PT94381B - Processo para a preparacao de uma composicao contendo um imunogeno para tratamentos antialergicos - Google Patents
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Description
DESCRIÇÃO
DA
PATENTE DE INVENÇÃO
N.° 94 381
REQUERENTE: PEPTIDE THERAPEUTICS LIMITED, inglesa, comer ciai e industrial, com sede em 321, Cambri dge Science Park, Milton Road, Cambridge CB4 4W6, Inglaterra.
EPÍGRAFE: PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UMA COMPOSI
ÇÃO CONTENDO UM IMUNOGENO PARA TRATAMENTOS ANTIALÊRGICOS
INVENTORES: Denis Raymond Stanworth, Ian Victor Lewin, Sarita Nayyar e Valerie Jones.
Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 4.° da Convenção de Paris de 20 de Março de 1883.
Inglaterra em 15 de Junho de 1989, sob o n». 8913737.6.
INPI MOO 113 RF 18732
RESUMO
A invenção refere-se a um processo para a preparação de uma composição contendo um imunogeno que contém um resíduo de um péptido libertador da histamina compreendendo uma cabeça de terminal N catiónica e uma cauda de terminal C hidrófobo, em conjunto com um resíduo capaz de sucitar anticorpos contra o referido péptido enquanto se inibe a libertação da histamina pelo citado péptido. A composição aplica-se nos tratamentos de combate às alergias.
Preferencialmente, o péptido libertador da histamina tem a seguinte fórmula
Lys- Thr- Lys- Gly- S e r- Gly- Phe- Phe-V al- Phe opcionalmente amidado com C.
Os anticorpos ao péptido libertador da histamina são vantajosos para uma imunização passiva.
Campo da invenção:
A presente invenção refere-se à inibição de interacções que normalmente causariam a libertação de histamina e outros mediadores entre as moléculas de IgE ligadas a um alérgenio e à célula.
CQQhgcimentos prévios
Os sintomas alérgicos surgem através da libertação de aminas vasoactivas (mediadores), nomeadamente, a histamina das células para os tecidos e estruturas vasculares circundantes. A histamina é normalmente guardada em células especiais conhecidas como mas-cells e leucócitos basófilos. As mast-cells estão dispersas através do tecido animal enquanto os basófilos circulam dentro do sistema vascular. Estas células fabricam e guardam a histamina interiormente, só a libertando quando ocorre uma sequência especializada de acontecimentos.
papel dos anticorpos de imunoglobulina E (IgE) na mediação do reacções alérgicas é bem conhecido. IgE é um arranjo complexo de cadeias polipeptídicas que consiste, como noutras imunoglobulinas, em duas cadeias leves e duas cadeias pesadas ligadas por ligações de dissulfureto numa configuração com a forma de Y. Cada cadeia leve tem dois domínios, um variável (VL) ligado a outro domínio que é constituído por uma sequência de aminoácidos relativamente invariável, denominado domínio constante (Cl). As cadeias pesadas, em constraste, têm um domínio variável (VH), e no caso da IgE, quatro domínios constantes (CHI, CH2, CH3 e CH4, também conhecidos como C-gl, C-g2, C-g3 e C-g4). Os dois braços do anticorpo são os responsáveis pela ligação com o antigénio, através de reacções em que a estrutura do polipéptido varia, chamadas fragmentos Fab (fragmento-antigénio-ligação) ou F(ab’)2, que representam os dois braços Fab’ interligados por ligações de dissulfureto.
A cauda ou eixo central do anticorpo contém uma sequência fixa ou constante de péptidos e é chamada fragmento Fc (fragmento-cristalino). 0 fragmento Fc contém os pontos biologicamente activos do anticorpo que lhe permitem a comunicação com outras células ou moléculas do sistema imunológico através de
ligações com os receptores Fc respectivos. Os receptores Fc sãb moléculas que se ligam com alta afinidade e especificidade com os pontos activos existentes dentro das regiões Fc da imunoglobulina. Os receptores Fc podem existir como proteínas de membrana integral dentro da membrana celular circundante do plasma exterior ou como moléculas solúveis” livres que circulam no plasma sanguíneo ou noutros fluídos corporais. A Figura 1 dos desenhos anexos mostra a estrutura de uma molécula de antii corpo e a localização dos pontos ligantes ao antigénio (braços Fab’), o fragmento Fc e os pontos activos que incluem o ponto ligante à célula.
Pontos activos que, dependendo da sua função, podem estar já expostos e logo capazes de se ligarem com receptores celulares ou, alternativamente, podem eètar escondidos até o anticorpo se ligar ao antigénio, depois do anticorpo pode mudar de estrutura e subsequentemente expor outros pontos activos que podem então despletar uma actividade imunológica específica.
A libertação alérgica (imunológica) de histamina dentro do organismo, a partir das mast-cells e basófilos, só pode acontecer nas seguintes circunstâncias;
Uma molécula de IgE tem de se bloquear ou se ligar, pela sua ponta Fc ao ponto receptor celular Fc, fixando assim a molécula de IgE à mast-cell ou sabófilo (Figura 2a(. As porções Fab’ das moléculas de IgE ligadas à célula têm que ser reticuladas por um antigénio compatível particular (o alergénio). Se uma tal interacção ocorrer (Figura 2b), a mast-cell ou basófilo é automaticamente induzida a libertar histamina para o meio local, manifestando sintomas alérgicos familiares.
As tentativas convencionais para o tratamento de alergias têm envolvido terapias sistémicas com anti-histaminas ou tentati-
vas para dessensibilizar pacientes, ou seja, não se destinavam à interacção básica IgE-mast-cell/basófilo.
Outro processo da técnica anterior incidiu na produção de cadeias polipeptídicas capazes de bloquear a ligação do anticorpo IgE com os receptores Pc da superfície celular e deslocar a IgE dos pontos onde estava ligada (Pigura 3).
Investigações foram feitas para definir a natureza do ponto causador”, dentro da região Fc da IgE, que fornece o sinal imunológico que resulta na libertação de histamina pelas mast· -cell/basófilo, que actuam segundo o modelo.
Estudos de actividade-estrutura feitos com os polipéptidos que actuam segundo o modelo de libertadores de histamina, corticotrofina (ACTH), melitina e análogos, indicaram que um agrupamento de aminoácidos básicos que ocorre em ambos os péptidos era uma condição essencial para a indução directa da libertação de histamina das mast-cells peritoneais dos ratos, (Jasani, B. e Stanwarth, D. R., Int. Archs. Allergy Appl. Imun.
pág. 74-80 (1973) e Jasani, B. et al., Biochem. J., 181 pág. 623-632 (1979)).
Além disso, a presença de resíduos hidrofóbicos vizinhos e a amidação do resíduo de ácido carboxílico C-terminal foram encontrados como factores que induzem esta libertação de histamina.
Com base nestas observações, a região Pc da IgE humana, cuja estrutura já dinha sido descoberta (Bennich, H. e Bahr-Lindastrom, H. von. Prog. Immunol., 11, pág 49-58 (1978) foi examinada à procura de sequências de aminoácidos que preenchessem tais critérios.
A sequência que abarca os resíduos 496-506 dentro do domínio
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Ce4:
Arg-Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-G1y-Phe-Phe-Val-Phe (todas as sequências mencionadas na presente memória descritiva devem ser lidas da maneira normal, isto é, com o terminal G na ponta direita) pareceu a que melhor satisfazia estes requisitos estruturais (Stanworth, D. R., et al., Biochem, J., 180 pág. 665-668 (1979)). Consequentemente, foram sintetizadas péptidos de comprimentos variávéis compostos por sequências representativas desta região e foram ensaiadas relativamente à capacidade de induzir a libertação não citolítica de histamina das mast-cells peritoneais de rato in vitro.
Um octapéptido (sequência 497-504), um nonapéptido (sequência 496-504) e um decapéptido (sequência 497-506), todos mostraram, dentro do limite de concentração de 0,100yuM, uma liberta ção de histamina dependente da dose.
Como resultado destes estudos sistémicos, surgiu uma imagem de quais os requisitos estruturais essenciais para uma indução directa das mast-cells e de que o sinal de indução provém das moléculas de IgE do anticorpo como consequência das suas reticulações através de um alergénico. Esta estrutura compreende uma cabeça polar N-terminal (catiónica) (por exemplo, Lys-Thr-Lys) separada por resíduos indiferentes (por exemplo Gly-Ser-Gly) duma cauda hidrófoba C-terminal (eg. Phe-Phe-Val-Phe-NH2). (como é uaual, ao longo desta memória descritiva, o grupo NH2 final significa que o grupo ácido carboxilico C-terminal foi amidado).
Significativamente, foram observadas característacas estruturais primárias, admiravelmente similares no neuropéptido Subs tância P:
Arg- Pr o-Lys- Pr o- G ln- G ln- Phe- Phe- G ly-Len-líe t- NH2 que, quando libertado dos neurónios, parece actuar directamente nas mast-cells’' vizinhas com a consequente libertação de histamina.
Stanworth et al. sugeriram a presença de um segundo receptor na superfície celular envolvido na libertação de histamina (mediador) . Poi feita a hipótese de que os pontos activos da região Pc da IgE conteriam um ponto causador que é distinto do ponto em que a IgE se liga à célula (ponto de ligação da célula). Depois da reticulação da IgE com o antigénio (alergénio), um segundo mecanismo é activado pelo ponto causador (tendo a sequência indutora necessária ou seja uma cabeça catiónica separada duma cauda hidrófoba por resíduos indiferentes).
Foi sugerido que, quando o alergénio se liga  IgE do anticorpo, ocorre uma transformação da conformação da IgE do anticorpo pondo os pontos activos da IgE em contacto com o postulado segundo receptor na membrana superficial da célula.
A indução da libertação de histamina por uma sequência específica de aminoàcidos (ponto causador) dentro dos pontos activos, pensou-se ocorrer pela inserção da cauda hidrófoba na dupla camada de lípidos da membrana celular, enquanto a cabeça catiónica interactuava com o suposto segundo receptor na membrana celular (Stanworth, D.R. et al., Molec. Immunol. 21, pág. 243-247 (1984)).
A explicação acima referida para o mecanismo da libertação de histamina das mast-cells não é aceite universalmente. Anteriores investigações tentaram desenvolver péptidos de bloqueie para impedirem a ligação da IgE às mast-cells e basófilos. 0 desenvolvimento de anticorpos com pontos antiligantes clari6
ficou a posição de pontos de ligação e subsequentemente desenvolveram-se antipéptidos de bloqueio (Burt, D. et al., Molecular Immnunolgy, 24, pág 379-389 (1987)). No entanto, sabe-se que o anticorpo IgE está por vezes ligado firmemente à mast-cell ou basófilo (Stanworth, D.R., Nature 233, pág. 310-316 (1971)) mesmo sem a presença de um alergénio e só com a presença deste é que o suposto segundo receptor é induzido e a histamína é libertada.
Portanto, somente bloqueando o ponto onte a IgE se liga com a mast-cell, se inibia a função de IgE de apenas moléculas livres e não estão ainda ligadas às mast-cells ou basófilos. Esta hipótese não é então utilizável quando já se tenha IgE ligada à célula, a não ser no caso em que o péptido de bloquei|o também é capaz de deslocar a IgE já ligada à célula. Esta hipótese foi encarada por Hamburger, que relatou, que um pentapéptido do domínio do CH2 da IgE humano era capaz de competir com os pontos ligantes específicos da IgE nas mast-cells da pele humana (Hamburger, R.N. Science, 189, pág 389-390 (1975)) No entanto, estes resultados não foram confirmados por outros investigadores (Bennich, Η. H. et al., Int. Arch. Allergy Appl Immnunol., 53, pág 459-468 (1977)).
Admitindo a validade da hipótese do segundo receptor, não é claro como impedir a interacção entre o ponto causador postulado sobre a molécula de anticorpo anafilático (IgE) e este segundo receptor na superfície celular. Presumivelmente, a reticulação de moléculas de anticorpos de IgE ligados à masfe-cell por um antivénio (o alergénio) específico, induz uma mudança conformacional dentro das regiões Fc ficando o ponto causador em próxima justaposição com o segundo receptor. Neste caso, qualquer tentativa para bloquear esta interacção poderia encontrar desvantagens de ordem estérica na região do suposto ponto causador.
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Sumário da invenção
Foi agora surpreendentemente descoberto pela Requerente que é possível produzir in vitro, ou mais surpreendentemente ainda produzir in vivo, um anticorpo para o ponto causador na região ao fragmento Fc da IgE, que impedirá a libertação de histamina quando a IgE ligada à célula é reticulada com o seu alergénio específico, mesmo quando a IgE presente na circulação já está ligada pela sua região Fc à mast-cell ou basófilo.
A invenção portanto fornece um imunogénio compreendendo (consistindo em ou incluindo) um resíduo de pêptido, libertador de histamina, que compreende uma cabeça N-terminal catiónica e uma cauda, C-terminal, hidrófoba, um conjunto com um resíduo capaz de produzir anticorpos contra o citado pêptido, enquanto inibe a libertação de histamina pelo mesmo. Esta definição aba. ca várias formas, poliméricas e reticuladas, de pêptidos e seu conjugado, compreendendo um veículo agregado ao pêptido, resumindo, qualquer forma que faça o peptideo perder a identidade e que reduza a sua função libertadora de histamina para um nível aceitavelmente baixo, de preferência, nulo.
Num primeiro uso da invenção, o hospedeiro é activamente imunizado contra a sequência indutora da região Fc da IgE através da administração ao hospedeiro, de uma quantidade de imunogénio, imunologicamente efectiva, como foi definido antes. Muito embora os pêptidos provoquem a libertação de histamina é surpreendente o facto de que eles próprios possam estar presentes de modo que não actuem como mediadores da libertação da histamina.
A invenção também inclui um ligando que compreende um domínio dos anticorpos específicos para um pêptido libertador de histamina referido antes. Esta definição inclui anticorpos mono-
cionais e policlonais, seus fragmentos que se ligam a antigénios, por exemplo, Fab' ou F(ab’)2, anticorpos híbridos e anticorpos do domínio de cadeia simples. Para abreviar, o termo anticorpo” é usado, daqui para a frente na presente memória descritiva, para referir o citado ligando.
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Num segundo uso da invenção, o hospedeiro é passivamente imunizado contra a atrás mencionada sequência de aminoácidos da região Fc de IgE humana pela administração ao citado hospedeiro de uma quantidade de ligando efectiva como inibidora, da libertação de histamina, que contém um anticorpo de domínio específico para o acima definido péptido libertador de histamina. 0 anticorpo monoclonal preferido, a partir do qual podem ser preparados anticorpos humanizados e fragmentos Fab' é o assunto do depósito duma patente abaixo descrita.
gescri£ão_dos_desenhos
A Figura 1 mostra a estrutura de um anticorpo e a localização das regiões Fab' e Fc.
A Figura 2 mostra o ponto em que o anticorpo de IgE se liga à mast-cell ou basófilo (2a) e a maneira oomo os anticorpos de IgE ligados à célula se reticulam com o antigénio, expondo a região causadora nos pontos activos da IgE que se podem aproximar do segundo receptor (2b).
A Figura 3 mostra a estratégia do desenvolvimento de péptidos para bloquearem a ligação da IgE ao receptor Fc superficial de célula.
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Des cri ção das f ormas_ d.e. realização_ preferidas
A presente invenção é dirigida à inibição da libertação de histamina (mediador) das mast-cells ou. basófilos durante uma reacção alérgica. Este período de indução ocorre quando uma mast-cell ou basófilo transportando uma IgE ligada à sua superfície contacta um antigénio (alergénio) para o qual a IgE é específica. 0 alergénio liga-se à IgE superficial, produzindo por isso uma modificação conformacional da IgE, expondo os pon tos causadores” que interactuam com um ”segundo receptor” na superfície da célula, causando a libertação de histamina ou de outro mediador guardado dentro da célula.
Esta inibição é provocada pela interferência com a interacção entre (1) os pontos ”activos” na região Pc da IgE ligada à célula, que tinha ficado ligada pelas suas regiões Pab’ a um alergénio, expondo assim ”pontos causadores” e (2) os segundos receptores” da superfície celular. (Normalmente, a interacção entre estes pontos causadores e os segundos receptores daria origem à libertação de histamina guardada na célula) .
A imunização pode ser passiva, isto é, realizar um tratamento profiláctico com, pelo menos, o fragmento Pab’ de um anticorpo da sequência de aminoácidos anti-IgE ou, préferivelmente, acti va, isto é, induzindo o hospedeiro a produzir os seus próprios anticorpos, pois a imunização activa dá origem a uma for ma de protecção mais contra a libertação de mediadores, induzi da imunologicamente, da IgE sensibilizada de mast-cells” ou basófilos. Além disto, existem factos que sugerem que os anticorpos antipeptídios reduzem o nível de produção de IgE contra um alergénio (ovalbumina) em animais experimentalmente sensibilizados (ratos).
Os péptidos libertadores de histamina contêm uma cabeça” catióniba N-terminal e uma cauda hidrófoba C-terminal. € preferível que a cauda C-terminal seja bloqueada por amidação. Os terminais C e N são geralmente separados por uma sequência qne contém resíduos de aminoácidos indiferentes que são predominantemente não-polares e não-hldrófobos. Os terminais N e C são geralmente separados por 2 a 8 aminoácidos preferencialmente 2 a 6 e optimamente 3 aminoácidos. A sequência preferida na separação destes terminais C e N é Cly-Ser-Gly, A prolina e a cisteína não são favorecidas.
A cabeça tem de ter carácter catlónico apropriada para a reque** rida interacção com a membrana da célula no segundo receptor, De preferência, tem um duplo-topo de dois resíduos catlónicos de aminoácidos separados, por exemplo, Lys-X-Lys em que X representa, pelo menos, um resíduo de aminoácidos polar ou neu·· tro. A cabeça contém os primeiros um, dois ou três aminoáciI dos do terminal N. A cauda tem carácter hidrófobo apropriado para a sua presumível entrada na blcamada de lipidos. Contém pelo menos os 2 aminoácidbs finais, preferivelmente os 2 a 6 |aminoácidos finais. Os aminoácidos preferenciais para a c&uda ' são a fenilalanina e a tirosina mas outros aminoácidos com cadeias laterais allfáticas extensas são também considerados hidrófobos. A cabeça ou a cauda podem também conter aminoácidos indiferentes” desde que não predominem e portanto não causem a perda da função. Preferivelmente a cabeça N-terminal consiste em ou só Lys ou Lys-Thr-Lys e mais preferivelmente & cauda C- j -terminal compreende, nos últimos 4 aminoácidos do peptídeo, especialmente uma sequência Phe-Phe.
Cs oéptidos especialmente preferidos incluem
- Lys-Thr-Lys-Gly- Ser-Gly-Phe- Phe- A rg- Lys- Thr- Lys-G ly- S e r- G ly- Phe- Phe(D (2)
- Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe-NH2 (3)
- Lys-Thi>Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe-Ser-Arg-NH2
- Lys-Thr-Iys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-NHg (5) (4) e os seus compostos análogos, libertadores de histamina, amidados ou não amidados. 0 preferido é o decapéptido (3) e é referido de agora em diante na presente memória descritiva como P30.
Estes péptidos medeiam a libertação de histamina não citolítica, embora esta libertação seja inibida quando o péptido é conjugado com material veicular imunológico. Preferencialmente, o hospedeiro é activamente imunizado pela administração de uma quantidade imunogénica de péptido, substancialmente incapaz de mediar a libertação de histamina, conjugado com um material veicular imunogénico, normalmente, uma proteína. A conjugação pode ser feita por meio de um curto resíduo de ligação, e.g. glutaraldeído, ou feita por meio de um resíduo mais longo, por exemplo, de um aminoácido apropriado em que o veículo está muito afastado do péptido. Esse resíduo de ligação, não deve interferir com o carácter catlónico da cabeça N-terminal do residuo de péptido. Os péptidos podem ser conjugados com o veículo por intermédio do terminal C ou N.
Alternativamente, o imunogénio pode tomar a forma de um péptido cílico contendo o resíduo do péptido libertador de histamina. A ciclização prejudica seriamente a libertação da histamina como é demonstrado nos exemplos em que o péptido cíclico F40 é ensaiado. Este péptido é uma forma ciclizada do péptido F30 em que em cada extremidade da molécula não amidada se adicionam grupos de cisteína. Alguma experimentação é precisa para assegurar que o péptido cHico retenha o péptido libertador de histamina fundamental numa conformação apropriada mas isso depende simplesmente da inserção de aminoácidos distanciadores conforme o necessário. Nestes péptidos cíclicos o resíduo em ponte cisteína-cisteína constitui o resíduo que faz sair os anticorpos, dentro da larga definição do imuonogénio da invenção.
imunogénio pode tomar a forma de um péptido polimérico, no qual o resíduo de uma molécula de péptido constitui o resíduo do péptido libertador de histamina na mais larga definição apresentada na presente memória descritiva, de imunogénio e a parte restante do imunogénio é o resíduo que faz sair o anticorpo, dentro do sentido da citada definição. Como os exemplos descritos aqui mostram, a dimerização enfraquece seriamenN te a libertação de histamina. Alguma experimentação pode ser precisa para determinar o grau apropriado ou a forma de polimerização para a estimulação dos anticorpos referidos.
Os imunogénios da invenção, embora sejam substancialmente incapazes de mediar a libertação não citolítica de histamina são capazes de libertar anticorpos com forte reactividade-conjugada serológica com a sequência de aminoácidos alvo da região Fc da IgE.
A dose inicial (por exemplo, 0,2-5 mg, de preferência, 1 mg) de imunogénio é administrada por via intramuscular, seguida por doses de reforço (acréscimo) do mesmo, aos 14s e 28a dias depois. As doses dependem evidentemente, nalguma extensão, da idade, peso e saúde geral do paciente como é reconhecido nas ciências terapêuticas.
A preparação de um anticorpo para a imunização passiva pode ser feita pela administração do imunogénio da invenção, de preferência, usando um agente auxiliar, a mamíferos e colectan· do em seguida o antissoro resultante. Podem ser obtidos melhores resultados através de repetidas injecções durante um certo período de tempo.
Embora não existam limitações particulares relativamente aos mamíferos utilizáveis para a preparação de anticorpos, a preferência recai em coelhos ou cobaias, mas cavalos, cabras, porcos, ratos, vacas, ovelhas, etc., podem também ser usados, a !produção de anticorpos, uma quantidade definida do antigénio, |cuja preparação foi descrita acima, é diluído até uma concentração desejada com uca solução salina fisiológica e a solução resultante é misturada com um meio auxiliar de Freund completo ipara preparar uma suspensão. Esta é administrada aos mamíferos. Por exemplo, a suspensão acima referida é administrada a coelhos intraperitonealmente (50 a 2500 ug/vez como a quantidade de antigénio)· Em seguida, a suspensão é administrada de duas em duas semanas durante um período de até 2-3 meses, de preferência, cerca de 1 mês, para efectuar a imunização. A recolha do anticorpo é feita pela colheita de sangue ao animal imunizado após 1 ou 2 semanas a seguir à administração final, seguida de centrifugação do sangue isoladamente do soro.
Os anticorpos podem incluir anticorpos monoclonais humanos e múrinicos. Preferencialmente o paciente será tratado com uma ipreoaração de fragmente Fab’ do anticorpo monoclonal murínico H ou um anticorpo quimérico humano-rato (contendo uma região !fc humana e uma região Fab’ de rato), para minimizar qualquer Ireacção adversa para com a imunoglobulina animal estranha,
Anticorpos monoclonais murínicos podem ser preparados pelo método de Edhler e Milstein (KOhler, G. Milstein, C.,,.jrature ί(Londres) 256, pag. 495 (1975)), por exemplo, fusão de células ide baço de ratos hiperimunizados com uma célula de mieloma.
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IjOs anticorpos monoclonais humanos são ligeiramente mais difíceis de arranjar mas muitos métodos têm sido utilizados, incluindo:
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| (1) | produção de anticorpos monoclonais por células-B transformadas como virus de Epstein-Barr (EBV); |
| (2) | linha de células para a hibridização de linfócitos B; |
| (3) | libridomas humanos murínicos; |
| (4) | hibridomas humanos/humanos; |
| (5) | heterohibridomas humanos (humanos/rato) |
Os hetero-hibridomas humanos humanos rato são os preferidos e envolvem uma combinação de características favoráveis de células paternais tanto humanas como murínicos. Células de hetero-hibridomas humanos-humano-rato têm sido consideradas apropria· das para a fusão com células-B (Teng, Lam, K. S., Rier
F, C. e Kaplan. H. S. (Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 80, pag. 7308 (1983)).
anticorpo monoclonal, a partir dos quais os anticorpos humanizados podem ser construídos é o assunto de um depósito de patente de acordo com o Tratado de Budapeste, depositado em 31 de Maio de 1990 na Colecção Europeia de Culturas de Células Animais, (Europeam Collection of Animal Cell Cultures) Porton Down, Salisbury, Wiltshire, Inglaterra com o número de acesso 900533107, θ designado daqui em diante por DEC 7B.
Quando usado no processo desta invenção, 0 anticorpo pode ser convenientemente introduzido no hospedeiro por injecção intramuscular. Quaisquer dos veículos líquidos ou sólidos comuns podem ser usados, desde que sejam aceites pelo hospedeiro e não tenham efeitos secundários adversos sobre estes ou quaisquer efeitos prejudiciais sobre a vacina. Solução fisiológica salina tamponada com fosfato (PBS) a um pH fisiológico, por exemplo, 6,8 a 7,2, de preferência, 7,0, pode ser usada sozinha ou com um agente auxiliar adequado, tal como um baseado ; em hidróxido de alumínio, como veículo. A concentração do anti4· gene imunogénico pode variar entre cerca de 50 e cerca de 500,1 de preferência, 200-300 yug por injecção, num volume de dissolvente igual a cerca de 0,25 a 1, de preferência, 0,5 ml. Injecções múltiplas serão requerida após a injecção inicial e podem ser administradas com intervalos de um ano.
Voltando agora para a imunização activa, a expressão material veicular imunogénico utilizada na presente memória descritiva inclui os materiais que têm a propriedade de independentemente promoverem uma resposta imunogénica no animal hospedeiro e que podem ser ligados covalentemente ao pollpéptido, ou directamente por formação de ligações de péptido ou de éster entre grupos hidróxilo, amino ou carboxilo livres no polipéptido e grupos correspondentes no material veicular imunogénico ou alternativamente por se ligarem através de um grupo difuncional ligante convencional. Exemplos desses veículos incluem albuminas de soros de animais, globulinas de soro de animais tiroglobulinas de animais, hemoglobinas de animais, hemocianinas de animais (particularmente a hemocianina Keyhole limpet (K1H)), proteínas extraídas de lombrigas (extractos de lombrigas, como os descritos no Pedido de Patente Japonesa Ns. 16 414/81, J. Immun., 111, pág. 260-268 (1973), J. Immun., 122, pág. 302-308 (1979), J. Immun. 98, pág. 893-900 (1967) e Am. J. Physiol.
199, pág. 575-578 (1960) ou produtos purificados deles derivados; polilisina, ácido poliglutãmico, copolímeros de lisina-ácido-glutâmico, copolímeros contendo lisina ou ornitina, etc, Recentemente produziram-se vacinas usando toxóides de difteria ou tétano como materiais veiculares imunogénicos (lepoy., M.
I., et al., J. of Infections Diseases, 150, pág. 402-406 (19841 e E. Coen Beuvery, et al., Infection and Immunity, 40, pág. 39·· -45 (1983) e estes materiais toxóides podem também ser utilizac
dos na presente invenção. Outros produtos veiculares apropriados são mencionados, por exemplo, na patente Norte-Americana n2. 4 575 495, incluindo vacinas, polímeros orgânicos, etc. A ί proteína purificada derivada da tuberculina (PPD) é particularmente prefirida para utilização no esquema de imunização activa ’’ pois (1) não induz por si própria a resposta da célula T (isto é, de facto um haptem da célula T) e no entanto comporta-se como um antigéno completamente processado e é reconhecido como tal pelas células T; (2) é conhecido como um dos melhores veículos de haptem no modo de reconhecimento ligado e (3) mais importante, pode ser usado em seres humanos sem mais ensaios .
Como agentes ligantes veiculares do naptem, convencionalmente utilizados na preparação de antigenes podem ser largamente utilizados .
A ligação covalente do pêptido ao material veicular imunogénico pode ser feita de uma maneira bem conhecida na ténica. Assin, por exemplo, para a ligação covalente directa é possível utilizar uma carbodiimida, de preferência, a diciclo-hexicarbodiimida ou l-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida como agente de acoplamento. 0 glutaraldeído pode também ser utilizado como meio de acoplamento vovalente ao pêptido ao material veicular imunogénico.
Nas composições acima indicadas, as proporções do haptem, agente ligante veicular do haptem e agente veicular podem ser apropriadamente determinadas mas prefere-se que o agente veicular seja empregue numa quantidade igual a cerca de 1 parte para 6 partes preferivelmente cerca de 1 para cerca de 5 partes em peso de haptem e o agente ligante veicular do haptem seja empregue numa quantidade igual a cerca de 5 até cerca de 10 vezes o número de moles de haptem. 11a reacção acima mencionada β
íè
C , o veículo é ligado ao heptem através do agente ligante veicular do heptano para se obter um antigene pretendido formado por um complexo péptido-agente veicular.
Depois de a reacção se ter completado, o imunogene assim obtido pode ser facilmente isolado e purificado por meio de um método de diálise, um método de filtração através de gel, método de precipitação fraccionada, etc.
Os péptidos usados na presente invenção podem ser facilmente sintetizados por processos em fase sólida bem conhecidos na técnica. Sínteses apropriadas podem ser realizadas usando os processos de T-boc” ou de P-moc.
Péptidos cíclicos são sintetizados pelo processo em fase sólida empregando o processo completamente automatizado bem conhecido de F-moc e da resina de poliamida, aparelho Biolynx LKB
Os seguintes exemplos ilustram a invenção.
Tween é uma marca registada.
EXEMPLO 1 - DETERMINAÇÃO DA CAPACIDADE DE LIBERTAÇÃO DE HISTAMINA DO CONJUGADO DE PÉPTIDO (P30)-KLH EM CÉLULAS INTERSTICIAIS DE RATOS
As células intersticiais peritoneais de rato são preparadas pela lavagem do peritoneu com tampão de HBT, com Ca++ livre, frio (solução de sal de Tyrode tamponada com Herpes).
Solução de sal de Tyrode tamponada com Hepes (concentrada x 10)
KaGl - 137 m M
KGl - 2,7 m M
NaH2P04.2H20
Glucose
MgCl26H20
CaCl2.2H2O
Hepes
Gelatina
| - | 0,4 m K |
| - | 5,6 m K |
| 0,5 m M | |
| - | 1 mM (não |
| 10 m M | |
| — | 1 mg ml”''· |
presente em HBT isento de Ca++)
A receita acima referida foi dissolvida e diluída em 1 litro de água destilada e guardada a -20aC até ser usada, para o que foi diluída 1 : 10 e o pH ajustado a 7,4 a 20sC por adição de NaOH 0,2M ou HC1 O,1M.
A suspensão celular foi centrifugada a 1200 rpm durante 5 minutos e ressuspensa em tampão HBT-Ca++, lavada novamente até foi finalmente suspensa em 2 ml de tampão HBT-Ca++. Uma pequena alíquota foi colorida com azul alciano e contada. As células foram usadas sem prévia purificação.
Um decapéptido (designado P30) de cadei £, sintético, humano, Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe-NH2 foi ligado com glu taraldeído a uma proteína transportadora (Hemocianina Keyhole Limpet (KLH), Sigma Chemical Co., Poole, Uorset). Um conjunto de tubos foi preparado contendo 100 yul de uma série de diluições, do conjugado F30-KLH, de 10”® a 10“^M (concentração de F30) e, em seguida, umaáLíquota (10<^ul) contendo 10”^ células intersticiais ml foi adicionada a cada tubo. Uma série de diluições similares foi feita com a forma não conjugada do pépti do F30, como forma de controlo.
Os tubos foram incubados a 372C durante 30 minutos, após a que foi adicionado 1 ml de tampão HBT com Ca++ livre, frio, a cada tubo e estes foram em seguida centrifugados, durante 5 min., a
ί
2000 rpm para parar a reacção. Os sobrenadantes foram decantados para outra série de tubos correspondentes contendo 0,25 ml de HC104 2M e adicionou-se 1,25 ml de HC104 0,4M aos agregados celulares para os separar.
A percentagem de histamina libertada das células intersticiais foi medida usando a análise espectrofluorométrica. A capacidade libertadora máxima do péptido livre foi grandemente reduzida quando este foi conjugado com K1H. Os resultados são apresentados na Tabela 1.
Tabela 1
Concentração de % de histamina libertada das células péptido (F30) de intersticiais do rato causado por
F30 F30-KLH
| 0 M | <10 | 410 |
| 10~®Μ | 15 | <10 |
| 10 7m | 10 | <10 |
| 10“ 6m | 15 | 10 |
| 10 5m | 50 | 15 |
| 10“ 4m | 70 | 22 |
/â' th
EXEMPLO 2-DETERMINAÇÃO DA CAPACIDADE LIBERTADORA DE HISTAMINA DOS PEPTIDOS F3O, F4O e F67 EM CÉLULAS INTERSTICIAIS DE RATO ISOLADAS
Foram ensaiadas quanto à sua capacidade indutora da libertação de histamina das células intersticiais de rato, isoladas de acordo com o método descrito no exemplo 1, três péptidos humanos de cadeia & sintéticos a forma linear não conjugada amidada F30, uma forma amidada dimerizada da anterior F67 e uma forma cíclica com ponte de cistina não amidada F40. Como pode ser visto pelos resultados da Tabela 2, tanto a forma cíclica F40, como a dimerizada F67, mostram uma capacidade libertadora de histamina menor do que a forma linear F30, embora na maior dose de teste (10“3) as actividades dos péptidos F40 e F30 fossem iguais.
Tabela 2
| Concentração de péptido | # de histamina libertada das células intersticiais de rato causada por; | ||
| F30 | F40 | F67 | |
| 0 M | 20 | 20 | 20 |
| 10-6M | 20 | 20 | 22 |
| 10 5M | 20 | 20 | 20 |
| 10 4m | 40 | 20 | 20 |
| io3m | 70 | 70 | 40 |
EXEMPLO 3 - PRODUÇÃO DE ANTISORO POLICLONAL (DE COELHOS)
CONTRA O DECAPEPTIDO (F3O) DE CADEIA 6 HUMANO
Ο P3O foi ligado ao KLH ou a um derivado proteico purificado de tuberculina (PPD) (Ministry of Agriculture, Pisheries and Food, Central Veterinary Labs., Veybridge), usando como agente ligante o glutaraldeído. A proteína transportadora (5 mg) e o pêptido sintético (3 mg) foram incubados com 21 mM de glutaral· deído (1 ml) durante 2-3 horas a 4°C.
Coelhos fêmeas, brancas neozelandezes (3,5 Kg Buxted Rabbit Co.) foram Imunizadas por injecção subcutânea de conjugado proteíco transportador de pêptido (250 ng) em auxiliar de Freund
completo. Injecções subcutâneas repetidas, em auxiliar de Freund imcompleto, foram feitas nos 14s e 282 dias.
Amostras de sangue foram tiradas 14 dias após cada injecção, sendo a actividade do anticorpo antipétpdido, do soro resultante, determinada por inibição ELISA e por ELISA directa (Burt, D. S., Hastings, G. Z., e Stanworth, D. R., Molecular Immunology,'23, págs. 181-191, (1986)), empregando placas flexíveis de micro-título de 96 cavidades (Falcon, Cowley, Oxford! A densidade óptica de cada cavidade foi medida a 492 nm (0D492) num leitor automático de placas (Multiskan MC, Flow Laboratories, Irvine, Scotland) ligado a um microcomputador BBC.
Os pontos finais da titulação ELISA apresentados pelo antisoro antipéptido F30 policlonal de coelho, por espécime, são dados na Tabela 3.
Tabela 3
| Diluição | NRS | Leitura ELISA OD | 492 | ||
| do soro | Coelho 1 | Coelho 2 | Coelho 3 | Coelho 4 ' | |
| Nula | 0,805 | 1,673 | 1,804 | 1,710 | ! 1,675 |
| 1 : 5 | 0,434 | 1,751 | 1,894 | 1,865 | 1,700 |
| 1 ; 25 | 0,108 | 1,805 | 1,944 | 0,894 | 1,652 |
| 1:125 | 0,023 | 1,367 | 0,859 | 0,164 | 0,404 |
| 1:625 | 0,000 | 0,306 | 0,110 | 0,042 | 0,069 |
| 1:3125 | 0,000 | 0,054 | 0,003 | 0,013 | 0,005 |
| NRS - soro | normal de coelho | ||||
| Os coelhos | 1 e 2 | foram imunizados com | conjugado | péptido (F30)- | |
| -KLH. | |||||
| Os coelhos | 3 e 4 | foram imunizados com | conjugado | péptido (F30)- |
-PPD.
EXEMPLO 4 - TAXA DE ACTIVIDADE ANTIALERGICA DO ANTISORO
ANTIPEPTIDO P3O DE COELHO (a) ánálise^ln vitro - Sistema_de_células_intersticiais jperi.í°£eais_de_rato
Análises in vitro foram feitas pela determinação da capacidade do antisoro antipéptido P3O policlonal para inibir a acção liDertadora de histamina do decapéptido P3O humano de cadeia f Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Val-Phe-NH2 nas células inters· tiais de ratos, quando apresentado junto ao péptido.
Alíquotas (150 jal contendo aproximadamente 10^ células de células intersticiais de peritoneais, purificadas, de rato, em so-j lução de Tyroide tamponada com hepes (HBTE), com Ca++, foram ) incubadas durante 15 minutos a 37»O na presença de una mistura de iguais volumes (100 ml) de solução de decapéptido (10 ΊΑ) e antisoro de coelho (contra o péptido F30), diluído 1 : 4, 1 : 8 ou 1 : 16. Em seguida, adicionaram-se 650yul de tampão HBT com Ca++ livre e a suspensão foi centrifugada (a aproximadamente 500 g durante 10 min.), a quantidade de histamina libertada para o sobrenadante foi determinada por um processo convencional automatizada espectrofluormétrico.
A inibição máxima (ou seja, 90 %) da capacidade libertadora de histamina do péptido (10-¾) surgiu quando se usou a diluição 1 ; 4 de antisoro anti-F30 policlonal de coelho (como se indica na Tabela 4)
Tabela 4
| Inibição da capacidade libertadora de histamina do E30 por antisoro anti-F30 | |||
| policlonal in vitro Histamina libertada % | Inibição % | ||
| Soro normal | de coelho | 29,4 | 0 |
| diluição de | antisoro | ||
| antipéptido | policlonal | ||
| 1 : 4 | 7,3 | 75 | |
| 1 ί 8 | 8,3 | 72 | |
| 1 ; 16 | 18,4 | 38 |
tf
(b) Análises in vitro - Estudos da.. ^-?4bição anafilática cutâ(i) Administração de antisoro antipéptido F30 de rato com soro sensibllizante alérgico
Uma mistura foi feita de iguais volumes, antisoro antipéptido de coelho e soro de um rato sensibilizado experimentalmente à ovalbumina. Aliquotas (0£2 ml) de diferentes diluições da mistura (i. e. nula, 1 : 2 1: 4, 1 : 8, 1 : 16 e 1 : 32) foram injectadas intramermicamente em 2 ratos machos Wistar. Depois de 48 horas foram testados por injecção intrapernal de uma mi tura (0,25 ml de cada) de solução de ovalbumina (20 jag/ml) e solução azul de Evan (1 $). Foram mortos 1,5-2 horas depois e as suas peles foram removidas e examinadas do lado de dentro.
As reacções que provocam a cor azul (PCA) foram medidas e comparadas como as produzidas em dois animais de controlo similarmente infectados com a mistura de soro sensibilizado de rato e soro de coelho. As reacções que provocam a cor azul foram consideravelmente reduzidas como os valores de PCA, na Tabela 5, indicam.
Tabela 5
Valor de PCA soro administrado com soro sensibllizante (antiovalbumina)
| Diluição da mistura de soros administrados | antisoro antipéptido | soro normal de coelho |
| Nula | 2 | 3 |
| 1 : 2 | 0 | 3 |
| 1 : 4 | 0 | 1 |
| 1 : 8 | 0 | 0,5 |
I I (ii) Administração do antisoro antipéptido (P30) de coelho (a) com (b) dois minutos antes de ou (c) dois minutos depois do alcrgeno (ovalbumina) que os vai testar.
Ratos (Wistar) foram injectados intradermicamente com diferentes diluições (nula, 1 : 2, 1 : 4, 1 : 8 e 1 : 16) de soro de um rato experimentalmente sensibilizado à ovalbumina. Depois de 46 horas um grupo (a) foi injectado intrapenalmente com uma mistura (1 : 1) de iguais volumes (0,25 ml) de ovalbumina (2 mg/ml) em azul de Evans/2 /) e antisoro antipéptido (?30) de coelho, outro grupo (b) foi injectado intravenosamente com antisoro antipéptido (F30) de coelho (0,25 ml) e minutos antes da injecçãc intravenosa com 0,25 ml de uma mistura (1 : 1) de ovalbumina (20 mg/ml) em azul de Svan^(2 %). Um terceiro grupo de ratos (c) foi injectado intravenosamente com antisoro (0,25 mi) antipéptido (F30) de coelho, 2 minutos depois da injecção intravenosa com 0,25 ml de uma mistura de (1 : 1) ovalbumina (20 g/ml) e azul de Evans (2 /). Os animais foram mortos e as
I suas peles removidas e examinadas no interior.
Cs resultados obtidos são resumidos na Tabela 6, na qual a intensidade da cor azul (PCA) observada foi ordenada por um slsi .
!tema +/-.
! 7 a b e 1 a 6
Resposta PCA observada na pele,.injectada
| Protocolo experimental | com soro sensibilizado de rato, | à ovalbu- 1:16 | |||
| mina, diluido | 1:8 | ||||
| Xula | 1:2 | 1:4 | |||
| a | 5,CC | 3,00 | 0,75 | 0,25 | 0,00 |
| i b 1 | 5,30 | 4,00 | C.75 | 0,C0 | 0,00 |
| í C | ó, CC | 4,75 | 2,25 | 0,75 | o,cc |
| i controlo | 3, CC | 4.:25- | ... JzÇ.o. | 1.75 | 0.25 |
I
No controlo foi injectado anti-^02 (cadeia Jf) policlonal, em vez do anti-?30.
Como será notado destes dados, a administração do antisoro antipéptido de coelho (em oposição ao soro normal de coelho) leva a uma redução da sor azul nos sítios injectados com as variadas soluções de soro senbibilizante. A inibição foi mais marcada nos ratos passivamente sensibilizados, que receberam o antisoro antipéptldo simultaneamente com o antigene que o vai testar (grupo a) do que naquelee que (grupo b) receberam o antisoro antipéptldo antes ou que (grupo c) receberam a antisoro antipéptldo depois do antigene que os vai testar.
EXEMPLO 5 - IMUNIZAÇÃO ACTIVA COM DECAPEPTIDO (F30) DS CADEIA í HUMANO USANDO CFA Ε IPA COMO AUXILIARES Ε A SUA TíPLUENCIA NC ESTADO DE HIPERSENSIBILIDALE DE RATOS EXPERILSNTALMENTE SENSIBILIZADOS
I (a)
Grupos de ratos (Wlstar, machos) foram hipersenaibilizados por injecção subcutânea de uma mistura (0,5 ml) de 0,5 ml de clara de ovo de galinha (200 mg de proteínas) e 2,5 ml de Bordetella i pertus8ls (40 1010 organismo/ml) por um processo experimenI tal bem conhecido (Jasani, 3. e Stanworth, D. R., Journal of j Immunological Methods, 30, pasg. 55-68 (1979)). Isto resultou
I * ! na sensibilização, por anticorpo IgE, das células interstlciaip dos seus tecidos, e o surgir de altos níveis de ovaibumina diz-nos que existe anticorpo IgE na circulação.
!(h)
Processo de
Grupos de ratos foram imunizados com o conjugado péptido ?30-proteína transportadora (KLH ou PPD), antes ou depois da sua sensibilização (como descrito no exemplo 3(a) acima) de acordo com o seguinte protocolo: primeiro os animais foram injectados com uma mistura (200yul) de conjugado péptido-proteína transportadora (1 mg/ml) emulsionado com um volume igual de auxiliar de Preund completo (CFA). Injecções repetidas, subcutâneas, do conjugado péptido-proteína transportadora, misturado com auxiliar de Breund (CFA), foram dadas no 14s e 21-2 dias.
(c) Análise do_ soro_de_.ratos imunizados:
(i) - Resposta do antipéptido (F30)
A actividade do anticorpo antipéptido (F30) associada com os isótopos principais de imunoglobulina, e subclasses de IgG, foi determinada por ELISA (imunoanálise de enzimas ligadas).
As placas de análise flexíveis de 96 cavidades foram revestidas com péptido F30. Alíquotas (120yul) de uma solução 2,5 yUM do péptido foram incubadas durante 1 hora a 372C. As placas foram então lavadas com tampão PBS (sal tamponado de fosfato)/ /tween. Alíquotas (100 yul) de soro do rato de ensaio, começando com diluição 1 : 4 e duplicando a diluição daí em diante, foram adicionadas às placas revestidas com péptido F30. As placas foram incubadas durante 1 hora a 37SC. Soro normal de rato foi utilizado como controlo. As placas foram lavadas com tampão (0,05 %) PBS/tween. 100 ^ul de IgG, IgM, IgA e IgE de ca bra-anti-rato foram juntas numa diluição de i : 1000. Os anticorpos foram diluídos em tampão (0,05 fi) PBS/tween. As placas foram incubadas durante 1 hora a 379C, antes de serem lavadas como foi acima descrito.
Alíquotas (100 ^ul) de IgE rato-anti-cabra, rotulado com peroxidase cocleária diluída 1 : 1000 com PBS/tween foram adicionadas às placas e incubadas durante 1 hora a 37SC. As placas /? , r ,! ',
Λ /. '*“%' '* ' foram lavadas como antes e adicionaram-se aliquotas de 100 yUl de substrato contendo 20 mg de o-fenilenodiamina, 250 ^ul de Η2θ2 e 5° ml ^e tampão citrato-fosfato (pH 5,0). A reacção enzimática colorida foi deixada decorrer durante 5-15 minutos antes de ser interrompida pela adição de 25 /ul de ^SO^ 4N a todas as cavidades. A densidade óptica dos componentes de cada cavidade foi lida a 429 nm (0L492) num leitor automático de placas Titerek.
Resultados típicos são dados na Tabela 7.
Tabela 7
IgG anti-F30 total Libertação de histamina (ng/ml) em máximo do ELISA OL ratos vacinados em ensaios in vivo (OD492) com ovalbumina
| CA 89 | 0,06 | 333 |
| A 89 | 0,75 | 70 |
| CB 89 | 0,03 | 2110 |
| B 89 | 0,33 | 200 |
A89: grupo de ratos imunizados com conjugado péptido-KLH antes da sensibilização experimental.
B89: grupo de ratos imunizados depois da sensibilização experimental
CA89 e CB89: grupo de ratos não imunizados de controlo respect vo.
(ii) Re sj?osta_da_ IgE_ ant i ovalbumina
A resposta da IgE antiovalbumina (i. e. alergeneo) dos ratos também foi determinada por ELISA.
Placas de análise flexíveis de 96 cavidades foram revestidas com ovalbumina por incubação, durante 1 hora a 37SC, com alíquotas (120yul) de uma solução de 5yUg.ml de ovalbumina em PBS, Depois de lavar as placas com PBS/tween 0,05 %, adicionaram-se às placas revestidas de ovalbumina 100 ^ul de soro de ensaio de rato, começando com diluição 1 : 4 e duplicando daí para a frente. As placas foram então incubadas durante 1 hora a 372C. Soro normal de rato foi usado como controlo. Depois de lavar com PBS/tween 0,05 % adicionou-se às placas, numa diluição de 1 ; 1000 em PBS/ tween, IgG (Pc)/cabra-anti-nato. As placas foram então incubadas durante 1 hora a 37SC. Depois de lavadas com PBS/tween 0,05 % foram adicionadas, numa diluição de 1:100' em PBS/tween, alíquotas (100 yul) de peroxidase cocleária/IgG/ /coelho-anti-cabra e as placas foram novamente incubadas duranjte 1 hora a 37SC. Depois da incubação as placas foram lavadas como anteriormente. Alíquotas (100 yul) de substrato foram adicionadas, sendo o substrato constituído por 20 mg de o-fenilenodiamina, 250 ^ul de H2O2 θ 50 ml de tampão citrato-fosfato 0,15 M (pH 5,0). A reacção enzimática colorida foi interrompida após 5-15 minutos para melhor definição da cor, com a adição de 25 ul de HgSO^ 4M em todas as cavidades.
A densidade óptica dos componentes de cada cavidade foi lida a 492 nm (0D492) num leitor de placas automático Titertek.
Resultados típicos, mostrando 0 efeito de pré ou pós-imunização com decapéptido (P30) humano de cadeia nos níveis de anti-ovalbumina IgE circulante de ratos experimentalmente sensibilizados à ovalbumina comparados com os níveis de antiovalbumina de controlo (não imunizados peptidicamente) em ratos experimentalmente sensibilizados, são mostrados na Tabela 8.
| T a b e la | 8 |
| Diluição de IgE 1 ; 32 | 0D492 |
| CA 89 | 0,548 |
| A 89 | 0,274 |
| CB 89 | 0,777 |
| 8 89 | 0,644 |
AS9:
grupo de ratos sensibilização imunizados com conjugado F2O-KLH antes da experimental
CA89: não Imunizados
ÍB89 grupo de ratos imunizados depois da sensibilização experimental
C289: controlos não imunizados (d) - Apreciação do efeito da produção de anticorpos anti-p^ptί doe F30 no estado dos ratos em condição de hlpersensiblil^»^** 0 efeito da pré cu pós-imunização com péptido (coso foi descrito na secção (b) acima) no estado de hicersensibilidade em ratos que tinham sido experimentalmente sensibilizados à ovalbumina (de acordo com o exemplo 5(a) acima) foi determinado pelo processo seguinte. Investigações similares foram feitas, como controlo, em grupos de ratos não imunizados.
i
I |Animais dos dois grupos, imunizados e controlo, foram sangrajd03 (pela veia da cauda) antes do desafio com aiergeno, sisté•mico, provocado por injecção intraperitoneal de ovalbumina (5
cg). Os animais foram mortos 10 min. depois, quando mais uma amostra de sangue foi tirada dos seus corações. Os níveis de histamina no soro, pré ou pós-desafio com alergeno, foram determinados por um processo espectrofluormétrico modelo automático. A gama de anticorpos do soro foi determinada por ELISA (de acordo com o exemplo 5(c) acima).
i - Efeito da pré ou rós-imunização com péptido de cadela 6 homano ?30.
A pré-imunização de grupos de ratos (com 6 cada) com conjugado j péptido-KLH resulta numa redução substancial do nível médio de histamina no soro, proveniente da indução com alergeno; como será visto dos dados por espéceiee da Tabela 7, onde os níveis médios de histamina observados na resposta ao desafio com alergeno (ovalbumina) foram de 7C ng/ml comparados a um valor médio de 330 ng/ml do grupo de controlo.
Pós-imunização de grupos de ratos (com 6 cada) com conjugado péptido-KLH apresenta uma redução mais dramática do nível de {histamina induzida pelo alergeno, dum nível médio de 2100 ng/ /ml dos animais controlo para 200 ng/ml nos animais teste, os dados são também indicados na Tabela 7.
ílatos pré- e pós-imunizados com péptido têm resposta de anticorpos antipéptido IgM e IgG pronunciadas (ver Tabela 7) em contraste com os grupos de ratos de controlo, embora náo apresentem resposta anticorpo antipéptido IgE. Cinco de seia ratos pós-imunizados, que não mostraram sinais nem de reacções adversas ao desafio sistémico com alergeno (ovalbumina), nem autento significativo na sua linha base de nívei de histamina no soro, possúhm quantidades elevadas de anticorpos antipéptido {?3C IgG e Igk* no seu soro. 0 sexto rato imunizado que mostrou
I
Í!
I um aumento do nível de hietamina no soro, depois do desafio con alergeno, não possuía quantidades apreciáveis de anticorpo antipéptido na sua circulação. Num contraste dramático, dois ratos controlo sensibilizados (não imunizados peptldicamente) morreram de choque anafilátlco dois minutos após o desafio com alergeno.
Também valores de resposta de anticorpos IgE contra ovalbumina (i. e. o alergeno experimental) de ratoe pré e pós-imunizados comparadas com as dos grupos de controlo, revelaram uma diminuição significativa no nível de IgE anti-ovalbumina circulante, resultante da pré-imunização com o péptldo (como se indica na Tabela 8).
ii Efeito da pré ou pós-imunlzação com decapéptldo de oadela
Ç de rato (P49) ou um não libertador de histamina análogo
ÍZ521
I
Estudos de pré e pós-imunização com péptldo em ratos experimentalmente sensibilizados, áimilares aos descritos acima, foram feitos empregando como imunogéno um decapéptldo de cadeia £ de rato P49 (Lys-Tyr-Asn-Gly-Ser-Aen-Gln-Arg-?he-Phe-Ile-Phe-NH2) ou um análogo (F57) em que o resíduo N-terminal de Usina foi substituído por glicina.
Pré-imunização com conjugado péptldo (F49)-PPD resultou num ίnível médio de histamina no soro, induzida por um alergeno, que é reauzido a zero quando comparado com o nível médio 300 ng/ml apresentado pelo grupo de ratos do controlo (não imunizados peptldicamente) presente na Tabela 9, enquanto isto, a pós-imunização com conjugado péptldo-ΡΡΏ mostrou uma redução no nível de histamina, induzida pelo alergeno, no soro de 950 ng/ í/ml nos animais de controlo para 50 ng/ml nos testados.
Em constraste, a pré ou pós-imunização de ratos, experimentalI mente sensibilizados, com o análogo (F57) do decapéptido de cadeia de cato (F49) não mostrou efeito significativo na libertação de histamina, induzida pelo alergeno, como se verifica na Tabela 9.
Tabela 9
Histamina libertada ng/ml
| Controlo | A | 300 |
| F49A | 0 | |
| F57A | 606 | |
| controlo | 3 | 950 |
| F49B | 50 | |
| F57B | 1159 |
A a Imunizados com pêptido antes da sensibllzaçio experimental
B 3 Imunizados com pêptido antes da sensibilzação experimental
F49 dodeceapéptido de rato, libertador de histamina i F57 Análogo, do dodecapéptido de rato F49, não libertador de histamina.
EXEMPLO 6 - IMUNIZAÇÃO ACTIVA COM PEPTIDO (F30) USANDO COMO AUXILIARES AL(OH), e CP.2O,961 i
í (a) Processo de sensibilização:
— Os grupos de ratos sensibilizados como se descreveu no Exemplo 5(a) (b) iniuniza£ão_]3e£tídica:
Grupos de ratos sensibilizados foram imunizados com conjugado de proteína veicular do péptido sintético F30 (PPD usado como conjugado). Os animais foram injectados subcutaneamente com uma mistura 5200ytil) de péptido-PPD (1 mg/ml) emulsionado num volume de auxiliar Al(OH)^ igual. Este processo foi repetido no 142 dia. No 352 dia sangraram-se pela cauda os ratos e o total de anticorpo antipéptido foi medido por ELISA, como des) crito no Exemplo 5(c).
Os resultados são apresentados na Tabela 10
| T a b | ela | 10 | ||||||
| Rato | 0L492 | |||||||
| ηδ. | 1:2 | 1:4 | Diluição 1:8 1:16 | do soro 1:32 | 1:64 | 1:128 | 1:256 | |
| 1 | 1,10 | 0,20 | 0,40 | 0,50 | 0,55 | 0,50 | 0,45 | 0,30 |
| 2 | 0,45 | 0,55 | 0,70 | 1,00 | l;10 | 1,10 | 1,00 | 0,79 |
| 3 | 0,60 | 0,65 | 0,85 | 0,90 | 0,95 | 0,75 | 0,65 | 0,40 |
| 4 | 0,65 | 0,95 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 0,80 | 0,40 |
| 5 | 0,75 | 0,90 | 0,95 | 1,05 | 1,40 | 1,45 | 1,50 | 1,20 |
(c) Processo_de_imunização_j>e_ptídica_-_amina_lípida CP 20^961 .£sada_çomo_ auxiliar
A imunização de ratos foi feita de acordo com (b) acima. Luas
injecções subcutâneas de conjugado péptido-PPD (500yul) emulsionado no auxiliar amlna líplda CP20,961, foram dadas no dia zero e no 4a. Ho 359 dia, sangrias pela cauda foram feitas e o anticorpo antlpéptido total foi determinado por ELISA. Os resultados são apresentados na Tabela 11.
| T a b e a 1 a | 1 | |||||||
| j Rato na. | 1:2 | 0D492 | 1:32 | 1:64 | 1:128 1:256 | |||
| Diluição do | soro 1:16 | |||||||
| 1:4 | 1:8 | |||||||
| 1 | 0,08 | 0,36 | 0,70 | 0,80 | 0,80 | 0,90 | 0,80 | 0,70 |
| 2 | 0,40 | 0,75 | 0,90 | 0,90 | 1,00 | 0,90 | 0,80 | 0,70 |
| 3 | 0,45 | 0,80 | 0,85 | 0,90 | 0,85 | 0,80 | 0,80 | 0,70 |
| 4 1 | 0,70 | 0,00 | 0,95 | 1,10 | 1,15 | 1,10 | 0,85 | 0,80 |
| |5 | 0,70 | 0,85 | 1,00 • | 1,20 | 1,50 | 1,30 | 1,20 | 0,80 |
EXEMPLO 7 - PRODUÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLOWAIS DS MORINA
Ratos BALB/c foram lnjectados intraperitonealmente (i.p.) com péptido F30 livre (lOO^ug) ou péptido P3O conjugado por tratamento com glutaraldeido a um agente veicular proteico PPD) emulsionado, em Iguais volumes de auxiliar de Preand completo. Repetiram-se as injecções no 14a e 28a dias com péptido (conjugado de) emulsionado em auxiliar de Preund incompleto. Amostras da sangue foram tiradas da cauda, a partir do 28a dia, e foram ensaiadas por ELISA indirecto para verificar ou não a
presença de anticorpos antipéptido . Três dias antes da fusão, ratos que apresentavam maiores quantidades de anticorpos no soro receberam uma injecção extra (i.p.) de 100 ^ug de péptido ou conjugado de péptido (100 ml) num volume igual de PBS, pH 7,2.
/b)__2__
Ratos hiperimunizados foram mortos por deslocação cervical, as suas bílis removidas e as células isoladas e lavadas. As células de bílis foram então fundidas com uma célula de mieloma de rato (Ag. 8.653 ou NSO/1) de uma cultura com crescimento logarítmico. Por modificações do método de Kõhler e Milstein (Kõhle
G. e Milstein, C., Nature (Londres) 256, pags 495 (1975)), células da bílis foram fundidas com as de mieloma na proporção de 2:1 respectivamente, usando PEG 40 % (polietileno glicol peso molecular 1450). A suspensão da fusão foi distribuída por placas de 96 cavidades e cultivada num meio contendo HAT (hipoxantina, aminopterina e timidina).
Depois do 10s. dias examinaram-se as placas à procura do crescimento de hibridomas. 0 sobrenadante, removido destas células foi examinado, por ELISA indirecto, à procura de anticorpos antipéptido.
lO^^^^Çloniza^ão
Quando cavidades positivas eram identificadas como produtoras do anticorpo desejado, as células híbridas eram duplicadas por diluição limitada e os clones eram de novo ensaiados. Os hibri· domas podem ser cultivados em frascos ou crescerem nos ratos. Uns dias antes de se injectarem os ratos BALB/c já com pristano (0,5 ml injectados i.p.) com 10-10' células híbridas, aumentou-se o fluído ascítico.
A formação de tumores deveria resultar após 2-4 semanas e o fluído ascítico acumulado retirado pela introdução de uma agulha hipodérmica na cavidade abdominal do rato. A concentração de anticorpo monoclonal no fluído ascítico foi determinada em cada passagem de tumor, variando entre 5 e 15 mg/ml.
^P2_2_Ensaio meio de cultura e o fluído ascítico foram examinados à procura de actividade de anticorpos monoclonais antipéptido (F30) por ELISA indirecto, usando placas de micro-título cobertas como descrito acima no Exemplo 5(c) (para a detecção de anticorpos antipéptido nos ratos). 0 segundo passo envolveu a incubação a 37SC durante 1 hora com diluição 1:1000 de IgE (total) antimurina de cabra rotulada com peroxidase; o seu desenvolvimento foi seguido da maneira convencional.
Os dados ELISA por espécime são apresentados na Tabela 12.
Tabela 12
Fluído Ascítico Leitura ELISA (OL 492)
DEC 1B DEC
| 1:40 | 1,597 | 1,322 | 1,693 | 1,068 | 1,305 |
| 1:80 | 1,567 | 1,327 | 1,473 | 1,102 | 1,235 |
| 1:160 | 1,557 | 1,395 | 1,329 | 1,087 | 1,092 |
| 1:320 | 1,475 | 1,295 | 1,218 | 0,994 | 0,922 |
| 1:640 | 1,266 | 1,192 | 1,025 | 0,642 | 0,713 |
| 1Ú280 | 1,015 | 0,808 | 0,948 | 0,234 | 0,511 |
| 1:2560 | 0,630 | 0,681 | 0,910 | .0,1.40.. | 0,300 |
Tabela 12 (continuação)
Hibridoma 1,342 0,923 1,020 1,355 1,079 sobrenadante (diluição 1:4)
Claims (14)
- R_E_I_Y_I_N_L_I_G_A_S_Õ_E_S lã. - Processo para a preparação de uma composição contendo um imunogeno, caracterizado pêlo facto de o citado imunogeno compreender um resíduo de um péptido libertador da histamina, o qual compreende uma cabeça de terminal N catiónica e uma cauda de terminal C hidrófoba, em conjunto com um resíduo capaz de fazer surgir anticorpos contra o referido péptido enquanto inibe a libertação da histamina pelo citado péptido.
- 2* 2 3 4 S. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de, no citado imunogeno, o terminal C, ser bloqueat j do por amidação.
- 3â. - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracte· rizado pelo facto de a cauda de terminal C compreender uma sequência Phe-Phe.
- 4ã. - Processo de acordo com as reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo facto de a cabeça do terminal N compreender uma sequência Lys-Thr-Lys.
- 5â. - Processo de acordo com as reivindicações 1, 2, 3 ou 4, caracterizado pelo facto de a cabeça de terminal N ser separada da cauda de terminal C por 2 a 6 resíduos de aminoácidos não hidrófobo e predominantemente não polar.
- 6®. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de a cabeça de terminal N ser separada da cauda de terminal C por uma sequência Gly-Ser-Gly.
- 7Ô. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo lacto de o resíduo do péptido que liberta a histamina ter a seguinte sequência:Lys-Thr-Lys-Gly-S er-Gly-Phe-Phe-Vai-Phe.
- 8â. - Processo de acordo com a reivindicação i, caracterizado pelo facto de o resíduo do péptido libertador da histamina pos suir uma das seguintes sequênciasLy s— Thr- L y s-G1 y- S e r- G1 y- Phe- PheArg-Lys-Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-PheLys-Thr-Lys-Gly-S er-Gly-Phe-Phe-Val-Phe-S e r-Arg, ouLys—Thr-Lys-Gly-Ser-Gly-Phe-Phe-Vai, ou um composto análogo do referido péptido, libertador da histamina, amidado ou não amidado.
- 9â. _ Processo de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5,6, 7 ou 8, caracterizado pelo facto de o mencionado imunogeno ter a forma de um pêptido polimérico, no qual o resíduo de uma molécula do pêptido constitui o referido resíduo do pêptido libertador da histamina, e o saldo constitui o resíduo para suscitar anticorpos.102. _ Processo de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, caracterizado pelo facto de o resíduo que suscita os anticorpos compreender o resíduo de composto conjugado ao pêptido libertador da histamina.lis. -wProcesso de acordo com as reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo facto de o imunogeno ser usado em tratamentos antialérgicos.122. - Processo para a preparação de uma composição para tratamento das alergias, caracterizado pelo facto de se incluir um imunogeno de acordo com as reivindicações 1 a 10, e um adju vante.
- 13a. - Processo de acordo com as reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo facto de se empregar um ligando que compreende um sector de anticorpos específico para um pêptido libertador da histamina, sendo o citado sector de anticorpos também reactivo com a sequência de aminoácidos na cadeia pesada de IgE, a qual compreende o sinal de disparo para a libertação da histamina.
- 14a. - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de se empregar um ligando com a forma de um anti- corpo monoclonal.
- 15a. - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo facto de se empregar um ligando com a forma de um frag mento Fab’ do citado anticorpo.
- 16s. - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo facto de se empregar um ligando com a forma de um fragmento P(ab’)2 do citado anticorpo.
- 17a. - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 13 a 16, caracterizado pelo facto de se empregar um ligando nos tratamentos antialérgicos.Lisboa, 15 de Junho de 19900 Agente Oficial da Propriedade Industrial
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| JP3156237B2 (ja) * | 1991-12-24 | 2001-04-16 | 雪印乳業株式会社 | 抗ヒトＩｇＥ モノクローナル抗体 |
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| US5958708A (en) * | 1992-09-25 | 1999-09-28 | Novartis Corporation | Reshaped monoclonal antibodies against an immunoglobulin isotype |
| JPH06113881A (ja) * | 1992-10-07 | 1994-04-26 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | ヒト型モノクローナル抗ペプチド抗体及びこれをコードするｄｎａ |
| WO1994014463A1 (en) * | 1992-12-21 | 1994-07-07 | The Uab Research Foundation | Compositions and method for the inhibition of phagocytes |
| US5759551A (en) * | 1993-04-27 | 1998-06-02 | United Biomedical, Inc. | Immunogenic LHRH peptide constructs and synthetic universal immune stimulators for vaccines |
| JP3795914B2 (ja) * | 1993-04-27 | 2006-07-12 | ユナイテッド・バイオメディカル・インコーポレイテッド | ワクチン用免疫原性ｌｈｒｈペプチド構築体および合成普遍免疫刺激器 |
| CN1146772A (zh) * | 1994-03-28 | 1997-04-02 | 美国联合生物医学公司 | 用于治疗过敏反应的合成肽免疫原 |
| GB9412714D0 (en) * | 1994-06-24 | 1994-08-17 | Lewin Ian V | T cill epitopes |
| GB9416321D0 (en) * | 1994-08-12 | 1994-10-05 | Peptide Therapeutics Ltd | Peptides and antibodies and their use in treatment of carcinomas |
| GB9417086D0 (en) * | 1994-08-24 | 1994-10-12 | Peptide Therapeutrics Limited | Screen for potential therapeutic compounds |
| GB9422294D0 (en) * | 1994-11-04 | 1994-12-21 | Peptide Therapeutics Ltd | Peptides for anti-allergy treatment |
| GB2304347A (en) | 1995-08-11 | 1997-03-19 | Boeringer Ingelheim Vetmedica | Antigenic preparations |
| ES2190799T5 (es) | 1996-03-01 | 2008-08-16 | Novartis Ag | Inmunogenos peptidicos para vacunacion y tratamiento contra la alergia. |
| US20010007771A1 (en) * | 1996-05-29 | 2001-07-12 | Sean M. Sullivan | Cationic polymers and lipids for the delivery of nucleic acids |
| GB9724531D0 (en) | 1997-11-19 | 1998-01-21 | Smithkline Biolog | Novel compounds |
| US6913749B2 (en) * | 1998-11-02 | 2005-07-05 | Resistentia Pharmaceuticals Ab | Immunogenic polypeptides for inducing anti-self IgE responses |
| US6573372B2 (en) | 1999-01-07 | 2003-06-03 | Heska Corporation | Feline immunoglobulin E molecules and compositions there of |
| EP2361635A3 (en) | 2000-08-30 | 2011-09-14 | Pfizer Products Inc. | Anti IgE vaccines |
| US7264810B2 (en) * | 2001-01-19 | 2007-09-04 | Cytos Biotechnology Ag | Molecular antigen array |
| GB0109297D0 (en) | 2001-04-12 | 2001-05-30 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vaccine |
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| RU2191602C1 (ru) * | 2001-06-01 | 2002-10-27 | Эпштейн Олег Ильич | Лекарственное средство и способ лечения аллергических и псевдоаллергических реакций |
| EP2196217A1 (en) | 2001-09-14 | 2010-06-16 | Cytos Biotechnology AG | Packaging of immunostimulatory substances into virus-like particles: method of preparation and use |
| DE60336902D1 (de) | 2002-07-19 | 2011-06-09 | Cytos Biotechnology Ag | Impfstoffzusammensetzungen enthaltende amyloid beta 1-6 antigenarrays |
| ES2381617T5 (es) | 2002-08-14 | 2016-02-24 | Macrogenics, Inc. | Anticuerpos específicos frente a FcgammaRIIB y sus procedimientos de uso |
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| PL2401300T3 (pl) * | 2009-02-25 | 2018-07-31 | Academia Sinica | Przeciwciała anty-C[epsilon]mX zdolne do wiązania z ludzkim mIgE na limfocytach B |
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Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE2602443A1 (de) * | 1975-04-04 | 1976-10-21 | Univ California | Biologisch aktive polypeptide |
| US4171299A (en) * | 1975-04-04 | 1979-10-16 | The Regents Of The University Of California | Polypeptide agents for blocking the human allergic response |
| EP0000252B1 (en) * | 1977-06-29 | 1982-02-03 | Beecham Group Plc | Peptides, pharmaceutical compositions containing the peptides and a process for the preparation of the peptides |
| US4579840A (en) * | 1983-08-12 | 1986-04-01 | Immunetech Pharmaceuticals | Method of blocking immune complex binding to immunoglobulin Fc receptors |
| US4683292A (en) * | 1983-08-12 | 1987-07-28 | Immunetech, Inc. | Immunotherapeutic polypeptide agents which bind to lymphocyte immunoglobulin FC receptors |
| AU1484688A (en) * | 1987-02-20 | 1988-09-14 | Imclone Systems, Inc. | Monoclonal antibodies in vaccine formulations |
| CA1336818C (en) * | 1987-04-16 | 1995-08-29 | International Institute Of Cellular And Molecular Pathology | Treatment of allergy and composition thereof |
| GB8727045D0 (en) * | 1987-11-19 | 1987-12-23 | Research Corp Ltd | Immunoglobulin e competitor |
| JPH0742313B2 (ja) * | 1988-03-28 | 1995-05-10 | 日立化成工業株式会社 | 新規ペプチド、その塩及びペプチド性抗アレルギー剤 |
| DE69112225T2 (de) * | 1990-05-25 | 1996-01-04 | Peptide Therapeutics Ltd | Immunodiagnostische probe für gelenkrheumatismus. |
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