PT92564A - Processo para amplificar e detectar sequencias de acido nucleico de um alvo especifico e equipamento portatil para a sua realizacao pratica - Google Patents

Description

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tido, preferivelmente trifosfato de nucleótido, para amplificação sob as condições propÊdas para alongar os ácidos nucleicos primários híbridos resultantes, preferivelmente numa direcção oposta ao citado substracto sólido. (c) se desnaturar o produto da operação (b), para se produzir as sequências de ácido nucleico de alvo imobilizado, e (d) se repetir, pelo menos uma vez um ciclo de operação (a), (b) e (c), com o produto da fase (c) do ciclo anterior a ser usado em lugar de (a) (ii), 0 processo acima descrito pode ser usado para se detectar as sequências de alvo específico do ácido nucleico usando-se uma amostra de ensaio que se supõe que contém as sequências de alvo do ácido nucleico, e para se determinar se está presente uma sequência amplificada.

EIQUA1RAMMT0 GERAL DA INVENÇÃO

Campo da Invenção A presente invenção refere-se à amplificação de um gene para detectar sequênoias específicas. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a um processo para detectar sequências de ácido nucleico de um alvo específico usando para tal oligonucleótidos imobilizados ou imobilizáveis.

Informação sobre a lécnica Anterior

A produção à escala industrial de sequências de ácidos nuclei-· cós é normalmente levada a cabo por clonação de uma sequência específica num veotor específico. A sequência a clonar é isolada, identificada, ligada covalentemente a um vector de cadeia única ou de cadeia dupla e então é clonada. Os vectores com o AM extra são separados a partir da célula hospedeira e, em função dos requisitos, o fragmento clonado de AM tem que ser restringido e separado a partir do AM restante. Se se pretender AM de cadeia simples, ou ele é clonado num vector de cadeia simples ou é necessário executar uma separação da cadeia. Todas estas técnicas envolvem manipulação por peritos em sistemas ‘biológicos e bioquímicos.

Analytical Biochemistry, 140. 95-103, (1984) descreve um processo para a preparação de amostras de AM de hibridização sem se imobilizar especifieamente um molde de AM de cadeia simples em celulose. Apesar de este processo ser útil, a distribuição dos comprimentos do produto novamente sintetizado não é tão uniforme quanto seria desejado. Parece agora que tal pode dever-se às ligações múltiplas do modelo de AM à celulose.

Um sistema homogéneo que envolve duas amostras foi descrito no Pedido de Depósito de Patente Europeia 192 168.

Este processo usa duas amostras não sobrepostas, uma das quai3 φ marcada para detecção e a outra para a separação do híbrido. 0 ensaio é levado a cabo numa solução homogénea e o híbrido é subsequentemente separado através de uma reacçãp de imobilização com um suporte sólido e uma amostra de separação. A amplificação das sequências de polinucleótidos purificadas realizada usando como material de iniciação um polinucleóti-do e um oligonucleótido imobilizados foi descrita na Patente 4 τ

Norte Americana N2. 4 734 363 e em Anal. Biochem., de Ashley et al. supracitada. Na Patente Norte Americana 4 734 363 usou--se um acoplamento terminal e no trabalho de Ashley et al. reacções de acoplamento intermédio não específicos para se imo bilizar os polinucleótidos.

Saiki et al, Science, 230, 1350, (1985) descreveu um processo de amplificação de uma sequência de ácido nucleico de /3-glo-bina numa amostra genómica humana para detectar o ponto de mutação da hibridização com um oligonucleótido. Esta sequência produzida é formado em solução. Para hibridização, d ADN tem que ser ou imobilizado após a amplificação ou tem que se levar a cabo uma digestão da restrição e separação para análise da sequência. 0 processo de amplificação descrito por Saiki et al, é também descrito na Patente Norte Americana 4 683 195 e na Patente Norte Americana 4 683 202 (a partir daqui referida como Mulliís). Uma limitação significativa deste processo é o facto de que a sequência amplificada resultante não pode ser separada facilmente a partir de mistura nem manipulada, e requer consequentemente esforços posteriores significativos para analisar ou detectar a sequência amplificada na terminação do termoéielo.

Sumário da Invenção A presente invenção refere-se à amplificação de um gene para detectar sequências específicas. As sequências amplificadas são produzidas usando sequências de material de iniciação ou imobilizados ou imobilizáveis ou marcadas não isotopicamente de forma que o produto possa ser. imobilizado para detecção. As sequências que servem como material de iniciação podem também ser marcadas durante a reacção de extensão. 5

Mais particularmente, a presente invenção refere-se a um processo para amplificar sequências de ácidos nucleicos de um alvo específico numa amostra, por exemplo, numa amostra que compreende AM de cadeia dupla; o processo compreende: (a) uma primeira fase de iniciação que envolve fazer-se contactar, sob condições de hibridização (i) um primeiro ácido nucleico de iniciação e um segundo ácido nuclei-oo de iniciação, sendo um dos mencionados primeiro ou segundo ácidos nucleicos de iniciação imobilizado ou imobilizável, sendo o outro imobilizado ou imobilizável ou marcado, com (ii) uma amostra a ensaiar que contlm sequências de ácido nucleico alvo, (b) fazer-se contactar o produto resultante da fase (a) com uma enzima de amplificação e pelo menos um resíduo de ácido nucleico sob condições apropriadas para alongar os ácidos nucleicos de iniciação híbridos resultantes, (c) se desnaturar o produto da fase (b) para se produzir sequências de ácido nucleico do alvo imobilizado, e (d) se repetir pelo menos uma vez um ácido de operações (a), (b) e (c), usando o produto da fase (c) do ciclo anterior que ê usado em vez de (a) (ii). A presente invenção refere-se também a um processo para de-tectar sequências de ácido nucleico de um alvo específico numa amostra, por exemplo, numa amostra que compreende AM de cadeia dupla, o qual compreende: (a) fazeiv-se contactar sob condições de hibridização (i) um primeiro ácido nucleico de iniciação e um segundo ácido nucleico de iniciação sendo um dos primeiro ou segundo ácidos nucleicos de iniciação imobilizado ou

imobilizável, e sendo o outro ou imobilizado ou imobilizável ou marcado, com (ii) uma amostra a ensaiar supeita de compreender sequências de ácido nucleico do alvo, (b) promover-se o contacto do produto obtido na fase (a) com uma enzima de amplificação e pelo menos um resíduo de nucleótido sob condições para alongar os ácidos nuclei-cos híbridos primários resultantes, (c) desnaturar-se o produto da fase (b) para originar sequências de aminoácido do alvo imobilizadas, (d) repetir-se pelo menos uma vez um ciclo de operações de fases (a), (b) e (c) com o produto da fase (c) do ciclo anterior em vez de (a) (ii), e (e) determinar se a sequência amplificada está presente. A presente invenção refere-se ainda a equipamento portátil para amplificar sequências de ácidos nucleicos de um alvo específico, compreendendo um ou mais contentores que contêm (a) um ácido nucleico de iniciação imobilizado ou imobilizável, (b) um ácido nucleico imobilizado, imobilizável ou marcado, (c) uma enzima de amplificação e (d) pelo menos um resíduo de nucleótido para amplificar. A presente invenção também se refere a um equipamento para detectar sequências de ácido nucleico de um alvo específico, que compreende um ou mais contentores que contêm (a) um ácido nucleico imobilizado ou imobilizável, (b) um ácido nucleico imobilizado, imobilizável ou marcado, (e) uma enzima de ampli ficação, (d) pelo menos um resíduo de nucleótido para amplificação e (e) um oligonucleótido marcado hibridizável específico para detectar a sequência amplificada. A presente invenção proporciona uma melhoria significativa

em relação às técnicas anteriores na medida em que um oligo-nucleótido imobilizado ou imobilizável pode ser usado para amplificar uma sequência específica numa mistura bruta que contém muitas outras sequências. Além disso, o análito pretendido produzido no fim do processo encontra-se sob a forma imobilizada e pronta para ensaios em fase heterogénea. A presente invenção produz sequências amplificadas imobilizadas e pode ser processada como um sistema automatizado para análises completas.

Uma forma de realização da presente invenção constitui um aperfeiçoamento em relação à Patente de Mullis, à Patente Norte-Americana n2. 4 683 195 e à Patente Norte-Americana 4 683 202, incorporadas na presente memória descritiva como referência. Neste aperfeiçoamento, pelo menos um dos ácidos nucleicos de iniciação é imobilizado ou imobilizável.

BREVE DESCRIÇÃO DAS PI&URAS A Pigura 1 é um diagrama esquemático mostrando as fases para levar a cabo uma amplificação de acordo com uma forma de realização da presente invenção. A Pigura 2 é uma fotografia dos resultados de amplificação de ácidos nucleicos de acordo com a invenção analisados por electroforese em gel. A Pigura 3 é uma fotografia dos resultados de digestão com endonuclease de restrição dos produtos de amplificação de acordo com a presente invenção. A Pigura 3 mostra que o processo de acordo com a invenção origina resultados tão específicos como se fosse realizado em solução. A Pigura 4 é uma fotografia de dois tubos de ensaio que con·

têm produto amplificado (cl = clamídia) espeoífico e de controlo (rato). 5ESÇRI5|0_DEIAmDA_DA_im^Ã0 Várias formas de realização preferidas da presente invenção são sumarizadas como se segue: TABELA 1

Natureza do ácido nucleico de iniciação 1 Natureza do ácido nucleico de iniciação 2 Detecção do produto amplificado (1) imobilizado imobilizado aglutinação, hibridização, clorimetria ou fluormetria (2) imobilizado imobilizável aglutinação, hibridização, clorimetria ou fluormetria (3) imobilizado marcado marcação ou hibridização (4) imobilizável marcado marcação ou hibridização (5) imobilizável imobilizado aglutinação, hibridização, clorimetria ou fluormetria

TABELA 1 (continuação)

Natureza do ácido nucleico de iniciação Z

Natureza do ácido nucleico de iniciação 2

Detecção do produto amplificado (6) marcado (7) marcado imobilizado imobilizável (8) imobilizado/marcado (9) imobilizável/marcado (10) imobilizado/ marcado (11) imobilizável/ marcado marcação ou hibridização marcação ou hibridização aglutinação, hibridização, calorimetria, ou fluorometria aglutinação, hibridização, colorimetria ou fluorometria aglutinação, hibridização, colorimetria, ou fluorometria aglutinação, hibridização, colorimetria, ou fluorometria

Na Tabela 1, deve-se entender que outros processos de detecção do produto amplificado podem ser usados, por exemplo, a digestão com endonuclease de restrição do produto e electro-forese em gel. 10

Uma descrição detalhada de formas de realização específicas (3) e (6) na Tabela 1 acima que se refere a amplificação de uma sequência de ácido nucleico a testar envolve fazer-se contactar um ácido nucleico ligado a um suporte sólido complementar de uma cadeia de sequência de ácido nucleico a testar e outro ácido nucleico ligado a uma marca detectável, sendo o ácido nucleico complementar de uma outra cadeia de sequência do ácido nucleico da amostra atestar sob condições de hibri-dização, amplificando o ácido nucleico hibridizado com uma enzima de tal maneira que são obtidas sequências complementares da amostra a testar, ao desnaturando o produto e re-ane-lando-o para produzir uma estrutura mais amplificável e repetindo o processo para produzir uma sequência a ensaiar imobilizada num suporte sólido numa quantidade superior à da concentração inicial. 0 produto é então testado, por exemplo, como se segue: (a) se se usar um oligonucleótido marcado como material de iniciação e o segundo material de iniciação se encontrar sob uma forma imobilizada, a deteeção de marca no suporte determinará a presença de ácidos nucleicos amr-plificadores a testar; (b) pela hibridização com uma amostra específica; (c) se durante a reacção de amplificação for incorporado um resíduo de ácido nucleico marcado, a proporção da incorporação de um tal resíduo determina a presença das sequências específicas; ou (d) uma reacção de aglutinação de amplificação posterior.

Uma descrição detalhada de outras realizações (4) e (7) na Tabela 1 acima referida que se refere à amplificação de uma

sequência de ácido nucleico para um ensaio envolve o contacto de um ácido nucleico imobilizável com um suporte sólido complementar para uma cadeia de sequência do ácido nucleico a ensaiar e outro ácido nucleico ligado a uma marca detectável, sendo o ácido nucleico complementar de outra cadeia de amostra de ácido nucleico a testar sob condições de hibridizaçao, ampliando o ácido nucleico com uma enzima tal que se produzem sequências complementares à amostra a testar, desnaturando o produto obtido, reanalizando para se obter uma estrutura mais amplificável, repetindo o processo para produzir a sequência a estar numa quantidade superior à concentração inicial e promovendo o contacto entre o produto amplificado e um suporte sólido para obter a imobilização para detecção. 0 produto imobilizado é então testado, por exemplo, como se segue: (a) detectando a marca no suporte sólido; e (b) por hibridizaçao com uma amostra específica.

Podem ser levados a cabo as formas de realizações (1), (2) e (5) da Tabela 1 de forma similar.

Tal como se descreveu acima, Saiki et al e Mullis descrevem um processo de reacção em cadeia de polimerase (PGR) para amplificar uma amostra a testar. Saiki et al e Mullis usaram dois oligonucleótidos diferentes como material de iniciação. A amostra a testar de ácido nucleico serviu como molde para a reacção de amplificação do material de iniciação. Os oligonucleótidos eram complementados nas extremidades das duas cadeias de uma amostra de ADN de cadeia dupla. Uo método de Saiki et al e Mullis, um oligonucleótido é específico para uma cadeia e o outro é específico para a cadeia complementar. Ambos os oligonucleótidos flanqueiam a região da sequência de mutação a analisar. Quando se procede à mistura dos oligonu-oleótidos com as amostras de ácidos nudeicos a ensaiar sob

condições de analização, os oligonucleótidos sofrem hibridi-zação de tal forma que o grupo 3-hidroxilo de cada oligonu-cleótido estará disponível para amplificação. Após se ter amplificado o oligonucleótido com a enzima de amplificação da iniciação dependente do molde, por exemplo, ADN polimerase, transcriptase inversa, etc., os processos de hibridização do oligonucleótido e amplificação são repetidos. A desvantagem de uma tal amplificação é o facto de a análise do produto obtido requerer operações de manuseamento de amostra difíceis por exemplo, a imobilização. A Requerente descobriu que o método PCR é significativamente aperfeiçoado através do uso de materiais de iniciação de ácidos nucleicos imobilizados ou imobilizáveis primários. Os produtos da presente invenção amplificados obtidos finais são já imobilizados ou especificamente imobilizáveis sem perda significativa da eficiência de amplificação.

Na Rig. 1. promove-se o contacto da amostra de ácido nucleico a ensaiar, a qual serve como modelo para o ciclo inicial de amplificação, com ácidos nucleicos de iniciação imobilizados ou imobilizáveis sob condições de hibridização. Uma sequência de iniciação é específica para uma cadeia e a outra é específica para a cadeia complementar. Os materiais de iniciação não são complementares uur .da. outra. Após se terem formado os híbridos do modelo de iniciação, estes são amplificados por uma enzima. A sequência amplificada é então submetida a novo ciclo para nova amplificação.

Numa forma de realização preferida, os ácidos nucleicos de iniciação são oligonucleótidos e são complementares das sequências terminais na posição 3' da amostra de ADN. Os ácidos nucleicos de iniciação podem possuir um comprimento qualquer compreendido no intervalo entre 3 a 10 quilobares ou mais, de preferência, entre 5 a 100 bares.

Quaisquer ácidos nucleioos complementares (da amostra) com um grupo hidroxi na posição 3' podem servir como material de iniciação para a reacção de amplificação mediada pelo modelo. 0 objectivo associado com o uso de dois materiais de iniciação ê amplificar ambas as cadeias. Os materiais de iniciação não têm de ser complementares (na sua totalidade) de sequência da amostra. Eles devem ser suficientemente complementares para iniciar a reacção de amplificação mediada pelo modelo específico da sequência. A fim de manter a fidelidade da reacção da amplificação do primário mediada pelo modelo, a iniciação deverá ocorrer a partir de uma região de base perfeitamente emparelhada. A sequência mínima pode incluir três pares de base. Eormalmente, uma região de dupla cadeia de 5 a 7 pares de base é suficientemente forte para se submeterem à reacção da amplificação do material de iniciação a temperaturas de 25-0 e inferiores. Se existirem menos do que 5 pares de base, a reacção de amplificação a baixa temperatura pode não ter tido lugar. A presente invenção é um aperfeiçoamento em relação aos processos de amplificação descrito na técnica anterior. A Patente Europeia ES, 0192 168 descreve processos para amplificar e detectar sequências de polinueleótidos e é incorporada na presente memória descritiva como referência. A presente invenção descreve um processo para amplificar os ácidos nuclei-cos de amostra a ensaiar no qual a sequência amplificada é produzida sob uma forma imobilizada. A vantagem principal associada com este processo reside no facto de o produto se formar sob um estado especificamente imobilizável ou imobilizado. Este facto torna mais fácil a separação da sequência não amplificada (por vezes 10 - 10 vezes a sequência do ensaio). Como está sob uma forma especificamente imobilizável ou imobilizada, a análise é mais fácil. A imobilização de um ácido nucleico, especialmente um oligonucleótido, é descrita em

Affinity Chromatograpliy, Herbert Sc&ott, larcel Dekker, Inc., pág. 15 a 20 (1984). A maioria das reacções de imobilização descritas no artigo anterior podem ser levadas a cabo por utilização de resíduos intermediários ou ligantes. Por exemplo, em vez de se usar "SEPHADEX'1 ou partículas de celulose direc- tamente, é possível usar "SEPHADEX*1 ou celulose ligada a po-liamina ou proteína e usar os resíduos de proteína ou polia-mina como sítios de acoplamento para um oligonueleótido.

Por exemplo, "SEPHADEX" activado com brometo de cianogénio pode reagir primeiramente com uma poliamina em grande excesso por exemplo, com espermina, e então acoplada a um oligonucleó-tido por meio de uma reacção de oxidação. Tal como foi descrito na Patente Europeia Na. 164 586 podem-se preparar oligonucleó tidos marcados com grupos amino com ligandos de conl·-primentos vários. Outros processos para a preparação de oligo·· nucleótidos marcados com grupos amino têm também sido descritos na técnica.

Como urna matriz de imobilização (suporte sólido) para a presente invenção, pode usar-se celulose reactiva ou activada, "SEPHADEX", SEPHAROSE», "SEPHACRYL", látex de poliestireno, po-liacrilatos, álcoois polivinílicos ou outras matrizes de origem natural ou sintética, as quais podem ser activadas para serem submetidas a reacção química. 0 substracto para a reacção de amplificação é constituído por um ou mais resíduos de ácidos nucleicos, por exemplo, trifos-fatos de nuoleótido (M!P).

Como a adição dos resíduos de nucleótidos ao material de iniciação ou à reacção de amplificação necessárias para a fidelidade da sequência seja específica, são preferíveis enzimas tais como AM polimerase, fragmento de Klenow da polimerase ou transcriptase inversa ou taq polimerase. Estas enzimas catalisam uma reacção de amplificação de material de iniciação 15

específica. Ião era nem esperado nem previsível que tais enzimas actuassem sobre oligonucleótidos de iniciação quando imobilizadas sem perda significativa da eficácia. A presente invenção refere-se ao processo para obtenção de sequências imobilizadas para análise. luma forma de realização, a presença de uma tal sequência pode ser detectada usando resíduos de nucleótidos marcados como substractos para a ampliação. Quando, por exemplo, se utiliza trifosfato de nu- -in cleótido marcado com fluoresceína ou com J P como substracto para ampliação com uma enzima de AM polimerase, o produto ampliado será marcado. Detectando-se essas marcas (radioacti-vas no caso de e fluorescentes no caso de fluoresceína) é possível averiguar a presença de sequências de ácido nuclei-cos a ensaiar. 0 nível amplificado pode também ser detectado por hibridiza-ção com uma amostra específica.

As amostras de oligonucleótidas imobilizados ou imobolizáveis compreendem pelo menos uma sequência de base de cadeia simples complementares das extremidades 3’ ou 5' da sequência a ser amplificada. A amostra não deve ser complementar da sequência inteira antes que seja realizada a reacção de ampliação enzimática. A bomdogia das extremidades das amostras pode ser tão curta como apenas 3 nucleótidos e pode atingir um com-· primento de 200 nulcleótidos; no entanto, é preferível que compreendam entre 10 e 30 resíduos de nucleótidos.

Os oligonuieótidos podem ser imobilizados em virtude de os oligonucleótidos estarem ligados numa sua extremidade a um substracto sólido e na qual a ampliação ocorre no sentido oposto ao do substracto sólido. A amostra pode compreender ADI de cadeia dupla e cada oligo-nucleótido pode ser complementar de uma cadeia de ADI de cadeia dupla. 16

A detecção da presença da sequência amplificada pode ser efec-tuada de várias formas incluindo qualquer uma das que se seguem: (1) marcando o resíduo de ácido nucleieo, por exemplo, com uma marca, tal como, por exemplo, um agrupamento radio-activo, um corante, um agrupamento fluorescente ou uma enzima e efectuando então uma análise para determinar a presença dessa marca; (2) submetendo o produto da operação (d) do método acima mencionado para detectar as sequências de ácidos nuclei--co de um alvo específico a condições de hibridização com uma amostra marcada (tal marca pode ser como se descreve acima na presente memória descritiva hibridi-zável com a sequência a testar e determinando ee de facto ocorreu hibridização; (3) determinação de uma alteração ou diferença de uma propriedade física, por exemplo, detecção de uma diferença de peso molecular ou densidade por meio da realização de electroforese, centrifugação, cromatografia por per-meação de gel ou por microscopia (determinação visual para detectar uma diferença de tamanho).

Materiais de iniciação

Os materiais de iniciação são conhecidos na técnica como as moléculas de ácido nucleieo que podem ser prolongadas enzima-ticamente quando formam um duplex com um ácido nucleieo complementar com uma sequência de cadeia simples ánica extra (a qual pode estar presente ou pode ser criada na reacção) com uma orientação própria. Como a maioria das enzimas responsá-

veis pelo prolongamento dos ácidos nucleicos adicionem resíduos à cadeia lateral na posição 3’ do resíduo de nucleósido existente, a sequência cópia deve ser de cadeia simples sob uma forma complementar em direcção à cadeia lateral na posição 32 do material de iniciação. Os materiais de iniciação são normalmente oligonucleótidos mas incluem qualquer AM hi-bridizável, ABE ou oligonucleótido. Como material de iniciação podem também servir um ácido nucleico de cadeia simples de maior peso molecular. Ácidos nucleicos tão curtos como tril nucleótidos e tão grandes como com 10 kb podem servir como material de iniciação. 0 tamanho preferido é determinado pela natureza específica da sequência a ser copiada ou amplificada. Os tamanhos mais preferidos para os quais estão compreendidos entre um hexanucleótido e um triacontâmero. Os exemplos do presente pedido de patente são realizados com oligonucléó-tidos de iniciação com o comprimento compreendido entre ico-sâmeros e triacontámeros mas podem ser usados outros comprimentos. Ácidos nucleicos imobilizáveis foram descritos em detalhe na Patente Europeia NS. 192 168. Os materiais de inicia ção prolongados pode ser usados de maneira semelhante.

Processos de imobilização: A imobilização química de um oligonucleótido é bem conhecida na prática. Assim, por exemplo, Affinity Chromatography por H. Schoot, Mareei Dekker, 1984, descreve diferentes processos de imobilização de oligonucleótidos e de ácidos nucleicos. Outros processos que não se encontram descritos neste livro são também conhecidos na técnica. Pode usar-se um copolímero de clorometil-estireno e estireno para a imobilização de um oligonucleótido que contém uma enzima primária. Podem ser usadas diferentes partículas de látex para imobilização segufc do técnicas químicas semelhantes às usadas na imobilização de 1,/ 18 <

proteínas. Em princípio, para a imobilização podem ser asados suportes sólidos tais como celulose e seus derivados, "SEPHA-DEX", nSEPHAROSEH e produtos semelhantes, partículas de látex de papeis, partículas magnéticas ou não magnéticas, partículas à base de sílica, produtos à base de vidro, poliuretanos, partículas ou folhas à base de "TEFLON”, •'IMMOBILOKf” e outros, para referir alguns.

Se foram usadas partículas magnéticas, a separação de materiais de iniciação fluorescentes não ligados de materiais de iniciação os ligados com uma substância fluorescente pode rea-lizar-se usando um campo magnético. Depois de realizado 0 procedimento de prolongamento, as câmaras reaccionais são mantidas perto de um campo magnético. As partículas imobilizadas são fixadas e o sobrenadante pode ser decantado ou aspirado.

As partículas imobilizadas podem ser lavadas repetidas vezes para remover qualquer excesso de materiais de iniciação marcadas com partículas fluorescentes a partir da mistura reac-cional. Depois da lavagem, as partículas magnéticas podem ser ressuspensas e o sinal fluorescente das partículas pode ser determinado qualitativa e quantitativamente. Outros processos de marcação podem ser utilizados em combinação com partículas magnéticas.

Marcação e detecção sem hibridização:

Quando um dos materiais de iniciação é imobilizado ou imobi-lizável, a detecção pode realizar-se no suporte sólido ou por hibridização com uma amostra marcada ou o produto pode ser detectado directamente usando o outro material de iniciação derivados com um marcador detectável. A marcação de um oligo-nucleótido com uma maxca detectável, como por exemplo, com um fluoróforo é conhecida na técnica. Todas as técnicas de 19

detecção podem ser levadas a cato por um perito no assunto.

Pode usar-se como marcador tiotina para um material de iniciação imobilizado ou imobilizável usando a tecnologia de Mo*· tina-avidina tem conhecida. Num sistema imobilizado/marcado, a tiotina encontra-se presente num material de iniciação e o sutstracto imotilizado no segundo material de iniciação. Num sistema imotilizável marcado, a tiotina encontra-se presente num material de iniciação e o marcador, tal como fluoresceína, está presente no segundo material de iniciação, realizando-se a amplificação por termociclosj o produto que contêm tiotina poderá ser imotilizado.

Materiais de iniciação marcados

Existe uma variedade de processos que podem ser usados na presente invenção para determinar a presença do material de iniciação prolongado marcado na fracção imotilizada separada ou na solução reaccional restante a fim de se concluir o ensaio. Um perito no assunto normal pode escolher entre quaisquer meios convencionais para detectar a existência de uma marca na amostra amplificada. A marca é uma característica natural do oligonucleótido de iniciação compreendido na amostra ou uma substância que possui propriedades físicas, químicas ou eléctricas detectáveis. Quando se introduz uma substância de marcação detectável, esta pode ser directamente ligada, como por exemplo, por ligações covalentes, à amostra ou pode ser ligada indirectamente, tal como por incorporação da substância realmente detectável numa microcápsula ou liposoma que por sua vez está ligado à amostra detectável.

Desenvolveram-se materiais de marcação no campo de ensaios de 20

imunidade e, na generalidade, a maioria das marcas úteis em tais processos podem ser aplicadas no processo de acordo com a presente invenção. São particularmente úteis os grupos en-zimaticamente activos, tais como enzimas (ver Olin, Chem.. (1976) 22:1232), Patente Norte-Americana Republicada N2. ... 31 006, Patente Britânica N2. 2 019 408), substractos de enzimas (ver Patente Norte-Americana N2. 4 492 751), coenzimas (ver Patentes Norte-Americanas N2. 4 230 797 e N2. 4 238 565)> e inibidores de enzimas (ver Patente Norte-Americana N2. ... 4 134 792); substâncias fluorescentes (ver Clin. Chem., (1979) 25:353); oromóforos; agentes luminescentes tais como quimio-luminescentes e biolumenisoentes (ver Patente Norte-Americana N2. 4 380 580); ligandos espeoificamente ligáveis tais como biotina (ver Memória Descritiva da Patente Europeia Número 63879) ou um heptano (ver Publicação da Patente POT. 82-2286); e radioisótopos tais como ^H, 35g, ^2P, 12^I e ^C. Estes mar-· cadores são detectados com base nas suas próprias propriedades físicas (por exemplo substâncias fluorescentes, cromófo-ros e radioisótopos) ou na sua reactividade ou propriedades de ligação (por exemplo ligandos, enzimas, substratos, coenzi-j-mas e inibidores). Por exemplo, espécies marcadas com um eo-factor podem ser detectadas adicionando a enzima (ou enzima quando se usa um sistema cíclico) para a qual a marcação é um cofactor e um substrato ou substratos para a enzima. Uma espécie marcada com hapteno ou com ligando (por exemplo, biotina) pode ser detectada adicionando um anticorpo ao hapteno ou uma proteína (por exemplo avidina) a qual liga o ligando, marcado com uma molécula detectável. Essa molécula deteetável pode ser uma molécula cujas propriedades físicas são mensuráveis (por exemplo, fluorescência ou absorvância) ou uma molécula que participe numa reaeção enzimática (por exemplo, ver a lista acima). Por exemplo, pode-se usar uma enzima que actu^ sobre um substrato para originar um produto com uma propriedade física mensurável. Exemplos desta última compreendem, fk

mas não se limitam, à beta-galacto-sidase, fosfatase alcalina e peroxidase alcalina.

Os processos para a preparação de um material de iniciação usados numa forma de realização preferida da presente invenção estão facilmente disponíveis de acordo com a técnica anterior. Quando se procede à marcação, usam-se processos sintéticos que são eficazes para se modificar os ácidos nuclei-cos sem se interferir substancialmente com a capacidade dos materiais de iniciação marcados participarem na hibridização e ampliação e seleccionam-se marcadores que sejam suficientemente estáveis sob as condições de ampliação e subsequente detecção. Relativamente aos métodos sobre a detecção de aglutinação veja-se Grieco e Meriney, Immunodiagnosis for Clini-cians (1983), Capítulo 2. A invenção será agora descrita com referência aos seguintes exemplos não-limitativos.

Exemplo 1 A sequência do gene humano de beta-gl-obina é usada como um sistema modelo para a presente invenção. Qualquer sequência conhecida pode ser amplificada por selecção apropriada dos primários imobilizados.

Uma sequência IP ou mais curta 5' ACA0AACTG!EG!D2CAC!DAGC 3' e uma sequência CP ou inais-curta CP 3* OCACITGCACCTACIÍECAAC 5'

Estes oligonueleótidos e a sua relação com as sequências glo- 22 22

U bina do alvo foram publicados por Saiki et al, Science, 230, 1350, (1985).

Os materiais de iniciação para oligonucleótidos são modificados colocando um ligante com uma cadeia de átomos de carbono com um grupo amina terminal na extremidade 5' de cada oligo-nucleótido usando para o efeito reagentes e protocolos disponíveis em Applied BioSystems, Supra. 0 material de iniciação modificado pode ser ligado oovalentemente a uma superfície tridimensional. A concentração local do material de iniciação para a - suporte sólido imobilizado é maior do que a concentração média em solução. Antes de se proceder à ligação co> valente entre os oligonucleótidos de iniciação modificados e o substrato sólido, os primários modificados são submetidos a reacção termocíolica para determinar se a modificação do material de iniciação afecta adversamente a amplificação. Tal como se mostra na Fig. 3, a formação de uma sequência de 110 pares de bases definidos pelos materiais de iniciação não foi afectada adversamente pela presença de um grupo NHg na extremidade 5’ dos materiais de iniciação. Podem-se usar ligantes alternativos tais como radicais alquilo, por exemplo, em ou em C^2‘ Reconhece-se também que é possível usar ligantes iguais ou diferentes para imobilizar e/ou marcar os materiais de iniciação. A escolha dos ligantes baseia-se na ausência de interferência de amplificação da sequência do nucleótido. Por exemplo, quando a transcrição se faz afastada do suporte sólido, podem-se usar ligantes mais curtos. Podem ser necessários ligantes mais longos para alguns suportes sólidos quando a transcrição se faz no sentido do suporte sólido.

Os oligonucleótidos modificados foram eovalentemente ligados a esferas de (CMS) clorometil-estireno na presença de um tampão de borato. As esferas foram levadas e peletizadas para remover qualquer oligonucleótido não ligado. 23

As esferas, aproximadamente 200yul numa suspensão aquosa que contém WP e OP imobilizadas, são adicionadas a uma solução (1 ml) que contém tris 10 mM de pH 7,5, NaCl 50 mM, MgClg 10 mM e trifosfatos de desoxinucleótido. 1,5 mM (todos estes quatro compostos). São aquecidos a 37°C durante 10 minutos e adicionam-se 20 unidades de fragmento de Klenow de polimerase ATM de E. coli (PL-Biochemical). Permite-se que a reacção proj, siga durante 5 minutos. A solução é então centrifugada numa microcentrifugadora e usando um trifosfato de desoxinucleósi-do como substrato radiactivo, calcula-se a reacção de fundo pela contagem de radioactividade das esferas num contador de cintilação.

Depois de se ter adicionado (0,1 yUg) 10 ja.1 de uma amostra aquosa de ATM humano arrefecida em gelo e desnaturada a quente (100°C), repete-se a reacção. 0 ciclo é repetido por aquecimento da mistura total num banho-maria em ebulição e arrefecendo-a rapidamente até 37°C. Em ciclos adiciona-se uma alíquota de enzima fresca (2 unidades).

As operações de aquecimento e de arrefecimento repetidas pode ter como resultado a aglutinação ou a agregação das esferas deixando-os num estado inferior ao estado óptimo para a am-pliação e analização. Os processos conhecidos na técnica para minimizar este problema incluem o uso de produtos tais como "IWEEN 80", glicina e albumina de soro bovino (BSA). Um destes compostos ou uma sua combinação adicionada após se ter realizado a ligação covalente modificada do oligonucleótido pode resolver este problema. 0 produto final é colectado sob a forma de uma sequência ampliada e modificada por centrifugação numa microcentrifugadora. 0 ácido nucleico obtido imobilizado ê então.ensaiado de três maneiras diferentes, nomeadamente, como se segue: 24

(D hibridização com um nonadecâmero marcado; (2) digestão com duas enzimas (Science, 230, 1350 (1985)); (3) detecção directa com ou sem qualquer digestão de restrição.

Os resultados da amplificação estudados por electroforese em gel de agarose são representados na Figura 2.

Exemplo 2: Hibridização com um nonadecâmero marcado Hibridizável com amostras de oligonuoleótidos marcados 0 produto prolongado imobilizado nas esferas é desnaturado por aquecimento num banho de água em ebulição e depois congelado em gelo. Tal como se descreve abaixo, as esferas são en~ tão hibridizadas com oligonucleótidos marcados com P. Preparou-se a seguinte mistura, para hibridização molecular: 450 jal de tampão EET 20x 750 jal de sulfato de dextrano a 20x 150 yul de água desionizada 75 yul de solução de Deihardfs lOOx 75 yU.1 de detergente HP-4Q. a 10 $ (Sigma) A esta mistura adicionou-se, um décimo da amostra do oligo-nucleótido preparado como é descrito por N. Dattagupta, D. Rabin, G-. Michaud e P.M.M, Rae, "A Simple Method for Genera-tion of High Specific Activity oligonucleotide Probes», Bio-techniques. Vol. 5, Ns. 1, 38-43 (1987). A concentração final da amostra do nonadecâmero ê aproximadamente 1 nanomolar. A Requerente descobriu que a adição de uma maior quantidade de 25

amostra do que esta tem como resultado um aumento da intensidade do fundo. Para preparar uma amostra marcada para uma única ou para algumas reacçães, a técnica de marcação como acima se descreveu pode ser feita reduzindo proporcionalmente as quantidades usando menos primário, substância modelo dGTP e dATP. Uma reacção a 0,1X pode ser realizada em 10yul, uma reao ção 0,2X pode ser realizada sobre 20 nl, etc. Quando o volume o permita, não é necessário evaporar à secura o /alfa J P7-al-fa-AIP.

Esferas que contêm aproximadamente 0,5 ml da sequência são colocadas em saquetas de plástico (por exemplo "SEAL-A-MEAL", '•SEAL AND SA¥E", etc) com uma extremidade da esquerda aberta. Adiciona-se a mistura de hibridização radioactiva com uma pipeta de Pasteur ou com uma seringa com uma agulha do tamanho 21 e a outra extremidade é selada. A hibridização é conduzida durante 1 hora a 50°C.

Após a hibridização, as esferas são separadas por centrifugação em tubos de ensaio e lavados com 6 x SSC (solução salina de citrato de sódio) durante 15 minutos com agitação suave.

Para lavagem sequencial, os leitos são transferidos para tubos de cultura de 1,5 ml previamente aquecidos que contêm 1,4 ml SSC 6X. Os tubos são novamente colocados num banho-maria de circulação a 57°C durante 10 minutos. 0 líquido é rapidamente centrifugado, e é então adicionada uma nova porção de 1,5 ml de SSC 6X, os tubos são então novamente colocados no banho-maria durante 10 minutos, o líquido é novamente centri-fugado e o líquido sobrenadante é então rejeitado. A radio-actividade no tubo é então avaliado com um contador de cintilação. A radioactividade associada ao leito ê a medida de hibridização e portanto a indicação de presença do gene a ensaiar na amostra original. / 26

Exemplo 3:

Digestão com duas enzimas lai como foi descrito por Saiki et al., Science, 230» 1350, (1985), o produto amplificado do Exemplo 1 pode ser ensaiado por hibridização e posteriormente por digestão de restrição e separação por eleotroforese em gel ou por cromatografia em camada fina.

Exemplo 4: Detecção directa 0 produto amplificado pode ser directamente ensaiado usando um trifosfato de nucleósido que contém um marcador como substrato para a reacção de amplificação/prolongamento. Quando, por exemplo, se usa um trifosfato de nucleósido marcado com 32p ou fluorescência ou biotina como substrato, a incorporação dos marcadores nos ácidos nucleicos prolongados é a indicação directa dos processos específicos e portanto da presença de uma sequência a ensaiar específica. Após a amplificação os ácidos nucleicos prolongados estão em esferas e a presença de qualquer dos marcadores no leito indica a presença da sequência a ensaiar. Os ensaios com a fluoresceína, biotina e O p P são bem conhecidos na prática. Podem ser usados com esta finalidade outros marcadores vulgares. A diferença em termos de propriedades físicas das esferas podem também ser usada para a detecção. Podem também ser usadas com o objectivo de detecção a imobilidade electroforética, a densidade num campo de centrifugação e as propriedades croma-tográficas.

Exemplo 5: Imobilização de um oligonuoleótido num látex de poliestireno 27

Partículas de látex de poliestireno que contem 75 $ de grupos clorometilo preparadas por polimerização de estireno e cloro-metilo estireno em emulsão foram lavadas e desionizadas num leito misto de resina como se segue: colocaram-se 2 g de leito misto de resina AG501-X8 (Biorad, Richmond, Cal., EUA) num tubo de ensaio de vidro corex de 30 ml. Adicionaram-se ao tubo 2 ml de água desionizada e 1 ml de uma suspensão a 10 ^ de resina. A mistura foi agitada durante uma hora à temperatura amhiente. A suspensão foi então filtrada através de um funil de vidro sinterizado para colectar as esferas como filtrado. 0 leito de resina foi então lavado com 1 ml de água desionizada. A lavagem e a desionização com o leito misto de resina foram repetidas uma vez. 0 produto final lavado foi armazenado a 4°C para um tubo de vidro. Esta técnica é usada como rotina para desionizar e lavar partículas de látex. A imobilização de oligonueleótidos que contêm amina primária foi realizada como se segue. Colocaram-se num tubo de micro-centrifugação (1,5 ml) 400 microlitros de borato de sódio 10 ml (pH 8,3) e adicionaram-se 100yul de partículas de látex lavadas (aproximadamente 2 mg) seguidos de 10 microlitros dos oligonucléótidos a uma concentração de 1 jag/jal do mesmo tampão. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 4 horas. Os grupos de clorometilo que não reagiram foram bloqueados pela adição de 500 microlitros de glicina 100 mM, "IWEEN 20” a 0,1 $ à temperatura ambiente durante 18 horas. A suspensão foi então centrifugada para remoção dos materiais que não reagiram e foi lavada com glicina lOOmM, ”ÍEWEEI 20” e albumina de soro bovino a 1 fo. As partículas de látex foram então armazenadas no tampão de lavagem a 4°C.

Pode-se usar um processo semelhante para ligar um oligonucleó-tido com ligante de amino (que contêm - EHg) a um qualquer suporte sólido que seja reactivo com o grupo amino.

Exemplo 6 - Ampliação de uma sequência de gene de cópia simples humano e detecção do produto

Este exemplo foi realizado para demonstrar a praticabilidade do aso de um oligonucleótido de inicialização imobilizado para amplificação. Uma mistura reaccional típica de 100 micro-litros contém os seguintes ingredientes: 1 microlitro de uma mistura de trifosfato de desoxinucleósido de todos os quatro nucleósi-dos, 25 mM cada, 2 microlitros de gelatina, 10 microgramas por microlitro, 2 microlitos dos oligonucleótidos de iniciação solúveis, 1 micrograma por microlitro, 10 microlitros de material de iniciação imobilizado, x microlitro do modelo (a concentração pode ser tão baixa como um picograma) 2,5 unidades de uma ADN polimerase termoestável (1 microlitro de polimerase taq de New Bnglanc. Biolab) e (100-(x+16) microlitro de um tampão que contém KC1 50 mMj tris lOmM pH 8,4; MgClg 2,5 mM. A mistura foi então processada com 30 a 35 repetições dos ciclos de aquecimento-arrefecimento que se seguem: a mistura foi aquecida a 95°C, depois arrefecida até 40°C para analização e novamente aquecida a 70°C para ampliar. No fim do último ciclo, a mistura foi mantida a 70°C durante 10 minutos para completar o último ciclo. As amostras foram então analizadas em gel de agarose. Os resultados são represen-

tados na Pig. 2. 0 produto da amplificação da esquerda para a direita asando pss 737 como amostra (Geever et al., (1981), Proc. Hat. Acad. Soi., US, 78, 5081-5085) é como se segue: S*/pss ♦ • ambos os materiais de iniciação em solução 6, 7* • « 7 marcado com rodamina e em solução; 6 imobilizado 6*, 7 0 0 6* marcado com rodamina e em solução; 7 imobilizado S*/AA 0 è amostra de ácido nucleico de AM contendo o gene de beta-globina normal, ambos os materiais de iniciação em solução e marcados 6, 7*/AA 0 • M/ 6 é imobilizado; 7 marcado e em solução e gene de beta-globina normal que contém AM 6*, 7/AA • • 7 é imobilizado; 6 é marcado e em solução e gene de beta-globina normal que contém AM 5Κ / siC / S /ss, 6, 7 /ss e 6 , 7/ss iguais aos três dltimos, excepto que as amostras a ensaiar provinham de um paciente com células de drepamocitose. 0 X 174-Hae III é um ácido nucleico marcador. o p

Se um dos desoxi-FIP é marcado, por exemplo, com P, a con- tagem directa de radioactividade antes e depois da digestão da restrição fornece a informação acerca da sequência. A sequência do oligonucleótido imobilizado 6 era a mesma que a do material iniciador WP da Figura 1 com a adição de dez adeninas na extremidade 51 A sequência do outro material iniciador 7, era a mesma que a do material de iniciação CP do Exemplo 1 com a adição de dez adeninas na extremidade 5 *. A quantidade do modelo usada foi igual a cerca de 1 picogra-ma.

Exemplo 7; Especificidade da amplificação A amplificação realizada como se descreveu no Exemplo 5 apenas com pss 737 usando materiais iniciadores é representada na Figura 3. As mesmas notações aplicadas na Figura 2 são novamente usadas. I) representa a digestão com uma endonuclease de restrição B de I. A digestão do fragmento de 110-130 p b não-imobilizado, representada nas baixas designadas 1,2/D; 6,7/D; 6,2/D e 6*, 7m/T) tem Gomo resultado a obtenção de dois fragmentos de igual comprimento porque o sítio de restrição Dedel está localizado centralmente. A digestão do fragmento de 110-130 pb imobilizado, representada na faixa designada por 6,7*/D> tem como resultado num único fragmento solúvel e um segundo fragmento ligado ao leito de mobilidade menor. 31

Exemplo 8: Uso de oligonucleótidos de inioiaoão marcados oom substâncias fluorescentes para amplificação A técnica foi dêntica à descrita para o Exemplo 6, excepto que foi usado um oligonucleótido de iniciação marcado com ro-damina em vez de oligonucleótido de iniciação soldvel não modificado, Os oligonucleótidos marcados foram sintetizados num sintetizador (APPLIED BIOSISIEMS, 380) e derivatizados de a-cordo com o protocolo fornecido por APPLIED BIOSYSTEMS usando para tal os produtos químicos fornecidos. As sequências dos iniciadores e o modelo usado foram os mesmos que no Exemplo 6.

Exemplo 9 i Amplificação e análises da Chlamydia trachomiti»

Usando os processos descritos nos Exemplos anteriores em que os oligonucleótidos modifioados podem ser usados com sucesso para a análise de uma sequência específica por amplificação da amostra, empregou-se uma das formas de realização da presente invenção para a análise da presença dum organismo por via sexual. Os oligonucleótidos de iniciação foram escolhidos de tal forma que correspondem à região conservada de uma proteína vulgar da Ohlamydia traohomitis para cohrir todos os se--rotipos e a sequência amplificada deve possuir a variabilidade suficiente para proporcionar informação sobre os serotipos específicos. As sequência que foram escolhidas para o presente exemplo correspondem aos resíduos do nucleótios da sequência que codifica a proteína da membrana mais externa maiori-tária do organismo. A sequência corresponde aos resíduos 1293 a 1313 para um iniciador e ê complementar dos resíduos 1527 a 1547 para 0 outro iniciador /R. S. Stephens, J. Baoterioloy, 169, 3879 (1987,27· Isso produz um fragmento de 255 pb do ADN como produto amplificado. As condições usadas para a amplifi- 32

cação foram idênticas às usadas no Exemplo 6 e a análise por eleotroforese em gel demonstrou a formação do produto esperado.

As sequências do uneicosâmêros são as seguintes: 5’ amino- CAA GOA AGT ΪΤΑ GCI OTO TCI e 5* amino- AGA ITT TOI AGA ITT ΟΑΪ CTT.

Os iniciadores foram modificados e marcados com rodamina tal como se descreveu previamente. Os iniciadores foram adicionados a uma amostra que continha o ADN genómico da Chlamydia total. Depois da amplificação o oligonucleótido marcado que não reagiu foi separado por electroforese em gel de agarose. ADN de rato foi usado como controlo visto que a Chlamydia tinha sido desenvolvida em células hospedeiras de ratos. A banda corada e o controlo correspondente foram cortados e fotografados como se mostra na Fig. 4.

Pode também usar-se a simples centrifugação ou filtração para a separação dos oligonucleótidos de iniciação (marcados) corados não incorporados.

Os iniciadores marcados imobilizados proporcionam um ensaio sensível, específico e facilmente analisável que pode ser completamente automatizado. Uma amostra de um paciente com a adição de iniciadores imobilizados ou marcados imobilizáveis, submetida a termociclos pode proporcionar um ensaio para diagnóstico clínico rápido.

Note-se que a presente memória descritiva e reivindicações são apresentadas a título de ilustração e não de limitação e que várias modificações e alterações podem ser feitas sem afastamento do espírito e do âmbito da presente invenção.

Claims (1)

1. 33

   REIVINDICAÇÕES lã. - Processo para amplificar sequências de ácido nucleico de um alvo específico, preferivelmente, oligonueleótidos, numa amostra, caracterizado pelo faoto de (a) se promover o contacto, sob condições de hibridização (i) de um primeiro ácido nucleico e um segundo ácido nucleico primários, sendo um dos mencionados primeiro ou segundo ácidos nucleicos primários imobilizado ou imobi-lizável, de preferência numa substância sólida, e sendo o outro imobilizado ou imobilizável ou marcado com (ii) uma amostra a ensaiar que contém sequências de áGido nucleico alvo; (b) se fazer contactar o produto obtido na fase (a) com uma enzima de amplificação e pelo menos um resíduo de nucleó--tido, preferivelmente trifosfato de nucleótido, para amplificação sob condições propícias para alongar os ácidos nucleicos primários híbridos resultantes, preferivelmente num sentido oposto ao citado substrato sólido; (c) se desnaturar o produto da operação (b), para se produzir sequências de ácido nucleico do alvo imobilizadas, e (d) se repetir, pelo menos uma vez, um ciclo de operações (a), (b) e (c), usando o produto da fase (c) do ciclo anterior em vez de (a) (ii). 2i. - Processo para detectar sequências de ácido nucleico de um alvo específico, prefèrivelmente, oligonueleótidos, numa amostra, caracterizado pelo facto de (a) se promover o contacto sob condições de hibridização de (i) um dos citados pri-j-meiro e segundo ácidos nucleicos primários, sendo um dos referidos primeiro ou segundo ácidos nucleicos imobilizado ou é 4

   imobilizável, de preferência num substrato sólido, sendo o outro imobilizado ou imobilizável ou marcado, com (ii) uma amostra a ensaiar em que se suspeita existirem sequências de ácido nucleico do alvo, (b) se promover o contacto do produto obtido em (a) com uma enzima de amplificação e pelo menos um resíduo de nucleótido, preferivelmente, um trifcsfato de nucleósido marcado, para amplificação em condições favoráveis para o alongamento dos ácidos nuleicos híbridos resultantes, preferivelmente num sentido oposto ao referido substrato sólido; (e) se desnaturar o produto obtido na operação (b), para se produzirem sequências de ácido nucleico do alvo imobilizadas; (d) se repetir, pelo menos uma vez, um ciclo de operações (a) (b) e (c), sendo o produto obtido em (c) do ciclo anterior usado em vez de (a) (ii), e (e) se determinar se está presente uma sequência amplificada. 3â. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de, na operação (e), se submeter a condições de hibridização o produto obtido em (d) segundo a reivindicação 2, com uma amostra marcada hibridizável com a sequência que está a ser ensaiada e se determinar se, de facto, ocorreu a hibridização. 4®. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de se efectuar a detecção determinando se existe uma diferença nas propriedades físicas das sequências de ácido nucleico de alvo específico, em que a citada diferença numa propriedade física é determinada por electroforese, centrifugação, cromatografia por permeação de gel ou microscopia. 5a. - Processo para detectar a presença ou a ausência de pelo 35

   menos uma sequência específica de ácido nucleico numa amostra que contém um ácido nucleico ou uma combinação de ácidos nu-cleicos; ou para distinguir entre duas sequências diferentes na mencionada amostra, em que se suspeita que a citada amostra contém a referida sequência ou as mencionadas sequências, numa amostra, caracterizado pelo facto de (a) se tratar a mistura da amostra com pelo menos um oligo-nucleótido primário imobilizado para pelo menos uma das cadeias laterais de cada sequência específica diferente, sob condições de hibridização tais que, para cada cadeia lateral de cada sequência diferente com a qual um primário é hibridizado, se sintetiza um produto de prolongamento de cada primário, o qual é complementar de cada cadeia lateral de ácido nucleico, em que o referido primário ou os mencionados primários são seleccionados de forma suficientemente complementares de cada cadeia lateral de cada sequência específica para se hibridizarem com ela, de forma que o produto do prolongamento sintetizado a partir de um primário, quando é separado do seu complemento, pode servir como modelo para a síntese do produto de prolongamento do outro primário e preferivelmente pelo menos um dos mencionados oli-primários é um oligonucleótido marcado; (b) se tratar o produto da operação (a) sob condições de desnaturação, para separar os produtos de prolongamente dos primários dos respectivos modelos; e (c) se repetir a operação (a) com o produto da operação (b), resultando na amplificação da sequência ou das sequências específicas do ácido nucleico, o qual é um produto final imobilizado, sendo depois analisado o citado produto final imobilizado. 6-. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado 36

   pelo facto de se analisar o produto final imobilizado (i) marcando o produto final imobilizado antes ou depois da separação do produto final da mistura que constitui a amostra; e (ii) analisando o produto final marcado. 7^. - Processo para detectar a presença ou a ausência de pelo menos uma sequência específica de um ácido nucleico numa amostra contendo um ácido nucleico ou numa combinação de ácidos nucleicos, suspeitando-se que a amostra contenha a referida sequência ou as referidas sequências numa mistura, caraeteri-zado pelo facto de; (a) se tratar a mistura que constitua amosira com pelo menos um oligonucleótido primário imobilizável de preferência, um oligonucleótido marcado para pelo menos uma de cada cadeia lateral de cada sequência específica diferente, sob condiçóes de hibridização, tais que, para cada cadeia lateral de cada sequência diferente, com a qual um primário é hibridizado se sintetiza um produto de prolongamento de cada primário, o qual ê complementar de cada cadeia lateral de ácido nucleico, em que o referido primário ou os mencionados primários são seleecionados de forma a serem suficientemente complementares de cada cadeia lateral de cada sequência específica, para se hi-bridizarem com ela, de forma que o produto do prolongamento sintetizado a partir de um primário, quando ê separado do seu complemento, pode servir como modelo para a síntese do produto de prolongamento do outro primário, (b) se tratar o produto da operação (a) sob condições de desnaturação, para separar os produtos de prolongamento dos primários, dos respectivos modelos;

   (ο) se repetir a operação (a) com o produto da operação (b), resultando na amplificação da sequência ou das sequências específica(s) do ácido nucleico, o qual á um produto final imobilizável, e (d) se analisar o produto final imoMlizável. 8^. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de a análise do produto final imoMlizável compreender as seguintes fases que consistem em (i) se separar o produto final imoMlizado da mistura da amostra, (ii) se imoMlizar o produto final, (iii) se adicionar ao produto da fase (ii) um marcador para se ligar ao produto final imobilizado e (iv) se analisar o produto final rotulado. 9a. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo facto de a citada análise do produto final imobilizável compreender ainda as operações que consistem em (i) se adicionar ao produto final proveniente da fase (c) um marcador que se liga com o produto final imobilizado; (ii) se imobilizar o produto final marcado; (iii) se separar o produto final imobilizado e marcado da mistura da amostra; e (iv) se analisar o produto final marcado. 10-. - Equipamento portátil para a realização prática do pro- 38

   cesso de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por compreender um ou mais recipientes que contêm (a) um ácido nucleico primário imobilizado ou imobilizável; (b) um ácido nucleico imobilizado, imobilizável ou marcado; (c) uma enzima de prolongamento; (d) pelo menos um resíduo de nucleótido para prolongamento e, preferencialmente, (e) um oligonucleótido hibridizável marcado específico para a detecção da sequência amplificada. lisboa, 13 de Dezembro de 1989 0 Agente Oficial da Propriedade Industrial L Mrk® da Silva Carvalho Agente Oficial de Propriedade Induítriat R. Castilho, 201-3. £.-1000 LiSSOA Telefs. 65 13 39 - Ó5 46 13