PT93427A - Processo para a preparacao de ws7622a,b,c e d e seus derivados de composicoes farmaceuticas que os contem - Google Patents

Description

t 61.986 bcp/pe-173^

14.11(11199¾¾ ' A—''*/^ /

Descrição do objecto do invento que FUJISAWA PHARMACEUTI.CAL C0., LTD, japonesa, industrial, com sede em b-J, Doshomachi 3-chome,Chuo--Ku, Osaka-Shi 0SAKA %bl, Japão, pretende obter em Portugal para: "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE WS7622A, B, C e D E SEUS DERIVA DOS DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE OS CONTÊM". 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30 35 A presente invenção refere-se a um processo para a preparação de WS7622A, B, C e D e seus deriva dos. Mais particularmente, esta invenção re-fere-se às novas substâncias WS7622A, B, C e D, respecti-vos derivados e seus sais aceitáveis farmaceuticamente os quais possuem uma acção inibidora de "elastase” dos leucoci tos humanos, aos respectivos processos de preparação, a uma composição farmacêutica constituída pelos mesmos e a um cor respondente método de utilização. As substâncias WS7622A, B, C e D podem ser produzidas utilizando uma classe produtora das substâncias WS7622A, B, C e D do género das Streptomyces num meio nutriente. 0 MICR00RGANISM0 0 microorganismo que pode ser utilizado 1 61.986 BCP/PE-173k 14. MlΓ a i

99<H

V 5 10 para a produção das substâncias WS7622A, B, C e D é uma classe produtora das substâncias WS7622A, B, Ce D-perten-cente ao género das Streptomyces de entre as quais as Strp tomyces resistomycificus No. 7622 foi depositada em primeiro lugar na Autoridade de Depósito Internacional sob o Tratado de Budapeste, o Instituto de Pesquisa da Fermentação, a Agencia de Tecnologia e Ciência Industrial (la 3, Higashi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305, Japão) sob o número de matrícula de FERM BP-2306 (a data de depósitos 23 de Fevereiro, 19®9)» como Strptomyces sp. No. 7622, e então esta classe foi denominada como Streptomyces resisto mycificus No. 7622.

Mod. 71-10000 ex. - 89/07

Deve ser compreendido que a produção 15 das novas substâncias WS7622A, B, C e D não está limitada â utilização do organismo particular aqui descrito, o qual foi dado apaenas para ilustração. Esta invenção inclui tam bém a utilização de quaisquer mutantes, os quais são capa zes de produzir as substâncias WS7622A, B, C e D incluindo 20 mutantes naturais assim como mutantes artificiais os quais podem ser produzidos do organismo descrito por meios con -vencionais tais como irradiação de raio-X, radiação ultra--violeta, tratamento com N-metilo-N’-nitro-N-hitrosoguani-dina, 2-aminopurina e os semelhantes. 25

As Streptomyces resistomycificus No. 7622 possuem as seguintes características monológicas, de cultura, biológicas e fisiológicas. (l) características morfológicass 30

Os métodos descritos por Shirling e Gottlieb^ foram empregues para este estudo taxonómico.

As observaçães morfológicas foram realizadas com microscópios ópticos e electrónicos em culturas desenvolvidas a 30°C durante 14 dias em água de fari- 2 35 61.986 BCP/PE-1734

14JÂR.1990 CLI lS

5 10

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 nha de aveia, agar de extracto fermentado de extracto de malte e ágar de sais inorgânicos de amido. 0 micélio vegetativo desenvolveu-se bem sem fragmentação. 0 micélio aéreo ramificou-se de for ma monopopia e formou cadeias em espiral de flexibilidade recta es esporos com mais de 30 esporos por cadeia. Os es poros possuiam uma superfície lisa e eram ovais na forma com um tamanho de 0.7-0.9x 0.8-1.1 um. Grânulso esclerjS ticos, esporângio e zoosporos não foram observados. (2) Características de cultura:

As características de cultura foram ob servadas em dez espécies de meios descritas por Shirling e 2)

Gottlieb acima mencioados e por Walsman '. A incubação foi realizada a 30°C duran te 21 dias. As denominações das cores utilizados neste es-tndo foram tiradas do Manual da Cor Methuen^. Os resulta dos são demonstrados no Quadro 1.

Quadro 1 Características de cultura da classe No. 7622 Meio Características de cultura 25 Água de extracto de fermento de G: bom Extracto de malte A: moderada, cinzento azulado (22E2) Rí castanho (6F4) 30 S: nenhum Ágar de farinha de aveia G: bom A: moderada, cinzento azulado (22D2) 35 R: castanho (6f6) S: nenhum = 3 = 6.986 bcp/pe-173^

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 1 Meio Características de cultura Ágar de sais inorgânicos de G: bom 5 amido A: abundante, cinzento acastanhado (7E2) R: castanho arrocheado (llF6) S: nenhum 10 Ágar de glicerina-aspa- Gs bom ragina A: abundante, cinzento acastanhado (6E2) 15 R: laranja acinzentada (5B5) Sí nenhum Ágar de ferro de extracto G: moderado de fermento de peptona A: nenhum 20 R: castanho (6F6) S: castanho escuro Ágar de tirosinas G: bom 25 As pobre, cinzento turquesa (2^E2) R: castanho escuro (7F8) Ss nenhum 30 Ágar de glucose - asparagina Gs moderado A: nenhum Rs branco amarelado (^A2) 35 Ss nenhum = k = 1 5 10 15

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 61.986 BCP/PE-173Z*

Meio ágar nutriente ágar de Bennet

Caracteristicas de cultura ágar de nitrato de sacarose

Caracteristicas de cultura G: fraco A: nenhum R: branco amarelado (4A2) S: nenhum G: bom A: fraco, cinzento lado (22E3) azu- R: laranja acastanhado (5C5) S: nenhum G: bom A: nenhum R; magenta acinzentada (13D*0 S: nenhum 25

Abreviaturas: G = crescimento, A = micélio aéreo, R = cor do avesso, S = pigmento solúvel 30 0 micélio aéreo variou entre cinzento a-zulado e cinzento acastanhado. 0 reverso do crescimento: era castanho em ágar de extracto de fermento de extracto de malte e em ágar de farinha de aveia, castanho arrocheado em ágar de sais inorgânicos de amido, e Magenta acinzentada éffi ágar de nitrato de sacarose. Produziram-se pigmentos melâ-nicos, mas não se produziram outros pigmentos solúveis. = 5 = 35

61.986 BCP/PE-173** (3) Tipo de parede de célula: A análise de lizada por métodos de Becker e outros A análise de parede de célula foi rea- *0 „ ______λμ5) e Yamaguchi" A análise de todas as células hidroli-zadas da classe No. 7^22 demonstrou a presença do ácido diaminopilémico-LL. Adequadamente, a parede da célula deis ta classe é classificada como tipo I. 10 (4) Propriedades fisiológicas e morfológicas:

As propriedades fisiológicas e a utilj. zação de fontes de carbono são demonstradas nos Quadros 2 e 3, respectivamente. 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 0 limite da temperatura durante o crej| cimento foi determinado em ágar de extracto de fermento de malte utilizando um incubador TN-3 gradiente da temperatura (fabricado pela Advantec Toyo Co., Ltd.). A utilização de fontes de carbono foi examinada de acordo com o método de Pridham e Gottlieb^,

Quadro 2 Propriedades fisiológicas da classe No. 7622

Caracteris ticas 12°C - 3^°C 27°C positiva negativa positiva positiva positiva negativa >3# e <k $>

CondiçSes 25

Limites da temperatura durante o crescimento temperatura óptima para crescimento liquefação de gelatina 30 coagulação do leite peptonização do leite hidrólise do amido produção de pigmentos melânicos decomposição de celulose tolerância do NaCl = 6 = 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30 61.986BCP/PE-173^ 14. MAR. 1990

Quadro 3 - Utilização de carbono da classe No. 7622 Compostos Crescimento Glucose + Sacarose + Xilose-D Frutose-D + Ramnose-D + Rafinose «» Arabinose-L + Inositol + Manitol + + i utilização possível +_ : utilização duvidosa - : sem utilização Com base nas características fisiológicas e morfológicas acima descritas, considera-se que a classe No. 7622 pertence ao gjénero das Streptomvces ^ . Assim, a classe No. 7622 foi comparada com as espécies dos Strptomyces descritas na bibliogra-8—X2) fia ” . Como resultado, verificou-se que a classe provou assemelhar-se intrinsecamente com as Streptomvces resistomycificus IF0128l*f nos pormenores. Então, desco-briu-se que as propriedades de ambas as classes eram quase idênticas excepto umas pequenas diferenças. Quadro k demonstra as duas classes. as diferenças entre = 7 = 35 61.986 BCP/PE-173^ 14.MAR.19t 1/

Quadro 4

Condiçães

Diferenças entre a classe No. 7622 e as Streptomyces resistomycificus IF0128l4

Características IF012814

No. 7622 10 15 crescimento em ágar de nitrato de sacarose limites de temperatura durante o crescimento tolerância ao NaCl fraco bom não se utiliza utiliza-se

14-37°C

Í2-34°C

Mod. 71 -10000 ex. -89/07 20

Considerou-se por ser correcto que estas diferenças são demasiado pequenas para julgar a classe No. 7622 como uma espécie diferente. Por isso, identificamos a classe como Streptomyces resistomycificus e designou-se Streptomyces resistomycificus No.7622, l) Shirling, E.B» e D, Gottliebs Métodos para caracterização das espécies Streptomyces.

Jornal Internacional de Bacterologia Sistemática, l6. 313-3^0, 1966. 2) Waksman, S.A.: As actinomicetes - Vol. 2: Classificação, identificação e descrição da ordem e espéciesj Williams e Xilkins, Co., Baltimore, 1961. 3) Kornerup, A. e J. H. Wanscherj Manual da Cor de Methuen, Londres, 197& 1*) Becker, B., M.P. Lechevalier, R.E. Gordon e Η. A. = 8 = 30 10 15

Mod. 71 -10000 βχ. · 89/07 20 25 30

61.986 BCP/pe-1734 óL

Lechevalier; Diferenciação rápida entre Nocardia e Strepromyces pela cromatografia de papel de todas as células hidrolizadasí Aplicação microbiológica. 12, b21 --U23, 196¾ 5) Yamaguchi, T.: Comparação da composição da célula de actinomicetes distintas morfologicamente: Jornal de Bzcteniologia. 8£, hkh-k53, 1965 6) Pridham, T. G. e D. Gottlieb: A utilização de compostos de carbono por alguns Actinomicetalos como um auxílio para a determinação das espécies: Jornal de Bacteriologia f>6: 107-11^, 19^8 7) Buchanan, R.E. e N.E. Gibbons: Manual de Bacterioljo gia Determinativa de Bergey, 8& edição: Williams e Wilkins Co., Baltimore, 197^· 8) Shirling, E. B. e D, Gottlieb: Descrição cooperativa do tipo de cultura das Streptomyces. 2. Descrição das espécies do primeiro estudo. Jornal Internacional de Bacteriologia Sistemática. 18^: 69—189» 1968 9) Shirling, E. B. e D. Gottlieb : Descrição Dooperati-va do tipo de cultura das Streptomyces, 3· Descrição de espécies adicionais dos primeiro e segundo e_s tudos. Jornal Internacional de Bacteriologia Sistemática 18 : 279-392, 1968 10) Shirling, E. B. e D. Gottlieb : Descrição Cooperati va do tipo de cultura das Streptomyces.h. Descrição das espécies do segundo, terceiro e quarto estudos. Jornal Internacional de Bacteriologia Sistemática. 19: 391-512, 1969 11) Skerman, V. B. D.; y, McGowan & P. H. Sneath: lista reconhecida dos nomes das bactérias. Jornal In— = 9 = 35 5 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30 61.986 bcp/pe-173^ HM \Á ternaéional de Bacteriologia Sistemática. 30: 225 --420, 1980 12) Moore, ¥. E. C., E. P. Cato & L. V. H. Moore: índice das Alteraçães de nomenclatura do fermento e das bactérias. Publicada no Jornal Internacional de Bacteriologia Sistemática. Desde I98O lista reconhecida nos Nomes das Bacférias. Jornal Internacional de Bacteriologia Sistemática. 35: 382-407, 1985.

As substâncias WS7622A. B. C e D

As substâncias WS7622A, Bf C e D são prc> duzidas quando a classe, pertencente ao género Streptomyces que produz as substâncias WS7622A, B, C e D, é desenvolvida (cultivada) num meio nutriente contendo fontes de carbono e nitrogénio assimiláveis sob condiçães aeróbicas (e. g. cultura de agitação, cultura submersa, etc.). 0 meio pode ser quer sintético, quer semi-sintético quer natural. As fontes de carbono preferidas podem ser glucose, manose, glicerina, melaço, amido, amido hidro-lizado, etc. e as fontes de nitrogénio preferidas podem ser extracto de carne, caseína hidrolizada, peptona, farinha de glúten, farinha de milho, farinha de semente de algodão farinha de soja, licro de milho "embebido". fermento seco, fosfato de amónio, sulfato de amónio, ureia, etc* Também se podem incorporar sais inorgânicos tais como fosfatos, cloretos e outros sais de metais, e.g. fosfato de hidrogénio de dissódio, fosfato de dihidrogénio de potássio, carbonato de cálcio, sulfato de magnésio, sulfato de ferro, sulfato de cobre, sulfato de zinco, cloreto de maganésio cloreto de magnésio, etc. Se se encontrar espuma cupiosa durante a fermentação, um agente deformado tais como óleos vegetais, e.g. óleo de soja, óleo de linhaça, etc. podem- 10 35 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30 61.986BCP/PE-173^ rf S'- -se adicionar álcoois "elevados" (com um grau elevado), e.g octadecanol em quantidades apropriadas. A fermentação é conduzida de preferência a volta dos 30°C durante 1 período de tempo compreendido entre 50 a 200 horas. Das condições de fermentação acima menciçj nadas, o ponto óptimo das condições é seleccionado de acor do com as características da classe de microorganismos empregue. Desde que uma porção maior das substâncias WS7622A, B, C e D assim produzidas no caldo de cultura esteja presenta intracelularmente, o caldo cultivado é filtrado em primeiro lugar. À. torta de micélio obtida é adici<> nado um dissolvente adequado como acetona e o composto desj. jado é então separado e purificado da mistura resultante pe> lo procedimento utilizado geralmeiite na produção dos antibióticos. Por exemplo, podem ser empregues procedimentos como concentrações sob pressão reduzida, secagem por congelação, extracção do dissolvente, regulação do pH, tratamento com uma resina de permuta aniónica, resina de permuta ca tiónica, resina adsorvente não iónica, etc. tratamento com um agente adsorvente como por exemplo carbono activado, áci do silícico, sílica gel ou de alumina, cristalização, e recristalização, isoladamente, ou numa combinação opcional. Os componentes WS7622A, B, C e D podem ser separados do caldo cultivado, por exemplo, pelos seguin tes dados da cromatologia líquida de alto desempenho: Cultura : Instituto Químico de Yamamura,Kyoto, A-302 (ODS 6 y x 150 mm) 11 35 ;'V 1 5 10 15 61.986 BCP/PE-173^

iJ

Fase Móvel : CH^H-C^CN-0,3 $ aq.I^PO^(I0íl:10) Detecçãos 210 mm Velocidade de circulação; 1 ml/min Tempo de Retenção (min): WS7622A * 6,93 WS7622B í 10,08 VS7622C ; 5,30 WS7622D ; 4,38

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30

As substâncias WS7Ô22A, B, C e D produzidas no caldo de cultura podem ser isoladas na sua forma livre ou se se desejar, na forma de um sal farmacêutica -mente aceitável, respectivamente. Para isolar estas subs[ tâncias na forma de um sal farmaceuticamente aceitável, o composto desejado obtido do extracto de micélio é tratado com uma base tal como uma base inorgânica; e. g. um com posto de metal alcalino (e. g. hidróxido de sódio, hidró^ xido de potássio, etc.), um composto de metal de terra alcalina (e. g. hidróxido de cálcio, hidróxido de magnésio, etc.), uma base inorgânica, e. g. amónia, etc., uma base orgânica (e. g. trietilamina, diciclohexilamina, etc) ou um ácido tal como um ácido inorgânico (e. g. ácido hi-droclórico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, etc.), ou um ácido orgânico (e. g. ácido fórmico, ácido acético, á-cido p-toluenossulfónico, ácido cítrico, ácido oxálico, etc.), por onde cada um dos sais correspondentes das suhs tâncias WS7622A, B, C e D pode ser obtido. Cada um dos sais das substâncias WS7622A B, C e D assim obtido pode ser reconvertido para as subs- 12 35 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30 61.986 bcp/pe-173^

; tâncias WS7622A, B, C e D livres em si mesmas pela maneira convencional. (l) Substância WS7622A s A substância WS7622A é uma substância nova e possui as seguintes propriedades físico-químicas. Propriedades físico-químicas da substância WS7622A :

Aspecto

Prisma incolor

Natureza da substâncias acídica

Reacção â cor

Solubilidade positiva em; sulfato de cório, vapor de iodo negativa em; nihidrina, molish : solúvel em; metanol, etanol, butanol-n pouco solúvel em; clorofórmio, acetona, acetato de etilo; insolúvel em; água, hexano-n Crometografia de camada fina (TLC) : clorofórmio-metanol (5:1, v/v) Rf 0,51 acetona-metanol (l0:l) 0,62 (prato de sílica gel 60 F25k de Kiesel gel, Merck) Ponto de fusão : 250-252°C (dec.) * 13 = 35 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30 61.986 BCP/PE-1734

Rotação específica : + 36° (c=l,0, MeOH)

Espectro Ultra Violeta : MeOH V max 287 nm (£ =3600)

MeOH-HCl ^ 287 nm max

MeOH-NaOH "n) 298 nm max °47H63N9°13

Formula molecular j Análise Elementar :Calculado (CV7H63N9°13’2H2°)} C 56,56, H 6,77,N 12,63 $> Encontrado . C 56,65, H 6,62, N 12,27 # Peso Molecular s FAB-MS m/z 984 (M+Na)+

Espectro de absorção infravermelha (ver Figura 1 junta): KBr max 3400, 3300, 3060, 2980, 2940, 1735 1710, 1690, I660, i64o, 154o, 1520 1470, 1380, m330, 1300, 1260, 1220 1200, 1160, 1130, 1090, 1000, 980, 9^0, 920 cm"1 * 14 * 35 1 5 10 15 61.986 BCP/PE-173^

Qi

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30

Espectro de Ressonância Magnética Nuclear H1 (ver Figura 2 junta) : (400MHz, cd^od) £ 7,22 - 7,09 (3H, m) 6,88 - 6,77 (3H, m) 6,74 (1H, s) 6,46 (1H, s) 5,46 (1H, m) 5,18 (1H, s) M5 (1H, s) 4,77 (1H, m) , 1 M3 1H, m) ^,50 (1H, ra) 3,96 (1H, m) 3,91 (1H, d, J=9Hz) 3,60 - 3,47 (2H, m) 3,03 (1H, m) 2,90 (3H, s) 2,86 (1H, m) 2,59 - 2,49 (2H, m) 2,39 (1H, m) 2,29 - 2,16 X2H, m) 2,00 (1H, m) 1,84 (1H, m) 1,7¾ (3H, d, J=6Hz) 1,72 - 1,53 (4H, m) 1,44 (3H, d, J = 6Hz) = 15 35 61.986 BCP/PE-1734

1,12 (1H, m 1,10 (6H, d 0,99 (3H, d 0,9*1- (3H, d 6Hz) 6Hz) 6Hz) . 1 τ

Espectro de Ressonância Magnética Nuclear C (ver Figura 3 junta) 10

(100MHz, CD^OD) J 15

Mod. 71-10000 ex. -89/07 20 25 30 179,7 (e) 176,3 (s) m,7 () 173,3 (3) 172,4 (3) 171,4 (b) 170,3 (3) 165,8 (s) 160,2 (s) 145,7 (s) 145,6 (s) 137,5 (s) 134,0 (d) 131,4 (s) 130,6 (d) 129,8 (s) 129,1 (d) 129,1 (s) = 16 * 35 61.986 BCP/PE-1734

Mod. 71 -10000 ex. -89/07 127,6 (d) 119,1 (d) 118,0 (d) 76,0 (d) 73,4 (d) 63,1 (d) 61,4 (d) 57,1 (d) 53,6 (d) 52,7 (d) 50,5 (d) 39,9 (t) 36,1 (t) 35,8 (d) 31,8 (q) 31,0 (t) 30,8 (d) 29,9 (t) 29,7 (t) 25,2 (t) 22,3 (t) 20,2 (q) 20,0 (q) 19,7 (q) 19,5 (q) 13,3 (q) = 17 = 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30 61.986 BCP/1732* (2) Substância WS7622B: A substância WS7Ó22B é uma substância nova e possui as seguintes propriedades físico-químicas. Propriedades físico-químicas da substância WS7622B :

Aspecto agulhas incolores

Natureza da substância : acídica Reacção à cor : positiva em; sulfato de cério, vapor de iodo, cloreto férrico negativa em; niidrina, Molish, Dragen-dorff Solubilidade í solúvel em; metanol, etanol, buta nol-n pouco solúvel em; clorofórmio, acetona insolúvel em; água, hexano-n Cromatografia em camada fina (TLC) s Clorofórmiqínetanol (5:1, V/V)Rf. 0,55 (prato de sílica gel P25^ de Kiesel gel, Merck) Ponto de fusão : 248-250°C (dec.) Rotação específica : + 39o (c = 1,0, MeOH) D 18 = 35 1 5 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30 6l.986 bcp/pe-1734 f\f

Espectro Ultra Violeta *‘λ Λ

MeOH max MeOH-HCl max

MeOH-NaOH max Fórmula Molecular : CWH65Vl3 Análise Elementar: 287 nni (£=3800) 287 nm 299 nm calculado (C48H65N9°13*^H20^ ! C 55,96, H 6,95, N 12,24 # encontrado ; C 55,84, H 7,05, N 12,12 $

Peso Molecular : FAB-MS m/z 998 (M+Na)+ Espectro de absorpção infravermelha (ver Figura 4 junta) 3400, 3300, 2960, 1735, 1680, 1660 1640, 1540, 1520, l46o, i4oo, 1380 1330, 1290, 1250, 1200, 1180, 1150 1130, 1080, 1050, 1000, 980, 94o, 920 cm' -1

Espectro de Ressonância Magnética Nuclear H (ver Figura 5 junta) : (400MHz, DMS0-dg) £ 9,48 (lH, s amplo) 9,03 (lH, s amplo)

1 5 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30 61.986 BCP/PE-1734 14M199ÕI i X IA* 8,76 (1H, s amplo) 8,30 (1H, d amplo, 7,77 (1H, d, J = 7H 7,21 (1H, d, J=8Hz) 7,20 - 7,11 (3H, m) 6,97 (1H, d amplo, 6,80 (2H, d, J=8Hz) 6,72 (1H, s amplo) 6,67 (1H, s) 6,63 (1H, q, J=7Hz) 6,37 (1H, s) 5,48 (1H, m) 5,4o (1H, m) 5,09 (1H, m) ^,77 (1H, m) 4,64 (1H, m) 4,38 (1H, m) 4,31 (1H, m) 3,87-3,80 (2H, m) 3,40-3,30 (2H, m) 2,95 (1H, m) 2,79 (3H, s) 2,65 (1H, m) 2,40-2,20 (4h, m) 2,00 (1H, m) ,1,87 (1H, m) 1,73 (1H, m) 20 35 61.986 BCP/PE-1734

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 1,65 (3H, d, J=7Hz) 1,65 - ι,4ο (5H, ra) 1,32 (3H, d» J =6Hz) 1,27 (1H, m) 0,97 (3H, d, J = 6Hz) 0,97 (1H, m) 0,91 (3H, d, J = 6Hz) 0,88 (3H, d, J = 6Hz) 0,81 (3H, t, J « 7Hz) Espectro de Ressonância Magnética Ntíclear 1 C (ver Figura 6 junta) : (100MHz, DMSO-dg) ^ 175,6 (s) 174,8 (s) 172,0 (s) 170,9 (s) 170,6 (s) 170,3 (s) 168,7 (s) 162,5 (s) 157,4 (s) 144,2 (s) 144,2 (s) 136,5 (s) 131,1 (d) 130,7 (s) 21 1 61.986 BCP/PE-1734 5 10 15 20 25 »6 (d) ,4 (s) ,9 (d) * 8 (s) ,4 (d) ,9 (d) ,8 (d) ,2 (d) ,1 (d) ,o (d) ,8 (d) ,2 (d) ,6 (d) ,8 (d) »6 (d) ,9 (d) ,2 (t) ,0 (t) ,8 (q) ,8 (t) ,8 (d) ,4 (t) ,1 (t) ,1 (t) ,3 (t) ,2 (t) *6 (q) 22 30 61.986BCP/PE-173^ 14.

19,1 (q) 19,0 (q) 17,7 (q) 12,9 (q) H,9 (q) 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 (3) Substância WS7622C: A substância WS7622C é uma substância nova e possui as seguintes propriedades fisico-químicas.

Propriedades físico-químicas da substância ¥876220 :

Aspecto Reacção â cor

Agulhas incolores positiva em; sulfato de cério, vapor de iodo, cloreto férrico negativa em; niidrina, Molish, Dragen dorff

Solubilidade : solúvel em; 25 metanol, etanol, pouco solúvel em; 30 clorofórmio, acetona, acetato de etilo insolúvel em; água, hexano-n

Cromatografia de Camada Fina (TLC) í

Clorofórmio-metanol (4:1, v/v) Rf 0,56 (prato de sílica gel 60 F254 de Kiesel gel, Merck) = 23 = 35 1 10 15

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 25 30 61.986 BCP/PE-173^

Ponto Ide Fusão Rotação Específica

Espectro Ultravioleta : 250-252 C (dec.) = /Zi 723 + 36° (C=0,5, D MeOH 5 \ /'max 287 nm ( MeOH-HCl . \ • */'max 287 nm MeOH) =3500) λ

MeOH-NaOHmax 298 nm Fórmula Molecular

‘ °*6H6lV 13

Análise Elementar s Calculado (C46H6lN9°13-6H2°) 5 C 52,31, H 6,97, N 11,94 $ Encontrado ; C 51*95, H, 6,66 n n,77 $ Peso Molecular : FAB-MA m/z 970 (M+Na)+ Espectro de Absorpção infravermelha (ver Fig. 7 junta) í KBr Ό 3400, v max * 3300, 2980, 1740, 1700, 1660, 1640, 1540, 1470, 1450, 1410, 1335, 126o, 1230, 1200, Il60, 1140, 1070, 1010, 980, 9^0, 920, 880 1 cm

Espectfo de Ressonância Magnética Nuclear H1 (ver Figura 8 junta) : £ (400MHz, CD30D) 7,21 - 7,10 (3H, m) - 2k = 35 1 5 10 15 Γν ο C0 ο ο ο ο 20 25 30 61.986 BCP/PE-1734

6,86 - 6,77 (3Η, m) 6,75 (1Η, s) 6,47 (ΐΗ, s) 5,46 (1Η, m) 5,18 (ΐΗ, m) 4,85 (ΐΗ, s) 4,74 (1Η, m) 4,65 (ΐΗ, -) 4,51 (ΐΗ, m) 3,9^ (1Η, ») 3,90 (1Η, d, J 3,58 - 3,46 (2Η, m) 3,02 (1Η, m) 2,90 (3Η, ») 2,86 (1Η, m) 2,55 (1Η, m) 2,38 (ΐΗ, dd, 2,28 (2Η, q, J 2,30 - 2,16 (2Η, m) 1,99 (ΐΗ, m) 1,84 (ΐΗ, m) 1,75 (3Η, d, J 1,78 - 1,54 (4η, m) 1,44 (3Η, d, J 1,13 (3Η, t, J 1,12 (ΐΗ, m) 1,01 (3Η, d, J 0,97 (3Η, d, J = ΙΟΗζ) J =14 e 11Hz) = 7Ηζ) =7Ηζ) =6,5Ηζ) =Ηζ) =6,5Ηζ) =6,5Ηζ) = 25 = 35 1 61.986 t4JAR199 BCP/PE-173^ * ff 13

Espectro de Ressonância Magnética Nuclear C 5 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30 (ver Figura 9 junta) : (lOOMHz, CD^OD) g 176,7 (s) 176,4 (s) 174,7 (s) 173,4 (s) 172,5 (s) 171,4 (a) 170,4 (a) 165,8 (») 160,4 (s) 145,8 (s) 145,7 (s) 137,5 (a) 134,0 (d) 131,4 (s) 130,6 (d) 129,8 (s) 129,1 (d) 129,1 (a) 127,7 (d) 119,1 (d) 118,0 (d) 76,0 (d) 73,5 (d) 63,1 (d) = 26 = 35 1 5 10 15

Mod. 71 -10000 ex. -89/07 20 25 61.986 bcp/pe-173^

6l,b (d) 57,1 (d) 53,7 (d) 52,7 (d) 50,5 (d) 39,9 (t) 36,1 (t) 31,8 (q) 31,0 (t) 30,8 (d) 29,9 (t) 29,7 (t) 29,7 (t) 25,3 (t) 22,3 (t) 20,2 (q) 19,¾ (q) 19Λ (q) 13,3 (q) 10,3 (q) (*l·) Substância WS7622D; A substância WS7622D é uma substância nova e possui as propriedades físico-químicas seguintes.

Propriedades físico-químicas da substância WS7622D :

Aspecto : Agulhas incolores 35

Natureza da substância : acídica = 27 = 1 5 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30 61.986 BCP/PE-I734

Reacção a cor

Solubilidade $ positiva em; sulfato de cério, vapor de iodeto, cloreto fér rico negativa em; niidrina, Molish, Dra-gendorff : solúvel em; metanol, etanol pouco solúvel em; água, clorofórmio insolúvel em; hexano-n

Cromatografia de camada fina (TLC) :

Clorofórmio-metanol (4:1, v/v) Rf 0,45 (prato de sílica gel 60 F254 de Kiesel gel, Merck)

Ponto de fusão s 250-252°C (dec. ) Rotação específica : &72k + 35,8° D (C « 0,5, MeOH) Espectro Ultra Violeta . Me 0H • \ max 287 nm (£ *3640) % MeOH-HCl max 287 nm MeOH-NaOH max 298 nm 28 = 35 61.986 BCP/PE-I734

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 1 Fórmula Molecular : C45H59N9°13 Análise Elementar: 5 Calculado (C^H 39Ng013.6H20); C 51,86, H 6,87, N 12,08 $ Encontrado ; C 51,90, H 6,26, N 12,08 $ 10 Peso Molecular: FAB-MS m/z 956 (M+Na)+ Espectro de Absorpção infravermelha (v.Fig.10 junta) KBr 3360, 2950, 1730, 1700, I68O, l660, 15 max 1640, 1530, 1460, 1380, 1330, 1290, 1250, 1200, II70, ll60, 1140, 1080, 980, 940, 920, 880 cm"1 20 Espectro de Ressonância Magnética Nuclear (v.Fig.ll junta) (400MHz, cd^od) 7,20 - 7,10 (3H, m) 6,85 - 6,77 (3H, m) 25 6,73 (1H, s) 6,46 (1H, s) 5,46 (1H, m) 5,18 (1H, m) 30 4,84 (1H, s) 4,73 (1H, m) 4,64 (1H, m) 35 4,50 (1H, m) 3,99 - 3,87 (2H, m) = 29 =

Mod. 71 -10000 βχ. - 89/07 61.986 , BCP/PE-1734 \rrJh i 1 1 3,58 - 3,k6 (2H, m) 3,01 (1H, m) 2,90 (3H, s) 5 2,87 (1H, m) 2,53 (1H, m) 2,38 (1H, dd , J =14 e 11Hz) 2,30 - 2,16 (2H, m) 10 2,00 (1H, m) 1,99 (3H, s) 1,84 (1H, m) 15 1,75 (3H, d, J =7Hz) 1,76 - 1,55 (4H, m) M3 (3H, d, J =6,5Hz) 1,15 (1H, m) 20 1,00 (3H, d> J =6,5Hz) 0,95 (3H, d, J =6,5Hz) Espectro de Ressonância Magnética Nuclear T T (ver Figura 12 junta) 25 (100MHz, CD^OD) g 176,4 (a) 174,6 (s) 173,¾ (s) 30 173,0 (s) 172,4 (s) 171, ^ (s) 35 170,4 (s) 165,8 (s) 30 = 1 5 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30 61.986 BCP/PE-1734

160,3 (s) 145,9 (s) 145,9 (s) 137,5 (s) 134,0 (d) 131,4 (s) 130,6 (d) 129,8 (s) 129,1 (d) 129,1 (s) 127,6 (d) 119,0 (d) 118,0 (d) 76,0 (d) 73,5 (d) 63,1 (d) 61,3 (d) 57,1 (d) 53.9 (d) 52,7 (d) 50,5 (d) 39,9 (t) 36,1 (t) 31,8 (q) 31,0 (t) 30,7 (d) 29,9 (t) 31 = 35 61,986 bcp/pe-1731 2* 29,6 (t) 25,3 (t) 22,¾ (q) 22,3 (t) 20,2 (q) 19,5 (q) 19,¾ (q) 13,3 (q)

Derivados da Substância WS7622A

15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20

Os derivados da substância WS7622A desta invenção podem ser representados pela seguinte fórmula (l):

(I) 25 30 = 32 = 35 1 2 em que R e R são seleccionados de cada grupo de baixo teor de alquilo ou grupo de baixo teor de alcano (alcanoilo).

Um grupo de baixo teor de alquilo significa aquele grupo que possui 1 a 6 átomos de carbono, e os exemplos preferidos do grupo de baixo teor de alquilo são metilo, etilo, nonilo, isopropilo, butilo, iso-butilo, butilo terciário, pentilo ou os semelhantes. 2

Um grupo de baixo teor de alcano significa aquele grupo que possui 1 a 6 átomos de carbono, e os exemplos preferidos do grupo de baixo teor de alcano são formilo, acetilo, propionilo, butinilo, isobuti-

61.986 BCP/PE-173^ rilo, valerilo, isovalerilo, pivaloilo, hexanol ou os semelhantes.

Derivados da substância WS7622A (i) podem ser preparados pelos seguintes métodos: (l) Processo 1 (Alquilação da Substância WS7622A): C*7H6lN9° OH . alquilo-inferioi 11\ ^ OH VeiVn- 0.alquilo-inferioi (II) (Ia)

Mod. 71-10000 ex. 89/07 A substância WS7622A di-alquilada (la) ou respectivo sal podem ser preparados pela reacção da subs tância WS7622A (li) ou o sal respectivo com um agente alqui lante.

Exemplos preferidos do sal dos compostos (Ia) e (II) podem incluir os mesmos como aqueles exemplificados como sais farmaceuticamente aceitáveis das substâncias WS7622A, B, C e D e correspondentes derivados. 25

Os exemplos preferidos dos agentes alqui-lantes inclui diazaalcanos (e. g. diazometano, diazoeta-no, etc,), Jialetos de alquilo (e. g. iodeto de metilo, iodeto de etilo, etc,), sulfatos de dialquilo (e, g. sulfato de dimetilo, etc.) e os semelhantes. 30

Esta reacção é conduzida de preferência num dissolvente inerte à reacção, tal como álcool (e.g. metanol, etanol, propanol, etc.) clorofórmio, ou uma mistura correspondente, à temperatura ambiente.

Nalgitns casos, esta reacção é executada de preferência na presença de uma base convencional. = 33 = 35 10 15

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 25 30 61.986 BCP/PB-173^

(2) Processo No. 2 (Acilação da substância WS7622A): C47H61N9°h: (II)

0H

Oh _ C^7H6lN9°ll

D.alquilo inferior — ^0.alquilo inferior (I ) A substâncias WS7622A di-acilada (i ) ou respectivo sal podem ser preparados pela reacção da substância WS7622A (li) ou sal correspondente com um composto da fórmula: R- OH em que R é um alcano inferior, ou respectivos derivados re-activos. Os exemplos preferidos de sal dos compos-tos (i ) e (li) podem incluir os mesmos como aqueles exemplificados como sais farmaceuticamente aceitáveis das substâncias WS7622A, B, C e D e derivados correspondentes. 0 mencionado derivado reactivo pode inclu ir haletos ácidos, azidas ácidas, anidridos ácidos, amidas activas, esteres activos e os semelhantes. Quando um ácido carboxílico livre (i.e, um composto da fórmula: R - 0H) é utilizado, esta reacção é conduzida de preferência na presença de um agente conden sador convencional. Esta reacção é conduzida de preferência num dissolvente convencional tal como álcool (e.g. metanol, etanol, propanol, etc,), sob refrigeração a gelo ou â tem peratura ambiente, e são obtidos bons resultados na maior = 34 = 35 1 1 5 10 15

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 25 30 61.986 BCP/pe-173^ parte dos casos quando esta reacção é executada na presença de uma base tal como piridina. Tal base, a qual é líquida, pode servir também como dissolvente.

Um sal farmaceutieamente aceitável de ca da uma das substâncias WS7Ú22A, B, C e D e respectivos derivados pode incluir um sal com uma base inorgânica ou orgânica tal como um sal de metal alcalino (e.g. sal de sódio, sal de potássio, etc.), um sal de metal de terra alcalina (e.g. sal de cálcio, etc.), sal de amónio, sal de etanolamina, sal de trietilamina, sal de diciclohexila-mina ou os semelhantes, e um sal ácido adicional com um á eido orgânico ou inorgânico tais como sulfoneto de metano hidrocloreto, sulfato, nitrato, fosfato ou os semelhantes.

As substâncias WS7622A, B, C e D, derivados respectivos e seus sais farmaceutieamente aceitáveis possuem uma actividade de inibição da elastase dos leucoci tos e é útil como inibidores da elastase dos leucócitos humanos para tratamento de doenças degenerativas, por exem pio, enfizema pulmonar, eteroesclorose, artrite reumatojL de, psorase, osteoartrites, pancreatite, sindroma de di, ficuldade respiratória adulta e os semelhantes.

Para ilustrar a utilidade das substâncias WS7622A, B, C e D, derivados correspondentes e respectivos sais farmaceutieamente aceitáveis, são mostrados os respeç tivos dados do teste farmacológico em seguida.

Análise de Inibição de Protease : (l) Preparação da elastase natural dos leucócitos humanos:

Cinquenta mililitros de sangue foram obtidos de um voluntário saudável. Os leucócitos foram isolados do sangue utilizando um meio de separação mono-poli = 35 = 35 61.986 bcp/pe-173^ (FLOW Laboratories--(Laboratórios Ambulatórios), Austrália) e foram recolhidos por centrifugação. Os eritrocitos restantes provocaram lise nas células pela adição de água de.8 tilada ao precipitado, e eentrifugados durante 30 min. a 3000 rpm. Ao precipitado resultante foram adicionados lOml de 2.M NaClO^ e a elastase foi extraída. Após a extraeção

O durante 120 min. a 0 C, o sobrenadante contendo uma acção de elastase foi obtido por centrifugação. Após a adição de um volume igual de clorofórmio a este sobrenadante e de o agitar com vigor, um sobrenadante purificado contendo uma acção de elastase foi separado. 10 mililitrosdo compensador Hepes foram adicionados ao sobrenadante e fornecidos para a análise de enzima. 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 30 (2) Método; Um compensador utilizado em toda a análise foi ο 0.1M HEPES (N-(2-hidroxietilo)piperazina-N,-2--ácido etanossulfónico) contendo 0.5M NaCl, pH 7»5· Vinte e cinco microlitros de 2 mM metoxisuccinilo^Ala)^--Pro-Val-p-nitroanilido (lOO mM de solução de dimetilsul-fóxido foram diluídos no tampão) e 5° /*1 da amostra (lO ul da amostra no dissolvente orgânico foi diluído ao quíntuplo no tampão) foram misturados em reservatórios de um prato de reservatório-microtítulo 96. Uma absorvência da mistura num comprimento de ondas a 415 nm foi reduzida por um leitor microprato (Corona Electric Co., Ibaraki, Japão). Após a medição, 25/*1 de 6 ^ig/ml de elastase de expectoração humana (HSE) ou 25 ^μΐ de preparação de elastase dos leucócitos humanos foi adicionado e mantido durante 30 min. â temperatura ambiente. Então, a absorvência a 415 nm foi medida. A percentagem de inibição por medica mento foi determinada pela fórmula 100 x (ΐ-'Ή” inibidor presente/nr" inibidor ausente), em que "r" significa absor vencia após 30 min. de absorvência de incubação negativa antes da adição de enzima. Efeitos de inibidores (i.e. = 36 = 35 10 15

Moei. 71 -10000 βχ. 89/07 20 25 30 61.986 bcp/pe-1731*

catalisadores negativos que retardam a reacção quimica) con tra outras proteases foram testados de uma forma similar u-tilizando N-succinilo-(Ala)^-p-nitroanilido para a elasta-se do pâncreas suíno (Tipo IV, 5/ug/ml final), N-alfa-ben-zoilo-Arg-p-nitroanilido para a Tripsina do pancreas bovino (Tipo X, 16 /ig/ml final), metoxisuccinilo-(Ala)g-Pro-Met--p-nitroanilido por quimotripsina do pancreas bovino (Tipo XI, 1,5 ug/ml final) e por catepsina de esputo humano G (10 unidades/ml final). HSE e catepsina e foram obtidas da Elastin Products Company Inc., MO, U.S.A.. Todos os outros substratos e proteases foram adquiridos da Sigma Chemicals Co,. (3) Resultados: (l) Efeito enibitório das substâncias WS7622A, B, C e D sobre várias actividades da protease de serina. = 37 = 35 61.986BCP/PE-I734

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 0 (ti 8 •H m (0 H 00 a φ -P « o 0] 0 V <0 0 Φ -P H OM » •ri co CO CM (ti o 0 O O -P 0 a •k *k (0 0 φ O O cti 3 s 1—1 φ 3 8 H fit φ 8 (ti H 1 •ri 8 co CO H 00 0 (0 •ri 0 H CM co ε a > •k •k •k •k •ri •ri 0 0 O O 0 3 >8 σ +3 (ti X—N a (C •ri 8 0 O »Λ m «0 •ri m m a > CM CM •ri 0 8 ,8 fr* Φ (0 (0 (ti m (ti Φ 0 •P 8 0 co H£> (0 0 <h H CO CM (C 8 0 0 O H (ti •s •k •k 8 a 0 O 0 Φ 13 Φ « tti 0 0 H •P -P a b- 00 <n 3 λ O co CM iO (ti a ε O 0 rH H (0 3 «k «k •s •k 8 0 λ O 0 0 0 (6 •ri /--V c Η <! m 0 P 8 s CM CM CM CM <cti CM CM CM CM -P W3 MO MO MO MO n 3 b- b- í> b> X 3 CO «3 CO CO 3 Ϊ* Sc !* > co = 38 = 1 61.986 BCP/PE-1731* 14MAR.499a Ϊ7 (2)

Efeito inibitório dos derivados da substância 'WS7622A na elastase de leucócitos humanos 10

Sig/ml G composto do Exemplo 2 0,0103 0 composto do Exemplo 3 0,0103

Mod. 71 -10000 βχ. - 89/07

Cada valor foi expressado como uma concentração inibitória de 50

As composições farmacêuticas desta invenção podem ser utilizadas nas formas farmacêuticas convencionais tais como pós, grânulos finos, grânulos, comprimidos, drageias, microcápsulas, cápsulas, supositórios, solução, em suspensão, emulsão, xaropes e os semelhantes. Se desejado, diluentes ou desagregadores (e. g. sacarose, lactose, amido, celulose cristalina, celulose de baixo teor substituto de hidroxipropilo, silicato de alumínio sintético, etc.), agentes de ligação (e. g. celulose, metilcelulose, hidroxipropilcelulose, hidroxi-propilmetilcelulose, polipropilpirrolidino, polivinil-pirrolidona, gelatina, goma arábica, polietilenoglicol, etc,), agentes corantes, agentes doces, lubrificantes (e. g. estearato de magnésio, etc.) ou os semelhantes, p£ dem ser administrados com a composição mencionada. A dose da composição mencionada desta = 39 = 35 15

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 25 14.MAR:199QWn a /—59 61.986 BCP/PE-173^ invenção depende da idade do paciente, do peso do seu corpo, da sua condição física, etc., e é administrada em geral pela via oral à dosagem diária de 100 mg a 10 g conforme se ê o composto desejado ou se é o respectivo sal farmaceutica-mente aceitável, de preferência 1 g a 5 g na mesma base, com um intervalo de 1 a 3 vezes ao dia. As unidades típicas das doses podem ser de 50 mg, 100 mg, 200 mg, 500 mg, 1 g e as semelhantes, apesar de estas serem apenas exemplos e concer-teza não limitativos. 0s Exemplos seguintes são dados para i-listrar esta invenção.

Exemplo 1 (Produção da substância WS7622A)

Um meio aquoso de sementeira (200 ml) contendo 1 $ de amido solúvel, 1$ de sacarose, 1 $ de glucose, 1 $ de 1 fármaco (nume comercial, farinha de semente de algodão), 0,5 $ de polipeptona, 0,5 $ de farinha de soja e 0,1 ^ de CaC0«, foi vertido em cada um de doze frascos

O

Elrenmyer de 500-ml, e esterilizado a 120 C durante 30 minutos. Um tubo em espiral de Strpromyces resistomyciflcus No. 7622 na cultura amadurecida em declive foi inoculado para cada meio de sementeira. Os frascos foram agitados nurr agitador rotativo a 30°C durante 3 dias. A cultura de sementes resultante foi inoculada para 1601 de um meio de fermentação, estéril constituído de h % Pine-Dex (nome comercial de amido ácido hidrolizado), 1 $ de farinha de glúten, 0,5 $ de germen de trigo, 0,5 $ de proteína de batata e 0,2 $ de CaCO^ num jarro-fermentador de aço inoxidável 2001. A fermentação foi realizada a 25°C durante 5 dias sob ventilação de l6oi/min e agitação de 200 rpm.

Uma quantidade de substância WS7622A no caldo de fermentação foi quantificada por uma análise in vitro de inibição de elastase. A amostra para a análise ho - 35 61.986 BCP/PE-I734

foi preparada da seguinte maneira; 5 10 15

Um volume igual de acetona foi adicionado para um caldo com agitação forte. A mistura foi deixada ficar a temperatura ambiente durante 1 hora e então filtrada. 0 filtrado foi concentrado sob uma pressão reduzida para um volume apropriado. A análise de inibição da elastase foi descrita an-teriormente.

Mod. 71-10000 ex. 89/07 20 25 30 0 caldo cultivado (l60Jt) foi filtrado com a ajuda de terra diatomácea. 50 litros de acetona foram adicionados a torta de micélio com agitação. A mistura foi deixada ficar a temperatura ambiente durante a noite, e então filtrada. 0 filtrado foi concentrado para remover a acetona sob pressão reduzida. 0 filtrado (l40Jfc) do caldo obtido acima e o extracto de micélio foram combinados, e en tão passados através de uma coluna de adsorvente polimérico Diaion HP-20 (nome comercial, produzido pela Mitsubishi Chemical Industrial Limited, 171 * Companhia Química Industrial Limitada Mitsubishi, 17l). A coluna (massa fluída) foi lavada com 50 A de água e 50 $ de solução aquosa de metanol (50 1) e o adsorbato foi purificado com kO & de metanol. A substância purificada foi concentrada sob pressão r£ duzida para dar um resíduo oleaginoso. 0 resíduo foi aplicado à cromatografia da coluna em sílica gel (Kiesel gel 60, 70 a 230 de engrenagem, Merck, l,3l). A coluna foi lavada com 2 1 de acetato de etilo-hexano-n (l:l, v/v) e k 1 de acetato de etilo e a substância activa foi purificada da coluna com acetona (3 i>) e acetona-metanol (10:1,6 -¾). As fracções activas (62,) foram combinadas e concentradas para secura, e foram submetidas à cromatografia de coluna em sílica gel com uma separação escalonada utilizando dissolventes da mistura clorofórmio-metanol. A substância activa foi purificada numa solução de clorofórmio-metanol (lOjl, V/V). As fracçães foram concentradas e secas sob pressão r<e duzida para produzirem 3 g de pó amarelo. A substância = kl = 35 10 15

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 25 30 61.986 BCP/PE-173^

l/J tr » ¥S7622A foi separada pela cromatografia líquida de alta realização (HPLC). Uma coluna de ácido inoxidável JMC-D-ODS--15B de 30 x 250 mm (Laboratórios Químicos Yamamura, Japão) condensada com sílica de fase inversa s-15 foi utilizada. Cinquanta miligramas do pó amarelo foram dissolvidos em 50 de metanol e aplicadas à HPLC com 6θ $ de solução a-quosa de metanol como fase móvel e taxa de circulação de 20 ml/min. O tempo de retenção da substância WS7Ó22A foi de 17»6 min. 0 cromatograma foi executado 6θ vezes e as frac-çães contendo a substância WS7622A foram combinadas e concentradas de uma forma seca. 0 resíduo foi dissolvido com pequenas quantidades de metanol e deixado ficar durante a noite para produzir 600 mg de substância ¥S7622A como prisma incolor. Exemplo 2 (Produção da substância ¥S7622A dimetilada) (r\ R^ : me tilo) : Para uma solução da substância WS7622A (l g) numa mistura de clorofórmio (20 ml) foi adicionado trimetilsilildiazometano (4 ml, 10 $ em peso em hexano, adquiridos da Petrarch Systems Co., Ltd.) e a solução foi deixada ficar à temperatura ambiente durante a noite. A solução foi evaporada por secura para dar um óleo o qual foi purificado, pela cromatografia de coluna em sílica gel purificadora, com uma mistura de clorofórmio e metanol (95*5)* As fracçSes do produto foram colhidas e evaporadas por secura. 0 resíduo branco obtido foi triturado com éter dierí-lico para produzir 0,62 g da substância WS7622A dimetilada como pó branco.

Aspecto Fórmula molecular FAB-MS m/z : po branco * C49H67N9°13* : 990 (M + H)+ = 42 = 35 1 1

61.986 BCP/PE-1734

Cromatografia de camada fina (TLC)

Prato de sílica gel (Merck Art 5715) clorofórmio -metanol Rf 5 10

Rotação específica (5:1, V/V) 0,72 clorofórmio-metanol Rf (9:1, v/v) 0,40 /V723 + 37° (C=l,6, CHCl^-MeOH D ~ J(1:1)

Espectro de absorção infravermelha:

Nujol 15 0 3400, v max * 3250, 1730, Ι66Ο, 1640 15^0, 1520, 1330, 126o, 1210 1180, ll60, 1100, 1080, 1000 980, 920 cm"1

Moei. 71 -10000 ex. - 89/07

Espectro de ressonância magnética nuclear H :

(4oomhz, cd3od) J 7,20 - 7,11 (3H, m) 6,93 (1H, s) 6,83 (1H, q, J =7Hz) 6,77 (2H, d, J =8Hz) 6,59 (1H, s) 5,48 (1H, m) 5,15 (1H, m) 4,85 (1H, s) 4,76 (1H, m) 4,67 (1H, m) = 43 = 10 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20 25 61.986 BCP/PE-173^

Wm,

RJ 7;-/ / /· c 4,42 (1H, m) 3,99 - 3,89 (2H, m) 3,82 (3H, s) 3,81 (3H, s) 3,66 (1H, m) 3,55 (1H, m) 3,02 (1H, m) 2,95 (3H, s) 2,90 (1H, m) 2,60 - 1,9¾ (6H, m) 1,82 (1H, m) 1,77 (3H, d, J =7Hz) 1,68 - 1,58 (4h, m) 1,46 (3H, d, J =7Hz) 1,13 (3H, d, J =6Hz) 1,12 (3H, d, J =6Hz) 1,01 (3H, d, J -6Hz) 0,96 (3H, d, J =6Hz) 1,00 (1H, m)

Exemplo 3 (Produção da substância ¥S7622A acetilada) (r\ R2 ! acetilo) 30

Para uma solução da substância WS7622A (l g) em piridina (5 ml) foi adicionado anidrido acético (0,24 ml) e a mistura foi deixada ficar a temperatura ambiente durante a noite. A mistura foi evaporada por secura para produzir um óleo, o qual foi purificado, pela cromatografia de coluna em silica gel purificadora, com = 44 = 35 5 10 61986 bcp/pe-1734

W»Q

^JL

uma mistura de clorofórmio e metanol (95*5)· A cristalização de éter metanol-isopropilo "quente" produzio 0,73 g da substância WS7Ó22A diacetilada como um pó branco.

Aspecto Fórmula molecular FAB-MS m/z prisma incolor C15H67N9°15 1046 (M + H)+

Cromatografia de camada fina : Prato de sílica gel

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 (Merck Art 5715 clorofórmio-metanol Rf (5*1, V/V) 0,73 clorofórmio-metanol Rf (9:1, V/V) 0,40

Rotação específica : 1°ζ7^ +29° (C=1,0, CHCl^-MeOH(1:1)

Espectro de absorção infravermelhas Nujol V 3400, max 1770, 1730, l660, l64o, 1540 1420, 1340, 126o, 1210, 1080, 1010 25 980, 920 em”"*' Espectro de ressonância magnética nuclear H : 30 (400MHz, DMSO-dg) £ 9,48 (1H, sinal amplo) 8,37 (1H, d, J =8Hz) 7,76 (1H, d, J =7Hz) 7,23 - 7,10 (4H, m) 7,18 (1H, s)

35

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 61.986 BCP/PE-1734 β Mf. 1990/ 1 7,03 (1H, d, J =9Hz) 6,93 (1H, s) 6,76 (2H, d, J =8Hz) 5 6,74 (1H, s amplo) 6,65 (1H, q, J =7Hz) 5,74 (1H, m) 5,b2 (1H, m) 10 5,08 (1H, m) 4,77 (1H, d, J =10Hz) 4,64 (1H, m) 15 4,57 (1H, m) 4,42 (1H, m) 3,92 - 3,78 (2H, m) 3,49 (1H, m) 20 3,34 (1H, m) 2,90 (1H, dd, J=3 e 12Hz) 0 00 CM (3H, s) 2,70 (1H, m) 25 2,6o (1H, dd, J=13 e 11Hz) 2,54 (1H, septet, J=6Hz) 2,42 - 2,27 (2H, m) 2,27 (3H, s) 30 2,25 (3H, s) 2,17 (1H, m) 1,88 (1H, m) 1,70 (1H, m) 35 1,66 (3H, d, J=7Hz) = 46 = 6l.986 bcp/pe-173^ 14M199(BÍ Γη % 1 h 5 10

Exemplo 4 1,60 - 1,46 (4H, m) 1,34 (3H, d, J =6Hz) 0,99 (6H, d, J =6Hz) 0,91 (3H, d, J =6Hz) 0,88 (3H d, J *6Hz) 0,90 (1H, m) (Produção da substância WS7622B) 15

Mod. 71 -10000 ex. - 89/07 20

Um meio aquoso de sementeira (200 ml) contendo 1 de amido solúvel, 1 $ de sacarose, 1 $ de glucose, l ήο de fármaco (farinha de semente de algodão, nome comercial), 0,5 $ de polipeptona, 0,5 $ de farinha de soja e 0,1 de CaCo^, foi vendido em cada um dos doze frascos Elrenmyer de 500 ml, e esterilizados a 120°C durante 30 min. Um"tubo de espiral" de Streptomyces (resistomycificus)

No. 7622 da cultura amadurecida em oblíquo foi inoculado para cada um dos meios de sementeira. Os frascos foram agitados num agitador rotativo a 30°C durante 3 dias. A cultura de sementes resultante foi enoculada para ΐ6θ 1 do meio de fer mentação estéril constituído por 4 $ Pine-Dex (nome comer-ciale de hidrólise de amido ácido), 1 $ de farinha de glúten, 0,5 $ de germen de trigo, 0,5 $ de proteína de batata, e 0,2 $ de CaCO^ num jarro fermen ador de aço inoxidável 200 1. A fermentação foi levada a cabo a 25°C durante 5 dias sob ventilação de l60 l/min. e uma agitação de 200 rpm.

Uma quantidade de substância WS7622B no caldo de fermentação foi quantificada pela análise in vitro de inibição da elastase. A amostra para a análise foi preparada da forma seguinte, um volume igual de acetona foi adicionado ao caldo com agitação vigorosa. A mistura foi deixada ficar à temperatura ambiente durante 1 hora e então foi filtrada. 0 filtrado foi concentrado sob pressão reduzida para um volume apropriado. A análise de inibição de elastase foi = 47 = 10 15

Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 25 61.986 BCP/PE-173^

''' / ύ descrita anteriormente, 0 caldo cultivado (l60 l) foi filtrado com a ajuda de terra diatomácea. 50 litros de acetona foram a-dicionados à tornta de mizélio agitadamente. A mistura foi deixada ficar a temperatura ambiente durante a noite, e então foi filtrada. 0 filtrado foi concentrado para remover a acetona sob pressão reduzida. 0 filtrado (lkO l) do caldo obtido acima e o extracto de micélio foram combinados,e então passado por uma coluna de adsorvente polimérico, Diaion HP-20 (nome comercial produzido por Mitsubishi Chemical Industries, Limited, 17l). A coluna foi lavada com 50 1 de água e 50 $ de solução aquosa de metanol (50 l), e o adsor-bato foi purificado com 4θ 1 de metanol. 0 eluato foi concentrado sob pressão reduzida para produzir um resíduo oleaginoso. 0 resíduo foi a-plicado a uma cromatografia de coluna em sílica gel (Kiesel gel 60, mede 70 a 230, Merck, l,3l). A colu a foi lavada com 2 1 de acetato de etilo-hexano-n (l:l, V/V) e k 1 de a-cetato de etilo e a substância activa foi purificada da (coluna com acetona (3 l) e metanol-acetona (l0sl,6 l). As fracçães activas (6 l) foram combinadas e concentradas para secura, e foi submetida a uma cromatografia de coluna em sílica gel com uma purificação escalonada utilizando dissolventes de mistura de clorofórmio-metanol. A substância activa foi purificada com clorofórmio-metanol (lO:l). As frac-çSes foram concentradas e secas sob pressão reduzida '~para produzirem 3 g de pó amarelo. A substância WS7622B foi separada pela cromatografia líquida de alta realização (HPLC). Uma coluna de ácido inoxidávek YMC-D-0D0S-15B de 30 x 250mn (Yamamura Chemical Laboratories, Japão) condensada com 5-15 de sílica de fase inversa foi utilizada. 50 miligramas do pó amarelo foram dissolvidas em 50 /il de metanol e aplicados ao HPLC com 60 $ da solução aquosa de metanol com uma fase móvel e uma velocidade de circulação de 20 ml/min. 0 - k8 = 30 61.986 BCP/PE-1734

15

Mod. 71-10000 βχ. - 89/07 20 30 tempo de retenção da substância WS7622B foi de 23»0 min. 0 cromatograma foi adicionada 60 vezes, e as fracçães contendo a substância WS7622B foram combinadas e concentradas, e en tão cristalizados com metanol para produzirem l80 mg da subs tância WS7Ó22B como agulhas incolores.

Exemplo 5 (Produção das substâncias WS7622C e D) A fermentação foi realizada da mesma maneira que no Exemplo 1.

Para o caldo cultivado (70 l) assim 'obtido, foram adicionados por agitação 70 litros de metanol. A mistura foi deixada ficar a temperatura ambiente durante 1 hora e então foi filtrada. l4o litros de água foram adicionados ao filtrado e 280 1 de 25 $ da solução aquosa de metanol foi elaborada, A solução foi passada por uma coluna de adsorveu te polimárico, Diaion HP-20 (nome comercial (produzido) fabricado por Mitsubishi Chemical Industries Limited, 5l)· A coluna foi lavada com 10 ml de 50 $ de solução aquosa de metanol e purificada com 10 1 de metanol. 0 purificado foi concentrado sob pressão reduzida para produzir um resíduo oleaginoso. 0 resíduo foi aplicado a uma cromatografia de coluna de sílica gel (Kiesel gel 60, mede 70 a 230, Merck, 2,21). A coluna foi lavada com 10 1 de acetona e as substâncias activas foram separadas da coluna com acetona-metanol (5:l). A colheita parcial do purificado foi da seguinte for ma; fracção No. 1:11, fracção No. 2:5,41, fracção No. 3: :3,8l» fracção No. 4:3,21. As su stâncias WS7622C e D foram purificadas na fracção No. 3 e No. 4, respectivamente.

Isolamento da substância WS7622C A fracção No. 3 foi concentrada e seca sob pressão reduzida para produzir 1,2 g de um pó amarelo. Uma grama do pó contendo a substância WS7622C foi de novo dissolvido em 6 ml de clorofórmio-metanol (l0:l) e submetido = 49 = 35 15

Mod. 71-10000 ex. -89/07 20 30 61.986 BCP/PE-173** a 100 ml de massa fluida em sílica gel, pré-condensado com cloroformio-metanol (lOil). A coluna foi lavada com 300 ml de clorofórmio-metanol (lOíl) e a substância WS7622C foi purificada com clorofórmio-metanol (5:l); Os primeiros 180 ml ^ do purificado foram postos de parte e os subsequentes 80 ml foram reunidos, concentrados e secos sob pressão reduzida para produzirem 372 mg de pó. 0 pó foi de novo dissolvido em 6 ml de etanol e deixado ficar a 4°C durante uma hora o qual produziu 170 mg da substância WS7622C como agulhas incolores. 10

Isolamento da substância WS7622D A fracção No. b foi concentrada por secura a qual produziu 3»3 g de um pó amarelo. Um grama do pó contendo a substância WS7622D foi dissolvida em 6 ml de cloro-fórmio-metanol (20:l) e submetida em 100 ml de coluna de sílica gel, pré-condensada com clorofórmio. A coluna foi lavada com 300 ml de clorofórmio-metanol (20:l) e 300 ml de clorofórmio-metanol (l0:l) e a substância WS7622D foi purif^L cada com clorofórmio-metanol (5:l). Os primeiros 200 ml do purificado foram postos à parte e os subsequentes 90 ml foram reunidos e concentrados para secura que produziu 127 mg de pó. 0 pó foi dissolvido numa quantidade pequena de etanol e deixado ficar a 4°C durante a noite o qual produziu 90 mg da substância WS7622D como agulhas, incolores. 0 deposito dos correspondentes pedidos para o invento acima descrito foram efectuados na Grã-Bretanha em lb de Março de 1989? em 11 de Setembro de 19895 em 18 de Setembro de 1989 e em 2 de Outubro de 1989 sob os n*s. 8905817.6; 8920^85.3; 8921078.5 e 892216U.2 respectiva- mente. 50 = 35

Claims (1)

161.986 BCP/PE-1734

-REIVINDICAÇÕES- 1& - Processo para a preparação de WS7622A, B, C e/ou D ou dos seus sais farmaceuticamente aceitáveis, caracterizado por compreender a cultura de uma estirpe produtora dessas substancias pertencentes a classe das estrep-tomicinas num meio nutriente e por se isolar as substâncias WS7622A, B, C e/ou D ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis do caldo cultivado. 2§ - Processo de acordo com a reivindiúação 1, caracterizado por a estirpe referida ser strptomyces re-sistomycificus No. 7622. (FERMBP-2306). 15 Mod. 71-10000 ex. - 89/07 20 3- - Processo para a preparação dos derivados de WS7622A de fórmula geral

0R 1 OR2 25 em que R e R são um grupo alquilo inferior ou um grupo de alcanoilo inferior e dos seus sais farmaceuticamente a-ceitáveis, caracterizado por se fazer reagir WS7622A ou o seu sal com um agente de alquilação, ou por se fazer reagir WS7622A ou o seu sal com um composto de fórmula geral: R - 0H em que R é um alcanoilo inferior ou os derivados reactivos. _ Processo para a preparação do derivado de di-alquilo inferior de WS7622A ou do seu sal a:eitável farmaceuticamente, caracterizado por se fazer reagir WS7622A ou o seu sal com um agente de alquilação. = 51 = 30 61.986 BCP/PE-I734 5- - Processo para a preparação do derivado de di-alcanoilo inferior de WS7622A ou do seu sal farmaceu tieamente aceitável caracterizado por se fazer reagir WS7622A ou o seu sal com um composto de fórmula; R - 0H, em que R é um alcanoilo inferior ou derivados reactivos res pectivos. 10 ga _ Processo de acordo com a reivindicação kf caracterizado por se preparar um derivado de dimetilo de WS7622A. 7- · Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por se preparar um derivado de di-acetilo de WS7622A. 15 8® - Processo para a preparação de uma com Mod. 71 -10000 ex. · 89/07 posição farmacêutica caracterizado por se incorporar como componente activo, as substâncias WS7622A, B, C e/ou D, ou derivado de di-alquilo ou de di-alcanoilo inferior de WS7622A, ou sais respectivos farmaceuticamente aceitáveis 2o quando preparados de acordo com as reivindicações anteriores. Lisboa, 14. (KR, 1990 Por FUJISAWA PHARMACEUTICAL' CO., LTD. 0 AGENTE OFICIAL

= 52 = 35