PT94064B - Processo para a preparacao de novos conjugados de antraciclina que comportam um novo ligante e de composicoes farmaceuticas que os contem - Google Patents

Description

O presente pedido de patente de invenção constitui uma continuação em parte do pedido de patente de invenção co-pendente Norte Americano, série n^s 270.509 requerido em 16 de Novembro de 1988, que por sua vez constitui uma continuação em parte do pedido de patente de invenção co-pendente Norte Americano série n^s 155.181 requerido em 11 de Fevereiro de 1988 no United States Patent and Trademark Office, aqui incorporados pela sua referência completa.

Como técnico da invenção:

A presente invenção refere-se a novos conjugados de antraciclina e nos métodos para a sua preparação. Mais particularmente, esta invenção refere-se a conjugados que contêm pelo menos uma molécula de antraciclina ligada a uma segunda molécula que reage com uma população escolhida para ser eliminada, estando a antraciclina ligada à molécula da célula reactiva através de uma ligação 13-cetolacihidrazona.

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Assim, de acordo com um aspecto da presente invenção, o conjugado consiste num anticorpo que reage com uma população celular escolhida para se eliminar, tendo este anticorpo umas tantas moléculas de antraciclina citotóxicas ligadas por convalência na sua estrutura. Cada molécula de antraciclina está conjugada com um anticorpo através de uma estrutura adaptadora, estando a antraciclina ligada a esta estrutura adaptadora através de uma ligação acil-hidrazona sensível a ácido na posição 13ceto da antraciclina. Um aspecto preferido desta invenção refere-se a um imunoconjugado de adriamicina em que a adriamicina se liga à estrutura adaptadora através de uma ligação de acil-hidrazina na posição 13-ceto. 0 adaptador contém, adicionalmente, uma ligação dissulfureto ou tioéter como parte de uma ligação de anticorpo ao imunoconjugado.

De acordo com um outro aspecto da presente invenção , a molécula de antraciclina está conjugada através de uma estrutura adaptadora a um ligando, como por exemplo o factor de crescimento epidérmico (EGF) ou bombezina, estando a antraciclina ligada ao adaptador através de uma ligação de acil-hidrazona sensível a ácido na posição 13-ceto de antraciclina. 0 adaptador pode conter ainda uma ligação dissulfureto ou tioéter na sua estrutura. Além disso, de acordo com a presente invenção os novos derivados de acil-hidrazona de antraciclinas sintetizam-se e utilizam-se na preparação dos conjugados da presente invenção.

A ligação de acil-hidrazona sensível a ácido dos conjugados desta invenção permite a libertação da antraciclina do conjugado no meio externo ou interno ácido da célula alvo. Os conjugados e métodos da presente invenção são portanto aplicáveis em sistemas de libertação de fármacos mediados por um anticorpo ou por um ligando para a morte preferencial de uma população de células escolhidas, no tratamento de doenças tais como os cancros e outros tumores, infecções virais não citocídicas ou outras infecções patogénicas e doenças auto-imunes.

Antecedentes da invenção:

As antraciclinas são compostos com acção antibiótica que exibem actividade citotóxica. Os estudos indicaram que as antraciclinas podem agir para matar células através de diferentes mecanismos incluindo: 1) intercalação de moléculas do fármaco em DNA de uma célula inibindo deste modo a síntese de ácido nucleico dependente de DNA; 2) produção pelo fármaco de radicais livres que em seguida reagem com macromoléculas celulares para provocar a destruição das células ou 3) interacções das moléculas de fármacos com a membrana celular [ver por exemplo, C. Peterson et. al.. Transport and Storage of Human Leukemia, em Antracycline Antibiotics in Câncer Therapy, Fim. Muggia et al. (ED.S) p. 132 (Martinus Niihoff Publishers

1982), e ainda, N.R. Bachur, Free Radical Damage. id. pp 97-102]. Devido ao seu potencial citotóxico, as antraciclinas têm sido utilizadas no tratamento de numerosos tipos de cancro tais como leucémia, carcinoma da mama, carcinoma do pulmão, adenocarcinoma ovórico e sarcomas [ consultar por exemplo, P..H. Wiernik, Current Status of Adriamycin and Daunomycin in Câncer Treatment, in Antracyclines : Current Status and New Development, S.t. Crooke et al., (EDS), pp 273-94 (Academic Press 1980) ]. As antraciclinas usadas correntemente incluem a adriamicina e a daunomicina.

Embora estes compostos possam ser úteis no tratamento de neoplasmas e outras doenças em que uma população celular escolhida se deseja eliminar, a sua eficácia terapêutica é frequentemente limitada pela toxicidade dependente da dose associada com a sua administração. Por exemplo, no tratamento de tumores, os efeitos indesejáveis típicos incluem depressão medular e toxicidade cardíaca [ver S.T. Crooke, Goals for Anthracycline Analog Development at Bristol Laboratories, Anthracyclines : Current Status and New Developments, Supra, pp 11 ] . Têm sido feitas tentativas, no tratamento de tumores, para melhorar os efeitos terapêuticos destes compostos mediante a ligação da antraciclina e anticorpos dirigidos contra anti-genes associados com tumor. Neste sentido, o fármaco pode ser libertado ou alvejado no sítio do tumor e dos seus efeitos indesejáveis tóxicos sobre as células normais do organismo serem, deste modo, /

decrescidos.

Os iraunoconjugados que contêm as antraciclinas, adriamicina (ADM) ou daunomicina (DAU), ligados a anti-corpos policionais ou monoclonais, para anti-genes associados com tumor são conhecidos tecnicamente ( consultar, por exemplo, J. Gallego et al., Preparation of Four Daunomucin - Monoclonal Antibody 791T/36 Conjugates with Anti-tumor Activity, Int., J. ,Câncer, 33, pp. 737-44, 1984) e R. Arnon et al., In Vitro and in Vivo Efficacy of Conjugates of Daunomycin with Anti-tumor Antibodies, Immunological Rev., 62, pp. 5.27, 1982).

As vias mais frequentemente utilizadas para a ligação de uma antraciclina com um anticorpo têm sido a ligação de um radical amino açúcar da antraciclina. Por exemplo, tem-se oxidado o grupo amino açúcar por tratamento com periodato de sódio e ligação directa a resíduos de lisina do anticorpo através de uma formação de uma base de Schiff [ consultar, por exemplo, E. Hurnitz et Al., The Convaient Binding of Daunomycin and Adriamycin to Antibodies with Retention of Both Drug and Antibody Activities, Câncer Res, 35, pp 1182 - 86 (1975) ].

Alternativamente, têm sido ligadas antraciclinas a anticorpos através de ligações mediadas por radicais carbodiimida do amino

açúcar da antraciclina a grupos carboxílico do anticorpo (ver, por exemplo, E. Hurwitz et ai., supra), e, por ligação cruzada com grupos amino açúcar do fármado e grupos amino do anticorpo com glutaraldeido (consultar, por exemplo, M. Belles-Isles et al. , In Vitro Activity of Daunimy. Cin-Anti-Alphafetoprotein Conjugate on Mouse Hepatoma Cells, Br. J. Câncer 41, pp 841-42, 1980). Contudo, os estudos com imunoconjugados era que a fracção amino açúcar da molécula da antraciclina foi modificada por ligação com anticorpo indicam perda de actividade citotóxica do fármaco conjugado (consultar, por exemplo, R. Arnon et al., Supra, pp 7 - 8). Além disso, os estudos com análogos de antraciclina indicam que modificações de antraciclina nos seus grupos amino-açúcar resultam no decréscimo da actividade citotóxica inicial (ver, por exemplo, K. Yamamoto et al., Antitumor Activity of Some Derivatives of Daunomycin at the Amino and Methyl Ketone Functions. J. Med. Chem. 15, pp 872-75, 1972).

Têm ainda sido preparados outros imunoconjugados em que a antraciclina , a daunomicina, se tem ligado directamente com um anticorpo na posição carbono-14 (C-14) do fármaco. Contudo, a actividade citotóxica selectiva destes imunoconjugados para células de tumor não tem sido facilmente reproduzível e revelou-se, apenas de modo consistente, na concentração de 20 MG/ML.

(consultar J. Gallego et al., Supra).

pedido de patente de invenção japonês 274658 descreve a conjugação de uma antraciclina ligada a um anticorpo através de uma ligação,13-ceto acil-hidrazona. Esta conjugação foi realizada por aplicação de métodos que se relacionam com a derivação do anticorpo e reacção subsequente desse derivado de antraciclina. Estes métodos não são favoráveis porque a derivação do anticorpo envolve reacções indesejáveis não específicas e a obtenção de uma relação antraciclina: anticorpo baixa.

De acordo com o primeiro método, o anticorpo tratou-se com carbodiimida na presença de hidrazina para formar um derivado hidrazídico do anticorpo que em seguida se fez reagir com antraciclina de modo a que a antraciclina se ligou directamente com a estrutura de anticorpo. Os imunoconjugados resultantes, contudo, tendem para a agregação de moléculas de anticorpo. Além disso, porque este método requer grupos carboxílicos ácidos na molécula do anticorpo que estão limitados em número, estes imunoconjugados exibem relações baixas de antraciclina-anticorpo (aproximadamente 1,1-1,3).

segundo método envolve a reacção do anticorpo cora anidrido succínico para formar um derivado amida ácido do anticorpo. Este derivado, em seguida, reage com hidrazina para formar um derivado

hidrazídico de anticorpo que, em seguida, reage com a antracíclina, a daunomicina. Esta segunda via é defeituosa por a reacção do derivado do anticorpo com a hidrazina não ser específica, conduzindo à produção de uma mistura de diferentes derivados de anticorpo além do derivado hidrazídico pretendido. Portanto, como indicado no pedido de patente de invenção 274658, a relação molar da antraciclína com o anticorpo era muito baixa (aproximadamente), consultar o pedido de patente de invenção japonês, pag. 264, coluna 1). Vêr ainda, o pedido de patente de invenção europeu publicação n^s 294294, que descreve a conjugação de um derivado de hidrazona em C-13 de uma antraciclína no radical carbohidratado de um anticorpo.

Finalmente, outras hidrazonas de antraciclínas são descritas em G.L. Tong et al., J. Med. Chem., 21, pp 732-37 (1978); T. Smith et al., J. Med. Chem., 21, pp 280-83 (1978), e R.T.C. Bronniee et al., J. Chem Soc. pp 659-61 (1986).

Consultar ainda a patente de invenção Norte Americana 4.112.217 que descreve bi-hidrazona de daumonicina e de adríamicina.

Noutros estudos, as antraciclínas têm sido ligadas a veículos de peso molecular elevado, tal como o dextrano ou o ácido poliglutãmico, a fim de potenciar a actividade citotóxica e

reduzir a toxicidade do fármaco [ consultar, por exemplo, R. Arnon et. al., Supara, na pagina 5 e E. Hurwitz et al., Solubie Macromolecules as Garriers for Daunorubicin, J. Appl. Biochem., 2, pp. 25-35 (1980)]. Estas antraciclínas ligadas com veículo também têm sido ligadas por covalência a anticorpos que se dirigem a antigenes associados com tumor para formarem imunoconjugados que dirigem a citotoxicidade do fármaco especificamente para as células do tumor.

Por exemplo, a adriamicina ligou-se a um anticorpo anti-tumor através de uma ponte de hidrazina-carboxil-metil-dextrano em que a molécula de adriamicina se ligou ao derivado de hidrazina de carboximetil dextrano na cadeia lateral carbonil C-13 do núcleo de tetraciclina da adriamicina para formar uma hidrazona.

O anticorpo, em seguida, foi ligado ao derivado de hidrazidadextrano com glutaraideído para formar um conjugado adriamicinadexa-anticorpo (consultar R. Arnon et al., Monoclonal Antibodies as Carriers for Immunotargeting of Drugs, em Monoclonal Antibodies for Câncer Detection and Therapy, R. W., Baldwin et al·., (eds), pp 363-83 1985 e E. Hurwite et al., A Conjugate of Adriamycin and Monoclonal Antibodies to Thy-l-Antigen Inhibits Human Neurobiastoma Cells in Vitro, Ann. N.Y. Acad. Sei. 417, pp

125-36 (1983)].

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Contudo, o uso de veículos, abrange alguns inconvenientes. Por exemplo, os imunoconjugados, contendo veículo são muito maiores e mais rapidamente eliminados pelo sistema reticuloendotelial in vivo (consultar, por exemplo, R.O. Dillman et al., Preclinical Trials with Combinations and Conjugates of T 101 Monoclonal Antibody and Doxorubicin, Câncer Res., 46, pp 4886-91 (1986)]. esta eliminação rápida dos imunoconjugados que contêm um veículo pode não ser vantajosa para a terapêutica porque o fármaco conjugado pode não conseguir alcançar o sítio de acção a que se destina, isto é, o grupo de células escolhido para serem mortas. Além disso, a presença de veículo de peso molecular elevado pode afectar de uma forma negativa a estabilidade do imunoconjugado, tendo-se demonstrado que reduz a actividade de ligação do anticorpo do conjugado [ver, por exemplo, M. J. Embienton et al., Antibody Targeting of Anti-Cancer Agents, em Monoclonal Antibodies for Câncer Detection and Therapy, R. W. Baldwin et al., (eds), pp 323-24 (1985)]. Também, em estudos com células de tumor não existe prova de que os imunoconjugados contendo um veículo de peso molecular alto estejam aptos a localizar as células tumorais in vivo. Compare C.H.J. Ford et al. Localization and Toxicity Study of a Vindesine-Anti-CEA Conjugate in Patients with Aduanced Câncer, BR J. Câncer, 47, 35-42 (1983), que descreve a localização em células tumorais in vivo de conjugados anticorpo fármaco realizados directamente.

Assim, tem sido descrita a conjugação de antraciclinas com

X* anticorpos através de ligações e veículos específicos. Como citado anteriormente, o uso deste imunoconjugado contêm inconvenientes distintos que dependem da ligação ou do veículo específico utilizado.

Certos conjugados, ligando - toxina também têm sido descritos. Por exemplo, a patente de invenção Norte-Americana 4 545 985 descrita por I. Pastan, descreve um conjugado de hexotoxina em que a hexotoxina de pseudomonas (PE) está ligado com EGF numa relação de 1:2 para se aplicar contra células comportando grande número de receptores de factor de crescimento epidérmico. Também têm sido preparados conjugados de toxina de ricina A-EGF e toxina diftérica-EGF {consultar, por exemplo, D.B. Cawley et al., Epidermal Growth Factor-Toxin A Chain Conjugates : EGF - Ricin A is a Potent Toxin while EGF-Diphtheria Fragment A is Nontoxic, Cell, 22, pp 563-70 (1980) e N. Shimizu et al., A Cytotoxic Epidermal Grouwth Factor Cross - Linked to Diphtheria Toxin AFragment, Febb Letters, 118 (n^Q 2), pp 274-73 (1980)]. Além disso, proteínas de fusão de hexotoxina de pseudomonas têm sido preparadas utilizando-se proteínas, polipeptidos e factor de crescimento tal como TGF - , IL-2, 11-6 e CDM [ver, por exemplo, I. Pastan et al., Novel Cytotoxic Agents Created by the Fusion of Growth Factor and Toxin Genes, Fourth Internam Conference on Monoclonal Antibody Immune Conjugates for Câncer, pp 36 (marco 30-Abril 1, 1989); H. Lorberdoum et al., Proc. Natl. Sei. USA, 85, pp 1992 - 26 (1988); V.K. Chaudhary et al., Proc.,

Natl. Acad. Sei. USA, 84, pp 4538-42 (1987): C.B. Siegall et al. Proc. Natl Acad. Sei. USA, 85, pp 9738-42 (1988): e U.K.

Chaudhary et al., Nature, 335, pp. 369-72 (1988) ]. Foi ainda preparada uma proteína de fusão da hormona estimuladora de

C< - melanócitos com toxina diftérica [ver. J.R. Murphy et al., Genetic Construction Expression and Melanona - Selective Cytotoxicity of a Dipheteria Toxin-Related - MelanocyteStimulating Hormone Fusion Protein, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 83, pp 8285-62 (1986), e Patente de Invenção Norte - Americana 4 675 382 requerida por J.R. Murphy ].

Conjugados de ligando contendo toxinas demonstraram ser imunogénicos em hospedeiros proteínas, contudo xenogénicos.

Além disso, estas antraciclinas como ADM e DAU têm sido ligadas por via química a certos ligandos de proteína ou polipeptídicos como a transferrina [ver o pedido de patente de invenção Britânico, GB 2116979 A ] e a melonotropina [ver J.M. Varga et al., Melanotropon-Daumomicin Conjugate Shows ReceptorMediated Cytotoxicity for Culured Murine Melanoma Cells, nature, 267 pp 56-58 (1977) ]. Consultar também o pedido de patente de invenção PLT WO 88/00837, EGF ligado através de um veículo polimérico e uma substância citotóxica como por exemplo a daunomicina e as patentes de invenção Norte-Americanas 4.522.750 e 4 590 001 (transferrina ligou-se a alcaloides vinca e à platina, respectivamente).

Resumo da Invenção:

A presente invenção proporciona um novo processo para a ligação de moléculas de antraciclina citotóxica, através de uma estrutura adaptadora, a molécula capaz de reagir com uma população celular alvo para ser morta. Esta molécula celular reactiva pode ser uma proteína tal como um anticorpo ou um ligando como a bombesina ou factor de crescimento epidérmico (EGF).

De acordo com um aspecto da presente invenção, moléculas de antraciclina ligam-se a anticorpos reactivos com uma população de células alvo escolhida. Esta antraciclina liga-se com o anticorpo através de uma estrutura adaptadora, sendo a antraciclina ligada a esse adaptador através de uma ligação de acil-hidrazona na posição 13-ceto da antraciclina para formar os novos imunoconjugados desta invenção. Por exemplo, um aspecto preferido desta invenção envolve a síntese de um novo derivado de arriamicina-hidrazona (ADM-HZN) que em seguida se condensa com um anticorpo tiolado, resultando na ligação da antraciclina ao anticorpo de uma estrura de ligação. Uma ligação acil-hidrazona formada na posição C-13 da adriamicina serve como o sítio de ligação desta ao adaptador. Adicionalmente, está presente uma ponte de dissulfureto no adaptador como o sítio de ligação do anticorpo.

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De acordo com um outro aspecto preferido, o derivado ADM-HZN foi reduzido para se obter um grupo sulfidrilo, e o derivado de hidrazona novo resultante foi condensado com um derivado anticorpo - maleimida. Assim, conduziu-se à formação de uma estrutura adaptadora contendo uma ligação de acihidrazona no sítio da ligação do adaptador na posição -13 de ADM e uma ligação tioéter no adaptador ao anticorpo.

De acordo ainda com ura outro aspecto preferido desta invenção, os novos intermediários da ADM-HZN foram ligados covalenteraente a ligandos tiolados, tais como a bombesina, a transferrina ou factor de crescimento epidérmico, resultando na ligação da antraciclina ao ligando através da estrutra adaptadora. Como num outro aspecto descrito anteriormente, a antraciclina liga-se ao adaptador através de uma ligação acilhidrazona formada na posição C-13 da antraciclina. Adicionalmente, pode estar presente uma ligação dissulfureto ou tioéter na estrutura adaptadora. Como é evidente, a partir destes aspectos, a presente invenção proporciona novos derivados de acil-hidrazona da antraciclina úteis na preparação dos conjugados desta invenção.

Os imonuconjugados da presente invenção apresentam relações molares antraciclina: anticorpo aproximadamente de 4-10 e retêm as actividades de anticorpo e citotóxicos do fármaco para matarem células alvo escohidas. Os conjugados ligando-antraciclina aqui

descritos podem apresentar uma relação antraciclina-ligando de, pelo menos, um e retêm a actividade de ligação do receptor e a actividade citotóxica do fármaco. A ligação hidrazona sensível a ácido que está presente no sítio de ligação da antraciclina com a estrutura adaptadora destes conjuntos, e também as ligações dissulfureto ou tioéter na estrutura adaptadora dos aspectos preferidos desta invenção, são idealmente apropriados para a libertação do fármaco activo sob condições de redução ou ácidas, tais como as que se encontram tipicamente, numa célula, por exemplo nas visículas de lisosoma.

Os conjugados da presente invenção podem ser introduzidos em composições farmacêuticas, tais como as que contêm uma quantidade eficaz do ponto de vista farmacêutico, de pelo menos um conjugado da presente invenção e ura veículo aceitável em farmácia. A presente invenção também abrange os métodos para a libertação selectiva de fármacos citotóxicos para uma população escolhida de células alvo, que se desejam eliminar, assim como métodos para o tratamento de mamíferos de um modo aceitável do ponto de vista farmacêutico, com uma quantidade farmacêuticamente eficaz das composições da presente invenção.

Vantajosamente, os conjugados, composições farmacêuticas e os métodos descritos aqui proporcionam uma via útil para os fármacos de antraciclina citotóxicos alvejarem uma população escolhida de células para a morte preferencial destas células alvo, no tratamento de doenças como do cancro e outros tumores, infecções patogénicas virais não citocídicas ou outras e doenças autoimunes.

Breve descrição dos desenhos

A figura 1 representa de uma forma esquemática a síntese de novos derivados de hidrazona ADM-HZN utilizados na preparação dos imunoconjugados da presente invenção.

A figura 2 representa de uma forma esquemática a síntese de imunoconjugados num aspecto da presente invenção, em que um anticorpo monoclonal (MAB) foi primeiramente tiolado utilizando-se (N-succinimidil-3-(2-piridiltio)propionato) (SPDP) ou 2-iminotiolano (2-IT) e o anticorpo tiolado foi em seguida submetido á reacção com ADM-HZN para formar um imunoconjugado da presente invenção, com uma ligação hidrazona na posição

13-ceto de ADM e uma ponte dissulfureto na estrutura adaptadora.

A figura 3 representa um diagrama de varrimento (scattergram) que compara o número de grupos tiol reactivos substituídos no anticorpo monoclnal (relação SH/MAB) para a relação molar ADM/MAB alcançada nos imunoconjugados produzidos por condensação de anticorpos monoclonais 5E9 e 3A1 tiolados com Nsufonimidil-3-2-piridil-ditio-propionato e ADM-HZN.

A figura 4 representa um diagrama de varrimento comparando a relação SH/MAB com a relação molar final ADM/MAB alcançada nos imunoconjugados produzidos por reacção de anticorpos 5E9 e 3A1 tiolados-2-ΙΤ com ADM-HZN.

A figura 5 representa um diagrama de varrimento que mostra a relação entre a proporção molar ADM/MAB e a proteína formada de imunoconjugados da presente invenção preparados utilizando-se anticorpos tiolados com N-succinimidil-3-2-piridil-ditiopropionato ou com 2-iminotiolano.

A figura 6 representa um diagrama que compara a relação molar ADM/MAB versus proteína obtida nos imunoconjugados que utilizam anticorpos monoclonais de isotipo IgGl, por exemplo 5E9 e 3A1 ou do isotipo IgG2 (por exemplo, L6). Estes anticorpos foram tiolados com N-succinimidil-3-2-piridinil-ditio-propionato.

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A figura 7 também representa um diagrama que compara a relação ADM/MAB versus proteína dos imunoconjugados contendo anticorpos do isotipo IgGl versus isotipo IgG2 (como na figura 6) excepto estes anticorpos terem sido tiolados com 2-iminotiolano.

A figura 8 representa de uma forma gráfica as curvas de ligação de dois imunoconjugados desta invenção comparados com as curvas de ligação dos anticorpos monoclnais não conjugados respectivos.

A figura 9 representa um cromatograma de HPLC demonstrando a estabilidade de um imunoconjugado da presente invenção, quando o PH se torna mis ácido.

A figura 10 representa um cromatograma de HPLC mostrando a libertação de um radical ADM a partir do imunoconjugado desta invenção após o tratamento com DDT.

A figura 11 representa um gráfico da citotoxicidade selectiva de imunoconjugados da presente invenção para a linha de células daudi utilizando-se um ensaio de formação de colónias em agar mole. Estes imunoconjugados foram preparados a partir de

anticorpos tiolados com 2-imidotiolano.

A figura 12 representa o gráfico da citotoxicidade selectiva de imunoconjugados desta invenção, para células namalwa e a potência acrescida destes imunoconjugados comparada com a de ADM livre utilizando-se um ensaio de diluição limitador.

A figura 13 representa o gráfico da toxicidade selectiva de imunoconjugados da presente invenção sobre células daudi utilizando-se um ensaio de formação de colónia em agar mole. Nesta circunstância os imunoconjugados foram preparados utilizando-se anticorpos tiolados com SPDP.

A figura 14 descreve sob a forma de um gráfico a citotoxicidade selectiva de outro imunoconjugado da presente invenção preparado com SPDP como agente de tiolação. Este imunoconjugado demonstrou-se citotóxico para células daudi e células namalwa, positivas para o antigénio, mas não para células HSB-2 negativas para o antigénio utilizando-se um ensaio de formação de colónia em agar mole.

A figura 15 representa a citotoxicidade selectiva de imunoconjugados de 5E9 e 3A1, da presente invenção, para uma linha de células de carcinoma de colon humano (5E9+, 3A1-), utilizando-se um ensaio de formação de colónia.

A figura 16 representa sob a forma de um gráfico a ausência de citotoxicidade das células daudi de imunoconjugados preparados por ligação de ADM a anticorpos monoclonais no resíduo de amino açúcar de ADM através de um adaptador dipetídico leu-ala.

A figura 17 representa, de uma forma esquemática a síntese de um imunoconjugado da presente invenção, em que o novo derivado ADM-HZN desta invenção reduziu-se e, em seguida, fez-se reagir com o anticorpo tratado com (succinimidil-4-(p-maleimidofenil)butirato. Para formar um imunoconjugado representando uma estrutura de ligação com uma ligação tioéter desta estrutura.

A figura 18 representa sob a formna de um gráfico, citotoxicidade de um imunoconjugado da presente invenção contendo, além da ligação 13-ceto acil-hidrazona, uma ligação tioéter na sua estrutura adaptadora. Este imunconjugado mostrou potência relativa superior à ADM livre sobre células namalwa utilizando-se um ensaio de incorporação de H-timidina.

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A figura 19 representa, sob a forma de um gráfico, a citotoxicidade sobre células HSB-2 do iraunoconjugado da figura 18, aplicando-se o mesmo ensaio de incorporação de H-timidina.

A figura 20 representa, sob a forma de um gráfico, a citotoxicidade selectiva de um imunoconjugado desta invenção para células antigénio positivas versus células antigénio 3 negativas aplicando-se o ensaio de incorporação de H-timidina, sendo o imunoconjugado, adicionalmente à ligação 13-ceto acilhidrazona, uma ligação tioéter na sua estrutura adaptadora.

A figura 21, representa, sob a forma de um gráfico, a actividade anti-tumoral in vivo de um imunoconjugado desta invenção-sobre enxertos de tumor dandi em murganhos.

imunoconjugado exibiu uma actividade anti-tumoral maior do que a observada utilizando-se uma dose equivalente de ADM livre.

A figura 22, representa, sob a forma de um gráfico, a actividade anti-tumoral in vivo de ADM sobre enxertos tumorais daudi humano em murganhos, em tempos de exposição variáveis de ADM, utilizando um esquema de tratamento de 7D x 3 e administração endovenosa.

A figura 23, representa, sob a forma de um gráfico, a actividade anti-tumoral in vivo de um imunoconjugado desta invenção para enxertos de tumor daudi humano em murganhos comparada com a actividade anti-tumoral de ADM livre optimizada (administrada por via endovenosa com um esquema de tratamento Q7Dx3 em doses entre 10 e 11 MG/KG/injecção. 0 imunoconjugado demonstrou actividade anti-tumoral superior.

A figura 24 representa, em forma de quadro, a actividade anti-tumoral in vivo de ADM para enxertos em murganhos de tumor ramos humano por administração endovenosa, mas com esquemas de tratamento e posologias variáveis.

A figura 25, representa, sob a forma de um gráfico, a actividade anti-tumoral in vivo de ADM para enxertos em murganhos de tumor ramos humano durante certo tempo e doses variáveis de ADM utilizando-se um esquema de tratamento de injecção única por via endovenosa.

A figura 26, representa, sob a forma de um gráfico, a actividade anti-tumoral in vivo de um imunoconjugado da presente invenção, para enxertos em murganhos de tumor ramos humano comparada com a actividade anti-tumoral ADM livre optimizada, administrada por via endovenosa com um esquema de tratamento QlDxl em doses de 16-18 MG/KG/injecção. O imunoconjugado mostrou

actividade anti-tumoral superior à de ADM livre. A figura 26, representa a actividade anti-tumoral in vivo dos imunoconjugados com diferentes tempos de exposição e dose do conjugado, demonstrando a natureza dependente da dosagem do efeito antitumoral do conjugado. As doses dos imunoconjugados testados na figura 26 A e B foram sob a forma de antracíclina conjugada com a quantidade de anti-corpo entre parenteses.

A figura 27, representa, a estrutura química de a) um conjugado de bombesina - ADM desta invenção; b) um conjugado EGF-ADM desta invenção; e c) um conjugado de transferrina - ADM desta invenção.

A figura 28 representa dois cromatogramas de HPLC de cisbombesina, cromatografada numa coluna C-18 de fase inversa e numa coluna de permuta iónica CX-300, respectivamente. Cada cromatograma foi desenvolvido a 220 e 280 NM. Esta figura demonstra a pureza da preparação de cis-bombezina utilizada para construir um conjugado de bombesina - ADM da presente invenção.

A figura 29 representa um espectro de massa de conjugado cisbombesina-ADM da presente invenção.

A figura 30, representa, sob a forma de um gráfico, um ensaio de ligação competitivo para células, swiss 3T3, em que se incubou I-GRP com concentrações crescentes de um conjugado cis-bombesina-ADM desta invenção cis-bombezina ou GRP e em que se mediu a inibição da ligação de 125,.

-GRP às células . Este ensaio demonstrou a retenção de actividade de ligação pelo conjugado de cis-bombesina-ADM para os receptores de bombesina para as células.

A figura 31, representa, sob a forma de um gráfico, a citotoxicidade de um conjugado cis-bombesina-ADM desta invenção para células de SVT2, utilizando-se um ensaio de incorporação de ^H-timidina. 0 conjugado exibiu uma potência relativa superior a ADM livre ou a ADM-HZN para as células.

A figura 32, representa, sob a forma de um gráfico, a citotoxicidade de um conjugado cis-bombesina-ADM desta invenção para células HCT116 utilizando-se um ensaio de incorporação de

H-.timidina.

A figura 33, representa, sob a forma de um gráfico, a citotoxicidade de um conjugado de cis-bombesina-ADM desta invenção para células Swiss 3T3, de acordo com um ensaio de incorporação de ^H-timidina.

A figura 34, representa, um cromatograma de -HPLC que demonstra a pureza da preparação de um conjugado de EGF-ADM desta invenção.

A figura 35, representa, sob a forma de um gráfico, um ensaio de ligação competitiva de células A4B1, em que se incubou 125j__Eqp _com concentrações crescentes de um conjugado EGF-ADM desta invenção ou de EGF e em que se mediu a inibição da ligação de ¹²⁵I-EGF com as células. Este ensaio demonstrou a retenção da actividade de ligação pelo conjugado de EGF-ADM para os receptores de EGF das células.

Descrição Detalhada da Invenção.

A fim de que a invenção aqui descrita possa ser completamente compreendida, indica-se em seguida uma descrição pormenorizada.

A presente invenção refere-se a novos conjugados de antraciclina, a derivados de acil-hidrazona de antraciclinas novos, a métodos para a sua preparação, a composições farmacêuticas e a métodos para a libertação de antraciclinas citotóxicas, numa população de células escolhida, que se deseja eliminar, no tratamento de doenças como os cancros e outros tumores, a infecções patogénicas não citocidicas virais ou outras e a doenças antoimunes. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a conjugados de antraciclina que contém pelo menos uma molécula de antraciclina ligada a uma molécula que é reactiva com uma população celular escolhida e que se deseja eliminar, sendo a antraciclina ligada à molécula celular reactiva através de uma ligação 13-CETO-acil-hidrazona. A molécula reactiva da célula pode ser uma proteína como por exemplo um anticorpo, ou um ligando tal como a bombesina ou EGF.

Assim, de acordo com um aspecto preferido da presente invenção, esta refere-se a imunoconjugados que contêm um anticorpo dirigido contra uma população de células escolhida, a qual contêm umas tantas moléculas de antraciclina conjugadas na sua estrutura. As moléculas de antraciclina são ligadas de um modo covalente com o anticorpo de modo a que a estrutura adaptadora é formada entre cada molécula de fármaco e o anticorpo sendo o adaptador ligado à antraciclina por uma ligação acilhidrazona na posição 13-ceto da antraciclina. De acordo com outro aspecto da presente invenção, esta abrange conjugados de antraciclina-ligando, constituindo o ligando um polipéptido ou um

ligando peptídico, que reage com um ou mais receptores associados com a superfície da célula de uma população de células escolhida, tendo o ligando pelo menos uma molécula de antraciclina ligada na sua estrutura. A antraciclina é ligada por covalência ao peptido através de uma estrutra adaptadora que se liga à antraciclina na posição 13-ceto através de uma ligação acil-hidrazona.

Os conjugados da presente invenção podem ser preparados por fases com a formação incial de um novo derivado antraciclinahidrazona que em seguida se faz reagir com uma proteína ou um ligando de especificidade apropriada [consultar por exemplo, R.R. Hardy, Purification and Compling of Fluorescent Proteins for use in flow Cytoometry, em Handbook of experimental Immunology, volume I: Immunochemistry, D.M. Ner et al., (Eds), p.p. 31.431.12 (4th Ed 1986) para a descrição de técnicas de ligação de anticorpos convencionais e J.M. Varga et. al., supra, para a preparação de conjugados de ligandos. 0 comprimento da estrutura adaptadora que liga a antraciclina com o componente reactivo da célula dos conjugados pode variar dado que está sob a forma de uma acil-hidrazona na posição C-13 da antraciclina. A estrutura adaptadora pode ainda conter outra ligação, tal como a ligação dissulfureto, tioéter, amida, carbamato, éter ou éster, ao longo do seu comprimento entre os pontos de ligação do fármaco com a molécula reactiva da célula.

/i*· + Λ

As antraciclínas que compreendem conjugados da presente invenção podem ser quaisquer antraciclínas contendo um grupo ceto na posição de carbono-13 (C-13). Estas antraciclínas incluem, mas não são limitadas a, adriamicina, daunomicina, detorubicina, carminomicina, darubicina, epirubicina, esorubicina,4'-THP-adreamicina, ad-32 e 3'-deamino-3'-(3-ciano-4-morfolinil)doxorubicina [consultar A.M Casazza, Experimental Studies on New Antharacyclines, em Adriamycin: Its Expanding Role in Câncer Treatment, M. Ogana et al., (Eds.) pp 439-52 (excerpta Medica 1984)].

Entendeu-se que a molécula da célula reactiva a que se liga a antraciclina no conjugado, pode ser qualquer molécula que se liga ou que reage com a população celular que se deseja eliminar. Estas moléculas incluem, mas não são limitadas a, proteínas de grande peso molecular (geralmente superior a 10.000 daltons) tais como anticorpos, proteínas de peso molecular menor (geralmente menor que 10.000 daltons), ligandos polipetídicos ou peptídicos e ligandos não peptidílicos.

Assim, os anticorpos que compreendem os imunoconjugados desta invenção podem ser qualquer anticorpo reactivo com uma população celular específica desejada, eliminada ou morta. Exemplos destes anticorpos incluem, mas não são limitados a, anticorpos que se ligam a antigénios associados com tumor, tais como os antigénios que se encontram nos carcinomas, melanomas, linfornas, cacercomas do tecido ósseo ou de tecidos moles , assim ?» como outros tumores, anticorpos que se ligam a antigénios associados com vírus ou com outros agentes patogénicos, e anticorpos que se ligam aos antigénios de superfífice celular anormal.

Estes anticorpos podem ser anticorpos monoclonais de preferência, ou anticorpos policlonais e podem produzir-se mediante a aplicação de técnicas conhecidas [ consultar, por exemplo, R.A.Deweger et. al., Eradication of Murine Lymphoma and Melanona Cells by Chlorambucil - Antibody Complexes, Immunological Ref., 62, pp 29-45 (1982), (Anticorpos Policlonais Específicos do Tumor Produzidos e Utilizados nos Conjugados ) e M.Yeh. et. al., Cell Surface Antigens of Human Melanoma Identified by Monoclonal Antibody, Proc., Natl. Acad. Sei., 76, pp 2 92 7-3 1 (19 79 ) e J.P. Brown et. al . , Structural Characterization of Human Melanoma-Associated Antigen p 97 With Monoclonal Antiobodies, J. Immunol, 127, (n^a 2), pp 539-46 (1981), (Anticorpos Produzidos Monoclonais específicos de Tumor)]. Por exemplo, o anticorpo monoclonal L6, específico de células de carcinoma de pulmão humano ou o anticorpo monoclonal 791T/36, específico para células de sarcoma osteogénicas, podem ser anticorpos utilizados. Além disso, podem-se utilizar anticorpos de não internalização ou de preferência anticorpos de internalização.

/ termo anticorpo é utilizado nesta memória descritiva paraT** abranger moléculas de anticorpo intactas ou os seus fragmentos que contém a região de ligação activa da molécula do anticorpo, por exemplo, FAB ou FAB'(2). Se são utilizados anticorpos monoclonais, estes podem ser de, mas não limitados, a anticorpos quiméricos, de origem humana ou murina.

Também se entende que o termo ligando como aqui se utiliza, inclui uma molécula que se liga específicamente a um receptor associado com a superfície da célula de uma população celular alvo escolhida. Ligandos preferidos que podem ser utilizados para formare. conjugados antraciclina-ligando incluem, mas não são limitados a, proteína, ligandos polipeptídicos, ou ligandos peptídicos como a transferrina, factor de crescimento de epiderme, bombesina, gastrina, peptido libertador de gastrina, factor de crescimento derivado de plaquetas, inter-leucina-2. Inter-leucina-6, TGF-^C , VGF, .TGF-jJ, insulina e factores de crescimento semelhantes a insulina I e II.

Outros ligandosnão peptidílicos incluem os esteróídes, os hidratos de carbono e as lectinas.

Assim, a molécula reactiva da célula, por exemplo, o anticorpo ou o ligando, dos conjugados desta invenção actua para libertar as moléculas de antraciclina numa população celular particular com que o anticorpo ou o ligando reagem.

à*

Por exemplo, um anticorpo dirigido contra um antigénio que se encontra na superfície de células de tumor ligar-se-á com e libertará antraciclinas nestas células de tumor a um anticorpo dirigido contra uma proteína do vírus de imunodeficiência humana (HIV) que causa a SIDA libertará as suas antracilinas citotóxicas nas células infectadas por HIV.

Identicamente, porque as células de tumor, tais como as células de carcinomas, expressam de preferência certos receptores com grande densidade, tais como os receptores de EGF, um ligando como por exemplo, EGF, ligar-se-á para e libertará as suas antraciclinas a células de carcinoma.

A libertação do fármaco no interior da população celular ou no sítio da população celular particular com que um anticorpo ou ligando reagem resulta na morte preferencial destas células particulares . Assim, é evidente que os conjugados da presente invenção são aplicáveis no tratamento de qualquer doença em que uma população celular específica se deseja eliminar, população celular que contém um antigénio de superfície celular ou receptor que permite a ligação do conjugado.

/

As doenças para que os conjugados da presente invenção se podem aplicar incluem, mas não são limitadas a, cancros e outros tumores, a infecções patogénicas virais, não citocídicas ou outras tais como a SIDA , Herpes, CMV (citamegalovírus), EBV (vírus de Epstein Barr) e SSPE (encefalites difusa esclorosante, subaguda), e artrite reumatóide.

Sem ligação com a teoria, acredita-se que as moléculas de antraciclina ligadas ao anticorpo ou ao ligando, isto é, sob a forma de um conjugado desta invenção, são libertadas nas células alvo para serem mortas através do anticorpo ou do ligando, especificamente, e podem em seguida, penetrar a célula através do mesmo esquema endocítico que conduz à internalização de anticorpos não conjugados e ligando na membrana [vêr, por exemplo, I. Pastan et AL., Pathway of Endocytosis, em Endocytosis, I. Pastan et AL., (eds.), pp 1 -44 (Plenum Press 19 85)] . Uma vez penetrada a célula, as vesículas endocíticas que contêm o conjugado fundem-se com principalmente lisosomas para formar lisosomas secundários ( vêr, por exemplo, M.J. Embleton et AL., Supra, na pág. 334]. Como as moléculas de antraciclina se ligam com o anticorpo ou com o componente do ligando do conjugado através de ligações de acil-hidrazona sensíveis a ácidos, a exposição do conjugado a um ambiente ácido das vesículas endocíticas e dos lisosomas resulta na libertação da antraciclina a partir do conjugado . Além disso, as antraciclinas libertadas consideram-se que constituem um fármaco /

relativamente inalterado capaz de actividade citotóxica total. Assim, a ligação de hidrazona sensível a ácido do conjugado é grandemente vantajosa para a libertação do fármaco citotóxico nas células alvo reforçando a citotoxicidade do conjugado sobre estas células. Alternativamente, a ligação de hidrazona pode ser cindida sob condições ácidas ou condições de redução no ambiente externo imediato ou gue rodeia as células alvo, por exemplo, no sítio do tumor e o fármaco libertado ser absorvido pelas células tumorais.

Os imunoconjugados da presente invenção e os métodos para a sua preparação são exemplificados por aspectos preferidos em que a antraciclina , adriamicina se conjugaram com anticorpos diversos.

Primeiro, um novo derivado de hidrazona-adriamicina foi sintetizado numa reacção de duas fases. 0 reagente heterobifuncional SPDP (N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato) foi submetido a reacção com a hidrazina para formar uma 3-(2-piridilditio)propionil hidrazida e em seguida a hidrazida reagiu com cloridrato de adriamicina (ADM-HCL) para formar um novo derivado de acil-hidrazona do ADM, contendo um radical dissulfureto protegido por um grupo piridilo. Pode ser utilizado um catalisador ácido como por exemplo o ácido trifluoroacético para facilitar a formação da hidrazona. 0

V, derivado formado foi designado por cloridrato de adriamicina 13(

-{3-(2-piridilditio)propionil}-hidrazona (ADM-HZN) (ver figura

D Este novo derivado ADM-hidrazona fez-se reagir em seguida com um anticorpo monoclonal previamente tiolado com SPDP e em seguida reduziu-se ou tiolou-se com 2-iminotiolano (ver figura 2). 0 imunoconjugado resultante era constituído por moléculas de ADM conjugadas com o anticorpo monoclonal por meio de uma estrutura adaptadora ligada na posição C-13 de cada ADM através de uma ligação acil-hidrazona e o adaptador contendo adicionalmente uma ponte dissulfureto através da qual se ligou o anticorpo (ver figura 2).

Outro aspecto desta invenção envolveu a síntese de outro novo derivado adriamicina-hidrazona em que a ADM-HZN descrito anteriormente foi posteriormente tratado com agentes de redução (ditiotreitol DTT) ou trihutilfosfina, para produzir a hidrazona de 13- {3-(mercaptopropionil)} adriamicina (ver figura 17). Este derivado em seguida reagiu com um anticorpo monoclonal a que os grupos de maleimida se tinham ligado, por exemplo, por reacçao do anticorpo com ( succinimidil-4-(Pmaleimidofenil)butirato). Como se representa na figura 17, formou-se um imunoconjugado exibindo uma estrutura adaptadora ligada por uma ponte de hidrazona na posição C-13 de cada /

molécula de ADM e tendo ainda uma ligação tioéter como parte da sua ligação com o anticorpo. Assim, é evidente que a estrutura adaptadora que liga o fármaco e o anticorpo pode compreender constituintes e ligações incluindo, ao longo destas ligações a ligação hidrazona sensível a ácido na posição 13-ceto da antraciclina.

De acordo com outro aspecto, o novo derivado ADM-HZN desta invenção fez-se reagir com os ligandos, bombesina, EGF ou transferrina, tendo primeiramente derivado os ligandos possuindo grupos tiol. No caso da bombesina introduziu-se um resíduo de cesteína no terminal amino do peptído para proporcionar um grupo sulfridilo reactivo para a conjugação com ADM-HZN. No caso de EGF murino, fez-se reagir o polipéptido com SPDP para introduzir um grupo sulfidrilo reactivo no terminal amino da molécula para a conjugação com ADM-HZN. No caso de transferrina, primeiramente a proteína reagiu com 2-iminotiolano para a introdução de grupos tiol reactivos na estrutura da proteína. Em cada caso, o ligando tiolado fez-se reagir em seguida com a ADM-HZN para formar um conjugado antraciclinaligando desta invenção exibindo um adaptador entre o ligando e o fármaco, adaptador ligado na posição C-13 de cada antraciclina por meio de uma ponte de acil-hidrazona. Adicionalmente, o adaptador continha uma ligação dissulfureto na sua estrutura (ver figura 27). Pode ainda reduzir-se com ditiotreitol, como descrito anteriormente para a /

J·' preparação de imunoconjugados e em seguida fazer-se reagir com o ** ligando a que os grupos maleimida foram ligados também como descrito anteriormente.

Um conjugado ADM-ligando poderá ser deste modo produzido de forma a conter uma estrutura adaptadora ligada por uma ligação de hidrazona à posição C-13 da ADM, contendo ainda a estrutura adaptadora uma ligação tioéter incorporada.

Também é evidente que a presente invenção proporciona novos derivados de acil-hidrazona 13-ceto antraciclinas de fórmulas gerais I, II ou III:

/

Na qual:

R representa CH , CH OH, CH OCO (CH )

3 2 2 2'3 (OC₂HC₅)₂;

CH , CH OCOCH 3 2

R2 representa um grupo de fórmula geral

ou οχ, em que X representa um átomo de hidrogénio ou de halogénio ou um grupo NO .

/ ,/ ϊ

R representa um átomo de hidrogénio ou um grupo hidroxi ou/

R₄ represenhta um grupo NH , NHCOCP , 4-morfolinil,

3-ciano-4-morfolinil, 1-piperidinil, 4-metoxi-l-piperidinil, benzilo amina, dibenzil amina, cianometil amina ou l-ciano-2metoxietil amina;

Rç. representa um grupo, um átomo de hidrogénio, um grupo hidroxi ou 0-THP;

R representa um átomo de hidrogénio o um grupo hidroxi, com 5 a condição de Rg não representar um grupo hidroxi quando Rg representa um grupo hidroxi ou 0-THP; e

N representa um número inteiro de 1 a 10, inclusivé;

,C —H

OH

Na qual,

R representa um grupo CH , CH OH, CH OCO(CH ) CH , CH OCOCH 1 3 2 2 2 3 3 2

R^ representa um átomo de hidrogénio, um grupo hidroxi ou metoxi;

R₄ representa um grupo NH2 , NHC0CF3, 4-morfo1ini1, 3-ciano-4-morfolinil, 1-piperidinil, 4-metoxi-l-piperidinil, benzilamina, dibenzilamina, cianometil amina ou l-ciano-2metoxietil amina;

R$ representa um átomo de hidrogénio ou um grupo hidroxi ou O-THP;

Rg representa um átomo de hidrogénio ou um grupo hidroxi com a condição de Rg não representar um grupo hidroxi quando R 5 representa um grupo hidroxi ou O-THP; e

N representa um número inteiro de 1 a 10 inclusive; e

c -(CK,)_r -s -S

Hf,' na qual,

R₁ representa um grupo CH^ , CH₂OH, Cí^OCO (Cí^) CH^ , OCOCH (OC₂H₅)₂;

R representa um grupo de fórmula geral.

ou

em que X representa um átomo de hidrogénio ou de halogénio ou grupo nitro;

R^ representa um átomo de hidrogénio ou um grupo hidroxi ou metoxi;

R₄ e R? representam cada um independentemente um átomo de hidrogénio ou um grupo acil eventualmente protegido, cicloalcil, eventualmente protegido, aril eventualmente protegido, ou aralquil eventualmente protegido; ou e R? conjuntamente com o átomo de azoto adjacente, formam um núcleo tetra, ou hectagonal eventualmente substituído;

R$ representa um átomo de hidrogénio ou um grupo hidroxi ou 0-THP;

Rg representa um átomop de hidrogénio ou um grupo hidroxi com a condição de R^ não apresentar um grupo hidroxi quando R5 representa um grupo hidroxi ou 0-THP; e

N representa um número inteiro de 1 a 10 inclusivé.

As acil-hidrazonas de antraciclina descritas anteriormente representam novos intermediários para a preparação dos conjugados da presente invenção e são exemplificados por ADMHZN e hidrazona de 13-^3-(mercaptopropionil)J adriamicina, respectivamente, como descrito na forma preferida aqui descrito.

Como se pode observar das fórmulas citadas anteriormente, as acil-hidrazonas intermediárias desta invenção incluem hidrazonas de qualquer das antraciclinas conhecidas tais como de adriamicina, daunomicina, e carcinomicina. Era adição, os intermediários incluem derivados de acil-hidrazona em sítios

,.ç4»

específicos da estrutura da antracíclina, por exemplo, hidrazona de 4¹-THP-adriamicina e hidrazona de 3'-desamino-3'-(3-ciano-4-morfonil)adriamicina. Estes intermediários últimos podem ser sintetizados primeiro por derivação da antracíclina para formar um análogo pretendido e em seguida utilizando-se esse análogo para preparar o intermediário de hidrazona desta invenção. Os análogos de antracíclina conhecidos incluem-se na patente de invenção Norte Americana 4 464 529 e 4 301 277, análogos de antracíclina 3'-desamino-3'-(4-morfolinil) ou 3'-desamino-3'-(3ciano-4-morfolinil), nas patentes de invenção Norte Americana 4 202 967 e 4 314 054, análogos de antracíclina 3'-desamino-3'-(1piperidinil) ou 3'-desamino-3'-(4-metoxi-l-piperidinil) , na patente de invenção Norte Americana 4 250 303, análogos de Nbensil ou Ν,Ν-dibenzil antracíclina, patente de invenção Norte Americana 4 591 637, análogos N-metoximetil ou N-cianometil de antracíclina e na patente de invenção Norte Americana 4 303 785, análogos acetálicos de antracíclina.

Assim, os análogos de antracíclina conhecidos podem fazer-se reagir, como descrito anteriormente, (ver figura 1) para produzir novas acil-hidrazonas que em seguida se podem conjugar com um anticorpo ou com um ligando de especificidade desejada, como referido anteriormente.

Alternativamente, uma acil-hidrazona intermediária não derivada desta invenção pode produzir-se primeiro como descrito anteriormente a partir da antraciclina não derivada, tal como a adriamicina, daunomicina ou carminomicina e este novo intermediário derivado para produzir depois uma nova acilhidrazona substituída como pretendido. Por exemplo, pode-se fazer derivar ADM-HZN no seu radical amino açúcar por animação redutora com 2,21-oxidiacetaldeída utilizando o processo descrito na patente de invenção Norte Americana 4 464 529 para produzir a hidrazona 3'-desamino-3'-(3¹-ciano-4-morfolinil) adriamicina. Identicamente, pode fazer-se derivar ADM-HZN no grupo amino açúcar para preparar novos derivados de acil-hidrazona como por exemplo, a hidrazona 3'-desamino-3(4-morfolinil)adriamicina, (ver patente de invenção Norte Americana 4 301 277), a hidrazona 3'-desamino-3(1-piridinil)adriamicina (ver patente de invenção Norte Americana 4 202 967), a hidrazona

3’-desamino-3'-(4-metoxi-l-piperidinil)adriamicina (ver patente de invenção Norte Americana 4 314 054) a hidrazona N-benzil adriamicina e a hidrazona de Ν,Ν-dibenzil adriamicina (ver patente de invenção Norte Americana 4 250 303) ou a hidrazona de N-metioximetil adriamicina e a hidrazona N-cianometil adriamicina (ver patente de invenção Norte Americana 4 591 637) . Também se pode fazer derivar ADM-HZN na posição de fórmulas gerais I a III como descrito na patente de invenção Norte Americana 4 303 785 para se obterem derivados acetálicos de hidrazona tal como 4’-THP-ADM-hidrazona.

Deve entender-se que estes novos processos para a derivação de acil-hidrazonas da presente invençãpodem utilizar como materiais iniciais hidrazonas de antraciclinas diferentes da adriamicina tais como a daumicina ou carminomicina, para a preparação de novos compostos como por exemplo a hidrazona de N-benzil daunomicina ou a hidrazona de 3'-desamino-3'-(4morfolinil) carminomicina, que também são abrangidas pelo âmbito da presente invenção.

A avaliação dos imunoconjugados da antraciclina-anticorpo preparados de acordo com a presente invenção mostrou que os imunoconjugados retêm a actividade de ligação com o anticorpo e exibem um anticorpo dirigido para a morte celular de células de linfoma e de carcinoma sob diversas condições de ensaio. Assim, as células que possuem o antigénio para o qual o anticorpo do conjugado é dirigido foram mortas eficientemente pela antraciclina embora as células que não possuem o antigénio apropriado não tivessem sido mortas. De facto, em diversas experiências, descobriu-se que a. antraciclina libertada no anticorpo era mais potente do que a quantidade do equivalente de antraciclina não conjugada. As diferenças nos mecanismo de aprensão da célula tumoral e nos mecanismos de transporte intracelular podem ser responsáveis pelas diferenças de potência entre o fármaco livre e o fármaco conjugado, observadas.

Além disso, estudos utilizando enxertos do tumor humano em murganhos demonstraram, a capacidade dos imunoconjugados da presente invenção para inibir o desenvolvimento de tumor in vivo, conduzindo em alguns casos a uma regressão completa do tumor. Os imunoconjugados demonstraram possuir uma potência superior e inibire-ψ o desenvolvimento do tumor numa maior extensão do que as antraciclinas não conjugadas. Também, os imunoconjugados foram tolerados pelos animais muito melhor do que o fármaco livre sendo pelo menos dez vezes menos tóxico do que a antraciclina não conjugada por si só.

As propriedades de ligação e de citotoxicidade dos imunoconjugados da presente invenção apresentam-se como representado uma melhoria sobre os imunoconjugados descritos na literatura em que as antraciclinas foram ligadas directamente com o anticorpo através de uma porção de amino açúcar de antraciclina. Estes imunoconjugados ligados através da atracção amino açúcar continham frequentemente proporções moleculares antraciclina, anticorpo menores e exibiam citoxicidade relativa reduzida para o fármaco livre e propriedades de ligação com o anticorpo reduzidas, (ver, por exemplo, R. Arnou et Al., Immunological Rev. 62, Supra, E. Hurwitz et Al., Câncer Res., 35, Supra, e R. Yamamato et Al., Supra). Além disso, os estudos de estabilidade realizados com os imunoconjugados da presente invenção indicaram que a antraciclina era libertada dos imonoconjugados sob condições de redução ou condições ácidas idênticas às que se encontram, no ambiente celular. Portanto, a retenção da actividade citotóxica do fármaco, elevada, observada com os imunoconjugados descritos, aqui, pode ser exemplificada pelo facto de que o fármaco relativamente inalterado é libertado nas células alvo.

Além disso, estamos aptos a optimizar as condições de reacção de forma a que as relações molares antraciclinas/anticorpo de aproximadamente 4-10, sejam alcançadas, utilizando-se vários anticorpos de diferentes isotipos. A quantidade de proteína recolhida após a condensação com o derivado ADM-HZN desceu dramaticamente quando se alcançaram relações molares maiores que 10.

Parece que a principal limitação para a obtenção de conjugados com relações molares maiores do que 10, deve-se à solubilidade reduzida dos conjugados em solução aquosa e à associação física da antraciclina cora a proteína.

Os estudos in vitro também demonstraram a capacidade dos conjugados antraciclina-ligando da presente invenção para matarem células alvo. Por exemplo, os presentes estudos demonstraram que certos conjugados de antraciclina-ligando desta invenção retinham a sua actividade de ligação com o receptor específico enquanto exibiam citotoxicidade para a célula de tumor. Assim um conjugado cis-bombesina-ADM preparado como descrito anteriormente, demonstrou uma actividade de ligação para uma linha de células positivas ao receptor de bombesina equivalente ao observado com cis-bombesina não conjugada e que era altamente citotóxica para a linha de células de fibroblasto transformadas, in vitro, de facto, o conjugado cis-bombesina-ADM foi mais potente do que ADM livre ou ADM-HZN. Também se preparou, como descrito anteriormente, ura conjugado EGF-ADM assim como um conjugado transferrina-ADM.

Nos estudos in vivo, que demonstraram a actividade antitumor reforçada dos imunoconjugados desta invenção para lá da do fármaco livre, assim como a toxicidade sistémica reduzida indicaram um índice terapêutico acrescido para os conjugados. Assim, a presente invenção também abrange as composições farmacêuticas associações e métodos para o tratamento de doenças como os cancros e outros tumores, de infecções patogénicas virais não citocídicas ou outras doenças autoimunes. Mais particularmente, a presente invenção inclui os métodos para o tratamento de doenças de mamíferos em que uma quantidade eficaz do ponto de vista farmacêutico de pelo menos um conjugado contendo antraciclina que se administra de uma forma habitual a hospedeiros mamíferos.

Aspectos alternativos dos métodos da presente invenção incluem a administração, quer simultânea quer sequencial, de diferentes conjugados, isto é, que comportam diferentes antraciclinas ou diferentes anticorpos ou diferentes ligandos, para se utilizar nos métodos de quimioterapia de associação.

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V

Por exemplo, um aspecto da presente invenção pode envolver o uso de imunoconjugados de antraciclina em que a especificidade do anticorpo componente do conjugado varia, isto é, utilizaram-se vários imunoconjugados contendo cada um um anticorpo que se liga especificamente com diferentes antigénios ou com diferentes sítios ou epítopes do mesmo antigénio presente numa população celular com interesse. 0 componente da antraciclina deste imunoconjugado pode ser igual ou diferente. Por exemplo, este aspecto pode ser especialmente útil no tratamento de certos tumores onde as quantidades de diferentes antigénios da superfície de um tumor são desconhecidos ou a população celular tumoral é heterogénea na expressão do antigénio e se deseja assegurar que uma quantidade eficiente do fármaco é dirigida para todas as células do tumor no sítio do tumor. 0 uso de conjugados que comportam especificidade antigénicas ou de epítope diferentes para o tumor, aumenta a probabilidade de obtenção de fármaco suficiente no sítio do tumor. Além disso , este aspecto é importante para o alcance de um grau elevado de especificidade para o tumor porque a probabilidade de que o tecido normal possua todos ou os mesmos antigénios associados com o tumor é pequena (ver, por exemplo, I. Hellstrom et Al., Monoclonal Antibodies to TNO Determinants of Melanoma - Antigen p. 97 Act Synergistically in Complement - Dependent Cytotoxicity, J. Immunos., 127 (ns 1), pp 157-160 (1981)].

De um modo alternativo, podem-se utilizar diferentes imunoconjugados em que apenas o componente de antraciclina do conjugado varia. Por exemplo, um anticorpo particular pode ser ligado a adriamicina para formar um imunoconjugado e pode ser ligado a daunomicina para formar um segundo imunoconjugado. Ambos os conjugados podem depois administrar-se a um hospedeiro a ser tratado e localizado, devido à especificidade, do anticorpo, no sítio da população celular seleccionada que se deseja eliminar. Ambos os fármacos podem em seguida ser libertados nesse sítio. Este aspecto pode ser importante quando existe a incerteza se a resistência ao fármaco de uma população celular particular, tal como um tumor, porque este método permite a libertação de diferentes fármacos no sítio ou nas células alvo. Um aspecto adicional inclui a conjugação de mais do que uma antraciclina com um anticorpo particular para formar um imunoconjugado que comporta diferentes espécies de moléculas de antraciclina na sua superfície, todas ligadas ao anticorpo através da ligação 13ceto acil-hidrazona. A administração do imunoconjugado deste tipo resulta na libertação de diferentes fármacos no sítio de ou nas células alvo.

Além disso, uma associação de anticorpo-antraciclina e de conjugados antraciclina-ligando pode utilizar-se de forma a que o fármaco possa alvejar uma população celular que comporta um anticorpo específico assim como um receptor para um ligando específico na sua superfície também, um tipo de antraciclina ou diferentes fármacos se podem utilizar nesta transferência de associação.

Os conjugados de antraciclina na presente invenção podem administrar-se sob a forma de composições farmacêuticas convencionais para a administração, incluindo mas não de composições farmacêuticas convencionais para a administração, incluindo mas não limitando a administração endovenosa, intraperitoneal, oral, intralinfática, ou administração directa no sítio de uma população celular escolhida como por exemplo, um tumor. É preferida a administração endovenosa . No caso de imunoconjugados para tratamento in vivo, pode ser útil utilizar conjugados que contêm fragmentos de anticorpo como por exemplo FAB ou FAB'2 ou anticorpos quiméricos.

As composições farmacêuticas da presente invenção - contendo conjugados de antraciclina - podem constituir-se em diversas formas posológicas que incluem mas não estão limitadas a formas sólidas, semi-sólidas e líquidas tais como comprimidos, pílulas, pós, soluções ou suspensões líquidas, supositórios, microcápsulas de polímero, ou microvesícuias, liposomas e soluções injectáveis ou profundíveis. As formas preferidas dependera da forma de administração e da aplicação terapêutica.

As composições farmacêuticas podem ainda incluir veículos aceitáveis do ponto de vista farmacêutico convencionais conhecidos como proteínas séricas como a albumina de soro humano, substâncias tampão como o sulfato, água ou sais ou electrólitos.

A forma mais eficaz de administração e do regime posológico para as composições de conjugados desta invenção depende da gravidade e da evolução da doença do doente e da resposta ao tratamento e da opinião do médico assistente. Deste modo, as doses do conjugado e de quaisquer compostos acompanhantes devem ser estabelecidas individualmente. No entanto, uma dose eficaz de um imunoconjugado desta invenção pode estar compreendido entre cerca de 1 e entre cerca de 100 MG/M2 de antracíclina e entre cerca de 500 e 5.000 MG/M2 de anticorpo. Uma dose eficaz de conjugados antraciclina-ligando pode estar compreendida entre cerca de 1 e cerca de 100 MG/M2 de antracíclina e entre cerca de 1 e cerca de 100 MG/M2 de ligando.

A fim de que a presente invenção aqui descrita possa ser totalmente compreendida, são indicados os exemplos que se seguem. Deve entender-se que estes exemplos são para síntese de compreensão apenas e não são construídos como limitadores do âmbito da presente invenção em qualquer sentido.

.i

Exemplo 1 exemplo que se segue demonstra a produção de um imunoconjugado de antraciclina novo, de acordo com a presente invenção, em que o fármaco está ligado directamente a um anticorpo monoclonal através de uma ligação de hidrazona na posição 13-ceto do fármaco.

Este aspecto particular descrito neste exemplo relaciona-se com a conjugação de ADM com o anticorpo monoclonal para formar um imunoconjugado que tem uma estrutura adaptadora com uma ligação de acil-hidrazona no seu ponto de ligação com a molécula de ADM do imunoconjugado, o adaptador contém ainda uma ponte dissulfureto como parte da sua ligação ao anticorpo. Este aspecto também proporciona um novo derivado acil-hidrazona de ADM (ADM-HZN).

Síntese de Adriamicina Hidrazona

Como fase inicial na preparação do imunoconjugado deste aspecto concreto, um derivado de ADM-hidrazona sintetizou-se primeiro do seguinte modo: 0,3 ml de hidrazina 1 M, isto é, NH₂ NH em solução em álcool isopropílico foi adicionada a uma solução arrefecida de PDP (70 mg, 022 mmoles) em 3 ml de tetra-hidrofurano (THF). Após agitação durante 20 minutos, à temperatura de 0°C, extraiu-se o produto cora cloreto de metileno, lavou-se com solução saturada de cloreto de sódio e secou-se com carbonato de potássio. Após evaporação dos dissolventes, cromatografou-se o resíduo obtido em alumina neutra (5% de álcool raetílico, 95% de cloreto de metileno) para se obterem 21 mg, rendimento 41% de hidrazida de 3-(2piridiltio)propionilo, composto 2 da figura 1. A hidrazida e o cloridrato de adriamicina, obtidos de Sanruku Inc. Japan, 48 MG (0,083 mmoles) dissolveram-se em 5 ml de álcool metílico e em seguida agitou-se na ausência de luz à temperatura ambiente durante 6 dias.

A reacção foi seguida por cromatografia em camada fina de fase inversa (TCS) (álcool metílico - água a 2-1, contendo acetato de amónio a 3% P/V). Após este período, evaporou-se o dissolvente e cromatografou-se o resíduo numa coluna C18 (MEOH:H 0 = 3:2, contendo NH OAC a 3% P/V).. Reuniram-se as fracções e liofilizaram-se eliminando-se o excesso de acetato de amónio sob f

V.

pressão reduzida. Dissolveu-se o resíduo em álcool metílico e precipitou-se por adição de acetonitrilo para fornecer 45 mg (rendimento 72%) de cloridrato de adriamicina 13-(3-(2-piridilditio)propionil }-hidrazona, referido aqui como ADM—

-HZN (composto 4 da figura 1). A ADM-HZN caracterizou-se do seguinte modo: ponto de fusão superior a 125° escurecendo a cor e não se definindo bem;

(acetona -	d., )1.25 (s, 3H,J=6Hz), 0	1.77	(m,lH),	2.06	(m, 1H) ,
2.30	(m,lH)	, 2.53 (d,lH, J=15Hz), 2.8	9-3.18	(m,6H),	3.71	(m,lH),
3.85	(m,lH)	, 3.97 (m,lH), 4.07 (S,3H)	, 4.78	(s,2H) ,	5.21	(m,lH) ,
5.58	(t,lH,	J=7Hz), 7.12 (m,lH), 7.64	(d,lH,	J=8Hz),	7.75	(m,2H),
7.90	(t,lH,	J=8Hz), 7.98 (d,lH,J=8Hz:	), 8,37 (d,lH,	J=4Hz)	, 10.50
(s,lH), 105	2 (S,1H), 14.19 (bs,lH);	IR (KBr) 3438	, 1674	, 1618,

1579, 1419, 1286, 1016, 988, 698 cm“¹ ; FA BMS (glicerol) m/e

755 (M+l), 737, 645, 625, 609.

u*.

S

Tiolação dos Anticorpos Monoclonais

Antes da reacção do composto ADM-HZN preparado como descrito anteriormente com um anticorpo monoclonal de interesse, o anticorpo teve que ser tiolado, isto é, tiveram que se introduzir grupos sulfidrilo na molécula do anticorpo.

Os anticorpos monoclonais que foram utilizados foram: 1) 5E9, um anticorpo IgGl reactivo com o receptor de transferrina em todas as células humanas em vários tipos histológicos de células cancerosas; 2) T33A1, aqui referido como 3A1, um anticorpo IgGl reactivo com o antigénio de células T humanas de 4 KD que também se encontra em certas leucémias de células T; 3) G.28.5, um anticorpo de IgGl reactivo com o antigénio de células B humanas de 50 KB e ainda reactivo com linfomas de células B humanas; 4) G28.1, um anticorpo de IgGl reactivo com o antigénio de células B humanas de 39 KB e ainda reactivo com linfomas de células B; e 5) L6, um anticorpo de IgG 2A reactivo com o antigénio glicolipídico do carcinomas do pulmão de células pequenas não humanas.

Os hibridomas que segregam os anticorpos monoclonais 5E9 e T33A1 obtiveram-se da American Type Culture Collection (ATCC).

Purificaram-se os anticorpos respectivos produzidos por líquido .¾ ascítico em murganhos BALB/C de acordo com o processo de C. Bruck et Al., One-Step Purification of Mouse Monoclonal Antibodies From Ascitic Fluid By DEAE - AFFIGEAL Blue Chromatography, J. Immunol Methods, SB, pp 313-19 (1982). Os anticorpos purificados G28.5, G28.1 e L6 foram fornecidos pelos Drs. J. Ledbether e I. Hellstrom (Oncogen, Seattle, Wa).

Os hibridomas que segregam os anticorpos monoclonais L6 e G28.5 foram depositados na ATCC e, 6 de Dezembro de 1984 e em 22 de Maio de 1986, respectivamente, sob os números de aceitação da ATCC HB 8677 e HB 9110. O anticorpo monoclonal G28.1 é um dos anticorpos conhecidos como reactivo com o maior epítope de antigénio CD37 e foi caracterizado por A.J. Michael (Ed.), Leukocyte Typing III, Oxford University Press (Reino Unido,

1987). Diversos destes anticorpos anti-CD37 estão comercializados.

A tiolação de qualquer destes anticorpos com SPDP realizou-se do seguinte modo: dissolveu-se SPDP (Pierce Chemical Co., II), (50 MM), em etanol, adicionou-se ao anticorpo monoclonal escolhido, por exemplo, 5E9 (5-10 MG/ML) em PBS (tampão de fosfato em solução de cloreto de sódio, PH 7,2) para se obter uma concentração final entre 5 e 10 MM. A mistura reaccional incubou-se durante 30 minutos à temperatura de 30° C. Separou-se a quantidade de SPDP que não reagiu do anticorpo derivado com SPDP por cromatografia de filtração por gel utilizando-se uma coluna PD-10, Pharmacia. Os grupos de protecção tiopiridílicos eliminaram-se por redução com excesso de ditiotreitol. Os anticorpos reduzidos passaram através de uma coluna PD-10 e os anticorpos que continham tiol livre foram utilizados para a condensação com o derivado ADM-HZN (ver figura 2).

Os grupos tiol reactivos foram também introduzidos na proteína do anticorpo utilizando-se 2-iminotiolano: o anticorpo (5-10 MG/ML em 50mM trietilamina, 50 mM NACL, lmM EDTA, PH 8,0) foi misturado com 2-IT (Pierce Chemical, Co.,IL) para uma concentração final entre 5 e 10 mmoles) Deixou-se a reacção processar durante 90 minutos à temperatura de 4° C e separaram-se os anticorpos tiolados por meio de uma coluna PD-10 equilibrada com NACI 2M/PB5.

Detectaram-se certos grupos tiol reactivos incorporados nos anticorpos utilizando-se DTNB (ácido 5,5'-ditiobis-(2-nitrobenzóico) (E 412 = 14150) de acordo com o processo de G.L. Ellman, Arch. Biochem. Biophys., 82, pp 70-77 (1959).

{

Conjugação de Anticorpos Monocionais Tiolados com ADM-HZN

Foram realizadas em seguida várias conjugações em que os anticorpos monocionais tiolados citados anteriormente foram ligados a ADM-HZN (ver figura 2).

Dissolveu-se ADM-HZN em metanol e adicionou-se a anticorpos tiolados com SPDP em PBS ou tiolados com 2-IT em NACL 2M/PBS numa experiência típica, adicionaram-se dez equivalentes de ADM-HZN aos anticorpos monoclonais que continham entre 10 a 20 grupos tiol reactivos. A reacção de conjugação foi realizada por incubação durante a noite à temperatura de 4° C. Centrifugou-se a mistura reaccional a 10000 x G e a ADM conjugada foi em seguida separada da ADM que não reagiu por passagem através de uma coluna PD-10. A quantidade de antraciclina conjugada ligada com o anticorpo foi determinada por absorvência a 495 NM (E 496 = 8030) . A quantidade de proteína do anticorpo determinou-se por absorvência a 280 NM (1 MG/ML = 1,4 unidades DO). Para corrigir a sobreposição da absorvência de ADM a 280 NM, realizou-se a seguinte fórmula:

-(0,72 x A )

280 ^v 280

Anticorpo (MG/ML) =

1/4 ,/

ί.

Os imunoconjugados analisaram-se para detecção da presença de ADM ou derivados de ADM não conjugados por HPLC. Realizou-se a análise de HPLC numa coluna Phenomenex preenchida com pérolas de 5-microns IB-SIL C18. Aplicou-se à coluna ADM-HCL não conjugado, ADM-HZN (0,1 mmoles) , ou imunoconjugados contendo 0,5 a 5 mmoles de equivalentes do fármaco e eluíu-se com metanol e fosfato de amónio 10 MM, PH 4,5 (70:30) a 1,5 Ml/minuto. Todos os imunoconjugados produzidos continham quantidades não significativas (< 1%) de fármaco não conjugado quando se analisou por HPLC.

Caracterização dos Imunoconjugados da Presente Invenção.

Os imunoconjugados produzidos deste modo eram constituídos por moléculas de ADM conjugadas, na posição 13-ceto, com uma estrutura adaptadora que formava uma ponte entre o fármaco e o anticorpo monoclonal respectivo. Além disso, a adição do anticorpo monoclonal com grupos tiol livres ao derivado ADM-HZN, que continha uma ligação dissulfureto protegida com tiopiridilo levou à formação de uma ligação dissulfureto no adaptador juntando ADM aos anticorpos (ver figura 2). Os imunoconjugados /

( /' produzidos de acordo com este processo incluem, , mas não estão limitados a, 5E9-ADM-7,5, 3A1-ADM-7,O, L6-ADM-9,0 e G

28,l-ADM-9,0, em que a primeira parte da designação refere o anticorpo monoclonal utilizado para formar o conjugado, a segunda parte da designação representa a antraciclina ligada ao anticorpo e o número na designação representa a relação molar ADM/anticorpo no imunoconjugado referido.

As proporções molares ADM/anticorpo alcançados de acordo com este processo dependeram do número de grupos tiol introduzidos no anticorpo monoclonal e da quantidade de derivado ADM-HZN adicionado ao anticorpo tiolado. Os diagramas de varrimento representados nas figuras 3 e 4 mostram que as relações ADM/anticorpo de 3 para 4 se conseguiram quando ADM-HZN se condensou com o anticorpo monoclonal 5E9 ou com o anticorpo monoclonal 3A1 que contêm aproximadamente oito grupos tiol. Tipicamente, um escesso molar de 10 vezes de ADM-HZN relativamente à proteína foi adicionado nestas reacções. Quando se utilizaram anticorpos apresentando 18 a 25 grupos tiol a relação ADM/anticorpo aumentou para 8 a 10. Não se observou diferença significativa nas relações ADM/anticorpo quando se utilizou SPDP em substituição de 2-IT para tiolar o anticorpo monoclonal (comparar as figuras 3 e 4). Contudo, a proteína final obtida após a conjugação do fármaco de anticorpo apresentou-se um pouco mais elevada com os anticorpos SPDP tiolados quando comparada com os anticorpos tiolados com 2—IT. (ver figura 5).

Rendimentos de proteína entre 50% e 80% foram obtidos regularmente com os anticorpos tiolados com SPDP tais como os anticorpos 5E9 e 3A1 embora se obtivessem rendimentos de 20-50% cora os mesmos anticorpos quando tiolados utilizando-se 2imidotiolano. Além disso, obteve-se um rendimento algo melhor de imunoconjugados utilizando-se anticorpos monoclonais de isotipo IgGl como por exemplo 5E9 e 3A1 para as conjugações que se realizaram com SPDP ou 2-IT (ver figuras 6 e 7).

A actividade de ligação dos imunoconjugados da presente invenção determinou-se através de um ensaio de competição 1 25 envolvendo a aplicação de um anticorpo marcado com I ✓

Suspenderam-se 1x10 células de antigénio positivas e de antigénio negativas respectivas em 0,1 ml de RPMI 1640 contendo FBs a 2% e misturaram-se com 0,1 ml de anticorpo monoclonal não conjugado diluído em série duas vezes ou de imunoconjugado a concentrações que se iniciavam a 50 MG/ML. As suspensões celulares, em duplicado, incubarara-se sob agitação à temperatura de 4° C durante uma hora. As células foram em seguida lavadas duas vezes e suspensas em -1 ml contendo 5 MG/ML de anticorpo homólogo marcado com 125 (actividade específica de 1-50 x 10 CPM/MG de proteína de anticorpo). Incubaram-se as amostras à temperatura de 4° C durante uma hora e cobriram-se com 0,15 ml numa mistura a 1:1 de dibutil: ftalato de dinomilo que estava a uma temperatura de 4° C. (centrifugaram-se as amostras a lOOOOxG

f * durante um minuto à temperatura de 4° C e fizeram-se as contagens das células ligadas (Pellet) utilizando-se um contador gama LKB.

A retenção de actividade de ligação pelso imunoconjugados desta invenção representa-se no Quadro I seguinte.

Quadro 1

Afinidade de Ligação Relativa Avaliada Após a Conjugação com ADM-HZN

Inibidor Ratio Molar

Marcador xlO t

xlO M

-K conj 7 xlO L/M

125

5E9- I 125

3A1- I

Adaptador-SPDP 5E9-ADM 3.5

4.0

4.9

6.8

8.5

3A1-ADM 2.6

3.3

4.2

6.7

125

5E9- I

125

3A1- I

Adaptador-2-ΙΤ 5E9-ADM 5.6

6.7

3AI-ADM 6.0

125

5E9- I

125

3A1- I

4.2

6.7

4.2

4.2

10.0

4.2

1.3

8.3

7.3

4.1

4.7

4.0

3.2

5.1

3.4 2.6

2.1 1.0,

4.0 3.0

2.1 1.6

2.1 0.7

1.3 1.5

1.3 5.1

1.3 0.8

1.3 0.9

4.0 3.1

4.0 2.7

1.3 1.6 '1 ' t

Concentração molar do conjugado de anticorpo dando 50%.

inibição do anticorpo marcado.

[T ] = t ccnj concentração molar do anticorpo que fornece 50% inibição do anticorpo marcado.

Afinidades relativas (K) calculadas utilizando-se a formula:

K conj = [T_t 1 constante de equilíbrio de MAb não conjugado determinado por análise de Scatchard*.

Como se mostra no Quadro, os imunoconjugados de 5E9 preparados utilizando-se SPDP e com relações molares variando entre 3,5 e

8,5 retêm mais de 80% da sua actividade de ligação original quando se compara com ο 5E9 não conjugado. Os imunoconjugados de 5E9 preparando-se usando-se 2-IT também retêm grandes actividades de ligação . Os imunoconjugados de 3A1 preparados utilizando SPDP mostraram alguma perda na actividade de ligação com o anticorpo. Em geral, a conjugação de ADM a estes ou a outros anticorpos resultou numa perda em grau relativamente pequeno de actividade de ligação com o anticorpo.

A figura 8 mostra as curvas de ligação de dois imunoconjugados desta invenção, 5E9-ADM-7,5 e 3A1-ADM-7,O, comparadas com as curvas de ligação de anticorpos monoclonais não conjugados 5E9 e 3A1. Para a obtenção destas curvas, incubaram-se os imunoconjugados à temperatura de 4 C em 0,1 Ml de meio de crescimento completo contendo 1x10 células alvo HSB-2 antigénio-positivas. Após uma hora, lavaram-se duas vezes as células no meio e incubaram-se durante mais 30 minutos em 0,1 Ml de meio contendo numa diluição a 1:40, de IgG de caprino e murganho marcada com FITC (Boehringer-Mannheim). Analisaram-se as células num analizador de células florescente Coulter Epics V. Comparou-se a fluorescência da superfície celular com a fluorescência obtida utilizando-se anticorpo monoclonal não conjugado com a mesma diluição. Como a figura indica, a actividade de ligação de cada um dos imunoconjugados foi conservada como demonstrou o facto da concentração de /

λ' y

imunoconjugados requeridos para saturar as células antigéniopositivas ser pelo menos o dobro da diluição maior do que a concentração necessária para o anticorpo não conjugado. As diferenças nos níveis de intensidade fluorescente entre os anticorpos não conjugados e os imunoconjugados verificou-se serem provenientes da ligação reduzida do reagente, caprino FITC anti-murganho, com o imunoconjugado quando comparada com a ligação com o anticorpo não conjugado.

A estabilidade de um imunoconjugado deste tipo - um conjugado L6-ADM - a diversos valores de PH, varia entre 4,0 e 7,0 foi analisada por aplicação de HPLC.

O conjugado L6-ADM-9,0 incubou-se em tampões de fosfato a cada um dos valores de PH indicados durante 24 horas à temperatura de 37°C. Em seguida aplicou-se cada uma das soluções a uma coluna de HPLC e determinou-se a quantidade de fármaco não-conjugado. Como representado da figura 9,o produto isolado detectou-se após 24 horas de incubação em colunas com diferentes valores de PH com tempo de retenção idêntico ao do padrão de ADM-HCL. A quantidade de material libertado do imunoconjugado após 24 horas aumentou quando o PH diminuiu de 7 para 4. 0 controlo não tratado representa a cromatografia do conjugado conservado à temperatura de -20^ C num tampão de fosfato com um PH de 7,4. Portanto, parece que o imunoconjugado

/'* tf tem um grupo de ligação sensível ao ácido que resultou na libertação de ADM a partir da proteína de anticorpo. Estes resultados são consistentes com a existência de uma ligação de hidrazona unindo o ADM à estrutura adaptadora como representado na figura 2.

De acordo com este aspecto de exemplo, o ADM foi ligado ao anticorpo através de uma estrutura adaptadora que também continha uma ligação dissulfureto (vêr figura 2). Deve portanto ser possível libertar um grupo ADM por redução de um imunoconjugado deste tipo com DTT. Portanto, o conjugado de L6-ADM, L6-ADM-9,0, tratou-se com dez vezes um excesso de DTT, incubou-se à temperatura ambiente durante 15 minutos e aplicou-se a uma coluna de HPLC. Desenvolveram-se padrões de ADM-HCL e de ADM-HZN simultaneamente, cujos picos dos cromatogramas são representados na figura 10. 0 conjugado L6-ADM-9,0 não apresentou um pico detectável do fármaco não conjugado antes da adição de DTT. A análise por HPLC forneceu a aparência de um pico único com um tempo de retenção da coluna mais idêntico ao do derivado ADM-HLC do que ao do derivado ADM=HZN (ver figura 10). A quantidade de ADM libertada após o tratamento com DTT foi aproximadamente de 99% dos equivalentes de ADM iniciais ligados ao anticorpo. Os resultados experimentais das figuras 9 e 10 demonstram que o grupo de ADM é libertado do imunoconjugado da presente invenção sob condições fisiológicas, isto é, condições de redução e em meio ácido, tipicas do ambiente celular.

'K

Actividade Citotóxica dos Imunoconjugados desta Invenção

Os imunoconjugados da presente invenção foram testados in vitro para a determinação da citotoxicidade utilizando-se diversos sistemas de ensaio. De acordo com um ensaio de formação de colónia em agar hoje, desenvolveram-se células daudi (o linfoma de Burkitt), obtidas da ATCC (fenotipo : 5E9+, 3A1-) em meio completo (RPMI 1640 mais soro de vitela fetal a 10%). Expuseram-se IxlO⁵ células em 1 Ml de meio durante uma hora e meia diluição em série de imunoconjugados de 5E9-ADM ou 3A1-ADM e ADM não conjugada. Realizaram-se determinações em triplicado para cada diluição. Os controles eram constituídos por células tratadas de um modo idêntico não expostas aos fármacos. Em seguida, lavaram-se as células e suspenderam-se em meio RPMI 1640 contendo FBS a 15% e agarose a 0,3% (Marine Colloid). Em seguida, sobrepôs-se 1 Ml da suspensão celular, 1x10 células sobre uma camada de agarose a 0,4%, em placas microtituladas de 6 cavidades (Costar). Incubaram-se as amostras durante 7-10 dias à temperatura de 37°C e coraram-se as colónias resultantes com 0,5 Ml de violeta de P-iodonitrotetrazólio a um MG/M1 (Sigma), durante 48 horas. Contaram-se as colónias num analisador de imagem 40-10 Optimax e determinou-se a inibição na formação de colónias comparando-se as células tratadas com o fármaco ou tratadas com imunoconjugados , com as células não tratadas que constituem o controlo.

%

Τ'

A Figura 11 mostra a comparação da actividade citotóxica do conjugado 5E9-ADM, conjugados 5E9-ADM-7,5 e de 3A1-ADM, 3A1-ADM-7,0 após exposição durante uma hora e meia de linhas de células de linfoma de Burkitt antigénio 3A1 negativas e antigénio 5E9 positivas, Daudi. Ambos os imunoconjugados prepararam-se com tiolação por meio de aplicação de 2-IT. A comparação das curvas dose-resposta mostra que o conjugado 5E9-ADM-7,5 que reteve 93% da actividade de ligação original para as células alvejadas que transportam antigénio (ver figura 8) foi significativamente mais potente do que o conjugado 3A1-ADM-7,O, o conjugado-controlo de não ligação.

ensaio de diluição limitador, que fornece uma medida da mortalidade celular, log foi utilizada para testar a actividade citotóxica do fármaco, dos dois imunoconjugados mencionados anteriormente, utilizando-se um esquema de exposição mais longo (24 horas). Este ensaio foi realizado utilizando-se células Namalwa do fenotipo 5E9 ,3A1 , essencialmente como descrito por M. Colombatti et Al., Selective Killing of Target Cells by Antibody-Ricin a Chain or Antibody - Gelonin Hybrid Molecules : Comparsion of Cytotoxic Potency and Use in Immunoselection Procedures' J. Immunol, 131, pp. 3091-95 (1983). Obtiveram-se as células na ATCC, que se incubaram com os imunoconjugados durante 22 horas, lavaram-se e determinou-se a mortalidade celular log. Esta foi calculada com base na eficácia de plaqueação que se avaliou pela porção de cavidades sem

crescimento, nas concentrações celulares limitadoras.

Como se mostra na figura 12, o conjugado 5E9-ADM-7,5 produziu mortalidade celular maior 1-2 logs nas concentrações testadas quando comparado com o conjugado 3A1-ADM-7,O de não ligação. Para a dose mais alta de 5E9-ADM-7,5 mediu-se a mortalidade celular até 5 logs.

Adicionalmente, embora se detectase actividade citotóxica para o imunoconjugado 3A1 não ligando de não ligação, o nível de citotoxicidade foi menor do que uma quantidade equivalente de ADM não conjugado.

Contudo, a actividade do imunoconjugado 5E9 foi, a concentrações diversas, superior do que uma dose equivalente de

ADM livre.

Como anteriormente afirmado, os imunoconjugados 5E9-ADM-7,5 e 3A1-ADM-7,O sintetizaram-se utilizando-se 2-IT como agente de tioação. Também se observou citotoxicidade imunoespecífica com imunoconjugados preparados utilizando-se SPDP como agente de tiolação. A figura 13 mostra a actividade citotóxica selectiva de imunconjugados 5E9-ADM- e 3A1-ADM preparados com f ί

SPDP como agente de tiolação, sobre células daudi, utilizando-se o ensaio de formação de colónias em agar mole, anteriormente citado.

Na figura 13 apresentam-se mais provas de citotoxicidade selectiva dos imunoconjugados preparados com SPDP, em que se testou o imunoconjugado G.28.l-ADM-9,0 em duas linhas de células positivas para o antigénio G.28.1, daudi e naraalwa e sobre a linha de células de leucémia de células T humana negativa para o antigénio G.28.1, HsB-2, utilizando-se um ensaio de formação de colónia em agar mole. Obtiveram-se as células HBsna ATCC. Como se mostra na figura, o imunoconjugado apresentou citotoxicidade para as duas linhas de células positivas de antigénio mas não para a linha de células de antigénio-negativas.

Também se observou a morte preferêncial de células de antigénio positivas pelo imunoconjugado 5E9-ADM-7,5 no ensaio de formação de colónia usando-se a linha de células de carcinoma de colon humano dependente de ancoragem, HCT116, que se obteve por doação do Dr. M. Brattain [Bristol Baylor, Labs, Houston, Texas].

Retiraram-se culturas em mono-camadas de células de carcinoma /

em frascos de cultura com tripsina-ETA (GIBCO), lavaram-se e passaram-se através de uma agulha de calibre 22 para se obter uma suspensão celular simples. Diluiram-se em série conjugados 5E9ADM-7,5, 3A1-ADM-7,O ou ADM não conjugado em 0,2 ml de meio contendo lxlO⁵ de células de carcinoma. Fez-se cada diluição em triplicado. Os controlos incluíam células não tratadas ou células tratadas com anticorpo.

Incubaram-se as células durante 3 horas, lavaram-se uma vez como meio e plaquearam-se 1x10^ células em um ml em microplacas de doze cavidades (Costar). Incubaram-se as placas durante 7-10 dias à temperatura de 37°C e fixaram-se com metanol absoluto durante 10 minutos. Coraram-se as colónias com violeta de cristal e contaram-se num analisador de imagem optimax 40-10. Como se mostra na figura 15, observou-se uma citotoxicidade superior quando as células de carcinoma foram expostas a 5E9-ADM-7,5 do que quando foram expostas a 3A1-ADM-7,O.

Devido a muitos relatórios demonstrarem que a ADM ligada a um anticorpo no açúcar no amino do fármaco resultou em imunoconjugados que mostram uma perda significativa da actividade farmacológica, testou-se a citotoxicidade de imunoconjugados preparados por ligação de ADM com o anticorpo na porção açúcar amino do fármaco por um adaptador dipeptídico leu-ala utilizando-se um sistema de ensaio de formação de colónia em agar mole. Como se mostrou na figura 16, nenhum dos

conjugados 5E9-ADM-4.0 ou 3A1-ADM-3.9 péptidos ligados foram citotóxicos para células daudi. 0 derivado ADM-LEU-ALA utilizado para preparar conjugados foi cerca de dois logs menos potente do que quantidades equivalentes de ADM não conjugado.

Exemplo 2

Este exmplo descreve a preparação de um imunoconjugado de antraciclina de acordo com a presente invenção, em que a ADM é conjugada com um anticorpo monoclonal através de uma estrutura adaptadora contendo uma ligação de acil-hidrazona no sítio de ligação à molécula de ADM e ainda contendo uma ligação tioéter como parte da sua ligação ao anticorpo . Este exemplo também proporciona um novo derivado de acil-hidrazona de ADM.

Preparação de imunoconjugados tendo uma ligação tioéter na estrutura adaptadora.

Fez-se reagir o anticorpo monoclonal 5E9 (2,5MG em 2,5 ML de solução de cloreto de sódio tamponada com fosfato) com SMPB (4-P-maleiimidofenil)butirato de succinimidilo, 59,5 MG em 100 ml de tetra-hidrofurano, à temperatura de 30°C durante 30 minutos. Ajustou-se o PH para 6 com tampão de citrato de sódio.

Fez-se passar a mistura

através de uma coluna de filtração gel PD-10 (Pharmacia) para separar o anticorpo contendo maleimida dos materiais por reagir. 0 derivado ADM-HZN (1 MG), preparado como descrito no exemplo 1 foi em seguida dissolvido em 1 ml de álcool metilico/água da 9:1 e fizeram-se reagir 0,5 mmole de ADM-HZN com 0,5 mmole de tri-n-butil-fosfina em acetona : água a 4:1 para preparar uma nova ADM-HZN reduzida, (ver figura 17). Após 10 minutos, adicionou-se enxofre , 0,1 m em tolueno para destruir a fosfina restante. Em seguida, misturou-se ADM-HZN reduzido com anticorpo 5E9 contendo maleimida. Os imunoconjugados obtidos deste modo purificaram-se por passagem através de uma coluna de filtração por gel PD-10.

Em alguns casos, quando a eliminação do tolueno não foi completa, separou-se uma camada de dissolvente orgânico que sobrenadou alguma da proteína da mistura reaccional. Utilizouse uma corrente de ar fraca para retirar o dissolvente e removeu-se a proteína desnaturada por centrifugação da mistura durante dois minutos a 16000xG. Em seguida, o sobrenadante límpido contendo os imunoconjugados filtrou-se por gel e analisou-se em PBS com um PH de 7,4. A relação molar ADManticorpo foi determinada por espectrofotometria a densidades de 280 e 495 como descrito no exemplo 1. Uma reação típica forneceu imunoconjugados com relações molares entre 3 e 4.

Actividade Citotóxica de Imunoconjugados com uma Ligação

Tioéter.

Imunoconjugados preparados de acordo com o método descrito neste exemplo foram testados para determinação da citotoxicidade sobre linhas de células de tumor antigénio positivas versus antigénio negativas utilizando-se um ensaio de incorporação de H-timidina, que permita avaliar a inibição de síntese de DNA. De acordo com este ensaio, diluições de ADM imunoconjugados ou não conjugado prepararam-se em meio completo e adicionou-se 100 P¹ a cada uma das diluições em cavidades de placas microtituladoras de 96 cavidades. Fez-se cada diluição em triplicado. Suspenderam-se as células tumorais em meio e adicionaram-se em seguida a cada cavidade 100 pl contendo 1x10^ células. Incubaram-se as células durante 24 horas à temperatura de 37° C em atmosfera húmida com 5% de CCL, . Adicionaram-se a cada cavidade 50 microlitros contendo 1 jtiCi [6-^H] timidina (New England Nuclear, 15 Ci/mmole) e incubaram-se durante 4 horas à temperatura de 37°C.

Transferiram-se as células para placas s.v. Militituladoras, Millipore e precipitaram-se com ácido tricloroacético frio a 25% (TCA). Lavaram-se os precipitados dez vezes com TCA frio a 5%. Secaram-se os filtros, funcionaram-se e contaram-se num á>

Econofluor Liquid Scintillation Fluid (New ENglando Nuclear). Todas as contagens corrigiram-se por subtração das contagens de base.

Um imunoconjugado de acordo com este método - 5E9-ADM-3.9 mostrou-se muito citotóxico para as células Namalwa e HBS-2 positivas para o antigénio 5E9 (ver figura 18). 0 imunoconjugado foi mais potente do que concentrações equivalentes de ADM não conjugado. Numa outra experiência, um imunoconjugado 3A1-ADM-6.0, em concentrações inferiores a 0,1 mg/ml de ADM verificou-se ter citotoxicidade para células HsB-2 positivas para o antigénio 3A1 mas não para células Namalwa negativas para o antigénio 3A1 (ver figura 20). Para concentrações maiores, a citotoxicidade do imunoconjugado foi aproximadamente a mesma para as duas linhas de células.

Exemplo 3

Actividade Anti-tumoral in vivo dos Imunoconjugados da Presente Invenção.

Os imunoconjugados desta invenção foram em seguida testados para determinação da sua actividade anti-tumoral in vivo. Mais particularmente, os imunoconjugados foram testados ^<s para a sua capacidade para inibir o crescimento de tumores de linfoma B humano no murganho.

Inocularam-se tumores sólidos primários Daudi e Ramos (Linfoma de Burkitt) em murganhos nus BALB/C por via subcutânea de células linfóides mantidas em cultura de tecidos. Obteve-se a linha de células Ramos na ATCC. Em seguida, os tumores Daudi e Ramos foram passados para fêmeas com 4 a 6 semanas de murganhos BALB/C (nu/nu) com peso entre 20 e 25 g (harlan * 7

Sprague-Dawley), utilizando-se células de tumor 1x10 /0,1 ml em

PBS para implantação subcutânea no flanco dos murganhos. Ambas as linhas de células mostraram uma taxa de crescimento linear entre 200 e 4000 MM3. 0 tempo de duplicação do volume médio durante o crescimento exponencial foi de 6,9 + 0,8 dias para tumores Daudi e 4,4 + 0,6 dias para tumores Ramos. Os volumes do tumor (V) calcularam-se utilizando-se a fórmula seguinte:

L x W 2

V=---------------2 em que L é igual ao comprimento em milímetros e W é igual à largura em milímetros.

Quando ο volume dos tumores alcançou 400 a 600 MM3 para tumores Daudi e 250 a 400 MM3 para tumores Ramos, distribuiramse os murganhos ao acaso em grupos de 5 a 10 animais para tratamento com ADM-HCL, isto é, com o fármaco livre, com imunoconjugados de ADM desta invenção, anticorpo monoclonal não conjugado ou uma mistura do anticorpo monoclonal mais ADM. Demonstrou-se a especificidade de morte celular por comparação da actividade anti-tumoral obtida com os imunoconjugados testados, isto é, cujo componente de anticorpo reage com as células tumorais a eliminar versus a actividade anti-tumoral obtida uti 1izando-se conjugados de não ligação, isto é, conjugados que não reagem com a população desse tumor. A mistura do anticorpo com o fármaco livre constituiu um controlo para demonstrar a necessidade de uma ligação covalente do fármaco com o anticorpo.

Exprimiram-se os resultados como a inibição do crescimento do tumor (T-C) ou do atraso duplo do tumor (TDD) que se avaliou de acordo com a demora para que o tumor duplicasse de volume (TVDT) quando as curvas de crescimento dos grupos tratados se compararam com os controlos não inoculados. O TDD calculou-se utilizando-se a seguinte fórmula:

T-C

TDD=

TVDT X 3,3 /

em que T representa o tempo (dias para o tumor do grupo tratado alcançar 3000 MM3); C representa o tempo em dias para os tumores do grupo de controlo alcançarem 3000 MM3 e TVDT representa o tempo para a duplicação do volume do tumor expresso em dias para os murganhos de controlo (não tratados) aumentar de 1.500 para 3.000 MM3. Cada ponto representa o volume do tumor médio no grupo da experiência.

Nestes estudos, a actividade antitumoral dos imunoconjugados de ADM sobre tumores Daudi ou Ramos comparou-se a:

a) ao obtido com o fármaco livre numa dose, via de administração e esquema equivalentes e

b) à actividade obtida com o fármaco livre numa dose, via e esquema óptimos.

Em todos os estudos descritos aqui, o tratamento com o fármaco, ADM-HCL realizou-se por adição de 50 a 100 de DMSO ao fármaco em pó, diluição do fármaco dissolvido em PBS para uma dose em particular de MG/KG/injecção no dia de injecção e inoculação em murganhos com tumores por via endovenosa; na veia da cauda ou por via intraperitoneal (i.p.).

Preparam-se os imunoconjugados de ADM utilizados nestes estudos de acordo com o método descrito no exemplo 1 e todos demonstraram reter mais de 90% da actividade de ligação com o anticorpo inicial. Específicamente, anticorpos monoclonais 5E9 e G.28.1 foram utilizados como componentes do anticorpo dos imunoconjugados nestes estudos. Os imunoconjugados de ADM conservaram-se à temperatura de 4^eC em PBS e usaram-se não após mais de duas semanas da sua preparação. Todos os imunoconjugados testados assim como controlos de anticorpo não conjugados se administraram por via intraperitoneal.

Além disso, como utilizado neste pedido de patente de invenção, a notação do esquema de tratamento Q7D x 3 relaciona-se com um esquema de tratamento em que se administrou a cada murganho do grupo fármaco três injecções, cada uma delas distanciada 7 dias da outra, isto é, uma injecção por semana durante 3 semanas. Identicamente, Q5D x 2 refere-se a um esquema de tratamento em que se administrou a cada murganho desse grupo um total de duas injecções de fármaco ou de conjugado no espaço de cinco dias. QlDxl refere-se a uma única injecção. Portanto, as notações para o esquema de tratamento são definidas de forma a que o primeiro número da notação represente o espaço em dias entre as injecções e o último represente o número de injecções em cada esquema.

A actividade anti-turaoral dos imunoconjugados em ADM da presente invenção foi, portanto, avaliada primeiro em comparação com o cloridrato de ADM livre numa dose, via de administração e esquema equivalentes. A actividade anti-tumoral sobre tumores Daudi do imunoconjugado 5E9-ADM-1.8 (relação molar = MR = 1,8 ADM moléculas/MAB), comparou-se com a actividade de

a) ADM-HZL não conjugada numa dose de 4,lmg/kg/injecção, b) anticorpo monoclonal 5E9 numa dose idêntica (630 ^m?/kg/injecção), c) uma mistura de anticorpo 5E9 mais ADM-HC1 (4,1 mg ADM+630 mg 5E9) e d) um imunoconjugado de não ligação, L6-ADM-8.6 (4,lmg/kg/injecção ADM) como controlo.

Deram-se doses a cada murganho, cinco murganhos por grupo, por via intraperitoneal, nos dias 20 e 25 após a implantação do tumor, isto é, um esquema Q5Dx2, quando os tamanhos iniciais dos tumores variavam entre 800 e 1100 mnP . A dose aplicada nesta experiência representava a dose máxima tolerada (DMT), i.p. para o fármaco livre, isto é, a dose do fármaco administrada por qualquer via de administração ou esquema que resulta numa DL (morte de 10% dos animais) (ver Quadro 1 em seguida).

Como a figura 21 indica, obteve-se a actividade anti-tumoral

I significativa com o conjugado 5E9-ADM. Além disso, esta actividade anti-tumoral foi maior do que a,observada com uma dose equivalente de fármaco livre. E, como no Quadro 4 em seguida se indica, três dos cinco murganhos tratados com o conjugado tiveram a regressão completa do tumor (cura) que corresponde a um TDD > 1.5. Em contraste, a ADM-HCL e 5E9 não conjugado assim como o conjugado L6-ADM de não ligação não exibiram actividade antitumoral. Observou-se inibição no crescimento de alguns tumores utilizando-se ADM-HCL mais uma mistura com 5E9, mas este efeito foi transitório e representou apenas um TDD de 0,2 estatisticamente não significativo.

Nesta experiência, o fármaco livre doseou-se a 4,1 ^m<?/kg/injecção devido à toxicidade associada com a administração intra-peritoneal do fármaco livre em doses acima de 4 a 5 mg/kg. Nestas doses baixas, a ADM livre e as suas misturas com anticorpo monoclonal demonstraram-se inactivos. Contudo, como a figura 21 torna evidente, mesmo nesta dose baixa, o imunoconjugado de ADM, foi ainda activo para inibir o crescimento de tumor.

Em seguida, pensou-se determinar a actividade anti-tumoral de imunoconjugados de ADM sobre tumores Daudi comparadas com a actividade anti-tumoral obtida com a aplicação do fármaco não conjugado, administrado numa dose, via de administração e esquema óptimos. Portanto, inicialmente, houve que determinar a dose, via e esquema para a ADM-HC1 livre que conduz a uma actividade anti-tumoral máxima sobre células Daudi. Para este estudo de optimizaçao, trataram-se murganhos com ADM-HCL utilizando-se diversas vias de administração, de doses e de esquemas. 0 espaço entre as inoculações foi dependente do esquema de tratamento utilizado. Determinaram-se os valores de

TDD como descrito anteriormente.

Os resultados deste estudo de optmização estão resumidos no Quadro 2 seguinte. Como se pode observar no Quadro 2, o esquema Q7Dx3, com adminstração i.v., forneceu uma resposta anti-tumor óptima, quer no que se relaciona com a demora de crescimento do tumor quer com o que se relaciona com as taxas de regressão do tumor com doses de 11 mg/mg/injecção, que foram também as doses máximas toleradas para o fármaco no esquema Q7Dx3, i.v..

„e'J*

Quadro 2 .¾

Actividade Anti-Tumoral de ADM-HC1 Sobre Enxertos de Tumor Daudi.

Esquema	Dose (mc/kc)a	Inibição do	m. ri Tumor Curas	TDD	Toxicidade
'i-nj	cum	i -C	CR	D/T	(%)
A)			Via	i.v.
QlDxl	20	20	-	-	—		7/7	(100)
	18	18	-		-	-	5/8	( 75)
	15	15	-	-	-	-	7/7	(100)
	12	12		*	—	-	7/7	(100)
Q7Dx3	12	36	>52	1	2	>2.0	4/S	( 50)
	11		28	0		i 7	2/8	( 25)
	11 12	w w	>42 21	0 I	4 0	>1.3 0.7	2/10 0/8	( 20)
	10	30	18	0	1	0.7:	0/8
	10	30	1 A « w	0	1	0.8	0/8
	10	30	27	0		0.8	0/7
	g	z /	23	0	1	0.5	0/10
		T5	5.2	2	0	0. IS	1/5	( 11)
S)			Via	iJ?	•
Q5Dx2	4.	3		V	r	0	0/5
	4.	1 S. 2	C	0	0		l/=
	4.	3 5	««* A m · X	0	0	. 1	c/s
	5.	5 11	2.2	c	0	• -	0/8
QSDx2	•	25	-	-	-	-	'/7	(ICC)
	10	20	-	-	-	-	8/8
	5	10	-	-	-	-	3/8	( 27)·
Q4Dx3	5	15	-	—	-	-	5/5	( 57)
Q7Dx3	10	30	-	-	-	-	8/8	(ICC)
		--				-	- /G */ -	( 57)

./ .¾

A - Resultados de grupos com o fármaco individuais.

B - T - C : representa o tempo em dias para que o grupo tratado com o fármaco (T) alcance 3000 MM3, comparado com os controlos não tratados (C).

Regressões completas (Cr) : redução temporária no volume do tumor para um volume tumoral não palpável.

Curas: Regressão completa sem evidência de reciviva do tumor.

C - D/T : Número de mortes sobre o número total de animais por grupo.

Mortes - fármaco registaram-se até 55 dias após a última dose.

A actividade anti-tumoral do fármaco sobre as células Daudi está ainda representada na figura 22. Utilizando-se um esquema Q7Dx3, e a via endovenosa, inibiram-se de um modo significativo o desenvolvimento dos enxertos do tumor Daudi, de forma dosedependente com 9,10 ou 11 mg/kg/injecção, respectivamente, após tratamento com ADM-HCL Os controlos consistiam em murganhos não tratados. A inibição do desenvolvimento do tumor (T-C) na

dose máxima tolerada foi de 11 mg/kg/inj., durante 28 dias o que corresponde a uma TDD de 1,1.

Também se testaram de acordo com diversos esquemas como administração i.p. (intraperitoneal) . Como descrito anteriormente, a dose máxima tolerada de ADM-HCL por via intraperitoneal determinou-se como situando-se entre 4-5 mg/kg/inj. Como se pode observar no Quadro 2B, o fármaco livre é inactivo sobre células Daudi com dose máxima tolerada, por via intra-peritoneal. Assim, determinou-se que a actividade anti-tumoral óptima para o fármaco livre se obtém por administração endovenosa sendo a dose máxima tolerada de 11 mg/kg/inj., dose esta do fármaco que mostra uma inibição do crescimento sobre células de tumor Daudi.

Destas experiências, portanto, determinou-se que a dose óptima do ADM-HCL para exercer a actividade anti-tumoral em tumores Daudi foi aproximadamente de 11 mg/kg/inj., e o esquema óptimo foi Q7Dx3 e a via óptima de administração a endovenosa.

Em seguida, comparou-se a actividade anti-tumoral sobre tumores Daudi de imunoconjugados de ADM desta invenção com a actividade anti-tumoral do fármaco livre, ADM-HCL administrado sob as mesmas condições óptimas como determinado anteriormente.

‘Ύ

Ο imunoconjugado de G.28.1-ADM, G28.l-ADM-7.6 (MR = 7,6 fármaco/MAB), com doses aplicadas de acordo cora o esquema Q5Dx2, foi comprado com doses de ADM-HCL de 10,11 e 12 mg/kg/inj. com um esquema Q7Dx3 por via endovenosa. Como se mostra na figura 23 e no quadro 3 seguinte, o fármaco livre foi activo, retardando em 28 dias o crescimento do tumor na dose de 11 mg/kg ou seja, a sua dose máxima tolerada com dois dos oito murganhos exibindo regressão total do tumor (curas). O imunoconjugado na dose mais alta testada (18,7 MG ADM, Q5Dx2,

i.p.) foi bem tolerado, ausência de mortes e de perda de peso, e demonstrou uma actividade anti-tumoral um pouco superior à do fármaco livre com três dos oito animais tratados exibindo total regressão do tumor. De novo, não se observou actividade anti-tumor associada com o imunoconjugado L6 sem ligação com o G28.1 não conjugado ou uma mistura de G.28.1 mais ADM-HCL, não conjugado. Assim, determinou-se que os imunoconjugados de ADM inibiram o crescimento de tumor numa maior extensão alcançada aplicando-se o fármaco não conjugado na sua dose, esquema e vias de administração, i.v. ou i.p. , óptimas.

/

Quadro 3

Actividade Anti-Tumoral de Conjugado de ADM-MAB (Q5Dx2 ; i.p.) comparada com ADM-HCL optimizado (Q7Dx3, i.v.) sobre enxertos de tumor Daudi

- · Ί ’·. rf&í .·%

Dcse	(mc./kc)e	Inibição	b· ce Tumcr		r m_· . - „ j-cx-cioace
	MAS	T-C CR
ADM		TDD	C/T (%)
ADM-HC1	O7Dx3: i	. V.
12		>33 3	2	>1.5	2/8
11		28 0	2	>1.1	0/8
10		18 0	2	o.s	0/8
G2S.1	-ADM 11.	O5Dx2:	i. r.
IS. 7	700	>31 0	2	>1'. 5	0/8
S.l	300	3 0	0	0.1	0/8
4.4	165	1 C	0	0	C/S
LS-ADM (5.5)	O5Dx2: i
1S.7	Ç65	—· i V	••4	0.3	0 /8
5.1	415	0 o	U	0	/2
G2S . 1	ADM	C5Dx2: i
4.5	700	c 2	r*	c*. ~	~ /C
G2S. 1		C5Dx2: i
	700			0.1	z* //-

* Ver a legenda do Quadro 2.

No Quadro 4 resume-se a actividade anti-tumoral obtida utilizando-se preparações de 5E9 e de G.28.1 imunoconjugados sobre enxertos de tumor Daudi em murganhos atímicos. A resposta mais alta foi obtida consistentemente com doses de anticorpo de 500 mg/kg ou mais. Nestas doses, obteve-se uma actividade anti-tumoral aplicando-se os conjugados com relações molares de entre 1,8 e 8,6. A actividade anti-tumoral apresentou-se mais dose-dependente do anticorpo do que dose dependente do fármaco como demonstrado pelo facto de a dose do anticorpo monoclonal aumentada corresponder a um aumento em ambas as TDD, isto é, na inibição do crescimento do tumor e na taxa de regressão do tumor. Em todas as experiências não se observou actividade anti-tumoral com conjugados L6-ADM de não ligação que foram testados paralelamente em doses equivalentes de anticorpo e de fármaco conjugado (resultados não apresentados). Além disso, o quadro representa a potência acrescida dos imunoconjugados da presente invenção quando comparada com a do fármaco livre que foi inactivo em doses de fármaco equivalentes (comparar com o Quadro 2 anterior).

.¾

Quadro 4

Actividade Anti-Tumoral de Imunoconjugados de ADM sobre enxertos de Tumor Daudi

Conjugado MR	Cum. Dose (mç/ke)	T-C (Dias )	Curas	TDD
ΜΑΞ	ADM
5E5-ADM-4.2C	200	4	10	0/7	0.5
5ES-ADM-8.6.	260	S.2	5	0/5	0.3
5ES-ADM-4.2C	500	ς	17	1/7	C.S
5ES-ADM-5.4. 5ES-ADM-4.2C	1I1C 1200	22. S IS. 3	* 1 >6i	2/5 2/7	1.4. >1.5~
5ES-ADM-1.S	1250	5.2	>35’	3/5	>1.5
G2S.l-ADM-4.5e	ICC	4	5	C/7	C.4
G2S.l-ADM-7.6S	23C	S.S	J.	C/7	0
G2S.l-ADM-7.6e	600	16		0/7	0.1
G2S.I-ADM-4.2	1110	16.5	>37	2/3	>1.7r
G2S.l-ADM-4.S	1200	21.4	>55	2/7	>1.5*
G2S.l-ADM-7.6e	-» 3 r* /-*	-· A	21	2/2	1.3

A - Esquema: Q5Dx2 Via: i.p. MR: relação molar de moléculas do fármaco / MAE

B - T - C : representa o tempo em dias que demorou o grupo tratado com o fármaco (T) a alcançar 3000 MM3 z

,¾ comparativamente aos controlos não atratados (C)

C - Curas: curas / número de animais tratados

D - 5E9 - ADM - 4.2 testado em três doses

E - JGZ28.1 - ADM - 7.6 testado em três doses.

F - Morte no grupo de controlo.

Quadro 5 seguinte demonstra a toxicidade reduzida alcançada utilizando-se imunoconjugados de ADM da presente invenção versus o fármaco não conjugado. Como se pode observar, os imunoconjugados foram pelo menos dez vezes menos tóxicos do que a ADM livre administrada por via intra-peritoneal.

Quadro 5

Toxicidade de ADM livre	e de MAB-ADM em Murganhos Nus com Tumor
Composto				ADM (mg/kg)C		·/
Nb	Esquema	Via	inj	Cumulativa	D/T	Mortes
ADM	4	QlDxl	i.v.	18	18	14/32	44
ADM	3	QlDxl	i.v.	16	16	3/31	10
ADM	1	QlDxl	i.v.	14	14	0/8	0
ADM	1	Q2Dx2	i.v.	15	30	7/7	100
ADM	2	Q2Dx2	i.v.	12	24	10/12	83
ADM	1	Q2Dx2	i.v.	10	20	3/5	60
ADM	1	Q2Dx2	i.v.	8	16	1/5	20
ADM	1	Q3Dx2	i.v.	16	32	8/8	100
ADM	1	Q3Dx2	i.v.	14	28	7/8	88
ADM	1	Q3Dx2	i.v.	12	24	6/8	75
ADM	1	Q4Dx2	i.v.	14	28	6/7	86
ADM	2	Q4Dx2	i.v.	12	24	7/15	47
ADM	1	Q4Dx2	i.v.	10	20	2/8	25
ADM	1	Q7Dx3	i.v.	12	36	4/8	50
ADM	3	Q7Dx3	i.v.	11	33	4/26	15
ADM	3	Q7Dx3	i.v.	10	30	0/24	0
ADM	1	Q8Dx2	i.p.	13	26	7/7	100
ADM	1	Q8Dx2	i.p.	10	20	8/8	100
ADM	1	Q8Dx2	i.p.	5	10	3/8	35
ADM	1	Q4Dx3	i.p.	5	15	6/9	67
ADM	1	Q5Dx2	i.p.	5.5	11	0/8	0
ADM	1	Q5Dx2	i.p.	4.1	8.2	1/5	20
G28.1-ADM	1	Q5Dx2	i.p.	27.2	55.4	0/8	0
	1	Q5Dx2	i.p.	18.7	37.4	0/8	0
G28.1-ADM	1	QlDx4	i.p.	24	96	3/8	38
	1	QlDx4	i.p.	14	64	0/8	0
G28.1-ADM	1	QlDx4	i.p.	10.5	42	0/5	0
L6-ADM	1	QlDx4	i.p.	31	124	1/8	13
	1	QlDx4	i.p.	18.6	74	0/8	0

a - Murganhos com tumores Daudi ou Ramos b - Número de experiências

-ADM = Quantidade de fármaco livre ou conjugado com MAB administrada.

D/T = número de mortes / total tratado.

Finalmente, a figura 26A e o Quadro 6 representam a actividade anti-tumoral do conjugado de G28.1-ADM sobre tumores Ramos humanos. De novo, o efeito anti-tumoral dos imunoconjugados sobre os tumores Ramos foi comparado com o que se observou utilizando-se ADM-HCL sob condições que permitem a obtenção de resultados óptimos, o que foi previamente determinado como uma dose injectável única entre 16 e 18 mg/kg/inj. (ver figuras 24 e 25). Na dose de imunoconjugado testado mais alta 10.6 mg/kg) a actividade anti-tumoral do conjugado foi superior à actividade obtida aplicando~se o fármaco livre na dose de 18 mg/kg (25% de mortalidade) por TDD a 0,5 e a actividade de ADM-HCL a 16 mg/kg (mortalidade 12%) por TDD a l₇0. 0 conjugado nesta dose foi bem tolerado em todos os animais tratados que não apresentaram perda de peso ou mortes.

A actividade anti-tumoral de G28.1-ADM verificou-se também ser dose-dependente como se demonstra na figura 26B. Assim, doses decrescentes de conjugado resultaram em TDD decrescente e número de regressões completas decrescentes.

conjugado L6-ADM (não ligação) numa dose comparável (10,6 mg/kg) demonstrou-se inactivo.

Quadro 6

Actividade Anti-tumoral do Conjugado MAB-ADM (QlDx4; i.p.) para ADM-HCL optimizada utilizando-se enxertos de tumor Ramos (QlDxl;

i.v.).

Dose	(mc/kc)e	_ - - b j-nioiçao ac Tumor	Toxicidade''
ADM	ΜΑΞ	Lr»	Curas	ΓΗΤΊ-ρ	D/T	(%)
ADM-HCL	C7Dx2: i.
IS		S 0	0	0.5	2/5	( 23)
15		5 0	0	0.3	i/s	( 12)
G2S.1	-ADM Í4.S)	01Dx4; i	w «
10.5	600	10.5 0	1	1.1	0/5
5.3	200	5 0	c	0.5	' 0/5
2.5	150	2.5 0	1	0.4	C/5
L6-ADM '(7.5)	ClDx4: i.	-
15.2	500				2/5	( 40)
10.5	250	0 0	-		C/5

tf

A - Dose por injecção

B - Ver a legenda do Quadro 2

Os exemplos anteriores, demonstram deste modo a preparação de novos imunoconjugados de antraciclina em que uma antraciclina citotóxica conjugada com um anticorpo por meio de uma nova ligação de acil-hidrazona sensível ao ácido. Os imunoconjugados retêm a actividade de ligação com o anticorpo (isto é, especificidade para células alvo) e a actividade citotóxica do fármaco e permitem a libertação do fármaco livre inalterado sob condições ácidas e de redução típicas do ambiente celular das células alvo.

A actividade anti-tumoral destes conjugados demonstrou-se quer in vitro quer in vivo e verificou-se ser superior à actividade obtida com antraciclina não conjugada livre. Além disso, os imunoconjugados foram tolerados in vivo muito melhor do que o fármaco não conjugado. Assim, os imunoconjugados da presente invenção mostraram um índice terapêutico reforçado (actividade anti-tumoral versus toxicidade) e são portanto particularmente úteis para a entrega de fármacos citotóxicos junto de uma população celular escolhida para matar de

f .¾ preferência essas células, durante o tratamento de doenças tais como cancros e outros tumores, infecções virais não citocídas e outras infecções patogénicas ou doenças antoimunes.

Exemplo 4

Os exemplos que se seguem relatam a preparação de novos conjugados de antraciclina e ligando em que a adriamicina se liga ao ligando peptídico, bombesina, através de uma ligação acil-hidrazona na posição 13-ceto do fármaco.

Preparação de um conjugado bombesina-ADM e preparou-se cis-bombesina com a seguinte sequência de aminoàcidos:

Cys-Glu-Gln-Lys-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH , de acordo com Vega Biotechnologies (Tuscon, Arizona).

Alternativamente, sintetizou-se cis-bombesina num sintetizador de peptido Milligam 9050 usando-se ésteres pentafluorados activados de aminoàcidos FMOC protegidos. Separou-se o peptido sintetizado da resina e eliminaram-se os grupos de protecção da cadeia lateral por incubação em ácido trifluoroacético a 92,5%, tiofenol a 2,5% e fenol a 5% durante duas horas à temperatura de

Λί

C.

Em seguida, purificou-se a cis-bombesina a partir do peptido da mistura peptídica impura por HPLC de fase inversa de C-18 (Perkin Elmer 410 Bio HPLC) seguida de HPLC de permuta iónica. Numa preparação clássica, 10 ml do peptido impuro e 20 mg de ditiotreitol (DTT) foram dissolvidos em acetonitrilo a 10% em acetato de amónio 0,01 Molar, PH 6,0, e separou-se utilizando-se um gradiente de acetonitrilo de '0-50% em acetato de amónio 0,01 M de PH 6,0. Controlaram-se os eluatos por D0280. Recolheram-se fracções de 1 ml e as que continham os grupos tiol identificaram-se por meio de reacção com DTNB como descrito anteriormente no exemplo 1.

Estas fracções, contendo os grupos tiol reactivos, foram também testadas para a imunoreactividade de bombesina num ensaio Elisa, com um anticorpo monoclonal anti-bombesina que liga à região peptídica da bombesina que se sabe interactuar com o receptor de bombesina. O ensaio realizou-se do seguinte modo: fizeram-se absorver 100 ng - 1 mg, de peptido de bombesina em placas immulon II para Elisa durante duas horas à temperatura de

C.

Bloquearam-se as placas com gelatina a 3% durante duas horas a temperatura de 37° C, lavaram-se cinco vezes com PBS contendo /

V. ..

$ .¾

TWEEN 20 a 0,05%, incubaram-se com anticorpo anti-bombesina de murganho à temperatura de 37 C e em seguida lavaram-se cinco vezes com PBS-TWEEN 20. Depois incubaram-se as placas com Ig anti-murganho de coelho marcada com peroxidase (Boehringer

Mannheim), antes de se desenvolver com substracto de TMB de acordo com as instruções do preparador. (Kirkegaard e Perry).

Reuniram-se as fracções de vários ensaios contendo grupos sulfidril livres e apresentando imunoreactividade de bombesina e purificaram-se depois por HPLC de permuta iónica. (Aquapore Cx300, coluna de 10 MM de Rainin) usando-se um gradiente salino de

2-50% (acetato de amónio 500. MM, PH 6,0) em acetonitrilo a 10%. Controlaram-se os eluatos a D0280 e analisaram-se fracções de ml para DTN B e para a imunoreactividade de bombesina de acordo com o ensaio Elisa como descrito anteriormente.

Reuniram-se as fracções e concentraram-se utilizando-se um aparelho de alto vácuo Savant e recromatografaram-se por HPLC numa coluna C-18 como descrito anteriormente. O produto final de cis-bombesina exibiu um único pico no cromatograma de HPLC (ver figura 28).

Em seguida utilizou-se a cis-bombesina purificada para reagir com ADM-HZN do seguinte modo: diluiu-se a cis-bombesina a cerca ,-.*·.** .¾ de 5-8 mg/4 ml em acetato de amónia 10 MM (1,25 - 2mg/ml) com o base na A280 de 2,08 para 1 mg/ml de cis -bombesina purificada. Ajustou-se o PH para 7,0 com hidróxido de amónio a 7 M e em seguida adicionaram-se 2,5-4 mg de ADM-HZN, em 400 ml de metanol. A solução foi introduzida num vortex e conservada ali durante uma hora à temperatura de 20°C, e em seguida durante 12 horas à temperaturade 4^<>C com agitação intermitente.

conjugado cis-bombesina-ADM separou-se do fármaco livre por HPLC de permuta iónica utilizando-se as condições citadas anteriormente para o peptido livre, com excepção da concentração do acetonitrilo que se manteve em 40% durante a separação.

As fracções que continham o conjugado, foram reunidas, secas e concentradas num aparelho de Savant e dissolveram-se em tampão inicial para separação por cromatografia de fase inversa como anteriormente citado. O péptido livre separou-se em seguida do fármaco-péptido conjugado por cromatografia de HPLC de fase inversa (como descrito anteriormente para a purificação do petido livre).

Controlou-se a coluna a 280 NM e a 495 NM. As fracções contendo o conjugado reuniram-se, secaram-se e armazenaram-se à temperatura de -20° C para posterior caracterização.

Alternativamente, preparou-se um conjugado de bombesina-ADM em que se ligou o ADM ao péptido de hombesina no resíduo da 3 lisina (lis ) do peptido de acordo com este método incubou-se a bombesina (também designada por Lis³-bombesina) com o excesso três vezes molar de SPDP a um PH de 8,5 durante uma hora a uma temperatura de 25°C. Separou-se a bombesina do excesso de SPDP por HPLC de fase inversa numa coluna de C-18, reduziu-se com um excesso de DTT e em seguida recromatografou-se por HPLC de fase inversa numa coluna C-18, como descrito anteriormente. O peptido reduzido incubou-se depois com um excesso de 2 molar de ADM-HZN durante uma hora à temperatura de 25° C seguidas de 14 horas à temperatura de 4°C. No entanto, as tentativas para separar o conjugado de péptido-fármaco do fármaco foi problemática por duas razões: 1) Na cromatografia em C-18, como descrito para a preparação da cis-bombesina citada anteriormente, o conjugado péptido-fármaco (detectado por um ensaio Elisa como descrito antes) era hidrofóbico e muito idêntico a ADM-HZN isolado mas diferindo no peptido reduzido e 2) a modificação da bombesina com o resíduo de lisina^ altera a carga do peptido tornando mais difícil a separação do fármaco livre por meio de cromatografia de permuta iónica. Portanto, a ligação do peptido cis-bombesina foi favorecida.

100

Caracterização do Conjugado de Bombesina-ADM conjugado bombesina-ADM preparado a partir de cis-bombesina como descrito anteriormente tem a estrutura representada na figura 27, sendo a ADM conjugada através de uma estrutura adaptadora na posição 13-ceto por meio de uma ligação de acil-hidrazona. 0 adaptador ligando o péptido ao fármaco contém uma ligação dissulfureto na estrutura. A figura 29 representa um espectro de massa do conjugado cis-bombesina-ADM. Esta análise mostrou um ião molecular de 2357 que corresponde a um condensado a 1:1 de cis-bombesina e ADM.

Testou-se o conjugado de cis-bombesina-ADM para detecção da capacidade para se ligar aos receptores de bombesinana linha de células Swiss 3T3, uma linha de células de fibroblasto de murganho normal obtida na ATCC. Avaliou-se a ligação através de um ensaio de competição que envolvia a aplicação de peptido

-i o c libertador de gastrina marcada com '^-’χ (GRP). 0 GRP, o análogo de bombesina, liga-se com o receptor da bombesina na superfície das células positivas ao receptor tais como as células Swiss 3T3. Assim, a GRP marcada com 125j incubou-se com concentrações crescentes de cis-bombesina, GRP ou o conjugado cis-bombesina-ADM e quantificou-se em radioactividade de ligação específica. Deste modo, mediu-se a inibição da ligação de GRP a

101 ensaio realizou-se do seguinte modo:

As células Swiss 3T3 foram deixadas a desenvolver até à confluência (5 a 7 dias) em frascos de 150 cm² T em meio MEM suplementar com soro bovino de fetal a 10%, 100 unidades/ml de penicilina e 100 mg/ml de estreptomicina (meio completo). Após as células confluírem, substituiu-se o meio completo MEM suplementar com 5 mg/ml de insulina, 5 mg/ml de transferrina e 5 mg/ml de selenito de sódio. Incubaram-se as células durante mais 24 horas e encolheram-se por arrastamento com um bastão com pontas de borracha em RPMI/HIP [RPMI 1640 contendo BSA (5mg/ml), Herpes (4,7 mg/ml), insulina (5 mg/ml), transferrina (5 mg/ml) e selenito de sódio (5 mg/ml)]. Lavaram-se as células uma vez e passaram-se três vezes através de uma agulha de calibre 22 para se obter uma suspensão de células simples. Em seguida, adicionou-se, com várias diluições e em triplicado, 10 ml de cis-bombesina, GRP ou conjugados de bombesina-ADM nos tubos contendo 5x10$ células a que também se adicionaram 150 ml de 125i_qrp (2 ng/ml, 2000 Ci/MMOL). Agitaram-se os tubos e incubaram-se durante uma hora à temperatura ambiente numa plataforma de agitação.

25

Separou-se I-GRP ligado às células por centrifugação a

12000 x G com uma camada de dibutilftalato : dioctilftalato a 1:1 num micro tubo de centrifugação.

102

Congelaram-se os tubos em neve carbónica e o aglomerado celular retirou-se e contou-se num contador garama LKB 1275.

Como se demonstrou na figura 30, houve uma competição específica da ligação de GRP-^^I marcado como para as células 3T3 por GRP, cis-bombesina e conjugado de cis-bombesina e conjugado de cis-bombesina-ADM. Mais importante, não se observou diferença significativa nas curvas de competição das três moléculas indicando que estas desempenham afinidade idênticas para os receptores de bombesina. Assim, a conjugação de DM com bombesina não altera a actividade de ligação ao peptido, retendo o conjugado a capacidade de ligação com os receptores de bombesina nas células positivas.

Outros estudos realizados nos laboratórios confirmaram que a cis-bombesina e a bombesina exibem actividade de ligação equivalente para os receptores de células positivas.

103

Actividade Citotóxica do Conjugado de Bombesina-ADM

A actividade citotóxica do conjugado de cis-bombesina-ADM

O determinou-se utilizando-se um ensaio de absorção de Htimidina.

De acordo com este ensaio, diversos tipos de células que contêm receptores de bombesina na sua superfície celular, foram adicionados a placas microtituladoras de 96 cavidades (5000 células por cavidade) e desenvolveram-se à temperatura de 37*C em meio MEM.

Estas células incluem a linha de células de fibroblasto Swiss

3T3 descrita anteriormete, a linha de células SVT2, uma linha de células de fibroblasto transformada obtida na ATCC e a linha de células HCT116, uma linha de células de carcinoma do colon referida no exemplo 1. Fizeram-se diluições do conjugado de cis-bombesina-ADM, de ADM e de ADM-HZN ou de uma mistura de cisbombesina-ADM mais 20 mg/ml de bombesina em meio HITS contendo meio RPMI 1640, 5 mg/ml de albumina de soro bovino, 0,02 M Hepes, 5 mg/ml de insulina, 5mg/ml de transferrina e 5 mg/ml de selenito de sódio . Adicionaram-se 50 ml de cada diluição em triplicado, do conjugado, do fármaco ou da mistura, nas cavidades que continham as células e incubaram-se à temperatura

104 de 37° C durante um mínimo de uma hora. Mantiveram-se as / cavidades de controlo a que apenas se adicionou meio. Em seguida, lavaram-se as células, adicionaram-se 200 ul de meio recente e incubaram-se as cavidades durante mais 38-44 horas em meio HITS à temperatura de 37°C, com humidade e atmosfera contendo 5% de CC^ · Em cada cavidade adicionou-se um MCg: de H-timidina (New England Nuclear) em 50 ml de meio e incubou-se durante 4 horas à temperatura de 37°C. Adicionou-se uma solução de tripsina (0,05%) em EDTA (0,53 NM) durante 15 minutos e recolheram-se as células com um dispositivo de recolha. Colocaram-se os filtros em líquido de cintilação RPI 3A7OB e contaram-se num contador de cintilação Beckman LS5801. Determinou-se a citotoxicidade através da fórmula seguinte:

% de inibição de H-TdR = controlo fCPMI - experimental (CPM) x 100 controlo (CPM) o

Mediu-se a inibição da incorporação de H-timidina no DNA das linhas de células positivas para o receptor de bombesina na presença do conjugado da presente invenção e portanto, o efeito citotóxico do conjugado sobre as células. Como se mostra na figura 31, o conjugado de cis-bombesina-ADM foi muito citotóxico para células SVT2 e, de facto, foi mais potente do que ADM livre ou ADM-HZN. Uma fracção da actividade citotóxica do

105 conjugado cis-bombesina-ADM foi bloqueada pelo execesso de bombesina (isto é, a mistura do conjugado com bombesina) o que indica que o efeito citotóxico do conjugado era devido pelo menos em parte, a uma ligação específica do conjugado com os receptores da bombesina. Como se mostra nas figuras 32 e 33, o conjugado foi também específicamente citotóxico (Após duas horas de exposição) para células HCT116 e Swiss 3TC.

Exemplo 5 exemplo que se segue descreve a preparação de outro conjugado de antraciclina-ligando da presente invenção em que a ADM é conjugada com o ligando peptídico, EGP, através de um adaptador que se liga a ADM por uma ligação acil-hidrazona numa posição 13-ceto.

Preparação de um Conjugado EGF-ADM

De acordo com esta experiência da presente invenção, o ADM conjugou-se com um EGF murino obtido da Biochemical Technologies, Inc. (Staughton, MA). Obteve-se o EGF das

106 ’ΐ glândulas submaxilares de murganho, purificadas por uma modificação do processo de Cohen , J.B.C , 237, pp 1555-62 (1962) e fornecidas sob a forma de um pó liofilizado estéril (catálogo n^a BT-201) a 0,1 mg/ampola. Ver ainda Savage et al., J. Biol. Chem., 22, pp 7669 (1973). Tiolou-se o péptido com SPDP para se introduzir um grupo tiol reactivo nesse péptido. No caso de EGF murino, contudo, não existem resíduos de lisina internos para a ligação de SPDP e, portanto, o único sítio para ligação com SPDP é o aminoàcido de terminal amino, dando origem a um composto que contém pelo menos um grupo sufidrilo reactivo por cada molécula de EGF (após redução com DTT).

A tiolação do EGF humano deve resultar, teoricamente, num maior grau de substituição, visto que a molécula possui moléculas de lisina internas.

Assim, o EGF dissolveu-se primeiro em 0,1 ml de PBS para se obter uma concentração final de 1,0 mg/ml. A esta solução adicionou-se SPDP com uma concentração final de 10 MM, (adquirido e diluído como descrito no exemplo 1, para tiolação do anticorpo). Incubou-se a mistura reaccional durante 30 minutos à temperatura de 30 C e em seguida adicionaram-se 0,02 ml de DTT (50 MM) para eliminar o grupo de protecção tiopiridilo. Eliminou-se o excesso de DTT e de SPDP presente no EGF tiolado por microdiálise contra PBS utilizando-se membranas de diálise de

107 •Ί* extensão de peso molecular 3 500 (Spectrum Medicai Industries Inc., número de catálogo 132723).

Em seguida, fez-se reagir o EGF murino tiolado com um excesso de 5 a 6 vezes de ADM-HZN preparado e diluído como descrito anteriormente no exemplo 1. Para este exemplo, adicionou-se 0,01 2 ml de ADM-HZN (1,2 x 10 M) a 0,1 mg de EGF tiolado com SPDP num volume final de 0,2 ml de PBS e arrefeceu-se para a temperatura de 4^C. Incubou-se a mistura reaccional durante a noite e dializou-se contra PBS, como descrito anteriormente para a eliminação de SPDP, para retirar do conjugado o fármaco que não reagiu.

Determinou-se a pureza do conjugado por HPLC ( ver figura 34). Realizou-se a HPLC numa coluna Browniee preenchida com pérolas RP18 de 5 microns. Comparou-se o conjugado EGF-ADM com EGF único não conjugado de lote, e ADM não conjugada. Eluíram as amostras com gradiente de formato de amónio a PH 2,8/acetonitrilo a 1,0 ml/minuto. Como se representa na figura 34, quando o conjugado EGF, isto é o conjugado EGF-ADM da presente invenção se comparou com o EGF não conjugado, houve uma alteração homogénea no tempo de retenção da proteína para um novo pico de proteína. Identicamente, quando o conjugado se comparou com ADM não conjugado, observou-se uma alteração no tempo de retenção similar do pico do fármaco

108 z

f .¾ conjugado para o pico do fármaco livre. Esta cromatografia por HPLC esclarece que havia menos de 1,0% de fármaco livre, detectado a 495 NM, ou de ligando livre, detectado a 280 NM, na preparação final do conjugado.

A pureza do conjugado também se determinou por análise de SDS-PAGE num gel de SDS-PAGE não redutor (gel com gradiente a 8 - 25%), dado não representado. As bandas de proteína individuais resolveram-se por coloração com corante de prata (Pharmacia Phastagel Silvex Stain Kit, número de catálogo 17-0617-01). O conjugado EGF-ADM, aproximadamente a 0,1 e 0,05 mg/ml foi comparado com três diluições do imunoconjugado EGF murino não conjugado (1,01, e 0,01 mg/ml). Não foi posta era evidência qualquer banda correspondente a proteína na preparação EGF-ADM que correspondia à proteína de EGF não conjugado. Esta experiência apoia a conclusão da figura 34 da não existência de EGF não conjugado na preparação de EGF-ADM conjugado.

Retenção da Actividade de Ligação do Conjugado EGF-ADM

Determinou-se a retenção da actividade de ligação de EGF após a ligação química de ADM-HZN a AGF por meio de um ensaio

109

de competição com radioisotopo utilizando-se a linha de células

A431. Esta linha de células era derivada de carcinoma de pulmão humano e no nosso laboratório pôde ligar-se com cerca de 1 - 4 x 10 moléculas de EGF (resultados não representados) . Diluíram-se as células em meio de crescimento RPMI 1640 contendo FCS a 10%, plaquearam-se em placas microtituladoras de 5 cavidades (5 x 10 células por cavidade) 24 horas antes do ensaio do doseamento. No dia do doseamento, as células A431 que se desenvolveram sob a forma de uma população celular aderente, lavaram-se em DMEM, contendo albumina de soro bovino a 2% (referida posteriormente aqui como tampão A). As células, em triplicado, incubaram-se com 0,05 ml de EGF diluído duas vezes em série ou EGF-ADM e 0,05 ml de EGF marcado com ¹ i (50 mg/ml) diluído em tampão A, para um volume final de 0,1 ml por cavidade. Incubaram-se as células à temperatura de 4°C durante 4 horas, e em seguida lavaram-se por três vezes com tampão A. Retiraram-se as células das placas de plástico de 96 cavidades por solubilização com hidróxido de sódio a 0,1 M e a quantidade de I - EGF ligada às células determinou-se por contagem num contador GAMMA LKB modelo 1272.

A actividade de ligação do conjugado de EGF-ADM para os receptores das células A431 está demonstrada na figura 35, que compara a capacidade de concentrações crescentes de EGF-ADM para 1 25 inibirem a ligaçao com EGF marcado com I. Os resultados

110 ,³^ apresentados sob a forma da inibição de ligação de ’¹²⁵I-AGF (B/BO) em que B representa as contagens radioactivas de ligação com a célula em várias concentrações de inibidor (B) dividido pelas contagens da ligação da célula com qualquer inibidor ( BO). Compararam-se duas preparações de conjugados separadas de EGF-ADM com EGF não conjugado. Ambas as preparações de conjugado exibiram actividades de ligação idênticas. Quando se comparou AGF não conjugado com conjugados de EGF-ADM estes exibiram apenas uma pequena perda de actividade de ligação para os receptores de EGF das células alvo do tumor

A431.

Exemplo 6

Ainda um outro exemplo de conjugados da presente invenção consiste na preparação de conjugado antraciclina-ligando, em que se conjugou a ADM com o ligando de proteína, a transferrina, através ainda de um adaptador ligado ao fármaco através de uma ligação 13-ceto acil-hidrazona. (ver figura 27) .

111

Preparação de um Conjugado Transferrina-ADM

Dissolveram-se 5,1 mg de holo-transferrina humano, substituída com 100% de ferro (sigma) em 2 ML de tampão contendo 50 MM de trietanolamina , 50 MM de cloreto de sódio e 1 MM de EDTA, PH 8,0. Em seguida adicionaram-se 40 ml de 2-IT (50 MM) e incubou-se a mistura durante 3 horas à temperatura de 37°C. Em seguida, separou-se o peptido tiolado numa coluna PD-10 (Pharmacia) como descrito anteriormente no exemplo 1. Depois, adicionaram-se 135 ml de ADM-HZN (2,1 MM) a 2,7 ML de transferrina tiolada em tampão PBS e incubou-se a mistura reaccional durante a noite à temperatura de 4°C.

Em seguida, centrifugou-se a mistura reaccional a 2000 RPM durante 10 minutos e preparou-se o conjugado transferrina-ADM da ADM que não reagiu por passagem através de uma coluna PD-10. Recolheu-se a parte do volume contendo o conjugado e determinou-se uma relação molar de ADM-transferrina de 4,6 utilizando-se a A250 de 1 para 1 mg/ml de transferrina.

Os exemplos de 4 a 6 demonstram portanto, a preparação de conjugados de ligando-antraciclina em que se liga um fármaco a antraciclina que é citotóxico e um reagente de ligação para

112 receptores associados com uma população celular escolhida que se deseja eliminar. A antraciclina é ligada com o ligando através de uma ligação nova de acil-hidrazona sensível ao ácido. Os conjugados descritos aqui retêm a capacidade de ligação para os receptores assim como a toxicidade da antraciclina para a população celular alvejada através do ligando.

Embora se tivessem descrito anteriormente vários aspectos da presente invenção , é evidente que a construção básica pode ser alterada para proporcionar outras realizações que utilizem imunoconjugados e métodos desta invenção. Portanto, entende-se que a presente invenção é bem definida pelas reivindicações apensas e não pelos aspectos que se apresentaram anteriormente como exemplo.

Claims (33)

1. REIVINDICAÇÕES

   1.- Processo para a preparaçao de imunoconjugados constituídos por, aproximadamente, 4 a 10 moléculas de antraciclina ligadas a um anticorpo capaz de reagir com uma população seleccionada de células que se pretende eliminar, comportando cada molécula de antraciclina um grupo ceto em posição e estando ligada ao anticorpo via um ligante que se encontra unido à antraciclina por uma ligação covalente atrvés de uma ligação acil-hidrazina em posição 13-ceto da antraciclina, caracterizado pelo facto:

   (a) de se fazer reagir um anticorpo com um agente capaz de fornecer grupos tiol; e (b) de se fazer reagir o anticorpo resultante que comporta grupos tiol com uma acil-hidrazona de fórmula geral .ίίϊ ο

   em que

   R^ representa um grupo CH^, CH₂0H, Cí^OCOCCl^) 3CH3 ou ch₂ococh(oc₂h₅)₂;

   R₂ representa um grupo de fórmula geral

   X representa um átomo de hidrogénio ou de halogéneo ou um grupo N0₂;

   R3 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo hidroxi ou OCH^;

   R^ representa um grupo NH_2> NHCOCF^, 4-morfolinilo, 3-ciano' 116 * .¾

   -4-morfolinilo, 1-piperidinilo, 4-metoxi-l-piperidinilo, benzilamina, dibenzilamina, cianometilamina ou 1-ciano-2-metoxietil-amina;

   R^ representa um átomo de hidrogénio ou um grupo hidroxi ou O-THP;

   Rg representa um átomo de hidrogénio ou um grupo hidroxi, com a condição de Rg não representar um grupo hidroxi quando R^ representa um grupo hidroxi ou O-THP; e n representa um número inteiro de 1 a 10 inclusivé;

   ou o

   na qual

   Rp R2, R₃, Rp Rg, X e n têm os significados definidos antes nas fórmulas gerais I e II; e

   R^ e Ry representam, cada um, independentemente, um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo eventualmente substituído cicloalquilo eventualmente substituído, arilo eventualmente substituído ou aralquilo eventualmente substituído; ou R^ e Ry, formam, considerados conjuntamente com o átomo de azoto adjacente, um núcleo com 4 a 7 membros e eventualmente substituído.
2. 2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar um ligante que comporta, adicionalmente uma ligação dissulfureto ou tioéter.
3. 3. - Processo para a preparação de imunoconjugados constituídos por pelo menos uma molécula de antraciclina com um grupo ceto em posição C-13 ligada via um ligante a um anticorpo capaz de reagir com uma população seleccionada de células que se pretende eliminar, encontrando-se esse ligante unido por uma ligação covalente ã antraciclina através de uma ligação acil-hidrazona em posição 13-ceto da antraciclina e contendo, adicionalmente, uma ponte dissulfureto ou tioéter, caracterizado pelo facto:

   (a) de se fazer reagir um anticorpo com um agente capaz de fornecer grupos tiol; e (b) de se fazer reagir o anticorpo resultante que comporta grupos tiol com uma acil-hidrazona de fórmula geral I, II ou III definida na reivindicação 1.
4. 4. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar uma antraciclina escolhida de entre um grupo constituído por adriamicina, daunomicina, detorubicina, carminomicina, idarubicina, epirubicina, esorubicina, 4'-THP-adriaV / ¹¹⁸ micina, AD-32 e 3'-desanino-3 ' - (3-ciano-4-morfolinil)-doxorubicina.
5. 5. - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 3, caracte_ rizado pelo facto de se utilizar como antraciclina a adriamicina ou a daunomicina.
6. 6. - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 3, caracte rizado pelo facto de se utilizar um anticorpo capaz de reagir com células tumorais.
7. 7. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo facto de se utilizar um anticorpo capaz de reagir com um antigénio associado a carcinomas, melanomas, linfomas ou sarcomas ósseos ou do tecido mole.
8. 8. - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 3, caract£ rizado pelo facto de se utilizar um anticorpo capaz de reagir com o antigénio CD 37 encontrado em linfomas de células B.
9. 9. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar como anticorpo um anticorpo monoclonal.
10. 10. - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 3, caracterizado pelo facto de se utilizar como anticorpo um anticorpo

    119 monoclonal 5E9, 3A1,L6, G28,l ou G28,5 e como antraciclina a adriamicina.
11. 11.- Processo para a preparação de conjugados antraciclina-ligando constituídos por pelo menos uma molécula de antraciclina ligada a um ligando capaz de reagir com uma população seleccionada de células que se pretende eliminar, comportando a antraciclina um grupo ceto em posição 13 e estando unida ao ligando via um ligante que se encontra unido à antraciclina por uma ligação covalente através de uma ligação acil-hidrazina em posição 13-ceto da antraciclina, caracterizado pelo facto (a) de se fazer reagir um ligando com um agente capaz de fornecer grupos tiol; e (b) de se fazer reagir o ligando resultante que comporta grupos tiol com uma acil-hidrazona de fórmula geral I, II ou III definida na reivindicação 1.
12. 12.- Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de se utilizar um ligante que comporta, adicionalmente, uma ligação dissulfureto ou uma ligação tioéter.
13. 13.- Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de se utilizar como ligando uma proteína, um polipeptido ou um péptido.

    .,12 C
14. 14. - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo facto de se utilizar um ligando escolhido de entre um grupo constituído por bombesina, transferrina, EGF, gastrina, o péptido capaz de libertar a gastrina, factor de crescimento derivado das plaquetas IL-2, IL-6, TGF-^C , VGF ou TGF- , insulina ou factores de crescimento I ou II similares à insulina.
15. 15. - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de se utilizar um ligando não peptidílico.
16. 16. - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracteriza do pelo facto de se utilizar um ligando escolhido de entre um gru po constituído por hidratos de carbono, esteróides e lecitinas.
17. 17.- Processo de acordo com a reivindciação 11, caracterizado pelo facto de se utilizar uma antraciclína escolhida de entre um grupo constituído por adriamicina, daunomicina, detorubicina, carminomicina, idarubicina, epirubicina, esorubicina,

    4'-THP-adriamicina, AD-32 ou 3'-desamino-3'-(3-ciano-4-morfolinil)-doxorubicina.
18. 18.- Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de se utilizar como ligando a bombesina e como antracíclina a adriamicina.

    121 *
19. 19. - Processo de acordo com a reivindciação 11, caracterizado pelo facto de se utilizar como ligando o EGF e como antraciclina a adriamicina.
20. 20, - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de se utilizar como ligando a transferrina e como antraciclina a adriamicina.
21. 21.- Processo para a preparação de novos compostos intermédios de fórmula geral o

    II

    122

    Ο em que , I<2’ ^R3> ^R5> ^r6’ &7» ^^en tem ^os significados definidos antes na reivindicação 1, caracterizado pelo facto (a) de se fazer reagir um éster N-hidroxisuccinimídico derivado de um ácido W- ^-ditio)-carboxílico, em que R£ tem os significados definidos antes, com hidrazina para se obter a hidrazida de um ácido W-(R2“ditio)-carboxílico, em que R2 tem os significados definidos antes, e (b) de se fazer reagir a hidrazida resultante com uma antraciclina de fórmula geral na qual /123 representa um grupo COCH^, COCH₂OH, COCH₂OCOCH(OC₂H₃) ou coch₂oco(ch₂)₃ch₃,

    R^ tem os significados definidos antes na fórmula geral I ou II, e

    R_3> R^ e Rg têm os significados definidos antes.
22. 22.- Processo para a preparação do cloridrato da 13- i 3-(2-piridilditio)-propionil |-hidrazona derivada da adriamicina ADM-HZN, caracterizado pelo facto de se fazer reagir o N-succinimidil-3-(2-piridilditio)-propionato (SPDP) com hidrazina para se obter a 3-(2-piridilditio)-propionil-hidrazida e de se fazer reagir este último composto com cloridrato de adriamicina.
23. 23.- Processo para a preparação da 13-^ 3-(mercaptopropionil) J -adriamicina-hidrazona, caracterizado pelo facto de se reduzir o cloridrato de adriamicina-13-3-(2-piridilditio)-propionil -hidrazona utilizando como agente redutor ditiotreitol (DTT) ou tributilfosfina.
24. 24.- Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo facto de se preparar uma 13-| 3-(mercaptopropionil)J -antraciclina-hidrazona mediante redução adicional do composto resultante utilizando um agente redutor apropriado.
25. 25.- Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 3, caracte124 rizado pelo facto de se utilizar como acil-hidrazona o cloridrato da adriamicina-13-| 3-(2-piridilditio)-propionil J· -hidrazona (ADM-HZN).'
26. 26.- Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 3, caracte rizado pelo facto de se utilizar como agente capaz de fornecer grupos tiol o SPDP (N-succinimidil-3-(2-piridilditio)-propionato) ou o 2-IT (2-iminotiolano).
27. 27. - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 3, caracte rizado pelo facto (a) de se fazer reagir o N-succinimidil-3-(2-piridilditio)-propionato (SPDP) com hidrazina para se obter a 3-(2-piridiltio)-propionil-hidrazida;

    (b) de se fazer reagir o cloridrato de adriamicina com a hidrazida preparada em (a) para se obter o cloridrato da adriamicina-13-^ 3-(2-piridilditio)-propionil l -hidrazona (ADM-HZN); e (c) de se fazer reagir este último composto com um anticorpo ao qual se uniram grupos tiol, anticorpo esse que é capaz de reagir com uma população seleccionada de células que se pretende eli minar.
28. 28. - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 3, caracte rizado pelo facto:

    (a) de se fazer reagir o N-succinimidil-3-(2-piridilditio)-pro125 pionato (SPDP) com hidrazina para se obter a 3-(2-piridiltio)-propionil-hidrazida;

    (b) de se fazer reagir o cloridrato de adriamicina com a hidrazida preparada em (a) para se obter o cloridrato da adriamicina-13- £ 3-(2-piridilditio)-propionilj -hidrazona (ADM-HZN);

    (c) de se tratar a ADM-HZN preparada em (b) com um agente redutor para se obter a 13-^ 3-(mercaptopropionil) j-adriamicina-hidrazona; e (d) de se fazer reagir esta última hidrazona preparada em (c) com um anticorpo ao qual se uniram grupos maleimida, canticorpo esse que é capaz de reagir com uma população seleccionada de células que se pretende eliminar.
29. 29.- Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de se utilizar como acil-hidrazina o cloridrato de adriamicina-13-3-(2-piridilditio)-propionil-hidrazona (ADM-HZN).
30. 30.- Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto:

    (a) de se fazer reagir o N-succinimidil-3-(2-piridilditio)-propionato (SPDP) com hidrazina para se obter a 3-(2-piridiltio)-propionil-hidrazida, (b) de se fazer reagir o cloridrato de adriamicina com a hidrazida preparada em (a) para se obter o cloridrato da adriamicina.126 (c) de se fazer reagir a hidrazona preparada em (b) com um ligando ao qual se uniram grupos tiol, ligando esse capaz de reagir com uma população seleccionada de células que se pretende eliminar .
31. 31.- Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto:

    (a) de se fazer reagir o N-succinimidil-3-(2-piridilditio)-propionato (SPDP) com hidrazina para se obter a 3-(2-piridiltio)-propionil-bidrazida;

    (b) de se fazer reagir o cloridrato de adriamicina com a hidrazida preparada em (a) para se obter o cloridrato da adriamicina-13-j 3-(2-piridilditio)-propionilj-hidrazona (ADM-HZN), (c) de se fazer reagir a hidrazona preparada em (b) com um agente

    -hidrazona, e (d) de se fazer reagir esta última hidrazona preparada em (c) com um ligando ao qual se uniram grupos maleimida, ligando esse que é capaz de reagir com uma população seleccionada de células que se pretende eliminar.
32. 32.- Processo para a preparação de composições farmacêuticas apropriadas para o tratamento de cancros, tumores não malignos, infecçoes patogénicas ou virais que não destroem as células ou

    127 situações de imunodeficiencia, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade eficaz de, pelo menos, um imunoconjugado preparado pelo processo de acordo com as reivindicações 1 ou 3 e que apresenta uma acção citotóxica sobre uma população seleccionada de células, com um veículo aceitável em farmácia.
33. 33.- Processo para a preparação de composições farmacêuticas apropriadas para o tratamento de cancros, tumores não malignos, infecções patogénicas ou virais que não destroem as células ou situações de imunodeficiência, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade eficaz de, pelo menos, um conjugado antraciclina-ligando preparado pelo processo de acordo com a reivindicação 11 e que apresenta uma acção citotóxica sobre uma população seleccionada de células, com um veículo aceitável em farmácia,