PT90386B - Processo e dispositivo para a determinacao colorimetrica de compostos quimicos e bioquimicos (analitos) em fluidos aquosos - Google Patents

Description

Descrição referente a patente de invenção de LifeScan, Inc., norte—americana, industrial e comercial, estabelecida em 2443 Wayandotte Street, Mountain View, CA 94043—2312, Estados Unidos da America,(inventores: Roger Phillips, Geoffery McGar raugh, Franklin A. Jurik e Ray mond D. Underwood, residentes nos E.U.A.), para ⁿPROCESSO E DISPOSITIVO PARA A DETERMINAÇÃO COLORIMÊTRICA DE COMPOSTOS QUÍMICOS E BIOQUÍMICOS (ANALÍTICOS) EM FLUIDOS AQUOSOS».

DESCRIÇÃO âmbito da invenção

A presente invenção refere—se a um processo e dispositivo de ensaio para determinação colorimetrica de componentes químicos e bioquímicos (analíticos) em fluidos aquosos especialmente sangue completo. Numa realizaçao preferida refere—se a um processo e dispositivo de ensaio para medir a concentração de glicose no sangue completo por meio de colori metria.

Antecedentes da invenção

Ê de uma importância cada vez maior a quanti—

N.

ficaçao de componentes químicos e bioquímicos em fluidos aquo sos coloridos, especialmente fluidos biológicos coloridos como o sangue completo e a urina e derivados de fluidos biológi cos como o soro sanguíneo e plasma sanguíneo. Existem importantes aplicações no diagnóstico e tratamento médico e na quan w 4* A tificaÇao da exposição a medicamentos terapêuticos, intoxican tes, produtos químicos perigosos e análogos. Por vezes, as quantidades de materiais a ser determinados sao ou tao minus— culos — na variaçao de um micrograma ou menos por decilitro — ou tao difíceis de determinar com precisão que o aparelho uti

Iizado ê complicado e útil só para pessoal de laboratório es— ** pecializado. Neste caso os resultados nao estão geralmente dis poníveis em algumas horas ou dias após a recolha da amostra. Noutras vezes, ha normalmente uma enfase na aptidao de operadores leigos para realizar o teste de modo rotineiro, rápido e reproduzível fora de um ambiente de laboratório com rápida

Μ M ou imediata apresentaçao da informação.

Um ensaio ou análise médica comum ê a medição dos níveis de glicose do sangue por diabéticos. Ensinamentos correntes aconselham os doentes diabéticos a medir o seu nível de glicose do sangue desde duas a sete vezes por dia dependendo da gravidade da doença ou dos seus casos individuais. Baseando—se no modelo observado nos níveis de glicose medidos, o doente e o médico juntos fazem ajustes na dieta, exercício e injecçao de insulina para controlar melhor a doença. Claro que esta informação deve estar de imediato à disposição do do en te.

Actualmente um método largamento utilizado nos Estados Unidos emprega um artigo de ensaio do tipo descrito na Patente Norte Americana n2 3 298 789 emitida em 17 de Janeiro de 1967 a Mast. Neste método coloca—se uma amostra de sangue completo, fresco, (normalmente 20—40 pl) numa almofada de reagente revestida de etil—celulose que contêm um sistema de en zimas possuindo actividade de glicose oxidase e peroxidase. 0 sistema de enzimas reage com a glicose e liberta peróxido de hidrogénio. A almofada também contêm um indicador que reage com o perôxido de hidrogénio na presença de peroxidase para proporcionar uma cor proporcional em intensidade ao nível de glicose da amostra.

Um outro método de ensaio de glicose do sangue emprega química semelhante mas em vez da almofada revesti da de etil—celulose emprega uma película resistente à água através da qual se dispersam as enzimas e o indicador. Este gênero de sistema está descrito na Patente Norte Americana 363O 957 emitida em 28 de Dezembro de 1971 a Rey et al.

Em ambos os casos deixa—se que a amostra permaneça em contacto com a almofada de reagente durante um determinado tempo (normalmente um minuto). Então, no primeiro caso, lava—se a amostra de sangue com uma corrente de água en quanto no segundo caso se limpa a película. A almofada de reagente ou a película ê então seca por enxugamento e avaliada. Faz—se a avaliaÇao quer por comparaçao da cor obtida com uma tabela de cores ou por colocaÇao da almofada ou película num instrumento de reflectáncia para leitura de um valor da inten sidade da luz.

Embora se tenha utilizado durante anos os métodos referidos anteriormente para controlar a glicose, estes apresentam certas limitações. 0 tamanho da amostra necessária ê bastante grande para um teste de picada de dedo e ê difícil «v de obter para algumas pessoas cujo sangue capilar nao se mani feste de imediato.

Além disso, estes métodos partilham uma limi— ** ** # taçao com outras simples determinações colorimetricas para operadores leigos em que o seu resultado ê baseado numa leitu ra de cor absoluta a qual está por sua vez relacionada com a extensão absoluta da reacçao entre a amostra e os reagentes de teste. 0 facto de a amostra ter de ser lavada ou limpa da almofada de reagente apos o intervalo de tempo da reacçao exi ge que o utilizador esteja pronto no fim do intervalo de tempo e limpe ou aplique um fluxo de lavagem na altura devida· 0 facto de a reacçao parar por remoção da amostra conduz a algu ma incerteza no resultado, especialmente nas maos so utilizador doméstico. Uma lavagem excessiva pode apresentar resultados baixos e uma lavagem insuficiente pode apresentar resulta dos elevados.

Um outro problema que muitas vezes existe em determinações colorimêtricas simples para operadores leigos ê o da necessidade de se iniciar uma sequência de tempo quando se aplica o sangue a uma almofada de reagente. Um utilizador provocará normalmente uma picada num dedo para obter uma amos tra de sangue e necessitara então de» simultaneamente» aplicar o eangue do dedo a uma almofada de reagente enquanto ini— cia um circuito de tempo com a sua outra mao» necessitando por isso das duas maos simultaneamente. Isto e particularmente di fícil visto que ê muitas vezes necessário assegurar-se que o circuito de tempo começpu apenas quando se aplicou o sangue à almofada de reagente. Todos os métodos da técnica anterior ne

M ** cessitam de manipulações adicionais ou circuiçao adicional pa ra se obter este resultado. Assim, ê desejável a simplifica— çao desta característica dos instrumentos de leitura por re— f lectancia.

A presença de glóbulos vermelhos ou outros componentes coloridos interfere muitas vezes com as medições destes valores absolutos, exigindo-se assim a exclusão de glé bulos vermelhos nestes dois métodos anteriores como se tem largamente praticado. No dispositivo da Patente Norte America na nfi 3 298 789, uma membrana de etil—celulose impede os glóbulos vermelhos de entrar na almofada de reagente. Do mesmo modo, a película à prova de água da Patente Norte Americana nfi 3 630 957 impede os glóbulos vermelhos de entrar na almofa da. Em ambos os casos a lavagem ou limpeza também actua na re moção destes globulos vermelhos que interferem potencialmente, antes da medição.

- 4 Deste modo, permanece a necessidade de um sis tema de detecção de analitos em lxquidos coloridos, como o sanguej que nao necessite da remoção de liquido em excesso de uma tira de reflectância da qual se obtém uma leitura da re— flectância

Resumo da invenção

Proporcionam—se novos métodos) composiçoes e dispositivo para testes de diagnóstico que compreendem uma uma matriz porosa hidrofílica que contêm um sistema de produção de sinal e um dispositivo de medição de reflectância que _ ** A e activado por uma alteraçao na reflectância da matriz quando o fluido penetra na matriz. 0 método compreende a adiçao da amostra) normalmente sangue completo) â matriz que filtra par tículas grandes, como glóbulos vermelhos, normalmente com a matriz presente no dispositivo. 0 sistema de produção de sinal produz um produto que altera posteriormente a reflectân— cia da matriz, cuja alteraçao pode ser relacionada com a presença de um analito na amostra.

Exemplo do sistema de teste de diagnóstico ê a determinação da glicose no sangue completo, em que a deter— ** Λ minaçao se faz sem interferencia a partir de sangue e sem um protocolo complicado sujeito a erro.

•v

Breve descrição dos desenhos

A presente invenção pode ser melhor compreenΛ % ** dida com referencia a descrição pormenorizada que se segue quando lida em conjunto com os desenhos anexos, em que.*

A figura 1 ê uma vista em perspectiva de uma ** realizaçao de um dispositivo de ensaio que contem a almofada ** da reacçao a qual se aplica o fluido a ser analxzado)

A figura 2 ê um diagrama esquemático de um

- 5 dispositivo que pode ser utilizado na prática da presente in— vençao »

A figura 3 é uma vista em perspectiva de uma realizaçao preferida do dispositivo de ensaio da presente in— «w ** vençao colocado dentro de um sistema de medição*

A figura 4 ê uma vista planificada ampliada de uma realizaçao preferida do dispositivo de ensaio da pre— sente invenção colocado dentro de um sistema de medição*

A figura 5 δ um gráfico que assinala uma cor— recçao de segunda ordem para eliminar erros devidos a efeitos

Μ M da cromatografia durante a utilização da presente invenção *

As figuras 6a e 6b sao diagramas de varrimento dos valores de glicose conforme medidos por uma realizaçao preferida da presente invenção (denominado sistema MPX de com primento de onda simples) graficamente representados em oposi çao aos valores de glicose da Iellow Springs Instruments (YSIj e

As figuras 7a* 7b» 7c e 7d sao diagramas de varrimento de valores de glicose conforme medidos por uma se— gunda realizaçao preferida da presente invenção (denominada sistema MPX de comprimento de onda dual) graficamente representados em oposição aos valores de glicose da Yellow Springs Instriments” (YSI).

Descrição pormenorizada da invenção elemento reagente

A presente invenção proporciona uma metodologia melhorada rápida e simples que utiliza um dispositivo se— guro e facil de operar para a determinação de analitos como a glicose* envolvendo especificamente um substracto de enzima que resulta na produção de peróxido de hidrogénio como um pro

- 6 duto da enzima. 0 método inclui a aplicaçao a uma matriz poro sa de um pequeno volume de sangue completo» suficiente para saturar a matriz. Note—se que o presente sistema ê susceptí— vel de determinação de níveis de glicose a partir de leituras ópticas de amostras de sangue completo. Ê desnecessária a se— w ** paraçao do plasma do sangue da amostra» e a presente invenção evita a necessidade deste passo. Além disto» este sistema é - ** susceptivel de realizaçao de leituras correctas contanto que apenas um pequeno volume sature a matriz da tira de teste. Pa ra além deste limite» a leitura ê independente do volume. Ligados à matriz encontram—se um ou mais reagentes de um siste— ma de produção de sinal» que resulta na produção de um produ— to resultante numa alteraçao inicial na quantidade de reflectância da matriz. A matriz encontra—se normalmente presente ** A num dispositivo de medição da reflectancia quando se aplica o sangue. A amostra líquida penetra a matriz» resultando numa alteraçao inicial da reflectancia na superfície de medição. Faz—se então a leitura uma ou mais vezes após a alteraçao ini

Λ ** ciai da reflectancia para referir a alteraçao posterior da re flectancia na superficie de medição ou na matriz como resulta «tf «tf do da formaçao do produto da reacçao a quantidade de analito na amostra.

Para medições no sangue» especialmente medições de glicose» utiliza—se normalmente sangue completo como veículo de teste. A matriz contém uma enzima oxidase que produz peróxido de hidrogénio. Também contida na matriz estará uma segunda enzima» especificamente uma peroxidase» e um sis— «tf tema de corante que produz um produto de absorçao de luz con— juntamente com a peroxidase. O produto de absorçao de luz altera o sinal de reflectancia do sistema da matriz. Com sangue completo» as leituras fazem—se em dois comprimentos de onda diferentes» com a leitura de um comprimento de onda utilizada para separar a interferência de segundo plano causada pelo he matócrito» oxigenação sanguínea» e outras variáveis que podem afectar o resultado. Assim» a presente invenção ê susceptivel de analisar amostras de sangue completo.

- 7 Utiliza—se um elemento reagente que inclui a matriz e os membros do sistema de produção de sinal contidos na matriz. 0 elemento reagente pode incluir outros componen— tes para aplicaçaes especificas. 0 método requer a aplicaçao de um pequeno volume de sangue, que normalmente nao tenha sido sujeito a tratamento anterior (a nao ser um tratamento por opção com um anticoagulante)> à matriz. 0 periodo de tempo da medição e activado ou iniciado*pelo dispositivo detectando au ·* A tomaticamente uma alteraçao na reflectancia da matriz quando ** A o fluido penetra na matriz. A alteraçao na reflectancia para além de um periodo de temoo pré—determinado como resultado da formaçao do produto da reacçao esta então relacionada a quantidade de analito da amostra. A intensidade da fonte de luz utilizada para analisar a amostra ê, naturalmente» também cui dadosamente controlada e regulada para assegurar a possibili— dade de repetição da medição.

primeiro componente da presente invenção a considerar é um elemento reagente, por conveniência em forma de uma almofada, que inclui uma matriz porosa inerte e o com— *4 ponente ou componentes de um sistema de produção de sinal» cu jo sistema é susceptivel de reacçao com um analito para produ «4 4* zir um produto de reacçao de absorçao de luz, impregnado nos «4 4* poros da matriz porosa. O sistema de produção de sinal nao im pede de modo significativo o fluxo do líquido através da matriz.

A fim de auxiliar a leitura da reflectancia» é preferível que a matriz possua pelo menos um lado que seja liso e plano. Normalmente, forma—se a matriz numa folha fina com pelo menos um lado liso e plano. Em utilização, aplica—se a amostra de líquido a ser analisado a um dos lados da folha em que qualquer composto do teste presente passa através do elemento reagente por meio de acçoes de capilaridade, torcida, fluxo de gravidade ou difusão. Os componentes do sistema de «4 «4 produção de sinal presentes na matriz reagirao para proporcio ** 4W nar um produto de reacçao de absorçao de luz. A luz incidente

encontra o elemento reagente num local diferente do local ao qual se aplica a amostra. A luz e então reflectida a partir da superfície do elemento como luz reflectida difusa. Esta luz difusa ê recebida e medida, por exemplo pelo detector de um espectrofotómetro de reflectência. A quantidade de luz re flectida estará relacionada com a quantidade de analito na amostra, sendo normalmente uma função inversa da quantidade de analito na amostra.

A matriz

Cada um dos componentes necessários para a ** # produção do elemento reagente sera descrito em tempo. O primeiro componente e a própria matriz.

A matriz será uma matriz porosa hidrofílica à qual se ligam os reagentes de modo covalente ou nao—covalen—te. A matriz permitirá o fluxo de um veículo aquoso através da matriz. Permitirá também a ligaçao de composiçoes de proteínas à matriz sem significativamente afectar de modo adverso a actividade biológica da proteína, isto ê, a actividade enzimática de uma enzima. Na extensão a que as proteínas tem de ser ligadas de modo covalente, a matriz possuirá locais pa a* ra a ligaçao covalente ou pode ser activada por meios conheci dos pela técnica. A composição da matriz deverá ser reflecti— da e de espessura suficiente para permitir a formaçao de um ** corante de absorçao de luz no volume nao ocupado ou na superfície a fim de afectar de modo substancial a reflectância a partir da matriz. A matriz pode ser de uma composição uniforme ou um revestimento num substracto que proporcione as propriedades físicas e estrutura necessárias.

A matriz nao se deformará ao molhar—se, reten do assim a sua conformação e tamanho originais. A matriz possuirá uma absorçao definida, para que o volume que ê absorvido possa ser calibrado entre limites razoáveis, sendo as variações normalmente mantidas abaixo de cerca de 5θ%» de prefe

- 9 rência nao superiores a 10%. A matriz possuirá resistência à água suficiente para permitir a manufactura de rotina. A ma— triz permitira que os reagentes ligados de modo nao—covalente sejam distribuídos de um modo relativamente uniforme na super fxcie da matriz.

Como exemplos de superfícies de matriz estão as poliamidas, especialmente com amostras que involvam sangue completo. As poliamidas sao polímeros de condensação de moná— meros de entre 4 a 8 átomos de carbono, em que os monómeros sao lactamas ou combinações de diaminas e ácidos di—carboxíli cos. Tambám podem ser utilizáveis outras compósiçoes polimári cas que possuam propriedades comparáveis. As composiçoes de poliamidas podem ser modificadas para introduzir outros grupos funcionais que proporcionem estruturas de carga, para que as superfícies da matriz possam ser neutras, positivas ou negativas, bem como neutras, básicas ou ácidas. As superfícies preferidas sao as de carga positiva. Concluiu—se que esta car ga positiva aumenta quer a estabilidade quer a durabilidade.

Quando utilizada com sangue total, a matriz porosa possui de preferência poros com um diâmetro medio compreendido entre 0,1 e 2,0 jim, de preferência entre 0,6 e 1,0 pm. Quando a matriz porosa contám poros possuindo um diâmetro médio de 0,8 um, a amostra de sangue nao causará um efeito cromatográfico. Isto significa que a amostra de sangue nao procurará sair dos bordos da matriz circular. Pelo contrário, o sangue permanece localizado dentro de todos os poros da matriz e proporciona uma possibilidade de leitura uniforme de toda a matriz. Além disso, este tamanho de poro maximiza o efeito de nao—manchamento do sangue. Isto e, o tamanho do po— ro e simultaneamente cheio de modo adequado, mas nao cheio de mais, para que o nível do hematácrito de sangue nao seja a causa de a amostra necessitar de ser enxuta antes da leitura da amostra. Tambám se concluiu que os poros deste tamanho sao optimos quando se tem em consideração a durabilidade e a esta bilidade.

Um modo preferido de preparaçao do material poroso ê moldar o polímero hidrofílico num nócleo de fibras nao tecidas. As fibras do n&cleo podem ser de qialquer material fibroso que possuam a integridade e resistência descritas, como os poliásteres e poliamidas. 0 reagente que formará o produto de reacçao de absorçao de luz, que sera apresentado posteriormente em detalhe, está presente dentro dos poros da matriz mas nao obstrui a matriz para que a porção lxquida do veículo de teste, por exemplo sangue, ao ser analisado, possa fluir através dos poros da matriz, enquanto que as partículas tais como os eritrócitos, sejam retidas à superfície.

A matriz ê reflectiva de modo substancial paΛ ** ra que proporcione uma reflectancia difusa sem a utilização de um suporte reflectivo. De preferencia pelo menos 25%, com maior preferência pelo menos 5θ%> da luz incidente aplicada a matriz á reflectida e emitida como reflectancia difusa. Utili za—se normalmente uma matriz de espessura inferior a 0,5 mm, sendo preferível com espessura compreendida entre 0,01 mm e 0,3 mm. Ê ainda de maior preferência uma espessura entre 0,1 mm e 0,2 mm, especificamente para matriz de nylon.

Normalmente, a matriz estará ligada a um suporte a fim de lhe proporcionar forma física e rigidez, embo— ra isto possa nao ser necessário. A figura 1 apresenta uma realizaçao da presente invenção em que há uma tira 10 que pos sui uma fina almofada de matriz hidrofílca 11 colocada numa extremidade de um suporte de plástico ou pega 12 por meio de um adesivo 13 que une de modo firme e directo a almofada de reagente 11 a pega 12. Existe um furo 14 no suporte de plásti co 12 no local ao qual está ligada a almofada de reagente 11 para que se possa aplicar a amostra a um dos lados da almofada de reagente e a luz reflectida a partir do outro lado.

Aplica—se uma amostra de líquido a ser testado a almofada 11.

Geralmente, com sangue como exemplar de uma amostra a ser testada, a almofada de reagente será na ordem dos 10 nm|2 a 100 mm^ de área, especialmente 10 mm^ a 5θ mm^ de área (ou possuindo um diâmetro de cerca de 2 mm a 10 mm), a qual tem normalmente um volume que ficará mais do que saturado com 5—Ιθ microlitros de amostra. Naturalmente, uma vez atingida a saturaÇao acima dos limites de 5—10 microlitros , nao e necessária qualquer outra quantidade de sangue.

# **

Efectuaram-se na técnica anterior medições de reflectáncia difusa utilizando um suporte reflectivo unido ou colocado atrás da matriz. Tal suporte nao é necessário ou estará presente normalmente durante a prática da presente inven çao, quer como parte do elemento reagente ou do dispositivo de reflectáncia.

Como se pode observar na figura 1, o apoio se gura a almofada reagente 11 para que se possa aplicar uma amos tra a um lado da almofada de reagente 11 enquanto se mede a reflectáncia da luz a partir do outro lado da almofada de reagente 11 oposto ao local onde se aplica a amostra·

A figura 2 representa um sistema em que o rea gente se aplica ao lado com o furo l4 na pega do apoio 12 enquanto a luz é reflectida e medida no outro lado da almofada de reagente 11. Podem empregar—se outras estruturas para além da descrita. A almofada 11 pode apresentar várias formas e for % ·* matos, sujeitas as limitações aqui incluídas. A almofada 11 deve ser acessível pelo menos numa superfície e normalmente nas duas.

Pode unir-se a camada hidrofílica (elemento reagente) ao apoio por qualquer meio conveniente, por exemplo, um suporte, agrafe ou adesivosj contudo, no método de prefe— rencia e ligado a base. A ligaçao pode ser feita com qualquer adesivo nao—reactivo, por um método térmico em que a superfí— • cie de base ê suficientemente fundida para prender algum do material utilizado para a camada hidrofílica ou por métodos de ligaçao ultra—sónica ou por microondas que unem do mesmo modo as almofadas hidrofílicas da amostra à base. Ê importan— te que a ligaçao seja de tal modo a nao interferir de modo ** A substancial com as medições da reflectancia difusa ou com a reacçao a ser medida, embora seja improvável que isto ocorra pois nao ê necessário adesivo no local onde ê feita a leitura. Por exemplo pode aplicar—se um adesivo 13 à tira de base 12 seguido primeiro por perfuração do furo 14-na tira e adesivo «tf combinados e então aplicar a almofada de reagente 11 ao adesi vo próximo do furo l4 para que a porção periférica da almofada de reagente se ligue à tira de base.

Os reagentes químicos

Pode utilizar—se qualquer sistema de produção de sinal que seja susceptivel de reagir com o analito da amos tra para produzir (quer directa ou indirectamente) um composto que seja caracteristicamente absortivo a um comprimento de onda diferente do comprimento de onda a que o veículo de teste absorve de modo substancial.

«tf

As matrizes de poliamida sao particularmente fiteis para efectuarem reacçoes em que o substracto (analito) reage com uma enzima oxidase que utiliza oxigénio de tal modo que produz um produto que reage posteriormente com um interme diário de corante para formar directa ou indirectamente um co tfktf rante que absorve numa variaçao de comprimento de onda predeterminada· Por exemplo, uma enzima oxidase pode oxidar um sub stracto e produzir peróxido de hidrogénio como um produto da reacçao. 0 peróxido de oxigénio pode depois reagir com um intermediário ou precursor de corante, numa reacçao por catálise ou nao catálise, para produzir uma forma oxidada do intermediário ou precursor. Este material oxidado pode produzir o produto colorido ou reagir com um segundo precursor para formar o corante final.

Exemplos nao limitativos de análises e reagen tes típicos incluem os seguintes materiais constantes na lista que se seguei

Tipo de amostra e analito Reagentes

Glicose em sangue? soro? urina ou outros fluidos biológicos? vinho? sumos de fru tas ou outros fluidos aquosos coloridos. 0 sangue com pleto é um tipo de amostra particularmente preferido? pois a separaçao é demorada e impraticável com utilização doméstica.

Glicose oxidase? Peroxidase e um aceitador de oxigénio.

Os aceitadores de oxigénio incluem:

O—dianizina (l)

0—toluidina

0—tolidina (l)

Benzidina (l) ? 2’ —azinodi— ( 3-etil—benz—tia— zolina ácido sulfónico(6)) (1)

3-metil-2—benzotiazolinona hi— drazona e N ?N—dimetilanilina (l) Fenilo e 4—aminofenazona (l)

2?4—diclorofenol sulfonatado e

4-aminofenazona (2)

3— metil—2—benzotiazolinona hidra zona e ácido 3-(dimetilamino)benzóico (3)

2—metoxi—4—alil fenol (4)

4— amino—antipireno—dimetilani— lina (5) (1) Conforme descreve Clinicai Chemistry ? Richterich e Columbo? p. 367 e referências citadas aqui (2) Analyst? 97? (1972) 142-5(3) Anal. Biochem. 105 (1980) 389-397 (4) Anal. Biochem.? 79? (1977) 597-601 (5) Clinica Chemica Acta ? 75? (1977) 307—391

Todos aqui incluidos como referência.

Método de Análise método de análise pa presente invenção ba— seia—se numa alteraÇao da absorçao, conforme medida por refle ctância difusa, a qual está dependente da quantidade de anali to presente na amostra a ser testada. Esta alteraÇao pode ser

M ** ** determinada por medição da alteraÇao na absorçao da amostra de teste entre dois ou mais pontos em tempo.

primeiro passo do ensaio a ser considerado sera a aplicaçao da amostra a matriz. Na pratica, pode realizar—se uma análise do seguinte modo:

Primeiro obtém—se uma amostra de fluido aquoso que contenha um analito. Pode obter—se sangue por picada no dedo, por exem pio. Aplica—se um excesso deste fluido, para além dos limites

- Λ de saturaÇao da matriz na area onde a reflectancia vai ser me dida.(i.e., cerca de 5~1θ microlitros) ao elemento ou elementos reagentes do dispositivo de teste. Nao ê necessário o simultâneo arranque de um cronémetro (como é vulgarmente necessário na técnica anterior), conforme se tornará claro mais adiante, devido ao processo de iniciaçao praticado pela presente invenção. Pode retirai?—se o excesso de fluido, como enxugar à luz, mas tal remoção também nao ê necessária. 0 dispositivo de teste é normalmente montado num instrumento para leitura da absorçao da luz, por exemplo, intensidade da cor por reflectancia, antes da aplicaçao da amostra. Mede—se a absorçao em certos pontos em tempo apés a aplicaçao da amos— tra. A absorçao diz respeito nesta aplicaçao nao so a luz den tro do limite visual co comprimento de onda mas também fora do limite visual do comprimento de onda, tais como a radiaçao infravermelha ou ultravioleta. A partir destas medições de absorçao pode calibrar-se a velocidade de desenvolvimento da cor em termos de nível do analito.

Instrumento de Medição

Pode conseguir—se um instrumento apropriado,

como um espectrofotómetro de reflexão difusa com software apropriado, para ler automaticamente a reflexão em certos pon tos em tempo, calcular a velocidade de alteraçao da reflectân cia e, utilizando factores de calibragem, controlar o nível do analito no fluido aquoso. Tal dispositivo está esquemática mente representado na figura 2 em que se apresenta um disposi tivo de teste da presente invenção compreendendo a base 12 a qual estâ fixa a almofada do reagente 11. A fonte de luz 5»' por exemplo um diodo de emissão de luz de alta intensidade (LED) projecta um feixe de luz para a almofada de reagent . Uma porção substancial desta luz (pelo menos 25%» de preferên cia pelo menos 35%» e com maior preferência pelo menos 5θ%»

Λ ** . Λ na ausência do produto da reacçao) e reflectida de modo difuso a partir da almofada de reagente e á detectada pelo detec— tor de luz 6, por exemplo um fototransietor que produz uma corrente de saida proporcional à luz que recebe.

Se se desejar a fonte de luz 5 e/ou o detector 6 podem ser adaptados a gerar ou responder a uma luz de comprimento de onda específico. 0 produto de saída do detector 6 passa para o amplificador 7> por exemplo, um circuito integrado linear que converte a corrente do fototransistor em voltagem. 0 produto do amplificador 7 pode ser distribuído pa ra o circuito de rastreio e detecção 8. Este ê um circuito in tegrado de combinaÇao linear/digital que localiza ou segue a voltagem analógica a partir do amplificador 7 e, sob comando do microprocessador 20, bloqueia ou mantém a voltagem ao seu nível nesse período.

O conversor analógico/digital 19 recebe a vol tagem analógica do circuito de rastreio e detecção 8 e conver te—o, por exemplo, num número digital binário de doze bits sob comando do microprocessador 20. 0 microprocessador 20 pode ser um circuito integrado binário. Serve as seguintes funções de controle: 1) regulação de tempo para todo o sistema} 2) leitura do produto de saida do conversor analógico/digital 19i 3) junto com o programa e a memória de dados 21, armazena

mento dos dados que correspondem à reflectância medida em determinados intervalos de tempo) 4) cálculo dos niveis de ana— lito a partir das reflectâncias armazenadas) e 5) produção da saída dos dados de concentração do analito para o mostrador 22. A memória 22 pode ser um circuito integrado digital que armazena os dados e o programa de operaçao do microprocessador. 0 referido dispositivo 22 pode apresentar várias formas. Normalmente ê um mostrador visual, como um mostrador de cristais líquidos (LCD) ou de LED, mas tambám pode ser uma impres sora de fita, um sinal audível, ou análogo. 0 instrumento tam bêm pode incluir um interruptor de arranque/paragem e pode proporcionar um controle de tempo visível ou audível para in— dicar tempos para aplicaÇao das amostras, efectuar leituras, etc., se se desejar.

Ligaçao da Reflectância

Na presente invenção, o próprio circuito de reflectância pode ser utilizado para iniciar a regulaÇao de tempo por medição de uma gota em reflectância que ocorre quan

M «V ** \ do a porção aquosa da solução de suspensão aplicada a almofada de reagente (por exemplo, sangue) migra para a superfície na qual a reflectância vai ser medida· NormaImente, o disposi tivo de medição ê ligado para um modo Ready no qual as leituras da reflectância sao automaticamente feitas em intervalos de espaços muito próximos (normalmente cerca de 0,2 segun dos) a partir de uma tira de reagente nao—reactivado, substan cialmente seca, diferente da cor branca. A medição inicial e normalmente feita antes da penetração da matriz pelo fluido a ser analisado mas pode ser feita após se ter aplicado o fluido num local sobre o elemento reagente diferente do local onde a reflectância está a ser medida. 0 valor da reflectância ê avaliado pelo microprocessador, normalmente por armazenamen to de valores sucessivos em memória e depois por comparaçao de cada valor com o valor nao—reactivado. Quando a solução aquosa penetra a matriz de reagente, a gota em reflectância assinala o começo do intervalo de tempo de medição. Podem uti lizar-se gotas em reflectáncia de 5-5θ% para iniciar a regula çao de tempo, normalmente uma gota de cerca de 10%. Neste modo simples há uma sincronização exacta do veículo de teste que alcança a superfície a partir da qual se fazem as medições e a iniciaÇao da sequencia de leituras, sem necessidade de acti vidade pelo utilizador.

Embora todos os sistemas descritos nesta apli caÇao sejam especialmente dirigidos a utilização de matrizes de poliamida e muito pa ticularmente·à utilização de tais matrizes na determinação da concentração de vários açúcares, co mo a glicose, e outros materiais de origem biológica, nao ê necessário limitar a caracteristica de ligaçao da reflectan— cia da presente invenção a tais matrizes. Por exemplo, a ma** triz utilizada com a ligaçao da reflectáncia pode ser formada a partir de qualquer material hidrofílico insolúvel na água e qualquer outro tipo de teste de reflectáncia.

Aplicaçao Especifica ao Teste da Glicose

Apresentar—se—á agora um exemplo específico relacionado com a detecção da glicose na presença de glóbulos vermelhos a fim de se salientar a vantagem específica e detalhe maior. Embora esta represente a realizaçao preferida da presente invenção, a invenção nao se limita a detecção de gli cose no sangue.

A utilização de superfícies de poliamida para formar o elemento reagente proporciona inúmeras caracteristi— cas desejáveis na presente invenção. Estas incluem: o elemento reagente é hidrofílico (i. e. absorve o reagente e a amostra de imediato), nao deforma ao ser molhado (de modo a proporcionar uma superfície plana para leitura da reflectáncia), ê compatível com enzimas (a fim de proporcionar boa estabilidade na duraÇao), absorve um volume de amostra limitado por unidade de volume da membrana (necessária para demonstrar uma extensa variaçao dinamica de medições), e apresenta resisten—

cia suficiente à água para permitir o fabrico de rotina.

Numa configuração caracteristica» realiza-se o presente método utilizando um dispositivo que consiste num suporte de plástico e do elemento reagente (tendo a matriz im pregnado em si o sistema de produção de sinal). A matriz preferida para utilização na preparaçao do elemento reagente e uma membrana de nylon de microfiltraÇao, particularmente membranas feitas de nylon—66 moldado num núcleo de fibras de po— liést er nao—tecidas. Numerosas membranas de nylon de microfil traÇao deste tipo sao comercialmente produzidas pela Pall Ul— trafine Filtration Corporation, possuindo tamanhos de poros compreendidos entre 0,1 e 3»θ micra. Estes materiais apresentam resistência mecânica e flexibilidade, estabilidade dimensional apús exposição a água e humedecimento rápido.

Sao possíveis muitas variações na estrutura química especifica do nylon. Estas incluem nylon-66 nao—traba lhado com grupos terminais de carga (vendido sob a marca Registada ULTRAPORE da Pall Ultrafine Filtration Corporation, •’ΡβΙΙ’¹ ). As cargas positivas predominam abaixo do pH 6 enquan to as cargas negativas predominam acima do pH 6. Noutras membranas o nylon ê trabalhado antes de se formar a membrana para proporcionar membranas com propriedades diferentes. Os nylons trabalhados com grupos carboxi sao negativamente carrega dos numa ampla variaçao de pH (vendidos como CARBOXYDYNE pela Pall). Os nylons podem também ser trabalhados com uma elevada densidade de grupos de carga positiva sobre a sua superfície, normalmente grupos de aminas quaternárias, para que apresen— tem pequena variaçao em carga numa ampla variaçao de pH (vendidos como POSIDYNE pela Pall). Tais materiais sao particular

- ·* mente adequados para a pratica da presente invenção.

Concluiu—se que mantendo o pH da solução abai xo de 4,8 ajudará a estabilizar as enzimas na solução. Encontrou—se o nível de estabilidade mais eficiente em pH 4,0. Isto resulta num tempo de armazenamento à temperatura ambiente de 12—18 meses. Assim, é desejável uma tira de ioes de carga po sitiva.

Ê também possível utilizar membranas que possuam grupos funcionais reactivos designados por imobilização covalente de proteínas (vendidas como membranas BIODYNE IMMUNO AFFINITY pela Pall). Tais materiais podem ser utilizados para ligar proteínas de modo covalente, por exemplo enzimas, utili zadas como reagentes. Embora todos estes materiais sejam utilizáveis, o nylon possuindo uma elevada densidade de grupos de carga positiva na sua superfície proporcionam a melhor estabilidade dos reagentes quando formulados numa almofada de reagentes seca. Os nylons nao—trabalhados proporcionam a seguinte melhor estabilidade com os nylons carboxilados a seguir.

Podem obter—se resultados desejáveis com tama nhos de poros que variam entre 0,2 e 2,0 pm, de preferência entre 0,5 e 1,2 pm, e com maior preferência de cerca de 0,8 pm, quando utilizados com sangue completo.

A forma da pega na qual o elemento reagente é montado ê relativamente pouco importante desde que a pega per roita o acesso a um lado do elemento reagente pela amostra e ao outro lado do elemento reagente pela luz incidente cuja re flexão vai ser medida. A pega também auxilia na inserção do elemento reagente no dispositivo de medição da absorçao para que este registe com o sistema éptico. Um exemplo de uma pega apropriada ê uma película de Mylar ou outra tira de plástico à qual se aplicou um adesivo de transferência como os adesivos de transferência 3M 465 ou Y946O. Faz—se um furo no plástico através do adesivo de transferência. Um elemento reagente, normalmente em forma de uma almofada fina, quer contendo reagentes ou à qual se adiciona posteriormente os reagentes, ê então aplicado à pega por meio do adesivo de transferência para que fique firmemente unido à pega na área que circunda o furo que foi feito através da pega e do adesivo de transferên cia.

Este dispositivo está ilustrado na figura 1, que apresenta uma tira 10 que possui uma almofada de reagente 11 ligada a uma pega de película de Mylar 12 por meio do adesivo 13· θ furo 14 permite o acesso da amostra ou da luz in— «* cidente a um lado da almofada de reagente 11 embora nao esteja impedido o acesso ao outro lado da almofada de reagente. Podem escolher—se todas as dimensões da almofada de reagente e da pega de modo a que a almofada de reagente se adapte com segurança num instrumento de leitura de reflectância num local próximo de uma fonte de luz e de um detector de luz refle ctida. Geralmente as dimensões do furo variam entre 2—10 mm de diâmetro e as da largura da pega cerca de 15 mm. Um furo 14 de 5 mm de diâmetro na tira de reagente apresentada na figura 1, funciona de modo bastente satisfatório. Naturalmente nao há limite específico para o diâmetro mínimo deste furo, embora se prefiram diâmetros de pelo menos 2 mm para facilida de de fabrico, aplicaçao da amostra e leitura da reflexão da luz.

Conforme se observa ainda nas figuras 3 e 4, a tira 10 pode ser optimamente conduzida numa ranhura 50 de uma máquina de exploração de imagem 60. Isto realiza—se por colocaçao de um encaixe 15 na tira 10 perto do ponto médio da parte superior da tira 10. Feito isto, a tira 10, quando conduzida através dos lados 55 da ranhura 5θ > alcançará de modo repetitivo o mesmo local, para assegurar a elevada exactidao nos resultados do teste. Tal carácter repetitivo ê assegurado ao movimentar o encaixe 15 contra o pino 65. A tira 10 girará à volta do pino 65 no encaixe 15 para que os bordos l6 da tira se adaptem nos lados 55 da ranhura 50. Isto, certamente, também alinha de modo repetitivo o furo l4 por cima do centro do teste 80 que inclui LEDs múltiplos 5 na máquina de explora çao de imagem. 60. Isto assegura que o furo l4 que contêm a amostra de sangue terá uma dosagem uniforme de luz incidente para análise.

Embora se possa utilizar inúmeros corantes co mo indicadores, a seiecçao dependerá da natureza da amostra·

Ê necessário seleccionar um corante que possua uma absorçao a um comprimento de onda diferente do comprimento de onda ao qual os glóbulos vermelhos absorvem a luz, com sangue completo como veiculo de teste ou outros contaminantes na solução a ser analisada com outros veículos de teste. O par de corantes MBTH-DMAB (cloridrato de 3-metil-2-benzotiazoIinona hidrazona e ácido 3“di^metilaminobenzóico) , embora sendo anteriormente descritos como apropriados para o desenvolvimento de cor para marcadores de peroxidase em testes imunológicos de enzimas, nunca foram utilizados num reagente para medição da glicose.

** Λ

Este par de corantes proporciona uma maior variaçao dinamica e apresenta uma estabilidade enzimática melhorada quando com— parados a corantes tradicionais utilizados para medição da glicose, tais como os derivados da benzidina. Esta estabilida de enzimática torna o par de corantes MBTH-DMAB especialmente desejável para assegurar uma durabilidade maior das tiras de teste. Alem disso, o par de corantes MBTH-DMAB nao ê carcinogênico, uma caracteristica da maior parte dos derivados da benzidina. Outro par de corantes que se pode utilizar na medi çao da glicose ê o par AAP—CTA (4—amino—antipireno e ácido cromotrópico). Embora este par nao proporcione uma variaçao dinâmica tão ampla como o MBTH-DMAB, é estável e apropriado para utilização na prática da presente invenção, quando se me de a glicose. De novo, o par de corantes AAP—CTA proporciona uma variaçao dinâmica alargada e maior estabilidade na activi dade enzimática do que os corantes de benzidina mais largamen te utilizados.

A utilizaÇao do par MBTH-DMAB permite a corre cçao do hematócrito e do grau de oxigenaÇao do sangue com um simples factor de correcçao. Os corantes de benzidina mais normalmente utilizados nao permitem tal correcçao. 0 corante MBTH-DMAB forma um cromoforo que absorve em aproximadamente 635 nm mas nao para uma extensão significante a 700 nm. Permi te—se variações ligeiras nas medições de comprimentos de onda. A 700 nm pode medir—se tanto o hematócrito como o grau de oxi genaçao por medição da cor do sangue. Além disso, os diodos

- 22 de emissão de luz (LED) estão comercialmente disponíveis para as duas medidas 635 nm e 700 nm, simplificando assim a produção de massa de um dispositivo. Ao utilizar o tamanho de poros da membrana preferido anteriormente descrito e a formulação do reagente, pode corrigir—se o comportamento quer do he— matócrito quer da oxigenação por medição ao comprimento de on da simples de 700 nm.

Descobriram—se duas condiçoes adicionais para proporcionar uma estabilidade específica e longa durabilidade para uma formulação de glicose oxidase/peroxidase numa matriz de poliamida. 0 armazenamento ê melhorado a um pH compreendido entre 3,8 e 5»θ, de preferência entre 3» 8 e 4,3» de maior pre ferência cerca de 4,0. Do mesmo modo» encontrou—se um bom armazenamento e estabilidade nao esperada com uma mistura de um sistema de tampao concentrado aos reagentes encontrados na ma triz. Concluiu—se que o tampao mais eficaz era um tampao de citrato de 10% em peso, com concentrações eficazes entre 5-15% Estas sao percentagens peso/volume da solução em que os reagentes sao aplicados à matriz. Podem—se utilizar outros tampões na mesma base molar. Conseguiu—se a maior estabilidade utilizando um pH baixo, de preferência pH 4, tun sistema coran te de MBTH—DMAB, e uma concentração de enzimas elevada de apro ximadamente 500—1000 M/ml de solução de aplicaçao. Como se in dicou anteriormente, estas tiras preparadas utilizando estes parâmetros resultam numa durabilidade de 12 a 18 meses.

Ao preparar o reagente de MBTH—DMAB e o siste ma de enzimas que forma o resíduo do sistema de produção de sinal, nao é necessário manter volumes e proporçoes exactas embora os valores sugeridos a seguir apresentem bons resultados. Os reagentes sao de imediato absorvidos pela almofada da matriz quando a glicose oxidase está presente numa solução de cerca de 27—54% em volume» a peroxidase está presente numa concentraÇao de cerca de 2,7-5,4 mg/ml, o MBTH está presente numa concentração de cerca de 4—8 mg/ml, e DMAB está presente numa concentração de cerca de 8—16 mg/ml. A proporção do peso

de DMAB—MBTH ê de preferência mantida nos limites de l:l a 4:1, de preferência de 1,5*1 a 2,5 ^J1 e de maior preferência de cerca de 2:1·

As técnicas básicas de fabrico para o elemento reagente sao, uma vez estabelecidas, directas. A prépria membrana ê forte e estável, especialmente quando se seleccio— na uma membrana de nylon da realizaçao preferida· Apenas duas soluçoes sao necessárias para aplicaçao do reagente, e estas soluçoes sao as duas estáveis e formuladas de imediato. A pri meira contêm geralmente os componentes corantes e a segunda contêm geralmente os enzimas. Quando se utiliza o par de corantes HBTH—DMAB, por exemplo, os corantes individuais sao dissolvidos num solvente orgânico aquoso, normalmente numa mistura de i:i de acetonitrilo e água. A matriz ê mergulhada na solução, o líquido em excesso removido por enxugamento, e a matriz ê posteriormente seca, normalmente a 50°C—60°C duran te 10—20 minutos. A matriz que contêm os corantes ê então mer gulhada numa solução aquosa que contêm as enzimas. A formulação típica contêm as enzimas da peroxidase e glicose oxidase bem como qualquer tampao, conservante, estabilizador, ou análogo. A matriz ê então enxuta para remover o líquido em exces so e seca como anteriormente. Uma fortnulaçao tipo para o reagente de glicose ê a seguinte:

Banho corante

Mi stura— se:

40	mg	de	MBTH
8o	mg	de	DMAB
5	ml	de	acetonitrilo, e
5	ml	de	água

Agita—se atê todos os sólidos estarem dissolvidos e verte—se para um prato de vidro ou outra superfície plana. Mergulha—se uma membrana Posidyne (Pall Co.), enxuga— -se o líquido em excesso, e seca—se a 5ó°C durante 15 minutos.

Banho de enzima

Mi stura— se:

6	ml	de	água
10	mg	de	EDTA,	sal	de di—sódio,
200	mg	de	Sigma	Poly	Pep , baixa viscosidade
0,668	g	de	citrato	de	só dio

ácido cítrico,

0,523 g de

2,0	ml	de
		do
30 mg		de
3,0	ml	de

TM em peso de GAF Gantrez AN—139 dissolvi— em agua peroxidase de rábano, 100 unidades/mg, e glicose oxidase, 2000 unidades/ml

Agita—se atê todos os sólidos estarem dissolvidos e deita—se num prato de vidro ou noutra superfície plana. Mergulha—se uma membrana previamente impregnada com coran tes, enxuga-se o líquido em excesso, e seca-se a 56° C durante 15 minutos.

aparelho electrónico utilizado para fazer as leituras da reflectância contêm, no mínimo, uma fonte de luz, um detector de luz reflectida, um amplificador, um conversor analógico/digital, um microprocessador com memória e programa, e um dispositivo mostrador, conforme se observa na figura 2.

A fonte de luz consiste normalmente num diodo de emissão de luz (LED). Embora seja possível utilizar uma fonte de luz policromática e um detector de luz susceptível de medir a dois comprimentos de onda diferentes, um aparelho preferido deveria conter duas fontes LED ou um diodo ónico susceptível de emitir dois comprimentos de onda de luz distin tos. Os LEDs comercialmente disponíveis que produzem comprimentos de onda de luz descritos como sendo os preferidos na presente descrição incluem um Hewlett Packard HLMP—1340 com uma emiss ao máxima a 635 nm e um Hewlett Packard QEMT—1045 com uma emissão de banda estreita máxima a 700 nm. Os detecto res de luz disponíveis comercialmente incluem um Hammamatsu hl «Ltí*»

5074—l8K e um Litronix BPX—65.

Embora sejam possíveis outros métodos de fazer medições, o método que se segue proporcionou os resultados desejados. Fizeram—se leituras por meio do fotodetector em intervalos determinados após se ter iniciado a regulaçao de tempo. 0 LED de 635 nm ê activado apenas durante um breve período de tempo de medição que começa aproximadamente 20 segundos após o tempo de arranque conforme se indicou pelo sistema de ligaçao da reflectancia anteriormente descrito. Se es ta leitura indicar que se encontra presente na amostra um ele vado nível de glicose, faz—se uma leitura de 3θ segundos e utiliza-se no cálculo final para melhorar a exactidao. Normal mente considera—se que os níveis elevados começam cerca dos 25O mg/dl. 0 antecedente ê corrigido com uma leitura a 7θ0 nm feita cerca de 15 segundos após o inicio do período de medição. A leitura a partir do fotodetector é integrada no intervalo enquanto o LED apropriado ê activado, o que acontece nor malmente em menos de um segundo. As leituras de reflectancia nao-trabalhadas utilizam—se posteriormente para cálculos realizados pelo microprocessador após o sinal ter sido amplifica do e convertido num sinal digital. Podem utilizar—se inúmeros microprocessadores para efectuar o cálculo, um microcomputador de teclado ónico AIM65 fabricado pela Rockwell Internatio nal mostrou—se satisfatório.

Os presentes métodos e aparelhos permitem um procedimento muito simples com passos operacionais mínimos por parte do utilizador. Em utilização, a tira de reagente 10 está colocada no detector para que o furo 14 na tira 10 regis te com a ópt ica do sistema de detecção. O sistema encaixe 15/ pino 65 anteriormente descrito, conforme se observa nas figuras 4 e 5» funciona perfeitamente para obter o referido alinhamento. Uma tampa amovível ou outra cobertura está colocada sobre a óptica e a tira para proteger o conjunto da luz ambiente. Isto faz—se para melhorar a leitura da tira 10. Embora ** \ o processo de iniciaçao possa começar a luz, a luz solar di—

recta ou luz de ambiente de alta intensidade tende a inibir os resultados. A tampa 90 assegura que a luz directa nao atin ja a tira de reagente 10. A tampa que nao necessita de ser im permeável à luz, apenas suficiente para proteger a tira 10 da luz directa.

Inicia—se então a sequência de mediçaes pressionando um botão no aparelho de medição que activa o microcomputador para fazer uma medição da luz reflectida a partir da almofada de reagente nao—reactivado, denominada uma leitura R . Retira—se então a tampa 90 e aplica—se uma gota de

S6 CQ sangue à tira de reagente 10, normalmente enquanto a tira de reagente 10 é registada com a óptica e o dispositivo de leitu ra. Ê preferivel que a tira de reagente se deixe em registo com a óptica a fim de minimizar o manuseamento. Fecha—se en— tao a tampa 90.

instrumento ê susceptivel de perceber a apli caçao do sangue ou de outra amostra por um decréscimo na re— flectancia quando a amostra passa através da matriz e a luz reflectida ê medida no lado oposto. 0 decréscimo na reflectan cia inicia uma sequência de regulaÇao de tempo que está descrita detalhadamente noutros locais da presente descrição. A tampa 90 deve ser substituída dentro dos 15 segundos de apli— caçao da amostra, embora este tempo possa variar dependendo do tipo de amostra a ser medida.

Os resultados sao normalmente apresentados aproximadamente 3θ segundos apos a apiicaçao do sangue quando se vai medir uma amostra de glicose sanguínea, embora seja aceitável uma reacçao de 20 segundos para amostras de glicose com uma concentração de glicose inferior a 250 mg/dl. Se se vao medir outras amostras, os tempos adequados para apresenta çao do resultado podem diferir e podem ser determinados de imediato a partir das características do reagente/amostra seleccionados.

Pode fazer—se uma avaliaçao exacta específica do nível de glicose (ou de qualquer outro analito a ser medido) utilizando a corrente de segundo plano, isto é, a corrente do fotodetector ligado com com nenhuma luz reflectida a partir da almofada de reagente, para fazer uma correcçao de segunda ordem. Foi demonstrado que além de um período de 2—3 meses este valor nao se altera para um instrumento específico preparado de acordo com as realizações preferidas da presente descrição, e é possível programar esta leitura de segunda ordem na memória do computador como uma constante.

Contudo, com uma ligeira modificação no proce dimento, pode medir—se este valor (ou normaliza-lo) com cada analise para resultados mais exactos. Cada LED ê activado an— tes da colocaçao da amostra de sangue na tira de reagente 10 mas com a tira de reagente no lugar. Mede—se um valor de re— flectáncia da tira 10, com a tira de reagente 10 no lugar e com a tampa de protecçao de luz 90 fechada· Se esta medição for diferente da medição original do valor de reflectáncia, aumenta—se a potência ao LED para que a reflectáncia seja a mesma· Isto assegura que a medição do conteúdo de glicose do sangue esté a ser feita com a mesma escala de repetição para cada leitura da glicose do sangue.

A razao para instituir este método é dupla. Primeiro, a intensidade dos diodos emissores de luz varia gran demente de LED para LED, mesmo quando todos os LEDs de medi— ** ·* ·*. çao sao novos. Segundo, a eficiência do LED varia com a tempe * ** ratura e a vida do LED. Com este método, os resultados sao re petíveis na mesma escala.

Os dados nao trabalhados para calcular um re— sultado num teste de glicose sao uma corrente de segunda ordem referida como reflectáncia de segunda ordem, R^, conforme se descreveu anteriormente; Uma leitura da tira de teste nao-reactivada, R , que é cerca de 95% opaca à luz e se encon S6Cd tra também descrita anteriormente} e uma medição do ponto final. Utilizando as realizações preferidas aqui descritas, o

ρ 9 ponto final nao e particularmente estável e deve ser cronome— trado com precisão a partir da aplicaçao de sangue inicial. Contudo, o medidor de acordo com o aqui descrito realiza esta regulaçao de tempo automaticamente. Para concentrações de gli cose abaixo de 25θ mg/dl, consegue—se um ponto final apropria do, estável, em 20 segundos, e efectua—se uma reflectância fi nal, ^R20* ^^ara concentrações de glicose acima dos 450 mg/dl ê apropriada uma leitura de reflectância de 30 segundos, ^r^q· Embora o sistema aqui descrito apresente uma boa diferenciação atá 800 mg/dl de glicose, a medição é um pouco ruidosa e inexacta acima dos 450 mg/dl, embora nao tanto que cause problemas significativos. Tempos de reacçao mais prolongados proporcionam leituras mais apropriadas para elevados níveis de concentração de glicose.

Uma leitura de reflectância de 700 nm para a medição de comprimento de onda dual á normalmente feita em 15 segundos (R^). Por esta altura o sangue deverá ter saturado por completo a almofada de reagente. Para além de 15 segundos a reacçao continua a realizar—se e á sentida, para uma pequena parte, por uma leitura a 700 nm. Por conseguinte, visto que a absorçao de corante pelo sinal de 700 nm ê uma desvantagem, ignoram—se nos cálculos as leituras para alem de 15 segundos.

Utilizam—se os dados nao—trabalhados anterior mente referidos para calcular os parâmetros proporcionais à concentração de glicose os quais podem ser mais facilmente - vi sualizados do que as medições de reflectância. Se se desejar, pode utilizar-se uma transformaçao logarítmica da reflectância análoga à relaçao entre a absorçao e a concentração do analito observadas em espectroscópia de transmissão (Lei de Beer). Uma simplificação das equações de Kubelka—Monk, deriva das especialmente por espectroscopia de reflectância revelaram—se particularmente fiteis. Nesta derivação K/S está relacionado com a concentração de analito com K/S definido pela Equaçao 1

K/S-t (1) =(1- R*t)²/(2 X R*t)

R*t ê a reflectividade feita num período de ponto final espe— _ « ** cífico, t, e e a fracçao absorvida do feixe de luz incidente descrita pela Equaçao 2, em que R é a reflectancia do ponto finai, R₂₀ ou R₃₀.

R*t = (R - R, )/(R - R, ) (2) t d seca b

R*t varia entre 0 para luz nao reflectida (R^) ^e 1 para luz reflectida total (R )· A utilização da reflectividade nos seca cálculos simplifica grandemente o modelo de medidor como uma fonte altamente estável e torna desnecessário um circuito de detecção visto que estes componentes sao controlados com cada «tf medição de R e R, .

seca b

Para uma leitura de comprimento de onda simples, o K/S pode ser calculado a 20 segundos (K/S—20) ou 3θ segundos (K/S-30)· As curvas de calibragem que relacionam estes parâmetros às medições de glicose de YSI (Yellow Springs Instruments) podem descrever—se com precisão pela equaçao polinomial de perceira ordem representada na Equaçao 3·

YSI = a + a_n(K/S) + a_o(K/S)² + a_o(K/S)³ (3) o 1 2 3

Os coeficientes para estes polinómios estão listados na Tabela 1.

TABELA 1

Coeficientes para ajuste do polinómio de terceira ordem de curvas de calibragem de comprimento de onda simples

	K/S—20	K/S—30
a0	-55,75	-55,25
ai	0,1632	0,1334
a2 a _	-5,765 χ io5 Q 2,58 X 10”	-2,241 x 10 O 1,20 x 10

As espécies químicas simples a serem medidas nas realizações preferidas ê o corante inaminas MBTH—DMAB e a matriz completa a ser analisada ê sangue completo distribuído numa membrana Posidyne de 0,8 ^1. A revista intitulada”Appli cation of Near Infra Red Spectrophotometry to the Nondestructive Analysis of Foods: A Review of Experimental Results”,

CRC Criticai Reviews in Food Science and Nutrition, 18 (3)

203-30 (1983), descreve a utilização de instrumentos baseados na medição numa diferença de densidade Sptica A.OD λ^) em que 0D\ é a densidade Sptica do comprimento de onda corresa ~ pondente a absorçao máxima de um componente a ser determinado e OD)^ ê a densidade Sptica a um comprimento de onda em que o mesmo componente nao absorve de modo significativo.

algoritmo para a medição de comprimento de onda dual ê por necessidade mais complexo do que para a medição do comprimento de onda simples mas é muito mais eficaz. A correcçao de primeira ordem aplicada pela leitura a 700 nm ê uma substracçao simples da cor de segundo plano prSpria do sangue. A fim de fazer esta correcçao pode determinar—se e de terminou-se a relaçao entre a absorçao a 635 um e 700 bm própria da cor do sangue por medição de amostras de sangue com 0 mg/dl de glicose sobre uma ampla variaÇao de cor do sangue. A variaÇao de cor foi estabelecida por variaÇao do hematócri— to, e observaram—se relações bastante lineares. A partir destas linhas normalizou-se o K/S—15 a 700 nm para dar equivalên cia ao K/S—30 a 635 um. Esta relaçao está referida na EquaÇao 4, em que K/S—15 n ê normalizado K/S—15 a 700 nm.

K/S—15n = (K/S—15 x 1,54) - 0,133 (4)

Note-se que a equivalência do sinal normalizado de 700 nm e do sinal 635 nm só é verdadeiro para glicose zero. As expres— «tf soes de que derivaram as curvas de calibragem definem—se pelas Equações 5 e 6.

K/S-20/15 = (K/S—20) - (K/S-15n) (5)

K/S-30/15 = (K/S-30) - (K/S-15n) (6)

Estas curvas ajustam—se melhor por equações de polinómios de quarta ordem semelhantes à EquaÇao 3 a que se adicinna um termo de quarta ordem em K/S. Os coeficientes «M *»* de ajuste de computador para estas equações estão listadas na Tabela 2.

TABELA 2

Coeficientes para ajuste do polinómio de quarta ordem de curvas de calibragem de comprimento de onda dual k/s—20/15

K/S-30/15

áo	-0,1388	1,099
ai	0,1064	0,05235
X	6,259 X io5	—4 1,229 χ 10
	— ft -6,12 x 10	-5,83 x 10-8
J	-11	Λ „-11
a4	3,21 x 10	1,30 x 10
	Também se efectuou	uma correcção

ordem para eliminar erros devidos a efeitos da cromatografia. As amostras de hematócrito baixo apresentam como característi ca baixas leituras a 700 nm comparadas com amostras de hematócrito mais elevado com a mesma leitura a 635 nm. Quando a razao de (K/S—30)/(K/S—15) ê marcada em oposição a K/S—30 sobre uma ampla variaçao de hematócritos e concentrações de glicose, a linha resultante no gráfico indica a fronteira entre amostras que apresentram efeitos da cromatografia (acima da curva) e os que nao apresentam (abaixo da curva). Os K/S— —3θ para as amostras acima da curva sao corrigidos por subida da leitura para corresponderem a um ponto sobre a curva com o mesmo (K/S-3O)/(K/S-15), conforme demonstrado pela correcção feita na figura 5·

Os factores de correcção referidos anteriormente foram estabelecidos para se adaptar um instrumento uni— co e um número limitado de preparações de reagente. 0 algoritmo pode ser optimizado para um instrumento individual e um reagente do mesmo modo que está anteriormente descrito.

Em resumo, o sistema da presente invenção minimiza as acçoes do operador e proporciona inúmeras vantagens sobre os métodos de leitura da reflectância da técnica anterior. Quando comparado com os métodos anteriores para determi naÇao de glicose no sangue, por exemplo, existem varias vanta gens evidentes. Primeiro, a quantidade de amostra necessária para saturar a fina almofada de reagente é pequena (normalmen te 5-Ιθ microlitro), e ê obviamente independente do volume uma vez que o volume inicial de sangue seja fornecido à almofada de reagente. Segundo, o tempo do operador necessário ê apenas o suficiente para aplicar a amostra à fina camada hi— drofllica e fechar a tampa (normalmente 4—7'segundos). Tercei ro, nao ê necessária a simultânea regulaçao do tempo do arran que. Quarto, pode utilizar-se sangue completo. 0 método nao exige qualquer separaçao ou utilização de sangue livre de gló bulos vermelhos e do mesmo modo pode ser utilizado com outras amostras fortemente coloridas. Quinto, por meio de técnicas de normalizaÇao e de leitura da reflectância aplicadas na pre sente invenção, o sistema proporciona leituras seguras, exac— tas e repetlveis para o tempo de duraÇao do sistema de expio— raçao de imagem.

Várias vantagens menos óbvias surgem como re— sultado da pratica da presente invenção com sangue completo. Normalmente as soluçoes aquosas (como o sangue) penetram a membrana hidrofílica para proporcionar uma camada de líquido sobre o lado oposto da membrana, uma superfície que nao ê então adequada para a medição da reflectância. Concluiu—se, con tudo, que o sangue, aparentemente devido a interacçoes dos glóbulos vermelhos e proteínas no sangue com a matriz, molha a matriz de poliatnida sem que um excesso de líquido tenha penetrado a matriz porosa para interferir com a leitura da reflectância no lado oposto da matriz. Além disso, seria de es33 perar que as membranas finas utilizadas na presente invenção quando molhadas transmitissem luz e desenvolvessem apenas um sinal fraco para o dispositivo de medição da reflectância. Os ensinamentos anteriores indicavam geralmente que era necessária uma camada reflectiva por detrás da matriz a fim de refle ctir luz suficiente. Noutros casos colocava-se uma almofada branca por detrás da almofada de reagente antes da medição da cor. No caso presente, nao se exige nem uma camada reflectiva nem uma almofada branca· De facto, a presente invenção ê nor— malmente realizada com uma superfície de absorçao de luz atrás do elemento reagente quando se faz incidir uma luz incidente sobre a matriz. Isto consegue—se utilizando uma superfície de absorçao de luz atrás do elemento reagente, junto com a medição da reflectância em dois comprimentos de onda. Isto permite medições de reflectância aceitáveis que se obtem sem remoção do líquido em excesso da matriz, eliminando assim um passo tipicamente exigido pelos ensinamentos anteriores.

A presente invenção que se encontra agora des crita na generalidade será melhor percebida por referência aos exemplos específicos que se seguem, que se apresentam com a finalidade de apenas ilustrar a presente invenção e nao para serem considerados limitadores da invenção a nao ser que assim seja especificado.

EXEMPLO 1

Reprodutibilidade

Utilizou—se uma amostra de sangue de homem (possuindo um nível de hematócrito de 45) para recolher os da dos de reprodutibilidade utilizando a realizaçao presentemente preferida do sistema, denominado sistema MPX. Os resultados estão representados nas tabelas 3—5·

TABELA 3

Reprodutibilidade de um sistema de comprimento de onda simples

Média (mg/dl) *D. P. (mg/dl) %C.V.«

auotYSI (mg/dl)	20seg.	30seg.	20seg.	30seg.	20seg.	30seg.
25	23,1	23,0	2,1	2,04	9,1	9,0
55	53,3	53,2	3,19	3,32	6,0	6,3
101	101	101	3,0	3,3	3,0	3,0
326	326,6	327	13,3	9,8	4,1	3,0
501		503		17,1		3,4
690		675		28		4,15
810		813		37		4,5
* D.P.	«rf = Desvio padrao
** % C.V.	= Co-	variaçao	(medida	em percentagem)
YSI	Leitura da glicose em	Yellow	Spring	Instru—

ment

TABELA 4

Reprodutibilida de Média	um sistema de comprimento de onda dual
(mg/dl) 30seg.	D.P. (mg/dl)	% C.V.
YSI(mg/dl)	20seg.	20seg.	30seg.	20seg.	30seg.
25	25	27	1,34	1,55	5,4	5,7
55	55	57,4	2,58	2,62	4,7	4,6
101	101	101,5	2,55	2,18	2,5	2,1
326	332	330	15,0	7,1	4,5	2,1
501		505		21,3		4,2
69O		687		22,8		3,3
8l0		817		30,4		3,7

TABELA $

Reprodutibilida de uma abertura de diâmetro de 3,0 mm

YSI (mg/dl) mm % c.v.

3,0 mm

55-100

300

600 avg.

4.8 3,0

3.8

3.9

4,9

5,0

5,5

5,1

Dividiu—se o sangue em aliquotas e reforçou—

-se com glicose com limites compreendidos entre 25—800 mg/dl. Fizeram-se vinte determinações em cada nível de teste de glicose a partir de tiras tiradas aleatoriamente de uma amostra de 5OO tiras (Lote FJ4—49B). Os resultados deste estudo condu

X ** ziram as seguintes conclusões!

1. Comprimento de onda dual vs. simples! A covariaçao média para o resultado da dual de 30 segundos foi de 3,7% vs. 4,8% para o resultado do comprimento de onda simples de 30 segundos, um aperfeiçoamento de 23% para os limites de gli cose de 25-810 mg/dl. Houve um aperfeiçoamento de 33% na covariaçao dos limites de glicose de 25—326 mg/dl. Aqui a covariaÇao diminui de 5,4% para 3,6%, um aperfeiçoamento significativo nos limites mais utilizados. A medição do com primento de onda dual de 20 segundos proporcionaram aperfeiçoamentos na covariaçao comparada à medição do comprimento de onda simples nos limites de 25—326 mg/dl (Tabelas 3 e 4)

2. Comprimento de onda dual, resultado de 20 vs. 30 segundos!

A covariaçao média para um resultado de 20 segundos nos li mites entre 25—100 mg/dl ê quase idêntica a leitura de 30 segundos, 4,2% vs. 4,1%. Contudo, a 326 mg/dl, a leitura de 30 segundos tem uma covariaçao de 2,1% e o resultado de 20 segundos uma covariaçao de 4,5%. Como se observou na curva de resposta K/S-20, a inclinação começa a diminuir precisamente acima de 250 mg/dl. Isto conduz a fraca repro dutibilidade em níveis de glicose superiores a 300 para o resultado de 20 segundos. A partir destes dados de reprodu

- 36 tibilidade a separaÇao para o resultado de 20 segundos está algures entre 100 e 326 mg/dl. Mais tarde determinou—se uma separaçao a 250 mg/dl a partir dos resultados do estudo de recuperaÇao desenvolvido no Exemplo II.

3· Dimensão da abertura! Efectuaram-se pesquizas com uma dimensão mais pequena de abertura da óptica, 3,0 mm. A experiência inicial utilizando uma amostra de disco manualmen— te humedecida em 10 repetições mostraram covariaçoes aperfeiçoadas com uma abertura de 3>0 mm, aparentemente devido a registo mais fácil com a óptica do sistema. Contudo, quan do se utilizou a membrana cilíndrica feita à máquina, a mê dia (Tabela 5) da maior abertura, 4,7 mm, foi 3*9% vs. uma covariaçao média, para a abertura de 3»0 mm, de 5i1%· Es^e aumento de 30% deveu—se provavelmente à superfície irregular do lote de membranas circulares conforme referido mais adiante.

EXEMPLO II

RecuperaÇao!

Testou—se sangue de 36 dadores para compara— çao do presente método preferido denominado MPX com um método característico da técnica anterior que utilisa um analisador de glicose Yellow Springs Instrument Model 23A fabricado pela Yellow Springs Instrument Co. , Yellow Springs, Ohio (YSI). Dividiram—se os dadores em homens e mulheres e ordenaram—se a partir de 35 a 55% em hematócrito. Utilizaram—se as amostras de sangue dentro das 30 horas de recolha, com heparina de lí— tio como anti—coagulante. Dividiu—se cada amostra em alíquo— tas e reforçou—se com glucose para proporcionar 152 amostras na variaçao de 0—700 mg/dl de glicose. Testou—se cada amostra em duplicado num total de 304 pontos de dados. Elaboraram—se as curvas de resposta pela equaçao apropriada (veja-se as tabelas 1 e 2). Registaram—se então os valores de glicose do MPX vs. Os valores do YSI para proporcionar diagramas de varrimento, como se pode observar nas Figuras 6a e 6b para o sis

tema de comprimento de onda simples, e 7a até 7d para o siste ma de comprimento de onda dual.

Comparaçao dos sistemas de MPX: Para os dois períodos de medição de 20 segundos e 3θ segundos há visualmente mais disper sao nos diagramas de varrimento de comprimento de onda simples do que nos diagramas de varrimento do comprimento de onda dual

A leitura de 20 segundos torna—se mais dispersa acima dos 250 . ** ** mg/dl mas a medição de 3θ segundos nao apresenta ampla disper sao até que o nível de glicose seja superior a 50θ mg/dl.

Estes diagramas de varrimento foram quantificados por determinação dos desvios do YSI em várias variações de glicose.. Obtiveram-se os resultados a seguir indicados.

TABELA 6

Exactidao do sistema MPX a partir de dados da recuperação

Medição Comprimento	do de	MPX	*D.P. 1	(mg/dl) C. V. 0-50	para variacães
onda	Período (seg. )	50-250	250450
Simples			20	15,6	7,2	14,5
Simples			30	/6,9	7,1	8,8	10,2
Dual			20	12,3	5,3	12,8	-
Dual			30	12,19	5,5	8,4

* = Desvio padrao

•K4Í	= Estas sao	covariaçoes	inter—métodos
Note—se que:
a.	0 sistema de	comprimento	de onda dual apresenta resultados
	que variaram	30% abaixo	do sistema de comprimento de onda
	simples.
b.	0 sistema de	comprimento	de onda simples, a partir de 0—50

mg/dl, apresentou um desvio padrao de ±6—7 mg/dl enquanto que o desvio padrao para uma medição de comprimento de onda dual foi apenas de ±2,2 mg/dl.

c. A separaçao para uma medição de MPX de 30 segundos ê de 250 mg/dl. Para a variaçao 5θ-25θ mg/dl as duas medições de 20 e 3θ segundos apresentam covariaçoes inter—métodos semelhantes (aproximadamente 7% para comprimento de onda simples, 5,5% para comprimento de onda dual). Contudo, nos limites de 25θ—45θ mg/dl as covariaçoes inter—métodos mais do que duplicam para a leitura de 20 segundos para 14,5% para o comprimento de onda simples e 12,8% para o comprimento de onda dual

d. A leitura de 3θ segundos foi inutilizével acima de 450 mg/ dl para as duas medições de comprimento de onda simples e dual (covariaçoes de 10,2% e 8,4%).

Em conclusão, os dois sistemas de MPX apresen tam óptima quantificaçao nos limites de 0—45θ mg/dl.

1. Sistema MPX — Comprimento de onda dual de 3θ segundos: Este sistema de comprimento de onda dual proporciona um período de medição de 3θ segundos com um limire de confiança de 95% (ddfinido como a probabilidade de uma medição que se encontra em + 2 de Desvio Padrao da leitura do YSI) de uma covariaçao de 11,3% para 50-450 mg/dl (Tabela 7) e ±4,4 mg/dl (Desvio padrao para 0—50 mg/dl.

2. Sistema MPX - Comprimento de onda dual de 30/20 segundos!

Este sistema de comprimento de onda dual proporciona um pe ríodo de medição de 20 segundos nos limites de 0—250 mg/dl e um período de 30 segundos para os limites de 250—450. Os limites de confiança de 95% sao quase idênticos ao sistema MPX de comprimento de onda dual de 3θ segundos (Tabela 7), 11,1% de covariaçao para 5θ—450 mg/dl e +4,6 mg/dl (Desvio Padrao) para 0—50 mg/dl.

TABELA 7

Comparaçao de limites de confiança de 95% para o sistema MPX, Tiras de reagente de GlucoScan Plus e Accu-Check bG

Variagao medição	da Comprimento de onda simples de MPX	Comprimento de MPX	de onda	dual
mg/dl	20 seg. 30 seg·	20 seg,	30 seg.
0-50	11,2 mg/dl 13,8 mg/dl	4,6 mg/dl	4,4 mg/dl
50-250	14,4 14,2	10,6	11,0
250-450	17,6	-	11,6
77-405	= GlucoScan Plus (Drexl	er Clinicai)		15 »9%
77-405	= Accu—Chek bG (Drexler	Clinicai)		10,7%
50-450	= Híbrida dual de 20/30	seg. em Sistema MPX	11,1%
50-450	= Comprimento de onda Dual de 30 seg	• em
	Sistema MPX			11 »3%

íííííííí

Os limites de confiança para MPX encontraram—se a partir de YSI. Os limites de confiança para o GlucoScan Plus e Accu—Chek bG encontraram—se a partir da equaÇao de regres sao vs. YSI que elimina a inclinação devida a pequenas di ferenças na calibragem

EXEMPLO III

Estabilidade:

** A maior parte do trabalho de graduaçao de níveis desenvolvido na optimizaçao da estabilidade foi comple~ TM mentado com a utilizaÇao de discos de membrana Posidyne de 0,8 p humedecidos manualmente. Estabeleceu—se previamente a formulação corante/enzima específica.

1. Estabilidade à Temperatura Ambiente! Este estudo tentou de monstrar graficamente qualquer alteraçao na resposta do re agente da membrana de Posidyne de 0,8 p armazenada a l8°C—20°C sobre dissecante de gel de sílica. Após 2,5 meses nao se verificou alteraçao notória conforme se mediu pela resposta de uma amostra à temperatura ambiente vs. a resposta de uma amostra armazenada a 5°C. Cada medição representava uma variaçao de glicose de 0—450 mg/dl.

2. Estabilidade a 37°£· Desenvolveu-se um estudo da estabilidade utilizando o mesmo reagente do estudo à temperatura ambiente. As diferenças dos valores de glicose do reagente tratado a 37°C vs. reagente à temperatura ambiente, para tiras tratadas com ou sem adesivo, foram graficamente representadas terminado o tempo. Embora os dados fossem ruidosos devido à fraca reprodutibilidade das tiras manuais, a estabilidade foi excelente para tiras quer fossem tratadas com ou sem adesivo.

3. Estabilidade a ^6°Ci Desenvolveram—se 8 estudos de estabilidade de 5 a 6 dias utilizando preparações diferentes de uma formulaÇao semelhante sobre uma membrana de disco (Tabela 8). Para o nível de teste de glicose baixo (80—100 mg/ dl) o valor de glicose médio desceu sobre pressão em 3,4% sendo a descida mais elevada de 9,55%· Para o nível de tes te elevado (280—320 mg/dl) a leitura de glicose diminuiu em média 3»4%, sendo a diminuição mais elevada de 10,0%.

TABELA 8

Estabilidade de pH = 4,0, Reagente de disco de Posidyne de 0,8^i

Formulação	tratada durante 5 dias a 6	dias a 5ó°C
	% da diferença (5Ó°C vs. Ambienie	Amostra à Temperatura )
Amostra No	Y&I V8Õ-1Ò0 mg/dl)	ΪΒΪ (2ÕÔ-320 mg/dl)
FJ22B	-6,25	+ 5,4
FJ27A	-4,0	-5»i4
FJ28B	-2,4	-5,3
FJ30H	-9,55	-10,0
FJ3IC	+4,43	-1,24
FJ36	-3»2	-8,5

- 4l -

FJ48B* -3,0 0,0

GM48A* -3,0 -2,5

Média de 8

-3,4 ^Estas duas amostras contêm duas vezes a concentração normal de enzima e corante.

Um estudo do tratamento desta membrana a 56°C, passado um período de 19 dias, nao apresentou diferenças significativas para tiras tratadas com ou sem adesivo. Nos dois casos a diminuição em 19 dias no valor da glicose foi inferior a 15% em níveis de teste baixo (80—100 mg/dl) e também a 3θθ mg/dl.

Concluiu-se um outro estudo a 56°C utilizando IM uma membrana de Posidyne de 0,8 ji com o dobro da concentra çao normal de enzima e corante. Efectuaram—se duas preparações separadas da mesma formulação e mediu—se a estabilidade após um período de 14 dias. Compararam-se a média dos resultados dos dois estudos. Encontraram—se alterações entre + 0% após o período de 14 dias nos dois níveis de teste de glicose alto e baixo.

EXEMPLOIV

Dimensão da Amostra

As caracteristicas de dimensão da amostra para o sistema MPX estão representados na Tabela 9

TABELA 9

Efeito da Dimensão da Amostra nas Medições do Sistema MPX

Comprimento de onda simples

Dimensão da Amostra (ul)

Comprimento de onda dual

YSI = 56

4l 50 39 31

31 42 30 19 30

TABELA 9 (continuação)

4	44	49	49	49	48	4l	45	44	45	44
5	54	48	49	51	50	50	49	48	49	49
10	48	48	50	47	48	54	53	56	55	54
20	49	49	49	50	49	55	57	58	60	58
			YSI	= 36O
3	301	260	276	286	280	274	232	244	260	252
4	3Ô3	378	367	341	367	361	356	342	318	344
5	398	402	382	370	388	378	387	366	351	370
10	364	362	378	368	368	356	358	379	369	366
20	375	370	38O	378	376	380	382	389	385	384
	0s volumes referidos	! na	Tabela :	foram transf

ridos para a almofada de reagente 10 representa na Figura 1, utilizando uma micropipeta. Quando se aplica sangue de uma pi cada no dedo para uma tira, a totalidade da amostra nao pode ser transferida. Assim, os volumes listados aqui nao represen tam a dimensão da totalidade da amostra necessária a ser espremida de um dedo para análise. Uma amostra de 3 /il é o mini mo necessário para cobrir por completo o círculo da almofada de reagente. Isto nao proporciona amostra suficiente para saturar por completo a almofada de reagente e o sistema MPX, quer a comprimentos de onda somples ou dual, apresenta fracos resultados. Uma amostra de 4 pl mal satura a almofada de reagente, enquanto uma amostra de 5 /il & claramente apropriada. Uma amostra de 10 p.1 & uraa grande gota brilhante e uma amostra de 20 ul ê uma gota muito grande e é só provavelmente uti lizada quando o sangue de uma pipeta se utiliza para constituir amostras.

Na concentração de glicose mais baixa o resul tado do comprimento de onda simples apresenta alguma dependên cia da dimensão da amostra, que é completamente eliminada uti lizando a medição de comprimento de onda dual. Embora esta de pendência com o comprimento de onda simples possa ser conside

- 43 rada aceitável, ê claramente indesejável.

EXEMPLO V

ReprodutibilidadeI

Efectuaram-se sempre com repetição as medições experimentais descritas anteriormente, normalmente 2, 3 ou 4 determinações por ponto de dados. Estes conjuntos apresentaram sempre íntima concordância mesmo em amostras com níveis extremos de oxigénio e hematécritos. As covariaçoes apre sentaram-se bem abaixo dos 5%· Carece assim que a reprodutibi lidade ê muito boa a excelente.

A matéria da presente invenção ê produzida por muitos comercialmente ou tem sido descrita na literatura. Os protocolos sao simples e requerem pouca especialidade técnica e estão relativamente livres de erro do operador. Os testes podem ser efectuados rapidamente. Utilizam reagentes nao dispendiosos e relativamente inofensivos, considerações importantes para os materiais utilizados em casa. 0 utilizador obtêm resultados que podem ser interpretados e utilizados em conjunto com uma terapia de manutenção. Além disto, os reagentes apresentam longa durabilidade, pelo que os resultados obtidos serão de confiança durante longos períodos de tempo.

O equipamento ê simples e seguro e substancialmente automático.

Todas as patentes e outras publicações espeti ficamente identificadas com esta descrição sao indicadoras do nível de especialidade dos peritos comuns da técnica em que a presente invenção se inclui e se encontram aqui individualmen te incorporados por referência ao mesmo âmbito, como acontece ria se cada referência fosse específica e individualmente incorporada por referência.

Estando agora a presente invenção descrita na

totalidade, será aparente para um perito da técnica comum que se podem fazer muitas modificações e alterações sem partir do espirito e do âmbito da presente invenção conforme se defini— ram nas reivindicações que se seguem.

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES

   - ia Processo para posicionar uma fita reagente possuindo um entalhe numa das suas extremidades e uma perfura çao centralizada, com um equipamento de leitura de reflectân— cia que possui uma haste adjacente a um dispositivo de leitura óptica, caracterizado por!

   se ajustar o referido entalhe da fita reagente contra a referida haste do dispositivo de leitura de refle ctância, de modo que o referido entalhe possa rodar em torno da haste de modo a fazer com que a perfuração centralizada se ja colocada sobre o referido dispositivo de leitura óptica.

   - 2β Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o dispositivo de leitura de reflectância possuir um canal em cascata com o referido entalhe, estando a haste localizada no interior desse canal e englobando ainda a fita reagente uma lâmina rectangular fina e estreita com uma largura idêntica â do referido canal e possuindo duas extremi

   - 45 dades, estando o referido entalhe localizado na primeira das referidas extremidades, e por adicionalmente se colocar a referida lâmina rectangular no canal referido após ajustamento do entalhe à referida haste, de modo que a colocação no referido canal proporciona o ajustamento do dispositivo de leitura óptico sob a perfuração centralizada colocada no referido canal.

   - 3^e Processo para alinhar uma fita reagente possuindo um entalhe numa das suas extremidades e uma perfuraÇao centralizada com um dispositivo de leitura de reflectância pos suindo um dispositivo de leitura óptica por baixo de um canal que possui aproximadamente a mesma largura da referida fita reagente, possuindo ainda esse canal uma haste numa das suas extremidades, caracterizado por se colocar a fita no referido canal e por permitir o ajustamento do referido entalhe à haste, rodando depois a referida fita em torno da haste de-modo que a perfuração centralizada fique colocada sobre o referido dispositivo de leitura óptica, ficando a fita reagente bem co locada no referido canal·

   - 4a Processo para cronometrar uma medição num dis positivo de leitura de reflectância, caracterizado por!

   se fazer pelo menos uma primeira leitura de re flectância óptica a partir de uma primeira superfície de uma matriz porosa numa fita reagente, antes da aplicaçao de uma amostra à segunda superfície da referida matriz^ se fazer pelo menos uma leitura de reflectân— cia adicional a partir da referida primeira superficiej e

   46 5?

   se comparar a referida leitura de reflectância adicional com a primeira leitura de reflectância e se ini ciar a medição do tempo após uma queda pró-determinada na reflectância resultante do facto de a referida amostra atingir a referida primeira superfície.

   - 5^a Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por se fazer pelo menos uma medição da leitura de reflectância num momento pró—determinado depois de a referida leitura adicional de reflectância diferir do referido valor de reflectância pelo valor da diferença pró—determinada.

   - 6a Processo de acordo com a reivindicação 5> caracterizado por a referida superfície se encontrar inicialraen te seca e por a referida leitura de reflectância adicional di ferir do referido primeiro valor de reflectância quando um meio de ensaio líquido constituído por uma tinta misturada com o sangue penetra na referida primeira superfície da referida matriz.

   Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a referida tinta precursora ser uma combinação de glicose oxidase, peroxidase e de um corante MBTH—DMAB (cloridrato de 3—metil—2—benzo—tiazolinona hidrazona e ácido 3—dimetil—amino—benzóico)·

   - 47 8a Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o referido tempo pré—determinado ser pelo menos 20 segundos.

   _ 9 a _

   Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o referido tempo pré-determinado ser de pelo menos 30 segundos.

   Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o referido tempo pré—determinado ser no máximo de 30 segundos.

   - lia Processo para normalizar a comutaçao de refle ctância num sistema que possui um leitor Sptico susceptível de ler a reflectância da luz emitida por uma diversidade de diodos emissores de luz (LED), sendo essa luz reflectida para o referido leitor Sptico a partir de uma membrana porosa, caracterizado por:

   se explorar a referida membrana porosa à procura de uma leitura de reflectância da intensidade dos referi dos LEDS antes de se colocar uma amostra de ensaioj se introduzir a referida leitura nos meios de controlo, sendo esses meios de controlo susceptíveis de arma— zenar leituras da intensidade dos referidos LEDS, sendo os re feridos meios de controlo capazes ainda de igualar a diferença entre um par de leituras do LED inicial e subsequente} e se utilizarem os referidos meios de controlo para activar a potância que permite ajustar a intensidade dos LEDS para proporcionar a mesma leitura de reflectância para cada LED·

   - 12a Processo para a determinação dos níveis de glicose no sangue caracterizado por:

   se colocar uma gota de sangue numa fita reagente j se colocar a referida fita num aparelho de me dida por exploração da reflectância em que o referido aparelho de medida ê sensível à presença da amostra de sangue na referida fita reagente, iniciando o aparelho de medida por ex ploraçao da reflectância uma sequencia temporal depois de detectar a presença da referida amostra de sangue na fita reagente} se fazerem medições de reflectancia '· (l) a partir da luminosidade própria do referido aparelho de medida (R_b)i (2) antes de a referida fita reagente conter sangue (R )} e (3) num momento pró—determinado (R^)> e calculando se co depois R t em que

   R t = (R —R )/(R -R, ) } t b seco b utilizando R t para calcular K/S—t, em que se define K/S—t co mo (l-R*t)²/(2xR*t) i e se calcularem os níveis de glicose a partir do referido valor K/S-t.

   - 13a - 49 Processo de acordo com a reivindicação 12, ca racterizado por o tempo pré—determinado ser de 20 segundos e por se definir o nível de glicose do modo seguinte: -55,75 + + 0.1632 x (κ/s-t) - (5.765 x IO^-5) x (K/S-t)² + (2.58 x x 10^-8) x (K/S-t)³.

   - 14a _

   Processo de acordo com a reivindicação 12, ca racterizado por o tempo pré—determinado ser de 30 segundos e o nível de glicose ser definido do modo seguinte: —55*25 + + 0.1334 x (K/S-t) - (2.241 x 10~⁵) x (K/S-t)² + (l.20 x xlO^-8) x (K/S-t)³.

   - 15Ô Processo para a determinação de níveis de gli cose no sangue caracterizado por:

   se colocar uma gota de sangue nu a fita reagente) se colocar a referida fita num aparelho de me dida por exploração da reflectância, sendo o referido aparelho de medida sensível à presença da amostra de sangue na referida fita reagente, iniciando o aparelho de medida por exploraÇao de reflectância uma sequencia temporal depois de de— tectar a presença da referida amostra de sangue na fita reagente ) se fazerem medições de reflectância: (l) a partir da luminosidade própria do referido aparelho de medida (R_b)j (2) antes da referida fita reagente conter sangue ^sec<?’ ^³^ decorridos 15 segundos após a fita reagente conter sangue ^e num momento final pré—determinado (R^.) se utilizarem as referidas leituras para cal50 - cular R*15 e R*t de acordo com as propriedades seguintes!

   ^¹⁵ = ^(R15 - V^seco’ V K«t = (R_t - R_b)/(R_seco - V ί se calcularem os níveis K/S e K/S , sendo ±5 t os referidos níveis definidos do modo seguinte:

   ^K/S15 ^{= (1_R}*¹⁵)^2/í2xR*15)

   K/S_t = (1-R^xt)²/(2xR*t);

   se normalizar o referido valor K/S^^ para se chegar a um valor K/S definido por lpn

   K/S

   15n ^{= (1}’^{54 x K/S}15^} ~ °»¹333i se chegar a um valor K)S definido por

   X bl/

   K/S_t/JL5 = vs_t - K/S_15n; e se utilizar o referido valor K/S^^^^ para cal cular os referidos níveis de glicose.

   - 16a Processo de acordo com a reivindicação 15, ca racterizado por o tempo pré-determinado ser de 20 segundos e por se definir o referido nível de glicose do modo seguinte:

   -0,01388 + O,io64 x (^R/^St/₁₅) + (6,259 x 10^-5) x x (K/St/15)²-(6,12 x 10~⁸) x (K/St/15)³ + + (3,21 χ 10^-11) x (^K/^St/₁₅)⁴- 17^a Processo de acordo com a reivindicação 15, ca racterizado por o referido tempo predeterminado ser de 3θ segundos e se definir o referido nível de glicose (YSI) do modo

   51 _4 seguinte; 1,099 + 0,05235 x (K/^St/₁₅> ^{+ (l}’^{229 x 10 x} x (K/St/15)² - (5,83 x 10^-8) x (K/St/15)³ + + (1,30 χ ίο^-11) x (K/s_t/15)\

   - 18a Processo de acordo com qualquer das reivindi— caçoes anteriores, caracterizado por a referida fita reagente ser constituída por uma matriz porosa} um sistema gerador de sinal na referida matriz porosa para reacçao com a amostra de sangue completoj e uma aba ligada à referida matriz porosa para > ** manusear a referida fita reagente apos a colocaçao da amostra de sangue na matriz porosa.

   - 19^a reivindicação 18, ca ser constituida por berturas com dimen—

   Processo de acordo com a racterizado por a referida matriz porosa uma membrana hidrofílica a qual contêm a soes entre 0,6 micra e 1,0 micron.

   - 20a Processo de acordo com a reivindicação 18, ca racterizado por o referido sistema gerador de sinal ser constituído por glicose oxidase, peroxidase e um indicador corante

   - 2ia 52 Processo de acordo com a reivindicação 20, ca racterizado por o referido indicador corante ser um indicador MBTH-DMAB (cloridrato de 3^_metil-2-benzo-tiazolinona hidrazona e ácido 3—dimetil-amino—benzóico).

   - 22S Processo de acordo com a reivindicação 18, ca racterizado por a referida matriz porosa ser mantida de forma estável com um valor de pH inferior a 4,8 e numa solução citrato a 10% aproximadamente.

   - 23^a Processo de acordo com a reivindicação 22, ca racterizado por a referida matriz porosa ser mantida de uma forma estável para valores de pH próximos de 4,0.

   - 24a Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores para a medição de glicose numa amostra de sangue completo em que a referida fita reagente está adaptada para colocaçao no equipamento de leitura de reflectância, caracterizado por a referida fita ser constituída por!

   uma membrana hidrofílica porosa possuindo poros com dimensões entre 0,6 micra e 1,0 micron aproximadamente um sistema gerador de sinal de glicose oxidase, peroxidase e um indicador corante incorporado na referida membrana para reacçao com a amostra de sangue completo) e una aba ligada à referida matriz porosa para

   53 manusear a referida fita reagente depois da colocaçao da amos tra de sangue na matriz porosa.

   - 25^a Processo de acordo com a reivindicação 24, ca racterizado por se manter a fita reagente com um valor de pH inferior a 4,8 e numa solução de citrato a 10% aproximadamente.

   - 26a Processo de acordo com a reivindicação 25, ca racterizado por o valor do pH ser cerca de 4,0.

   - 27^a Processo de acordo com a reivindicação 24, ca racterizado por o referido indicador corante ser um indicador MBTH-DMAB.

   - 28a _

   Processo de acordo com a reivindicação 24, ca racterizado por se manter a membrana hidrofílica numa solução de poliamida com uma carga positiva e por conter pelo menos dois lados lisos, estando o primeiro dos referidos lados liga do à referida aba, sendo possível colocar a amostra do sangue no referido primeiro lado de modo que a amostra migre para o segundo dos referidos lados.

   54 293 Processo de acordo com a reivindicação 24, ca racterizado por a referida aba ser constituída por uma lâmina rectangular que possui duas extremidades, contando a lâmina ** «tf rectangular uma perfuração centralizada para ligaçao a referi da membrana porosa, e possuindo a referida lâmina rectangular um entalhe cortado numa das referidas extremidades.

   Processo de acordo com a reivindicação 29, ca racterizado por o referido entalhe ser susceptivel de ajustamento a uma haste sobre o dispositivo de leitura de reflectân cia para garantir um alinhamento repetitivo da referida membrana sobre um leitor de reflectância.

   Processo de acordo com a reivindicação 29, ca racterizado por a referida membrana hidrofílica conter dois lados lisos, estando o primeiro dos referidos lados lisos da membrana ligado a referida aba na perfuração centralizada, e sendo possível inserir a amostra de sangue no primeiro lado da membrana através da referida perfuração de modo que a amos tra migre para o segundo lado da membrana lisa.

   - 32a Processo de acordo com a reivindicação 31» ca racterizado por a referida fita reagente estar preparada para leitura pelo aparelho de medição de reflectáncia após saturaÇao do referido segundo lado da membrana lisa.

   - 33^a Processo de acordo com a reivindicação 32, ca racterizado por o referido segundo lado da membrana lisa pos— suir uma area compreendida aproximadamente entre 10 mnr e 5θ mm 2

   - 34a Processo de acordo com a reivindicação 33, ca racterizado por o referido segundo lado da membrana lisa possuir um diâmetro compreendido aproximadamente entre 2 mm e 10 mm.

   - 35^a Processo de acordo com a reivindicação 32, ca racterizado por o referido segundo lado da membrana se encontrar preparado para leitura pelo equipamento de medição de re flectáncia depois da colocaçao de um volume vompreendido apro ximadamente entre 5 microlitros e 10 microlitros de amostra de sangue sobre a referida membrana hidrofílica.

   - 36a Processo de acordo com a reivindicação 32, ca

   56 racterizado por o referido segundo lado da membrana se encontrar preparado para leitura pelo referido segundo lado da tnem brana lisa sem separaÇao da amostra de sangue nas suas partes componentes.

   - 37a Processo de acordo com a reivindicação 32, ca racterizado por o referido segundo lado da membrana se encon— trar preparado para leitura apos colocaçao de um volume limiar da referida amostra de sangue sobre a membrana hidrofílica, sendo a fita reagente susceptível de ler a amostra de sangue apesar do volume dessa amostra na fita reagente ficar acima do referido volume limiar.

   Processo de acordo com a reivindicação 37, ca racterizado por o referido voiume limiar estar compreendido entre 5 microlitros e 10 microlitros da referida amostra de sangue completo.

   - 39a Processo de acordo com qualquer das reivindicaçoes anteriores para a medição de glicose numa amostra de sangue completo, estando a fita reagente adaptada para coloca ·* A çao num equipamento de leitura de reflectância, caracterizado por a referida fita ser constituida por!

   uma aba adaptada para colocaçao no referido equipamento de leitura de reflectância, englobando a referida aba uma fina lâmina rectangular possuindo duas extremidades de cada lado de uma perfuração centralizada com um diâmetro compreendido aproximadamente entre 2 mm e 10 mm, em que uma das referidas extremidades possui um entalhe que se prolonga sensivelmente até ao meio a partir da referida extremidadej por uma membrana hidrofílica porosa que possui dois lados lisos estando um primeiro dos referidos lados ligados à aba na perfuração centralizada, contendo a referida membrana*poros que possuem abertura com dimensões compreendidas entre 0,6 micra e 1,0 micronj e por uma solução corante incorporada na referi da membrana porosa incluindo glicose oxidase, peroxidase e um indicador MBTH—DMAB mantendo—se a referida solução corante na membrana hidrofílica com valor de pH próximos de 4,8 e numa solução de citrato de 10%, sendo a referida fita reagente susceptível de medir amostras de sangue completo sem que haja separaçao da referida amostra nos seus componentes depois de se ter coloca do um volume limiar de amostra de sangue na referida membrana hidro fíli ca.

   Processo de acordo com a reivindicação 39, ca racterizado por a referida amostra de sangue poder ser coloca da através da referida perfuração centralizada sobre o referi do primeiro lado da membrana hidrofílica e em que a amostra de sangue ê susceptível de migrar para o referido segundo lado da membrana hidrofílica, podendo as leituras das medidas de reflectancia ser efectuadas pelo equipamento de leitura de reflectancia.

   - 4ia Processo de acordo com a reivindicação 40, ca

   58 racterizado por o referido volume limiar estar compreendido aproximadamente entre 5 microlitros e 10 microlitros da referida amostra de sangue completo.

   A requerente reivindica a prioridade do pedido norte—americano apresentado em 28 de Abril de 1988, sob o número de série 187,602.

   Lisboa, 27 de Abril de 19θ9· • ÀGEwrí QfieiAL βΑ *POr»>£BAfií I*3usr««

   59 RESUMO

   PROCESSO E DISPOSITIVO PARÂ A DETERMINAÇAO COLORIMÉTRICA DE COMPOSTOS QUÍMICOS E BIOQUÍMICOS (ANALÍTICOS) EM FLUIDOS AQUOSOS

   A presente invenção refere-se a um processo para a determinação da presença de um analito (componentes químicos e bioquímicos em fluidos aquosos) num fluido, em con junto com diversos componentes de um equipamento especialmen— te projectado para executar o processo.

   «rf

   0 processo implica a realizaçao de uma leitura de reflectância a partir de uma superfície de uma matriz porosa inerte impregnada com um reagente que irá interactuar com o analito (componentes químicos e bioquímicos em fluidos . ** aquosos) para proporcionar um produto de reacçao absorvente de luz quando se aplica o fluido que vai ser analizado a outra superfície e migra através da matriz para a superfície que

   A ** vai ser lida. As medidas de reflectância sao feitas em dois comprimentos de onda separados no sentido de eliminar interfe rências, accionando—se um circuito de cronometragem através da diminuição iniciai da reflectância por humedecimento da su perfície cuja reflectância vai ser medida, devido ao fluido que passa através da matriz inerte. Garante—se a possibilidade de repetição através de uma técnica de normalizaçao adapta da à fonte de luz antes de cada leitura, e através de um processo de alinhamento executado sobre a fita reagente antes da «rf «rf colocaÇao no aparelho. 0 processo e o aparelho sao particular mente adequados para a medição de níveis de glicose no sangue sem que seja necessário separar do soro e do plasma as células vermelhas do sangue.