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PT975771E - Proteínas de fusão da região constante da imunoglobulina/receptor do ftc-beta do tipoii - Google Patents

Proteínas de fusão da região constante da imunoglobulina/receptor do ftc-beta do tipoii Download PDF

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PT975771E
PT975771E PT98918247T PT98918247T PT975771E PT 975771 E PT975771 E PT 975771E PT 98918247 T PT98918247 T PT 98918247T PT 98918247 T PT98918247 T PT 98918247T PT 975771 E PT975771 E PT 975771E
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PT
Portugal
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beta
tgf
ftc
quot
seq
Prior art date
Application number
PT98918247T
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English (en)
Inventor
Philip Gotwals
Victor Koteliansky
Richard Cate
Michelle Sanicola-Nadel
Original Assignee
Biogen Idec Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Description

Msetiçào
PROTEÍNAS DE FUSÃO DA REGIÃO CONSTANTE DA
IMUNOGLOiUI^Xm/tlCiffQII DO FTC-BETA DO TIPO II A presente invenção tem por objecto proteínas de fusão solúveis do receptor do FTC-beta e as suas utilizações em processos ou em condições de tratamento, caracterizadas por uma sobre-produção de FTC-beta, incluindo a fibro-proliferação. 0 factor beta de transformação do crescimento (FTC-beta) representa uma família de polipéptidos, dos quais três estão presentes nos mamíferos, FTC-beta 1, FTC-beta 2 e FTC-beta 3. Estes factores têm efeitos globais no crescimento e na diferenciação das células (Roberts e Sporn (1990) Handok. Exp. Pharm. 95: 419-58). Há um crescente corpo de evidências de que o FTC-beta também modula o processo imunitário (Wahl et al. (1989) Immunol. Today 10: 258-61). Para além da estimulação da congregação de células imunitárias no sítio do trauma, o FTC-beta também providencia uma reacção fortemente positiva à sua própria síntese continuada (Kim et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10: 1492-1497) . O FTC-beta pode ser um factor proeminente na etiologia dcs distúrbios fibroproliferatívos. O FTC-beta é conhecido por estimular as células a produzir mais proteínas, incluindo colagénio, biglícano, decorina e fibronectina; e por inibir enzimas que degradam estas proteínas. Assim, o FTC-beta pode causar acumulação de tecido fibroso. Por na nefropatia diabética e na glomerulonef rite mesangial humana, ambas distúrbios fibroproliferativos, uma caracteristica patológica proeminente e importante é a da matriz mesangial (Mauer et ai. (1984) J. Clin. Invest, 74: 1143-55). Do mesmo modo, a fibrose após radiação é caracterizada por um excesso de FTC-beta, pela proliferação de fibroblastos e pela sobre-produção de tecido conjuntivo (Canney e Dean (1990) Brit. J. Radio!. 63:620-23). Os investigadores que trabalharam neste domínio t m tentado suprimir os efeitos do FTC-beta por meio da administração de um anticorpo anti-FTC-beta. Ver, Border et al. (1990) Nature 346: 371-74; Border et al. ((1992) Kidney Int. 41: 566-570) .
Os efeitos biológicos de FTC-beta são mediados por várias proteínas específicas da superfície das células, incluindo os chamados receptores de FTC-beta do tipo I, do tipo II e do tipo III. A maior parte destes receptores foram inicialmente identificados por FTC-beta radio-iodado, reticulados quimicamente com proteínas da superfície das células utilizando o reagente bifuncional DSS. Quase todas as linhas de células que respondem a FTC-beta expressam tanto os receptores do tipo I como os do tipo II, embora os níveis da sua expressão possam variar entre diferentes tipos de células. Nenhum dos receptores do tipo I ou do tipo II, na ausência um do outro, pode mediar uma resposta de FTC beta, embora o receptor do tipo II sozinho seja capaz de se ligar a FTC-beta.
No desenvolvimento de melhores iníbídores de FTC-beta para tratar distúrbios fibroprolíf , s é importante cttTtíderrr que esses íníbidcres devem ter um peso molecular mais baixo e uma maior afinidade do que os anticorpos anti- FTC-beta. Esta combinação de características vai permitir doses muito mais Caixas e vai aumentar a facilidade de administração. Além disso, uma proteína natural não vai causar reacções cruzadas com outras espécies.
De acordo com isto, a presente invenção tem por objecto novas composições e utilizações dessas composições em processos para o tratamento terapêutico de pacientes com distúrbios fibroproliferativos, conforme se descreve aqui a seguir. A presente invenção tem também por objecto vectores de ADN recombinante que permitem a expressão de proteínas de fusão dos receptores de FTC-beta em células hospedeiras bacterianas e de mamíferos e processos para a sua utilização.
Um dos aspectos da presente invenção á uma proteína de fusão do receptor de FTC-beta isolada, que inibe concorrencialmente a ligação de FTC-beta ao receptor de FTC-beta, em que esta proteína é um receptor de FTC-beta do tipo II, que compreende (a) um polipéptido codificado pelo polipéptido mostrado na SEQ ID N°. 2; (b) um polipéptido que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N° . 8; ou (c) um polipéptido que compreende a sequência de aminoácidos que é, pelo menos 98 % idêntica § sequência de aminoácidos da SEQ ID Nc . 8 ligada a uma segunda proteína que não ú um receptor de FTC-beta do tipo II, em que a segunda proteína é ona região constante de uma imunoglobulina. Ouímíí proteínas preferidas contêm a nova sequência de aminoácidos da SEQ ID Ir\, li, que engloba a região da fusão em cada um dos lados da junção de receptor de FTC-beta/imunoglobulína.
As composições farmacêuticas da presente invenção são exemplificadas por uma proteína de fusão do receptor de FTC-beta, que compreende (a) um polipéptido codificado pelo polipéptido mostrado na SEQ Ir! ar2; (b) um poiipéptído que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 8; ou crd um poiipéptído que compreende uma sequência de aminoácidos que é, pelo menos, 98 % idêntica à sequência de aminoácidos da ÇEQ Ir! N° . 8, num veículo âéôitâvs:! sob o ponto de vista farmacêutico, sendo que a proteína de fusão está numa quantidade suficiente para inibir concorrencial-mente a ligação de FTC-beta a um ligando de FTC-beta.
Noutro aspecto, a presente invenção tem por objecto a utilização de uma proteína de fusão de R FTC-beta II, que compreende (a) um polipéptido codificado pelo polinucleótido mostrado na SEQ ID r. 2 ou 4; (b) um polipéptido que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 8 ou 9; ou (c) um polipéptido que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 98 % idêntica â sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 8 ou 9, e uma região constante de um imunoglobulina, em que a referida proteína de fusão de R FTC-beta II se liga a FTC-beta para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de w& iiiãWlmm gue sofre de um distúrbio fibroproliferacivo.
Os polinucleótidos isolados estão : englobados aqui, codificando, ria expressão, para \m receptor de FTC- beta do tipo I± ligado a uma segunda proteína, que não é um receptor de FTC-beta do tipo II, conforme descrito aqui. Os PèI.ilítt®le6tidos proferidos seleccionam-se no grupo que consiste nas SEQ ID N°s. 1, 2, 3, 4, 10 e 12. Os polinucleótidos que hibridam com estas sequências em cundiçõou de hibridação normalizadas e que codificam uma proteína que têm uma actividade ínibidora de FTC-beta de uma prcteína de fusão do receptor de FTC-beta do tipo II, estão também aqui descritas. Os polinucleótidos que codificam na expressão de uma proteína codificada pelas sequências referidas de polinucleótidos estão também aqui englobados.
Os processos da presente invenção incluem um processo para a produção da proteína de fusão do receptor de FTC-beta conforme aqui descrito, compreendendo a cultura de uma célula hospedeira contendo um vector da presente invenção, permitindo que a referida célula expresse a proteína de fusão, isolando e purificando a proteína de fusão.
Um enquadramento é a utilização de uma composição num processo para o abaixamento dos níveis de FTC-beta num indivíduo, que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade efectiva de um antagonista de FTC-beta, que é proteína de fusão do receptor de FTC-beta, que compreende a sequência de aminoácidos das SEQ ID N°s 8, 9, 11 e 13.
Outro enquadramento, consiste na utilização de uma composição num processo para abaixamento dos níveis de FTC-beta num indivíduo cam artrite, que compreende a admxfrCqtcaçIc ao indivíduo de uma quantidade de um q/qCoT.c do FTC-beta, que i urus proteína de fcaio do :v, .>· q* FTC-beta, compreendendo a de sibí noádidoa das SEQ ID N°s. 8, 9, ll e 13. Num * a presente invenção providencia a utilização de oíV! o-vçpor a oao num processo para o tratamento de um indivíduo, de umu condição médica associada com um distúrbio fibroproliferativo. 0 processo providencia a utilização, para uma administração parenterica, cral ou local de uma quantidade suficiente da proteína de fusão solúvel do receptor de FTC-beta a um indivíduo, para reduzir ou melhorar o distúrbio e/ou bloquear a actividade de ETC-beca no indivíduo.
Ainda noutro enquadramento, a utilização da composição no processo da presente invenção providencia a administração da proteína de fusão do receptor de FTC-beta por processos intravenosos, intraoculares, intra-articula-res, transdérmicos e entéricos. Noutro enquadramento da presente invenção, a composição compreende a administração da proteína de fusão do receptor de FTC-beta a pacientes com distúrbios vasculares do colaqénio, tais como, esclerose sistémica, polimiosite, escleroderma, dermatomio-site ou lúpus eritematoso sistémico.
Ainda noutro enquadramento da presente invenção, a composição compreende a administração da proteína de fusão do receptor de FTC-beta a pacientes com fibrcse intra-ocular e pulmonar. Ainda noutro enquadramento, a proteína de fusão do receptor de FTC-beta é administrada a pacientes com nefropatia diabética, glomerulonefrite, vitreoretino-patia proliferativa e artrite reumatóide.
Ainda ísouf.ro enquadramento, a utilização da composição no processo da presente íáwnçSd providencia o tratamento de uma ferida num indivíduo para evitar a sobre-produção da íçúí.í:':!?: -.í:'-:u.:-çç;í.'í:¾ulbu do bTvdaaaaa, A allil í/gÇçbò da composição do processo providencia a administração de uma quantidade suficiente da proteína de fusão do receptor de FTC-beta ao indivíduo, para reduzir a quantidade ou a actividade de FTC-beta nesse indivíduo. Noutros enquadramentos, os tipos feridas incluem incisões cirúrgicas, lacerações induzidas por traumas e feridas que envolvem o peritoneu para os quais a sobre-produção da formação do tecido conjuntivo constitui adesões abdominais. Ainda noutro enquadramento, a sobre-produção da formação de tecido conjuntivo que serão evitadas incluem escaras, incluindo as escaras que envolvem a restenose de vasos sanguíneos e escaras hipertróficas e quelóides.
Noutro enquadramento, a presente invenção providencia a utilização de uma composição num processo que previne a fibrose após radiação num indivíduo que sofre ou estará próximo de sofrer terapia de radiação. A proteína de fusão do receptor de FTC-beta é administrada numa quantidade suficiente para prevenir a sobre-produção da formação de tecido fibroso.
Deve entender-se que tanto a descrição geral anterior como a descrição detalhada que se segue são exemplifica-tivas e explanatórias e pretendem providenciar uma maior explanação da invenção conforme é reivindicado. misto SEQ ID N°. 1 Sequência de Nucleótídos do Vector de
Expressão de R FTC'-$ II : Fc de Coelho 1851 CTCCGACGGC TCCTTCITCC i901 GGTGGCAGCA GGGGAACGTC 1951 CACAACCACT AGACGCAGAA 2001 GCggccgcGT CGACCGTGAC 2051 GTCCGGACGC GCCCCAGCTC 2101 AGCATCSCCC GAAííGíAGGGG 2151 TGTTAGUGGG CCCGTGGGAC 22m CGGGTCCGCC CTGTAGCGCT 2251 CCACCGTCTT TCAGGCCCCG 2301 CAGGTGACTC TGCGCAGCAC 2351 CCAGAAGGGG CCCCTGSACT 2401 TGCCTGCGCG GAGCTTCTGG 2451 CGCCTCGGGG ACACCCAGGC 2501 GTCCCGTGCC CACGGCCGGT 2551 GTAGGGCTTC CCGGGGCTCC 2601 GGCCTCTCTT TCTTAGGTCT 2651 CTTCCCCTCT CTCCGAGGCC 2701 CACGGTCCTC CCGGACGGCC 2751 TCGTTCTCTG CAGCCTCCCG 2301 CTCGGCCCGG GGCGCAGGCG 2851 TAGGCTGCAA GACAGAGTGG 2901 GGCCCGGGCT CCTTCTTTCC 2951 AGTGGAAGGA AGCTCTTACC 3001 CTTGGCGGGA CCCAGGGCTC 3051 AGCGACGGCG TCTGCAGCGA 3101 GGCACGGTCC ACACTGTCCA 3151 TGGACAGTTB GAGTGGGGCT 3201 CCGAGCCGTG GGAAGGGACT 3251 CCGAACCTCG CTCimiCA&G 32 01 AGGAGGCCCC fMAAMGAGG 3 ' i CACGAGCTGA GCGGTCCCCA 3401 CTACGAGGCA GGAGGGGTTG 3451 7CGCGGCGAG OllGlAAl-lGO:
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TGTCGGGGCG CAGCCATGAC CCAGTCACGT 6901 6951 GAGTGTATAC TGGCTTAACT ATGCGGCATC AGAGIAGATT GTACSGAGAG 7001 TGCACCATAT GCGGTGTGAA ATACCGCACA GATGCGTAAG GAGAAAATAC /051 cgcatcaggc gctcttccgc ttcctcgctc mmmtma TJCGCSCGGT 7101 CGTTCGGZTG SGGZGAGCGG TATCAGCTCA CTCAAAZGCG GTAATACGGT 7151 TATCCACAGA ATCAGGGGAT AACCCAGGAA AGAACATGTG MiCASAMAG:
72 0 1 CAGCAAAAGG CCAGGAACCG GmAàAwGGIIu' GCGTTGCTUG CGTTTTTCCA 7251 TAGGYSCCGC CCCCCTGACG AGCATCACAA AAATCGACGC
73 3 1 GGTGGCGAAA CCCGACAGGA uAMAAaGG'! ACCAGGCGTT TCCCCCSGGA 7351 AGCTCCCTCG TGCGCTCTCC IGTTCCGACC CTGCCGCTTA CCGGATACCS 7401 GSCCGCCTTT CSCCCTSCGG GAAGCGTGGC GCTTTCTCAT AGCTCACGCT 7451 GTASGTATCT CAGTTCGGTG TAGGTCGTTC GCTCCAAGCT GGGCTGTGTG 7501 CACGAACCCC CCGTTCAGCC CGACIGCTGC GCCTTATCCG GTAACTATCG 7551 TCTTGAGTCC AACCCGGTAA GACACGACTT ATCGCCACTG GCAGCAGCCA 7501 CTGGTAACAG GATTAGCAGA GCGAGGSATG TAGGCGGTGC TACAGAGTTC 7651 TTGAAGTGGT GGCCTAACTA CGGCTACACT AGAAGGACAG TATTTGGTAT 7701 CTGCGCTCTG CTGAAGCCAG TTACCTTCGG mMJcã&TST GGTAGCTCTT 7751 GATCCGGCAA AOSA^GCAOC GCTGGTAGCG GTGGTTTTTT TGTTTGCAAG 7801 CAGCAGATTA CGCGCAGAAA AAAAGGATCT CAAGAAGATC CTTTGATCTT 7851 TTCTACGGGG TCTGACGCTC AGTGGMCGA AAACTCACGT TMGGGATTT 7301 TGGTCATGAG ATTATCAAAA AGGATCTTCA CCTAGATCCT TTTAAATTAA 7351 MàMS TTAAATCAAT CTAAAGTATA TATGAGTAAA CTTGGTCTGA 8001 CAGTTACCAA TGCTTAATCA GTGAGGCACC TATCTCAGCG ATCTGTCTAT 8051 TSCGTTCATC CATAGTTGCC TGACTCCCCG TCGTGTAGAT
8101 CGGGAGGGCT TACCATCTGG CCCCAGTGGT GCAATGATAC CGCGAGACCC 8151 ACGCTCACCG GCTCCAGATT TATCAGCAAT AAACCAGCCA GCCGGAAGGG 82 0 1 CCGAC-CGCAG AAGTGGTCCT GCAACTTTAT CCGCCTCCAT CCAGTCTATT MTTGGTGGC ísíGílMGCllMr AGTAAGTAGT TCGCCAGTTA ATAGTTTGCG 8301 CAACGTTGTT GYCATTGCTG CAGGCATCGT GGTGTCACGC TCGTCGTTTG 8351 GTATGGCTTC ATTCAGCTCC OTfCTSMC GATCAAGGCG AGTTACATGA 8401 TCCCCCATGT TGTGCAAAM AGCGGTTAGC TCCTICGGTC CTCCGATCGT 8451 fGTCAGA&ljT AAGTTGGCCG CAGTGTTATC ACTCATGGTT ATGGCAGCAC g 5 01 TGCATáA:ITC! TCTTACTGTC ÃTGCS&TCC8 TAA 7 · 7GJ' ΪΤ TTCTGTGACT 8 551 3GTGAGTACT ATTCTGAGAA TAGTGTATGC GGCGACCGAG
8601 TTGCTCTTGC CCGGCGTCAA CACGGGATAA CATAGCAGAA
8651 CTTTAAAAGT GCTCATCATT GGAAAACGTT CTTCGGGGCG AAAACTCTCA 8701 AGGATCTTAC CGCTGTTGAG ATCCAGTTCG XT-Fm&rG-A CTCGTUCACC 8751 GA:xr-X!GA7T;·:-·· TCAGCATCTT ΑΙΜΧΧΙΓΑΑΧ CAGCGTTTCT GGGTGAGCAA 8801 AAACAGGAAG GCAAAATGCC GCAAAAAAGG GAATAAGGGC GACACGGAAA 8 8 51 TGTTGAATAC TCATACTCTT OlilGGTGTGAA TMTMTGAÂ GCATTTATCA 8901 .--i /-imrn ^rprppirp CSCATGAGCG GATACATATT íAGí-íàAAAI-A 8 9 5 1 Λ ': ' - * ' " GGTTCCGCUC A^ATTTCCCC GAAAAGTGCC ACCTGACGTC 900 1 IGAGAÂÂCCA TSATTATCAT GACATTAACC fAiuAAAAATA GGCGSATCAC 905 1 GAGGCCCTTT CGTCTTCAAG AATTCCG SEQ ID N°. 2: Sequência de Nucleótidos de R FTC-β II : Fc de Coelho
ATGGGTCGGGGGCTGCTCCGGGGCCTGTGGCCGCTGCACCTCGTCCTGTGGACGCGCATC 832
GCCAGCACGATCCCGCCGCACGTTCAGAAGTCGGTTAATAACGACATGATGGTCACGGAC 892 952 TGTGACAACCAGAAGTCCTGCATGAGCAACTGCAGCATCACGTCCATCTGTGAGAAGGCA 1012
CACGAAGTCTGCGTGGCCGTCTGGAGGAAGAACGATGAAAACATAACCCTGGAGACTGTG 1072
TGTCACGACCCCAAGCTCGCCTACCATGGATTCCTTCTGGAAGATTCTGCCTCTCCAAAG 1132
TGTATCATGAAAGAAAAGAAGGTGTTTGGGGAGACTTTCTTCATGTGTTCCTGCAGCACT 1192
GACGAGTGCAATGACCACATCATCTTCTCTGAGGAATACACCACCAGCAGTCCGGATCTG 1252 > >V;G‘S\.v V·
lAAM^GACAcAIGOCCÂGCGrGGCCAGCAO^GAACTCCTGGGGGGACCGTCA 1312 ΟΊΧΙΤΧΧΧΑΧΧΑΧΧΧλΧΧΙΑΧΧΜΙΑ®^^ 1372 .····":·:·-:-.····>. ...··.·'··v..-··.· V, :,.··..·\ ·.·. v .-v-λ .:·\.·ν.ν.:;.·;:.\ :ç, .·v,v:,·;·..··.,.ν.ν.-/λ. -.,:-.2-:-1...:.1-:-. ·..·:-.-...1:-.1::21,2-.1- .·. \.-21-22·.:· 2 :-..2:-221.. .22A ri\. 12 2.1-2 1432 1492 1552 AGOGrGCAMXiAOTCGAMm^ ié> 12 1672 «ΑνlAOCG.·::'7 reklT:ΐΧ ίΑΧΧΧΪΤΑΟΊ 1732
GAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGTTGGAC 1792
TCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAG 1852
GGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAG 1912
AGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA 1972 SEQ ID N°. 3: Sequência de Nucleótidos do Vector de
Expressão do R fT€>$ II :Fc Humano
ACATAACTTA CGGTAAATGG CCCATTGACG TCAFITAATGA CTTTCCATTG ACGTCAATGG GCAGTACATC AAGTGTATCA TGACGGTAAA TGGCCCGCCT ACTTTCCTAC TTGGCAGTAC GTGATGCGGT TTTGGCAGTA ACGGGGATTT CZAFIGTCTCC GGCACCAAAA TCAACGGGAC GKlAGGimAA TGGGCGGTAG AGCTCGTTTA GTGAACCGTC :>»·* >> ,·:·:·γ·:>·· τ·α· .·-·; λ; n ·;λ> y. .·-·· ,··· · GATCCGGTAC 7'CGi~;'Í:GGG:C'r GTCTTTTTGT CTTTTATTTC AAGAACTGCT GCTCAADiAlA
1 GAATTCGAGC TTGCATGCCT GCAGGTCGTT 51 CCCGCCTGGC TGACCGCCCA ACGACCCCCG 101 CGTATGTTCC CATAGTAACG CCAATAGGGA 151 GTGGAGTATT TACGGIAAAC TGCCCACTTG 201 TATGCCAAGT ACGCCCCCTA TTGACGTCAA 251 GGCATTATGC CCAGTACATG ACCTTATGGG 301 ATCTACGTAT TAGTCATCGC IATTACCATG 351 CATCAATGGG CGTGGATAGC GGITTGACTC 401 ACCCCATTGA CGTCAATGGG AGTTTGLTTT 451 TTTCCA&MT QGCiiirSffiA CTCCGCCCCA 501 GCGTGTACGG TGGGAGGTCT ATATAAGCAG 551 ÂímTCGCCTG GAGACGCCAT CCACGCTGTT 631 CGGGACCGAT
65i GXAXGAoCXG AAâGTTAACG (ΑΑΑΑΟΓΙΑΤΑ 701 AGGTCCCGGA TCCGGTGGTG
75i TGTTGCCTTT ACTTCTAGGC CTGTACGGAA GTGTTACTTC TSGIAOAAAA 801 GCTGCGGAAT TCTXCCCGCG GCCGCTCTGC CATGGGTCGG GGGCTGCTCA 851 GGGGCCTGTG GCCGCTGCAC ATCGTCZTGT GGACGCGTAT CGCCAGCACG 901 ATCCCACCGC ACGTTCAGAA GTCGGTTAAT AACGACATGA TAGTCACTGA 951 cmzmmQZ GCAGTCAAGT TTCCACAACT GTGTAAATTT tgtgatgtga 1001 gattttccac ctgtgacaac cagaaatcct gcatgagcaa ctgcagcalc
1051 ACCTCCATCT GTGAGAAGCC ACAGGAAGTC TGTGTGGCTG TATGGAGAAA íioi ' . \ g ;iac--.7.11:1:11: tagagacagt ttgccatgac 1151 cctaccatga ctttattctg gaagatgctg cttctccaaa gtgcatiats
12 01 .MOGMAAM AAMO-CCTQG TGAGACTTTC TTCATGTGTT CCTGTAGCTC 1251 TGATGAGTGC AATGACAACA TCATCTTCTC AACACCAGCA 1301 ASCCTGACTT GGTCGACAÃA ACTCACACAT GCCCACCGTG CCCAGCACCT 1351 GAACTCCTGG GGGGACCGTC AGTCTTCCTC TTCCCCCCAA AACCCAAGGA 1401 caccctcatg atcscccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg 1451 tgagccacga agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg
1501 GAGGTGCATA ATGCCAAGAC AAAGCCGCGG GAGGAGCAGT ACAACAGCAC 1551 GTACCGTGTG GTCAGCGTCC TCACCGTCCT GCACCAGGAC TGGCTGAATG 1601 GCAAGGAGTA CAAGTGCAAG GTCTCCAACA AAGCCCTCCC AGCCCCCATC 1631 GAGAAAACCA TCTCCAAAGC CAAAGGGCAG CCCCGAGAAC CACAGGTGTA 1701 CACCCTGCCC CCATCCCGGG ATGAGCTGAC CAAGAACCAG GTCAGCCTGA 1751 CCTGCCTUGT CAAAGGCTTC TATCCCAGCG ACATCGCCGT GGAGTGGGAG 1801 AGCAATGGGC AGCCGGAGAA CAACTACAAG ACCACGCCTC CCGTGTTGGA 1831 CTCCGACGGC TCCTTCTTCC TCTACAGCAA GCTCACCGTG GACAAGAGCA 1901 GGTGGCAGCA GGGGAACGTC TTCTCATGCT CCGTGATGCA TGAGGCTCTG 1931 CACAACCACT ACACGCAGAA GAGCCTCTCC CTGTLTCCGG GTAAATGAGT 2001 GCGGCCGCGT CGACCGTGAC CCCTGCGCCG CGCGGACTCC TGCCCGGAGG 2051 GTCCGGACGC SCCCCAGCTC GCGCCCCTTC CCASASTTAT TCGGACCCCA 2101 AGCATCGCIC GMáCffiQGM. CCGGCTGGGG TGTCCGTGCG
2151 TGTTAGGGGG CCCGTGGGAC CTCCCTTGCC GTCTCTCCTC GCGCACGGCC 2201 CGGGTCCGCC CTGTAGCGCT CGCTGTCTGT CCCCTGCCTG AAGCGCCCCA 2251 CCACCGTCTT TCAGGCCCCG GACTTGGTGC CGGGTCCAGG CSTAS&SSRG 23 01 Câ(lG7'OAGTC IGCÍICAGCAC TCGCTTTATT TCGCCAGAGT CGCGGGGCGT 2351 CCAGAAGGGG CCCCTGGACT CCGGCGCGGG GCCGGCTCAG 7CCCCCCCCT \x:..
2451 CSCCTCGGGG ACACCCAGGC CTGCTTCTTC CTGSGCTCGG CGTCCCTGGA 2501 GTCCCGTGCC CACGGCCGGT GGCCCCCTTC GCGLGACTCC CAGCGCFGGG 2551 ÍS:SQ0€C'1'TC CCGGGGCTCG CTGGCGGCCC GTGGCCTCTC CTCTTTCCGC 2601 GGCCTCTCTT TCTIAGGTCT CTCCTCCTTC SGCGGCTTCT CCTTCCGCBG
2651 CTTCCCCTCT CTCCGAGGCC TCTCCTTGGG TCCCCGGTCT 2-01 CACGGTCCTC CCGGACGGCC TCTCCGGTGG CCTCGCCGGG CTUGTCTTCG 2751 TCGTTCTCTG CAGCCTCCCG ACTCCCGGGA ATCTTGGGTC TGACCTCTGC 2801 CTCGGCCCGG SGCGCAGGCG GCGCTGATGG AGGCGCCTGG GCCTCGAACT 2851 TAGGCTGCAA GACAGAGTGG GGTCCTGGGG TAAGCGCCCA CCTTCCCCCC 2901 GGCCCGGGCT CCTTCTTTCC TTGGGGATGA AGGTCCCAAT GCCCGCGGTC 2951 AGTGGAAGGA AGCTCTTACC AGGGGCGACG ATGGCTCCCT CGGGGCTGAG 3001 CTTGGCGGGA CCCAGGGCTC GGGCACACGT GCTTGGAGTG CTGCCTCCGC 3051 AGGGACGGCG TCTGCAGCGA CAGGGTCGGG ACCCGAGTCA GCTGGGCCGA 3101 GGCACGGTCC ACACTGTCCA TCCCTCCCTC ACCCCTAGAG CCCCCCTCCC 3151 TGGACAGTTG GAGTGGGGCT CCCCCGGTAC GGCTGAGACT AAGGATGCCC 3201 CCGAGCCGTG GGAAGGGACT CCGGGACTCC GCTGCCGCGG CGCCCCTTCT 3251 CCGAACCTCG CTCTTTCAAT TGGTCATTCT TCCCCCCGAC CACGGGCTGT 3301 AGGAGGCCCC TAGCAAGGGA GGGGTCGCAG GAGTGCCCCC GGGGGGCGCT 3351 CACGAGCTGA GCGGTCCCCA GAGAGGGCGC AGGGGAAAGG CGGCAGAACG 3401 CTACGAGGCA GGAGGGGTTG CACAAGGTSC ATCCGGAAGC CAGAACCTAC 3451 TCGCGGCGAG GGGAATGGGC CCCGCAAAAG GTCCACACCG GGTGAGAGGG 3501 GCGCGCAAGG CCCGTCACTT AAGGGACATA TGACGTGAGC TCAGATCTTT 3551 GTGAAGGAAC CTTACTTCTG TGGTGTGACA TAATTGGACA AACTACCTAC 3501 AGAGATTTAA AGCTCTAAGG TAAATATAAA ATTTTTAAGT GTATAATGTG 3651 TTAAACTACT GATTCTAATT GTTTGTGTAT TTTAGASTCC AACCTATGGA 3701 ACTGATGAAT GGGAGCAGTG Γ^’Τ^ΠΆ T ΤΓΉΗ TTTAATGAGG AAAACCTGTT 3751 TTGCTCAGAA GAAATGCCAT CTAGTGATGA TGAGGCTACT GCTGACTCTC 3801 AACATTCTAC TCCTCCAAAA AGGTAGAAGA CCCCAAGGAC 3851 ITTCCTTCAG AÀ i . .1.". .· TTTTTTGAGT CATGCTGSGT TTAGTAATAG AACTCTTGCT TGCTTTGCTA ILSACACCAC GCTGCACTGC 393i TATACAAGAA :··.· ·\ ··:·:'·ν: v- y. v. ·>: ·:···*·:>*· TAACCTTTAT AAGTAGGCAT 4301 4 051 ΑΑΑΑΓΓΪΛΤΛ AGTGTCTGCT à/à/A : AàG.A.1 ACTGTTTTTT ATGCTCAAAA CTTACTCCAC ACAGGCATAG .·'· ; í. vi- ·:· :····.:·' : TTTAGCTTTT 4101 X; ·λ·.<-?\·>:-:·:·ϊχ;;·-·:·:·ϊ·.·λ A .i:\í ::UÀ:>.ÀÀ λΑ..:·. 1 TGATGTATAG TGCCTTGACT 4131 AGAGATCATA ATCAGCCATA CCACATTTGT AGAGGTTTTA CTTGCTTTAA 4201 AMAQCTCm ACACCTCCCC CTGAAGCTGA &AC&TM&&T 42 51 GTTGTTGTTA ACTTGTTTAT AATGGTTACA M^MJíQCMí
4301 TAGCATCACA AATXTCACM ATAAAGCATT TTTTTCACTG CATTCTAGTT 4351 GTGGTTTGTC 31 V2 A.G' 3'3 ! ATCATGTCTG GATCCTCTAC
4401 GCCGGACGCA TCGTGGCCGG OTCàSOTe GCCACAGGTG CGGTTGCTGG 4451 CGCCTATATC GGCGACATCA CCGATGGGGA AGATCGGGCT CGCCACTTCG 4501 GGCTCATGAG CGCTTGTTTC GGCGTGGGTA TGGTGGCAGG CCCCGTGGCC 4551 GGGGGACTGT TGGGCGCCAT CTCCTTGCAT GCACCATTCC TTGCGGCGGC 4601 GGTGCTCAAC GGCCTCAACC TACTACTGGG CTGCTTCCTA ATGCAGGAGT 46 51 CGCATAAGGG AGAGCGTCSA GACTCCATCT CA&AAAAMA ATAAAATAAA 4 701 Μ\ΤΊΆ$·ΑΆΆΆ. MGGGCCCT TGTGCAAAGC TGACAGCTTG TATGTTTCTG 4751 CTGTTGACAT TTGTGGGCTG TTTACCAACA CTTCTGGAAC ACAGCAGTGG 4801 AAGGGACTTC CCAGATATTT TAAAATTACC CTTAGAAAGC GGTCTGTGAA 4351 AAACCCCTAC CCAATTTCCT TTTTGTTAAG TGACCTAATT AACAGGAGGA 4901 CACAGAGGGT GGATGGGCAG CCTATGATTG GAATGTCCTC TCAAGTAGAG 4951 GAGGTTAGGG TTTATGAGGA CACAGAGGAG CTTCCTGGGG ATCCAGACAT 5001 GATAAGATAC ATTGATGAGT TTGGACMC CACAACTAGA ATGCAGTGAA 5051 AAAAATGCTT TATTTGTGAA ATTTGTGATG CTATTGCTTT ATTTGTAACC 5101 ATTATAAGCT GCAATAAACA AGTTAACAAC AACAATTGCA TTCATTTTAT 5151 GTTTCAGGTT CAGGGGGAGG TGTGGGAGGT TTTTTAAAGC AAGTAAAACC 5201 TCTACAAATG TGGTATGGCT GATTATGATC TCTAGTCAAG GCACTATACA 5251 TCAAATATTC CTTATTAACC CCTTTACAAA TTAAAAAGCT AAAGGTACAC 5301 AATTTTTGAG CATAGTTATT AATAGCAGAC ACTCTATGCC TGTGTGGAGT 5351 AAGAAAAAAC AGTATGTTAT GATTATAACT GTTATGCCTA CTTATAAAGG 5401 TTACAGAATA TTTTTCCATA ATTTTCTTGT ATAGCAGTGC AGCTTTTTCC 5451 TITGTGGTGT AAATAGCAAA GCAAGCAAGA GTTCTATTAC TAMCllGAGC 5501 MAÂCTCÃM aaacttagca aitctgaagc: AMGTCCTTG GGGTCTTCTA 5551 CCTTTCTCTT CTTTTTTGGA GGAGTAGAAT GTTGAGAGTC AGCAGTAGCC 5601 TCATCATCAC TAGATGGCAT TTCTTCTGAG " \ , TTTCCTCATT
5651 CACCACTGCT CCCATTCATC AGTTCCATAG GTTGGAATCT 57 01 ' " ' ' ATCAGTAGTT f&ACAGAfTA TACACTTÃSft
5751 ΜΤΤΤΣΗΪ»Χ TTACCTTAGA 8CTTSM1X0 TCTGTAGGTA GTTTGTCCAA 58Ci TTATGTCACA CCACAGAAGT AÂGGTTCCTT TAAAGCCAGC
5851 AAAAGTCCCA TGGTCTTATA AMATQCATA GCTTTAGGAG GGGAGCASAG 5901 catcttcctg ttagtctttc ttctcgtaga
5951 ATACTTGATG CCTTTTTCCT CCTGGACCTC AGAGASGACG CCTGGGTATT 6001 CTGGGAGAAG TTTASATTTC CCCAAàTCAà TTTCTGGGAA AAACGTGTCA 6051 CTTTCAAATT CCTGCAIGAT CCTTGSCACA MMTSfm GGTGGCCTGG 6101 TTGATTCATG GCTTCCTGGT AAâ<»QAM:7 GCCTCCGACT ÃGCGAGAGS 6151 TGTCSACTTT ACTTGCCAAT TCCGGTTGTT CAATAAGTCT TAAGGCATCA 6201 TCCAAACTTT TGGCAAGAAA ATGAGCTCCT CGTGGTGGTT CTTTGAGTTC 6251 TCTACTGAGA ACTATATTAA TTCIGTCCTT TJWWOOTCSA- TTCTTCTCAG 6301 GAATGGAGAA CCAGGTTTTC CTACCCATAA TCACCAGAST CTGTTTACCT 6351 TCCACTGAAG AGGTTGTGGT CATTCTTTGG AAGTACTTGA ACTCGTTCCT 6401 GAGCGGAGGC CAGGGTAGGT CTCCGTTCTT GCCAATCCCC ATATTTTGGG 5451 ACACGGCGAC GATGCAGTTC AATGGTCGAA CCATGATGGC AGCGGGGATA 6501 .AAATOOTMX' AGCCTTCACG CTAGGATTGC CGTCAAGTTT GGCGCGAAAT 6551 CGCAGCCCTG AGCTGTCCCC CCCCCCAAGC TTTTTGCAAA AGCCTAGGCC 6601 TCCAAAAAAG CCTCCTCACT ACTTCTGGAA TAGCTCAGAG GCCGAGGCGG 6651 CCTCGGCCTC TGCATAAATA AAAAAAATTA GTCAGCCATG GGGCGGAGAA 6701 TGGGCGGAAC TGGGCGGAGT TAGGGGCGGG ATGGGCGGAG TTAGGGGCGG 6751 GACTATGGTT GCTGACTAAT TGAGATGCTG CCTCGCGCGT TTCGGTGATG 6801 ACGGTGAAAA CCTCTGACAC ATGCAGCTCC CGGAGACGGT CACAGCTTGT 6851 CTGTAAGCGG ATGCCGGGAG CAGACAAGCC CGTCAGGGCG CGTCAGCGGG 6901 TGTTGGCGGG TGTCGGGGCG CAGCCATGAC CCAGTCACGT AGCGATAGCG 6951 GAGTGTATAC TGGCTTAACT ATGCGGCATC AGAGCAGATT GTACTGAGAG 7001 TGCACCATAT GCGGTGTGAA ATACCGCACA GATGCGTAAG GAGAAAATAC 7051 CGCATCAGGC GCTCTTCCGC TTCCTCGCTC ACTGACTCGC TGCGCTCGGT 7101 CGTTCGGCTG CGGCGAGCGG TATCAGCTCA CTCAAAGGCG GTAATACGGT 7151 TATCCACAGA ATIAGGGGAT AACGCAGGAA AGAACATGTG AGCAAAAGGC 72 01 CAGCAAAAGG CCAGGAACCG GCGTTGCTGG CGTTTTTGCA
7251 TAGGGTCCGC CCCCCTGACG AGCATCACAA AAATCGACGC TCAAGTCAGA 7301 GGTGGCGAAA CCCGACAGGA CTATAAAGAT ACCAGGCGTT TCCCCCTGGA 7351 AGCTCCCTCG TGCGCTCTCC TGTTCCGACC CTGCCGCTTA CCGGATACCT 7401 GTCCGCCTTT CTCCCTTCGG GAAGCGTGGC GCTTTCTCAT AGISCACGCT ... ... . ?'*·:··v ·”·:.-·-ν·'>· >: .·*v v ..•,.·?ίΛ'···?·!·:···>.·',< -:····*···:··· s. ·'·!·.·“'·"•••'''•ν.'-'Λ y. .-·ν··->' ,-v· jy-·:·- ·;'-·;ί òv .:. .< 5Gv.\;-:.5:: .i >>.>·;·>>.:·:.:V.1,OvGv-:- -2-v-.-G:- vi i i <:->
7501 oAslGAAOCGC CCGTGCAGCC CGACCGCTGC OiGCTIATCGO GTAACTATCG 7551 76 Cl 7651 7701 7751 7801 7851 7901
TCTTGAGTCC AACCCGGTAA GTGGGAAGMí GAT7AGCAGA GClAÍTlvT GGCCTAACTA CTGCGCTCTG CTGAAGCCAG GATCCGGCAA ACAAACCACC CAG CAGATTA GGCGÍGGSM TTCTACGGGG TCTGACGCTC TGGICATGAG ATTATCAAAA
GACACGACTT GCGAGGTATG CGGCTACACT TTACCTTCGG GCTGGTAGCG AAAAGGATCT AGTGGAACGA AGGATCTTCA
ATCGCCACTG TAGGCGGTGC AGAAGGACAG GTGGSTTTTT AAACTCACGT CCTAGATCCT
GCAGCAGCCA TACAGAGTTC TATTTGGTAT GGTAGCTCTT TGTTTGCAAG CTTTGATCTT TAAGGGATTT TTTAAATTAA 7951 AAATGAAGTT TTAAATCAAT CTAAAGTATA TATGAGTAAA CTTGGTCTGA 8001 CAGTTACCAA TGCTTAATCA GTGAGGCACC TATCTCAGCG ATCTGSCTAT 8051 TTCGTTCATC CATAGTTGCC TGACTCCCCG TCGTGTAGAT AACTACGATA 8101 CGGGAGGGCT TACCATCTGG CCCCAGTGCT GCAATGATAC CGCGAGACCC 8151 ACGCTCACCG GCTCCAGATT TATCAGCAAT MACCAOCCA GCCGGAAGGG 8201 CCGAGCGCAG AAGTGGTCCT GCAACTTTAT CCGCCTCCAT CCAGTCTATT 8251 AATTGTTGCC GGGAAGCTAG AGTAAGTAGT TCGCCAGTTA ATAGTTTGCG 8301 CAACGTTGTT GCCATTGCTG CAGGCATCGT GGTGTCACGC TCGTCGTTTG 8351 GTATGGCTTC ATTCAGCTCC GGTTCCCAAC GATCAAGGCG AGTTACATGA 8401 TCCCCCATGT TGTGCAAAAA AGCGGTTAGC TCCTTCGGTC CTCCGATCGT 8451 TGTCAGAAGT AAGTTGGCCG CAGTGTTATC ACTCATGGTT ATGGCAGCAC 8501 TGCATAATTC TCTTACTGTC ATGCCATCCG TPAGATGCTT TTCTGTGACT 8551 GGTGAGTACT CAÂCCAAGTC ATTCTGAGAA TAGTGTATGC GGCGACCGAG 8601 TSGCTCTTGC CCGGCGTCAA CACGGGATAA TACCGCGCCA CATAGCAGAA 8651 GCTCATCATT GGAAAACGTT CTTCGGGGCG AAAACTCTCA 8701 AGGATCTTAC CGCTGTTGAG ATCCAGTTCG ATGTAACCCA CTCGTGCACC 8751 CAACTGATCT TCAGCATCTT TTACTTTCAC CAGCGTTTCT GGGTGAGCAA 8801 AAACAGGAAG GCAAAATGCC GACACGGAAA 8351 TGTTGAATAC TCATACTCTS CCTTTTTCAA TATTATSGAA GCATTTATCA 8 901 GGGTTATTGT CTCATGAGCG GATACATATT TGAATGTATT TAGJWJUWTA 8 951 AACAAATAGG GGTTCCGCGC ACATTTCCCC 3V"-'GTGCC ACCTGACGTC 9001 TAAGAAACCA SSATTASCAT GACATTAACC TATSAJWRTA GGCGTATCAC 9051 GAGGCCCTTT CGTCTTCAAG AATPCCa SEQ ID N° . 4: Sequência de Nucleôtidos do R FTC-β II: Fc
Humano -7 ί··>’Ví;.?Vv -777 d.xd-y./W-^x : «.· v. \·. .·.·< ,· ; ;':·· ·i. \ '••••-•AN o c-v. . «v .vR\d. ’? > *7 ·'.·,·:···.·:·'·. V. :;·<·ννχ :;.·..-·α >·. y .'•y,·-.'».;.; y. .y, v -.> \·. ;. X y< ;Αν:.ΛΛ >χy. .y .y.A.y.-.yyv.v. ...-v\-X-y.y ·· X ·>ΝΛν'ι;;Λ·.ΐ>'\ ·>··': .•'ΧΛ'··".-
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GTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTC . .\;í
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GACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACG
·>· A' •.UUvU
SEQ ID N°. 5: Iniciador frontal - de Coelho e Humano SEQ ID N°. 6: Iniciador Inverso - Coelho :·*νί ·'/ ί· •..RAF A ·’ SEQ ID N°. 7: Iniciador Inverso - Humano 5 ' -AGTTTTGTCGACCPSIGTCAGGATTGCTGGTGTTA-3 ' SEQ ID N°. 8: Sequência de Amínoãcidos do R PTC-;? II:Fc de
Coelho M G R G L L R G L W P L H L V L W T R I 1 A S T I P P H V Q K S V N N D M M V T D N N '«jr A V K F P Q L c K F C D V R s S T C D N Q K s C M S N c s T T S -i- C E K A H E V c V A ¥ W R K N D E N I T L E T V /”1 H D P K L A Y H G F L L E D s A S P K I M E P- A P E r E p E: S .••v Y T 6: p: Y B JV; Y -E B P P L 6 .H’ T ís;· >·' >: Ά·.·. F : E P p; 161
ΪΑ ’:·> vi h G ο κ :h T Y K Π m Y .£· ?í sY ;í ", .5- A ·£
P G F L T V G B B
v :M B B A. I, i i M P SEQ ID N". 9: Sequência de Aminoãcidos de R FTC»$ IIsFc
Humano
M G R G L L R G T J_» W P L II I V L w T R 1 i A S S I P P H V Q K s V N N D M I V T D N N G A V K F P Q T ±J c K F rT D V R F s T C D N Q K s C M S N c s I T S I C E K P 0 E V c V A V W R K N D E N I T L E T V c H D P K L P Y H D F I L E D A A S P K c I M K E K K K P G E T F F M C S c s s D E G N D N I I F S E E Y N T S N P D L v D K T H T c P p C P A P E L L G G P s 161 V p L· F P P K P K D T : j M I S R T P E V T C V V V D V s H E D P E V K F N w Y V D iS AS ‘V K â R G P BB· E s •i N Is T v p G s * !· L F . \· k *;7: y :D AÍ :Y E; K y·’ Y K K y:' *:,V K A B, F A *>· T '}y κ ψ ϊ G K s. ..... V, ,v. s. ... W: >·· 1: C v ·’ Λ.·,. .s .· K M A i B v’: Y :B: E γ Ê B p F yy r F F? G Y i: T P E E s D V A B . RB A T V <Y Y SEQ ID N°. 10: Sequência de Nucleótidos da "Junção" de
Fusão de RII:Fc de Coelho SEQ ID N°. 11: Sequência de Aminoácidos da "Junção" da
Fusão de RII:Fc de Coelho
SEEYTTSSPDLVDKTHTCPPCP SEQ ID N°. 12: Sequência de Nucleótidos da "Junção" da Fusão de RII:Fc Humana
TCTCAGAAGAATATAACACCAGCAATCCTGACTTGGTCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGC CCA SEQ ID N°. 13: Sequência de Aminoácidos da "Junção" da Fusão de RII:Fc Humana
SEEYNTSNPDLVDKTHTCPPCP
Utilizaram-se aqui os seguintes termos e expressões: Definições "Reconbinante" j tal como se uti.iizã aqui, significa que uma pmcbelóà m*rvm de sistemas de expressão recombi- nantes (por exemplo, microbianos ou de mamíferos). "Microbiano" refere-se a proteínas recombinantes em sistemas de expressão de bactérias cu de fungos (por produto "microbiano exemplo, levedura). Define-se recombinante" como uma proteína produzida num sistema de expressão microbiana que está praticamente livre de substâncias endógenas naturais. A proteína expressa na maior parte das culturas bacterianas, por exemplo, E. coli, estará isenta de glícano. A proteína expressa em levedura pode ter um modelo de glicosílação diferente da expressa em células de mamíferos. "Activo sob o ponto de vista biológico", tal como se utiliza ao longo da presente memória descritiva como uma característica dos receptores de FTC-beta, significa que uma determinada molécula partilha uma homologia da sequência de aminoácidos suficiente com os enquadramentos da presente invenção aqui descritos, como sendo capaz de se ligar a quantidades detectáveis de FTC-beta e/ou transmitir um estimulo de FTC-beta a uma célula, por exemplo, um componente de uma estrutura de um receptor híbrido ou uma reacção cruzada com anticorpos do receptor anti-FTC-beta em função do receptor de FTC-beta de fontes naturais (isto é, não recombinantes). Preferencialmente, as fusões do receptor de FTC-beta activas sob o ponto de vista biológico dentro do âmbito da presente invenção são capazes de se ligar superior a 0,1 nmoles de FTC-beta por nmole do receptor e, mais preferencialmente, superior a 0,5 nmole de FTC-beta por nmole do receptor em condições de ligação padrão (ver a seguir).
Do mesmo modo, uma "molécula de ligaglt de FTC-beta", tal como se utiliza aqui, é qualquer molécula que exiba a mesma fsctividbuHí biológica ou uma actividade que é praticamente igual como uma proteína de fusão do receptor de FTC-beta. "Indivíduo" significa um organismo vivo, incluindo seres humanos, outros mamíferos e quaisquer outros animais que produzam FTC-beta. "Sobre-produção de FTC-beta", tal como se utiliza aqui, ··· uma quantidade de FTC-beta presente no soro ou no tecido, que está anormalmente acima do nível normal. Mais preferencialmente, sobre-produção de FTC-beta é um nível entre cerca de 2 e cerca de 20 vezes o normal. Ainda mais preferencialmente, a sobre-produção de FTC-beta é um nível entre cerca de 2 e cerca de 15 vezes o normal. Por exemplo, Deguchi mediu a produção de FTC-beta durante 24 horas das células brônquio-alveolares e relatou níveis normais de 410 + /- 225 ρ§/11Γ células, contra o excesso de produção de FTC-beta de 1.283 +/- 453 pg/íô1' células no lúpus eritematoso sistémico e 1.417 +/- 471 pi/10' células no escleroderma ((1992) Ann. Rheum. Dis. 51:36265). A sobre-produção de FTC-beta pode ser determinada em combinação com os níveis normais, medindo a proteína de FTC-beta de ARNm de FTC-beta ou de produtos cuja síntese é estimulada por FTC-beta, tal como, o colagénío. "Tecido conjuntivo" é tecido fibroso caracterizado pela presença de fibroblastos e proteínas fibrosas, tais como, colagénío e elastina.
Um "distúrbio fibroprcliferativo" é caracterizado pela proliferação de fibroblastos mais a correspondente sobre-xpressão da matriz extracelular, tal como, fibronectina, laminína e colagénío. ã "composição terapêutica", tal como utiliza o aqui, é definida como compreendendo as proteínas proíOmce icocnçn;;. e o;-:ros ingredientes ponxo de vista fisiológico. A composição terapêutica pode conter excipientes, tais como, água, minerais u veícrulgç, tais como, proteína..
Uma U:|us.rf:;U..dad.o suficiente" das proteínas da presente invenção, tal como se utiliza aqui, refere-se à quantidade da proteína de Γ U S 3.0 do receptor de FTC-beta que neutraliza a actividade biológica do excesso de FTC-Seta. Pode ser determinada por (1) variáveis clínicas apropriadas de melhoramento, (2) avaliação patológica dos efeitos na fibrose e/ou na imunossupressão ou prevenção da fibrose ou (3) uma inibição directa de FTC-beta. "Arninoácido" - uma unidade monomérica de um péptido, polipéptido ou proteína. Há vinte arninoácidos encontrados nos péptidos, polipéptidos e proteínas de ocorrência natural, sendo que todos eles são isómeros L. 0 termo também inclui análogos de arninoácidos e isómeros D dos arninoácidos da proteína e dos seus análogos. "Proteína" - qualquer polímero que consiste pratica-mente em qualquer um dos vinte arninoácidos. Embora "polipéptido" seja muitas vezes utilizado em referência, a polipéptidos relativamente grandes e "péptido" seja muitas vezes utilizado em referência a polipéptidos pequenos, a utilização destes termos na técnica sobrepõe-se e varia. 0 termo "proteína", tal como se utiliza aqui, refere-se a péptidos, proteínas e polipéptidos, a menos que se indique de outra forma. funcional" de um resíduo de arninoácido, é um arninoácido que tem propriedades físico-químicas às âd resíduo de arninoácido que foi substituído pelo equivalente lurvciUvíU., 'ΡαΜοό - refere-se a uma Ligação covalente, colinear, de duas ou mais proteínas o:u dos seus fragmentos por via das suas estruturas peptídicas individuais, mais preferencialmente, através da expressão ira de uma molécula de polinucleótido que codifica essas proteínas. "Mutante" - qualquer alteração no material genético de um em particular, qualquer alteração úlígto ê, eliminação, » adição ou alteração) numa sequência de polinucleótídos de tipo selvagem ou qualquer alteração numa proteína de tipo selvagem. "De tipo selvagem ou de ocorrência natural", sequência de polinucleótídos de ocorrência natural de um exão de uma proteína ou de uma parte dela ou uma sequência de proteínas ou uma porção delas, respectivamente, tal como existe nsrmalmente ín vivo. "Condições de hibridação padrão" - condições de salinidade e temperatura praticamente equivalentes a 0,5 x SSC âtvá cerca de 5 x ÇSC e 65 'C tanto para a hibridação como para a lavagem. A expressão "condições de hibridação padrão", tal como se utiliza aqui, é assim uma definição operacional e engloba uma gama de condições de hibridação. As condições mais severas podem, por exemplo, incluir a hibridação com um tampão de clivagem de placa (polivinilpirrolidona a 0,2 %, Ficoll 400 a 0,2 %; albumina de soro bovino a 0,2 %, Tris-HCl 50 me; (pH 7,5); NaCl 1 M; pirofosfato de sódio a 0,1 %; SDS a l %) ; sulfato de dextrano a 13 i «i 100 qg/mL de ADN de esperma de salmão, desnaturado,e tratado com ultra-sons, a 65 "C, durante 12-2 0 horas e lavagem com NaCl 75 i^/çdtrafCí de sódio 7,5 ®M (0,5 x ; a 1 %, a 65 KC5. As condições menos severas paiismq: gor exemplo, incluir a híUcrxónção com nm tampão de clivagem de placa, sulfato de dextrano a 10 % e 110 qg/mL de ADN de esperma de salmão, desnaturado, tratado com ultra-sons, a 55 "C, durante 12-20 horas e lavado com NaCl 3 00 mM/citrato de sódio 3 0 (2,0 x .' . ' a 1 %, a 55 °C. Ver também, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. New York, Sections 6.3.1-6.3.6, (1989) . "Sequência de expressão de controlo" - uma sequência de polinucleótidos que controla e regula a expressão dos genes quando ligada operacionalmente a esses genes. "Operacionalmente ligada" - uma sequência de polinucleótidos (ADN, ARN) está operacionalmente ligada a uma sequência de expressão de controlo quando a sequência de expressão de controlo controla e regula a transcrição e a tradução dessa sequência de polinucleótidos. A expressão "ligado operacionalmente" inclui ter um sinal inicial apropriado (por exemplo, ATG) na frente da sequência de polinucleótidos a ser expressa e mantendo a estrutura de leitura correcta para permitir a expressão da sequência de polinucleótidos sobre o controlo da sequência de expressão de controlo e a produção do polipéptido desejado codificado pela sequência de polinucleótidos. "Vector de expressão" - um polinucleótido, tal como um plasmido de ADN ou fago (entre outros exemplos comuns) que permite a expressão de pelo menos um gene quando o vector de expressão é introduzido numa célula hospedeira. O vector pode ou não ser capaz de replicar numa célula. camente pu3£0M) - quando aplicado a um ácido nucleico, isto é, sequências de polinucleótidos que codificam polipê- 28 ptídos, significa um polinucleótido de ARN ou de ADN, uma porção de um polinucleótido genómiec, um polinucleótido de ADNc ou sintético que, em virtude da sua origem ou manipulação: 11': não está associado com todo o polinucleótido com o qual está associado na natureza (por exemplo, está presente numa célula hospedeira como um vector de expressão ou uma parte dele); ou (ii) está ligado a um ácido nucleico ou a outra parte química diferente daquela a que está ligado na natureza; ou (iii) não ocorre na natureza. Por "isolado" entende-se ainda uma sequência de polinucleótido que está (i) amplificada in vitro, por exemplo, por uma reacção em cadeia de polimerase (RCP); (ii) sintetizado quimicamente; (iii) produzido de forma recombinante por clonagem; ou (iv) purificado, por exemplo, por clivagem e separação em gel.
Assim, "ácido nucleico praticamente puro" é um ácido nucleico que não e imediatamente contíguo a uma ou a ambas as sequências de codificação a que está normalmente contido no genoma de ocorrência natural do organismo do qual esse ácido nucleico derivou. ADN praticamente puro também inclui um ADN recombinante que faz parte de um gene híbrido que codifica sequências adicionais. "Isolado" (utilizado intermutavelmente como "praticamente puro") - quando aplicado a polipéptidos, significa um polípêptido ou uma porção dele que, em virtude da sua origem ou manipulação: (i) está presente numa célula hospedeira como um produto de expressão de uma porção de um vector de expressão; ou (ii) está ligado a uma proteína ou a outra parte química diferente daquela a que está ligado na natureza; ou (iii) não ocorre natureza. Por "isolado" entende-se ainda uma proteína que é: y.; sintetizada quimicamente; ou iii) expressa numa célula hospedeira e purificada das proteínas associadas. C termo geralmente significa um polipéptido que tenha sido separado de outras proteínas e ácidos nucleícos com os quais ocorre na natureza. Preferencialmente, c polipéprido é também separado de ouiúlansua.s, tais como, anticorpos ou matrizes de gel (poiiacrilamida) , gue são utilizadas para o purificar. "Promotor heterólogo" - tal como se utiliza aqui, é um promotor que não está associado na natureza com um gene ou um ácido nucleico purificado. "Homólogo" - tal como se utiliza aqui, é sinónimo do termo "identidade" e refere-se à semelhança de sequências entre dois polipéptidos, moléculas ou entre dois ácidos nucleicos. Quando uma posição nas duas sequências comparadas está ocupada pela mesma base ou subunidade monomérica de aminoácido (por exemplo, se uma posição em cada uma das duas moléculas de ADN está ocupada por adenina ou uma posição em cada um dos dois péptidos está ocupada por uma lisina), então as respectivas moléculas são homólogas nessa posição. A percentagem de homologia entre duas sequências em função do número de posições emparelhadas ou homólogas partilhadas pelas duas sequências divididas pelo número de posições comparadas x 100. Por exemplo, se 6 de 10 das posições nas duas sequências estão emparelhadas ou são homólogas, então as duas sequências são 60 % homólogas. A título de exemplo, as sequências de ADN CTGACT e CAGGTT partilham 50 % de homologia (3 de um total de 6 posições coincidem). Geralmente, faz-se uma quando sequências estão alinhados para dar a homologia
DEFINIR íssfâla», Exemplos de referências para
Os termos "péptidos", "proteínas" e "polipêptidos" são utilizados aqui de forma intermutável, As expressões ''sequência de polinucleótidos" e "sequência de nucleõtidos" são também utilizadas aqui de forma intermutável. A prática da presente invenção utilizará, a menos que seja indicado de outra forma, técnicas convencionais da biologia das células, cultura de células, biologia molecular, microbiologia, ADN recombinante, química das proteínas e imunologia, que esfls dentro das competências desta técnica. Essas técnicas estão descritas na literatura. Ver, por exemplo, Molecular Cloning: A Laborato-y Manual, 2* edição. (Sambrook, Fritsch e Maníatís, eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning, Volumes I e 11 (D. N. Glover, ed) , 1985;
Oligonucleotide Synthesis, (M. J. Gait, ed.), 1984; patente de invenção norte-americana U.S. No. 4.6 83.195 (Mullis et al. ,) ; Nucleic Acid Hybridization (3. D. Hames e S. J. Higgins, eds.), 1984; Transcription and Translation (B.D. Hames e S. J. Higgins, eds.), 1984; Culture of Animal Cells (R. I. Freshney, ed). Alan R. Liss, Inc., 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal), 1984; Methods in Enzymology, Volumes 154 e 155 (Wu et ai., eds), Academic Press, New York; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. H. Míller e Μ. P. Calos, eds.), 1987, Cold Spring Harbor Laboratory; Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Waiker, eds.), Academic Press, Londcn, 1987; Handbook of Experiment Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir e C, C. Blackwell, eds.), 1986; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986. II. Propriedades Gerais de Proteínas e Polinucleótidos
Isolados A. Fusões Soláreis ao Receptor de FTC-beta e dos seus
Análogos como Antagonistas de FTC-beta A presente invenção utiliza polipêptidos antagonistas de FTC-beta isolados e purificados. Os polipêptidos antagonistas de FTC-beta isolados e purificados, utilizados na presente invenção, estão praticamente isentos de outros materiais contaminantes de origem natural ou endógena e contêm menos do que cerca de I % em massa de resíduos de contaminantes de proteínas dos processos de produção. Os polipêptidos antagonistas de FTC-beta utilizados na presente invenção estão, eventualmente, sem a glicosilação do modelo natural associado.
Tal como se utiliza aqui, a expressão "receptor de FTC-Seta" refere-se a proteínas que têm sequências de aminoácidos que são praticamente semelhantes ao receptor de FTC-beta de mamífero natural ou às sequências de moléculas de ligação de FTC-beta e que são capazes de se ligarem a FTC-beta e de inibirem que FTC-beta se ligue a membranas das células contendo o receptor de FTC-beta. 0 receptor de FTC-beta preferido é o receptor de FTC-beta maduro, de comprimento completo, do tipo II. 0 receptor de FTC-beta do tipo II é uma proteína ligada à membrana, com um domínio intracelular, domínio transmembrana e uma porção extra-celular que se liga a FTC-beta. Tem-se determinado o receptor de FTC-beta do tipo II humano como tendo uma sequência de aminoácidos mostrada em Lin et al., Cell: 68, 775-785 (1992) e corrigido como se mostra na palenlá de invenção norte-americana U.S. 5.693.607.
Os receptores de FTC-heta da presente invenção preferidos, são fermas solúveis do receptor de FTC-beta do tipo IT, assim como, moléculas de ligação solúveis de FIC-beta do tipo II. Os receptores de FTC-beta solúveis incluem, por exemplo, análogos ou subunidades de proteínas naturais, que têm, pelo menos 2 0 aminoãcidos e que exibem, pelo menos, alguma actividade biológica em comum com o receptor de FTC-beta do tipi* 13 ou com as moléculas de ligação de FTC-beta.
As expressões "proteína de fusão do receptor de FTC-beta do tipo II" ou "R FTC-beta II:Fc", são utilizados intermutavelmente e representam os enquadramentos mais preferidos das composições da presente invenção. Esta proteína de fusão contém, pelo menos, uma parte do receptor de FTC-beta (tipo II) ligado, pelo menos, a uma parte da segunda proteína que não é um receptor de FTC-beta do tipo II. Especificamente, a segunda proteína pode ser a região constante de uma imunoglobulina (preferencialmente, IgG, sendo o mais preferencial, IgGl) ou pode ser uma sua expressão, tal como, a sua articulação CH2 ou CH3. As fusões preferidas da presente invenção são homodímeros, ligados uns aos outros por ligações de dissulfureto mas também se considera que as formas heterodiméricas estão dentro âmbito da presente invenção. Ver Secção IV.
Assim, as composições mais preferidas da presente invenção são antagonistas de FTC-beta que são proteínas de fusão solúveis, tais como, moléculas de anticorpos quiméricos recombinantes, comportando sequências do receptor FTCVb-ggs: substituídas pelos domínios variáveis de alguma ou de ambas as cadeias leves e pesadas da de Itnntóglotoli nc e que têm domínios de região constante não modificados. Por exemplo, R FTC-beta II é produzido a partir de genes quiméricos: una cadela pesada, quimérica de R FTC-beta 11/impuòúlcbuliili; I humana. No seguimento da transcrição e da qq&díivãG do gene quimérico, o produto do gene liga-se num homodímero qu® tenha uas receptor de FTC-beta de forma líirilPoto. Essas formas polivalentes ao receptor de FTC-beta podem ter uma maior afinidade de ligação para o ligando de FSC-beta.
As estruturas do receptor de FTC-beta solúvel da presente invenção, estão desprovidas da região da transmembrana (e são segregadas a partir da célula) mas retêm a capacidade de se ligar a FTC-beta. As várias proteínas bio-equivalentes e os análogos de arninoácidos têm uma sequência de arninoácidos correspondendo a toda ou parte da região extracelular de um receptor natural de FTC-beta (por exemplo, SEQ ID N°. 8 ou 9 ou sequências de arninoácidos praticamente semelhantes ou, pelo menos, 98 % homologas das sequências da SEQ ID N°. 8 ou 9) e que são biologicamente activas pelo facto de se ligarem ao ligando de FTC-beta. Os receptores equivalentes de FTC-beta incluem polipéptidos que variam destas sequências por uma ou mais substituições, eliminações ou adições e que retêm a capacidade de se ligar a FTC-beta ou de inibir a actividade de transdução do sinal de FTC-beta por via da superfície da célula ligada às proteínas do receptor de FTC-beta. A inibição da actividade de transdução do sinal de FTC-beta pode ser determinada transfectando as células com ADNs do receptor de FTC-beta recombínante, para se obter uma expressão recombínante do receptor. Faz-se então as células contactarem com FTC-beta e examinam-se os efeitos nbítáb&ltlCb:! resultantes. Se resultar um efeito que é atribuível à :Tbçlo do ligando, então o receptor recombinan-te tem uma actividade de transdução do sinal. Exemplos de processos para determinar se um |x:di.oèntidõ tem actividade àe cransdução do sinal, estão descritos por Idzerda et al. , J. Exp. Med. 171: 861 (1990); Ctxtix et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 86: 3045 (1989); Prywes et al . , EMBC J. 5:2179 (1986) e Chou et 1 J. Bíoi. Chem. 262: 1842 (1987) . Alternativamente, as células primárias ou as liudàií de células que expressam um receptor endógeno de FTC-beta e têm uma resposta biológica detectãvel a FTC-beta podem também ser utilizadas.
Um "fragmento" das proteínas da presente invenção é uma porção ou toda uma proteína que seja capaz de se ligar a FTC-beta. Preferencialmente, este fragmento tem uma elevada afinidade para FTC-beta. Os fragmentos preferidos das proteínas de fusão são os fragmentos de proteínas que compreendem, pelo menos, parte da porção extracelular do receptor de FTC-beta do tipo 11 ligado a, pelo menos, uma parte da uma região constante de uma imunoglobulina. Preferencialmente, a afinidade está no intervalo de cerca de a M, embora a afinidade possa variar consideravelmente com fragmentos de diferentes dimensões, variando de 10‘7 a 19 '"'' M. Num enquadramento, o fragmento tem cerca de 10-110 aminoácidos de comprimento e compreende o sítio de ligação de FTC-beta ligado a, pelo menos, parte de uma região constante de uma imunoglobulina.
Se a sequência de aminoácidos naturais do domínio extracelular do receptor de FTC-beta (por exemplo, os aminoácidos 1 a 160 das SEQ ID N°s. 8 ou 9) é utilizada nas proteínas de fusão, a sequência de aminoácidos parece-se com a poreto extracelular inteira do receptor do tipo LI. Quando se utilizam porções do receptor de FTC-beta do tipà II menores, elas parecem-se com vãrias porções das porções extracelulares do receptor de FTC-beta âú tipo II, desde que se liguem a FTC-beta cora elevada afinidade. Embora, a sequência de um dado "fragmento" se baseie preferencialmente no receptor natural de FTC-beta da região extracelular, a definição também engloba análogos de proteínas da presente i-trucls que têm uma elevada afinidade para FTC-beta. Esses áuálóvos incluem os que são produzidos por substituições conservadoras de aminoácidos, assim como, os que são produzidos por u; atui .1 Zhç-kc- do fragmenta pelas células mutadas.
Os membros da família dos receptores de FTC-beta úteis nas utilizações das composições nos processos da presente invenção, incluem qualquer uma das proteínas naturais de ocorrência natural incluindo as suas contrapartes filogenéticas, alélicas ou outras das suas variantes, quer produzidas a partir de fontes naturais ou quimicamente, incluindo mutainas ou proteínas mutantes, assim como, formas recombinantes e novas, membros activos da família. Os polipéptidos incluem uma sequência de aminoácidos de, pelo menos, 98 % ou 99 % homólogas a sequência de aminoácidos das SEQ ID N°s. 8 ou 9 . 0 polipéptido pode também incluir uma sequência de aminoácidos praticamente igual à sequência de aminoácidos nas SEQ ID N°s. 8 ou 9 . 0 polipéptido tem, pelo menos, 5 , 10, 20, 50, 100 ou 150 aminoácidos de comprimento e inclui, pelo menos 5, preferencialmente, pelo menos 10, mais preferencialmente, pelo menos 20 e, ainda mais preferencialmente, pelo menos 50, 100 ou 150 aminoácidos contíguos das SEQ ID N°s . 8 ou 9 .
Os polipéptidos da presente invenção incluem aqueles que têm origem como resultado da existência de genes múltiplos, eventos alternativos de transcrição, eventos de alternativa de AEN e eventos alternativos de tradução e de pós-tradução. 0 poiipéptido pode ser feito mteiramente por meios sintéticos ou pode ser exçresso em sistemas, por exemplo, de cultura que resultam nas modificações pós-tradução praticamente ig-oais? presentes quando a proteína é expressa numa célula natural ou em Bonnornas que resultam na omissão de modificações pós-tradução presentes quando expressas numa célula natural. B. Sequências Isoladas do Lolinucleótidos A presente invenção também tem por objecto polinucleótidos que derivam de polinucleótidos que codificam, sob expressão, o receptor de FTC-beta de tipo natural (por exemplo, SEQ ID N°s. 1-4, 10 e 12), ver também a patente de invenção norte-americana U.S. 5.693.607. Um ADNc que codifica uma molécula de um receptor de FTC-beta do tipo II (isto é, os nucleótidos numerados como 832-1.311 das SEQ ID N°. 2 ou da SEQ ID H°. 4), é uma sequência de ADN complementar (ADNc) que codifica para o receptor de FTC-beta. Outros membros da família dos receptores de FTC-beta apresentam-se como polinucleótidos de FTC-beta do tipo I, de tipo natural (REF) e polinucleótidos do tipo III, de tipo natural (REF).
Também tem por objecto polinucleótidos isolados, exibidos nas SEQ ID N°s . 1-4, 10 e 12, que podem ser alterados para originar polinucleótidos equivalentes sob o ponto de vista funcional. Um polinucleótido é "equivalente sob o ponto de vista funcional" comparado com os das SEQ ID-N°s. 1-4, 10 e i2 se satisfaz pelo menos uma das seguintes zonàímvs: (a) o "equivalente funcional" é um polínucleóti-do que híbrida rios* uma qualquer das sequências anteriores (SEQ ID N°s. 1-4, 10, 12) em condições de hibridação padrão. Maís codifica uma proteína do receptor de FTC-beta com a mesma actividade biológica que o receptor de FTC-beta de tipo natural e (b) o "equivalente funcional" é um poiinucleótido que codifica na expressão para uma sequência de aminoácidos codificada por um qualquer dos polinucleótidos das SEQ ID N°s. 1-4, 10 e 12.
Devido à degenerescência das sequências de codificação dos nucleótidos, podem utilizar-se outros polinucieótidos para codificar os receptores de FTC-beta ou as suas fusões. Para o receptor de FTC-beta do tipo II, estes polinucleótidos incluem toda ou porções de ADN que codificam as SEQ ID N°s. 8 ou 9, que estão alterados pela substituição de diferentes codões, que codificam o mesmo resíduo de aminoácidos dentro da sequência, produzindo assim uma alteração silenciosa. Essas sequências alteradas são encaradas como equivalentes das SEQ ID N°s. 8 ou 9. Por exemplo, Fen (f) é codificada por dois codões, TTC ou TTT, Tri (Y) é codificada pelo TAC ou TAT e His (E) é codificada por CAC ou CAT. Por outro lado, Trp (W) é codificado por um único codão, TGG. De acordo com isto, deve entender-se que para uma dada sequência de ADN que codifica uma proteína particular, haverá muitas sequências degeneradas de ADN que serão codificadas por ela. Estas sequências de ADN degeneradas estão consideradas dentro do âmbito da presente invenção.
As proteínas de fusão da presente invenção que Incorporam os receptores de FTC-Seta do tipo II de coelho, estão indicadas nas SEQ ID N°s . 2 e 8 para o ADNc e as sequências de aminoácidos deduzidas, respectivamente. Também tem por objecto as proteínas de fusão que incorporam o receptor humano de FTC-beta do cipo II mostrado nas SEQ 10 Νί:'§, 4 e 9 para o ADNc e as sequências de aminoácidos deduzidas, respectivamente.
As proteínas preferidas de R FTC-beta ii:Fc da presente itrtPPplP incluem a nova sequência de "junção" de XDN SEQ ID N° . 6 e SEQ ID N° . 11 de aminoácidos. A SEQ ID N°. 10 representa os 11 codões de tripleto em cada um dos lados da junção de CTG/GTC entre o ADN de R FTC-beta II de coelho e o ADN da imuncglobulina. NA SEQ ID N° . 10, as extremidades da sequência de FTC-beta depois do tripleto CTG e a sequência da imunoglobulína comega no tripleto GTC. A sequência da "junção" de aminoácidos de coelho deduzida, correspondente, está representada na SEQ ID N°. 11 em que a extremidade da sequência do receptor de FTC-beta é a leucina e o início da sequência de imunoglobulína é a valina imediatamente depois. Também se descreve aqui as sequências de ADNc humano da "junção" correspondente e as sequências de aminoácidos das SEQ ID N°s. 12 e 13, respectivamente. Na SEQ ID N°, 2, a junção correspondente começa no tripieto do início do nucleótido 1.309 e termina no tripleto do início do nucleótido 1.312.
Pode acontecer que as SEQ ID N°s. 10 e 12 sejam o ADN mínimo necessário para a hibridação em condições padrão com qualquer sequência de ADN que codifique qualquer um de receptor de FTC-beta:proteína de fusão de Fc. Apesar disso, dado que toda a sonda híbrida em ambos os lados da junção e ambos os lados da junção de receptor FTC-beta/região constante participam na bibridação, podem existir sequências mais pequenas. Além disso, os especialistas na matéria compreenderam que sequências de ACN maiores do que as SEQ ID N°s. 10 e 12, serão apropriadas também para a hibridação. Um especialista na matéria pode ensaiar se uma: sonda particular, tal como, as SSQ ID N°s. iu e 12 são capazes de híbridar em ambos os lados da junção, por meio da marcação da extremidade 5' quer de um oligcnucleótido de num oligonucleótido de estrutcra helicoidal simples de sentido inverso, com um fosfato de ATP apropriadamente marcado utilizando um polinucleótido-cinase. Uma sequência da presente invenção deve hibridar e por isso ser marcada por ambas :s«: sondas de oligonucleótido. Deve entender-se ainda que a presente invenção engloba as sequências completamente degeneradas que codificam a junção das ÇEQ ID N°s. 10 e 12.
Tal como a maior parte dos genes de mamíferos, os receptores de ETC-beta de mamíferos estão presumivelmente codificados por genes com múltiplos exões. As estruturas alternativas de ARNm que podem ser atribuídas a diferentes eventos de junção de ARNm no seguimento da transcrição e que partilham grandes regiões de identidade cu semelhança com os ADNcs reivindicados aqui, também podem ser utilizados. 3 vector que contém o clone de ADNc de R FTC-beta II:Fc foi utilizado para expressar e purificar R FTC-beta II:Fc solúvel.
Podem isolar-se outros ADNcs de receptores de FTG-beta de mamíferos utilizando uma sequência de ADN do receptor de FTC-beta humano apropriada como sonda para pesquisar uma biblioteca de ADNc particular de mamíferos, por meio da hibridação de espécies cruzadas. Os receptores de FTC-beta de mamíferos utilizados na presente invenção incluem, a título de exemplo, receptores de FTC-beta de primatas, seres humanos, murinos, caninos, felinos, bovinos, equinos e porcinos. Os receptores de FTC-beta de mamíferos podem obter-se por hibridação de espécies cruzadas utilizando um ADNc de estrutura helicoidal simples derivado da sequência fe ADN de receptor humano de FTC-betà como uma sonda de hibridação, para isolar os ADNcs doe receptores de FTC-beta mamíferos. III. Produção de Polipéptidos Recombinantes
Os polipéptidos isolados aqui descritos podem ser produzidos por qualquer processo conhecido na técnica, ésses processos vão desde processos directos de síntese de proteínas até à cònstrúção de uma sequência de ADN que codifique as sequências de polipéptidos isolados e à expressão dessas sequências num hospedeiro transformado, apropriado. Por exemplo, o ADNc pode obter-se por pesquisa numa biblioteca de ADNc humano com um fragmento de ADNc marcado, que codifica os polipéptidos das SEQ ID N°s. 8, 9, 11 ou 13 e por identificação dos clones positivos por meio de autoradiografia. Vários ciclos de purificação de placas e hibridação são realizados utilizando processos convencionais.
Num enquadramento de um processo recombinante, constrói-se uma sequência de ADN isolando ou sintetizando uma sequência de ADN que codifique uma proteína de interesse, de origem natural. Eventualmente, a sequência pode sofrer mutagénese por mutagénese específica do sítio para originar os análogos funcionais. Ver, por exemplo, Zoeller et ai., Proc. Nat. Acad. Sei. USA 81 : 5662-5066 (1984) e a patente de invenção norte-americana U.S. 4.588.585. Outro processo de construção de uma sequência de ADN que codifica um polipéptido de interesse, será por síntese química utilizando um sintetizador de oligonucleótidos. Esses oligonucleótidos podem ser concebidos, preferencialmente, com base na sequência de amínoãcidos do polipéptido desejado e, preferencialmente, seleccionando os codões que estão favorecidos na célula do hospedeiro, em que o polipéptido recombinante de interesse será prhbú.ítids)
Podem aplicar-se processos normalizados para sintetizar uma sequência de um polipéptido isolado codificando um polipéptido isclado de interesse. ... exemplo, pode-se utilizar uma sequência completa de amínoãcidos para. construir um gene traduzido ao contrário. Ver iiârnppiw et al, , supra. disso, pode-se sintetizar um oligômero de ADN contendo uma sequência de nucleótidos que codifica para o polipéptido particular isolado. For exemplo, pode-se sintetizar vários oligonucieótidos pequenos que codificam para porções do polipéptido desejado e depois faz-se a respectiva ligação. Os oiigonucleótidos individuais normalmente contêm prolongamentos de 5' ou 3' para uma junção complementar. Uma vez combinados (por síntese, mutagénese dirigida ao sítio ou outro processo), as sequências de ADN mutantes que codificam um polipéptido particular de interesse isolado, serão inseridas num vector de expressão e ligadas operacionalmente a uma sequência de controlo de expressão apropriada para a expressão da proteína de um hospedeiro desejado. A ligação apropriada pode ser confirmada por sequenciação de nucleótidos, mapeamento de restrição e expressão de um polipéptido activo sob o ponto de vista biológico num hospedeiro apropriado. Como é sabido na técnica, para se obter elevados níveis de expressão de um gene transfectado num hospedeiro, o gene deve estar operacionalmente ligado às sequências de controlo de expressão transcricionais e de tradução, que são funcionais no hospedeiro de expressão escolhido. A. Expressão do Receptor de FTC-beta Recombinante
Os vectores de expressão recombinantes são utilizados preferencialmente para amplificar ou expressar o ADN que codifica as fusões do receptor de FTC-beta, Os vectores de expressão recombinantes são estruturas de ADN replicáveis que têffi fragmentos de ADN sintéticos ou derivados de ADNc, que codificam as fusões dc receptcr de FTC-beta ou análogos bioequivalentes ligados operacionalmente a elementos reguladores transcricionaís ou translacionais apropriados derivados de genes de mamíferos, microbianos, virais ou de insectos. Uma unidade transcricional geralmente compreende um conjunto de (1) um elemento ou vários elementos genéticos com um papel regulador na expressão dos genes, por exemplo, promotores ou elementos de aumento transcricional, (2) uma sequência estrutural ou de codificação que está transcrita no ARN e traduzida na proteína e (3) sequências de transcrição e de inicio de tradução e de terminação apropriadas, conforme descrito em detalhe a seguir. Esses elementos reguladores podem incluir uma sequência de operador para controlar a transcrição. A capacidade para replicar num hospedeiro, normalmente conferida por uma origem de replicação e a selecção de genes para facilitar o reconhecimento de transfcrmantes, pode ser adicionalmente incorporada. As regiões de ADN estão ligadas operacionalmente quando estão funcionalmente relacionadas umas com as outras. Por exemplo, um ADN para um péptido de sinal (líder secretor) está operacionalmente ligado ao ADN para um polipéptido se estiver expresso como um percursor que participa na secreção do polipéptido: um promotor está operacionalrnente ligado a uma sequência de codificação se controla a transcrição da sequência; ou um sítio de ligação do ribossoma está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação se estiver posicionado de tal maneira que permita a tradução. Geralmente, operacionalrnente ligado significa contíguo e, no caso de lideres de secreção, contíguo e no mesmo fragmento de leitura. Os elementos estruturais apropriados para serem utilizados nos sistemas de expressão de leveduras incluem, preferencialmente, uma sequência líder que permite a secreção extraceiular da proteína traduzida por uma cêhiíâ hospedeira. Alternativamente, quando uma proteína recombinante está expressa sem uma sequência líder ou de transporte, pode i&o!.u:lr um resíduo de metionma no terminal N. Este resíduo pode, eventualmente, ser em seguida clivado a partir da proteína recombinante expressã, para originar um produto final.
As sequências de AM que codificam os receptores de FTC-beta de mamíferos que se pretendem expressar como uma fusão num microrganismo, podem conter preferencialmente intrões que podem terminar prematuramente a transcrição do ADN no ARNm dado que essa terminação prematura da transcrição pode ser desejável, por exemplo, quando dela vão resultar mutantes com truncagens vantajosas no terminal C, por exemplo, eliminação de uma região da transmernbrana para originar um receptor solúvel não ligado à membrana das células. Devido ao código de degenerescência, podem considerar-se variações nas sequências de nucleótidos que codificam as mesmas sequências de aminoácidos. Tal como já foi discutido antes, outros enquadramentos incluem sequências capazes de hibridar com as sequências do ADNc fornecido em condições padrão (50 °C, 2 x SSC) e outras sequências que hibridam ou degeneram com as que codificam as proteínas da presente invenção, activas sob o ponto de vista biológico. A escolha da sequência de controlo de expressão e do ooctor de expressão dependerá da escolha do hospedeiro. Pode ntiliíitr-st issa grande variedade de de hospedeiro/vector de expressão. Os Vwttotíít do expressão dtíoUs ::: r:s hospedeiros eucarióticos incluem, por 0.-0-00 vectcres que compreendem as de ϋύΏΐΨ&Ιζ". da expressão de SV40, vírus do papiioma bovino, adenovírus e citomegalovírus. Os vectores de expressão úteis para hospedeiros bacterianos íOCÍU-ê® plasmidos bacterianos conhecidos, tais como, plasmidos de Esheríchia coli, incluindo pCRl, pBR322, pMB9 e os seus derivados, uma gama Kss.i:& v&sta de cla-PTodis de hospedeiros, tais como, M13 e fagos de ADN de estrutura helicoidal simples, filamentosos. Os vectores de E. ccli preferidos incluem os vectores pL contendo c promotor do fago lambda pL (patente de invenção norte-americana U.S. 4.874.702), vectores de pET contendo o promotor de T7 polimerase (Studier et al., Methods m Enzymology 185: 60-89, 1990 1) e o vector pSP72 (Kaelin et al., supra). Os vectores de expressão úteis para as células de leveduras incluem, por exemplo, o 2 μ. e os plasmidos centrómeros.
Além disso, pode-se utilizar nestes vectores gualguer uma de uma ampla variedade de sequências de controlo de expressão. Essas sequências de controlo de expressão úteis incluem as sequências de controlo de expressão associadas com genes estruturais dos vectores de expressão anteriores. Exemplos de sequências de controlo de expressão Úteis incluem, por exemplo, os promotores precoces e tardios de SV40 ou de adenovírus, o , sistema lac, o sistema trp, o sistema TAC ou TRC, o principal operador e as regiões promotoras do fago lambda, por exemplo, pL, as regiões de controlo da proteína de revestimento fd, o promotor para 3-fosfoglicerato- cmase ou outros enzimas glicolíticos, os de fosfatase ácida, ρο-r exemplo, o , os promotores do sistema de emparelhamento alfa de leveduras e outras sequências conhecidas por controlarem a expressão de 0 ADN do receptor recombinante de FTC-beta ou o ADN de FTC-beta recombinante R:Fc é expresso ou amplificado num sistema de expressão recombinante, que compreende uma monocultura praticamente de um hospedeiro apropriado, que tem integrado estavelmente ípor transformação ou transfecção) uma unidade transcricional recombinante no &DS* cromossómico ou comporta a unidade transcricional recombinante como um composto de um plasmido residente. Geralmente, as células que constituem o sistema são a progenia de um único transformante antigo. Os sistemas de expressão recombinante, tal como se definem aqui, irão expressar proteínas heterólogas após indução de elementos reguladores ligados â sequência de ADN ou genes sintéticos a ser expressos.
As células hospedeiras apropriadas para a expressão de receptores de FTC-beta de mamíferos e as suas proteínas de fusão incluem células procarióticas, de leveduras ou células eucarióticas superiores, sob o controlo dos promotores apropriados. As células procarióticas incluem organismos gram negativos ou gram positivos, por exemplo, E. coli ou bacilos. As células eucarióticas superiores incluem linhas de células estabelecidas com origem em mamíferos, conforme se descreve a seguir. Os sistemas de tradução isentos de células podem também ser utilizados para produzir receptores de FTC-beta de mamíferos e R FTC-beta :Fc utilizando ARNs derivado das estruturas de ADN da presente invenção. Os vectores de clonagern e de expressão apropriados para serem utilizados com bactérias, fungos, leveduras e hospedeiros celulares de mamíferos, estão descritos por Pouwels et al. (Cloníng Vectors: A Laboratory Hera;·;;; . Elsevíer, N.i 19BB) .
As proteínas recombinantes da presente invenção podem sei expressas em hospedeiros de leveduras, preferencialmente, da espécie Saccharomyces, sais como, S. cerevisiae. As leveduras de outros géneros, tais corno, Pichia ou Kluyveromyces podem também ser utilizadas. Os véctores de levedura conterão geralmente uma origem de replicação do plasmido de levedura de 2 mu ou uma sequência de replicação autónoma, um promotor. 0 ADR que codifica as proteínas da presente invenção e as sequências de ADN para poliadenilação e terminação da transcrição e um gene de selecção. Preferencialmente, os vectores de levedura irão incluir uma origem de replicação e um marcador seleccionável que permite a transformação tanto da levedura como de E. colí, por exemplo, o gene resistente a ampícilina de E. colí e c gene TRP1 ou UPA3 de S. cerevisiae, que dão um marcador de selecção para uma estirpe mutante de levedura, a que falta a capacidade para crescer em triptofano e um promotoi derivado de um gene de levedura altamente expresso, para induzir a transcrição de uma sequência estrutural a jusante. A presença da lesão de TRP1 ou de tiR&3 no genoma da célula hospedeira de levedura vai providenciar então um ambiente efectivo para detectar a transformação por meio do crescimento na ausência de triptofano ou uracilo.
As sequências de promotor apropriadas em vectores de leveduras incluem os promotores para metalotioneína, 3-fcs-foglicerato-cinase (Hitzeman et al. , J. Eiol. Chem. 255:2073, 1990) ou outras enzimas glicolíticos (Hess et al. , J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149, 1968; e Holland et al., Biochem. 7: 4900, > tais como, enolase, gliceraldeído-3-fosfato-des-hidrogenase, hexocinase, piruvato-descarboxi-lase, fosfofructocinase, glicose-6-fosfatc-isomerase, 3-fl::: c f 11 o s r aíc · SSepi ruva to-cinase, trioçef csfalc-isso- rnerase, fosfoglicose-isomerase e glicocinase. Os vectores apropriados e os promotores apropriados para serem utilizados na expressão da levedura, estão ainda descritos em R. Hitzeman et al., patente de invenção europeia EP A 73,657. Os vectores de levedura específicos podem ser combinados utilizando sequências de ADN de pUCIS para selecção e replicação em E. coli. (0 gene Amp' e origem de replicação) e sequências de ADN de leveduras incluindo um prcmotor de ADH2 que reprime a glicose e um líder da secreção do factor alfa. 0 promotor de ADH2 jã foi descrito por Russell et al. (J. Biol. Chem. 258: 2674, 1982) e Beier et al. (Nature 300:724. 1982). O líder do factor alfa de levedura, que dirige a secreção de proteínas heterólogas, pode ser inserido entre o promotor e o gene estrutural para ser expresso. Ver, por exemplo, Kurjan et al., Cell 30: 933, 1982; e Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 81:5330, 1984. A sequência líder pode ser modificada para conter, próximo da sua extremidade 3', um ou mais sítios de restrição úteis para facilitar a fusão da sequência líder com os genes estranhos.
Os protocolos de trânsformação de levedura apropriados são conhecidos pelos especialistas na matéria: uma técnica exemplar está descrita por Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. 75: 1929, 1978, conforme descrito por Sherman et al., Laboratory Course Manual for Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986.
Pode utilizar-se também com vantagem os sistemas de culturas de células de mamíferos ou de insectos para expressar a proteína recombinante. A expressão das proteínas r&d&ítMhântes em células de mamíferos á particularmente preferida, papauq essas proteínas estão geralmente dobradas de forma correcta, modificadas de forma apropriada e são funcionais. Exemplos de linhas de células hospedeiras de mamíferos apropriadas incluem linhas de CQS-7 de células de rim de macaco, descritas por Gluzman (Cell 23: 175, 1981) e outras linhas de células capazes de expressar um vector apropriado incluindo, por exemplo, as células L, C127, 3T3, ovário de hamster chinês (OHC) e linhas de células HeLa e BHK. Os vectores de expressão de mamíferos podem compreender elementos não transcritos, tais como, uma origem de replicação, um promotor apropriado e um melhorador ligado ao gene a ser expresso e outras seguências não transcrita-s gue flangueiam 5' ou 3' e seguências não traduzidas de 5' ou 3' , tal como é necessário sítios de ligação do ribossoma, um sítio de poliadenilação, sítios de dadores conjugados, sítios receptores e seguências de terminação transcricional. Os sistemas de baculovírus para a produção de proteínas heterólogas em células de insectos foram revistos por
Luckow and Summers, Bio/Technology 6:47 (1988).
Os vectores de expressão recombinantes compreendem ADNcs que estão estavelmente integrados em ADN de células hospedeiras. Consegue-se um elevado nível do produto de expressão seleccionando linhas de células que tenham números amplificadcs de ADN do vector. As linhas de células que têm números amplificados de ADN do vector seleccionam-se, por exemplo, psr transformação de uma célula hospedeira com um que compreende uma sequência de ADN que codifica uma enzima que é inibida por um fãrmaco conhecido. 0 vector pode também compreender uma sequência de ADN que codifica uma proteína desejada. a célula hospedeira pode sei ter·irannfpúpaún com um segundo vSDlc&r que compreende a sequência de ADN que codifica a proteína desejada. Faz-se então a cnltura das células hospedeiras em concentrações transformadas ou co-transformadas crescentes do fãrmaco conhecido, seleccionando assim para as células resistentes ao fãrmaco. Essas células resistentes ao fãrmaco sobrevivem em concentrações crescentes do fármaco tóxico por meio da sobre-produção da enzima que é inibida pelo fãrmaco, frequentemente em resultado da amplificação do gene que codifica a enzima. Quando a resistência ao fãrmaco é causada pelo aumento do número de cópias do ADN do vector que codifica a enzima que pode ser inibida, há uma concomitante co-amplificação do ADN do vector que codifica a proteína desejada no ADN das células hospedeiras.
Um sistema preferido para essa co-amplificação utiliza o gene para a di-hidrofolato-redutase (DHFR) , que pode ser inibida pelo fármaco metotrexato (MTX). para se conseguir uma co-amplificação, transforma-se uma célula hospedeira a que falta um gene activo que codifica DHFR com um vector, que compreende a sequência de ADN que codifica DHFR ou uma proteína desejada ou é transformada com um vector que compreende uma sequência de ADN que codifica DHFR e um vector que compreende uma sequência de ADN que codifica a proteína desejada. As células hospedeiras transformadas ou co-transformadas são postas em cultura num meio que contém níveis crescentes de MTX e seleccionam-se essas linhas de células que sobrevivem.
Um sistema de co-amplificação particularmente preferido utiliza o gene para a glutamina sintetase (GS) , que é responsável pela síntese de glutamato e amónia, utilizando a hidrólise de ATP em ADP e fosfato para provocar a reacção. A GS é dt a inibição por meio de uma variedade de ip.i.M.soxèíSpor exemplo, tUSAj Assim, as proteínas da presente invsMsçãiS podem ser expressas em concentrações elevadas por co-amplificação das células transformadas com um vector que compreende a sequência de ADN para GS e uma proteína desejada ou co-transformadas com um vector que compreende uma sequência de ADN que codifica GS e um vector que compreende uma sequência de ADN que codifica a proteína desejada, fazendo-se as culturas das células hospedeiras em meios que contêm níveis crescentes de MSX e seleccionando as células que sobreviveram. O sistema de co-amplificação de GS, os vectores de expressão recombinant.es apropriados e as linhas de células, estão descritos nos seguintes pedidos de patente de invenção PCT: WO 87/04462, WO 89/01036, WO 89/10404 e WO 86/05807.
As proteínas recombinantes são expressas, preferencialmente, por co-amplificação de DHFR ou de GS em células hospedeiras de mamíferos, tais como, células de ovário de hamster chinês (OHC) ou, alternativamente, em células de mieloma de murino, tal como, SP2/0-Agl4 ou NSO ou numa linha de células de mieloma de rato, tal como, YB2/3.0-Ag20, descritas nos pedidos de patente de invenção PCT WO 89/10404 e WO 86/05807.
Deve entender-se que nem todos os vectores e as sequências de controlo de expressão vão funcionar igualmente bem para expressar um dado polipéptido isolado. Também nem todos os hospedeiros funcionam igualmente bem com o mesmo sistema de expressão. Contudo, um especialista na matéria pode fazer uma selecção destes vectores, sistemas de controlo de expressão e hospedeiros sem necessitar de fazer experimentação. Β.
Purificação de R FTC-beta II:Fc Recombinante
As proteínas produzidas por um hospedeiro transformado podem ser purificadas de acordo com qualquer processo apropriado. Esses processos padronizados incluem cromatografia (por exemplo, cromatografia de permuta iónica, de afinidade e de dimensionamento da coluna), centrifuqação, solubilidade diferencial ou por qualquer outra técnica normalizada para purificação de proteínas. Os marcadores de afinidade, tais como, hexa-histidina, domínio da liqação da maltose, sequência de revestimento da gripe e glutationa-S-transferase podem ligar-se à proteína para permitir uma purificação fácil por passagem sobre uma coluna de afinidade apropriada. As proteínas isoladas podem também ser caracterizadas fisicamente utilizando técnicas como proteólise, ressonância magnética nuclear e cristalografia por raios X.
Por exemplo, pode-se primeiro concentrar os sobrena-dantes de sistemas que segregam proteínas recombinantes em meios de cultura utilizando um filtro de concentração de proteína disponível comercialmente, por exemplo, uma unidade de ultra-filtração da Amicon ou da Míllípore Pellicon. No seguimento da etapa de concentração, o concentrado pode ser aplicado a uma matriz de purificação apropriada. Por exemplo, uma matriz de afinidade apropriada pode conter um FTC-beta ou lectina ou uma molécula de anticorpo ou uma proteína A ligada a um suporte apropriado. Alternativamente, pode-se utilizar uma resina permutadora de aniões, por exemplo, uma matriz ou um substrato com grupos dietilaminoetilo (DEAE) pendentes. As matrizes podem ser acrilamida, agarose, celulose ou outros tipos utilizados na purificação das proteínas. Alternativamente, pode-se utilizar uma arapa de permuta catiónica. Os permutadores de catiões apropriados incluem virias matrizes insolúveis que compreendem grupos sulfopropilo ou carboximetilo. Os grupos sulfopropiio são os preferidos. Finalmente, pode-se utilizar uma ou mais etapas de cromatografia liquida de elevada resolução de fase inversa (GLER-FI) utilizando meio hidrofóbico de CLER·” FI, por exemplo, gel de sílica com grupos metilo pendentes ou outros grupos alífãticos para aumentar a purificação de uma composição de R FTC-beta II:Fc. Algumas ou todas as etapas de purificação anteriores, em várias combinações, podem também ser utilizadas para providenciar uma proteína recombinante, homogénea. A proteína recombinante produzida em culturas bacterianas é normalmente isolada pela extracção inicial de aglomerados de células, seguida de uma ou mais concentrações, salinização e etapas de permuta iónica aquosa ou cromatografia de exclusão. Finalmente, pode-se utilizar para as etapas de purificação finais a cromatografia líquida de elevada resolução (CLER) ^ ^ células microbianas utilizadas na expressão de receptores de FTC-beta, recornbinantes de mamíferos, podem romper-se por qualquer processo conveniente, incluindo os ciclos de congelação-descongelação, ultra-sons, rompimento mecânico ou utilização de agentes de iise de células. A fermentação de leveduras que expressam a fusão do receptor de FTC-beta de mamíferos, sob a forma de uma proteína segregada, simplifica enormernente a purificação. A proteína segregada que rSiAUfa de uma fermentação em grande escola pode ser purificada per processos análogos acs descritos por Urdal et al. (J. 296: 171
Esta referência descreve duas etapas sequenciais de CLER de fase Inversa para purificação de FEC-GM recombinante numa coluna preparativa de CLER. C. Produção de Fragmentos e Análogos
Os fragmentos de uma proteína isolada ipcc exemplo; fragmentos da SEQ IP H'::o 8) podem também ser produzidos de forma eficiente por processos recombinantes, por digestão proteolítica ou por síntese química, utilizando processos conhecidos dos especialistas na matéria. Nos processos recombinantes, os fragmentos internos ou terminais de um polipéptido podem ser gerados removendo um ou mais nucleótidos de uma das extremidades (para um fragmento terminal) ou de ambas as extremidades (para um fragmento interno! de uma sequência de ADN que codifica para o polipéptido isolado. A expressão do ADN mutagenizado produz fragmentos de polipéptido. A digestão com endonucleases que "mordiscam a extremidade" também gera ADNs que codifica uma estrutura dos fragmentos. Os ADNs que codificam os fragmentos de uma proteína podem também ser gerados por corte aleatório, digestão por restrição ou uma combinação de ambas.
Os fragmentos do receptor de FTC-beta podem ser gerados directamente a partir de proteínas intactas de receptor de FTC-beta. Os péptidos podem ser clivados especificamente por enzimas proteolíticas incluindo, mas não se limitando, a plasmina, trombina, tripsina, quimio-tripsina ou pepsina. Cada uma destas enzimas é específica para e tipo de ligação peptídiea que ela própria ataca. R tripsina catalisa a hidrólise das ligações peptídicas em que o grupo carbonilo pertence a um aminoãcido básico, normalmente arginína ou iisina. A pepsina e a qulrnio-tripsina catalisam a hidrólise das „ peptídicas aminoácidos aromáticos, tais como, triptofano, tírosina e fenilalanina. Geram-se conjuntos alternados de de proteína clivados evitando a clivagem no sitio que i susceptível a uma enzima proteolitica. Por exemplo, a reacção dos grupos e-aminoãcido de lisina com tioacetato tis etiltriflúor em condições mediamente básicas, origina resíduos de amínoácidos bloqueados cuja ligação peptidica adjacente já não é susceptível à hidrólise por meio de tripsina. As proteínas podem ser modificadas para criar ligações peptíaicas que são susceptíveis a enzimas proteolíticas. Por exemplo, a aiquilação de resíduos de cisteína com ó-halogeno-etilaminas origina ligações peptídicas que são hidrolisáveis pela tripsina (Lindley, Nature i78: 047 (1956)). Além disso, os reagentes químicos que clivam as cadeias de péptidos em resíduos específicos também podem ser utilizados. Por exemplo, o brometo de cianogénio eiiva péptidos nos resíduos de metionina (Gross and Witkip, J. Am. Chem. Soc., 83: 1510 16 1 Assim, tratando as proteínas com várias combinações de modificadores, enzimas proteolíticas e/ou reagentes químicos, as proteínas podem ser dividas em fragmentos com um comprimento desejado sem sobreposição dos fragmentos ou divididas em fragmentos sobrepostos de um determinado comprimento.
Os fragmentos podem também ser sintetizados quimicamente utilizando técnicas conhecidas na técnica, tais como, a química de F-moc ou t-Boc de fase sólida de Merrifield.
Merrifíeld, Recent Progress in Hormone Research 23: 451 (1967) . D. Produção de Sequências de ADN e de Péptidos Alteradas:
Processos Aleatórios
Podem preparar-se variantes de sequências de amincácidos de uma proteína (tal como, as variantes da SEQ ID N-° . 8) pur mutagenese aleatória de ADN que codifica a proteína ou uma sua porção particular. Os processos úteis incluem mutagenese por RCP e mutagénese de saturação. Pode-se também gerar uma biblioteca de variantes aleatórias de sequências de aminoácidos por meio da síntese de um conjunto de sequências de oligonucleótidos degeneradas. Os processos de geração de variantes de sequências de aminoácidos de uma dada proteína utilizando ADN e péptidos alterados, são bem conhecidos na técnica. Os exemplos que se seguem desses processos não pretendem limitar o âmbito da presente invenção, mas servem meramente para ilustrar técnicas representativas. Os especialistas nesta técnica irão reconhecer que outros processos são úteis sobre este ponto de vista.
Mutagénese por RCP: Em resumo, utiliza-se Taq polime-rase (ou outra polimerase) para introduzir mutações aleatórias num fragmento clonado de ADN (ver, Leung et al., Technique 1: 11-15 (1989)). As condições da RCP são escolhidas de tal modo que a fidelidade da síntese de ADN é reduzida pelos polímeros de Taq ADN utilizando, por exemplo, uma relação de dGTP/'dATP de cinco e adicionando Mn+2 ú reacção de RCP. 0 conjunto dos fragmentos de ADN amplificados e inserido em vectores de clonagem apropriados para originar bibliotecas de mutantes aleatórios. de Saturação: Há um processo de forma em Mayers et al., Science, 229: 242 (1989). E;:t resumo, s técnica inclui a geração de matações por tratamento ou irradiação de um ADN de estrutura helicoidal simples in vitro e a síntese de uma estrutura helicoidal de ADNc. A frequência da mutação é modulada pela severidade do tratamento e basicamente podem obter-se todas as subscituições de bases possíveis.
Mutagénese de Gligonucleótidos Degenerados: Fode ge-rar-se uma biblioteca de péptidos homólogos a partir de um conjunto de sequências degeneradas de oligonucleótidos. A síntese química das sequências degeneradas pode ser realizada num sintetizador automático de ADN e os genes sintéticos são então ligados num vector de expressão
apropriado. Ver, Itakura et ·*··., Recombmant DNA, Proc. 3rG
Cleveland Symposium on Macromolecules, pp. 273-289 (A. G.
Walton ed.), Elsevier Amsterdam, 1981. E. Produção de Sequências de ADN Alterado e Péptidos:
Processos Directos A mutagénese não aleatória ou dirigida origina sequências específicas ou mutações em porções especificas de uma sequência de polinucleótidos que codifica um polipéptido isolado, para originar variantes que incluem eliminações, inserções ou substituições de resíduos da sequência de aminoácidos conhecida do polipéptido isolado. Os sítios de mutação podem ser modificados individualmente ou em série, por exemplo, por: (1) substituindo primeiro com aminoácidos conservados e depois com mais escolhas de radicais consoante os resultados alcançados; (2) eliminando o resíduo alvo; ou tíd inserindo resíduos da mesma classe ou de uma classe adjacente diferente ao sítio localizado ou combinações dõs opções 1-3.
Mutagénese por Rastreâmento de Alanina: Este processo localiza os resíduos ou as regiões de uma dada proteína que são localizações preferidas para a mutagénese. Ver, Cunningham and Wells, Science 244: 1081-1085 (1989). Ao rastrear a alanina, selecciona-se um resíduo ou um grupo de resíduos alvo e substitui-se por alanina ou polialanina. Esta substituição pode afectar a interacção do arninoácido com os aminoácidos vizinhos g/ou com o ambiente aquoso ou da membrana circundante. Os que têm sensibilidade funcional às substituições são então refinados por meio da introdução de mais variantes ou de outras variantes no sítio ou para os sítios da substituição.
Mutagénese Mediada por Oligonucleótidos: Pode-se utilizar uma versão deste processo para preparar a substituição, eliminação e inserção de variantes de ADN. Ver, Adelman et al. , DNA 2: 183 (1983). Em resumo, o ADN desejado é alterado por hibridação de um iniciador de oligonucleótido que codifica uma mutação de ADN com uma matriz de ADN que normalmente tem uma forma helicoidal simples de um plasmido ou de um fago contendo uma sequência de ADN não alterada ou de tipo natural da proteína desejada (por exemplo, a proteína). Depois da hibridação, utiliza-se uma ADN-polimerase para fazer a segunda e complementar estrutura helicoidal de ADN da matriz, que irá incorporar o iniciador de oligonucleótido e que irá codificar para a alteração seleccionada na sequência de ADN desejada. Geralmente, os oligonucleótidos que se utilizam têm pelo menos 25 nucleótidos de comprimento. Um oligonucleótido óptimo terá 12 a i5 nucleótidos que são completamente complementares da matriz em cada um dos lados da mutação. Isto assegura que o oligonucleótido irá hibridar apropriadamente com a v.' s da matriz de ACM de estrutura helicoidal simples.
Mutagénese de Cassete: Este processo (Wells et al.,
Gene 34: 315 ilBBtêj) requer um plasmido ou outro vector que contém c ADN da subunidade da proteína a ser mutada. Os codões no ADN da subunidade de proteína são identificados e insere-se um único sítio de endonuclêase de restrição em cada lado dos sítios de mutação identificados, utilizándo-se o processo de mutagénese dirigido ao oligonucleótido descrito antes. 0 plasmido é então cortado nestes sítios para ser linearizado. Sintetiza-se um oligonucleótido de estrutura helicoidal dupla codificando a sequência do ADN entre os sítios de restrição mas contendo as mutações desejadas, utilizando processos padrão. As duas estruturas helicoidais são sintetizadas separadamente e depois são hibridadas em conjunto utilizado processos padrão. Este oligonucleótido de estrutura helicoidal dupla é a "cassete" e tem extremidades 3' e 5' que são compatíveis com as extremidades do plasmido linearizado, de tal modo que podem ser directamente ligados. 0 plasmido contém então assim a sequência de ADN da subunidade de proteína desejada já
Mutagénese Combinatória: Numa versão deste processo (Ladner et al., patente de invenção WO 88/06630), as sequências de aminoácidos para um grupo de proteínas homólogas ou outras proteínas relacionadas, estão alinnadas, preferencialmente, para promover a maior homologia possível. Todos os aminoácidos que aparecem numa dada posição das sequências alinhadas podem ser seleccionados para criar um conjunto degenerado de sequências combinatórias. A biblioteca diversificada é gerada por mutagénese combinatória ao nível do ácido nucleíco e e codificada por uma biblioteca de genes variada. Por exemplo, uma mistura de olígonucleõtidos sintéticos pode ser ligada por via onti:máóiçq. » -,.¾¾ & sequência de genes de tal modo que o conjunto degenerado de sequências potenciais se possa expressar com péptidos individuais ou, alternativamem:e, como um conjunto de proteínas contendo todo o conjunto das sequências degeneradas. IV. Outras Variantes de Polipéptidos Isolados
Os derivados de proteínas da presente invenção também incluem várias formas estruturais da proteína primária que retém actividade biológica. Devido à presença dos grupos amino e carboxilo ionizáveis, por exemplo, uma proteína de fusão do receptor de FTC-beta, pode estar sob a forma de sais ácidos ou básicos ou pode estar sob uma forma neutra. Os resíduos de aminoácidos individuais podem também ser modificados por oxidação ou redução. A estrutura primária do aminoácido (por exemplo, da parte de R FTC-beta II) pode ser modificada por meio da formação de conjugados covalentes ou agregadores com outras partes químicas, tais como, grupos glicosilo, lípidos, fosfatos, grupos acetilo e similares ou pela criação de mutantes das sequências de aminoácidos.
Os derivados covalentes do receptor de FTC-beta podem ser preparados ligando grupos funcionais particulares às cadeias laterais dos aminoácidos do receptor de FTC-beta ou nos terminais N ou C. Outros derivados de R FTC-beta II:Fc incluem conjugados covalentes ou agregadcres de R FTC-beta II ou os seus fragmentos com outras proteínas ou polipéptidos, por meio do síntese em cultura recombinante sob a forma de fusões adicionais do terminai N ou do terminal C. Por exemplo, o pêptido conjugado pode ser uma sequência de polipéptido de sinal (ou líder) na região terminal N da proteína a qual de forma co-transiacionai ou pós-translacional dirige a transferência da proteína do seu sítio de síntese para o seu sitio de função dentro ou fora da membrana da célula ou da parede (por exemplo, a sequência lidtr do factor alfa de levedura). As proteínas do receptor de FTC-beta podem compreender péptidos adicionais para facilitar a purificação ou a identificação do receptor de FTC-beta (por exemplo, poli-Eis). A sequência de aminoãcidcs do receptor de FSC-beta pode também estar ligada ao pêptiao Asp-Tir-Lis-Asp-Asp-Asp-Asp-Lis (DYKDDDDK) (Hopp et al„ , Bio/Technolcgy 6: 1204, 1988). A última sequência é altamente antigénica e providencia um epitopo ligado inversamente por um anticorpo monoclonal especifico, permitindo um ensaio rápido e uma purificação fácil da proteína recornbinante expressa. Esta sequência é também especificamente clivada por enterocinase da mucosa de bovinos no resíduo que se segue imediatamente ao par de Asp-Lis. As proteínas de fusão recobertas com este péptido podem também ser resistentes à degradação intracelular em E. coli.
As formas polivalentes do receptor de FTC-beta são úteis dado que possuem múltiplos sítios de ligação do receptor de FTC-beta para o ligando de FTC-beta. Por exemplo, um receptor blvalente de FTC-beta, solúvel, pode consistir em duas repetições em tandem dos aminoácidos numerados de 1-160 das SEQ. ID. N°s. 8 ou 9 separadas por uma região ligante, sendo as repetições ligadas ao domínio constante de imunoglobulina. Podem construir-se formas polivalentes alternativas, por exemplo, acoplando quimicamente as fusões do receptor de FTC-beta e Fc a qualquer molécula veicular aceitável sob o ponto de vista clínico, um polímero seleccionado do grupo que consiste em Ficoll, polietileno-glicol ou dextrano, utilizando técnicas de acoplamento convencionais. Alternativamente, a fusão do receptor de FTC-beta pode ser acoplada quimicamente a bictina e o conjugado de receptor de biotina-FTC-beta a Fc podem então ligar-se a avidina, resultando em moléculas receptoras tetravaientes de avidina/biotina/receptor de As fusões de receptor de FTC-beta e Fc podem ser acopiadas eovalentemente a dinitrofenol (DNP) ou trinitro-fenol (TNP) e o conjugado resultante precipita com anti-DNP ou anti-TNP-IgM, para formar conjugados decaméricos com uma valência de 10 para os sítios de ligação do receptor de FTC-beta.
Os análogos funcionais dos mutantes da fusão de R FTC-beta II:Fc que têm sítios de N-glicosilação inactivados podem ser produzidos por síntese dos oligonucleótidos e ligação ou por técnicas de mutagénese específicas dos sítios. Estas proteínas análogas podem ser produzidas numa forma homogénea, de hidratos de carbono reduzidos com um bom rendimento, utilizando sistemas de expressão de leveduras. Os sítios de N-glicosilação em proteínas eucarióticas são caracterizados pelo tripleto de aminoácidos Asn-Al-Z, em que Al representa qualquer amino-ácido excepto Pro e Z representa Ser ou Tre. Nesta sequência, Asn providencia um grupo amino de cadeia lateral para a ligação covalente de hidratos de carbono. Esse sítio pode ser eliminado substituindo outro aminoácido por Asn ou pelo resíduo Z, eliminando Asn ou Z ou inserindo um aminoácido diferente de Z entre A! e Z ou qualquer outro aminoácido diferente de Mil entre Asn e Al. Os derivados do receptor de FTC-beta podem também ser obtidos por mutações do receptor de FTC-beta ou das suas subunidades. Os análogos bioequivalentes das proteínas do receptor de FTC-beta podem ser ·.·< s;v:·.'r·.:idcv . por exemplo, fazendo várias substituições dos resíduos ou das sequências ou eliminando resíduos terminais ou internos ou sequências não necessárias para a actividade biológica.
Outros análogos incluem a proteína de R FTC-beta II:Fc ou os seus fragmentos activos sob o ponto de vista luldléglUod, cujas sequências diferem das SEQ ID N°s. 2 ou 4 por uma ou mais substituições conservadoras de aminoácidos ou por uma ou mais substituições não conservadoras de aminoácidos ou por eliminações ou inserções que não vão abolir a actividade biológica da proteína isolada. As substituições conservadoras incluem normalmente a substituição de um aminoácido por outro com caracteristicas semelhantes, tais como, substituições dentro dos seguintes grupos: valína, alanina e glicina; leucina e isoleucina; ácido aspártico e ácido glutâmico; asparagina e glutamina; serina e trionina; lisina e arginina; e fenilalanina e tirosina. Os aminoácidos hidrofóbicos não polares incluem alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina. Os aminoácidos neutros polares incluem glicina, serina, trionina, cisteína, tirosina, asparagina e glutamina. Os aminoácidos carregados positivamente (básicos) incluem arginina, lisina e his-tidina. Os aminoácidos carregados negativamente (ácidos) incluem ácido aspártico e ácido glutâmico. Outras substituições conservadoras são fáceis de se fazer pelos especialistas na matéria. Per exemplo, para o aminoácido alanina, uma substituição conservadora pode ser feita em um qualquer de D-alanina, glicina, beta-alanina, L-cisteina e D-cisteína. Para a lisina, uma substituição pode ser qualquer uma de 0-lisina, arginina, D-arginina, homo-argínina, metionina, D-metionina, ornitina ou D-crnitina.
Geralmente, as substituições que se pode esperar que induzam alterações nas propriedades funcionais dos polipéptidos isolados são aquelas em que: (i) um residuo polar, por exemplo, serina ou trionina, está substituido por um residuo hidrofóbico, por exemplo, leucina, isoleucina, fenilalanina ou alanina; (li) um residuo de cisteína está substituido por qualquer outro residuo; (iii) um residuo com uma cadeia lateral electropositiva, por exemplo, lisina, arginina ou histidina, está substituido por um resiàuo com, uma cadeia lateral electronegativa, por exemplo, ácido glutâmico ou ácido aspártico; ou (iv) um residuo com uma cadeia lateral volumosa, por exemplo, fenilalanina, está substituido por outro que não tenha cadeia lateral, por exemplo, glicina.
Também se descrevem moléculas isoladas que são: variantes alélicas, mutantes naturais, mutantes induzidos, proteínas codificadas pelo ADN que híbrida em condições de alta ou baixa severidade com um ácido nucleico que codifica um polipéptido, tal como, as SEQ ID N°s. 8 ou 9 e polipéptidos que se ligam especificamente aos péptidos por meio de anti-soros, especialmente por anti-soros a um sítio activo ou a um sítio de ligação. Todas as variantes aqui descritas é espectável que: (i) retenham a função biológica da proteína original. V. Utilizações A presente invenção tem por objecto composições e utilizações de composições para serem administradas a um indi-v-íduo com uma condição médica particular, numa quantidade suficiente de proteína de fusão do receptor de FTC-beta, tal como, R FSC-beta II:Fc, para reduzir a actividade de FTC-beta no indivíduo. A presente invenção ainda tem por objecto composições e utilizações das composições para libertarem R FTC-beta ll:Fc num sítio, em que FTC-beta não está em excessc, tal como, em estados de doença caracterizados por fibroproliferação e imunossupres-são, tal como, os estados associados a doenças infecciosas.
Embora não pretendendo estar ligado a qualquer teoria em particular, parece que R FTC-beta II:Fc regula « actividade de FTC-beta competindo com FTC-beta por meio de receptores da superfície das células. Crê-se ainda que inactiva FTC-beta por meio da sua eliminação de um conjunto livre de FTC-beta disponível para interagir com os receptores da superfície das células. Consoante as propriedades farmacológicas de clearance, o complexo de R FTC-beta II:Fc/FTC-beta é retirado do sítio de FTC-beta. Esta acção de complexação com um excesso de FTC-beta reduz a quantidade de FTC-beta livre. Com menos FTC-beta disponível para complexar com os receptores das células, a fibroproliferação induzida por FTC-beta diminui, resultando na estase do estado de doença. A administração das proteínas da presente invenção ou dos fragmentos da presente invenção pode ser feita em distúrbios fibroproliferativos. Tal como se mencionou antes, os modelos de glomerulonefrite em animais mostraram bons resultados com anticorpos anti-FTC-beta a bloquear o excesso de FTC-beta. Estes anticorpos são difíceis de libertar porque têm um elevado peso molecular e podem implicar severas reacções alérgicas quando derivam de outras espécies. Assim, seria preferível administrar uma proteína natural ou um seu análogo próximo com um peso molecular mais baixo, tal como, R FTC-beta II:Fc, no caso da glomerulonefrite. Os distúrbios dos rins associados com um excesso de FTC-beta incluem, mas não se limitam, a glomerulonefrite mesangial proliferativa, glomerulonefrite crescêntríca, nefropatia diabética., fibrose renal interstí- ciai, fibrose renal em pacientes que foram transplantados e receberam ciclosponna e nefropatia associada com VIH. Estas condições estão associadas com a sobre-produção da formação de tecido fibroso, que a administração de R FTC-beta II:Fc deverá suprimir.
Dado que não é conhecido que o R FTC-beta II por si só tenha um efeito colateral de captura de R FTC-beta II:Fc, pode ser administrado com segurança durante ou no fim da cirurgi . de colocação da retina, que é a causa mais comum de vitreoretinopatia proliferativa (VHP) (Connor et al. (1989) J. Clin. Invest. 83: 1661-1666). Outra condição importante fibroproliferativa ê a artrite reumatéide (AR) , que está também associada com um excesso de produção de FTC-beta. Os dados indicam que o bloqueio de FTC-beta em qualquer momento no desenvolvimento de estados crónicos de AR, pode ajudar a parar a deterioração progressiva das articulações e dos ossos. Por esta razão, as fusões da presente invenção podem ser administradas a pacientes com dores precoces das articulações e a pacientes com dores prolongadas de articulações e articulações deterioradas. A teoria actual é que a deterioração das articulações na AR é •a devida a uma sobre-produção de FTC-beta. 0 excesso de FTC-beta tem sido medido nas articulações após ensaios em animais que foram injectados com paredes de células estreptocócicas cuja presença se acredita que cause a artrite reumatóide (AR). Dado que o anticorpo anti-FTC-beta bloqueia as alterações artríticas neste modelo, crê-se que as fusões da presente invenção podem também ter um efeito positivo. Outras condições associadas com um excesso do nível de FTC-beta incluem a fibrose pulmonar idiopática e a míelofibrose. Para complexar com o excesso de FTC-beta e para diminuir c desenvolvimento do excessc de tecido fibroso, as proteínas da presente invenção podem ser administradas nestas condições.
As proteínas da presente invenção podem ser utilizadas para tratar distúrbios vasculares do colagénio que estão associados com a sobre-produção ae t?*« Acredita-se hoje em dia que há uma sobre-produção de FTC-beta nos distúrbios vasculares do colagénio, tal como, na esclerose sistémica progressiva (ESP) , polimiosite, escleroderma, dermatomiosite, fascite eosinofílica e morfea. Os distúrbios vasculares do colagénio podem também estar associados com a ocorrência do síndroma de Raynaud. Entre outros efeitos, a sobre-produção de FTC-beta pode estar também envolvida na fibrose pulmonar intersticial e no distúrbio dos pulmões no último estado, que está associado com distúrbios auto-imunes, tais como, o lúpus eritematoso sistémico (LES) e escleroderma (Deguchi, (1992) Ann. Rheum. Dis. 51: 362-65); ou podem ser causados por contactos com químicos, alergias ao pó e febre dos fenos. Uma quantidade efectiva sob o ponto de vista terapêutico das proteínas da presente invenção pode ser administrada para neutralizar a actividade biológica de FTC-beta que, por sua vez, irá prevenir fibrose não desejada.
As proteínas da presente invenção podem também ser utilizadas na prevenção da sobre-produção de escaras em pacientes que são conhecidos por formarem colóides ou escaras hipertróficas. For exemplo, pode-se administrar R FTC-beta II:Fc para prevenir escaras ou a produção de escaras durante a cura de feridas em vários tipos de feridas, incluindo incisões cirúrgicas e lacerações traumáticas. A fusão de R FTC-beta II.-Fc pode ser aplicada a feridas da pele antes que elas fechem para ajudar a que sarem antes de formar escaras. As proteínas da presente invenção podem ser colocadas em feridas cirúrgicas abdominais para prevenir a formação de adesões que ocorrem cambem muito vulgarmente depois desse tipo de cirurgia. A presente invenção permite uma administração local de fusão suficiente para complexar com a sobre-produção de FTC-beta e prevenir a sobre-produção de processos de cura. 0 excesso de FTC-beta também tem sido referido em polipose nasal, uma condição caracterizada por pólipos múltiplos (Ohno et al. (1992) J. Clin. Invest. 89: 1662-68). As proteínas de fusão podem ajudar a baixar os níveis de FTC-beta e diminuir a hiperproliferação que resulta em pólipos. Por exemplo, pode-se administrar R FTC-beta II:Fc após uma cirurgia aos pólipos para prevenir a sobre-produção de escaras e a recorrência de pólipos e pode ser administrada para inibir a formação de pólipos no intestino.
As proteínas da presente invenção podem também ser administradas no seguimento de angioplastia coronária, colocando-as preferencialmente ao longo do interior das artérias afectadas. De acordo com Karas et al., ((1991) Clin. Cardiol. 14: 791-801) a restenose ou a formação de escaras e o fecho das artérias no seguimento de angioplastia coronária é visto em aproximadamente um terço dos pacientes operados. Dado que a rede fibrosa que, em última análise, se desenvolve numa escara normalmente acumula-se rapidamente, a administração precoce, por exemplo, de R FTC-beta II:Fc irá reduzir o excesso de FTC-beta nesta área e diminuir a proliferação excessiva de tecido c;::.ívuAT.tvo e a restenose.
Também se tem observado um excesso de FTC-beta em fibrose cardíaca após enfarte e na vasculopatia hiperten- siva. Para ajudar numa cura apropriada, sem excesso de escaras ou de formação de tecido fibroso, pode-se administrar nestas condições as proteínas da presente invenção. Também tem sido observado o excesso de FTC-beta nos tecidos de pacientes íbx; recebem terapia de radiação. Esse tecido é caracterizado pelo desenvolvimento excessivo de tecido conjuntivo, espessamento epitelial e oclusão dos vasos sanguíneos associadas com um sobrecrescimento das células endoteliais. A administração de R FTC-beta II:Fc irá complexar com o excesso de FTC-beta e irá contribuir para a cura da ferida sem fibrose excessiva. VI. Formulação, Administração e Dosagem A formulação, o processo de administração e a dosagem das proteínas da presente invenção, irá depender do distúrbio a ser tratado e da história clínica do paciente. Estes factores podem determinar-se facilmente durante a terapia. Os pacientes apropriados com condições causadas por um excesso de FTC-beta podem ser identificados por ensaios laboratoriais, história clínica e verificações físicas. 0 excesso de FTC-beta pode ser determinado directamente ou por imuno-ensaio do soro dos pacientes ou de um tecido afectado. 0 excesso de FTC-beta pode também ser determinado por bioensaios, tal como, o ensaio de proliferação de células descrito em Kekow et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 87: 8321-25. O excesso de FTC-beta pode também ser determinado indirectamente medindo o nível de ARNm de FTC-beta (por exemplo, na reacção em cadeia de polimerase de Kekow et al.). A história clínica pode reveiar factos que suportam um diagnóstico de distúrbio fibroproliferativo, distúrbio «.iSAcuIar do colagénio, imunossupressão ou um potencial para uma cicatrização problemática ae feridas, tal como, nas adesões peritoniais que se seguem à cirurgia ou restenose de vasos sanguíneos após angioplastia coronária. As condições que estão identificadas como estando associadas com níveis eleva-dos de FTC-beta e/ou proliferação de tecido fibroso, são consideradas como causadoras do excesso de FIC-beta. Os pacientes podem ter um largo espectro de indicações físicas, que são indicativas destes distúrbios. Têm-se utilizado biopsias da pele para analisar FTC-beta em pacientes com esclerose sistémica. Nas artrites verificam-se inchaços e articulações quentes. De acordo com as utilizações das composições no processo da presente invenção, a formulação compreende as proteínas da presente invenção sob uma forma administrável. As utilizações das composições no processo da presente invenção providenciam formulações das proteínas da presente invenção sob modos que são facilmente evidentes para os especialistas nesta técnica. Preferencialmente, as proteínas da presente invenção estão dissolvidas em veículos compatíveis sob o ponto de vista fisiológico.
Os veículos compatíveis sob o ponto de vista fisiológico para as proteínas da presente invenção incluem soluções intravenosas, tais como, soluções salinas normais, albumina do soro, dextrose a 5 %, preparações de plasma, soluções contendo outras proteínas e soluções de TPN. 0 veículo preferido para administração parentérica é uma solução aquosa isotónica, esterilizada, tal como, uma solução salina ou dextrose a 5 %. Ainda mais preferido, ê uma solução salina normal com albumina de soro humano. Para utilização das proteínas da presente invenção no reforço da resposta imunitária a vacinas, elas pdúem sei misturadas com uma formulação de vacina.
Consoante o modo de administração, as proteínas da presente invenção podem estar sob a forma de preparações líquidas ou em dosagens semi-sólidas, tais como, por exemplo, líquidos, suspensões ou similares. Alternativamente, pode colocar-se uma solução num implante, tal como, uma bomba osmótica, para a libertação lenta durante um período de tempo prolongado. Alternativamente, as proteínas da presente invenção podem ser dadas em formulações de veículos de libertação sustentada, tais como, veículos poliméricos semipermeáveis sob a forma de supositórios ou microcápsulas. Ver, por exemplo, a patente de invenção norte-americana U.S. 3.773.919 para matrizes microcapsulares de libertação sustentada incluindo polilactídios; Sidmon et al., Biopolymers 22 (1), 547-556 (1983) para copolímeros de ácido L-glutâmico e L-glutamato de gama-etilo; Langer et al., J. Biomed. Res. 15, 167-277 (1981) para poli-(2-hidroxietilmetacrilato) ou similares. 0 modo de administração liberta proteínas da presente invenção em indivíduos de uma forma segura e eficaz sob o ponto de vista fisiológico. As proteínas da presente invenção podem ser dadas por vias de administração intraocular, intranasal, subcutânea, intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitonial, intra-articular, entérica ou outras vias de administração convencionais. Num enquadramento preferido, as proteínas da presente invenção são administradas localmente nos sítios do tecido afectado por meio de bolus de injecção ou de perfusão. Por exemplo, para VRP, o modo de administração preferido á uma única injecção intraocular. A administração local é também preferida nas feridas peritoníaís para evitar a formação de adesões e noutras feridas para encorajar a cicacrização sem colóides ou escaras visíveis. Para a polípose nasal, preferem-se gotas nasais. As administrações locais e sistémicas são igualmente preferidas em fibrose do pulmão (injecção parentéríca ou aerossol nasal ou gotas) . A artrite reumatóíde (AR! pode ser tratada por administração intra-articular ou sistémica. A administração sistémica é o modo de administração preferido na glomerulonefrite e em distúrbios da pele muito difusos (tais como, esclerose sistémica progressiva, fascite difusa e morfea generalizada) . A administração sistémica também é preferível quando se utilizam as proteínas da presente invenção para reforçar a resposta a vacinas, sendo as proteínas da presente invenção administradas com a vacina por injecção subcutânea, intramuscular ou intradérmica. A dose de proteínas da presente invenção a ser administrada, pode ser facilmente determinada pelos especialistas nesta técnica, com base nos sintomas usuais dos pacientes discutidos antes. A dosagem de proteínas da presente invenção a ser dadas numa injecção é preferível que esteja entre 20 ng e 300 mg. A injecção em bolus pode ser repetida durante vários dias ou as proteínas da presente invenção podem ser infundidas de uma forma contínua. Se são dadas sob a forma de infusão intravenosa, a quantidade de proteínas da presente invenção a ser infundida, ao longo de um período de 24 horas, é de cerca de 1 mg até cerra de 100 mg. sub-normal ou a cerca A quantidade de proteínas da presente invenção a administrar pode ser determinada mantendo a concentração de FTC-beta ao tecido local a um mv«!
Preferencialmente, as proteínas da presente invenção aplicam-se topicamente, injectadas no sítio do problema ou injectadas intravenosamente. Mais preferencialmente, as proteínas da presente invenção são administradas por injecção em bolus no sítio em que tem de ser controlado. For Injecção intravenosa, as proteínas da presente invenção devem ser administradas a utt, taxa tal que mantenham uma concentração no soro em circulação suficiente para reduzir o excesso de FTC-beta.
Preferencialmente, o paciente começa com uma dose de proteínas da presente invenção relativamente baixa. A dose baixa deve continuar, preferencialmente, até que a fase aguda do paciente tenha melhorado ou tenha tido melhoras adequadas, conforme indicado por verificações físicas apropriadas e resultados laboratoriais. Essa melhoria pode ser evidente num prazo de duas a três semanas. Na ausência de melhorias significativas, a dose de proteínas da presente invenção deve ser aumentada.
Os processos de terapia de genes de administração de moléculas da presente invenção estão também englobados no âmbito da presente invenção. O termo "transformação" refere-se a qualquer modificação genética das células e inclui tanto a "transfecção" como a "transdução". Tal como se utiliza aqui, "transfecção de células" refere-se à aquisição por uma célula, de um novo material genético por incorporação de mais ADN. Assim, a transfecção refere-se à inserção de ácido nucleico (por exemplo, ADN) numa célula utilizando processos físicos ou químicos. As várias técnicas de transfecção são conheciãas pelos especialistas na matéria. Pelo contrário, a "trans-dução de células" refere-se ao processo de transferência de âeido nucleico para dentro de imz. célula, utilizando um vírus de ADN ou de
ARN . Pode-se incorporar uma ou mais sequências isoladas de polinucleótidos, codificando uma ou mais proteínas de R FTC-beta II:Fc contidas dentro do vírus, no cromossoma da célula transduzida. Alternativa-mente, a célula é transduzida com um vírus mas a célula não terá incorporado o polinucleótido isolado nos seus cromossomas, mas será capaz de expressar extracromosso-micamente o interferão dentro da célula. De acordo com um enquadramento, as células são transformadas (isto é, geneticamente modificadas) ex vivo. As células são isoladas de um mamífero (preferencialmente, um ser humano) e transformadas (isto é, transduzidas ou transfectadas in vitro) com um vector contendo um polinucleótido isolado, tal como, um nucleótido de R FTC-beta ll:Fc ligado operacionalmente a uma ou mais sequências de controlo de expressão para expressar uma proteína recombinante segregada. As células são então administradas a um receptor mamífero para libertação da proteína in si tu. Preferencialmente, o receptor mamífero é um ser humano e as células a serem modificadas são células autólogas, isto é, as células são isoladas do receptor mamífero. 0 isolamento e a cultura das células in vitro, já foram referenciados. De acordo com outro enquadramento, as células são transformadas ou de alguma forma modificadas geneticamente in vivo. As células do receptor mamífero (preferen-cialmente, um ser humano), são transformadas (isto é, transduzidas ou transfectadas) in vivo com um vector, contendo o polinucleótido isolado similar e a proteína é libertada in sítu.
Os polinucleótidos isolados que codificam a proteína de fusão são nt r-xt: v; âoc na célula ex vivo ou in vivo por processos genéticos de transferência, tais como, transfecção ou ·:. r&n&áuçlU:·; para originar uma célula geneticamente Os vá:;Loe vebtcrssv: de expressão (isto é, veículos para facilitar a libertação do polinucleótido isolado na célula alvo) são conhecidos pelos especialistas nesta técnica. Normalmente, o material introduzido inclui um polinucleótido isolado da presente invenção em conjunto com um promotor para controlar a transcrição. Se a libertação do polinucleótido de R LTC-Beta II:Fc se destina a tecidos específicos, pode ser desejável atingir a expressão deste gene. Por exemplo, M muitos promotores descritos na literatura que são apenas expressos nalguns tecidos. Assim, seleccicnando o promotor apropriado (constitutivo versus indutível; forte versus fraco), é possível controlar tanto a existência como o nível de expressão de uma proteína de fusão na célula geneticamente modificada. Se o gene que codifica proteína de fusão está sob o controlo de um promotor indutível, a libertação da proteína in situ é activada pela exposição da célula geneticamente modificada, in sítu, a condições que permitam a transcrição da proteína, por exemplo, por injecção dos indutores específicos dos promotores indutíveis que controlam a transcrição do agente. Recentemente, desenvolveram-se sistemas muito sofisticados que permitem uma regulação precisa da expressão de genes por meio de moléculas pequenas administradas exogenamente. Esses sistemas incluem o sistema de FKI7 6/ rapa mi c $. nu (Rivera et al., Nature Medicine 2 (9): 1028-1032, 1996); o sistema de tetraciclina (Gossen et al., Science 268: 1766-1768, 1995), 1995), o sistema de ecdisona (No et al., Proc. Nat. Acad. Sei., USA 93: 3346-3351, 1996) e o sistema de progesterona (Wang et al., Nature Biotechnology 15: 239-243, 1957).
De acordo com isto, a quantidade de proteína de fusão guíí 8 libertada in situ é regulada pelo controlo de factores, tais como, íij a natureza do promotor utilizado oaru dirigir a transcrição do polinucleótido inserido (isto é, se o promotor é constitutivo ou indutível, forte ou fraco ou se se trata de tecido especifico); (2) o número de cópias do polinucleótido exógeno que está inserido na célula; (3) o número de células transduzidas/transfectadas que são administradas (por exemplo, implantadas, feitas no paciente) ; (4) a ditsíutslo do implante (por exemplo, enxerto ou sistema de expressão encapsulado) em processos ex vivo; (5) um número de implântes em processos ex vivo; (6) c número de células transduzidas/transfectadas por administração in vivo; (7) o tempo que dura a que as células transduzidas/transfectadas ou os implantes sejam deixados no lugar tanto em processos ex vivo como in vivo; e (8) a taxa de produção da proteína de fusão pela célula geneticamente modificada.
Os vectores de expressão compatíveis com as células hospedeiras de mamíferos para serem utilizadas na terapia de genes incluem, por exemplo, plasmidos, vectores retrovirais de aves, de murinos e de seres humanos, vectores de adenovírus; vectores virais de herpes; parvovírus; e poxvírus não replicativcs. Em particular, a replicação recombinante defeituosa de vírus pode ser gerada em linhas de células em pacote, que produzem apenas vírus com replicação defeituosa. Ver, Current Protocols in Molecular Biology: Sections 9, 10-9, 14 (Ausubel et al., eds.), Greene Publishing Associates, 1989. Vectores virais específicos para serem utilizados nos sistemas de transferência de genes estão bem estabelecidos, ¥br, por exemplo, Madzak et al., J. Gen. Virol., 73: 1533-36 (1992) (papovavírus SV4 0) ; Berkner et al. , Curr. Top. Microbíoi. Immunol., 158: 39-61 (1992) (adenovírus); Mcss et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158: 25-38 (1932) (vírus de vacinia) ; Muzyczka, Curr. Túp, Microbiol. Immunol., 158: 97-123 (1992) (vírus adeno-associados); Margulskee, Curr.
Top. Microbiol. Immunol., 158: 67-93 (1992) (virus do herpes simplex (VHS) e vírus de Epstein-Barr (VHB)); Miller, Curr. Sop. Microbiol. Immunol-, 158: 1-24 (1992) (retrovírus) ; Brandyopadhyay et *·).., Mói. Cell. Biol., 4: 749-754 (1984) (retrovírus); Miller et al. , Nature, 357: 455-450 (1992) (retrovírus); Anderson, Science, 256: 808-813 (1992) (retrovírus). 3s vectores preferidos são os vírus de ADN que incluem adenovírus (preferencialmente, vectores à base de Ad-2 ou Ad-5), vírus do herpes (preferencialmente, vectores à base do virus do herpes simplex) e parvovírus (preferencialmente, vectores à base de parvovírus "defeituosos" ou não autónomos, mais preferencialmente, vectores à base de vírus adeno-associados, mais preferencialmente, vectores à base de VAA-2). Ver, por exemplo, Ali et al., Gene Therapy 1: 36384, 1994; patentes de invenção norte-americanas U.S. 4.797.368 e 5.399.346 e discussão que se segue.
Os vírus adeno-associados (VAA) também têm sido utilizados como vectores para a terapia somática de genes. 0 VAA é um virus pequeno, com ADN de hélice simples (HS), com uma organização genómica simples (4,7 kb) , que o torna um substrato ideal para a engenharia genética. Os dois quadros de leitura aberta codificam uma série de polipéptidos rep e cap. Os polipêptidos rep (rep78, rep68, rep62 e repéO) estão envolvidos na replícação, resgate e integração do genoma de VAA. As proteínas cap (VP1, VP2 e VP3) provêm da cápside do virião. A flanquear os quadres de leitura aberta de rep e cap nas extremidades 5' e 3' estão 145 repetições de pb de terminal invertido (RTIs), as primeiras 1VA pb de cada um são capazes de formar estruturas em duplex em forma de Y ou de T. Da maior importância para o desenvolvimento dos yt criares de VAA, os feiSÍAioÀS completos de rep e cap podem ser excísados e substituídos com um transgene terapêutico ou repórter. Ver, B. J. Cárter, in Handbook of Parvoviruses, ed., P. Tijsser, CRC Press, pp. 155-168 (1990). Tem sido demonstrado que as RTIs representam a sequência mínima necessária para a replicação, resgate, empacotamento e integração do genoma de VAA. 0 cicio de v-lSs de VAA é bifãsico, composto por episódios latentes e líticos. Durante uma infecção latente, os viriões de VAA entram numa célula sob a forma de um ADNhs encapsidado e, pouco tempo depois, são libertados para o núcleo onde o ADN de VAA se integra estavelmente num cromossoma hospedeiro sem a necessidade aparente da divisão das células hospedeiras. Na ausência de um vírus auxiliar, o genoma de VAA integrado permanece latente mas capaz de ser activado e resgatado. A fase lítica do ciclo de vida começa quando uma célula que comporta um provirus de VAA é estimulada com uma infecção secundária por um vírus do herpes ou um adenovírus, que codificam funções mais auxiliares que são necessárias para que o VAA ajude na sua excisão da cromatina hospedeira (B. J. Cárter, supra). O ACN de estrutura helicoidal simples (hs) da infecção parental expande-se para os ADNs da forma de replicação (FR) em duplex de uma maneira dependente de rep. Os genomas de VAA resgatados são empilhados em cápsides de proteínas pré-formadas (simetria icosaédrica com aproximadamente com 20 nm de diâmetro) e libertados como viriões infecciosos, que comportam empilhados quer genomas de ADNhs + ou -, seguindo a lise das células. Os VAA têm um potencial significativo na terapia dos genes. As partículas virais são muito estáveis e os VAAA recombinantes (VAAri têtó características "semelhantes a fãrmacos", em que vAAr pode ser purificado por aglomeração ou por associação em gradiente. São eetêYéís ao calor e podem ser liofílízados para formarem um pó e serem re-hidratados com uma actividade completa. O seu AOn integra-se estavelmente nos cromossomas hospedeiros para uma expressão a longo prazo. A sua gama de hospedeiros é vasta e o VAA não causa doenças conhecidas de modo que os vectores recombinantes não são tóxicos. Recentemente, c baculovirus recombinante, derivado primeiramente do baculovirus, vírus de poli-hedrose de múltiplos núcleos de Autographa cal í forni ca ivpmmr} , tem mostrado ser capaz de transduzir células de mamífero in vitro. (Ver, Hofmann, C., Sandig, V., Jennings, G. , Rudolph, M., Schlag, P., and Strauss, M. (1995), "Efficient gene transfer into human hepatocytes by baculovirus vectors", Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92, 10099-10103;
Boyce, F.M. and Bucher, N.L.R. (1996) "Baculovirus-mediated gene transfer into mammalian cells", Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93, 2348-2352) . Os baculovirus recombinantes têm várias vantagens potenciais para a terapia de genes. Estas vantagens incluem uma grande capacidade de inserção de ADN, uma falta de uma resposta imunitária pré-existente em seres humanos, a falta de replicação em mamíferos, uma falta de toxicidade para os mamíferos, uma falta de expressão de genes virais em células de mamíferos devido à especificidade para insectos dos promotores transcricionais do baculovirus e, potencialmente, uma falta de resposta citotóxica dos linfócitos T dirigida contra estas proteínas virais. A presente invenção será ilustrada pelos exemplos não limitativos que se seguem.
Exemplo 1: Construção e Expressão da Proteína de Fusão Solúvel de R FTC-beta:Fc de Coelho
Iscla-se um clone de comprimento completo (MIS.~.3fíl) codificando o receptor de FTC-beta ("ΡΤΓ.β") do tipe II de coelho, <§ isolado de uma biblioteca de ADNc de ovário de coelho conforme descrito ídi Clemente et al., Most. Endocri:í'.í®|.8: 1006 [1994]). o gene de fusão de R FTC-beta II:Fc recombinante de coelho, consistindo no domínio extracelular do receptor de tipo II de coelho (nucleótidos 832-1.311 da SEQ ID N°. i:' fundido com a porção Fc de IgGl humana (nucleótidos 1.312-1.955 da SEQ ID N°. 2), constrói-se como se segue:
Fragmento i) Um fragmento de 479 pb, contendo o domínio extracelular do receptor de FTC-beta de tipo II de coelho, é amplificado a partir do clone MIS„..3fll, por RCP convencional, utilizando os iniciadores de oligonucleótidos apropriados (SEQ ID Nt 5 e SEQ ID N°. 6). Estes oligonucleótidos conferem sítios de enzimas de restrição de Notl e Sall de flanqueio no produto resultante de RCP, que é em seguida digerido com estas duas enzimas de restrição.
Fragmento 2) pSAB132 (Miller et al., J. Exp. Med. 178: 211 [1993]) é digerido com a enzima de restrição Notl e os grupos fosfato terminais são eliminados por digestão com fosfatase intestinal alcalina de bezerro.
Fragmento 3) Constrói-se pSAB144. Isola-se a região charneira contendo a região constante da cadeia pesada (L) da IgGl humana, as sequências CH2 e CH3, com iniciadores específicos da cadeia P por amplificação por RCP do ADN a partir do ARN das células COS-7 que *, ciímm sido transfectadas com plasmido contendo inserções genómicas de 3 pares de quilobases {Miller et al., J. Exp. Med. 178: 211 [1993]). Os iniciadores específicos das cadeias pesadas são concebidos de t«I maneira que resultem as sequências de CH2 e CH3 de IgGl amplificadas por RCP, flanqueadas por sítios de reconhecimento de enzimas de restrição Sall em 5' e Notl em 3'. pSAB144 é digerido com as enzimas de restrição Notl e Sall para libertar um fragmento de 700 pares de bases contendo a porção Fc da IgGl humana.
Os fragmentes 1, 2 e 3 são ligados e transformados em bactérias capazes de transformação. Recuperam-se cs plasmidos a partir dos transformantes e analisa-se por digestões de enzima de restrição e electroforese em gel para saber a orientação correcta dos fragmentos unidos. Esta estrutura compreende o gene de fusão recombinante de R FTC-beta II:Fc de coelho e toda a sequência de codificação é confirmada pela sequenciação do ADN (SEQ ID N°s. 1 e 2). O gene de fusão recombinante de R FTC-beta II:Fc de coelho é transfectado em células de ovário de hamster chinês (OHC) por electroporação a 280 volts. Depois da transfecção inicial, seleccionam-se as células para a expressão de di-hidrofolato-redutase (DKFR) por sub-culturas em meio selectivo sem glicina, hipoxantina e timidina. As colónias resultantes são então transferidas para placas com 24 orifícios e analisadas quanto à expressão dos genes de fusão de R FTC-beta :Fc de coelho. As culturas com a expressão mais elevada são submetidas a amplificação por exposição a quantidades crescentes de metotrexato. As células capazes de crescer em metotrexato 25 nM são clonados por diluição limitativa em placas com 96 orifícios. Os clones com a expressão mais altâ são transferidos para uma cultura em suspensão e os clones que expressam os aÍ¥#1:íí mais elevados de R FTC-beta il:Fc são seleccionados para produzirem R FTC-beta II:Fc.
Os especialistas na técnica podem construir e expressar um gene recombinante similar contendo o dominio extracelular do receptor de FTC-beta de tipo II humano isolando o gene receptor de FTC-beta de tipo II humano a partir de ADNc de ovário humano disponível comercialmente (Clontech) e substituindo o iniciadcr de oligonucieótidos descrito na SEQ ID N°. 7 pelo iniciador de oligonucieótidos descrito na SEQ ID N°, 6. A. sequência de ADN do gene de fusão humano de R FTC-beta :Fc está- descrita (SEQID N°. 3 e SEQ ID N°. 4).
Exemplo 2: Ά Proteína de Fusão de R FTC-beta : Fc Liga-se a FTC-beta In Vitro 0 gene de fusão de R FTC-beta :Fc recombinante, de coelho (SEQ ID N° . 2 contida dentro da SEQ ID b':' 1 do vector de expressão) é transfectado em células COS por electroporação a 280 volts. As células transfectadas crescem em DMEM, complementado com soro bovino fetal a 10 %. Passados 5 dias, as células são retiradas da cultura por centrifugação e avalia-se o sobrenadante quanto à expressão de R FTC-beta II:Fc recombinante de coelho, por electroforese em gel de SDS/políacrilamida (SDS/PAGE). O R FTC-beta II:Fc presente no sobrenadânte da cultura de células é analisado quanto à sua capacidade para ligar FTC-beta. (NEN Life Science Products), faz-se a sua incubação durante 2,5 horas com um meio de cultura de células ( contendo R FTC-beta II:Fc de coelho ou controlo de IgG e proteína A-sefarose que se liga à porção Fc de IgG. Os complexos de proteína A:Fc resultantes são recuperados por centrifugação, lavados em solução saiina tamponada com fosfato e analisados por ' e autoradiografados . C S FTC-beta II :Fc imunoprecipita j -FTC-beta mas o mesmo não acontece com o controlo de IgG.
Exemplo 3: Ensaio de Proliferação de Células de Pulmão de Marta A proliferação de células epiteliais de pulmão de marta (CCL64) é inibida por FSC-beta 1, Assim, pode-se verificar a capacidade de R FTC-beta t¥c. para bloquear o efeito anti-proliferativo de FTC-beta 1. As células CCL64 são mantidas em MEM complementado com 100 unidades/mL de penicilina, 100 ag/mh de estreptomicina e soro bovino fetal a 10 %. Para o ensaio, faz-se a incubação de uma série de diluições de R FTC-beta :Fc com 0,1 ng/mL de FTC-beta 1, durante 1 hora, num meio de ensaio (MEM complementado com 100 unidades/mL de penicilina, 100 }i§/wL de estreptomicina e soro bovino fetal a 10 %) numa placa microtituladora de cultura de tecido de 95 orifícios. As células CCL64 são novamente suspensas em meio de ensaio e adiciona-se à placa de ensaio, numa concentração de 4.000 células por cavidade. As células são incubadas a 37 °C, durante 72 horas e submetidas a impulsos com |4'H] -timidina (70-86 Ci/mmole) durante mais 4 horas. A síntese de ADN, que reflecte a proliferação das células, é determinada medindo a incorporação de rsHj-timidina. Quando as células começam a proliferar apenas num meio, mede-se a quantidade de ["Mj -timidina incorporada a 188.745 contagens por minuto (CPM). Quando FTC-beta 1 está incluído no meio, a proliferação fica inibida e mede-se a quantidade de -timidina inrorporada a 49.088 contagens por minuto. A seguir, mostram-se os resultados quando se aumentam as quantidades de R FTC-beta :Fc ou IgG de controlo, que são adicionados ao meio:
Concen. R FTC-beta II:Fc IgG de Controlo ^g/r-iL (OPM) (CPM) ·>; ·?*: - 53.619 173,4X1 55.097 _ A; 1H,770 S4043 ;:i. ft . -f··" i 3., 443 S, i i Xis,ISs SS,si3 A Á « í --· *·· XXS,íXl3 52,415 δ;? M is.m S.. Si Si:341 SI,ifi 44 U 4 $, Si: 4 i4< 33:S S í Q 4 2 , SB A quantidade de R FTC-beta II:Fc necessária para inibir o efeito anti-proliferativo de 0,1 ng/mL de FTC-beta por equivalentes de 50 %, equivale a 0,5
Exemplo 4: Modelo de Traumas em Vasos de Ratos
Utilizaram-se ratos Sprague-Dawley machos, pesando 400 g e com cerca de 3-4 meses de idade (Bantin & Kingman, Edwards, WA) . Todos os processos cirúrgicos foram realizados com anestesia geral por injecção intraperitonial de xilazina (2,2 mg/kg, AnaSed TM, Lloyd Laboratories, Shenandoah, IA) e cetamina (540 mg/kg, Ketaset TM, Aveco Co., Fort Dodge, IA). A artéria carótida comum esquerda foi exposta com um cateter de balão de 2F, introduzindo o cateter através da artéria carótida externa. A carótida comum esquerda distai e as artérias carótidas externas, foram expostas através de uma incisão na linha média do pescoço. Fez-se passar o cateter três vezes com um balão suficientemente distendido com uma ggrúçfe salina para gerar uma ligeira resistência. Este processo produz uma
151 GTGGAGTATT TACGGTAAAC TGCCCACTTG GCAGTACATC AAGTGTATCA 201 TATGCCAAGT ACGCCCCCTA TTGACGTCAA TGACGGTAAA TGGCCCGCCT 251 GGCATTATGC COlGTACArG ASTTTCCTAC TTGGCAGTAC 301 ATCTACGTAT TAGTCATCGC TATTACCATG GTGATGCGGT TTTGGCAGTA 351 CGTGGATAGC GGTTTGACIC ACGGGGATTT CCAAGTCTCC 401 ,·. ;A ^GTGA^TGGG s™. AG .L Gilí x J. AGTTTGTTTT 451 TTTCCAAAAT GTCGTAACAA CTCCGCCCCA •cl· :íacía:aaa TGGGCGGTAG 501 GCGTGTACGG TGGGAGGTCT ATATAAGCAG AGCTCGTTTA C-TGAACCGTC 551 AGATCGCCTG GAGACGCCAT CCACGCTGTT TTGACCTCCA TAGAAGACAC 6C1 CGGGACCGAT CCAGCCTCCG GACTCTAGAG GATCCGGTAC TCGAGGAACT 651 GAAAAACCAG AAAGTTAACT GGTAAGTTTA GTCTTTTTGT CTTTTATTTC 701 AGGTCCCGGA TCCGGTGGTG GTGCAAATCA AAGAACTGCT CCI'CAGTGGA 751 TGTTGCCTTT ACTTCTAGGC CTGTACGGAA GTGTTACTTC TGCTCTAAAA 801 GCTGGGGAAT TGTACCCGCG GCCGCTCTGC CATGGGTCGG GGGCTGCTCC 851 GGGGCCTGTG GCCGCTGCAC CTCGTCCTGT GGACGCGCAT CGCCAGCACG 901 ACCCCGCCGC ACGTTCAGAA GTCGGTTAAT AACGACATGA TGGTCACGGA 951 CAACAATGGC GCCGTCAAGT TCCCACAACT GTGCAAGTTT TGCGATGTGC 1001 GATCTTCCAC CTGTGACAAC CAGAAGTCCT GCATGAGCAA CTGCAGCATC 1051 ACGTCCATCT GTGAGAAGGC ACACGAAGTC TGCGTGGCCG TCTGGAGGAA 1101 GAACGATGAA AACATAACCC SGGAGACTGT GTGTCACGAC CCCAAGCTCG 1151 CCTACCATGG ATTCCTTGTG GAAGATTCTG CCTCTCCAAA GTGTATCATG 1201 AAAGAAAAGA AGGTGTTTGG GGAGACTTTC TTCATGTGTT CCTGGAGCAC 1251 TGACGAGTGC AATGACGACA TCATCTTCTC TGAGGAATAC ACCACCAGCA 1301 GTCCGGATCT GGTCGACAAA ACTCACACAT GCCCACCGTG CCCAGCACCT 1351 GAACTCCTGG GGGGACCGTC AGTCTTCCTC TTCCCCCCAA AACCCAAGGA 1401 CACCCTCATG ATCTCCCGGA CCCCTGAGGT CACATGCGTG GTGGTGGACG 1451 TGAGCCACGA AGACCCTGAG GTCAAGTTCA ACTGGTACGT GGACGGCGTG 1501 GAGGTGCATA ATGCCAAGAC AAAGCCGCGG GAGGAGCAGT ACAACAGCAC 1551 GTACCGTGTG GTCAGCGTCC TCACCGTCCT GCACCAGGAC TGGCTGAATG 1601 GâMCkIaOIA. CAAGTGIAÂG GTCTCCAACA AAGCCCTCCC AGCCCCCATC 1651 GAGAAA1CCA iiiiiiiAAiii:: ia1:AC7ai::ai CACAGGTGTA 1701 CACCCTGCCC CCATGCCGGG ATGAGCTGAC GTCAGCCTGA 1751 CCTuCCTGta i TATCCCAGCG ACATCGCCTT GGAGTGGGAG 1101 ;NV. ,·:ν: a ·:. \ ;···.;;···.. ·:·: .·· ····.······'.· :· /·····.- ’·. CAÂ:17 Α1ΆΛΪ ACCACGCCTC CCGTGTTGGA distensão da própria, carótida, liga-se a carótida esquerda até à retirada do cateter e fecha-se a incisão.
Os tratamentos experimentais incluíram uma série de injecções intravenosas de 1 mL do receptor de FTC-beta do tipo 11:Fc (SEQ id N°. 8) em SBF dado em cada um dos dias após a operação a 5 mg/kg. Passados 14 dias desde a exposição do cateter de balão, anestesiaram-se todos os ratos e fixaran-se as artérias carótidas por perfusão, a uma pressão de 120 mm Hg com paraformaldeido a l % e glutaraldeido a 1,25 %, no seio de tampão de fosfato 0,1 M, a pH 7,4, por via de uma cânula grande colocada de forma retrógrada na aorta abdominal. Dez minutos antes da fixação, deu-se a estes animais uma injecção intravenosa de azul de Evans (0,3 mL em solução salina a 5 %). Passados 5 minutos da perfusão, as artérias carótidas comuns esquerda e direita foram repostas, incluindo o arco aórtico. Depois, estes vasos sanguíneos foram fixados por emersão no mesmo fixador que se utilizou para a perfusão.
Fez-se a análise de segmentos da artéria para pesquisar a presença ou a ausência de endotélio obtendo-se três fragmentos da artéria carótida esquerda exposta, corada de azul e embebendo-os em parafina para um seccionamento transversal, utilizando um micro-torno "Micron". Para medir as áreas mais íntimas, obtiveram-se f otonicrográf icos de 3-4 secções de cada aasimil. Os fotomicrográfícos foram digitalízados e analisados com um software de análise de imagens (NIH Image 1.55 for
Macintosh) . Mediram- -se as áreas intimais por determinação da área entre o lúmen e a lâmina elástica interna. Determinaram-se as áreas médias medindo a área entre a lâmina elástica interna e externa. A relação entre as áreas íntíma/médía foi calculada a partir destas medições.
Efeito de R FTC-beta II:Fc (SEQ ID N°. 8) na restenose no modelo de ratos.
Quadro 1: Área da íntima (mm2)
Tratamento Área Média Desv. Fadrão Erro Padrão
Controlo (n=4) 0,15
Experimental: 0,068 0,015 0,016 0,008 0, 007 5 mg/kg/dose 35 mg/kg por ciclc de terapia (n=5)
Um teste T desemparelhado entre tratamentos, resultou num p = 0, 0001 significativo sob o ponto de vista estatístico.
Quadro 2: Relação entre as Áreas Íntima/Média
Tratamento Área Média Desv. Padrão Erro Padrão
Controlo (n=4) 0,706 0,03 0,015
Experimental: 0,360 0,137 0, 06 1 5 mg/kg/dose 35 mg/kg por ciclc de terapia (n=5)
Um teste T desemparelhado entre tratamentos resultou num p = 0,0018 significativo sob o ponto de vista estatístico, indicando que o tratamento com a SEQ ID N“. 8 reduziu significativamente a formação da íntima relativamente â média, quando comparado com os grupos não tratados.
Exemplo 5: Modelo de Fibrose do Pulmão
Uma acumulação em excesso do colagénio no pulmão é a marca de fibrose no pulmão. A de colagénio no tecido depende da taxa de ,=., - de colagénio e da degradação do colagénio e, em casos de fibrose, a taxa de síntese de colagénio predomina em relação à taxa de degradação de culuqenu.o.
Compraram-se hamsters da raça Solden Syrain isentos de doenças respiratórias crónicas, pesando 120-130 g, à Charles River (Boston, MA) e alojaram-se em gaiolas de plástico, em grupos de 4, em instalações aprovadas pela American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care. Deixaram-se os animais aclimatarem-se durante uma semana às condições do laboratório antes de iniciar as experiências. Eles tiveram acesso a Rodent Laboratory Chow 5001 (Purina Mills. Inc., St. Louis, MO) e água ad libitum e estiveram alojados numa sala com ar filtrado e com um ciclo de luz/escuro de 12 horas/12 horas. Os hamsters foram distribuídos pelos grupos seguintes para os estudos bioquímicos e histopatológicos.
Grupo de Tratamento Estudo Estudo Bioquímico Histopatológico (n) (n) Sol. Salina IT ± Sol. Salina IP 10 § Bleomicína IT +- Sol. Salina IP Bleomicína IT + Recep. de FTC-beta do 10 i; tipo II;Fc Sol. Salina IT i Recep. de FTC-beta 10 do tipo II:Fc 10 ''6
Dissolve-se o sulfato de bleomicína em solução salina, isotónica, esterilizada, isenta de pírogénio, imediatamente antes da instilação intra-traqueal {IT). Sob o efeito de anestesia com pentobarbital (25-35 mg/kg, ip) os hamsters, no grupo apropriado, receberam bleomicína bus unida-des/kg/4 riu ou equivalente (4 mL/kg) de solução salina, ísoucnica, isenta de pirogénio, através de uma via tians-oral. Adminrstra-se o receptor de FTC-beta do tipo 7I:Fc por via intraperitonial (ip) ou intra-traqueal, numa dose terapêutica para o hamster em grupos apropriados, de duas vezes por semana, durante 21-28 dias após a instalação. Depois, os animais de cada grupo foram sacrificados por meio de uma o-v-erdose dê pentobarbital da sódio (100-125 mg/kg, ip) e os seus pulmões foram tratados para fazer estudos bioquímicos e hiutiSintddgico.f:·. 1. Estudo Bioquímico
Os pulmões dos animais utilizados para os estudos bioquímicos, foram perfundidos in situ por via do ventrículo direito com uma solução salina, isotónica, arrefecida com gelo, para lavar o sangue do sistema vascular pulmonar através de uma abertura no ventrículo esquerdo. Os glóbulos do pulmão foram rapidamente dissecados, retirou-se-lhe todo o tecido não parenquimal, mergulhou-se em azoto líquido para uma congelação rápida e depois armazenou-se a -80 °C. Os pulmões congelados foram mais tarde descongelados e homogeneizados em KC 0,1 M, tampão de Tris 0,02 M (pH 7,6) com um homogeneizador Polytron. Armazenaram-se a -80 °C, várias aliquotas de 1 mL do produto homogeneizado até ao momento de se realizarem vários ensaios bioquímicos.
Quantificou-se o teor de hidroxiprolina do produto homogeneizado do pulmão como uma medida do teor de colagénio, pelas técnicas de Woessner, Arch. Bíochem.
Biophys. 93: 440-447 (1961) e peroxidaçáo de lípidos pelo processo conforme descrito em Giri, et al., Biochem. Pharmaccl, 54: 1205-1216 (1997). 2 .
Estudo Histopatologico
Anestesiaram-·se os hamsters até ao nível da secessão da batida cardiaca. Abriu-se o iómx, o ccração foi desligado das suas bases e fez-se passar uma cânula na traqueia. Os pulmões e o coração foram retirados em bloco, pesados e colocados num banho de uma solução salina normal e instilou-se os pulmões com um fixador de glutaraldeido-paraformaldeído a 1 %, em tampão de cacodilato 0,12 M, a 40Qm Osm, a uma pressão de 30 cm de H20. Fixaram-se os pulmões por via desta pressão durante cerca de 2 horas e depois armazenaram-se num fixador com as traqueias ocludidas. Antes de se embeber, o pulmão é isolado do coração e de todo o tecido não pulmonar por dissecção cega e é retirado. Cortam-se os blocos de tecido de, pelo menos, duas fatias sagitais (espessura de 2-3 mm) da parte craniana direita, da cauda direita e dos lóbus esquerdos do pulmão esquerdo de cada pulmão. Corta-se cada bloco com uma face de cerca de 1 õstu Desidrataram-se os blocos numa série graduada de etanol e embeberam-se em parafina. Cortam-se secções (espessura de 5 Mm) dos blocos em parafina e coram-se com haematoxilina e eosina, para fazer as avaliações histológicas. 3. Análise e Interpretação dos Dados
Os valores para os diferentes determinantes bioquímicos nos pulmões de controlo e dos animais tratados estão expressos por mg de proteína do pulmão ou ADN. Contudo, deve notar-se que a expressão dos dados baseia-se por mg de uma proteína ou do ADN do pulmão, vai tender a : um abaixamento artificial dos valores nos animais tratados. Este prcblema é atribuído a íiiilitPucSó de leucócitos, presença de proteína do plasma residual nos pulmões mesmo após perfusão e proliferação das células do tipo II e dos fibroblastcs no estudo de longo prazo, nos pulmões de hamsier tratados com bleomicina. Para evitar um abaixamento artificial dos os dados serão expressos numa base por pulmão. Ver, Starcher et ^., Am. Rev. Resp. Dis., 117:299-305 (1973) e Witschi, Essays Toxícol., 6: 125-191 (1975).
Os dados foram analisados em termos de valores médios com os seus desvios paarão e os erros padrão das médias. Irá aplicar-se o teste T de Student, as distribuições do qui quadrado, o coeficiente de correlação, a análise de variância (ANOVA) e o teste de comparação múltipla, para d&MM-r o significado das diferenças entre os grupos de controlo e de tratamento utilizando um pacote estatístico com base em computador (SAS/STAT Guide, 6 a- Ed. Cary, N.C. pp. 183-260 (1985) ) .
Exemplo 6: Modelo de Glomerulonefrite 0 efeito das proteínas da presente invenção é avaliado num modelo de glomerulonefrite. A glomerulonefrite experimental é induzida em ratos com uma única injecção de soro de nefrotixina da membrana de base anti-glomerular (SNT) derivado de coelhos. A lesão experimental é uma glomerulonefrite mesangial proliferativa e é caracterizada pela expansão da matriz mesangial e pela hipercelularidade. As células traumatizadas são expressas em mais ARNm de FTC-beta i e FTC-beta l que, por sua vez, estimula a síntese de dois proteoglicanos, biglicanos e aecorina. De particular interesse, é o facto da nefrite reprodutível progredir através das escaras glomerulares e tubulointersticiais, t&l ao estado final da doença renal.
Primeiro, a glomerulonefrite é induzida em ratos por uma injecção intravenosa de soro de SNT. Em seguida, durante seis dias, tratam-se dois grupos de ratos com uma injecção iAbMvtotíta diária de solução salina (o grupo de controlo negativo) ou proteínas da presente invenção. No décimo dia, os animais são sacrificados e fazem-se lâminas dos rins, que são coradas periodicamente com soluções de ácido de Schiff para enfatizar as alterações patológicas. Os rins com controlo negativo têm uma glomerulonefrite completa com material fibroso, amorfo, vermelho rosado a preencher a maior parte dos glomérulos. Os rins de controlo positivo têm um modelo de coloração que é semelhante a um gi omérulo normal. 0 rim que é tratado com proteínas da presente invenção também tem uma aparência normal, indicando que as proteínas da presente invenção bloqueiam a resposta devido a uma secreção da sobre-produção de FTC-beta. A extensão do trauma glomerular pode ser quantificada realizando contagens das células glomerulares desde 30 glomérulos seleccionados aleatoriamente de animais normais e de animais nefríticos em cada grupo. Por volta do 10° dia, há mais células nos glomérulos resultantes dos ratos tratados com SNT. A função renal é também avaliada por meio da medição dos níveis de albumina na origem e por quantificação da clearance da creatinina.
Uma outra medida do efeito das proteínas da presente invenção no processo de doença, consiste quantificar a quantidade de aglomeração de matriz extracelular nos glomérulos. O grau de expansão da mâtriz glomerular Θ determinado como uma percentagem de cada glomérulo ocupado pela matriz mesangíal de acordo com o método de Raij et al. (1984) Kidney Int. 26: 137-43. Os rins tratados com R PTC- beca II:Fc é possível que tenham percentagens semelhantes da matriz mesangial do que no rim normal e bastante menos matriz mesangial do que os rins com controlo negativo.
Exemplo 7: Modelo de Artrite A artrite é induzida em ratos fêmea LEW sem patogéne-ses (Harlan Çprague Dawley, Indianapolis, Ind.), pesando cerca de 100 gramas. Cada um recebe uma dose de fragmentos de parede da célula de streptococci do grupo A (SCW) (30 mu g ramnose/gm de peso do corpo) , injectado intraperitonial-mente (ip), de acordo com a técnica descrita em Brandes et al. (1991) J. Clin. Invest. 87: 1108. Injectou-se intra- articularmente (IA) aos ratos injectados SGW e aos ratos injectados LEW de controlo nos tornozelos traseiros, uma das seguintes injecções: 1. proteínas da presente invenção em 25 um 1 SBF, 2. apenas SBF, ou
3. um controlo de IgG
Monitorizou-se clinicamente as articulações determinando a quantidade de eritema das articulações, os inchaços e a distorção numa escala de 0 (normal) a 4 (inflamação severa). Tiraram-se radiografias e avaliaram-se quanto ao inchaço dos tecidos moles, ao tratamento do espaço das articulações, às erosões e deformações dos ossos. Obtiveram-se espécies de tecido e preparam-se para análise histopatológica, tal como descrito em Brandes et al., ibid. Isolou-se o ARN total de tecido sinovial excisado de acordo com o processo de Allen et al. (1390) J. Exp. Med. 171: A injecção de 3CW produz uma resposta inflamatória aguda qu* é detectável clinicamente no prazo de algumas horas e no máximo em 3-5 dias. Quando se injecta receptor de FTG-beta do tipo II:Fc directamente na articulação antes da administração l‘P da SCW, a inflamação às 24 horas, é significativamente infericr à observada em articulações com o anticorpo irrelevante. No pico da resposta ajuda, a inflamação dessas articulações tratadas permanece muito longe das articulações com o anticorpo irrelevante. Mesmo se as articulações são injectadas com receptor de FTC-beta de tipo II: Fc guando se desenvolve a inflamação (13" dia), a fusão tem ainda um efeito anti-inflamatório significativo, quando comparada com o anticorpo irrelevante. Dado que proteínas da presente invenção também se ligam a FTC-beta, elas têm um efeito benéfico similar quando dadas numa fase precoce ou tardia do processo inflamatório. Outros modelos experimentais bem estabelecidos de AR incluem a artrite induzida por colagénio e adjuvante. Ver, por exemplo, Janusz MJ et al., Inflamm Res. 46: 503-508 (1997); Myers et al., Life Sei 61: 1861-1878 (1997); e Kock et al., Clin Immunol Immunopathol 86: 199-208 (1998). <1·.0> BIOGEN, INC. -:-:121; Proteínas de Fusão do Receptor de FTC-beta do Tipo II e Processos <140> Patente de < 141> 1998-04-16
Norte-Americana PA <16G> 13 ":!?&> Patentln Ver. 2.0 < 21C > 1 9077
c2:12> ADN
Coelho <22 0> <.-:22:3;í< Descrição de um Organismo Desconhecido: Coelho gaattcgagc ttgcatgccc gaaggtcgtt atataactta cggtaaatgg ccagcctggc tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc áagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg q x·: >.· q q qq q tttggcagta catcaatggg cgtggatage ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agcttgtttt ggcaccaaaa ccaacgggac ttcccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa • Aíl-imv Ag gcgtgtacgg atataagcag agetcgttta gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt ttgacctcca tagaagaaac cgggaccgat ccagcctccg gactctagag gãtccggtac tcgaggaâct gaaaaaccag GcLãgfcfcãact ggtaagttta gtctttttgt cttttatttc aggtcccgga tccgrgtgsity gtgcaaatca aagaactgct cctcagtqga tgttgccttt acttctaggc ctgtacggaa gtgttacttc tgctctaaaa gctgcggaat tgtacccgcg gcegctctgc cacgggtcgg gggctgct.cc ggggcctgtg gdcgctgcac ctcgtcctyt ggacgcgcat cgccagcacg ãtcccgccgc acgttcagaa gtcggttaat 33. cgaca z g 3 tggtcacgga caacaatggc gccgtcaagt .CCCaCdãCt gtgcaagttt tgcgatatgc gqt.íiçíccac ctgtgacaac cagaagtcct gcatgagcaa CÍ.ÇMÇCiCU acgtccatct gtgagaaggc acacgaagtc tgcaf.ggccg tctggaggaa 03acgatgaa 3.303033003 tggagactgt gtgt.cac.gac cccaagctcg cctaccatgg attccttctg g a 3 q a n t cx cj cctctccaaa gtgtatcatg 3330333303 gcccaccgtg gqagactttc tqaggaatac accaccagca gtccggatct ggggaccgtc tgacgagtga ggtcgacaaa agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga cãccctcãtg atctccccga cccctgaagt cacatgcgtq gnggtggacg agaccctgag gtcaagttaa actggtacgt ggacggcgtg gaggtagata atgccaagac aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gteagcytcc Lcaccgtccl gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagLa caagLgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag cacaggggta caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggctcc acatcgccgt ggagtgggag aggaatgggc agccgg&gaa caactacaag accacgcctc ccgtgttgga ctccgacggc tccttcttce tctacagcaa gctcaccgtg gacaagagca ggtggeagca ggggaacgtc ttctcatgat ccgtgatgca tgaggctctg cacaaccact ócacgcagaa gagcctctcc ctgtctacgg gtaaatgagt gcgçccgcgt cgaccgtgac ccctgcgccg cggggactcc tgccccgagg gtccggacgc gccccagctc gcgccccctc ccatatttat tcggacccca agcatcgccc caataaagac cagcaagcaa ccggctgggg tgtccgtgcg r:.r ccegrgggac ctcccttgcc gtctctcctc gcgcacggcc cgggtccgcc ctgtagcgct cgctgtctct cccctgcctg aggcgcccca ccaccgtctt tcaggccccg gacttggtgc cgtaaaggag caggtgactc tgcgcagcag tcgctttatt tcgccagagt s " .ν' ;CS ' cccctggact gccggctcag tcccgcccct tgcctgcgcg gagcttctgg cgactcccag cccgtcggga acacccaggc ctgcttcttc cgtccctgga gtcccgtgcc qqgggqqgg:: ggcccccttc gcgtgactcc mmtwm gtagggcgtc ctqgcggccc gtggcctctc ctctttccgc ggcctctctt tcttaggtct ctcctccttc cgcgqcttct ccttccgcgg cttcccctct ctccgaggcc tccccttggg tcccaggtct cacggtcctc ccggacggcc tctccggtgg cctcgccggg ctcctcttcg tcgttctatg cagcctcccg actcccggga atcttgggtc tgacctctgc ctcggcccgg ggctcgaact taggctgcaa taagcgccca cettcccccc ccttctttcc ttggggatga aggtcccaat gcccgaggtc qqqgyqqgíqg agctcttacc atggctccct qvyqqqí.g.í·.) cttggcggga cccagggctc gggcacacgt gcttggagtg ctgcctccgc tctgcagcga :v*::vv;.v:;g:g;:: acccgagtca V :V:. ggcacggtcc acâctgtcca tccctccctc acccctagag SÍÍSiXCgqqK tggacagttg cccccggcac ggctgagact aaggdtgccc ccgagccgtg ccgggactcc g-tqqv;g:-:;g cgccccttct ccgaacctcg ctctttcaat tggtcãttct tccccccgac cacgggctgt aggaggcccc tagcaaggga ggagtgcccc cacgagctga gcggtccaca cggcagaacg ctacgaggga •g :< : > ·.: :: cacaaggttc atccggaagc cagaacctac tcgcggcgag gggaatgggc cccgcaaaag grccacaccg a-v;·a gcgcgcaagg cccgteactt aagggacata tgacgtgagc tcagatcttt gtgaaggíi^.i: cttacttctg tggtgtgaca taattggaca aactacctac agagatttaa agctctaagg taaatataaa attttrraagt gtataatgtg '.qsaíieísa?; 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Ser Glu Glu Tir Açn Tre Ser Açn Pro Asp Leu Vai Asp Lis Tre 1 5 10 15 Tre Cis Pro Pro Cis Pro 20
His
Lisboa, 19 de Setembro de 2007

Claims (5)

  1. Composição que compreende uma proteína de fusão do receptor de FTC-beta do tipo LI (R FTC-beta LI), caracterizada pelo f&tts de compreender (a! um p<>Lip«ptiíio codificado pelo polinucleótido mostrado na SEQ ID N°. 2; (b) um polipéptido que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N”. 8; ou (c) um polipéptido que compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 98 % idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 8, e uma região constante de uma imunoglobulina, em que a referida proteína de fusão de R FTC-beta II se liga a FTC-beta. Composição que compreende uma proteína de fusão do receptor de FTC-beta do tipo II (R FTC-beta II), caracterizada pelo facto de compreender (d) um polipéptido codificado pelo polinucleótido mostrado na SEQ ID Nd 2 ; iííi um polipéptido que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID N°. 8; ou (f) am Ptd.lpéptldP que compreende uma saupiictala da aminoãciáas que ê. pelo menos 98 a idêntica & sequência de aminoácidos da SEQ ID H'u. a e uma região constante de uma imunoglobulina, em que a referida proteína de fusão de R FTC-Seta II se liga a FTC-beta para ser utilizada como um medicamento. Composição, de acordo com a rsiviadlc&çlô 2, caracterizada pelo facto de a região constante ser de IgGl. Composição, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizada pelo facto de a região constante compreender a charneira, que é a porção CH2 ou CH3 de igGi. Composição, de acordo com uma qualquer das reivindicações 2 a 4, caracterizada pelo facto de a proteína de fusão de R FTC-beta XI ser um homodímero. Utilização de uma proteína de fusão de R FTC-beta II, caracterizada pelo facto de compreender (a) um polipéptido codificado pelo polinucleótido mostrado na SEQ ID N°. 2 ou 4; (b) um polipéptido que compreende a sequência de aminoãcidos da SEQ ID N°. 8 ou 9; ou (c) um polipéptido que compreende uma sequência de aminoãcidos que é pelo menos 98 % idêntica à sequência de aminoácidcs da SEQ ID N°. 8 ou 9 e uma região constante de uma imunoglobulina, em que a referida proteína de fusão de R FTC-beta II se liga a FTC-beta, para a preparação de uma composição farma- cêutíca para o tratamento de um indivíduo que sofre de um distúrbio fibroproliferativo.
  2. 7. Utilização, de acordo com a reivindicação 6, caracte-rizada pelo facto de o distúrbio fibroproliferõtivo ser artrite, nefropatia diabética, glomerulonefrite, vitreoretínopatia proliferativa, mielofibrose ou um distúrbio vascular do colagénio seleccionado no grupo que consiste em esclerose sistémica, polimiosite, escleroderma, dermatomiosite ou lúpus eritematoso sistémico.
  3. 8. Utilização, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizada pelo facto de a região constante ser de IgGl.
  4. 9. Utilização, de acordo com uma qualquer das reivindicações 6 a 8, caracterizada pelo facto de a região constante compreender a charneira, que é a porção CH2 ou CH3 de IgGl.
  5. 10. Utilização, de acordo com uma qualquer das reivindicações 6 a 9, caracterizada pelo facto de a proteína de fusão de R FTC-beta II ser um homodímero. Lisboa, 19 de Setembro de 2007
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