PT92677A - Processo de producao de uma proteina de circumesporozoito de plasmodium em celulas de inseto e de vacinas contendo a referida proteina - Google Patents

Description

-2- > 70 394 SKR Case 12092-1

MEMORIA DESCRITIVA

Campo da invenção 0 presente invento refere-se ã expressão da proteína de Circumesporozoito de Plasmodium em células de insecto. Mais esp£ cificamente, o presente invento refere-se à produção destas proteínas em células de Drosophila e Lepidoptera.

Antecedentes da invenção A malária humana é provocada por um parasita do género Plasmodium. Existem quatro espécies que se conhece que infectam o homem: P. falciparum, P. vivax, P. malariae e P. ovale.As formas mais graves de malária humana são provocadas pelo P. falciparum e P. vivax; o P. falciparum é o mais prevalente. 0 parasita da malária é transmitido por mosquitos ao hjo mem, na forma de um esporozoito que migra para o fígado, multiplica-se nas hepatócitos e emerge para iniciar um crescimento cí clico em eritocitos. 0 parasita no estado de merozoito, que é li bertado no final de cada ciclo, reinvade rapidamente os glóbulos vermelhos. Os estados de merozoito e de esperozoito são antigeni^ camente distintos, e geralmente os anticorpos contra uma das fo_r mas não reagem de um modo cruzado com a outra.

Verificou-se que os mamíferos, incluindo o homem, podem ser protegidos contra o desafio por Plasmodium quando vacinados com esporozoítos irradiados (Clyde et al., Am 3 Trop Med Hyg, 24:397 (1973), Nussenzweig et al., Phil Tran R Soc Lond B, 307:117-28 (1984)). Este método, embora eficaz, é limitado, dev_i do à dificuldade em cultivar os esporozoítos.

Os esporozoítos exprimem uma proteína de superfície especifica da espécie, a proteína de circumesporozoito (CS), que foi primeiro identificada no P. berqhei,um parasita de roedores. Os anticorpos monoclonais em relação a esta proteína protegeram completamente os ratinhos do desafio com mosquitos infectados (Potocnjak et al., J Exp Med, 131:1304-13 (1980)).

Dame et al., (Science, 225:593-9 (1984), patente dos E. -3- '*· 70 394 SKR Case 12092-1 U.A. nS 4 707 357) descrevem a clonação da proteína CS de P. falei parum em E. coli. Este gene codifica uma proteína de 412 aminoáci-dos, que contem 41 repetições de tetrapéptido (37 unidades de te-trapéptido invariantes e 4 variantes). Os anticorpos monoclonais contra a proteína CS foram inibidos na sua ligação à proteína na presença de péptidos sintéticos derivados da região de repetição. Enea et al., (Science, 225:628-9 (1984)) caracterizou ainda um ep^L topo imunodominante da região de repetição que consistia de: (Pro-Asn-Ala-Asn) n

Adicionalmente, Arnot et al., (Science, 230:815-18 (1985)) descrevem a clonação e a sequência da proteína CS de P. vivax. Verificou-se que a estrutura geral deste proteína CS é similar, na sua estrutura global, às proteínas CS de P. falciparum e de P. Know-lesi (uma espécie de malária de símio). Isto é, consistem de uma sequência de sinal amino-terminal, de um domínio de fixação carboxi^ -terminal e de um grande domínio de repetição central, flanqueado de ambos os lados por sequências conservadas designadas por regiões I e II. 0 domínio de repetição é a região imunodominante da proteína CS. Verificou-se que as regiões conservadas (I e II) estão altamente carregadas.

As vacinas de subunidade contra o esporozoito de P. falciparum têm sido dirigidas contra a região de repetição da proteína CS. Young et al., (Science, 228:958-62 (1985)) descreve a clonação e a expressão de unidades de repetição de CS, em tandem, em E. co-1i. Quando introduzidas em ratinhos, estas moléculas foram altamente imunogénicas. Os anticorpos criados contra as unidades de rja petição em ratinhos reconhecem a proteína CS em esporozoitos vivos e bloquearam a invasão de esporozoitos das células de hepatoma hu-mano in vitro.

Adicionalmente, Young et al. descrevem a expressão muito pequena da proteína CS de P. falciparum madura (i.e., menos a sequência de sinal) em E. coli.

Dame et al. , (Science, 225:593-9 (1984)) descreve a exprejs são em níveis baixos da proteína CS de P. falciparum, a todo o com- -4- 70 394 SKR Case 12092-1 primento, em E. coli. Ambas as referências (i.e., Young et al. e Dame et al.) não descrevem um processo para a produção da proteína CS de P. falciparum em quantidades úteis.

Dame et al. (Patente dos E.U.A. n9 4 707 357), Bailou et al♦ (Science, 228:996-9 (1985), Zavala et al. (Science, 228;1436-40 (1985)), Mazier et al. (Science, 231:156-9 (1986), e Nussenzweig et al. (PCT/W086/05790) descrevem a utilização de péptidos sintéticos como vacinas de subunidadecom base epitopos identificadas na regi^ ão de repetição. Mais recentemente, Vergara et al. (PCT/W086/01721 ) e Bernardi et al. (Pedidos de Patente do Reino Unido n9 2 193 215 e 2 199 038) descrevem péptidos antigénicos compreendendo as Regiões I e/ou II fundidas com as repetições de tetrapeptido da proteína CS. 0 desenvolvimento destas vacinas, de subunidade correspondentes a polipéptidos, sintéticos ou recombinantes, da região de rj3 petição, tem sido dificultado devido à sua imunidade protectora limitada. Ainda que as vacinas de subunidade das repetições de protegi na CS de P. falciparúm tenham imunizado com sucesso ratinhos contra a malária, as vacinas até agora testadas em humanos têm sido insufi_ cientemente imunoprotectoras para o seu uso generalizado (Bailou et al., Lancet, I_: 1277-81 (1987)).

Egan et al. (Science, 236:453 (1987)) descrevem que no modelo murino da malária (P. berqhei) a imunidade protectora induzida por vacinas de subunidade e por esporozoitos parece ser fundamenta_l mente diferente. As vacinas de subunidade induziram uma protecção predominantemente mediada por anticorpos enquanto que os esporozoitos irradiados induziram uma imunidade prolonganda mediada por cél]j 1 as.

Sadoff et al. (Science, 240:336-8 (1988)) descrevem a expressão de uma proteína compreendendo uma proteína CS de P. berqhei, a todo o comprimento, numa estirpe não virulenta de Salmonella ty-phimurium. Esta proteína CS é expressa na superfície da célula da S. typhimurium e induziu uma imunidade mediada por células,específica do antigénio. Sadoff et al. sugerem que a proteína CS contem um (uns) epitopo (s) de células T que é (são) capaz(es) de induzir -5- 70 394 SKR Case 12092-1 imunidade protectora mediada por células.

Good et al., Proc Natl Acad Sei USA, 8J5:1199-1203 (1988) descrevem domínios de células T para a proteína CS de P. falcipa-rum. Estes sítios foram identificados sintetizando péptidos sintj| ticos sobrepostos, englobando toda a proteína CS. Em todos estes péptidos localizaram-se três sítios; todos 3' em relação à região de repetição CS.

Sinigaglia et al♦, Nature, 336:778-780 (1988), referem que alguns péptidos sintéticos correspondentes a uma região da pr£ teína de P. falciparum, 3' em relação à região de repetição, podem ser reconhecidos por moléculas da classe II de células T de MHC diferentes. A produção de uma vacina eficaz, depende contudo, da capacidade de produzir grandes quantidades de antigénio. Barr et al. (J Exp Med, 165:1160 (1987)) descrevem a expressão de uma proteína CS recombinante de P. vivax em levedura. Esta contem todo o domínio de repetição,mais 15 aminoácidos precedendo as repetições,e 48 aminoácidos após as repetições, do lado do terminal carboxilo.

Valenzuela et al . , (patente dos E.U.A. n 2 4 722 840) e Rutgers et al ♦ (Bio/Technoloqy, _6:1065-70 (1988)) descrevem repetições de CS de P. falciparum com vários comprimentos, fundidas com o antigénio de superfície da hepatite B. Estas fusões são expressas na forma de partículas virais no Saccharomyces cerevisiae.

De Wilde et al,, PCT/W088/05817, descrevem a expressão da proteína CS de P. falciparum madura (i.e., menos a sequência de sjl nal) em S. cervisiae.

Smith et al. (Science, 224:397-9 (1984)) descrevem a expressão da proteína CS de P. knowlesi num vírus recombinante. As células de mamífero infectadas com o vírus recombinante exprimiram um polipéptido CS que foi reconhecido por um anticorpo monoclonal contra a proteína CS de P. knowlesi. 4 745 Q51) e Matsuura et al. (3 Gen Virol, 68:1233-50 (1987))

No sistema de expressão de baculovírus, pode usar-se um promotor forte, temporalmente regulado, para exprimir níveis mui to elevados de genes hetero^logos. Smith el al. (patente dos E.U.A. nS - 6 - 70 394 SKR Case 12092-1 descrevem vectores de baculovírus contendo o promotor de gene poli--hedrina para exprimir genes procarióticos e eucaridticos.

Miller et al. (PCT/W088/02030) descrevem um método para produzir genes heterélogos?utilizando uma mistura de pelo menos dois baculovirus geneticamente distintos.

Cochran et a 1. (Pedido de Patente Europeia n9 228 036) dej3 crevem a expressão do factor de crescimento da vacina (VGF) num baculovirus recombinante. Adicionalmente, Cochran et al, apresenta u-ma lista hipotética de proteínas que podem ser expressas num bacul£ vírus recombinante, incluindo o antigénio de superfície da hepatite B e polipéptidos de Plasmodium.

Para além do sistema de expressão do baculovirus, tem também sido referido que as células de Drosophila exprimem genes bactjj rianos estranhos. H. Johansen et al., 28th Annual Drosophila Confe-rence, p. 41 (1987) é um resumo publicado pelos inventores do presente pedido de patente que de uma forma breve refere que os genes galk de E_^ coli, regulados por um promotor de metalotioneína de Dro sophila, foram expressos em linhas de células de Drosophila.

Numa publicação posterior, Johansen et al., Genes & Dev, 3^: 882-889 (1989 ) descrevem a expressão do ocongene H-ras humano em células hospedeiras de Drosophila. A. Vanderstraten et al,,"Proeeedinqs of the 7th International Conference on Invertebrate and Fish Tissue Culture", Abstract, University of Tokyo Press, Japão, (1987) e A. Vanderstraten et al., em "Invertebrate and Fish Tissue Culture", Eds. Y. Kuroda et al. , Japão Scientific Societies Press, Tokyo, pp. 131-134, (1988) são também publicações dos presentes inventores, que descutem a utili^ zaçâo de um sistema de selecção com higromicina B na expressão de genes estranhos em células de D. melanogaster em cultura. 0 mesmo refere que se usou o sistema para co-introduzir e sobre-exprimir o gene galk de E. coli e outros genes de origem mamífera. B. J. Bond et al., Mol Cell Biol, _6(6):2080 (1986) descreve a estrutura do gene 5C de actina da Drosophila melanogaster. Ejs ta publicação refere os dois sítios de início da transcrição do g_e ne 5C da actina e fusões, entre as sequências de promotor e o gene -7- 70 394 SKR Case 12092-1 da acetiltransferase de cloranfenicol bacteriano, inseridas em células hospedeiras de D. melanoqaster. E pois um objectivo do presente invento exprimir proteínas em células de insecto e usar estes produtos recombinantes como agentes de vacina e de diagnóstico.

Sumário da invenção

Num seu aspecto, o presente invento refere-se ao processo de preparação de uma unidade de expressão do gene do circumesporo-zoito de Plasmodium que inclui uma sequência de codificação de ADN para a proteína desejada e as sequências reguladoras necessárias para a transcrição da sequência de codificação da proteína e subs£ quente tradução numa célula de insecto.

Em aspectos relacionados, o presente invento refere-se ao processo de preparação de um vector de ADN ou de um baculovírus re combinante que compreende a unidade de expressão do gene do prese£ te invento.

Ainda num outro aspecto relacionado, o presente invento descreve uma célula de insecto transfectada com o vector de ADN ou com o baculovírus recombinante do presente invento.

Em aspectos relacionados adicionais, o presente invento refere-se ao processo de preparação de uma proteína de circumespjo rozoito de Plasmodium, ou dum seu derivado, que compreende a sua produção pelas células de insecto transfectadas do presente invein to. 0 derivado abrange qualquer proteína de circumesporozoito de Plasmodium tal como as resultantes de delecções, adições, substituições ou rearranjos dos aminoácidos ou suas modificações químicas, que mantenham a capacidade de serem reconhecidas por anticojr pos criados contra a proteína de circumesporozoito de Plasmodium do tipo selvagem.

Num seu outro aspecto, o presente invento refere-se ao processo de preparação de uma vacina para estimular a protecção contra a infecção da malária, que compreende uma quantidade imun£ -protectora e não tóxica da proteína de circumesporozoito de Plasmodium preparada de acordo com a invenção. -8- 70 394 SKR Case 12092-1 0 presente invento refere-se pois ao processo de preparação de uma proteína de circumesporozoito de P1 a s m o d i u m . Este proces so compreende a cultura de uma célula hospedeira transfectada com a unidade de expressão do presente invento num meio de cultura adequado.

Descrição Detalhada da Invenção 0 presente invento refere-se à expressão de proteínas Plas-modium, e de seus derivados, em culturas de células de insectos. As células de insectos são transfectadas usando técnicas convencionais para introduzir ADN estranho numa célula hospedeira de insecto^ sem afectar adversamente a célula hospedeira. As células hospedeiras rei combinantes assim construídas^ produzem proteínas de PIasmodium que estão completamente isentas de materiais contaminantes. Estas podem ser expressas, intracelularmente, ou ligadas à membrana, ou segregai dast para o meio de cultura das células. Após a secreção, a proteína está disponível para ser purificada por técnicas convencionais. A proteína expressa intracelularmente pode ser extraída das células hospedeiras usando também técnicas convencionais. A sequência de codificação de ADN para a proteína de circumesporozoito de Plasmodium falciparum é descrita por Dame et al. ,

Science, 225:593-1 9 (1984) como sendo a '5' ATG seguinte: ATGAG AAAAT T AGCTATTTT 24 ATCTGTTTCT TCCTTTTTAT TTGTTGAGGC CTTATTCCAG GAATACCAGT 74 GCTATGGAAG TTCGTCAAAC ACAAGGGTTC TAAATGAATT AAATT ATGAT 124 AATGCAGGCA CTAATTTATA TAATGAATTA GAAATGAATT ATT ATGGGAA 174 ACAGGAAAAT TGGTAT AGTC TTAAAAAAAA T AGTAGATCA CTTGGAGAAA 224 ATGATGATGG AAATAATAAT AATGGAGAT A ATGGTCGTGA AGGTAAAGAT 274 GAAGATAAAA GAGATGG AAA T AACGAAGAC AACGAGAAAT T AAGGAAACC 324 AAAACAT AAA AAATT AAAGC AACCAGGGGA TGGTAATCCT GATCCAAATG -9- 70 394 SKR Case 12092-1 374 CAAACCCAAA TGTAGATCCC AATGCCAACC CAAATGTAGA TCCAAATGCA 424 AACCCAAATG T AGATCCAAA TGCAAACCCA AATGCAAACC CAAATGCAAA 474 CCCAAATGCA AACCCAAATG CAAACCCAAA TGCAAACCCA AATGCAAACC 524 CAAATGCAAA CCCAAATGCA AACCCCAATG CAAATCCT AA TGCAAATCCT 574 AATGCAAACC CAAATGCAAA TCCTAATGCA AACCCAAATG CAAACCCAAA 624 CGT AGATCCT AATGCAAATC CAAATGCAAA CCCAAATGCA AACCCAAACG 674 CAAACCCCAA TGCAAATCCT AATGCAAACC CCAATGCAAA TCCTAATGCA 724 AATCCT AATG CCAATCCAAA TGCAAATCCA AATGCAAACC CAAACGCAAA 774 CCCCAATGCA AATCCT AATG CCAATCCAAA TGCAAATCCA AATGCAAACC 824 CAAATGCAAA CCCAAATGCA AACCCCAATG CAAATCCT AA T AAAAACAAT 874 CAAGGT AATG GACAAGGTCA CAATATGCCA AATGACCCAA ACCGAAATGT 924 AGATGAAAAT GCT AATGCCA ACAATGCTGT AAAAAAT AAT AATAACGAAG 974 AACCAAGTGA TAAGCACAT A GAACAAT ATT T AAAGAAAAT AAAAAATTCT 1024 ATTTCAACTG AATGGTCCCC ATGT AGTGTA ACTTGTGGAA ATGGT ATTCA 1074 AGTTAGAATA AAGCCTGGCT CTGCTAATAA ACCTAAAGAC GAATTAGATT 1124 ATGAAAATGA TATTGAAAAA AAAATTTGT A AAATGGAAAA ATGTTCCAGT 1174 GTGTTT AATG TCGTAAATAG TTCAAT AGGA TTAATAATGG T ATT ATCCTT 1124 Onde CTTGTTCCTT o primeiro AATTAG 3' ATG codifica uma metionina N-terminal e ο líl codão , TAG, é um sinal de fim de tradução (i.e., paragem).

As moléculas de ADN compreendendo a sequência de codifi^ cação do presente invento podem ser obtidas a partir do ARNm de P. falciparum usando técnicas conhecidas, p. e., fabricando ADN complementar^ ou ADNc, a partir de um molde de ADNm ou pela reacção de cadeia com polimerase (ver, Mullis et al., Patente dos E.U.A. -10- 70 394 SKR Case 12092-1 4-800 159). Alternativamente, esta sequência de codificação pode ser sintetizada por técnicas convencionais de síntese de ADN. Adicionalmente, existem numerosas células hospedeiras recombinantes contendo a molécula de ADN do circumesporozoito de P. falciparum, que estão vulgarmente disponíveis. 0 presente invento não está limitado k sequêcia especifi-camente descrita, mas inclui todas as sequências de codificação de ADN de proteína CS, tal como a seguir se descrevem. Tal como são _a qui utilizados, os termos "proteína CS","proteína de circumesporozoito" ou "polipéptido CS", incluem a proteína de circumesporozoito de P. falciparum a todo o comprimento, substancialmente como an teriormente se descreveu, e todos os seus derivados. 0 termo "der_i vado", abrange qualquer sequência de codificação de ADN de CS, tal como uma sequência de codificação de CS truncada ou outros derivados que codificam uma proteína que retem a capacidade de induzir uma imuno-resposta em relação à proteína CS do tipo selvagem apds administração interna no homem. Estes outros derivados podem ser preparados pela adição, delecção, substituição, ou rearranjo de por aminoácidos ou/suas modificações químicas. A sequência de codificação de ADN de CS da invenção compreende a proteína CS a todo o comprimento, ou um derivado de proteína CS que retem substancialmente toda a região conservada I (ba ses 319-363) e a região conservada II (bases 1030-1068), e pelo m£ nos uma unidade tetrapéptido Asn-Ala-Asn-Pro, tal como aqui depois se descreve em pormenor.

Como exemplo, a sequência de codificação de ADN de CS usai da no presente invento é substancialmente a mesma (i.e., difere em não mais do que cerca de 10 aminoácidos) do que a sequência de codificação de ADN codificada pela sequência ilustrada anteriormente, ou que carece de toda ou de parte da região de fixação carboxi-tej? minai (aproximadamente, aminoácidos 392-412), ou que carece do pé-ptido de sinal (aproximadamente, aminoácidos 1-18), ou que carece de um péptido de sinal e de uma região de fixação. No Exemplo 1 a-presentam-se exemplos de concretizações preferidas. 0 derivado da invenção pode ser um híbrido, isto é, um po -11- 70 394 SKR Case 12092-1 lipéptido de fusão contendo as sequências de codificação de ADN a-dicionais que podem compreender um ou mais epitopos de outros imu-nogénios de esporozoito, de outras imunogénios de PIasmodium,ou de outros imunogénios sem serem de Plasmodium. Alternativamente, o deri_ vado da invenção pode ser fundido com um polipéptido transportador que tem propriedades imuno-estimul antes, como no caso de um adjuvajn te, ou que de outro modo melhore a imuno-resposta em relação ao polipéptido CS, ou que seja útil na expressão, purificação ou formulji çio do polipéptido CS.

Como exemplo, uma sequência de codificação de ADN desejável para a proteína CS do presente invento pode ser construída fundindo a sequência de codificação de ADN da proteína CS madura com uma sequência de sinal heteróloga, p.e., a sequência do activador de plasminogéneo tissular (tPA). Esta sequência de sinal funciona para dirigir a secreção da proteína da célula hospedeira. A sequência de sinal pode também ser derivada de outras sequências de sinal disponíveis, p.e., das do gene HSV-I gD do vírus Herpes Simplex (Lasky et. al., Science, supra .). A sequência de codificação de ADN de CS pode também ser seguida por uma região de poliadenilação (poli A), tal como uma região de poli A inicial SV40. A região de poli A, que funciona na p£ liadenilação das transcritas de ARN, parece desempenhar um papel na estabilização da transcrição. Uma região de poli A pode ser derivada de uma variedade de genes nos quais está naturalmente presente. Esta região pode também ser modificada para alterar a sua sequência desde que as funções de poliadenilação e de estabilização da transcrição não sejam afectadas adversamente. A sequência de codificação de ADN recombinante do presente invento pode também compreender um marcador de selecção genética. 0 marcador de selecção pode ser qualquer gene ou genes que provoquem uma mudança fenotípica facilmente detectavel numa célula hospedeira transfectada. Esta mudança fenotípica pode ser, por exemplo, a resistência a uma droga, tal como o gene de resistência à higromi-cina B.

Alternativamente, pode usar-se com células de Drosophila -12- 70 394 SKR Case 12092-1 um sistema de selecção usando a droga metotrexato a di-hidrofola to-redutase procariótica (DHFR). A DHFR eucariótica endógena das células é inibida pelo metotrexato. Deste modo, transfectando célu las com um plasmideo contendo a DHFR procariótica, que é insensível ao metotrexato, e depois seleccionando com metotrexato verificar ^se-a que apenas as células transfectadas com e exprimindo a DHFR procariótica sobreviverão.

Além disso, ao contrário do que se verifica com a selecção com metotrexato de células de memífero e de bactéria transfor madas, pode usar-se o metotrexato no sistema de Drosophila para oj) ter inicialmente um número de cópias elevado de transfectantes. A-penas as células que tem incorporado o gene DHFR procariótico pro-tector sobreviverão. Concumitantemente, estas células possuem a u-nidade de expressão de gene desejada.

Incluem-se também na molécula recombinante, as regiões re guiares necessárias ou desejáveis para a transcrição da sequência de codificação da proteína CS e para sua subsequente tradução e ejx pressão na célula hospedeira. A região reguladora contei, tipicamente, uma região promotora que funciona na ligação da ARN polime-rase e no início da transcrição de ARN. A região promotora encon-tra-se tipicamente a montante da sequência de codificação da proteína CS.

Os promotores que se conhecem como sendo úteis em células de Drosophila incluem promotores de células de mamífero bem como promotores de Drosophila, preferindo-se estes últimos. Exemplos de promotores de Drosophila úteis incluem o promotor de metalotioneí-na de Drosophila. (Lastowski-Perry et al.,J. Biol. Chem., 260:1527 (1985)). Este promotor induzível dirige a transcrição com níveis e levados, do gene na presença de metais, p.e., CuSO^. A utilização do promotor de metalotioneína de Drosophila resulta no facto de o sistema de expressão da invenção manter a total regulação mesmo pji ra um número de cópias elevado. Este facto está em contraste dire-cto com o uso do promotor de metalotioneína de mamífero em células de mamífero nas quais o efeito regulador do metal diminui à medida que o número de cópias aumenta. No sistema de expressão de Proso- -13- 70 394 SKR Case 12092-1 phila, este efeito retido de indutividade aumenta a expressão do produto de gene na célula de Drosophila para um número de cópias _e levado. 0 promotor do gene 5C de actina de Drosophila (B.J. Bond et al., Mol. Cell. Biol., 2080 (1986)) é também uma sequência promotora desejável. 0 promotor 5C de actina é um promotor constitutivo e não requer a adição de metal. Deste modo, é melhor adaptado para utilização num sistema de produção em grande escala, tal como um sistema de perfusão, do que o promotor de metalotioneína de Drosophila. Uma vantagem adicional consiste no facto de a ausêji cia de uma concentração elevada de cobre no meio mantém as células num estado mais saudavel por períodos de tempo mais prolongados.

Exemplos de outros promotores de Drosophila conhecidos ijn cluem, p.e., os promotores indutíveis por choque térmico (Hsp 70) e COPIA LTR. 0 promotor inicial SV40 resulta em níveis de expressão mais baixos do que o promotor de metalotioneína de Drosophila. Os promotores que são vulgarmente utilizados nos vectores de expressão de células incluindo, p.e., o LTR do vi rus/^sarcoma de Rous de aves e o vírus de símio (promotor inicial SV40), demonstram uma função e uma expressão pobres no sistema de Drosophila.

Os promotores para uso em células de Lepidoptera incluem promotores de um genoma de baculovírus. 0 promotor para o gene po-li-hedrina é preferido em virtude da proteína poli-hedrina ser naturalmente sobre-expressa em relação a outras proteínas de baculo-virus. 0 gene de poli-hedrina preferido é do baculovírus AcMNPV. Ver, Summers et al♦, patente dos E.U.A. ns 4 745 051 ; Smith et al. , Proc Natl Acad Sei USA, 82:8404 (1985); e Cochran, EP-A-228.036.

As células de insecto que podem ser usadas na invenção ijn cluem células de Drosophila SI, S2, S3, KC-0 e células de D. hydei. Ver, por exemplo, Schneider et al., J Embryol Exp Morph, 27:353 (1972); Scultz et al., Proc Natl Acad Sei USA, 183:9428 (1986); Sinclair et al., Mol Cell Biol, .5:3208 (1985).

Uma linha de células de Drosophila preferida para uso na prática do presente invento é a linha S2· As células S^ (Schneider, J. Embryol. Exp. Morph. 2_7:353 (1972)) são culturas de células es- -14- 70 394 SKR Case 12092-1 táveis de células de Drosophila embrionárias poliploides. 0 uso da cj5 lula de Drosophila S7 tem muitas vantagens que inclui, mas não está a ela limitado, a capacidade de crescerem a uma densidja de elevada à temperatura ambiente. A integração estável do sistema de selecção produziu até 1000 cópias da unidade de expressão de g£ ne transfectado, nos cromossomas da célula.

No presente invento podem também ser úteis outros sistemas de cultura de células de Drosophila. Algumas células possivelmente úteis são, por exemplo, a linha de células de Drosophila Me-lanoqaster KC-0 que é uma linha de células isenta de soro (Schulz et al., Proc. Nat'l Acad, Sei. USA, 83: 9428 (1986)). Estudos preliminares usando a linha KC-0 têm sugerido que a transfecção é ma-is difícil do que com as células" S2· Outra linha de células que p£ de ser útil, é uma linha de células da Drosophila hydei ♦ Pode cori seguir-se a expressão da proteína usando a linha de células hydei; contudo, a transfecção nesta linha de células pode resultar na expressão do ADN transfectado, com uma eficiência muito baixa (Sinclair et al. , Mol. Cell. Biol., 3208 (1985)). Outras linhas de células de Drosophila disponíveis, que podem ser usadas no presente invento, incluem as linhas e S^.

As células de Drosophila seleccionadas para utilização no presente invento podem ser cultivadas numa variedade de meios ni-trientes adequados, incluindo, p.e., meio M^. 0 meio M^ consiste de uma formulação de sais equilibrados e de aminoácidos essenciais a um pH de 6,6. A preparação do meio é substancialmente feita como se descreveu em Lindquist, PIS ("Drosophila Information Services"), 58: 163 (1982). Podem também usar-se outros meios convencionais pjj ra a cultura de células de Drosophila. Células de Lepidoptera úteis incluem células de Trichoplu-sia ni, Spodoptera fruqiperda, Heliothis zea, Autoqraphica califor-nica, Rachiplusia ou, Galleria melonella, Manduca sexta ou outras células que possam ser infectadas com baculovírus. Estes incluem vírus de poli-hedrose (NPV), vírus com nucleocápside simples (SNPV) e vírus com nucleocapsides múltiplos (MNPV). Os baculovírus preferidos são os baculovírus NPV ou MNPV porque contêm o promotor de gene de poli-hedrina que é expresso com níveis elevados em células infecta- -15- 70 394 SKR Case 12092-1 das. Particularmente, exemplifica-se aqui depois, o vírus MNPV da Autoqraphica california (AcMNPV). Contudo, podem também usar-se outros vírus MNPV e NPV tais como o vírus do bicho-da-sede, Bom-byx mori. As células de Lepidoptera são transf ectadas com um bacjj lovirus recombinante da invenção de acordo com técnicas de trans-fecção convencionais. Estas incluem, mas não estão limitadas a., precipitação com fosfato de cálcio, electroporação, e transferência mediada por lipossomas. As células são cultivadas de acordo com técnicas de cultura convencionais numa variedade de meios de nutrientes incluindo, por exemplo, TC100 (Gibco Europe; Gardiner et al. , J Invert Path, J25:363 (1975 )) suplementado com 10% de soro de vitelo fetal (FCS), e a uma temperatura de 27°C a 28°C durante um período de 18 a 24 horas. Obtêm-se excelentes rendimentos de produtos codificados por vírus còm a infecção de culturas crescendo activamente para densidades de 1 a 1,2 x 10 células/ml. Ver, Miller et al., em Setlow and Hollander (eds.), Genetic Enqi-neerinq: Principies and Methods, Vol 8, pág. 277-98, Plenum Pu-blishing Co. New York, 1986.

Numa concretização preferida do presente invento, exprime-se uma proteína CS em células de Lepidoptera para produzir po-lipéptidos imunigénicos. Para a expressão da proteína CS em células Lepidoptera, prefere-se o uso de um sistema de expressão de baculovírus. Neste sistema, coloca-se tipicamente uma "cassette" de expressão compreendendo a sequência de codificação de ADN da proteína CS, ligada operativamente a um promotor baculovivus,num vector de vaivém. Este vector, contém uma quantidade suficiente de ADN bacteriano para propagar o vector de vaivém em E. coli ou em qualquer outro hospedeiro procariótico adequado. Este vector de vaivém contem também uma quantidade suficiente de ADN de bacu_ lovirus flanqueando a sequência de codoficação da proteína CS de forma a permitir a recombinação entre um baculovírus do tipo selvagem e o gene heterólogo. 0 vector recombinante é depois co-transfectado, em células de Lepidoptera, com ADN de um baculdvi-rus do tipo selvagem. Os baculovírus recombinantes resultantes de recombinação homóloga são então seleccionados e purificados em placa por técnicas convencionais. Ver Summers et al., TAES Buli -16- 70 394 SKR Case 12092-1 (Texas Agricultural Experimental Station Bulletin) NR 1535, Maio 1987. A produção em células de insecto pode também ser realizada infectando larvas de insecto. Por exemplo, pode produzir-se uma proteína CS em lagartas Heliothis virescens alimentando o bji culovírus da invenção conjuntamente com vestígios do baculovírus do tipo selvagem e depois extractando a proteína CS da hemolinfa após cerca de dois dias. Ver, por exemplo, Miller et al., PCT/ /W088/02030.

Noutra concretização preferida, exprime-se uma proteína CS em células hospedeiras de Drosophila. Para a expressão em células de Drosophila prefere-se utilizar um sistema de dois ve-ctores. Num tal sistema, uma unidade de expressão do gene da proteína CS encontra-se, tipicamente, num vector de expressão. Ej3 te vector de expressão compreende uma região reguladora que funciona em Drosophila, p.e., um promotor de metalotioneína ou de actina 5C, uma unidade de expressão de gene e uma região de poli_ adenilação, p.e., o local de poli A do SV40. 0 segundo vector^do sistema de dois vectores,compreende uma unidade de expressão do gene marcador de selecção, p.e., hi-gromicina B ou DHFR. 0 vector pCOHYGRO, como adicionalmente se descreve no Exemplo 1, codifica o gene da fosfotransferase da h_i gromicina B que, quando expresso, confere resistência à higromi cina às células hospedeiras transfectadasjque estão a exprimir o referido gene marcador seleccionável. Outro exemplo é o gene da di-hidrofolato-redutase (DHFR) que, quando é expresso, é títil como marcador seleccionável na presença do metotrexato. Estes marcadores seleccionáveis, conjuntamente com a co-transfecção de células de Drosophila é adicionalmente descrito por Johansen et al . , pedido de patente dos E.U.A. n2 de série 07/047 736, deposi_ tado em 8 de Maio de 1987 (equivalente ao pedido de patente Eurjo peia nS 290 261) e é aqui incorporado como referência.

As células‘de Drosophila S£ são especialmente adequadas para a produção de proteína, com níveis elevados, no processo do presente invento. As células podem ser mantidas em culturas em suspensão k temperatura ambiente (24 -IoC). 0 meio de cultura é -17- 70 394 SKR Case 12092-1 o meio suplementado com 5 a 10¾ (v/v) de soro de bovino fetal (FBS) desactivado por calor. Na concretização preferida da invenção o meio de cultura contem 5¾ de FBS. Após a indução,as cj§ lulas são cultivadas em meio isento de soro. Quando se usa o sij3 tema de vector pCOHYGRO, o meio é também suplementado com 300 p.q/ /ml de higromicina B. Neste meio, as células S£ podem ser cultivadas na forma de culturas em suspensão, por exemplo, em balões agitados de 250 ml a 2000 ml, com agitação de 50-60 rpm. As den- 6 7 sidades de células são mantidas tipicamente, entre 10 e 10 células por ml. Numa concretização do presente invento, as células são cultivadas antes da indução em balões agitados de 1500 mlj em meios contendo 5¾ de soro. A transcrição e expressão da sequência de codificação da proteína CS nos sistemas anteriormente referidos podem ser eon-troladas.Por exemplo, pode usar-se a análise de mancha Southern para determinar o número de cópias do gene CS. A análise de mancha Northern fornece informação relativa ao tamanho da sequência genética transcrita (ver, p.e., Maniatis et al. , Molecular Clo-ning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982)). 0 nível de transcrição pode também ser quantificado. A expressão da proteína CS seleccionada nas cjé lulas recombinantes pode ser adicionalmente verificada por análi_ se de mancha Western. A purificação do polipéptido CS a partir da cultura de células é realizada por técnicas convencionais de isolamento de proteínas, p.e., precipitação selectiva, cromatografia de absorção e cromatografia de afinidade, incluindo uma coluna de afinidade de anticorpos monoclonais, tal como se descreve no Exemplo 3.

As proteínas produzidas por células de Drosophila,de a-cordo com o presente invento, estão completamente isentas de materiais contaminantes?de mamíferos, de bactérias e de protozoários e, o que é mais importante, de outros materiais de Plasmo-dium. A vacina do presente invento compreende uma quantidade -18- 70 394 SKR Case 12092-1 imunoprotectora de proteína CS de P. falciparum, preparada de acordo com o método do presente invento. 0 termo"imunoprotector" refere--se à quantidade necessária para induzir uma imuno-resposta contra um desafio subsequente de modo a que a doença seja evitada ou minimizada. Numa concretização preferida, a vacina do presente invento compreende uma solução aquosa da proteína CS derivada de insecto que pode ser usada directamente. Alternativamente, a proteína CS, com ou sem liofilização prévia, pode ser misturada., ou absorvida, com quaisquer dos vários adjuvantes conhecidos. Estes adjuvantes ir[ cluem, mas não estão limitados a, hidróxido de alumínio, dipéptido de muramilo e saponinas tais como o Quil A. Como exemplo alternativo adicional a proteína CS pode ser encapsulada dentro de microper-tículas tais como lipossomas. Ainda numa outra alternativa exemplar, a proteína CS pode estar conjugada com uma macromolécula imunoesti-mulante, tal como, uma Bordetella morta ou um toxóide de tétano. A preparação da vacina está genericamente descrita em New Trends and Developments in Vaccines, Voller et al.,(eds.), Univer-sity Park Press, Baltimore, Maryland, 1978. A encapsulação em lipos somas é descrita por Fullerton, patente dos E.U.A. n2 4 235 877. A conjugação de proteínas com macromoléculas é descrita, por exemplo, por Likhite, patente dos E.U.A. ηδ 4 372 945 e por Armor et al., p£ tente dos E.U.A. n9 4 474 757. 0 uso do Quil A está referido em Dalsgaard et al. , Acta Vet Scand, .18.:349 (1987).

Os exemplos que se seguem são ilustrativos mas não limitativos do presente invento. As enzimas de restrição e os outros reagentes foram usados substancialmente de acordo com as instruções dos vendedores.

Exemplos

Exemplo 1. Construções de vectores A) VECTORES DE BACULOVIRUS: i) Proteína CS de P. falciparum a todo o comprimento 0 plasmídio WR201 é obtido no Walter Reed Army Institute of Research. Contem um fragmento EcoRI, de 2,3 Kilobases, do fago >mPfl, que codifica a proteína de circumesporozoito de P. falcipa- -19- 70 394 SKR Case 12092-1 rum completa de 412 aminoácidos, incluindo a sequência de sinal.Ver Dame et al., Science, 225:593-9 (1984). A partir do WR201, isola-se um fragmento StuI - AsuII que codifica os aminoácidos 18-412 da proteína CS mais o ADN 3' não trjs duzido. A este fragmento do gene CS liga-se um oligdmero sintético HindiII - StuI: 5' 3'

AGCTTACCATGATGAGAAAATTAGCTATTTTATCTGTTTCTTCCTTTTTATTTGTTGAGG ATGGTACTACTCTTTT AATCGAT AAAAT AGACAAAGAAGGAAAAAT AAACAACTCC 3' 5' para recriar os aminoácidos 1 - 17, mas sem a região de ADN não trai duzida 5'. 0 novo fragmento (i.e., HindiII-StuI-AsuII) é tratado com ADN-polimerase I de E. coli, Fragmento grande (i.e. fragmento de Klenow) e é ligada num sítio de clonação num vector capaz de se rei plicar em E. coli. Por exemplo, insere-se o framento HindiII-StuI--AsuII em sítios Mlul - Bell de terminais rombos, de um vector de vaivém típico, aqui designado por TigND, para criar um plasmídio a qui designado por pNlV2103. 0 plasmídio TigND é um derivado do plasmídio TND (Connors et al. , DNA, _7:651-661 (1988) ou Pedido de patente dos E. U. A. ne de série 07/137 892, depositado em 28 de Dezembro de 1987). 0 plas_ mídeo TigND difere do plasmídêo TND devido ao facto do LTR de Rous estar substituído pela sequência melhoradoia de imunoglobulina de ca deia pesada, 2B gama, de ratinho. Alternativamente pode inserir-se o fragmento do gene CS HindIII-StuI-AsuII nos sítios HindIII-Accl do pUC19 ou do pBR322, ou noutros vectores de clonação convencionais. 0 plasmídêo pAcYMl é um vector de vaivém de baculovlrus contendo as sequências do genoma de AcMNPV que inclui o promotor do gene da poli-hedrina, mas não o gene da poli-hedrina, e as sequências de um plasmídêo bacteriano de elevado número de cúpias, pUC8. Ver Matsuura et al., 3 Gen Virol, 68: 1233-50 (1987). A par_ tir do pNIV2103, trãta-se, com ADN-polimerase I de E. coli e isola-se um fragmento HindIII - Ddel de 1261 pares, codificando a proteína CS a todo o comprimento, incluindo o ADN de P. falciparum, -20- 70 394 SKR Case 12092-1 não traduzido 3', do WR201, 0 fragmento de terminais rombos é depois ligado a um sitio de terminal rombo BamHI do plasmídeo pAcYMl, para criar um plasmídeo aqui designado por pNIV2112. ii) Proteína CS "sem fixação"

Para criar um gene de CS sem os últimos 21 aminoácidos (i.e., no terminal carboxilo), o fragmento de gene HindlII-StuI--AsuII do Exemplo (i) é primeiro clonado nos sítios HindIII-AccI do M13mpl8, um vector padrão usado em subclonação, sequencial e muita génese. Depois, usando técnicas convencionais de mutagéne-se dirigida a sítios, fundiu-se o gene CS com o iniciador: 5' ACACTGGAGCACTTTCCAT 3' para introduzir um sítio HgiAI no codão de aminoácido 390. 0 vejc tor é digerido com EspI (5' em relação ao sítio HindiII) e com HgiAI obtendo-se um fragmento de gene CS codificando os aminoác_i dos 1 - 390. Liga-se depois, este fragmento e um adaptador sintético, que codifica o aminoácido 391, um codão de paragem e um sitio Bell, 5' CCAGTTGATGATCATCTAGAGG 3' 3' ACGAGGTCAACTACTAGTAGATCTCC 3' aos sítios MluI - Bell do plasmídeo TigND para gerar o plasmídeo pNIV2104. A partir do pNIV2104, liga-se depois um fragmento HindIII - Bell, de terminais rombos com 1180 pares de bases, codificando os aminoácidos 1 - 391, a um sítio BamHI de terminal rombo do pAcYMl para criar o plasmídeo pNIV2105. Este plasmídeo é essencialmente o mesmo que o pNIV2112 com a expepção de codifi^ car uma proteína CS sem terminal carboxilo. iii) Proteína CS sem sequência de sinal e sem fixação A partir do plasmídeo pNIV21Q5, constroi-se um vector subsequente, o pNIV2111, ao qual faltam os primeiros 17 codões (i.e. a sequência de sinal) para além dos últimos 21 codões do ge ne da proteína CS. Este vector é construído (1) eliminando o fragmento Xhol - StuI do pNIV2105, que compreende o promotor do gene da poli-hedrina na sequência de sinal da CS (aminoácidos 1 - 17), -21- 70 394 SKR Case 12092-1 e (2) substituindo este fragmento por um ligante sintético: 5' GATCCACCATGG 3' 3' GTGGTACC 5' e com um fragmento Xhol - BamHI isolado a partir do pAcYMl.O vector resultante, pNIV2111, codifica uma proteína CS desde os aminoácidos 18 a 391, à qual falta uma sequência de sinal e uma sequência de fixação.

B) VECT0RE5 DE DR0S0PHILA

iv) pMTtPA

Como vector básico para a expressão do gene em Drosophila, usou-se o vector de expressão de tPA, pMTtPA (também designado por pDMtPA). Este vector é um derivado do vector pMLl, um pequeno vector pBR322 contendo o gene de beta-lactamase que eliminou as sequêri cias de veneno [Mellon et al , Cell, 27: 297 (1982)] . Estas sequên: cias são inibidoras da amplificação do vector. Digeriu-se este vector com SalI e Aat2 que removem uma pequena peça do pBR322, e preencheram-se os terminais digeridos. A peça ausente do pBR322 é depois substituída por uma "cassette" contendo o promotor de metalotioneí-na do Drosophila num fragmento EcoRl-Stul de terminais preenchidos seguido de um fragmento HindlII-Sacl, preenchido, do pDSPI [d.S. Pfarr et al. , DNA, .4(6): 461 (1985)] contendo uma sequência de sinal do tPA,opré-péptido e toda a região de codificação do tPA. 0 gene do tPA neste fragmento é seguido por um sítio de poliadenila-ção inicial SV40.

v) pCOHYGRO

Usou-se um plasmídeo disponível comercialmente, pUC18 [Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD, E.U.A.] contendo um sitio BamHI e Smal . Clonou-se o LTR 5' de um elemento COPIA integrado (357 pares de bases) no sítio BamHI do vector pUC18, resultando no vector designado por pUCOPIA. 0 COPIA é um membro representativo das sequências de repetição intermédia dispersa, que se encontram dispersas no genoma da Drosophila [Rubin et al., em Cold Sprinq Harbor Symp. Quant. Biol., 45: 619 (1980)] . 0 vector pUCOPIA foi cortado no sítio Smal e clonou-se o gene de E. coli C£ dificando a fosfotransferase de higromicina B ("cassett" de higro- -22- 70 394 SKR Case 12092-1 miclna B) no pUCOPIA usando técnicas de clonação convencionais. A "cassette" da higromicina B foi isolada num fragmento HindlII--BamHI, de 1481 pares de bases, do vector DSP-Higro [Gertz et al., Gene, 25_:179 (1983)] . A "cassette" da higromicina B contém a se quência de codificação do gene da fosfotransferase de higromicina B e a região de poli A inicial SV40. Os sítios HindIII e BamHI f£ ram preenchidos usando ADN-polimerase e a "cassette" da higromicina B foi ligada ao sítio Smal do vector PUCOPIA para produzir o vector pCOHYGRO. vi) pMTcsp391

Para preparar uma sequência de codificação da CS de P. falciparum madura sem os codões dos últimos 21 aminoácidos, clo-nou-se um fragmento EcoRI-AsuII do plasmídeo WR201 (ver Exemplo (i)) nos sítios EcoRI-AccI do M13mpl8, que foi também citado no Exemplo (i). Usando técnicas convencionais de mutagénese dirigida a sítios, o gene CS foi sujeito a mutagénese como iniciador do E-xemplo (ii) para introduzir um sítio HgiAI no codão do aminoáci-do 390. Depois, digeriu-se o vector com EcoRI e HgiAI obtendo-se um fraqmento do gene CS codificando os aminoácidos 1 - 390. Ligou--se, depois^este fragmento e um adaptador sintético que codifica o aminoácido 391, um codão de paragem, um sítio Bell e um sjC tio Xbal. 5' CCAGTTGATGATCAT 3' 3' ACGAGGTCAACTACT.AGTAGATC 5’ nos sítios EcoRI - Xbal do plasmídeo pULB1221 (ver, Pierard et al. , DNA, 8:321-328 (1989)) para gerar o plasmídeo pULB1221CSPdel. A partir do plasmidép pULB1221CSPdel isolou-se um fragmeji to BstXI - Xbal codificando os aminoácidos 26 - 391. Ligaram-se este fragmento e um adaptador sintético BqlII - BstXI que codifica a serina e os aminoácidos 19-25 da CS: 5' GATCTTTATTCCAGGAATACCAGTGCT 3' 3' AAATAAGGTCCTTATGGTC 5' nos sítios BgllI - Xbal de um vector com o promotor de metalotio-neína de Drosophila, uma sequência de sinal do tPA, e um sitio de poliadenilação inicial de SV40, tal como o vector pMTtPA derivado -23- 70 394 SKR Case 12092-1 do vector pgpl60A32 (Johansen et al., Pedido de patente dos E.U.A. nS de série 07/278 386, depositado em 1 de Dezembro de 1988). 0 vector resultante, o pMTcsp391, codifica uma proteína CS madura à qual falta uma sequência de fixação carboxi-terminal (i.e., sem os aminoácidos 392 - 412) e com um resíduo serina adicional na extremidade amino-terminal, i.e., ser-CS^ 391* vii) pMTcsp398

Construiu-se outro vector, contendo uma sequência de codificação da CS de P. falciparum modificada, digerindo 0 vector pMTcsp391 com as endonucleases de restrição HgiAl e Xbal, e substituindo subsequentemente 0 fragmento HgiAl - Xbal por um adaptador de oligonucleétido sintético com a sequência:

5' CCAGTGTGTTTAATGTCGTGAATTCTTGAT 3' ACGAGGTCACACAAATTACAGCACTTAAGAACTAGATC 5' 0 adaptador codifica os aminoácidos.da CS,390 - 398 mais um codão de terminação. Este vector resultante, designado por pMTcsp398,ct) difica uma proteína CS madura com uma serina adicional na extreini dade amino-terminal e à qual faltam também os codões de fixação do terminal carboxilo 399-412, i.e, ser-CS·^ 398* viii) pMTcsp412

Isolou-se um fragmento BstXl - EcoRV de 1492 pb da proteí^ na CS de P. falciparum (aminoácidos 26 - 412) a partir do plasmí-deo WR201 (anteriormente referido). Ligaram-se este fragmento BstXl - EçoRV e o mesmo adaptador sintético que foi utilizado para a construção do vector (vi), nos sítios BqlII - Saci (de terminais rombos) do vector, pMTtPA (ver construção (iv)). A construção final, pMTcsp412, codifica uma proteína CS madura (aminoácidos 19 -- 412) mais uma serina adicional no terminal amino, i.e., ser--CS 19-412

Exemplo 2. Expressão em células de insecto

A) CÉLULAS SPODOPTERA FRUGIPERDA

As células Spodoptera fruqiperda 9 (Sf9) estão disponíveis no ATCC (Rockville, MD, E.U.A.). As células Sf9 foram co-tranjs fectadas com um dos vectòres recombinantes seguintes, plasmídeos pNTV2112, pNIV2105 ou pNIV2111 e com 0 ADN AcMNPV do tipo selvagem, -24- 70 394 SKR Case 12092-1 com 50 /ig e 1 yUg, respectivamente, substancialmente como se descre ve em Summers et al. , TAES Buli, NR 1535, Maio 1987, anteriormente citado.

As partículas de virós resultantes foram obtidas recolher^ do os sobrenadantes. Usou-se depois o meio contendo vírus para infectar as células Sf9 num ensaio em placa. A infecção subsequente das células Sf9 com um baculovírus recombinante purificado em placa resultou em células exprimindo a proteína CS em vez da proteína poli-hedrina.

Verificou-se que as células infectadas com baculovírus rj3 combinante derivadas do pNIV2112 exprimiam intracelularmente uma proteína CS, com aproximadamente 3 /ig/ml de sobrenadante de meio de cultura infectada. A análise por mancha Western mostrou essencialmente uma banda a cerca de 60 Kilodalton.

As células infectadas com baculovírus recombinante derivjj das do pNIV2105 exprimem uma proteína CS "sem fixação", i.e., sem uma fixação carboxi-terminal, a um nível de aproximadamente 1 psg/ /ml de sobrenadante de uma cultura de 7 dias. A análise de mancha Western das proteínas no sobrenadante e no extracto de células mos trou duas bandas em dupleto imuno-reactivas a cerca de 50 e 60 kilodalton.

As células infectadas com pNIV2111 exprimem intracelular-mente uma proteína CS, com um nível de aproximadamente 3 ju.g/1,5 x x 10^ células, 3 dias após a infecção. A análise de mancha Western das proteínas no extracto de células mostrou essencialmente 2 bandas com aproximadamente 50 kilodaltons. B) CÉLULAS DE DR0S0PHILA:

Co-transfectaram-se cada um dos vectores MTcsp do Exemplo 1 com pCOHYGRO em células de Drosophila 5£, com uma proporção de vector MTcsp para pCOHYGRO de 20:1. A transfecção foi realizada por técnicas convencionais usando precipitação com CaPO^. As linhas de células policlonais foram geradas após selecção com higromicina B durante 2 semanas. Geraram-se linhas de células clonais simples diluindo em série a linha de células policlonais e colocando em pia ca, uma célula por cavidade em placas de 96 cavidades. Cultivaram- -25- 70 394 SKR Case 12092-1 -se as linhas de células e seguiu-se a expressão da proteína CS a- pós 6 dias de indução com CuSO. de uma cultura com uma densidade 6 ^ de células de 5x10 células/ml. A produção das proteínas CS foi medida por ELISA ou por técnicas de mancha Western convencionais usando anticorpos criados contra as regiões de repetição CS, substancialmente como é descrito por Gross et al, no pedido de patente dos E.U.A. n^ de série 07/256 181, depositado em 11 de Outubro de 1988. Os níveis de produção mais elevados atingidos para uma linha de células clonal sim pies foi de 9mg/l, em balões agitados de 100 ml, com um período de indução de 6 dias com uma densidade de células de 5 x 10 células/ /ml.

Um perito na arte pode exprimir outras proteínas de circum esporozoito de Plasmodium e seus fragmentos, descritos pelo presente invento, usando substancialmente os mesmos sistemas e procedimentos que se exemplificaram anteriormente bem como utilizando sistemas e materiais similares que estão disponíveis publicamente.

Exemplo 3. Purificação das proteínas recombinantes expressas em células de insecto

As proteínas CS recombinantes expressas em 5. fruqiperda foram purificadas como se segue: lisararam-se células infectadas Sf9 por 3 ciclos de congelamento-descongelamento em tampão RIPA (50 mM de tris-HCl pH 7,2 , NaCl 0,15M, l?ó de triton X-100, 0,1?Ó de SDS, 1% de desoxicolato de Na), Centrifugou-se o extracto em bruto durante 30 minutos a 1300 rpm. Incobou-se o sobrenadante com DNAse durante 30 minutos a 37°C, pH 7,5. Ajustou-se o pH a 5,5 e adicionaram-se RNAse e MgSO^. Apés úma incubação adicional de 30 minutos a 37 C, tornou-se o extracto celular 1M em MgC^ e 1M em NaCl; depois, ajustou-se o pH a 1,6 pela adição de HC1 concentrado e incubou-se a amostra durante 1 hora a 0°C e centrifugou-se durante 30 minutos a 13 000 rpm. Dialisou-se o sobrenadante contra carbonato de amónio 20 mM, pH 7,5, e aplicou-se numa coluna de afinidade preparada a partir de um anticorpo monoclonal reconhecendo as repetições da proteína CS (Ver Nardin et al., J Exp Med, 156 :20 (19 8 2 )). Efectuou-se a eluiçâo com ecetato de Na 100 mM a pH 4,0 , na preseri ça de NaCl 500 mM. -26- 70 394 SKR Case 12092-1

Esta técnica de purificação é também eficaz com proteínas CS recombinantes expressas num hospedeiro Drosophila.

Exemplo 4. Vacina contendo proteína CS

Uma vacina ilustrativa do presente invento é preparada co mo se segue: adiciona-se a proteína CS recombinante, derivada de insecto, da invenção, com agitação, até uma concentração final de 10 - 2 000 yLtg/ml, preferivelmente 600 - 1600 μq/ml, a uma solução salina tamponada (NaCl 150 mM, fosfato de sódio 10 mM, pH 6,8; e£ terilizada por filtração) contendo 1,0 mg de Al^ + (na forma de gel de hidróxido de alumínio) por ml. Mantem-se o pH num valor de pH 6,8 e deixa-se a mistura de um dia para o outro a cerca de 4°C. A-diciona-se timerosal até uma concentração final de 0,0005?ó. Verifi ca-se o pH e ajusta-se, se necessário, até pH 6,8.

Cada dose de vacina contém 0,5 ml a 3,0 ml da formulação da vacina CS, preparada como anteriormente se descreveu. Como exern pio, a quantidade de polipéptido por dose é de cerca de 1 a cerca de 2 000 ^g. Preferivelmente, cada dose conterá aproximadamente 800 jug de polipéptido/0,5 ml.

Preferivelmente, a vacina éadministrada parentericamente, p.e., intramuscularmente (im) ou subcutaneamente (sc), embora se possam utilizar outras vias de administração para induzir uma respo_s ta protectora. A vacina é administrada numa única dose ou em doses múltiplas, p.e., com 2 a 4 doses suplementares. Preferivelmente, administram-se doses múltiplas num período de 1 - 6 semanas. Depois, podem readministrar-se as vacinas tal como for necessário, p.e., anualmente. A descrição anterior e os exemplos, descrevem totalmente a invenção e as suas concretizações preferidas. 0 presente invento não está limitado pelas concretizações especificamente descritas, mas engloba todas as suas variações e modificações abrangidas pelo campo das reivindicações seguintes.

Claims (10)

1. -27- k 70 394 SKR Case 12092-1 REIVINDIC AÇ0E5 1 - Processo de produção de uma proteína de CS de Plasmo-dium em células de insecto, caracterizado por compreender cultivar em meio adequado células de insecto transfectadas com uma unidade de expressão do gene da proteína CS de Plasmodium sendo as ve feridas células capazes de expressar a referida proteína.
2. 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza do por as células de insecto serem células de Drosophila.
3. 3 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizja do por as referidas células serem transfectadas com um primeiro vector contendo a sequência de codificação da higomicina B transfe^ rase e com um segundo vector contendo a sequência de codificação de uma unidade de expressão do gene da proteína CS de Plasmodium.
4. 4 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracteriza; do por o referido primeiro vector ser pCOHYGRO. 3 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracteriza^ do por o referido segundo vector compreender a sequência de codif^L cação de ADN de CS de pMTcsp391, pMTcsp398 ou pMTcsp412.
5. 6 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracteriza do por as células de Drosophila serem células de D. melanoqaster S2*
6. 7 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizja do por as referidas células S£ serem co-transfectadas com o vector pCOHYGRO e com um vector compreendendo a unidade de expressão do gene de CS tal como está presente em pMJcsp391, pMTcsp398 ou pMT csp412.
7. 8 - Processo de .acordo com a reivindicação 1, caracteriz_a do por as células de insecto serem células de Lepidoptera.
8. 9 - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizja do por as referidas células serem co-transfectadas com um primeiro vector compreendendo um ADN plasmídico, o qual contém a sequência de codificação de uma unidade de expressão do gene de CS de Plasmo-dium. 70 394 k SKR Case 12092-1 * -28-
9. 10 - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracteriz_a do por as células de Lepidoptera serem de S. fruqiperda.
10. 11 - Processo de preparação de uma vacina para estimulação de protecção contra a infecção pela malária caracterizado por compreender a associação de uma quantidade imunoprotector e não tóxica de da proteína de CS produzida de acordo com a reivindicação 1. L7. 15 Lisboa, Por SMITHKLINE BIOLOGICALS