efec-tuou-se a precipitação do ADN (método 1) dissolveu-se em 50 jul de 1 x tampão polimerase T4 e apôs a adição de 40 unidades de BamHI, digeriu-se a 37°C durante 1 hora. Efectuou-se a precipitação do ADN (método 1) e fraccionou-se sobre um gel de agarose a 1,0% (p/v) (método 2). Isolou-se um fragmento de 1400 pb (método 3) e dissolveu-se em 10 jil de água. Para se preparar o vec tor (ver método 6) digeriu-se 1 jig do ADN do vector pDS56/RBSII, 6xHis com 10 unidades de BamHI em tampão polimerase T4 a 37°C durante 1 hora. O vector pDS56/KBSII,6xHis é um derivado do vec tor pDS56/RBSII gue se encontra descrito pormenorizadamente no pedido de patente de invenção europeia publicação N°. 282 042. A sequência nucleotídica do vector pDS56/RBSII,6xHis encontra--se indicada na Figura 10. O vector pDS56/KBSIIf6xHis difere do vector pDS56/RBSII por possuir um fragmento de ADN adicional que codifica 6 resíduos de histidina. Pode preparar-se o vector pDS56/RBSII,6xHis, a partir do vector pDS56/KBSII, de acordo com métodos convencionais, de tecnologia de ADN recombinante, por exemplo, por incorporação de um fragmento de ADN de síntese adequado no vector pDS56/RBSII. O vector pDS56/RBSII,6xHis encon tra-se depositado na forma de uma cultura de E. coli M15 contendo os plasmídeos pDS56/RBSII,6xHis e pDMI, 1 desde 6 de Abril de 1989 no Deutsche Sammlung von Mikroorganismer, Mascheroder Weg 16 em Braunschweig, Alemanha sob o número de depósito DSM 5298 em específica conexão com o pedido de patente de invenção europeia, publicação N°. 393 502, de acordo com o tratado de Budapeste. Desfoforilou-se o vector ADN (método 4), extraiu-se uma vez com fenol (ver descrição anterior), purificou-se sobre um gel de agarose a 0,8% (p/v) e isolou-se, subsequentemente, de -3/ ί '> η.
.J acordo com ο método 3 .Dissolveu-se o ADN. isolado em 50jal de âgua.
Incubaram-se 5 jil do ADN do vector pDS56/RBSII, 6xHis linearizado que se tinha digerido com BamHI e desfosforilado (método 6) com 5 jil de um fragmento de 1400 pb, 1,2 jj.1 de 10 x tampão ligase e 6 unidades Weiss de ADN ligase T4, â temperatu ra ambiente durante 1 hora. Depois, transformaram-se 10 jil de ADN em células competentes de coli SG13009 (pUHAl) (método 7) e colocaram-se em placas LB contendo 100 jig/ml de ampicili-na e 25 p.g/ml de canamicina. Recolheram-se individualmente as colónias com um palito e transferiram-se para 3 ml de meio LB contendo 100 pg/ml de ampicilina e 25 jig/ml de canamicina. Incubaram-se as culturas num caldo agitado a 37°C até ã densidade óptica a 600nm (DO^qq) com meio puro como referência ser de 0,6. Recolheu-se uma alíquota de 500 jil da cultura com o contro lo não induzido. Adicionou-se IPTG (a uma concentração final de 1 mM) a parte restante da cultura e incubou-se a cultura induzi da durante mais 3 horas. Removeu-se então 500 jil da cultura in duzida e centrifugou-se conjuntamente com uma amostra não indu zida (3 minutos a 12 000 RPM, 20°C). Aspirourse_o_sobrenadante e efectuou-se uma suspensão do sedimento celular em 100 jil de tampão de amostra SDS. Incubaram-se as amostras em água em ebulição durante 7 minutos e depois fraccionaram-se as proteínas num gel de poliacrilamida SDS a 12% (método 13) por electrofore se (3 horas a uma corrente constante de 50 mA). Corou-se o gel com 0,1% (p/v) de azul de Coomassie em 30% (v/v) de acido acêti co e 10% (v/v) de metanol num agitador durante 30 minutos. Descolorou-se o gel em 10% (v/v) de metanol e em 10% (v/v) de acido acético a 65°C durante 2 horas. Os clones que apresentavam bandas adicionais foram comparados com as amostras não induzidas com peso molecular aparente de 69 kD.a (= 69 000 Daltons) e designaram-se por coli SG13009 (pDS-NXY? pUHAl). A estirpe SG 13009 de coli (pDS-NXY? pUHAl) foi depositada a 16 de Março de 1990 no Deutsche Sammlung von Mikroorganismen em B.raunschweig, Alemanha, sob um numero de depósito DSM 5846 de acordo com o tra tado de Budapeste. A estirpe SG13009 de coli foi descrita por Gottesman et al., em J. Bacteriol., 148, (1981) 265-273. O plas-mídeo pUHAl codifica o repressor lac. É um derivado do plasmídeo pDMI, 1 que se encontra descrito pormenorizadamente no pedido de patente de invenção europeia, publicação N°. 309 746. O plasmídeo pUHAl difere do plasmídeo pDMI,l pela substituição do alelo laclg pelo alelo lacl que contém o promotor de tipo selvagem. Es ta substituição assegura a produção de uma quantidade óptima de repressor, lac, na estirpe SG13009 (pDS-NXY; pUHAl). Isto torna possível uma expressão particularmente eficiente de uma proteína recombinante. Pode obter-se a estirpe SG13009 (pUHAl) de um modo conhecido que se inicia na estirpe SG13009 (pDS-NXY? pUHAl).
Análise de mancha de Western dos produtos de expressão de pDS--NXY
Fraccionou-se um lisado E^ coli SG13009 (pDS-NXY;pOHAL) num mini-gel SDS e transferiram-se as proteínas para filtros de nitrocelulose (métodos 13 e 14). Depois analisaram-se os filtros de acordo com a técnica de mancha de Western (Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76, (1979) 4350-4354) utilizando soro de coelho anti-esporozoítico ou soros humanos de indivíduos expostos â malária. Segundo este procedimento foi possível demonstrar que estes soros reconheciam os antigenes específicos para os pa / ( -36- {' r rasitas da malária num lisado. Isto significa que o antigene de síntese com a sequência de aminoãcidos (II) é reconhecido pelos anticorpos contra o antigene natural, o que significa que coincide em pelo menos um epítope específico com o antigene do espo rozõito do PlasModium falciparum com a sequência de aminoãcidos (I) na extremidade N. Também é possível concluir-se indirecta-mente que o antigene natural pode ser reconhecido in vivo pelo sistema imunitário de indivíduos infectados.
Reacção de anticorpos contra a proteína recombinante de 69 KDa com esporozõitos e P, falciparum em diversas fases no sangue
Efectuou-se uma cultura de |h_ coli SG13009 (pDS-NXY; pUHAl) de acordo com métodos convencionais e induziu-se de modo a expressar o polipêptido recombinante com a sequência de amino ácidos (II) (= proteína de 69 kDa). Depois isolou-se a proteína recombinante de 69 kDa a partir do lisado de coli e purificou-se por cromatografia de afinidade numa resina de quelato de ácido nitrilotriacético/níquel. Utilizou-se a proteína purificada de 69 kDa para se imunizarem coelhos. Após duas injecções de reforço ensaiou-se o soro para se verificar a existência de esporozõitos e de merozõitos de Plasmodium não fixos por imuno-flurescência. 0 soro reconheceu ambas as fases do parasita. Por isso ensaiou-se o soro de coelho (diluição de 1:500) em manchas de Western de esporozõitos e extractos de fases sanguíneas. O soro reconheceu uma banda de 200 kDa no extracto esporozoítico enquanto três bandas de, aproximadamente, 50-55 kDa foram reconhecidas no extracto da fase sanguínea. As proteínas de 50-53 kDa das fases sanguíneas foram descritas por Wahlgren et al., -37-
Proc. Natl. Acad. Sei. USA’ 83, (19B6) 2677-2681. A comparação da sequência de aminoâcidos destas proteínas de 50-53 kDa com a sequência de aminoâcidos do antigene do esporozõito da presente in venção indica que deve tratar-se de proteínas diferentes. Também se descobriu que quando se utiliza NXY-ADN como sonda não se de-tectam transcrições de NXY no ARN da fase sanguínea. Deste modo, o antigene do Plasmodium, de acordo com a presente invenção, ê específico para a fase esporozoítica.
Reconhecimento do gene NXY em 9 isolados de p. falciparum e de P. berghei
Digeriu-se ADN genõmico de 9 isolados diferentes de P. falciparum com SspI e separaramrse os fragmentos num gel de agaro-se a 1,2% (p/v). Transferiram-se os ADNs para uma membrana de ni trocelulose e hibridaram-se com uma sonda radioactiva específica do gene do antigene do esporozõito do Plasmodium a partir do ADN de M13-NXY (fragmento EcoRI de 2 kb) (60°C, 2xSSC; métodos 2, 3, 12, 15). A parte A da Figura 9 demonstra claramente que se podem detectar duas bandas (de aproximadamente 1,7 kb e de aproximada-mente 15 kb relativamente aos marcadores) com os 9 isolados que estavam em analise. As diferenças na intensidade eram originadas por diferentes quantidades de ADN.
No sentido de se verificar se o gene de NXY também podia ser detectado no parasita da malária P^_ berghei, no rato, di geriu-se em cada um dos casos o ADN de P_;_ falciparum (pistas 1 e 2) e o ADN de P^_ berghei (pistas 3 e 4) com Dral (pistas 1 e 3) ou com HindIII (pistas 2 e 4) e ensaiou-se, tal como anteriormen te se referiu, com a sonda radioactiva obtida a partir do ADN de -38 Μ13-ΝΧΥ. A parte B da figura 9 demonstra claramente que se pode detectar uma banda específica de NXY nas 4 pistas. Apesar do ADN específico de NXY possuir diferentes dimensões em cada um dos ca sos não existe, contudo, uma reacção cruzada não específica, de vido ao facto de, tal como anteriormente se demonstrou, a sequê cia nucleotídica que codifica os primeiros 47 aminoãcidos do ADN de falciparum ser idêntica à sequência nucleotídica correspondente do ADN de J^_ berghei.

Claims (9)

  1. 9- REIVINDICAÇÕE 1.- Processo para·'a preparação de um polipeptido gue coincide em pelo menos um epitope específico com o antigene es-porozoito Plasmodium falciparum o qual contém a sequência de aminoácidos N-terminal (I) .-40- T 10 I 15 I 1 Met AS? Lys Vai 1 Asr. « ^ . Λ-.& vai His Lvs 1 Lie Asr. Aia Vai 1 Lys 1 6 vai As? Aia vai % mm Λ£*« «ys vai A Ser vai Asn Lys Leu AS? Vai 21 vai Asr. Lys «W *. Asr. vai 2sr lys Leu Asr. Aia vai * V m Lys 45 vai As? Ser Vai n=S Lys Met Asn % * a Λ·£ Vai Asn Lys vai * MM Λί.* Ala 61 Vai * Ai.* Lys Vai Asn Aia vai Asn —ys vai Asn vai Vai Asn Lys 75 Lys AS? lie Leu Asn j-ys Leu A,sr. A.la Leu Tyr Lvs Met Asr. Aia 51 Vai Tvr 4 Lys v S- Asn r.—— Leu Asn » m * * Vai Ser Ala Vai Asn Lys 105 Vai Ser Aia vai Asn Lys vai Ssr » ' * Λ·* Vai Asr. Lys Met Gly Ala 121 Vai Asr. * Λμι <M vai Asn Gly vai Asr. Lvs Vai Asn Giu Vai As? Giu 125 Vai Asn Giú Vai Asr. C-lu Vai Asr. v*» Vai Asn Giu Vai As? Giu 151 Leu Asn Giu Vai Asr. Asn Vai Asr. 11. Vai Asn Giu Vai As? Ser 155 vai Asr. Giu vai Asn Giu Met Asn .. cmm Vai Asn Lys Vai AS? Glu 161 Leu Asn Giu vai Asr. Giu Vai % mm ΛΑ*· λ£Γ. Vai Asn Giu Vai AS? Asr. 1=5 Vai Asn Vai Met Asr. Asn Vai Asr. C-lu MSC Asn Asr. Met Λ MM /-.w.4 Giu 211 Met v mm Asn Vai r.sn Vai Vai Asn Giu Vai Asn Asr. Vai Asr. Giu 226 Vai Asn Asn vai Asn Giu Met Asr. > Aak Vai Asn Giu Met As? Asn 241 Meu Asn Giu Met Asn t mm Λΐ.* Vai Asn vai vai Asn Giu vai .“.sn Asn 255 Vai Asn Giu Meu Asn Asr. Thr Asn Giu Leu Asr. Glu vai * «·« AS** Giu 271 Vai Asn Asn vai Asn Giu Vai Asn * » _ r.i *. Vai Asn Vai Vai As? Giu 265 Vai Asn Asr. vai Asn Giu Met Ιϊΐ As? Met Asn Glu Leu As? Glu 301 Vai Asn Gly vai As.r. Giu Vai Asn r»*** '•'U — A.sn Giu lie :-:is Glu 315 Me? Asn Asn lie Asn Giu Vai A.sr. Asr. mU m Asn Glu Vai M C*1 Asn 331 rfV. «- Asn Giu Lie m··*· -1- Giu Met Asn * — —_ AS** Met Asn AS? Vai Asr. Asn 245 mW v Asn Giu ris Asn Vai Vai Asn vai Asn Giu Vai « MM, Lys 261 Vai Asn As? Ser Asn Asn Ser Asn % Λ£* Aia Asn Glu Giy Asr. Asn 376 Aia Asn * r m Ser nSn AS? Ser Ser « MM AS.» Thr Asn Asn Asn «U M Ser 291 Ser Ser «U «· > «. *4 /Vi.* Asn Ser Asn Asn % MM AS.» —v— Ser Cys Ser Ser Gin 405 Asn Γ—V. — «V« «U m Ser Ser Giu Asn As? As? Ser Leu Giu As? Lys 421 Ar? Asn Giu Giu As? Giu As? Giu Glr AS? As? Gin Lys * « *M « r*u« 425 Gir. Lys Giu Lys Aw?* Asr. Leu C-lu Glr. C-lu As? Met Ser 'TU**· » V M Λ 451 C-lu As? Ϊ 1·#«» * — r Asn Lys Asn As? Giu Lys Asn Lie As? Glu C-lr. Asp 465 Lys ?he His 1-cU Ser Asn r.S? — su. Gly Lys Lie * 4 * As? « U M «Tm 461 r.i** Gir. Giy As? Giu Vai Vel Vai Ser Lys Asn Lys AS? Lys Leu 496 Giu Lys His Leu % mm As? Tvr Lys Ser • Ύ M Tyr • yr Leu Ser Lys 511 Aia - u — Leu Met A3? Lys Ils Giy Giu 5er Glr. As? Asn AS? AS? =25 Asr. Vai Cys Asr* Ser As? Giu «eu Giy — As? vj — — Ser Lie 541 Lys «•V.— Asr. Ssr As? Gin As? As? As? vai Lys Giu Lvs AS? AS? 555 Ser Asr. Lie ?he Met Lys MSt Lie Lie Lie lie Ar? —eu Vc- Lie 571 Ket Lie Lie Met Lie Met rLs Lie Lie Tm Tyr Leu Lis Leu = 65 Glr. AS? -y s Lis Lie Tm Ar? Λ <»« Γ.ν* . «ys —y s Vai Giu —y s «Um Ser 501 Asr. Lie «.cU Asr. Λ=η ?r.s AS? AS? As? dy Asr. AS? Λΐ.. * MM, AÍ « As? 515 As? Asr. As? As? Asn As? As? As? As? Asr. Asn Asr. Asr. AS? As? 531 Met Asn Asn r - — C··* Lyr As? r' « Λ’ .. Aft? Asn Lie Asr. « W M As? 546 „ r » .-v=r. Lie * — c — Lyr «u — ?rc Ser As? f* , - m r" — U««» Lie Glr. AS? As? £51 «».m Met * Λβι Λϊ.* f**U w λ£Γ. Me? Tyr * m ?rr —eu w» ,. AS? «Um =75 4 T m Ser Λ$Γ. /vSC Tis Glu As? = er Thr Lis Asr. Ai? /%S? » w 1 Μ M S As? Ser V - - λ£Γ. Asr. Aer Asn Thr TMr As? i V w λΞΓ. —w ·» -r.e — £ i;cT /“ · .. Met As ? caracterizado pelo facto: a) de se cultivar, sob condições que permitem a expres são do polipeptido codificado pelo ADN, um microrganismo que foi transformado com um vector microbiano replicável o qual con tém um ADN que codifica o referido polipeptido, em particular um ADN que contêm a sequência nucleotídica a partir da posição 948 até à posição 3088 na sequência (I) ou uma parte dessa sequência, e b) de se isolar o polipeptido a partir da cultura.
  2. 2,- Processo para a preparação de um polipeptido que coincide em pelo menos uma epitope específico com o antigene esporozoito Plasmodium falciparum o qual contém a sequência de aminoácidos N-terminal (I) e cujo polipeptido está ligado covalqi mente a um peptido de afinidade, por exemplo o polipeptido com a sequência de aminoácidos (II) > 1 Me: Ar: Gly Se: IS Vai Asn Lvs Giu 31 ——e Asn Ala Vá: 46 Vai Asr. Lvs Leu 61 leu Asr. Aia Vai 76 Vai Asr Lys Vai 51 Vai Asr. Vai Vai 105 Leu Tyr Lys Me: 121 Vai Ser Aia vai 136 Vai Asn Lys Me: 151 Vai Asn Glu Vai 1 £6 Vai Asr. Glu Vai 181 Vai Asr. Giu Vai 156 Vai Asr. Lys Vai 211 Vai Asr. Glu Vai 225 Me: Asr* Asn Ms: 241 Vai Asr. Asr. Vai 255 Vai Asr. Giu Me: 271 Vai Asr. Glu Vai 285 Leu Asr. Giu Vai 301 Vai Asr. "ai Vai 316 Me: Asr. Giu Leu 331 ---Aiu WiU 346 Thr Asr. Giu Vai 351 Me: Asr. As: vai 376 Vai Asr. Glú vai 351 Aia Asr. Glu Gly 406 Asr. Asr. Asr. 421 Vhr Ser Cys Se: 436 Asp Ser Leu Glu 451 As? As? Glr. Lys 466 Glu As? Me: Ser 481 Asr. 11 a Asr. Gly À2- Ñ I V.-, H:s Mas HiS His His His Giy Ser Vai Asn Ser Asr. Asr. Me: Asr. lvs Vai Asr. Ala Vai His Lys Asp Lys vai Asn Ala Vai Asr. Lys vai Asn Ser * «MM Λ*Γ* Vai Vai Asn —ys ****** Ac·· Vai Leu Ser Lys • Lys Vai Asr. e ~— vai His Lys Me: Asr. Ala Asr. Aia Vai Asn lys Vai Asr. Ala Vai Asn Lys Asr. Lys Lys As? llâ Leu Asn Lys Leu Asr. Ala Asn r._c. Vai Tyr lys Me: .Asn Aia Leu Asr. LyS Asn Lys Vai Ser Vai Asn Lys Vai Ser Aia Giy Aia Vai Asn % 1--, Vai Asr. Giy vai Asr. Lys Asn G* Vai Asr. Glu Vai Asr. Giu vai Asn Me: % —— λα*. Glu Leu Asn G’ ·' Vai Asn Asn vai Λώ.» AÍ6 % ·*%— Ser Vai Asr. Giu Vai Asn Giu Me: Asn Giu Asr. Giu Glu Vai Asr. Giu Vai Asn Asn. a.£" Vai Asr. Vai Me: Asn Asr. Vai is- et'·' • •d·* » wk Asr. Glu Me: Asn Vai Asn vai vai AC.* Glu Vai Asn AC.· Vai Asr. Glu Me: Asn Asn Asn Me: Asr. r-% ·« Me: Asn Asr. Vai Asn Vai Asn Asn vai Asr. Q* , , Me: Asr. Asr. Asr. Giu • ··>·« Glu Vai Asr. *__ Vai Asr. Glu vai Asn Glu Vai Asn « _ Vai Asr. Glu Me: Asr. Asn Asr. Glu Vai Asn Λ' .. W·» Vai Asn Glu Vai * Λ.Ο.* AC** HiS ÇV» Me: Asr. Asn lie Asr. Glu vai Asn Asr. Asr. Asn Thr Asr. Glu lie Tyr Glu Me: Asn Asn Asn t AC"* Asn Gl** lie .Asn Vai Vai Asn Aia Asn Lys Vai Asn AS? Ser %__ AC?* Asn Ser Asr. Asp Asn Asr. Ala Asn Ser •Asn As? Ser Ser •Asn Ser Ser Ser Asr. Asn Ser Asr. Asr. Asr. Ser Glr. Asr. ΡΊ... u_ Ser Ssr Glu Asn Asn Asn Lys Ar c Asn Glu Glu As? Glu As? Giu Glu As? Glr. Lys r * ψ _ -VO Asn Asn —eu Giu Glr. * ^ w . » e Giu As? % - r_ A»·· Asn lys Asr. AS? Glu Lys lie t Λ· M » · % Λ. — A Λ — CL -ys Leu Asn caracterizado pelo facto: a) de se cultivar sob condições que permitem a expressão do polipeptido codificado pelo ADN, um microrganismo que foi transformado com um vector microbiano replicável o qual con têm um ADN que codifica o referido polipeptido, em particular um ADN que contém a sequência nucleotídica a partir da posição 948 até â posição 3088 na sequência (II) ou uma parte dessa se- -43- / 'ti* V guencia; e b) de se isolar o polipeptido a partir da cultura.
  3. 3.- Processo para a preparação de um polipeptido que coincide em pelo menos um epitope específico com o antigene es porozoito Plasmodium falciparum o qual contém a sequeência de aminoãcidos N-terminal (I) e cujo polipeptido compreende uma parte da sequência (NXY)n, (YNX)n OU (XYN)n na qual N representa um resíduo de asparagina; X representa um resíduo de aminoãcido carregado, por exemplo um resíduo de aminoãcido de ácido glu-tâmico ou lisina; Y representa um resíduo de aminoãcido hidrofõbico, por exemplo um resíduo de aminoãcido de valina ou metiomina, e n representa um número compreendido entre 3 e 120, caracterizado pelo facto: a) de se cultivar, sob condições que permitem a expres são do polipeptido codificado pelo ADN, um microrganismo que foi transformado com um vector microbiano replicãvel o qual con tém um ADN que codifica o referido polipeptido, em particular um ADN que contém a sequência nucleotídica a partir da posição 948 até à posição 3088 na sequência (II) ou uma parte dessa se- 44-
    quência; e b) de se isolar o polipeptido a partir da cultura.
  4. 4.- Processo para a preparação de um polipeptido tal como definido nas reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo facto: a) de se preparar por métodos convencionais de síntese peptídica, péptidos que correspondem a sub-partes do referi do polipeptido; e b) de se ligarem vários péptidos na sequência requeri da.
  5. 5. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindi cações 1 a 4, caracterizado pelo facto de se purificar adicionalmente o polipeptido até â homogeneidade.
  6. 6. - Processo para a preparação de um vector microbia no replicável, o qual contém um ADN que codifica um polipeptido tal como definido nas reivindicações 1, 2 ou 3, em particular um ADN que contém a sequência nucleotídica a partir da posição 948 até à posição 3088 da sequência II, ou uma parte des sa sequência, caracterizado pelo facto: a) de se integrar num vector, um ADN que codifica o referido polipeptido, em particular um ADN que contém a sequên cia nucleotídica a partir da posição 948 até à posição 3088 na
    sequência II, ou uma parte dessa sequência; b) de se replicar num microrganismo o vector transforma do; e c) de se isolar os vectores microbianos replicados a partir do microrganismo.
  7. 7. - Processo para a preparação de um microrganismo transformado o qual é susceptível de produzir um polipeptido tal como definido nas reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pe lo facto: a) de se transformar um microrganismo que contém um vector microbiano replicável, em que o vector contém um ADN que codifica o referido polipeptido, em particular um ADN que contém a sequência nucleotídica a partir da posição 948 até â posição 3088 na sequência II ou uma parte dessa sequência, em que o ADN está ligado a uma sequência de controlo de expressão ) de forma que o polipeptido codificado pelo ADN possa ser ex presso; e b) de se desenvolver o microrganismo transformado num meio de cultura.
  8. 8. - Processo para a preparação de anticorpos que são dirigidos contra um polipeptido preparado pelo processo de acor do com as reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo facto: a), de se injectar um polipeptido preparado pelo proce£
    ί so de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, em um organismo ho£ pedeiro adequado, o qual é susceptível de uma reacção imunolõgi ca contra o referido polipeptido; e b) de se isolar por um procedimento conhecido, os anti corpos produzidos e dirigidos contra o polipeptido.
  9. 9.- Processo para a preparação de uma composição imu-nogénica susceptível de elicitar uma resposta imuno-protectora contra a malária, caracterizado pelo facto de se misturar um polipeptido preparado pelo processo de acordo com as reivindica ções 1, 2 ou 3, com um adjuvante ou veiculo farmaceuticamente aceitável. Lisboa, 22 de Março de 1991 O Agente Oficial da Propriedade Industrial
PT97117A 1990-03-23 1991-03-22 Processo para a preparacao de derivados polipeptidicos e de composicoes imunogenicas que os contem PT97117A (pt)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CH97090 1990-03-23

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PT97117A true PT97117A (pt) 1991-11-29

Family

ID=4199439

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT97117A PT97117A (pt) 1990-03-23 1991-03-22 Processo para a preparacao de derivados polipeptidicos e de composicoes imunogenicas que os contem

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP0447956A1 (pt)
JP (1) JPH0686679A (pt)
AU (1) AU637468B2 (pt)
CA (1) CA2037151A1 (pt)
IE (1) IE910966A1 (pt)
IL (1) IL97578A0 (pt)
NZ (1) NZ237447A (pt)
PT (1) PT97117A (pt)
ZA (1) ZA911950B (pt)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU3355095A (en) * 1994-09-02 1996-03-27 Meiji Milk Products Company Limited Diagnostic drug for chlamydia infection
WO2001026681A2 (en) * 1999-10-13 2001-04-19 Chiron Corporation Method of obtaining cellular immune responses from proteins
RU2540871C2 (ru) * 2008-02-01 2015-02-10 Альфа-О Пептидес Аг Самоорганизующиеся пептидные наночастицы, полезные в качестве вакцин

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3686178T2 (de) * 1985-02-07 1993-03-11 Smithkline Beckman Corp Malaria-impfstoff.
GB8615068D0 (en) * 1986-06-20 1986-07-23 Wellcome Found Vaccines
FI884485A0 (fi) * 1987-01-30 1988-09-29 Smith Kline Rit Bildning av ytprotein av p. falciparums sporozoit i jaest.
AU625713B2 (en) * 1988-02-19 1992-07-16 Microgenesys, Inc. Method for producing recombinant protein derived from the circumsporozoite gene of plasmodium falciparum
FR2645877B1 (fr) * 1989-04-12 1991-07-05 Pasteur Institut Molecules comportant au moins une sequence peptidique porteuse d'un, ou plusieurs, epitope caracteristique d'une proteine produite par p. falciparum au niveau du stade sporozoite et dans les hepatocytes
AU7163091A (en) * 1989-12-12 1991-07-18 Biomedical Research Institute Novel malarial sporozoite peptide antigens

Also Published As

Publication number Publication date
ZA911950B (en) 1991-11-27
IE910966A1 (en) 1991-09-25
NZ237447A (en) 1993-05-26
AU637468B2 (en) 1993-05-27
JPH0686679A (ja) 1994-03-29
CA2037151A1 (en) 1991-09-24
AU7358991A (en) 1991-10-03
EP0447956A1 (de) 1991-09-25
IL97578A0 (en) 1992-06-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20080213795A1 (en) DNA sequences encoding peptide sequences specific for the hepatic stages of P. falciparum bearing epitopes capable of stimulating the T lymphocytes
US20110020387A1 (en) Malaria vaccine
US5231168A (en) Malaria antigen
DK166284B (da) Immunologisk aktivt peptid, der er i stand til at fremkalde immunisering mod malaria, malariamodvirkende immunogent stimulerende middel, der indeholder peptidet, anvendelse af peptidet til fremstilling af et saadant middel, en dna-sekvens, der koder for peptidet, en rekombinant dna-kloningsbaerer, der omfatter dna-sekvensen samt e. coli, der indeholder kloningsbaereren
AU2011326338A1 (en) Treatment and prevention of malaria
JP3023997B2 (ja) 組み換えコクシジウム症ワクチン−５−７アイメリア表面抗原
EP0885012A1 (en) Malaria vaccine based upon the addition of a msa1 peptide
AU656914B2 (en) New peptides and their use
JP2000506381A (ja) マラリア原虫ｍｓｐ―１のｃ末端断片を含む組換えタンパク質
US5198535A (en) Protective malaria sporozoite surface protein immunogen and gene
US5061788A (en) Recombinant malarial polypeptides
PT97117A (pt) Processo para a preparacao de derivados polipeptidicos e de composicoes imunogenicas que os contem
US5543323A (en) Plasmodium merozoite rhoptries antigenic polypeptides
US6270771B1 (en) Peptide sequences specific for the hepatic stages of P. falciparum bearing epitopes capable of stimulating the T lymphocytes
US5225534A (en) Recombinant malarial polypeptides
EP0388738B1 (en) Plasmodium merozoite rhoptries antigen and derivatives
PT100757A (pt) Polipeptidos aptos para induzir "in vivo"anticorpos capazes de inibir a invasao de globulos vermelhos por merozoitos de "p.falciparum", produtos aparentados e sua aplicacao na producao de composicoes de vacinacao
HK1080754B (en) Malaria vaccine

Legal Events

Date Code Title Description
BB1A Laying open of patent application

Effective date: 19910724

FC3A Refusal

Effective date: 19971017