PT89041B

PT89041B - Metodo de preparacao de diagnosticos e vacinas nanbv

Info

Publication number: PT89041B
Application number: PT8904188A
Authority: PT
Inventors: Michael Houghton; Qui-Lim Choo; George Kuo
Original assignee: Chiron Corp
Priority date: 1987-11-18
Filing date: 1988-11-18
Publication date: 1993-03-31
Also published as: IL88420A0; IL88420A; PT89041A

Description

VIVIRIDAE (Seriss eds, Fraenkel-Conrat e Wagner, vol. eds, Schlesinger e Schlesinger, Plenurn Press), págs, 327-374.

Broach (1981) em: Molecular Biology of the íeast 5accharomyees Vol 1, p, 445, Cold Spring Harbor Press,

Broach et ^1. (1983), Meth. Enz. 101:307.

Chang et al, (l977), Nature 198?1056.

Chirgwin et al, (l979), Biochernistry 18; 5294.

Chomczynski e Sacchi (1987), Analytical Biochernistry 162:156. Clewell et al. ,(1969), Proc. Natl. Acad. Sei, E.U.A, 62; 1159« Clewell (1972), J, Baoteriol. 110:667.

Cohen (1972), Proc. Natl, Acad. Sei. E.U.A, 69:2110.

Cousens et al, (1987), gene 6l:-265«

De Boer et al. (1983), Prop. Natl. Acad, Sei. E.U.A. 292:128. Dreesman et al. (1985), J.Infect. Disease 151?76l.

Feinstone, S.M. e Hoofnagle, J.H. (1984), New Engl. J. Med,

331:185.

Fields & Knipe (1986), FUNDAMENTAL VIROLOGY (Raven Press, N.Y.) Fiers et al. (1978), Nature 273:113.

Gerety, R.J. et al., em VIRAL HEPATITIS AND LIVER DISEASE (Vyas, B.N., Dienstag, J.L., e Hoofnagle, J.H., eds. Grune and Stratton, Inc., 1984) págs, 23-47.

Goeddel et al, (ΐ9θθ), Nucleic Acids Res. 8:4-057,

Graham e Van der Eb (1978),.Virology 5²:546.

Grunstein e Hogness (1975), Proc. Natl. Acad. Sei, E.U,A. 73? :39ól.

Grych et al, (1985), Nature 316:74,

Gubler e Hoffman (1983), Gene 2^:263.

Hammerling*et al. (l98l), MONOCLONAL ANTIBODIES AND T-CELL HYBRIDOWAS.

Hess et al. (1968), J. Adv. Enzyme Reg (7,:149.

Hinnen et al, (ΐ97θ)» Proc. Natl. Acad, Sei, 75:1929.

Hitzeman et al(1980), J. Biol, Chem, 255:5073.

Holland et al. (1978), Biochemistry 17;4900♦

Holland (1981), J. Biol. Chem. 256:1385.

Houghton et al, (1981), Nucleic Acids Res, (9:247.

Hunyh, T.V, et al. (1985) em DNA CLONING TECHNIQUES; A PRACTI

CAL APPROACH (D. Glover, Ed., IRL Press, Oxford, Reino Uni do) págs. 49-78.

Immun, Rev, (1982) 62;I85.

Iwarson (1987), British Medicai J, 295:946..

Kennett et al. (1980) MONOCLONAL ANTIBODIES,

Laemmli (1970), Nature 227, 680,

Lee et al, (1988), Science 239:1288.

Maniatis, T., et al. (1982) MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)

Mayer and Walker, eds, (198?), IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Academic Press, London).

Maxam et al, (ΐ9θθ), Methods in Enzymology 65;499·

MacNamara et al. (1984), Science 226:1353.

Messing et al, (ΐ9θΐ), Nucleic Acids Res, 2.^{3θ9·

Messing (1983), Methods in Enzymology 101;20-37»

METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press),

Michelle et al., Int. Symposium on Virai Hepatitis,

Monath (1986) in THE VIRUSES: THE TOGAVIRADAE AND FLAVIVIRIDAE (Series eds, Praenkel-Conrat and Wagner, vol.eds, Schlesinger and Schlesinger, Plenum Press), págs, 375-440. Nagahuma et al. (1984), Anal. Biochem, l4l;74,

Neurath et al. (1984), Science 224;392.

Nisonoff et al, (l98l), Clin. Immunol. Immunopathol. 21:397-406.

Overby, L.R. (1985), Curr. Hepatol. 5:49.

Overby, L.R. (1986), Curr, Hepatol. 6:65,

Overby, L.R. (1987), Curr, Hepatol, 7:35.

Peleg (1969), Nature 221:193 .

Pfefferkorn e Shapiro (1974), em COMPREHENSIVE VTROLOGY, Vol, (Fraenkel-Conrat & Wagner, eds,, Plenum, N.Y.) págs. 171

-23O.

Prince, A.M. (1983)» Annu. Rev. Microbiol, 37:217.

Rice et al. (1986) , em THE 'VIRUSES: THE TOGAVIRIDAE ANI) FLAVI

VIRIDAE (Series eds. Fraenkel-Conrat & Wagner, vol. eds.

Schlesinger and Schlesinger, Plenum Press), págs, 279-328. Roehrig (1986) em THE VIRUSES; THE TOGAVIRIDAE AND FLAVIVIRIDAE (Series eds, Fraenkel-Conrat & Wagner, vol. eds. Schle singer and Schlesinger, Plenum Press).

Sadler et al. (1980), Gene 8, 279.

Saiki et al. (1986), Nature 3241163,

Sanger et al, (1977), Proc, Natl. Acad. Scl, E.U.A, 74:5463. Schlesinger et al. (1986), J, Virol» 60:1153♦

Schreier , M., et al, (ΐ9θθ) HYBRIDOMA TECHNIQUES.

Scopes (1984), PROTEIN PURJFICATION, PRINCIPLES AND PRACTICE,

SECOND EDITION (Springer-Verlag, N, Y.).

Shimatake et al. (l98l), Nature 292;128.

Steimer et al. (1986), J. Virol. 58:9.

Stollar (ΐ98θ), in THE TOGAVIRUSES (R.W. Schl esinger, ed, Aca demic Press, N.Y.) págs, 584-622,

Taylor et al, (1976), Biochem, Biophys. Acta 442: 324,

Towbin et al. (1979), Proc. Natl. Acad. Sei, E.U,A, 76, 4350, Tsu e Herzenherg (1980), em SELECTED METHODS IN CELLULAR WIU

NOLOGY (W.H, Freeman and Co.) págs. 373-391.

Vytdehaag et al, (1985), J. Immunol. 134:1225,

Valenzuela, P., et al. (1982), Nature 298:344.

Valenzuela, P,, et al. (1984), em HEPATITIS B (Millman, I,, et al., ed, Plenum Press) págs, 225-236,

Warner (1984), DNA 3.:401,

Wu e Grossman (1987), Methods in Enzymology Vol, 154, RECQMBI

NANT DNA, Part E.

Wu (1987), Methods in Enzymology vol. 155, RECOMBINANT DNA, part F,

Zoller (1982), Nucleic Acids Res, 10:6487,

Patentes Citadas

Patente

Patente norte-americana No, norte-americana No, norte-americana No, norte-ámericana No.

norte-americana No.

norte-americana No, norte-ainericana No.

norte-americana No.

4.341,761 4,399.121 4.427.783 4.444.887 4.466,917 4.472.5OO 4.491.632 4,493.890

Técnica Anterior

A hepatite Não-A e NSo-B (NANBH) ê uma doença ou família

de doenças transmissíveis que se crê serem induzidas por vírus, e que são distinguíveis de outras formas de doenças do fígado associadas com vírus, incluindo as causadas pelas conhecidas viroses de hepatite, isto é, vírus de hepatite A (HAV), vírus de hepatite B (HBV), e vírus de hepatite delta (HDV), assim como a hepatite induzida por citomegalovírus (CMV) ou vírus Epstein-Barr (EBV), A NANBH foi primeiramente identificada em indivíduos inoculados. A transmissão do homem para o chimpanzé e a passagem em série em chimpanzés proporciona a evidência de que a NANBH é devida a um agente ou agentes infecciosos transmissíveis. Todavia, o agente transmissível responsável p<e t

la NANBH não está ainda identificado e o número de agentes que são causadores da doença são desconhecidos,

A evidência epidemiolégica sugere que podem existir três tipos de NANBH: o tipo epidémico transportado pela água; o tipo associado a sangue ou agulha; e o tipo (comunitariamente adquirido) que ocorre esporadicamente. Todavia, o número de agentes que podem ser causadores de NANBH é desconheci do.

A diagnose e identificação clínicas de NANBH têm sido realizadas principalmente por exclusão de outros marcadores virais. Entre os métodos utilizados para detectar antigenes e anticorpos supostos de NANBH estão a difusão agar-gel, contra-imunoelectroforese, microscopia de irnunof luorescência, microscopia de electrão imune, ensaio de radio-imunidade e ensaio imunoabsorvente ligado a enzima. Todavia, nenhum destes ensaios provou ser suficientemente sensível, específico e

- 6 reprodutível para, ser utilizado como urn teste de diagnóstico para NANBH.

Ate agora não tem existido nern clareza nem acordo quanto à identidade ou especificidade dos sistemas antigene anticorpo associados com agentes de NANBH, Isto é devido, pelo menos em parte, à anterior ou co-infecção de HBV com NANBV em indivíduos, e à conhecida complexidade dos antigenes solúveis, e em partículas,associados com HBV, assim como à integração de HBV DNA no genoma de células de fígado. Além disso, exis te a possibilidade de o NANBH ser provocado por mais que um agente infeccioso, bem como a possibilidade de o NANBH ter sido não diagnosricado. Além disso, não e claro que os ensaios serológicos detectem no soro de doentes com NANBH. Tem sido admitido que os ensaios de difusão agar-gel e contra-imuno electr<o forese detectam respostas aytoimunes ou interacções de proteína não-específicas que algumas vezes ocorrem entre espécimes de so, ro, e que os mesmos não representam reacções específicas antigene-anticorpo de NANBH. A imunofluorescência, e o imunoabsorvente ligado a enzima, e ensaios de radioimunidade parecem detectar baixos níveis de um material análogo ao factor reurnatói . de que está frequentemente presente no soro dos doentes com NANBH, assim como em doentes com doenças hepáticas e não hepáticas, Parte da reactividade detectada pode representar um anticorpo para antigenes citoplásmicos de um hospedeiro determinado .

Existe um certo número de candidatos a NANBV. Ver por exemplo as revistas de Prince (1983), Feinstone e Hoof nagle (1984), e Overby (1985, 1986, 19θ7) θ o artigo de Iwar- 7 a son

(1987). Contudo, não existe prova de que qualquer destes candidatos represente o agente etiológico de NANBH,

A procura de métodos sensitivos, específicos, para screeninge identificar veículos de NANBV e sangue ou produtos de sangue contaminados por NANBV é significativa. A hepa tite pos-transfusão (PTH) ocorre em aproximadamente 10% dos pa cientes inoculados, e a NANBH corita-se ate 90$ destes casos, 0 problema maior nesta doença é a progressão frequente para a da nificação crónica do fígado (25-55$),

Os cuidados cora o paciente assim como a prevenção da transmissão de NANBH pelo sangue e produtos de sangue ou por estreito contacto pessoal exige diagnóstico seguro e utensílios de prognóstico para detectar ácidos nucleícos, antigenes e anticorpos relacionados com NANBV, Além disso, existe também uma necessidade de vacinas eficazes e de agentes terapêuticos imunoterapêuticos para a prevenção e/ou tratamento da doença.

Revelação da Invenção

A invenção diz respeito ao isolamento e caracterização de um agente etiológico recentemente desooberto de NANBH, vírus da hepatite, C (HCV). Mais especificamente, a invenção proporciona uma família de réplicas cDNA de porções do genoma HCV. Estas réplicas cDNA foram isoladas por uma téc; nica que incluía uma nova fase de scresning de produtos de expressão provenientes de librarias cDNAjcriadas a partir de um agente em partículas em tecido infectado com soros provenientes de doentes com NANBH,para detectar antigenes recente8 mente sintetizados derivados do genoma do agente virai até agora não isolado e não caracterizado, e os clones escolhidos os quais produzem produtos que reagem imunologicamente apenas como soros provenientes de indivíduos infectados, em comparação com indivíduos não infectados.

Estudos da natureza do genoma do HCV, utilizando sondas derivadas do HCV cDNA, assim como informação de sequencia contida dentro do HCV cDNA, são sugestivas de que o HCV é um Flavivirus ou um vírus Flavi análogo.

Porções das sequências cDNA derivadas de HCV são úteis como sondas para a diagnose de presença de vírus em amostras, e para isolar as variantes do vírus que ocorrem natu ralmente. Estes cDNA’s tornam também·disponíveis sequências de

I polipéptido de antigenes HCV codificados dentro do(s) genoma(s) e permitem a produção de polipéptidos que são úteis como padrões ou reagentes nos testes de diagnóstico e/ou como componentes de vacinas. Anticorpos, tanto policlonais como monoclonais, dirigidos contra epitop.es HCV contidos dentro destas sequências de polipéptido são também úteis para teste de diagnéstico, como agentes terapêuticos, para screening dos agen tes antivirais, e para o isolamento do agente NANBV do qual e.s tes cDNA*s derivam. Além disso, utilizando sondas derivadas destes cDNA's é possível isolar e sequenciar outras porções do genoma HCV, dando assim lugar a sondas e polipéptidos adicionais que são úteis na diagnose e/ou tratamento, tanto profiláticos como terapêuticos, de NANBH,·

De acordo com isto, em relação aos polinucleó^

- 9 tidos, alguns aspectos da invenção são: um polinucleótido HCV purificado; um polinucleótido HCV recombinante; um polinucleótido recombinante que compreende uma sequência derivada do genoma HCV ou de HCV cDNA; um polinucleótido recombinante codifi cando um epítope de HCV; um vector recombinante contendo qualquer dos polinucleótidos recombinantes acima, e uma célula hos pedeira transformada por qualquer destes vectores.

Outros aspectos da invenção são: um sistema de expressão recombinante compreendendo uma estrutura de leitu ra aberta (ORF) de DNA derivado de um genoma HCV ou de HCV cDNA, em que a ORF está operacionalmente ligada a uma sequência t

de controle compatível com um hospedeiro desejado, uma célula transformada pelo sistema de expressão recombinante, e um poli péptido produzido pela célula transformada.

Ainda outros aspectos da invenção são: HCV purificado, uma preparação de polipéptidos a partir do HCV pu rificado; um polipéptido HCV purificado; um polipéptido puri ficado compreendendo um epítope que é imunologicamente identificável com um epítope contido em HCV,

Aspectos incluídos na invenção são um polipéja tido HCV recombinante; um polipéptido recombinante composto por uma sequência derivada de um genoma HCV ou de HCV cDNA . _umpolipéptido recombinante constituído por um epítope HCV; e um polipéptido de fusão constituído por um polipéptido HCV.

Também incluídos na invenção estão um anticorpo monoclonal dirigido contra um epítope HCV; e uma preparja ção purificada de anticorpos policlonais dirigida contra um epítope HCV.

Outro aspecto da invenção é uma partícula que é imunogénica contra a infecção do HCV compreendendo um polipéptido nâo-HCV tendo uma sequência de aminoácido capaz de formar uma partícula quando a referida sequência é produzida num hospedeiro eucariótico, e um epítope HCV,

Ainda outro aspecto da invenção é uma sonda de polinucleótido para HCV,

Aspectos da invenção que pertencem a conjun tos são os destinados a: amostras de análise para a presença de polinucleotidos derivados de HCV compreendendo uma sonda de polinucleótido, contendo uma sequência de nucleótido proveniente de HCV de cerca de 8 ou mais nucleotidos, num recipien te adequado; amostras de análise para a presença de um antigene HCV compreendendo um anticorpo dirigido contra o antigene HCV a ser detectado, num recipiente adequado; amostras de análise para a presença de um anticorpo dirigido contra um antigjí ne HCV compreendendo um polipéptido contendo um epítope HCV presente no antigene HCV, num recipiente adequado.

Outros aspectos da invenção são: um polipep tido que compreende um epítope HCV ligado a um substrato sólido; e um anticorpo para um epítope HCV, ligado a um substrato soli. do.

Ainda outros aspectos da invenção são: um mé todo para produzir um polipéptido contendo um epítope HCV compreen^ dendo células de hospedeiro de incubação transformadas com um vector de expressão contendo uma sequência codificando um polipéptido que contém um epítope HCV sob condições que permitem a expressão do referido polipéptido; e um polipéptido contendo um epítope HCV produzido por este método.

A invençSo inclui também um método para dete£ tar ácidos nucleicos HCV, numa amostra que inclui ácidas nuclei cos reactivos da amostra com uma sonda para um polinucleotido HCV,sob condições que permitem a formação de um polinucleotido duplex entre a sonda e o ácido nucleico HCV, da amostra, e detectando um polinucleotido duplex que contém a sonda.

Os imunoensaios estão também incluídos na invenção, Estes incluem um imunoensaio parã detectar um antigene HCV que compreende incubar uma amostra suspeita de conter um an tigene HCV com ura anticorpo de sonda dirigido contra o antigene HCV a ser detectado,sob condições'que permitem a formação de um complexo antigene-anticorpoj e detectar um complexo antigene-an ticorpo contendo o anticorpo de sonda. Um imunoensaio para dete£ tar anticorpos dirigidos contra um antigene HCV compreendendo incubar uma amostra suspeita de conter anticorpos anti-HCV com um polipéptido de sonda que contém um epítope de HCV, sob condi^ ções que permitem a formação de um complexo anticorpo-antigene; e detectar o complexo anticorpo-antigene que contém o antigene sonda.

Também incluídas na invenção estão vacinas pa ra tratamento da infecçâo HCV compreendendo um péptido imunogénico contendo um epítope HCV, ou uma preparação inactiuada da HCV, ou uma preparação atenuada de HCV.

Outro aspecto da invenção é uma célula desenvolvida em cultura de tecido, infectada com HCV,

Ainda outra aspecto da invenção é um método para produzir anticorpos para HCV que compreende administrar a um indivíduo um polipéptido imunogénico isolado contendo um epí t ope HCV, numa quantidade suficiente para produzir uma resposta imune.

Mais outro aspecto da invenção é um método para isolar cDNA derivado do genoma de um agente infeccioso não identificado, compreendendo: (a) proporcionar células hospedeiras transformadas com vectores de expressão contendo uma libraria cDNA preparada a partir de ácidos nucleicos isolados a partir de tecido infectado com o agBnte_?e desenvolvendo as referidas células hospedeiras sob condições que permitem a expressão de polipéptido(s) codificados no cDNA; (b) interaccionar os produtos de expressão do cDNA com dm anticorpo contendo componente de corpo de um indivíduo infectado com o referido agente in feccioso ,sob condições que permitem uma imunoreacção, e detectar complexos anticorpo-antigene formados como um resultado da interacção; (c) desenvolver células hospedeiras que expressam polipéptidos que formam complexos anticorpo-antigene na fase (b) sob condições que permitem o seu desenvolvimento como clones individuais e isolar os referidos clones; (d) desenvolver célu las a partir dos clones de (c) sob condições que permitem a expressão de polipéptido(s ) codificado(s) dentro do cDNA, e inter cionar os produtos de expressão com anticorpo contendo componen tes de corpo de indivíduos diferentes do indivíduo na fase (a) os quais são infectados com o agente infeccioso e com indivíduos de controle não infectados com o agente, e detectando complexos anticorpo-antigene formados como um resultado da intera£ ção; (e) desenvolver células hospedeiras que expressam polipég tidos que formam complexos anticorpo-antigene com um anticorpo contendo componentes de corpo de indivíduos infectados e indi víduos Suspeitos de estarem infectados, e não com os referidos componentes de indivíduos de cõntrole, sob condiçoes que permitem o seu desenvolvimento como clones individuais, e iso lando os referidos clones; e(f) isolar ta cDNA a partir dos clones da célula hospedeira de (e).

Breve Descrição dos Desenhos

A Fig. 1 mostra a sequência de nucleotido de du pia fibra de HCV cDNA inserido no clone 5-1-1, e a sequência putativa de aminoácido do polipéptido codificade no mesmo.

A Fig, 2 mostra as liomologias das sequências HCV cDNA que se sobrepõem em clones 5-1-1, 81, 1-2, e 91.

A Fig, 3 mostra uma sequência compósita de HCV cDNA derivada dos clones que se sobrepõem 81, 1-2, e 91, e a sequência de aminoácido codificada na mesma,’

A Fig. 4 mostra a sequência de nucleotido de du pia fibra do HCV cDNA inserido no clone 8l, e a sequência puta tiva do aminoácido d.o polipéptido codificada na mesma,

A Fig. 5 mostra a sequência HCV cDNA no clone 36, o segmento que se sobrepõe a NANBV cDNA do clone 8l, e a sequência de polipéptido codificada dentro do clone 36,

A Fig. 6 mostra a ORF combinada de HCV cDNAs nos clones 36 e 8l, e o polipéptido codificado nos mesmos,

A Fig. 7 mostra a sequência HCV cDNA no clone 32, o segmento que se sobrepõe ao clone 8l, e o polipéptido co. dificado nos mesmos.

A Fig, 8 mostra a sequência HCV cDNA no clone 35, o segmento que se sobrepõe ao clone 36, e o polipêptido co_ dificado nos meamos.

A Fig, 9 mostra a ORF combinada de HCV cDNAs nos clones 35, 36, 81 e 32, e o polipêptido codificado nos mesmos,

A Fig. 10 mostra a sequência HCV cDNA no clone 37b, o segmento que se sobrepõe ao clone 35, θ o polipêptido codificado nos mesmos,

A Fig, 11 mostra a sequência HCV cDNA no clone 33b, o segmento que se sobrepõe ao clone 32, e o polipêptido codificado nos mesmos,

A Fig, 12 mostra a sequência HCV cDNA no clone 40b, o segmento que se sobrepõe ao clone 37b, e o polipêptido codificado nos mesmos,

A Fig. 13 mostra a sequência HCV cDNA no clone 25c, o segmento que se sobrepõe ao clone 33b, e o polipêptido codificado nos mesmos.

A Fig, l4 mostra a sequência de nucleotido e o polipêptido codificado no mesmoyda ORF que se prolonga através do HCV cDNAs nos clones 40b, 37b, 35, 36, 8l, 32, 33b, e 25c.

A Fig, 15 mostra a sequência HCV cDNA no clone 33c, o segmento que se sobrepõe aos clones 40b e 33c, e os amd. noácidos codificados nos mesmos,

A Fig. 16 mostra a sequência HCV cDNA no clone 8h, o segmento que se sobrepõe ao clone 33c, e os aminoácidos codificados nos mesmos,

A Fig. 17 mostra a sequência HCV cDNA no clone

7θ, o segmento que se sobrepõe ao clone 8h, e os aminoácidos codificados nos mesmos.

A Fig, 18 mostra a sequência HCV cDNA no clone 14c, o segmento que se sobrepõe ao clone 25c, e os aminoácidos codificados nos mesmos.

A Fig. 19 mostra a sequência HCV cDNA no clone 8f, o segmento que se sobrepõe ao clone l4c, e os aminoácidos codificados nos mesmos.

A Fig. 20 mostra a sequência HCV cDNA no clone 33f, o segmento que se sobrepõe ao clone 8f, e os aminoácidos codificados nos mesmos. · '

A Fig. 21 mostra a sequência HCV cDNA no clone 33g, o segmento que se sobrepõe ao clone 33f, e os aminoácidos codificados nos mesmos.

A Fig, 22 mostra a sequência HCV oDNA no clone 7f, o segmento que se sobrepõe à sequência no clone 7e, e os aminoácidos codificados nos mesmos,

A Fig, 23 mostra a sequência HCV cDNA no clone 11b, o segmento que se sobrepõe à sequência no clone 7f, θ os aminoácidos codificados nos mesmos.

A Fig. 24 mostra a sequência HCV cDNA no clone l4i, o segmento que se sobrepõe à sequência no clone 11b,e os aminoácidos codificados nos mesmos.

A Fig. 25 mostra a sequência HCV cDNA no clone 39c, o segmento que se sobrepõe a sequência no clone 33g, e os aminoácidos codificados nos mesmos.

A Figura 26 mostra uma sequência HCV cDNA compó_ sita derivada dos cDNAs alinhados em clones l4i, 11b, 7f, 7®,

8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 8l, 32, 33b, 25c, lUc, 8f, 33f, e 33gJ também é mostrada ^a sequência de aminoácido do polipe£ tido codificada na ORF estendida na sequência derivada.

A Fig, 27 mostra a sequência do HCV cDNA no cl£ ne 12f, o segmento que se sobrepõe ao clone l4i, e os aminoáci. dos codificados nos mesmos, '

A Fig. 28 mostra a sequência do HCV cDNA no cio. ne 35f, 0 segmento que se sobrepõe ao clone 39c, e os aminoáci dos codificados nos mesmos.

A Fig, 29 mostra a «equencia do HCV cDNA no cl£ ne 19g, o segmento que se sobrepõe ao clone 35f, ® os aminoáci. dos codificados nos mesmos.'

A Fig, 30 mostra a sequência do clone ?6g, o segmento que se sobrepõe ao clone 19g, © ^os aminoácidos codifji cados nos mesmos,

A Fig, 31 mostra a sequência do clone 15θ, o segmento que se sobrepõe ao clone 26g, e os aminoácidos oodifi. cados nos mesmos,

A Fig, 32 mostra a sequência num cDNA compósito, que foi derivada pelo alinhamento de clones 12f a 15®, na direcção 5’ a 3’» ^a mesma mostra também os aminoácidos codifica dos na ORF continua,

A Fig, 33 mostra uma fotografia de manchas Ocidentais de uma proteína dé fusão, SOD-NANB^ com soro de chimpanzés, a partir de chimpanzés infectados com B6-NAN8, HAV e HBV.

ί - *

A Fig. 34 mostra uma fotografia de manchas Oci. dentais de uma proteína de fusão, SOD-NANB^ _{1 lf} com soro proveniente de seres humanos infectados com NANBV, HAV, HBV, e a partir de seres humanos de controle.

A Fig. 35 é um mapa mostrando as características significativas do vector pAB24,

A Fig. 36 mostra a sequência putativa de aminoá eido do carboxi-terminus do polipéptido de fusão C100-3, e a s£ quência de nucleótido que codifica 0 mesmo.

A Fig. 37 θ uma fotografia de um gel de poliacrilamida manchado de azul coomas'sie que identifica C100-3 expresso em levedura.

A Fig. 37 mostra uma mancha Ocidental de C100-3 com soro proveniente de um ser humano infectado com NANBV.

A Fig. 38 mostra uma auto-radiografia de uma mancha Setentrional de RNA isolado do fígado de um chimpanzé i.n fectado com BB-NANBV, sondado com BB-NANBV cDNA do clone 8l,

A Fig, 39 mostra uma auto-radiografia de ácido nucleico NANBV tratado com RNase A ou DNase I, e sondado com BB-NANBV cDNA do clone 81.

A Fig, 40 mostra uma auto-radiografia de ácidos nucleicos extraídos de partículas NANBV capturadas a partir de plasma infectado com anti-NANB^ χ χ» ^e sondado com NANBV cDNA 32 rotulado p,a partir do clone 81.

A Fig, 4l mostra auto-radiografias de filtros contendo ácidos nucleicos NANBV isolados, sondados _com s

sondas DNA com mais e menos fibras classificadas

3P 'P derivadas de NANBV cDNA em clone 8l,

A Fig. 42 mostra as homologias entre um polipéptido codificado em HCV cDNA e uma proteína NS proveniente de flavi.vírus Dengue,

A Fig, 43 mostra um histograma da distribuição da infecção HCV em amostras ao acaso, como determinado por um screening ELISA,

A Fig. 44 mostra um·histograma da distribuição da infecção HCV em amostras ao acaso utilizando duas configu rações de imunoglobulina-enzima conjugadas no ensaio ELISA,

A Fig, 45 mostra as sequências numa mistura primária, derivada de uma sequência conservada em NS1 de flavivírus.

Modos para a Realização da Invenção

I, Definições

A expressão vírus da hepatite C foi reserva da pelos profissionais deste campo para um agente etiológico até agora desconhecido de NANBH. De acordo com isto, como aqui utilizado, vírus da hepatite C (HCV) refere-se a um a gente causador de NANBH, que foi anteriormente referido como NANBV e/ou BB-NANBV, Os termos HCV, NANBV, e BB-NANBV são aqui utilizados permutavelmente, Como uma extensão desta terminologia, a doença provocada pelo HCV, anteriormente denomi nada hepatite NANB (NANBH), é denominada hepatite C. Os termos NANBH e hepatite C podem ser aqui utilizados interpermutavelmente.

termo HCV, como aqui utilizado, denota uma espécie virai que provoca NANBH, e estirpes atenuadas ou partículas de interferência defectivas derivadas das mesmas.Como se mostra em seguida, o genoma HCV é constituído por RNA.É sa bido que RNA contendo vírus tem velocidades relativamente ele. vadas de mutação espontânea, isto é, presumivelmente na ordem de 10 a 10 por nucleotido (Fields & Knipe (1986)), Portanto, existem múltiplas estirpes dentro das espécies HCV dejs critas abaixo. As composições e métodos aqui descritos, permitem a propagação, identificação, detecção, e isolamento das várias estirpes relacionadas. Além disso, as mesmas permitem também a preparação de diagnósticos e vacinas para as várias estirpes, e têm utilidade em processos de screening, para agentes anti-virais para utilização farmacológica,na medida em que elas inibem a replicação de HCV.

A informação aqui proporcionada, embora deriva da de uma estirpe de HCV, em seguida aqui referida como CDC/ /HCV1, é suficiente para permitir uma taxinomistia para identificar outras estirpes que estão compreendidas dentro das es pécies, Como aqui descrito, descobriu-se que o HCV é um Flavi vírus ou um vírus flavi análogo. A morfologia e composição de partículas de Flavivírus são conhecidas, e são discutidas em Brinton (1986). Geralmente, em relação à morfologia, os Flavivírus contêm um nucleoòápsido central circundado por uma bi-camada de lípido. Os viriães são esféricos e têm um diâmetro de cerca de 40-50 nm. Os seus núcleos têm cerca de 25- 30 nm de diâmetro. Ao longo da superfície exterior do invólucro do virião estão projecções que têm cerca de 5-10 nm de coinprimen to, com saliências arredondadas terminais com cerca de 2 nm de diâmetro,

HCV codifica um epítope que é imunologicamen te identificável com· um epítope no genoma de HCV a partir do qual os cDNAs aqui descritos são derivados; de preferência o epítope e codificado num cDNA aqui descrito, 0 epítope e único para HCV quando comparado com os outros Flavívírus conhecidos,

A singularidade do epítope pode ser determinada pela sua reac tividade imunológica com HCV e falta de reactividade imunológji

I ca com outras espécies de Flavivírus. Métodos para determinar a reactividade imunológica são conhecidos na arte, por exemplo, i

por radioimunoensaio, por ensaio Elisa, por hemaglutinação, e vários exemplos de técnicas adequadas para ensaios são aqui pro_ porcionados.

Além do que acontece, os seguintes parâmetros são aplicáveis, quer isoladamente quer em combinação na identificação de uma estirpe como HCV. Visto que as estirpes HCV estão progressivamente relacionadas, espera-se que a homologia tc>

I tal dos genomas ao nível de nucleótido seja de cerca de 40% ou mais, de preferência cerca de 60% ou mais, e ainda mais preferivelmente cerca de 80% ou mais; e,além disso, que existam sequências contíguas correspondentes de, pelo menos, cerca de 1'3 nucleótidos, A correspondência entre a.sequência genómica da estirpe HCV putativa e a sequência CDC/CH1 HCV cDNA pode ser determinada por técnicas conhecidas na arte, Por exemplo, as mesmas podem ser determinadas por uma comparação directa da informação de sequência do polinucleótido a partir do HCV putativo, e da(s) sequência(s) HCV cDNA aqui descritas. Por exemplo, também,as mesmas podem ser determinadas por hibridaçSO dos polinucleotidos sob condições que formam duplexes estáveis en tre regiões homólogas (por exemplo, as que poderiam ser usadas anteriormente à digestão S^), seguida pela digestão com nuclease(s) específica(s) de fibra simples, seguida pela determinação do tamanho dos fragmentos macerados.

Devido à relação evolucionária das estirpes de HCV, as estirpes HCV putativas são identificáveis pela sua ho mologia ao nível de polipéptido, Geralmerite, as estirpes de HCV são mais que cerca de 40$ homólogas, de preferência mais que cerca de 60$ homólogas, e mesmo mais preferivelmente mais que cerca de 80$ homologai⁵ ao nível de polipéptido. As técnicas para determinar a homologia da sequência de aminõácido são conhecidas na arte. Por exemplo, a sequência de aminoácido pode ser determinada directamente e comparada com as sequências aqui proporcionadas. Por exemplo, também, a sequência de nucleótido do material genómico do HCV putativo pode ser d£ terminada (usualmente através de um intermediário cDNA); a sequência de aminoacido codificada no mesmo pode ser determinada, e as regiões correspondentes comparadas.

Como aqui utilizado, um polinucleotido deriva do de uma sequência designada, por exemplo o HCV cDNA, partji cularmente os exemplificados nas Pigs. 1-32, ou a partir de um genoma HCV, refere-se a uma sequência de polinucleotido que é composta por uma sequência de aproximadamente pelo menos cerca de 6 nucleótidos, tem de preferência pelo menos cer ca de 8 nucleótidos, tem de preferência pelo menos cerca de 10-12 nucleótidos, e ainda com maior preferência,pelo menos,

cerca de 15-20 nucleótidos correspondentes, isto é, homólogos a/ou complementares a, uma região da sequência de nucleótido designada. De preferência, a sequência da região^a partir da qual o polinucleótido é derivado* é homóloga a, ou complementar a, uma sequência que é única para um genoma HCV, Pode ser determinado pelas técnicas conhecidas dos entendidos na arte se uma sequência é ou não única para o genoma HCV. Por exemplo,a sequência pode ser comparada com sequências em bancos de dados, por exemplo Genebank, para determinar se a mesma está presente no hospedeiro não infectado ou outros organismos. A sequência pode também ser comparada com as sequências conhecidas de outros agentes virais, incluindo aqueles que são conhecidos para induzir hepatite, por exemplo, HAV, HBV, e HDV, e com outros elementos do FÍavivíridae, A correspondência ou não correspondência da sequência derivada para outras sequências pode também ser determinada por hibridação sob condições de rigor apropriadas. As técnicas de hibridaçaoj para determinar a complementaridade de sequências de ácido nucleioo são conhecidas na arte, e são discutidas mais adiante. Consultar também, por exemplo, Maniatis et.al, (1982), Além disso, más combinações de polinucleótidos duplex, formados por hibridação podem ser determinadas por técnicas conhecidas, incluin do, por exemplo, digestão com uma nuclease, tal como Sl, que especificamente macera áreas de fibra simples em polinucleóti. dos duplex. Regiões a partir das quais sequências DNA típicas podem ser derivadas incluem, mas não estão limitadas a elas, por exemplo, regiões codificando epítepos específicos, assim como regiões não-transcritas e/ou não-transladadas.

χΟ polinucleótido derivado não é necessariamente derivado fisicamente da sequência de nucleótido representada, mas pode ser gerado de qualquer maneira, incluindo, por exemplo síntese química ou replicação DNA ou transcrição inversa ou transcrição, que são baseadas na informação proporcionada pela sequência das bases na(s) região(ões) a partir da(s) qual ou quais o polinucleótido é derivado. Além disso, combinaçães de regiões que correspondem às da sequência designada podem ser nw dificadas por formas conhecidas na arte compatíveis com a utili. zação pretendida.

De forma semelhante, uma sequência de polipépti^ t

do ou de aminoácido derivada de uma sequência de ácido nucleí. co designada, por exemplo, as sequências nas Figs. 1-32, ou de um genoma HCV, refere-se a um polipéptido que tem uma sequência de aminoácido idêntica à de um polipéptido codificado na sequên cia, ou uma porção do mesmo em que a porção consiste etn pelo me. nos 3-5 aminoácidos, e mais preferivelmente pelo menos tí-10 ami noácidos, e ainda mais preferivelmente pelo menos 11-15 aminoácidos, ou que é imunologicamente identificável com um polipépt.1 do codificado na sequência.

Um recombinante ou polipéptido derivado não é necessariamente traduzido a partir de uma sequência de ácido nucleico designada, por exemplo, as sequências nas Figs, 1-32, ou a partir de um genoma HCV; o meãmo é gerado de qualquer ma neira, incidindo por exemplo, síntese química, ou expressão de um sistema de expressão recombinante, ou isolamento a partir de

HCV mutado.

A expressão polinucleótido recombinante como

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aqui utilizada significa um polinucleótido de origem genómica, cDNA, semi-sintética, ou sintética que, em virtude da sua origem ou manipulação! (l) não está associado com todo ou uma porção do polinucleótido com o qual o mesmo está associado, em natureza ou na forma de uma libraria; e/ou (2) está ligado a um polinucleótido diferente daquele ao qual está ligado em natureza.

termo polinucleótido, como aqui utilizado, refere-se a uma forma polimérica de nucleotidos de qualquer comprimento, quer ribunocleótidos quer desoxiribunocleótidos. Este termo refere-se apenas à estrutura primária da molécula.

t

Assim, este termo inclui DNA com fibra dupla e simple^, assim como RNA com fibra dupla e simples. 0 mesmo inclui também formas do polinucleótido modificadas, por exemplo, por metilação e/ou por encapsulamento, e não modificadas,do polinucleótido.

Como aqui utilizada, a expressão HCV contendo uma sequência que corresponde a um cDNA significa que o HCV contém uma sequência de polinucleótido que é homóloga da, ou ) complementar a uma sequência no DNA designado; o grau de homologia ou complementaridade do cDNA será aproximadamente de 50$ ou mais, será,de preferência,de pelo menos, cerca de 70$, e mesmo com maior preferência será,pelo menos, cerca de 90$. As sequências que correspondem serão de, pelo menos cerca de 70 nucleotidos, de preferência pelo menos cerca de 80 nucleotidos, e ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 90 nucleótidos em comprimento. A correspondência entre a sequência HCV e o cDNA pode ser determinada por técnicas conhecidas na arte, incluindo, por exemplo, uma comparação directa do material se25 ί

quenciado com os cDNAs descritos, ou hibridação e digestão com nucleases de fibra simples, seguida pela determinação do tamanho dos fragmentos macerados.

A expressão purificado de polinucleótido virai refere-se a um genoma HCV ou fragmento do mesmo que está essencialmente isento, isto é, contendo menos que cerca de 50$, de preferência menos que cerca de 70$, .e mesmo mais preferivel mente menos que cerca de 90$ de polipéptidos com os quais o po. linucleotido virai está naturalmente associado. Técnicas para purificar polinucleotidos virais a partir de partículas virais são conhecidas na arte, e incluem por exemplo, o rompimento das partículas com um agente caotropico, e a separação do(s) polinucleétido(s) e polipéptidos por cromatografia de permuta de iões, cromatografia de afinidade, e sedimentação de acordo com a densidade.

A expressão polipéptido virai purificado refere-se a um polipéptido HCV, ou fragmento do mesmo, que está es sencialmente livre, isto é, contém menos que cerca de 50$, de preferência menos que cerca de 70$, e mesmo mais preferivelmen te menos que cerca de 90$, de componentes celulares com os quais o polipéptido virai está naturalrnente associado. As técnicas para purificar polipéptidos virais são conhecidas na arte, e exemplos dessas técnicas são discutidos adiante,

Células hospedeiras recombinantes, células hospedeiras, células, linhas de células, culturas de células e outras expressões semelhantes designando microorganismos ou linhas de células eucariéticas maiores, cultivadas

como entidades unicelulares referem-se a células que podem ser, ou têm sido, utilizadas como recipientes para vector recombinante ou outra transferência DNA, e incluem a progénie da célu la original que foi transfectada. Compreende-se que a progénie de uma célula parental simples pode não ser, necessariamente, completamente idêntica em morfologia ou na genómica ou complemento DNA total ao progenitor original, devido à mutação acidental ou deliberada, A progénie da célula parental que é suficientemente semelhante à do progenitor a ser caracterizada pela propriedade relevante, tal como a presença de uma sequência de nucleótido codificando um péptido desejado, é incluí da na progénie pretendida por esta definição, e está coberta pelas expressões acima.

Um replicão é qualquer elemento genético,por exemplo um plasmídeo, um cromossoma, um vírus, que se comporta como uma unidade autónoma de replicação de polinucleótido dentro de uma célula; isto é, capaz de replicação sob o seu próprio controle.

Um vector é um replicão ao qual outro segmento de polinucleótido está ligado, de modo a efectuar a replicação e/ou expressão do segmento ligado.

Sequência de controle refere-se a sequências de polinucleótido que são necessárias para efectuar a expressão das sequências de codificação às quais as mesmas estão ligadas. A natureza de tais sequências de controle difere dependendo do organismo hospedeiro; em procariotas, tais sequências de controle incluem geralmente um promotor, .local de ligação ribosso27 XI υ

mal, e finalizadores; em eucariotas, geralmente, tais sequências de controle incluem promotores, finalizadores e, em alguns casos, intensificadores. A expressão sequências de controle é destinada a incluir, no mínimo, todos os componentes cuja presença é necessária para expressão, e podem também incluir componentes adicionais cuja presença θ vantajosa, por exemplo, sequências guia.

Ligado operativamente refere-se a uma justja i

posição em que os componentes assim descritos estão numa rela ção permitindo aos mesmos funcionar da sua maneira pretendida. Uma sequência de controle .ligada operativamente a uma sequência de codificação está ligada de tal modo que a expressão da sequência de codificação é conseguida sob condições compatíveis com as sequências de controle.

Uma estrutura de leitura aberta (ORF) é uma região de uma sequência de polinucleotido que codifica um poli péptidoj esta região pode representar uma porção duma sequência de codifioação ou uma sequência de codificação total.

Uma sequência de codificação é uma sequência de polinucleotido que é transcrita em mRNA e/ou traduzida num polipéptido quando colocada sob o controle de sequências reguladoras apropriadas. Os limites da sequência de codificação são determinados por um codão de início de translação no 5’-terminus, e um codão de paragem de translação no 3'-terminus, Uma sequência de codificação pode incluir, mas não está limitada a, mRNA, cDNA, e sequências de polinucleotido recombinantes.

J

Imunologicamente identificável com/como refere-se à presença de epítope(s) e polipêptido(s) que estão tam bém presentes em e são únicos para o(s) polipéptido(s), desig nado(s) normalmente proteína HCV, A identidade imunológica po. de aer determinada pela ligação anticorpo e/ou competição na ligação; estas técnicas são conhecidas dos medianamente entendidos na arte, e são também ilustrados em seguida. A singu laridade de um epítope pode também ser determinada por buscas de computador de bancos de dados conhecidos, por exemplo Genjs bank, para as sequências de polinucleótido que codificam o epítope, e por comparações de sequência de aminoácido com outras proteínas conhecidas.

Como aqui utilizado epítope refere-se a um determinante antigénico de um polipêptido; um epítope pode compreender 3 aminoácidos numa conformação espacial que é úni_ ca para o epítope; geralmente um epítope consiste em pelo ni£ nos 5 de tais aminoácidos, e mais usualmente, consiste em pelo menos 8-10 de tais aminoácidos. Métodos para determinar a conformação espacial dos aminoácidos são conhecidos n,a arte,e incluem, por exemplo, cristalografia de raio-X e ressonância magnética nuclear 2-dimensional.

Um polipêptido é imunologicamente reactivo com um anticorpo quando o mesmo se liga a um anticorpo devido ao reconhecimento de anticorpo de um epítope específico, contido dentro do polipêptido. A reactividade imunológica pode ser dei terminada por ligação anticorpo, mais particularmente pela CjL nética da ligação anticorpo, e/ou por competição em ligação u- 29ύ tilizando como competidor(es) um polipéptido ou polipéptidos conhecidqs contendo um epítope contra o qual ou contra os quais o anticorpo é dirigido. As técnicas para determinar se um polipéptido é imunologicamente reactivo com um anticorpo são conhecidas na arte.

Como aqui utilizada, a expressão polipéjo tido imunogénico contendo um epítope HCV inclui polipéptidos de HCV que ocorrem naturalmente ou fragmentos dos mesmos, assim como polipéptidos preparados por outros meios, por exemplo, síntese química, ou a expressão do polipéptido num organismo recombinante.

termo polipéptido” refere-se a uma cadeia molecular de aminoácidos .e não se refere a um cornprimen to específico do produto; assim, peptidos, oligopéptidos, e proteínas estão incluídos dentro da definição de polipéptido. Este termo também não se refere a modificações pos-expre_s são do polipéptido, por exemplo, glicosilações, acetilações, fosforilações e análogos,

Transformação, como aqui utilizada, refere-se à inserção de um polinucleétido exógeno numa célula hospedeira, independentemente do método utilizado para a in serção, por exemplo, levantamento directo, transdução, ou união-f, 0 polinucleétido exógeno pode ser mantido como um vector não integrado, por exemplo, um plasmídeo ou, alternativamente, pode ser integrado num genonia hospedeiro.

Tratamento, como aqui utilizado, refere-se a profilaxia e/ou terapia.

Um indivíduo, como aqui utilizado, refere-se a vertebrados, particularmente elementos das espécies mamíferas, e inclui mas não está limitado aos animais domésticos, animais de desporto, primatas e seres humanos,

Como aqui utilizado, a fibra mais de um ácido nucleico contém a sequência que codifica o polipéptido. Afibra menos contém uma sequência que é complementar à sequência da fibra mais.

Como aqui utilizado, um genoma com fibras positivo de um vírus é aquele em que o genoma, quer RNA quer DNA, é de fibra simples e que codifica um polipéptido ou polipéptidos virais. Exemplos de vírus fibrados positivos de RNA incluem Togaviridae, Coronaviridae, Retroviridao, Picornaviridae e Caliciviridae, Incluídos também, estão os Flaviviridae, que eram anteriormente classificados como Togaviridae. Ver Fields & Knipe (1986).

Como aqui utilizado, anticorpo contendo componente de corpo refere-se a um componente de corpo de indivíduo, que é uma fonte dos-anticorpos de interesse. Anticorpos contendo componentes de corpo são conhecidos na arte, e incluem, mas não estando á eles limitados, por exemplo, plasma, soro, fluido espinal, fluido linfático, as secções externas dos tractos respiratório, intestinal e genito-urinário, lágrimas, saliva, leite, células de sangue brancas e tnielotnas,

Como aqui utilizado, HCV purificado refere-se a uma preparação de HCV que foi isolada a partir dos constituintes celulares com os quais o vírus está normalmente associado, e a partir de outras espécies de vírus que podem estar presentes no tecido infectado. As técnicas para ,is£ lar vírus são conhecidas dos entendidos na arte, e incluem, por exemplo, centrifugação e cromatografia de afinidade; um método para preparar HCV purificado é discutido mais adiante.

II, Descrição da Invenção

A prática da presente invenção utilizará, a menos que de outro modo seja indicado, técnicas convencionais de biologia molecular, microbiologia, DNA recombinante, e imunologia, que estão dentro da experiência da técnica.

Tais técnicas estão coinpletamente explicadas na literatura.

Ver por exemplo, Maniatis, Fitsch & Sambrook, MOLECULAR CLO

NING; A LABORATORY MANUAL (1982); DNA CLONING, VOLUMES I E II (D. N. Glover ed. 1985); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESI3 (M.J. Gait ed, 1984)5 NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (B.D. Hames & S,

J. Higgins eds. 1984); TRANSCRIPTION AND TRANSLATION (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. 1984); ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney ed. 1986); IMMOBILIZED CELLS AND ENZYMES (iRL Press, 1986); B. Perbal, A PRACTICAL GUIDE TO MOLECULAR CLONING (1984); as series, METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.); GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (J.H. Miller e M.P, Calos eds, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Methods in Enzymology Vol. 154 e Vol. 155 (Wu e Grossman, e Wu, eds,, respectivamente), Mayer e Walker, eds, (1987), IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Academic Press, Londres) Scopes, (1987), PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE, Segunda Edição (Springer-Verlag, N.Y.), e HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, VOLUMES I-IV (D.M.

Weir e C,C, Blackwell eds. 1986),

Todas as patentes, pedidos de patente, e publicações aqui mencionados, tanto anteriormente como em seguida, são portanto aqui incorporados como referencia.

Os materiais e processos úteis da presente invenção são tornados possíveis pela provisão de uma família de sequências de nucleótido estreitamente homólogas isjo ladas a partir de uma libraria cDNA derivada de sequências de ácido nucleíco presentes no plasma de um chimpanzé infectado com HCV. Esta família de sequências de nucleótidos não é de origem humana ou de chimpanzés, visto que a mesma não hibridiza para DNA genómico nem em seres humanos nem em chimpanzés, a partir de indivíduos não infectados, uma vez que os nucleótidos desta família de sequências estão presentes apenas no fígado e plasma de chimpanzés com infecção HCV, e vis to que a sequência não está presente em Genebank. Além disso, a família de sequências não apresenta homologia significativa para sequências contidas dentro do genoma HBV.

A sequência de uin membro da família, contido dentro do clone 5-1-1, tem uma estrutura de leitura aber32 ta, (ORF) contínua que codifica um polipéptido de aproximadamen te 50 aminoácidos. Soros provenientes de seres humanos infectados com HCV contém anticorpos que se ligam a este polipéptido, ao passo que os soros provenientes de seres humanos não infectados não contêm anticorpos para este polipéptido. Finalmente, enquanto que os soros provenientes de chimpanzés não infectados não contêm anticorpos para este polipéptido, os anticorpos são induzidos em chimpanzés a seguir à infecção NANBH aguda.

Além disso, anticorpos para este polipéptido não são detectados em chimpanzés e seres humanos infectados com HAV e HBV, Por este critério, a sequência é um cDNA para uma sequência virai, i

em que o vírus provoca ou está associado com NANBH; esta sequên cia cDNA está representada, na Fig, 1, Como discutido mais adian te, a sequência cDNA no clone 5-1-1 .difere daquela dos outros cDNAs isolados pelo facto de a mesma conter 28 pares base extra. Um compósito com outros elementos identificados na família cDNA, que foram isolados utilizando como uma sonda uma sequência sintética equivalente a um fragmento do cDNA no clone 5-1-1, está representado na Fig. 3, Um membro da família cDNA que foi isolado utilizando uma sequência sintética derivada do cDNA no clone 81 está representado na Fig. 5, θ θ compósito desta sequência com o do clone 81 está representado na Fig. 6. Outros membros da família cDNA, incluindo aqueles presentes nos clones l4i, llb, 7f, 7e, 8H, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b,

25c, l4c, 8f, 33f, 33g, θ 39c são descritos na Secção IV.À. Um compósito dos cDNAs nestes clones está descrito na Secção IV.A.18, l

e representado na Fig. 26. 0 compósito cDNA mostra que o mesmo contém uma ORF contínua, e assim codifica uma poliproteína. Êste dado é consistente com a sugestão, discutida mais adiante, de que HCV é um flavivírus ou vírus flavi análogo.

A disponibilidade desta família de cDNAS mostrada nas Figs. 1-32, inclusive’, permite a construção de sondas DNA e polipéptidos úteis para diagnosticar NANBH devida â in fecção HCV, e na separação de dadores de sangue assim como de sangue doado e produtos de sangue pàra infecção. Por exemplo,

I a partir das sequências é possível sintetizar oligomeros DNA fljB CBifCA âfi 8-10 nucleótidos, ou maiores, que são úteis como sondas de hibridação para detectár a presença do genoma virai em, por exemplo, soros de sujeitos suspeitos de abrigarem o ví rus, ou para screening do sangue doado para a presença do vírus, A família de sequênçias cDNA também permite o projecto e produção de polipéptidos específicos HCV que são úteis como reagentes de diagnóstico para a presença de anticorpos levanta dos durante a NANBH, Anticorpos para polipéptidos purificados derivados dos cDNAs podem também ser utilizados para detectár antigenes virais em indivíduos infectados e no sangue, conhecimento destas sequências cDNA também permite o projecto e produção de polipéptidos que podem ser utilizados como vacinas contra HCV e também para a produção de anticorpos, que por sua vez podem ser utilizados para a protecção contra a doença, e/ou para terapia de indivíduos infectados com HCV.

Além disso, a família de sequências cDNA permite ainda a caracterização do genoma HCV. Sondas de polinucleótido derivadas destas sequências podem ser utilizadas para o screening¹ de librarias cDNA para sobreposição adicional de sequências cDNA, que, por sua vez, podem ser utilizadas para obter mais sequências de sobreposição. A menbs que o genoma seja segmentado, e os segmentos não tenham sequências comuns, esta técnica pode ser utilizada para ganhar a sequência do genoma total. Todavia, se o genoma for segmentado, outros segmentos do genoma podem ser obtidos repetindo o processo de screening serolégico lambda-gtll utilizado para isolar os clones cDNA aqui descritos, ou alternativamente isolando o genoma a partir de par tículas HCV purificadas.

A família de sequências cDNA e os polipéptidos _A t derivados destas sequências, assim como os anticorpos dirigidos contra estes polipéptidos são também úteis no isolamento e identificação do(s) agente(s) BB-NANBV. Por exemplo, anticor pos dirigidos contra epítopes HCV pontidos em polipéptidos derivados dojs cDNAs podem ser utilizados em processos baseados na afinidade cromatografica para isolar o vírus. Anternativamente, os anticorpos podem ser utilizados para identificar par tículas virais isoladas por outras técnicas. Os antigenes virais e o material genémico dentro das partículas virais isola^ das podem então ser posteriormente caracterizados.

A informação obtida a partir de posterior sequenciamento do(s) genoma(s) de HCV, assim como a partir de posterior caracterização dos antigenes de HCV e caracterização do genoma, permite o projecto e síntese de sondas adicionais e polipéptidos e anticorpos que podem ser utilizados para diagnostico, para prevenção, e para terapia de NANBH induzida por

HCV, e para screening de sangue infectado e produtos de sangue relacionados,

A disponibilidade de sondas para HCV, incluindo antigenes e anticorpos, e polinucleótidos derivados do ge-. noma a partir do qual a família dos cDNAs é derivada também permite o desenvolvimento de sistemas de cultura de tecido que serão a utilização principal na elucidação da biologia de HCV, Isto, por seu lado, pode conduzir ao desenvolvimento de novos regimes de tratamento com base· em compostos antivirais

I que de preferência inibem á replicação de, ou infecção por,

HCV, t

método utilizado para identificar e isolar o agente etiológico para NANBH é novo, e o mesmo pode ser aplicável à identificação e/ou isolamento de agentes não caracte rizados até agora que contêm um genorna, e que estão associados· com uma variedade de doenças, incluindo as induzidas por vírus, viroides, bactérias, fungos e parasitas. Neste método, uma libraria cDNA foi criada a partir de ácidos nucleicos pre sentes em tecido infectado a partir de um indivíduo infectado.

A librária foi criada num vector que permitiu a expressão de polipéptidos codificados no cDNA, Clones de células hospedeiras contendo o vector, que expressa um fragmento imunologicamente reactivo de um polipéptido do agente etiológico, foram seleccionados por screening imunolégico dos produtos de ex pressão da librária com um anticorpo contendo componente de corpo proveniente de outro indivíduo previamente infectado com o agente putativo. As fases na técnica cie screening imunolégico in- 36 cluem Interacclonar os produtos de expressão do cDNA contendo vectores com o anticorpo que contém componente de corpo , de um segundo indivíduo, infectado, e detectar a formação de complexos anticorpo-antige ne entre o(s) produto(s) 'de expressão e anticorpos do segundo indivíduo infectado. Os clones isolados são depois peneirados imunologicamente por interacção dos seus produtos de expressão com o anticorpo contendo componentes de corpo de outros indivíduos infectados com o agente putativo e com in divíduos de controle não infectados com o agente putativo, e detectando a formação de complexos antigene-anticorpo com an ticorpos a partir de indivíduos, infectados; os vectores contendo. cDNA que codificam polipéptidos que reagem imunologica mente com anticorpos provenientes - de indivíduos infectados e indivíduos suspeitos de estarem infectados com o agente, mas não com indivíduos de controle, são isolados. Os indivíduos infectados utilizados para a construção da libraria cDNA, e para oscraening” imunológico não necessitam ser das mesmas espécies.

Os cDNAs isolados como um resultado deste método, e os seus produtos de expressão, e anticorpos dirigi dos contra os produtos de expressão, são úteis em caracterizar e/ou capturar o agente etiólogico. Como descrito com mais pormenor em seguida, este método tem sido utilizado com êxito para isolar uma família de cDNAs derivada do genoma HCV.

II ,Α. Preparação da Sequência cDNA

Soro colhido de um chimpanzé com infecçao crónica HCV e contendo um elevado título do vírus, isto é, pelo menos 10 doses infecciosas de chimpanzé/ml (CID/ml) foi utilizado para isolar partículas virais; ácidos nucleicos isolados destas partículas foram utilizados como padrão na construção de uma libraria cDNA· para o genoma virai. Os procedimentos para o isolamento de partículas HCV putativas e para a construção da libraria cDNA em lambda-gtll são dis cutidos na Secção IV.A.l. 0 lambda-gtll é um vector que tem sido desenvolvido especif icamente para expressar cDNAs ins.e ridos como polipéptidos de fusão com beta-galactosidase e para peneirar grandes números de fage recombinante com anti. ' -soros específicos levantados contra um antigene definido,

A libraria cDNA lambda-gtll gerada a partir de uma colheita cDNA contendo cDNA de tamanho médio aproximado de 200 pares base foi peneirada para codificar epítopes que se podem ligar especificamente com soros derivados de pacientes que tinham anteriormente experimentado hepatite NANB, Huynh, T.V. et al, (1985). Foi feito o screening a, aproximadamente, 10^ fages, e 5 fages positivos foram identificados purificados, e depois testados para especificidade de ligação a soros, de diferentes-seres humanos echimpazes prq viamente infectados com o agente HCV. Um dos fages, 5-1-1, ligou 5 dos 8 soros humanos testados. Esta ligação parece selectiva para soros derivados de doentes com infecções an teriores de hepatite NANB, visto que soros de 7 dadores normais de sangue não apresentaram tal ligação.

A sequência do cDNA em fage 5-1-1 recombi nante foi determinada, e está representada na Fig, 1. 0 polipéptido codificado por este cDNA clonado, que está na mes ma estrutura translacional que a metade beta-Galactosidase N-terminal do polipéptido de fusão está representado acima da sequência de nucleótido. Esta ORF translacional, portanto, codifica um (uns) epítopp(s) especificamente reconhecido(s) pelos soros provenientes de pacientes com infecções de hepatite NANB.

A disponibilidade do cDNA no fage 5-1-1 recombinante permitiu o isolametito de outros clones contendo segmentos adicionais e/ou segmentos alternativos de cDNA até ao genoraa virai. A l.ibrária cDNA lambda-gtll acima, foi peneirada utilizando derivado de polinucleotido sintético a partir da sequência cDNA 5-1-1 clonada. Este screening proporcionou três outros clones, que foram identificados co mo 81, 1-2 e 91; os cDNAs contidos dentro destes clones Fo ram sequenciados. Ver Secções IV.A.3 e IV,A.4, As homologias entre os quatro clones independentes estão representadas na Fig. 2, onde as homologias estão indicadas pelas li nhas verticais. Sequências de nucleotidos· presentes unicamente nos clones 5-1-1, 8l, e 91 estão indicadas por letras minúsculas.

Os cDNAs clonados presentes eni fages recombinantes nos clones 5-1-1, 8l, 1-2, e 91 são altamente homólogos e diferem apenas em duas regiões. Primeiro, o nu

I cleótido número 67 no clone 1-2 é uma timidina, ao passo que os outros três clones contem um resíduo citidina nesta posição. Esta substituição, contudo, não altera a natureza do aminoácido codificado.

A segunda diferença entre os clones é que o clone 5-1-1 contém 28 pares base no seu 5'-terminus que não estão presentes nos outros clones. A sequência extra p£ de ser um artefacto clonando 5¹-terminal; artefactos clonan do 5'-terminal são comumente observados nos produtos dos rné todos cDNA.

Sequências sintéticas derivadas da região 5' e da região 3' do cDNA HCV rio clone 8l foram utilizadas para peneirar e isolar cDNAs a partir da libraria lambda-gtll NANBV cDNA, que se sobrepõe ao clone 8l cDNA (Secção IV.A.5,). As sequências dos cDNAs resultantes, que estão no clone 36 e no clone 32, respectivamente, estão representadas na Fig. 5 ® na Fig, 7·

De maneira análoga, um polinucleótido sintático, baseado na região 5' do clone 36, foi utilizado para 0 screening e para isolar cDNAs da libraria lambda gt-11 NANBV cDNA que se sobrepõe ao clone 36 cDNA (Secção IV.A.8J. Um clone purificado de cDNA contendo fage recombinante o qual, hibridado até ã sonda polinucleótida sintética, foi designado clone 35, e a sequência NANBV cDNA contida neste clone, está representada na Figura 8.

Utilizando a técnica de isolar as sequências cDNA que se sobrepõem, os clones contendo sequências HCV cDNA a montante e a jusante foram obtidos. 0 isolamento destes clones, é descrito mais adiante na Secção IV.A

A análise das sequências de nucleótido dos HCV cDNAs codificados dentro dos clones isolados mostra que cDNA compósito contém uma ORF longa contínua. A Fig. 26 mostra a sequência do cDNA compósito a partir destes clones, juntamente com o polipéptido HCV putativo codificado na rne_s ma.

A descrição do método para restabelecer as sequências cDNA é, na maioria dos casos, de interesse histórico. As sequências resultantes (e os seus complementos) são aqui proporcionados, e as sequências, ou qualquer porção das mesmas, podem ser preparadas utilizando métodos sintéticos, ou por uma combinação de métodos sintéticos com restabelecimento de sequências parciais utilizando métodos semelhantes aos aqui descritos.

Estirpes de Lambda-gtll replicadas a partir da libraria HCV cDNA e a partir dos clones 5-1-1, 81,

1-2 e 91 foram depositadas nos termos do Tratado de Budapejs te na American Type Culture Collection (àTCC), 12301 Park lawn Dr., Rockville, Marilândia 20852, e receberam os seguintes Números de Acessão.

Lambda-gtll ATCC No. pata de Depósito

Libraria HCV cDNA	40394	1 de Dez. de	1987
clone 81	40388	17 de Nov, de	1987
clone 91	40389	17 de Nov, de	1987
clone 1-2	' 40390	17 de Nov, de	1987
clone 5-1-1	40391	18 de Nov. de	1987

Depois da concessão e publicação deste pedido como uma Patente dos Estados Unidos, toda a restrição sobre a disponibilidade destes depósitos será irrevogavelmente removida, e o acesso aos depósitos designados ficará disponível durante a pendência do pedido acima mencionado, por alguém determina do pelo Comissário, para ser a isso autorizado sob o código 37 CFR l.l4 e 35 USC 1,22, Alem disso, os depósitos designa dos serão mantidos durante um período de trinta (30) anos a partir da data do depósito, ou durante cinco (5) anos depois da última petição para o depósito; ou durante a vida obrigatória da patente norte-americana, seja qual for a sua durat ção. Estes depósitos e outros materiais depositados aqui men cionados são pretendidos apenas por conveniência, e não são exigidos para a prática da presente invenção, em virtude da presente descrição. As sequências HCV cDNA em todos os materiais depositados são aqui incorporadas por referência.

A descrição acima, da marcha (walking) do genoma,isolando sequências cDNA que se sobrepõem a partir da libraria HCV lambda gt-11 proporciona um método pelo qual os cDNAs correspondendo ao genoma HCV total podem ser isolados. Contudo, dada a informação aqui proporcionada, outros métodos para isolar estas cDNAs são óbvios para qualquer pessoa entendida na arte. Alguns destes métodos estão descritos na Secção IV.A,, mais adiante.

II.B. Preparação de Polipéptidos e Fragmentos Virais

A disponibilidade das sequências cDNA, tanto aquelas isoladas utilizando as sequências cDNA nas

Figs. 1-32, como discutido mais adiante, assim como as sequên cias cDNA nestas figuras, permite a construção de vectores de expressão codificando antigenicamente regiões activas do polipéptido codificado na sua fibra.· Estas regiões antigenioamente activas podem ser derivadas de antigenes de revestimento ou invólucro ou de antigenes de núcleo, incluindo, por exemplo, polinucleótido ligando proteínas, polinucleótido polimerase(s), e outras proteínas virais exigidas para a replicação e/ou reunião da partícula de vírus. Fragmentos codificando os polipéptidos desejados são derivados dos clones cDNA utilizan do maceração de restrição convencional ou por métodos sintéticos, e estão ligados em vectorefe que podem, por exemplo, con ter porções de sequências de fusão tais como beta-Galactosidase ou dismutase de superóxido (SOD), de preferência SOD, Métodos e vectores que são úteis para a produção de polipéptidos que contêm sequências de fusão de SOD estão descritos na Publi. cação Oficial da Patente Europeia número 0196056, publicada em 1 de Outubro de 1986. Vectores codificando polipéptidos de fu são de SOD e polipéptidos HCV, isto é NANE^^, ΝΑΝΒ_θ1, e C100-3, que são codificados num compósito de HCV cDNAs, estão descritos nas Secções IV,B.l, IV,B,2, e IV.B,4, respectivamente. Qualquer porção desejada de HCV cDNA contendo uma estru tura de leitura aberta, em qualquer sentido de fibra, pode ser obtida como um polipéptido recombinante, tal como uma proteína madura ou de fusão; alternativamente, um polipéptido codifica do no cDNA pode ser proporcionado por síntese química.

DNA que codifica o polipéptido desejado, quer na forma fundida quer amadurecida, e quer contendo ou não uma .

sequência de sinal para permitir secreção, pode estar ligado em vectores de expressão para qualquer hospedeiro conveniente. Ambos os sistemas de hospedeiro eucariótico e procariótico são presentemente utilizados na formação de polipéptidos recombinantes, e um sumário de alguns dos sistemas de controle mais comuns e linhas de células hospedeiras é dado na Secção III, A., mais adiante, 0 polipéptido é então isolado a partir de células lisoladas ou a partir do meio de cultura e puri ficado até à extensão necessária para a sua utilização preten dida, A purificação pode ser efectuada por técnicas conhecidas na arte, por exemplo, fraccionamento por sal, cromatograt fia sobre resinas permutadoras de iões, cromatografia de afinidade, centrifugação, e análogos. Ver, por exemplo, Methods in Enzymology, para uma variedade de métodos para purificação de proteínas. Tais polipéptidos podem ser utilizados como dia£ nésticos, ou aqueles que dão lugar a neutralização de anticor pos podem ser formulados em vacinas. Anticorpos levantados con tra estes polipéptidos podem também ser utilizados como diagnósticos, ou para imunoterapia passiva. Além disso, como discu tido na Secção II.J. mais adiante, anticorpos para estes polipéptidos são úteis para isolar e identificar partículas HCV.

Os antigenes HCV podem também ser isolados a partir de viriões HCV. Os viriões podem ser germinados em células infectadas de HCV em cultura de tecido, ou num hospedeiro infectado.

II. C. Preparação de Polipéptidos Antigénicos e Conjugação com um Veículo

Uma região antigénica de um polipéptido é de um modo geral relativamente pequena - tipicamente 8 a 10 aminoácidos, ou menos, em comprimento. Fragmentos tão pequenos como 5 aminoácidos podem caracterizar uma região antigénica. Estes segmentos podem corresponder a regiões do antigene de HCV, De acordo com isto, utilizando os cDNAs de HCV como uma base,

DNAs codificando segmentos curtos de polipéptidos HCV podem ser expressos da maneira recombinante, quer como proteínas de fusão, quer como polipéptidos isolados. Além disso, sequências de aminoácido curtas podem ser convenientemente obtidas por síntese química. Nos casos em que o polipéptido sintetiza do está correctamente configurado de modo a proporcionar o epítopa correcto, mas é demasiado 'pequeno para sei' imunogénico, o polipéptido pode ser ligado a um veículo adequado.

Um número de técnicas para a obtenção de tal ligação são conhecidas na arte, incluindo a formação de ligações de dissulfureto utilizando N-succinimidil-3-(2-piridiltio)propionato (SPDP) e succinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-l-carboxilato (SMCC) obtidos na Pierce Company, Rockford, Illinois, (se o péptido não tiver um grupo sulfidri^ lo, este pode ser proporcionado pela adição de um resíduo de cisteína). Estes reagentes criam uma ligação de dissulfureto entre si próprios, e resíduos cisteína de péptido sobre uma prote ina, e uma ligação de amida através do epsilon-amino sobre uma lisina, ou outro grupo amino livre no outro. Uma varie dade de tais dissulfureto/agentes formadores de amida é conhecida , Ver, por exemplo, Immun. Rev, (1982) 02.:185. Outros agentes de ligação bifuncionais formam um tioéter em vez de uma ligação de dissulfureto. Muitos destes agentes formadores de tioéter estão à venda no comércio e incluem ésteres reactivos de ácido 6-ma.leimidocapróico, ácido 2-bromoacético, á eido 2-iodoacético, ácido 4-(N-maleimidometil) ci clohexano-1-carboxílico, e análogos. Os grupos carboxilo poderi ser activadoscombinando os mesmos com succinimida ou ácido 1-hidrq xil-2-nitro-4-sulfónico, sal de sódio. A lista anterior não pretende ser exaustiva, e modificações dos compostos menciona dos podem claramente ser utilizadas.

Pode ser utilizado qualquer veículo que não in duza por si próprio a produção de anticorpos prejudiciais para o hospedeiro. Veículos adequqdos são tipicamente grandes macromoléculas, lentamente metabolizadas, tais corno proteínas; polissacáridos, tais corno sefarose funcionalizada por latex, agarose, celulose, grãos de celulose e análogos; aminoácidos poliméricos, tais como ácido poliglutâmico, polilisina, e aná logos; copolimeros de aminoácido; e partículas de vírus inaje tivo, ver, por exemplo, a secção II.D, Substratos de proteí na especialmente úteis são albuminas de soro, hemocianina de lapas apanhadas em buracos, moléculas de imunoglobulina, tir£ globulina, ovalbumina, toxóide do tétano, e outras proteínas bem conhecidas dos entendidos na arte.

II.D, Preparação de Imunogéneos Híbridos em Partículas

Contendo Epítopas HCV . A imunogenicidade dos epítopes de HCV pode tam bém ser intensificada preparando os mesmos em mamíferos ou sistemas de levedura fundidos ou reunidos com proteínas forrn£ doras de partículas, tais como, por exemplo, as associadas

com o antigene de superfície da hepatite B. Construções em que o epítope NANBV está directamente ligado à proteína formai dora de partículas, codificando sequências, produzem híbridos que são imunogénicos em relação ao epítope HCV, Além disso, todos os vectores preparados incluem epítopes específicos para HCV, tendo vários graus de imunogenicidade, tal como, por exern pio, o péptido pré-S. Assim, partículas construídas a partir da proteína formadora de partículas que incluem sequências HCV são imunogênicas em relação a HCV e HBV.

antigene de superfície de hepatite (HBSAg) foi mostrado para ser formado e reunido em partículas em S, cerevisiae (Valenzuela et al, (1982)), assim como em, por exern pio, células de mamíferos (Valenzuela, P., et al (1984)),a for mação de tais partículas foi mostrada para intensificar a imunogenicidade da sub-unidade monómero, As construções podem tam bém incluir o .epítope imuno-dominante de HBSAg, compreendendo os 55 aminoácidos da região de pré-superfície (pré-S), Neurath et al. (1984). Construções da partícula pré-S-HBSAg expressível em levedura são reveladas na EPO No. 174.444, publicada em 19 de Março de 1986; híbridos incluindo sequências virais heterélogas para expressão de levedura são reveladas na EPO n? 175*261, publicada em 26 de Março de 1966. Ambos os pedidos es tão transmitidos para a cessionária da presente, e são aqui in corporados como referência. Estas construções podem também ser expressas em células de mamíferos tais como células de ová rio de hamster Chinês (CHO) utilizando um vector de reductase SV40-dihidrofolato (Michelle et al. (1984)).

Além disso, as porções da sequência que codifica a . - 47 proteína formadora de partículas podem ser substituídas por codões que codificam um epítope HCV. Nesta substituição, as regiões que não são necessárias para mediar a agregação das unidades para formar partículas imunogénicas em levedura ou mamíferos podem ser anuladas, eliminando assim locais antigé nicos de HBU adicionais da competição com o epítope HCV,

II. E. Preparação de Vacinas

Podem ser preparadas vacinas a partir de um ou mais polipéptidos imunogénicos, derivados de HCV cDNA bem como a pa.rtir das sequências cDNA nas Figs. 1-32, ou a partir do genoma HCV, ao qual as mesmas correspondem, A homologia observada entre HCV e Flavivírus proporciona informação respeitante aos polipéptidos que são provavelmente para ser mais eficazes,como vacinas, assim como as regiões do genoma em que os mesmos estão codificados. À estrutura geral do genoma Flavivírus é discutida em Rice et al. (1986), 0 flaviví^ rus RNA genómico crê-se ser a única espécie de vírus mRNA es pecífica, e o mesmo é traduzido em três proteínas estruturais virais, isto é, C. M, e E, assim como em duas grandes proteínas não estruturais, NV4 e NV5, e um conjunto complexo de proteínas não estruturais mais pequenas, É sabido que os maiores epítop®s de neutralização para Flavivírus residem na proteína E (invólucro) (Roehrig (1986)). 0 gene HCV E corres pondente, e a região codificando o polipêptido, podem ser diaj» nosticados, com base na homologia do Flavivírus. Assim, as vacinas podem ser constituídas por polipéptidos recombinantes contendo epítopes de HCV E. Estes polipéptidos podem ser β

'j expressos em bactérias, levedura, ou células de mamíferos, ou alternativainente podem ser isolados a partir de prepara ções virais. È também previsto que outras proteínas estruturais podem também conter epítopes que dão lugar a anticorpos anti-HCV protectores. Assim, os polipéptidos conten do os epítopes de E, C, e M podem ser utilizados, quer isol£ damente quer etn combinação, em vacinas HCV,

Além do que se descreveu acima, mostrou-se que a imunização com NSl (proteína não-estrutural l), resulta na protecção contra a febre amarela (Schlesinger et al. (1986). Isto é verdadeiro embora a imunização não dê lu gar a anticorpos de neutralização. Assim, partieularmente devido ao facto desta proteína parecer ser altamente conser vada entre Flavivírus, é provável que o HCV NS1 seja também protector contra a infecção de HCV. Além disso, 0 mesmo mos. tra também que as proteínas não estruturais podem proporcio nar protecção contra a patogenicidade virai, mesmo se as mesmas não provocarem a produção de anticorpos de neutralização .

Em vista do acima descrito, as vacinas multivalentes contra HCV podem ser constituídas por uma ou mais proteínas estruturais, e/ou uma ou mais proteínas não

I estruturais. Estas vacinãs podem ser constituídas por, por exemplo, polipéptidos de HCV recombinantes e/ou polipéptidos isolados a partir dos viriões. Além disso, pode ser po.s sivel utilizar HCV inactivado em vacinas; a inactivação pode ser efectuada pela preparação de lisatos virais, ou por

-49 _

outros meios conhecidos na arte para provocar a inactivação de Flavivírus, por exemplo tratamento com solventes or gânicos ou detergentes, ou tratamento com formalina. Alem disso, as vacinas podem também ser preparadas a partir de estirpes de HCV atenuadas, A preparação das estirpes de HCV atenuadas é descrita mais adiante.

É sabido que algumas das proteínas em Flavivírus contêm regiões altamente conservadas; assim, alguma reactividade imunologica cruzada é esperada entre HCV e outros Flavivírus, ,É possível que epítopes repartidos entre os Flavivírus e HCV dêem lugar a anticorpos protectores contra um ou mais dos desarranjos provocados por estes agentes patogénicos. Assim, pode ser possível conceber vaci nas com fins múltiplos cpm base neste conhecimento.

A preparação de vacinas que contêm polipéptido(s) imunogénicos como ingredientes activos, é conhecida dos enten didos na arte. Tipicamente, tais vacinas são preparadas como injectáveis, quer como soluções líquidas quer como suspensões; formas sólidas adequadas para solução ou suspensão em líquido antes da injecção podem também ser preparadas. A preparação pode também ser emulsionada, ou a proteína encaji sulada em lipossomas , Os ingredientes imunogénicos activos são por vezes misturados com excipientes que são farmacêuti. camente aceitáveis e compatíveis com o ingrediente activo. Excipientes adequados são, por exemplo, água, salmoura, dex trose, glicerol, etanol, ou análogos e combinações dos mesmos, Além disso, se for desejado, a vacina pode conter quan tidades menores de substâncias auxiliares tais como agentes molhantes ou emulsionantes, agentes tampão de pH, e/ou adjuvantes que intensificam a eficácia da vacina. Exemplos de adjuvantes que podem ser eficazes incluem, mas não estão a eles limitados: hidroxido de alumínio, N-acetil-mura mil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11Ó37, referida como nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etila mina (CGP 19835-A, referida como MTP-PE) , e R1BI, que contém três componèntes extraídos de ^bactérias, lípido A de monofosforilo, dimicolato de trehalose e esqueleto de parede de célula (MPL + TDM + CWS·) numa emulsão a 2$ de esqualeno/ /Tween 80. A eficácia de um adjuvante pode ser determinada pela medição da quantidade de anticorpos dirigidos contra um polipéptido imunogénico contendo uma sequência antigénica HCV que resulta da administração deste polipéptido em vacinas que são também constituídas por vários adjuvantes.

As vacinas são convencionalmente administradas parenteralmente, por injecção, por exemplo, quer sub cutânea quer intramuscularmente. Formulações adicionais que são adequadas para outros modos de administração incluem su positorios e, em alguns casos, formulações orais. Para supo sitérios, os ligantes e veículos tradicionais podem incluir, por exemplo, polialquileno glicéis ou trigliceridos; tais supositórios podem ser formados a partir de misturas conten do o ingrediente activo na gama·de 0,5$ a 10$, preferivelmente l$-2$. Formulações orais incluem tais excipientes nor _

rnalmente empregados como, por exemplo, graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sodio, celulose, carbonato de magnésio, e análogos. Estas composições tomam a forma de soluções, suspensões, comprimidos, pílulas, cápsulas, formulações ou pés de libertação retardada e contêm 10$-95$ de ingrediente activo, preferivelmente 25$-7O$.

As proteínas podem sei’ formuladas dentro da vacina como formas neutrais ou de sal. Sais farmacêuticamente aceitáveis incluem os sais de adição de ácido (formados com grupos amino livres do péptido) e que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácidos clorídrico e fosfórico, ou tais ácidos orgânicos, tais como acéti co, oxálico, tartárico, maleico, e análogos. Os sais formados com os grupos carboxilo livres podem também ser derivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo, sódio, potássio, amónio, cálcio, ou hidróxidos férricos, e de tais ba ses orgânicas como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, e análogos.

11. F, Dosagem e Administração de Vacinas

As vacinas sãò administradas de uma maneira compatível com a formulação de dosagem, e numa quantidade tal que será profilática e/ou terapeuticamente eficaz,

A quantidade a ser administrada, que está geralmente na gama de 5 microgramas a 250 microgramas de antigene por dose, depende do sujeito a ser tratado, da capacidade do sistema imu

Li ne do sujeito para sintetizar anticorpos, e do grau de protecção desejado. Quantidades precisas do ingrediente activo exigidas para serem administradas podem depender do julgamen to do médico e pode ser peculiar a cada sujeito.

A vacina pode ser dada num horário de djo se simples, ou de preferência num horário de dose múltipla.

Um horário de dose múltipla é aquele em que um curso primário de vacinação pode ser com i-10 doses separadas, seguidas por outras doses dadas a intervalos de tempo subsequentes necessários para manter e/ou reforçar a resposta imune, por exemplo, a 1-4 meses durante uma segtinda dose e, se necessário uma(s) dose(s) subsequente(s) depois de vários meses. 0 regi me de dosagem será também., pelo menos em parte, determinado pela necessidade do indivíduo e estará dependente do julgamento do médico.

Além disso, a vacina contendo o(s) antigene(s) HCV imunogénico(s) pode ser administrada em conjunto com outros agentes imunorreguladores, por exemplo, globulinas imunes.

’ Preparação de Anticorpos Contra Epítopes HCV

Os polipéptidos imunogénicos preparados como acima descrito são usados para produzir anticorpos, tanto policlonais como monoclonais. Se forem desejados anticorpos policlonais, um mamífero seleccionado (por exemplo, rato, coelho, cabra, cavalo, etc.) é imunizado com um polipéptido imunogénico que comporta um(uns) epítopô(s) HCV, 0 soro pro- 53 !Í

veniente do animal imunizado é reunido e tratado de acordo com processos conhecidos. Se o soro contendo anticorpos poli cionais para um epítope HCV contiver anticorpos para outros antigenes, os anticorpos policlonais podem ser purificados por cromatografia de imunoafinidade. Técnicas para a produção e processamento de anti-soros policlonais sao conhecidas na arte, ver por exemplo Mayer e Walker (1987),

Alternativamente, anticorpos policlonais podem ser isolados a partir de um mamífero que tenha sido prje viamente infectado com HCV. Um exemplo de um método para puri ficar anticorpos até epítopes HCV, a partir de soro provenien te de um indivíduo infectado, baseado na cromatografia de afi. nidade e utilizando um polipéptido de fusão de SOD e um polipéptido codificado dentro do clone cDNA 5-1-1, está apresenta do na Secção V.E.

Anticorpos monoclonais dirigidos contra epítopes HCV podem também ser facilmente produzidos por qual, quer pessoa entendida na arte, A metodologia geral para fabricar anticorpos monoclonais por hibridomas é bem conhecida. Linhas de células produtoras de anticorpos imortais podem ser criadas por fusão de células, e também por outras técnicas tais como transformação directa de linfocitos B com DNA oncogénico, ou transfecção com vírus Epstein-Barr. Ver por exemplo, M. Schreier et al.(1981); Hammerling et al.(1981); Kennett et al. (1980); ver também, . patentes norte-americanas Nos. 4.341,761; 4.399*121; 4.427.783; 4.444.887; 4.466,917; 4.472.500; 4,491.632, e 4.493.890.

Painéis de anticorpos monoclonais produzidos contra epítopes

- 54 HCV podem ser peneirados para várias propriedadesj isto é, para isotipo, afinidade de epítope, etc.

Anticorpos, tanto monoclonais como po ii. clonais, que são dirigidos contra epítopes HCV são particularrnente úteis em diagnose, e aqueles que são neutralizadores são úteis em imunoterapia passiva. Anticorpos monoclonais, em particular, podem ser utilizados para aumentar os anticorpos anti-idiotipo.

Os anticorpos anti-idiotipo são iinunoglobulinas que transportam unia imagem interna do antigene do agente infeccioso contra o qual a protecção é desejada. Ver, por exemplo, Nisonoff, A,, et al, (1981) e Dreesman et al. (1985).

Técnicas para elevar anticorpos anti-idiotipo são conhecidas na arte. Ver, por exemplo, Grzych (1985), MacNamara et al. (1984), e Uytdehaag et al. (1985), Estes anticorpos anti-idiotipo podem também ser úteis para o tratamento de NANBH, assim como para a elucidação das regiões imunogénicas de antigenes HCV.

11. Η, Sondas e Conjuntos de Oligonucleótldo de diagnóstico

Utilizando as porções reveladas dos HCV cDNAs como uma base, incluindo as representadas nas Eigs. 1-32, podem ser preparados oligétneros de aproximadamente 8 nucleótidos ou mais, quer por excisão quer sinteticamente, os quais hibridizam com o genoma HCV e são úteis na identificação do(s) agente(s) viral(ais), posterior caracteriza55 ção do(s) genoma(s) viral(ais), assim como na detecção do(s) vírus nos indivíduos doentes. As sondas para polinucleótidos IICV (naturais ou derivadas) são de um comprimento que permite a detecção das únicas sequências virais por hibridação. Embora 6-8 nucleótidos possa ser um comprimento utilizável, são preferidas sequências de 10-12 nucleótidos, e cerca de 20 nucleótidos parece ser óptimo. De preferência, estas sequências derivarão de regiões que não têm heterogeneidade. Estas sondas podem ser preparadas utilizando métodos de rotina, incluindo métodos sintéticos de oligonucleótido auto-Ligado, Entre as sondas úteis, por exemplo, estão o clone 5-1-1 e os clones adicionais aqui revelados, assim como os vários oligomeros úteis para sondar librarias cDNA, indicados mais adiante. Um complemento para qualquer porção única do genoma HCV será satisfatório. Para utilização como sondas, é desejável uma completa complementaridade·, embora isso possa ser desnecessário à medida que o fragmento é aumentado.

Para utilização de tais sondas como diag nósticos, a amostra biológica a ser analizada, tal como sangue ou soro, é tratada, caso se deseje, para extrair os ácidos nucleicos nela contidos. 0 ácido nucleico resultante prç) veniente da amostra pode ser submetida a electroforese de gel ou oju tras técnicas de separação de dimensão; alternativamente, a amostra de ácido nucleico pode ser manchada por pontos sem separação de dimensão. As sondas são então classificadas. Classificações adequadas, e métodos para classificar sondas são conhecidos na arte, e incluem, por exemplo, classifica56 'Μ ções radioactivas incorporadas por tradução de incisão ou kinasing, biotina, sondas fluorescentes, e sondas quemiluminescentes. Os ácidos nucleicos extraídos da amostra são d£ pois tratados com a sonda classificada sob condições de hibri^ dação de rigores adequados.

As sondas podem ser completamente comple mentares para o genoma HCV. Portanto, normalmente são deseja veis condições de elevado rigor a fim de evitar positivos falsos. Contudo, condições de elevado rigor devem ser utilizadas apenas se as sondas forem complementares a regiões do genoma virai que não tem heterogeneidade. 0 rigor de híbrida ção é determinado por um número de factores durante a hibridação e durante o processo de lavagem, incluindo a temperatura, a resistência iónica, a extensão do tempo, e a concentração de formamida. Estes factores estão resumidos em, por exem pio, Maniatis, T, (1982),

Geralmente, espera-se que as sequências de genoma HCV estejam presentes no soro de indivíduos infecta dos a níveis relativamente baixos, isto é, a aproximadamente

3 λ r

-IO⁵ sequências por ml. Este nível pode exigir que as técnicas de amplificação sejam utilizadas em ensaios de hibridação, Tais técnicas são conhecidas na arte. Por exemplo, o sis tema Bio-Bridge da Enzo Biochemical Corpòration utiliza transferase de desoxínucleótido terminal para adicionar caudas 3'-poH -dT nao modificadas a uma sonda DNA, A sonda poli dT com cauda é hibridada até à sequência de nucleótido alvo, e depois até à poli-A biotina modificada. 0 pedido PCT 84/03520 e

ΕΡΑ124-221 descrevem um ensaio de hibridação DNA em que: (l) analite é temperada até uma sonda DNA de fibra simples que é complementar de um oligonucleôtido de enzima classificado; (2) o duplex com cauda resultante é hibridado até um oligonu cleétido de enzima classificado. A EPA 204-510 descreve um en saio de hibridação DNA em que a analite DNA é contactada com uma sonda que tem uma cauda, tal como uma cauda poli-dT, uma fibra amplificadora que tem uma sequência que hibridiza para a cauda da sonda, tal como uma sequência poli-A, e que é capaz de ligar uma pluralidade de fibras classificadas. Uma té<? nica particularmente desejável pode envolver primeiro a ampli ficação das sequências HCV de alvo em soros aproximadamente 10,000 vezes, isto é, até,aproximadamente 10 sequências/ml. Isto pode ser realizado, por exemplo, pela técnica de Saiki et al. (1986). A(s) sequêpcia(s) ampliadas·podem então ser detectadas utilizando um ensaio de hibridação que está descrito no pedido de patente norte-americana co-pendente, Attorney Docket No. 2300-0171, que foi depositado em 15 de Ou tubro de 1987, θ transmitido para a cessionária da presente, e é aqui incorporado como referência. Este ensaio de hibrida ção, que deve detectar sequências ao nível de 10^/ml utiliza multímeros de ácido nucleico que ligam a uma analite de ácido nucleico de fibra simples, e que também ligam a uma multa, plicidade de oligonucleôtidos classificados de fibra simples. Um ensaio de sanduíche de fase de solução adequado que pode ser utilizado com sondas de polinucleótido classificadas, e os métodos para a preparação de sondas estão descritos na EPO 225.807, publicada em 16 de Junho de 1987, que foi trans _ 58 mitida para a cessionária, e que é aqui incorporada como referencia .

As sondas podem ser embaladas em conjuntos de diagnóstico. Os conjuntos de diagnóstico incluem a sonda DNA que pode ser classificada; alternativamente, a son da DNA pode ser nao classificada e os ingredientes para cla.s sificar podem ser incluídos no conjunto, 0 conjunto pode tam bém conter outros reagentes embalados e materiais necessários para o protocolo de hibridação particular, por exemplo, regras, assim como instruções para conduzir o teste, ί

II.I. Imunoensaio e Conjuntos de Diagnóstico

Ambos' os polipêptidos que reagem imunolo gicamente com soro contendo anticorpos HCV, por exemplo, os derivados de, ou codificados dentro dós clones descritos na Secção

I

IV.A., e compósitos dos mesmos (ver secção IV.A.) e os anticorpos levantados contra os epitopes específicos de HCV nestes polipêptidos, ver por exemplo a Secção IV.E, são úteis nos imunoensaios para detectar a presença de anticorpos de HCV, ou a presença de vírus e/ou de antigenes virais, em amos tras biológicas, incluindo, por exemplo, amostras de sangue oú soro· θ desenho dos imunoensaios está sujeito a um grande nú mero de variações, e uma variedade destas são conhecidas na arte. Por exemplo, o imunoensaio pode utilizar um antigene vi ral, por exemplo, um polipéptido derivado de qualquer dos cio. nes contendo o HCV cDNA descrito na Secção IV.A., ou dos cDNAs compósitos derivados dos cDNAs nestes clones, ou do genoma HCV a partir do qual o cDNA 'nestes clones é derivado; al

Ο ter na ti vamente, o itnunoensaio pode utilizar uma combinação de antigenes virais derivados destas fontes. 0 mesmo pode usar, por exemplo, um anticorpo monoclonal dirigido para um(uns) epítope(s) viral(ais), uma combinação de anticorpos monoclonais dirigidos para um antigene virai, anticorpos mo noclonais dirigidos para antigenes virais diferentes, anticorpos policlonais dirigidos para o mesmo antigene virai, ou anticorpos policlonais dirigidos para antigenes virais diferentes. Os protocolos podem ser baseados, por exemplo, na competição, ou reacção directa, ou ensaios tipo sanduíche.

Os protocolos podem também, por exemplo, utilizar suportes , i solidos, ou podem ser realizados por imunoprecipitação. A maioria dos ensaios envolve o uso de anticorpo classificado ou polipéptido; as classificações podem ser, por exemplo, fluorescente, químio-luminescente, radioactiva, ou moléculas corantes. Os ensaios que amplificam os sinais a partir da son da são também conhecidos; exemplos dos quais são ensaios que utilizam biotina e avidina, e enzima classificado e imunoensaios mediados , tais como ensaios ELISA, modelo Flavivirus para HCV permite diagnósticos em relação à localização provável dos epítopes de diagnóstico para as proteínas estruturais de virião, Os domínios C, pré-M, Μ, e E são todos susceptíveis de conter epítopes de potencial significativo para detectar antigenes virais, e particularmente para diagnose. De maneira semelhan te, os domínios das proteínas não estruturais são supostos de conter epítopes de diagnóstico importantes (por exemplo, NS5 codificando uma polimerase putativa; e NS1 codificando

- 60 um antigene complemento-ligação putativo). Os polipéptidos recombinantes, ou polipéptidos virais, que incluem epítopes a partir destes domínios específicos podem ser úteis para a detecção de anticorpos virais em dadores de sangue com infe£ ções e pacientes infectados.

Além disso, anticorpos dirigidos contra as proteínas E e/ou M podem ser usados em imunoensaios para a detecção de antigenes virais ein pacientes com NANBH causada por HCV, e em dadores de sangue infecciosos. Além disso, estes anticorpos serão extremamente úteis para detectar dado, res e pacientes em fase aguda.

Os conjuntos adequados para imunodiagnose e contendo os reagentes classificados apropriados são cons truídos embalando os materiais apropriados, incluindo os poli péptidos da invenção contendo epítopes HCV ou anticorpos diri gidos contra epítopes HCV em recipientes adequados, juntamente cotri os reagentes remanescentes e materiais necessários para a condução do ensaio, assim como um conjunto adequado de instruções de ensaio.

II,J, Posterior Caracterização do Genoma HCV, Viriões, e Antigenes Virais Utilizando Sondas Derivadas De cDNA para o Genoma Virai

A informação de sequencia HCV cDNA nos clones descritos na Secção IV,A., como representada nas Figs, 1-32, inclusive, pode ser utilizada para adquirir informação adicional sobre a sequência do genoma HCV, e para identificação e isolamento do agente HCV, e assim auxiliará na sua ca61 a

racterização incluindo a natureza do genoma, a estrutura da partícula virai, e a natureza dos antigenes de que é composta. Esta informação, por sua vez, pode conduzir a sondas de polinucleótido adicionais, polipéptidos derivados do genoma HCV, e. anticorpos dirigidos contra epítopes HCV que seriam úteis para a diagnose e/ou tratamento da NAN.BM provocada por MCU,

A informação da sequência cDNA nos clones acima mencionados é útil para o desenho de sondas para o is£ lamento de sequências cDNA adicionais que são derivadas de regiões ainda não identificadas ,do(s) genoma(s) HCV a partir dos quais os cDNAs em clones descritos na Secção IV.A, são derivados. Por exemplo, bondas classificadas contendo uma se. quência de aproximadamente 8 ou mais nucleotidos, e de pref£ rencia 20 ou mais nucleotidos, que são derivados das regiões próximas do 5’”terminus ou 3¹-terminas da família das sequên cias HCV cDNA representadas nas Figs. 1, 3, 6, 9, l4 e 32 po. dem ser utilizadas para isolar sequências cDNA que se sobrepõem a partir de librarias HCV cDNA. Estas sequências que se sobrepõem aos cDNAs nos clones acima mencionados, mas que também contêm sequências derivadas de regiões do genoma a partir do qual o cDNA nos clones acima mencionados não são derivados, podem então ser utilizadas para sintetizar sondas para identificação de outros fragmentos que se sobrepõem os quais não se sobrepõem necessariamente aos cDNAs nos clones descritos na Secção IV.A. A menos que o genoma HCV seja se^ mentado e os segmentos careçam de sequências comuns, é possível sequenciar o(s) genqtna(s) totais utilizando a técnica do isolamento de cDNAs que se sobrepõem derivados do(s) geno ma(s) viral(ais). Embora seja improvável, se o genoma for um genoma segmentado que carece de sequências comuns, a sequência do genoma pode ser determinada por librarias lambda-gtll HCV cDNA peneiradas serologicamente, como utilizadas para is£ lar o clone .5-1-1, sequenciando cDNA isolados, e utilizando os cDNAs isolados para isolar fragmentos que se sobrepõem, utilizando a técnica descrita para o isolamento e sequenciamento dos clones descritos na Secção IV.A, Alternativamente, a caracterização dos segmentos genómicos pode ser feita a par tir do(s) genoma(s) viral(ais) i,solado(s) a partir de partícu las HCV purificadas. Métodos para purificar partículas HCV e para detectar as mesmas durante o processo de purificação são aqui descritos, mais adiante. Processos para isolar genomas de polinucleótido a partir de partículas virais são conhecidos na arte, e um processo que pode ser utilizado está representa do no Exemplo IV,A.1. Os segmentos genómicos isolados podem então ser cionados e sequenciados. Então, com a informação aqui proporcionada, é possível clonar e sequênciar o(s) genoma(s) HCV independentemente da sua natureza.

Métodos para construir librarias cDNA são conhecidos na técnica, e são discutidos anteriormente e em s.e guida; um método para a cqnstrução de librarias de HCV cDNA em lambda-gtll é discutido mais adiante na Secção IV.A. Contu do, librarias cDNA que são úteis para screening ç,om sondas de ácido nucleico podem também ser construídas noutros vectores conhecidos na arte, por exemplo, lambda-gtlO (Huynh et al. (1985).). 0 derivado HCV de cDNA detectado pelas sondas deriva

- 63 das dos cDNAs nas Figs. 1-32, e das das sondas sintetizadas a partir de polinucleótidos derivados destes cDNAs, pode ser isolado a partir do clone.por digestão do polinucleótido isola do com o(s) enzima(s) de restrição adequado(s), e sequenciado. Ver, por exemplo, a Secção IV.A.3· © IV.A.4 para as técnicas utilizadas para o isolamento e sequenciamento de HCV cDNA que se sobrepõe a HCV cDNA no clone 5-1-1, Secções IV.A.5-IV,A,7 para o isolamento e sequenciamento de HCV cDNA que sobrepõe àquele no clone 8l, e Secção IV.A.8 e IV.A.9 para o isolamento e sequenciamento de um clone que se sobrepõe a outro clone (clone 36), que se sobrepõe ao clone 8l, i

A informação de sequência derivada destes HCV cDNAs que se sobrepõem é útil para determinar áreas de ho mologia e heterogeneidade dentro do(s) genoma(s) viral(ais), que podem indicar a presença de estirpes diferentes do genoma, e/ou de populações de partículas defectivas. É também útil pa ra o desenho das sondas de hibridação para detectar HCV ou an tigenes HCV ou ácidos nucleicos de HCV nas amostras biológicas^

I , e durante o isolamento de HCV (discutido mais adiante), utilizando as técnicas descritas na Secção II.G, Além disso, os cDNAs que se sobrepõem podem ser utilizados para criar vectores de expressão para polipéptidos derivados do(s) genoma(s) de HCV que também codificam os polipéptidos codificados nos clones 5-1-1, 36, 81, 91, θ 1-2, e nos outros clones descritos na Secção IV.A, As técnicas para a criação destes polipép, tidos contendo epítopes HCV, e para anticorpos dirigidos contra epítopes HCV contidos dentro dos mesmos, assim como as suas utilizações, são análogas às descritas para os polipépti_ 64 _

dos derivados de sequências NANBV cDNA contidas dentro dos clones 5-1-1, 32, 35, 36, 1-2, 8l, e 91, e discutidas anterior mente e mais adiante.

Codificados dentro da família de sequências cDNA contidas dentro dos clones 5-1-1» 32, 35» 36, 8l,

91, 1-2, e outros clones descritos na Secção IV.A. são antigene(s) contendo epítopes que parecem ser únicos para HCV; is. to é, anticorpos dirigidos contra estes antigenes estão ausen tes em indivíduos infectados com HAV ou HBV, e em indivíduos não infectados com HCV (ver os dados serológicos presentes na Secção IV.B,), Além disso, uma domparação da informação de se, quência destes cDNAs com as sequências de HAV, HBV, HDV, e com as sequências genómicas em Genebank indica que existe a homolo. gia mínima entre estes cDNAs e as sequências de polinucleétido daquelas fontes. Assim, os anticorpos dirigidos contra os antigenes codificados dentro dos cDNAs destes clones podem ser utilizados para identificar partículas BB-NANBV isoladas a partir de indivíduos infectados. Além disso, os mesmos são também úteis para o isolamento de agente(s) NANBH,

Partículas HCV podem ser isoladas a partir de soros provenientes de indivíduos infectados com BB-NANBV ou a partir de culturas de células por qualquer dos rné todos conhecidos na arte, incluindo por exemplo, técnicas baseadas na descriminação de dimensão, tais como métodos de sediL mentação ou exclusão, ou técnicas baseadas na densidade tais como ultra-centrifugação em gradientes de densidade, ou preci pitação com agentes tais como polietileno glicol, ou cromato65 grafia sobre uma variedade de materiais tais como materiais de permuta anionicos ou cationicos, e materiais que se ligam devido a hidrofobicidade, assim como colunas de afinidade. Durante o processo de isolamento a presença de HCV pode ser detectada por análise de hibridação do genoma extraído, uti lizando sondas derivadas dos HCV cDNAs descritos anteriormen te, ou por imunoensaio (ver Secção II.i) utilizando como son das anticorpos dirigidos contra antigenes de HCV codificados dentro da família das sequências cDNA nas Figs. 1-32, e também dirigidos contra antigenes HCV codificados dentro das se quências HCV cDNA que se sobrepõem, discutidas anteriormente.

i

Os anticorpos podem ser monoclonais, ou policlonais, e pode ser desejável purificar os anticorpos antes da sua utilização, no imunoensaio. Um processo de purificação para anticorpos po. liclonais dirigidos contra antigene(s) codificados com o clone 5-l?-l está descrito na Secção IV.E; processos de purificação análogos podem ser utilizados para anticorpos dirigidos contra outros antigenes HCV,

Anticorpos dirigidos contra antigenes HCV codificados dentro da família de cDNAs representados nas Figs, 1-32, assim como aqueles codificados dentro dos HCV cDNAs que se sobrepõem, os quais estão afixados a suportes sólidos, são úteis para o isolamento de HCV por cromatografia de imunoafinidade. Técnicas para a cromatografia de imunoafinidade são conhecidas na arte, incluindo técnicas pa ra afixar anticorpos a suportes sólidos de modo que os mesmos retenham a sua actividade imunoselectiva; as técnicas p£ dem ser aquelas em que os anticorpos são adsorvidos para o suporte (ver, por exemplo, Kurstak em ΕΝΖΥΜΕ IMMUNODIAGNOS1S, páginas 31-37), assim como aquelas em que os anticorpos estão covalentemente ligados ao suporte. Geralmente, as técnicas são semelhantes às utilizadas para ligação covalente de antigenes a um suporte solido, as quais estão geralmente descritas na Secção II,C},contudo, grupos espaçadores podem ser incluídos nos agentes de ligação bifuncionais de modo que o antigene que liga o local ao anticorpo permanece aces sível,

Durante o processo de purificação a pre. sençade HCV pode ser detectada,e/ou verificada por hibrida ção de ácido nucleico, utilizando como sondas polinucleétidos derivados da família das sequências HCV cDNA representa das nas Figs, 1-3², assim como a partir de sequências HCV cDNA que se sobrepõem, descritas anteriormente. Neste caso, as fracções são tratadas sob condições que poderão provocar o rompimento das partículas virais, por exemplo, com detergentes na presença de agentes de quelificação, e na presença

I de ácido nucleico virai determinado por técnicas de hibridação descritas na Secção II.H, Posterior confirmação de que as partículas isoladas são os agentes que induzem HCV pode ser obtida infectando chimpanzés com as partículas de vírus isoladas, seguindo-se a determinação de se os sintomas de NANBH resultam da infecção.

Partículas virais provenientes de prepa rações purificadas podem então ser ainda caracterizadas. 0 ácido nucleico genómico foi purificado. Com base na sua sen sibilidade a RNase, e não .a DNase I, parece que o vírus '

- 67 composto por um genoma RNA. Ver Exemplo IV.C,2., mais adian te, A capacidade de formar fibras e a circularidade ou não circularidade podem ser determinadas por técnicas conhecidas na arte, incluindo, por exemplo, a sua visualização por microscópio electrónico, a sua migração em gradientes de densi dade, e as suas características de sedimentação. Com base na hibridação do genoma HCV capturado até fibras negativas dos HCV cDNAs, parece que o HCV pode ser constituído por um gen£ ma RNA positivo com fibras (ver Secção IV.H.l), Técnicas tais como estas estão descritas em, por exemplo, METHODS IN ΕΝΖΥΜΟ LOGY. Além disso, o ácido nucleico purificado pode ser cionai do e sequenciado por técnicas conhecidas, incluindo a transcrição inversa visto que_;p material genómico e RNA. Ver, por exemplo, Maniatis (1982), e Glover (1985). Utilizando o ácido nucleico derivado das partículas virais, é possível sequenciar todo o genoma, quer o mesmo seja ou não segmentado.

exame da homologia do polipéptido codific^ do dentro da ORF contínua de clones combinados l4i a 39c (Ver Fig. 26), mostra que o polipéptido HCV contém regiões de honw logia com as correspondentes proteínas em regiões conservadas de flavivírus. Um exemplo disto está descrito na Secção IV.H.3. Esta descoberta tem muitas ramificações importantes. Em primeiro lugar, esta evidência, em conjunto com os resultados que mostram que o HCV contem um genoma com fibras positivas, cuja dimensão é de aproximadamente 10,000 nucleotidos, ó con sistente com a sugestão de que o HCV é um flavivírus, ou um vírus análogo. Geralmente, os viriões de flavivírus e os seus genomas têm uma estrutura e organização relativamente consistentes, que são conhecidas. Ver Rice et al, (1986), e Brinton, M.A. (1988), Assim, os genes estruturais codificando os polipéptidos C, pré-M/M, e E podem estar localizados no 5'-terminus do genorna a montante do clone l4i. Além disso, uti lizando a comparação com outros flavivírus, podem ser feitos prognósticos quanto à localização precisa das sequências que codificam estas proteínas, isolamento das sequências a montante 1 das no clone l4i pode ser realizado de várias maneiras que, dada aqui a informação, serão óbvias para qualquer pessoa en tendida na arte. Por exemplo, a'técnica de marcha walking do genorna, pode ser utilizada para isolar outras sequências que são 5' para aquelas no clone l4i, mas que se sobrepõem àquele clone; este por seu lado conduz ao isolamento de sequências adicionais. Esta técnica está amplamente demonstrada mais adiante, na Secção IV.A.. Por exemplo, também, é sabido que os flavivírus têm conservado epítopes e regiões de sequências de ácido nucleico conservadas. Os polinucleótidos

I contendo as sequências conservadas podem ser utilizados como sondas que ligam o genorna HCV, permitindo assim o seu isolamento. Além disso, estas sequências conservadas, em conjunto com as derivadas dos HCV cDNAs representados na Eig. 22, podem ser utilizadas para desenhar primários para utilização em sistemas que ampliam as sequências de genorna a montante daquelas no clone l4i, utilizando a tecnologia de reacção de cadeia de polimerase. Um exemplo disto está descrito mais adiante.

A estrutura do HCV pode também ser deter minada e os seus componentes isolados, A morfologia e dimensão podem ser determinados por, por exemplo, microscopia elec trónica, A identificação e a localização de antigenes de polipéptido virais específicos tais como antigenes de revestimento ou invólucro, ou antigenes internos, tais como proteínas de ligação de ácido nucleico, antigenes de núcleo, e polimerase(s) de polinucleotido podem também ser determinadas por, por exemplo, determinação de se os antigenes estão pre sentes como componentes virais maiores ou menores, assim como pela utilização de anticorpos dirigidos contra os antigenes específicos codificados dentro de cDNAs isolados como son das. Esta informação ó útil na concepção de vacinas; por exemplo, pode ser preferível incluir um'antigene exterior numa preparação de vacina. Vacinas multivalentes podem ser consta, tuídas por, por exemplo, um polipéptido derivado do genoma codificando uma proteína estrutural, por exemplo, E, assim

I como um polipéptido a partir de outra porção do genoma, por exemplo, um polipéptido não estrutural ou estrutural.

II, K, Sistemas de Cultura de Célula e Sistemas de Modelo

Animal para Replicação HCV

A sugestão de que o HCV é um flavivírus ·. ou vírus flavi análogo também proporciona informação sobre métodos para a germinação de HCV. A expressão flavi análogo significa que o vírus apresenta uma quantidade significa tiva de homologia para as regiões conservadas conhecidas de flavivírus e que a maior parte do genoma é uma ORF simples.

Os métodos para cultivar flavivírus são conhecidos dos enten didos na arte (Ver, por exemplo, as revistas por Brinton (1986) e Stollar, V, (1980)), De um modo geral, células ou linhas de células adequadas para cultivar HCV podem incluir aquelas que são conhecidas para suportar a replicação de Fia vivírus, por exemplo, as seguintes: linhas de células de rim de macaco (por exemplo MKg, VERO); linhas'de células de rim de porcinos (por exemplo PS); linhas de células de rim de hamster bebé (por exemplo BHK); linhas de células de macrofage de murino (por exemplo, P388D1, Mkl, Mml); linhas de cé lulas de macrofage de seres humanos (por exemplo, U-937); leucócitos de sangue periféricos de seres humanos; monócitos aderentes de seres humanos; hepatócitos ou linhas de cé lulas de hepatócito (por.exemplo, HUH7, HEPG2); células de embriões ou embrionárias (por exemplo, fibroblastos de embrião de pinto); ou linhas de células derivadas de invertebrados, de preferência de insectos (por exemplo linhas de cé lulas de drosofila), ou mais preferivelmente de artrópodes, por exemplo linhas de células de mosquitos (por exemplo, A. Albopictus, Aedes aegypti, Cutex tritaeniorhynchus) ou linhas de células de ácaros (por exemplo RML-14 Dermacentor pa rumapertus),

É possível que os hepatocitos primários possam ser cultivados, e depois infectados com HCV5 ou alter nativamente, as culturas de hepatocitos pode ser derivada de fígados de indivíduos infectados (por exemplo, seres humanos ou chimpanzés), 0 último caso é um exemplo de uma célula que é infectada in vivo sendo passada in vitro, Além disso, vá71

ύ rios métodos de imortalização podem ser utilizados para obter linhas de células derivadas de culturas de hepatocitos. Por exemplo, culturas de fígado primárias (antes e depois do enriquecimento da população de hepatocitos) podem ser fundidas até uma variedade de células para manter a estabilidade. Por exemplo, também, as culturas podem ser infectadas com vi rus de transformação, ou transfectadas com genes de transfor mação a fim de criar linhas de células permanentes >ou semi-permanentes. Além disso, por exemplo, células em culturas de fígado podem ser fundidas para estabelecer linhas de célu las (e.g,, HepG-2) , Métodos para'a fusão de células são conhe eidos na arte, e incluem, por exemplo, a utilização de agentes de fusão tais como pplietileno glicol, vírus Sendai, e vírus Epstein-Barr.

Como foi discutido anteriormente, o HCV é um Flavivírus ou vírus Flavi análogo. Portanto, é provável que a infecção HCV de linhas de células possa ser realizada por técnicas conhecidas na arte para infectar células com Flavivírus. Estas incluem, por exemplo, incubar as células com preparações virais sob condições que permitam a entrada de vírus dentro da célula. Além disso, pode ser possível obter produção virai por transfecção de células com polinucleó, tidos virais isolados. E sabido que o Togavírus e o Flavivírus RNAs são infecciosos numa variedade de linhas de células de vertebrados (Pfefferkorn e Shapiro(197^)), θ numa linha de células de mosquito (peleg (1969))· Métodos para transfeç. tar células de cultura de tecido com duplexes RNA, RNAs com fibras positivos, e DNAs (incluindo cDNAs) são conhecidos na arte, e incluem, por exemplo, técnicas que utilizam elecfcroporação, e precipitação com DEAE-Dextran ou fosfato de cálcio. Uma fonte abundante de HCV RNA pode ser obtida realizan do in vitro a transcrição de um HCV cDNA correspondendo ao genoma completo. A transfecção com este material, ou com HCV cDNA clonado deve resultar em replicação virai e na propagação in vitro do vírus.

Além disso para células cultivadas, sistemas de modelo animal podem ser utilizados para replicação virai; sistemas animais em que flavivírus estão presentes são conhecidos dos entendidos na arte (Ver, por exemplo, a revista por Monath (1986)). Assim, a replicação de HCV pode ocorrer não apenas em chimpanzés, mas também em, por exemplo, saguis e ratos lactentes. '

11. L. Peneiramento para Agentes Anti-Virais para HCV

A viabilidade da cultura de células e sistemas de modelo animal para HCV também torna possível o screening para agentes anti-virais que inibem a replicação de HCV, e particularmente para aqueles agentes que preferivelmente permitem o desenvolvimento e multiplicação das cé lulas ao mesmo tempo que inibem a replicação virai. Estes mé todos de screening são conhecidos dos entendidos na arte. Geralmente, os agentes anti-virais são testados a uma variedade de concentrações, para o seu efeito sobre a replicação virai preventiva em sistemas de cultura de células que supor tam a replicação virai, e depois para uma inibição de infec- 73- -

tividade ou patogenicidade virai (e um nível baixo de toxicidade ) num sistema de modelo animal.

Os métodos e composições aqui proporcionados para detectar antigenes HCV e polinucleótidos HCV sao úteis pa ra o screéninçj dos agentes anti-virais em que os mesmos pro porcionam uma alternativa, e talvez meios mais sensitivos, para detectar o efeito do agente sobre a replicaçao virai, que o ensaio de

das HCV-polinucleótido aqui descritas podem ser utilizadas para quantificar a quantidade de ácido nucleíco virai produzido na cultura de célula. Isto pode ser realizado, por exemplo, por hi bridação ou hibridação de competição dos ácidos nucleícos de células infectadas com uma sonda HCV-polinucleótido classificada. Por exemplo, também, ^nticorpos anti-HCV podem ser utilizados para identificar e quantificar antigene(s) de HCV na cultura de células utilizando os imunoensaios aqui descritos. Além disso, visto que pode ser desejável quantificar antigenes HCV na cultura de célula infectada por um ensaio de competição, os polipéptidos codificados dentro dos HCV cDNAs aqui descritos são úteis nestes ensaios de competição. Geralmente, um polipéjo tido HCV recombinante derivado do HCV cDNA deveria ser classificado, e a inibição de ligação deste polipéptido classificado para um polipéptido HCV devido ao antigene produzido no sistema de cultura de célula deve ser controlado, Mais ainda, estas técnicas são particularmente úteis nos casos em que o HCV pode ser capaz de replicar numa linha de célula sem causar a morte da célula.

- 74 II.Μ. Preparação de Estirpes Atenuadas de HCV

Além do acima descrito, utilizando os sistemas de cultura de tecido e/ou sistemas de modele animal, pode ser possível isolar estirpes atenuadas de HCV. Estas estirpes serão adequadas para vacina, ou para o isolamento de antigenes virais. As estirpes atenuadas são isoláveis depois de múltiplas passagens na cultura de células e/ou modelo animal. A detecção de uma estirpe atenuada numa célula ou indivíduo infectados é realizável por meio de técnicas conhecidas na arte, e pode in cluir, por exemplo, a utilização de anticorpos para um ou mais epítopes codificados em HCV como uma sonda ou a utilização de um polinucleótido contendo uma sequência HCV de pelo menos cer ca de 8 nucleótido» como uma sonda. Alternativamente, ou em adi. Ção, uma estirpe atenuada pode ser construída utilizando a inI formação genómica de HCV aqui proporcionada, e utilizando técnicas recombinantes. Geralmente, pode tentar-se retirar a região do genoma codificando, por exemplo, um polipéptido relacionado com a patogenicidade, mas que permite a replicação vi ral. Além disso, a construção de genoma permitirá a expressão de um epítope que dá lugar à neutralização de anticorpos para HCV, 0 genoma alterado pode então ser utilizado para transfor mar células que permitem a replicação de HCV, e as células d£ senvolvem-se sob condições para permitir a replicação virai. Estirpes de HCV atenuadas são úteis não apenas para fins dé va cina, mas também como fontes para a produção comercial de anti genes virais, visto que o processamento destes vírus exigiria medidas de protecção menos rigorosas para os funcionários en volvidos na produção virai,

III. Métodos Gerais

As técnicas gerais utilizadas na extracção do genoma a partir de um vírus, preparando e sondando uma libraria cDNA, sequenciando clones, construindo vectores de expressão, transformando células, realizando ensaios imunológicos tais como radioimunoensaios e.ensaios ELISA, para desen volvimento de células em cultura, e análogos são conhecidos na arte e manuais de laboratório estão disponíveis, os quais descrevem estas técnicas. Todavia, como um guia geral, o que se segue mostra algumas fontes correntemente disponíveis para tais procedimentos, e para materiais úteis para realizar os mesmos.

III,A, Hospedeiros e Sequências de Controle de Expressão

Células hospedeiras tanto procarióticas como eucarióticas podem ser utilizadas para expressão das desejadas sequências de codificação quando são utilizadas sequências de controle apropriadas que são compatíveis com o hospedeiro designado. Entre os hospedeiros procarióticos, o E, coli é mais frequentemente utilizado. As sequências de con trole de expressão para procariotes incluem promotores, contendo opcionalmente porções operadoras, e locais de ligação de ribossoma, Vectores de transferência compatíveis com hosp£ deiros procarióticos são comumente derivados de, por exemplo, pBR322, um plasmideo contendo operões que conferem resistên- 76 cia a ampicilina β tetraciclina, e os vários vectores pUC, que também contêm sequências que conferem marcadores de resistência a antibióticos. Estes marcadores podem ser utiliza dos para obter transformantes bem sucedidos por selecção. Se quências de controle procariótico comumente utilizadas incluem a Beta-lactamase (penicilinase) e sistemas promotores de lactose (Chang et al, (1977))» o sistema promotor triptofano (trp) (Goeddel et al.)(1980)) e o promotor lambda-derivado e local de ligação do ribossoma N gene (Shimatake et al. (ΐ9θΐ)) e o promotor híbrido tac (De Doer et al. (1983)) derivados das sequências dos promotores trp e lac UV5. Os sis temas anteriores são particularmente compatíveis com E, coli; se for desejado, outros hospedeiros procarióticos tais como estirpes de Bacillus ou Pseudomonas podem ser utilizados, com sequências de controle correspondentes.

Hospedeiros eucarióticos incluem levedura e células de mamíferos em sistemas de cultura. Os Saccharomyces cervisiae e Saccharomyces carlsbergensis são os hospedeiros de levedura mais comummente utilizados, e são hospedej. ros de fungos convenientes. Vectores de levedura compatíveis suportam marcadores que permitem a selecção de transformantes com êxito conferindo prototrofia a mutantes auxotróficos ou resistência a metais pesados sobre estirpes do tipo selvagem. Vectores compatíveis de levedura podem empregar a origem 2 mi cron de replicação (Broach et al. (1983)), a combinação de CEN3 e ARSI ou outros meios para assegurar a replicação, tais como as sequências que resultarão na incorporação de um fragmento no genoma da célula hospedeira. As sequências de contro

- 77 '“Μ le para vectores de levedura são conhecidas na arte e incluem promotores para a síntese de enzimas glicolíticos (Hess et al. (1968)} Holland et al, (ΐ97θ))» incluindo o promotor para 3 fosfoglicerato quinase (Hitzeman (1980)). Finalizadores podem também ser incluídos, tais como os derivados do gene enolase (Holland (l98l)). Sistemas de controle particularmente úteis são aqueles que compreendem o promotor gliceraldeído-3 fosfato deshidrogenase (GAPDH) ou o promotor regularizável de álcool deshidrogenase (ADH),finalizadores também derivados de GAPDH, e se for desejada a secreção, a sequência guia proveniente do factor alfa de levedura. Além disso, a região reguladora transcri cional e a região de iniciação transcricional que estão operativamente ligadas podem ser tais que as mesmas não estão associadas no organismo do tipo selvagem. Estes sistemas estão de_s critos em pormenor na EPO 120.551» publicada em 3 de Outubro de 1984; EPO 116.201, publicada em 22 de Agosto de 1984; e EPO 164,556, publicada em 18 de Dezembro de 1985» as quais foram todas transmitidas para a presente cessionária, e são aqui incorporadas como referencia.

Linhas de células de mamíferos disponíveis como hospedeiras para expressão são conhecidas na arte e incluem muitas linhas de células imortalizadas disponíveis a partir da American Type Culture Collection (ATCC), incluindo células HeLa, células de ovário de hamster chinês (CHO), células de rim de hamster bebé (ΒΗΚ) e um certo número de outras linhas de células. Promotores adequados para células de mamíferos são também conhecidos na arte e incluem promotores virais tais como os obtidos a partir de Siroian Virus 4θ (SV4O) (Fiers (1978)), Rous sarcoma vírus (RSV), adenovírus (ADV), e vírus de papiloma de bovino (BPV). Células de mamíferos podem também exigir sequências finalizadoras e sequências de adição poli A; sequências de intensificador que aumen tam a expressão podem também ser incluídos, e sequências que provocam a amplificação do gene podem também ser desejáveis. Estas sequências são conhecidas na arte. Os vectores adequados para replicação em células de mamíferos podem incluir replicões virais, ou sequências que asseguram a integração das sequências apropriadas codificando epítopes NANBV no geno ma hospedeiro.

III.B. Transformações

A transformação pode ser realizada por qualquer método para introduzir polinucleótidos numa célula hoape deira, incluindo, por exemplo, embalar o polinucleótido num vírus e transductar a célula hospedeira com o vírus, e por le^ vantamento directo do polinucleótido. 0 procedimento de transformação utilizado depende do hospedeiro a ser transformado. Por exem) pio, a transformação das células hospedeiras de E. coli com lambda-gtll contendo sequências BB-NANBV é discutida na secção do Exemplo, mais abaixo. A transformação bacteriana por levantamento directo emprega geralmente o tratamento com cálcio ou cloreto de rubídio (Cohen (197²)} Maniatis (1982)), A transformação de levedura por levantamento directo pode ser realizada utilizando o método de Hinnen et al. (1978). As transformações em mamíferos por levantamento directo podem ser conduzidas utilizando o método de precipitação de fosfato

ο de cálcio de Graham e Van der Eb (ΐ97θ)» as várias modifi cações conhecidas do mesmo.

III.C, Construção de Vector

A construção de vector emprega técnicas que são conhecidas na arte, A clivagem de DNA no local específico é realizada tratando com enzimas de restrição adequados sob condições que são geralmente especificadas pelo fabricante destes enzimas comercialmente disponíveis. Em geral, cerca de 1 micrograma de plasmideo ou sequência DNA é clivado por uma unidade de enzima em cerca de 20 microlitros de solução tampão por incubação durante 1-2 horas a 37° C. Depois de incuba ção com o enzima de restrição, a proteína é removida por extrac ção com fenol/clorofórmio e o DNA recuperado por precipitação com etanol. Os fragmentos clivados podem ser separados utilizan do poliacrilamida ou técnicas de electroforese de gel de agaro se, de acordo com os procedimentos gerais encontrados em Methods in Enzymology (1980) 65:499-560.

Os fragmentos de clivagem terminados, viscosos, podem ser terminados sem corte utilizando polimerase I de DNA E. coli (Klenow) na presença dos trifosfatos de desoxi^ nuoleótido apropriado (dNTPs) presentes na mistura. 0 tratamen to com nuclease SI pode também ser utilizado, resultando na hi drólise de quaisquer porções de DNA de fibra simples.

As ligações são realizadas utilizando tampões padrão e condições de temperatura utilizando ligase T4 DNA e ATP; as ligações terminais viscosas exigem menos ATP e menos li. gase que as ligações terminais sem corte. Quando os fragmentos de vector são utilizados como parte de uma mistura de ligação, o fragmento de vector é muitas vezes tratado com fosfatase alcalina bacteriana (BAP) ou fosfatase alcalina intestjl nal de vitelo para remover o 5'-fosfato e assim evitar a religação do vector; alternativamente, a digestão de enzima de restrição de fragmentos não desejados pode ser utilizada para evitar a ligação.

As misturas de ligação são transformadas em hospedeiros de clonagem adequados, tais como E. coli. e trans formantes bem sucedidos escolhidos por, por exemplo, resistên cia antibiótica, e peneirados para construção correcta.

III.D. Construção de Sequências DNA Desejadas

Oligonucleótidos sintéticos podem ser preparados utilizando um sintetizador de oligonucleótido automatiza do como descrito por Warner (1984), Caso se deseje, as fibras 32 sintéticas podem ser classificadas com P, por tratamento com , 32 quinase de polinucleotido na presença de P-ATP, utilizando condições padrão para a reacção.

As sequências DNA, incluindo as isoladas a partir de librarias cDNA, podem ser modificadas por técnicas conhecidas, incluindo, por exemplo a mutagénese dirigida ao local, como descrito por Zoller (1982). Abreviadamente, o DNA a ser modificado é embalado no fago como uma sequência de fibra simples, e convertido num DNA de fibra'dupla com polimera se de DNA utilizando, como primário, um oligonucleótido sintjs tico complementar para a porção do DNA a ser modificada, e tendo a desejada modificação incluída na sua própria sequên3

cia. 0 DNA de fibra dupla resultante é transformado num fago

I suportando bactéria hospedeira. Culturas das bactérias trans formadas, que,contêm replicações de cada fibra do fago, são laminadas em agar para se obterem placas. Teoricamente, 50% das novas placas contêm fago tendo a sequência mutada, e os restantes 50% têm a sequência original. Os replicados das pia cas são hibridados até uma sonda sintética classificada a tem peraturas e condições que permitem a hibridação com a fibra correcta, mas não com a sequência não modificada. As sequências que foram identificadas por hibridação são recuperadas e clonadas.

III.E. Hibridação com Sonda

Librarias DNA podem ser sondadas utilizando o procedimento de Grunste.in e Hogness(l975)· Abreviadamente, neste procedimento, o DNA a ser sondado é imobilizado sobre filtros de nitrocelulose, desnaturado, e pré-hibridado çom um tampão contendo 0-50% de formamida, (^75 M de NaCl, 75 mM de citrato de Na, 0,02% (peso/v) cada de albumina de soro de bovino, polivinil pirrolidona, e Picoll, 50 mM de fosfato de Na (pH 6,5), 0,1% de SDS, e 100 microgramas/ml de veículo de DNA desnaturado.

A percentagem de formamida no tampão, assim como o tempo e as condições de temperatura da pré-hibridaçâo e subsequentes fases de hibridação depende do rigor exigido. As sondas oligomé ricas que exigem baixas condições de rigor são geralmente uti lizadas com baixas percentagens de formamida, temperaturas inferiores, e longos períodos de hibridação.. As sondas contendo mais que 3θ ou Uo nucleótidos tais como as derivadas de cDNA b

ou de sequências genómicas empregam geralmente temperaturas elevadas, por exemplo cerca de 40-42° C, e uma elevada percen tagem, por exemplo 5θ%, de formamida. Seguindo a pré-hibridação, a sonda de oligonucleotido 5*- P-classifiçada é adicionada ao tampão, e os filtros são incubados nesta mistura sob condições de hibridação. Depois de lavagem, os filtros tratados são submetidos a auto-radiografia para mostrar a localizai ção da sonda hibridada; o DNA em locais correspondentes, sobre as placas de agar originais, é utilizado como a fonte do desejado DNA

III. F. Verificação de Construção e Sequenciamento

Para construções de vector de rotina, as mis turas de ligação são transformadas na estirpe HB101 de E, coli ou outro hospedeiro adequado, e transformantes bem sucedidos escolhidos por resistência antibiótica ou outros marcadores, Os plasmídeos provenientes dos transformantes são então preparados de acordo com o método de Clewell et al, (1969), seguindo usualmente a ampliação de cloramfenicol (Clewell (1972)), 0 DNA é isolado e analizado, usualmente por análise de enzima de restrição e/ou sequenciamento. 0 sequenciamento pode ser efectuado pelo método dideoxi de Sanger et al. (1977) como descrito ainda por Messing et al, (1981), ou pelo método de Maxam et al. (1980). Os problemas com a compressão por fita, que são por vezes observados nas regiões ricas GC, foram ultrapassados pela utilização de T-desazoguanosina de acordo com Barr et al, (1986).

III.G, Ensaio Imunosorvente de Bnzima-Ligado ensaio imunosorvente de enzima-lqgado

- 83 (ELISA) pode ser utilizado para medir ae concentrações quer de antigene quer de anticorpo. Este método depende da conjugação de um enzima quer com antigene quer com um anticorpo, e utiliza a actividade do enzima ligado como uma classificação quanti tativa. Para medir o anticorpo, o antigene conhecido é fixado a uma fase sólida (por exemplo, uma microplaca ou taça de plájs tico) incubada com diluições de soro de teste, lavado, incubado com anti-imunoglobulina classificada com um enzima, e lavado de novo. Os enzimas adequados para classificação são conhecidos na arte, e incluem, por exemplo, peroxidase de rábano. A actividade do enzima ligada à fase sólida e medida por adição do substrato específico, e determinado a formação de produto ou utilização de substrato colorimetricamente. A ligação da a£ tividade do enzima e uma função directa da quantidade de ligação de anticorpo.

Para medir o antigene, um anticorpo específico conhecido é fixado à fase sólida, é adicionado material de teste contendo antigene, depois uma incubação da fase sólida e lavada, e e adicionado um segundo anticorpo de enzima-clas sifiçado. Depois da lavagem, e adicionado substrato, e a activi. dade do enzima ó estimada colorimetricamente, e referida à concentração de antigene.

IV. Exemplos

Descritos em seguida estão exemplos da presente invenção que são proporcionados apenas com fins ilustrativos, e não para limitar o âmbito da presente invenção. À luz da presente descrição, numerosas formas de realização den84

tro do âmbito das roivindicações tornar-se-ão evidentes para aqueles normalmente entendidos na arte. Os procedimentos indicados, por exemplo, nas Secções IV.A. podem, se fór desejado, ser repetidos mas não necessitam sê-lo, na medida era que estão disponíveis técnicas para a construção das desejadas sequências de nucleotido com base na informação proporcionada pela invenção. A expressão é exemplificada em E. coli} todavia, outros sistemas estão disponíveis, como indicado mais completamente na Secção III.A. Epítopes adicionais derivados da estrutura ge nómica podem também ser produzidos, e utilizados para gerar an ticorpos como se indica mais adiante.

IV.A. Preparação, Isolamento e Sequenciamento de HCV cDNA

IV.A.1. Preparação de HCV cDNA

A fonte do agente NANB foi um reservatório de plasma derivado de um chimpanzé com NANBH crónica, 0 chimpanzé tinha sido experimentalmente infectado com sangue de outro chimpanzé com NANBH crónica resultante de infecção com

I HCV num banho contaminado de concentrado de factor 8 derivado de soros humanos colhidos. 0 reservatório de plasma de chimpan zé foi feito combinando muitas amostras de plasma individual contendo elevados níveis de actividade de alanina aminotransfe rase; esta actividade resulta do ferimento hepático devido à infecção com o HCV, Visto que 1 ml de uma diluição a 10~^ deste soro colhido deu i.v. NANBH provocado noutro chimpanzé, o seu CID foi de pelo menos 10^/ml, isto é, o mesmo tinha um ele vado título de vírus infeccioso.

Uma libraria cDNA proveniente do reserva tório de plasma de elevado título foi gerada como segue. Primeiro, as partículas virais foram isoladas a partir do plasma; uma parte aliquota de 90 ml foi diluída com 310 ml de uma solução contendo 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, ImM EDTA, 100 mM de NaCl. Fo ram removidos fragmentos por centrifugação durante 20 minutos a 15,000 x g a 20° C. As partículas virais no sobrenadante re sultante foram então transformadas em raicroesferas por centri fugação num rotor Beckman SW28 a 28.000 rpm durante 5 horas a 20° C. Para libertar o genoma virai, as partículas foram rompi das suspendendo as microesferas em 15 ml de solução contendo 1$ de sulfato de dodecil sódio (SDS), 10 mM EDTA, 10 mM Tris-HC1, pH 7,5, contendo também 2 mg/ml de proteinase k, seguin do-se a incubação a 45° C durante 90 minutos. Os ácidos nucle^ cos foram isolados adicionando 0,8 microgramas de MS2 bacteriç> fago RNA como veículo, e extraindo a mistura quatro vezes com uma mistura 1;1 de fenol:clorofórmio (fenol saturado com 0,5^MTris-HCl), pH 7,5, 0,1$ (v/v) d® beta-mercaptoetanol, 0,1$ (peso/v) de hidroxiquinolona, seguindo-se a extracção por duas vezes com clorofórmio, A fase aquosa foi concentrada com 1-butanol antes da precipitação com 2,5 volumes de etanol absoluto durante a noite a -20° C. 0 ácido nucleico foi recuperado por centrifugação num rotor Beckman SW4l a 40.000 rpm durante 90 minutos a 4° C, e dissolvido em água que tinha sido tratada com 0,05$ (v/v) de dietilpirocarbonato e colocado em autoclave.

ácido nucleico obtido pelo procedimento acima ( <2 microgramas) foi desnaturado com 17,5 mM CH^HgOH; o cDNA foi sintetizado utilizando este ácido nucleico desnatura do como padrão, e foi clonado no local EcoRl do fage lainbda86 '3

-gtll utilizando métodos descritos por Huynh (1985), excepto em que os primários ao acaso substituíram oligo(dT) 12-18 durante a síntese da primeira fibra cDNA por transcriptase inver sa (Taylor et al. (1976)). Os cDNAs de fibra dupla resultantes foram fraccionados de acordo com o tamanho sobre uma coluna de

I

Sepharose CL-4B} o material' eluido de tamanho aproximado 400, 300, 200, e 100 pares-base foram colhidos em reservatórios de cDNA 1, 2, 3 e 4, respectivamente. A librária lambda-gtll cDNA foi gerada a partir do cDNA no reservatório 3.

A librária lambda-gtll cDNA gerada a par tir do reservatório 3 foi peneirada para epítopes que se podem ligar especificamente com soro derivado de um paciente que tinha previamente experimentado NANBH. Cerca de 10^ de fages foram p£ neirados com soros de paciente utilizando os métodos de Huynh et al. (1985), excepto em que a ligação de anticorpo humano foi detectada com antisoros Xg anti-humanos de carneiro que 12 Ç tinham sido radio-classifiçados com I. Cinco fages positivos foram identificados e purificados. Os cinco fages positivos foram então testados para especificidade de ligação a soros a partir de 8 seres humanos diferentes previamente infecta dos com o agente NANBH, utilizando o mesmo método. Quatro dos fages codificaram ujn polipéptido quereagiu imunologicamente com apenas um soro humano, isto é, o único que foi utilizado para screening primário da librária de fage, 0 quinto fage (5-1—l) codificou um polipéptido que reagiu imunologicamente com 5 dos 8 dos soros testados. Mais ainda, este polipéptido não rea giu imunologicamente com soros provenientes de 7 dadores de san

----- - gue normais. Portanto, parece que o clone 5-1-1 codifica um polipéptido que é especificamente reconhecido imunologicamen te pelos soros provenientes de pacientes NANB,

IV,A,2, Sequências do HCV cDNA no Fago Recombinante 5-1-1« e do Polipéptido Codificado Dentro da Sequência, cDNA no fago recombinante 5-1-1 foi sequen ciado pelo método de Sanger et al. (1977). Essencialmente, o cDNA foi extirpado com EcoRI, isolado por fraccionamento de dimensão utilizando electroforese de gel. Os fragmentos de res trição de EcoRI foram subclonados nos vectores M13, mpl8 e mpl9 (Messing (1983)) e sequenciados utilizando o método de terminação de cadeia dideoxi de Sanger et al, (1977)). A sequência obtida está representada na Fig. 1.

polipéptido codificado na Pig. 1 que é codificado no HCV cDNA está na mesma estrutura translacional que a metade N-terminal beta-galactosidase na qual está fundida. Como mostrado na Secção IV.A., a estrutura de leitura aberta (ORF) translacional de 5—1—1 codifica epitope(s) especificamen te reconhecido(s) por soros de pacientes e chimpanzés com in— fecções NANBH.

IV,A,3. Isolamento do HCV cDNA que se Sobrepõe a cDNA no Clone 5-1-1

A sobreposição do HCV cDNA ao cDNA no clone foi obtida por screening da mesma libraria lambda—gtll, criada como descrito na Secção XV,A. 1., com um polinu— cleótido sintético derivado da sequência do HCV cDNA em clones 5-1-1, como representado na Fig. 1. A sequência do polinu—

ο cleótido utilizada para screening foi:

5'-TCC CTT GCT CGA TGT ACG GTA AGT GCT GAG

AGC ACT CTT CCA TCT CAT CGA ACT CTC GGT AGA GGA CTT CCC TGT

CAG GT-3'.

A libraria lambda-gtll foi peneirada com esta sonda, utilizando o método descrito em Huynh (1985). Aproximadamente 1 em 50,000 clones hibridaram com a sonda. Três clones que contêm cDNAs que hibridam com a sónda sintética foram numerados 81, 1-2 e 91.

IV.A.4. Sequências de Nucleótido de HCV cDNAs que Sobrepõem a cDNA no Clone 5-1-1.

As sequências de nucleótido dos três cDNAs nos clones 81, 1-2 e 91 foram determinadas essencialmente cjo mo na Secção IV.A.2. As sequências destes clones em relação à sequência HCV cDNA no fago 5-1-1 está representada na Fig. 2, a qual mostra a fibra codificando o epítope HCV detectado, e onde as homologias nas sequências de nucleótido são indicadas pelas linhas verticais entre as sequências.

As sequências dos HCV cDNAs clonados são altamente homólogas nas regiões sobrepostas (ver Fig. 2). Todavia, existem diferenças em duas regiões, 0 nucleótido 67 no clone 1-2 é uma timidina, ao passo que os outros três clones contêm um resíduo de cltidina nesta posição. Deve notar-se, contudo, que o mesmo aminoácido é codificado quando quer C quer T ocupa esta posição.

A segunda diferença naquele clone 5-1-1 con tem 28 pares de base que não estão presentes nos outros três clones. Estes pares de base ocorrem no início da sequência cDNA em 5-1-1» ^e são indicados por letras minúsculas. Com base nos dados do radioimunoensaio, que será discutido mais adiante na Secção IV.D., é possível que um epítope HCV possa ser codificado nesta região 28 bp,

A ausência dos 28 pares de base de 5-1-1 nos clones 81, 1-2 e 91 pode significar que o cDNA nestes clones foi derivados dos genomas HCV defectivosj alternativamente, a região 28 bp poderia ser artefacto terminal no clone 5-1-1«

As sequências de letras minúsculas na sequência de nucleótido dos clones 81 e 91 indicam simplesmente que estas sequências não foram encontradas em outros cDNAs porque os cDNAs que se sobrepõem a estas regiões não foram ainda iso.

lados.

Uma sequência HCV cDNA compósita derivada dos cDNAs que se sobrepõem nos clones 5-1-1, 8l,. 1-2 e 91 está, representa da na Fig. 3. Todavia, nesta figura os únicos 28 pares de base do clone 5-1-1 foram omitidos.A figura mostra também a sequência do.polipéptido codificado dentro da OHF do HCV cDNA compósito ,

IV.A.5. Isolamento dos HCV cDNAs que se sobrepõem ao cDNA

Clone 81.

isolamento das sequências HCV cDNA a montante de, e que se sobrepõem àquelas no clone 81 cDNA foi realizado como segue. A libraria lambda-gtll cDNA prpparada como descrito na Secção IV.A.l. foi peneirada por hibridaçâo com uma sonda de polinucleótido sintético que era homóloga de uma sequência 5’ terminal do clone 81. A sequência do clone 81 está representada na Figura 4. A sequência do polinucleóti- 9’0 do sintético utilizada para ''screening foi:

5’ CTG TCA GGT ATG ATT GCC GGC TTC CCG GAC 3'.

Os métodos foram essencialmente como os descritos em Huynh (1985)» excepto em que aos filtros de libraria foram dadas duas lavagens sob condições rigorosas, isto é, as lavagens em 5 x x SSC, 0,1$ de SDS a 55° C durante 30 minutos cada. Aproximadamente 1 em 50.000 clones hibridaram com a sonda. Um fage recombinante positivo que continha cDNA que hibridizou com a sequência foi isolado e purificado. Este fage foi numerado como clone 36.

As sequências cDNA a jusante, que se sobrepõem às sequências terminais de carboxilo no clone cDNA 81 foram iso ladas utilizando um procedimento semelhante ao utilizado para 0 isolamento das sequências cDNA a montante, excepto em que uma sonda de oligonucleótido sintético foi preparada, a qual é homologa de uma sequência 3’ terminal do clone 81. A sequência do polinucleótido sintético utilizado para screening foi:

5' TTT GGC TAG TGG TTÁ GTG GGC TGG TGA CAG 3'

Um fage recombinante positivo, que continha cDNA que hibridizou com esta última sequência foi isolado e purificado, e foi numerado clone 3²»

IV.A.6. Sequência de nucleótido de HCV cDNA no Clone 36.

A sequência de -nucleótido do cDNA no clone 36 foi determinada essencialmente como descrito na Secção IV.A.2.

A sequência com fibra dupla do cDNA, a sua região de sobreposi^ ção com o HCV cDNA no clone 81, e o polipéptido codificado pela _ 91 _

ORF estão representados na Fig. 5.

A ORF no clone 36 está na mesma estrutura translacional que o antigene HCV codificado no clone 8l. Assim, em combinação, as ORFs nos clones 36 e 81 codificam um polipejj tido que representa parte de um grande antigene HCV. A sequência deste polipéptido HCV putativo e a sequência DNA com fibra dupla codificando a mesma, que e derivada das ORFs combinadas dos HCV cDNAs dos clones 36 e 81, como está representado na Fig. 6.

IV,A.7 Sequências de nucleótido de HCV cDNA no Clone 32

A sequência de nucleótido do cDNA no clone 32 foi determinada essencialmente como foi a descrita na Secção IV.A.2 para a sequencia do clone 5-1-1, Os dados de sequência indicaram que o cDNA no clone 32 de fage recombinante foi deri vado de duas fontes diferentes. Um fragmento do cDNA era composto por 418 nucleótidos derivados do genoma HCV; o outro fra£ mento era composto por 172 nucleótidos derivados do genoma bacteriofago MS2, que tinha sido utilizado como veículo durante a preparação da libraria cDNA de plasma lambda-gtll.

A sequência do cDNA no clone 3² correspondendo à do genoma HCV está representada na Fig, 7. A região das sequências que se sobrepõem às do clone 81, e o polipéptido codificado pela ORF são também indicados na figura. Esta sequência contem uma ORF contínua que está na mesma estrutura translacional que o antigene HCV codificado pelo clone 81,

IV,A,8 Isolamento do HCV cDNA que se Sobrepõe a cDNA no Clone

2á isolamento das sequências HCV cDNA a montan

- 92 te de, e que se sobrepõem às do clone 36 cDNA foi realizado como descrito na Secção IV,A.5, para aquelas que se sobrepõem ao clone 81 cDNA, excepto em que o polinucleótido sintético foi baseado na região 5’ do clone 36· A sequência do polinucleótido sintético utilizado para o screening foi:

5' AAG CCA CCG TGT GCG CTA GGG CTC AAGCCC 3’

Aproximadamente 1 em 50.000 clonas hibridaram com a sonda. 0 clone purificado, isolado, do fage recombinante que continha cDNA que hibridou para esta sequência foi designado clone 35·

IV.A.9 Sequencia de Nucleótido de HCV cDNA no Clone 35

A sequência de nucleótido do cDNA no clone 35 foi determinada essencialmente como descrito na Secção IV.A.2.

A sequência, a sua região de sobreposição com a do cDNA no clo_ ne 36, e o polipéptido putativo codificado na mesma, estão representados na Fig, 8.

clone 35 contém aparentemente uma ORF sim- ’ pies, contínua, que codifica um polipéptido na mesma estrutura translacional que a codificada pelo clone 36, clone 8l, e clone 32, À Fig. 9 mostra a sequência do comprimento contínuo da ORF que se prolonga através dos clones 35» 36, 81 e 32, juntamente com o polipéptido HCV putativo codificado nos mesmos, Es ta sequência combinada foi confirmada utilizando outros clones cDNA independentes derivados da mesma libraria cDNA lambda-gtll,

IV.A,10. Isolamento do HCV cDNA que se Sobrepõe a cDNA no Clo0 isolamento das sequências HCV cDNA a montan te de, e que se sobrepõem às do clone 35 cDNA foi realizado c£

- 93 mo descrito na Secção IV.A.8, para aquelas que se sobrepõem ao clone 36 cDNA, excepto em què o polinucleotido sintético era baseado na região 5’ do clone 35. A sequência do polinucle tido sintético utilizada para o screening foi:

5' CAG GAT GCT GTC TCC CGC ACT CAA CGT 3'

Aproximadamente 1 em 50.000 clones hibridaram com a sonda. 0 clone isolado, purificado, do fago recombinante que continha cDNA que hibridou para esta sequência foi designado clone 37h.

IV,A.11. Sequência de Nucleótido de HCV no Clone 37b

A sequência de nucleótido do cDNA no clone 37b foi determinada essencialmente como descrito na Secção IV.A.2. A sequência, a sua região de sobreposição com a do cDNA no clone 35, e o polipéptido putativo codificado no mesmo, estão representados na'Fig, 10.

nucleótido 5’-terminal do clone 35 θ um T, ao passo que o nucleótido correspondente no clone 37b é um A. Os cDNAs provenientes de três outros clones independentes que foram isolados durante o procedimento em que o clone 37b foi isolado, descrito na Secção IV.A.10, foram também sequenciados. Os cDNAs provenientes destes clones contêm também um A nesta posição. Assim, o 5’-terminal T no clone 35 pode ser um artefacto do procedimento de clonação. É sabido que os artefa£ tos muitas vezes se levantam nos 5’-terminais das moléculas de cDNA.

clone 37b contem aparentemente uma ORF con tínua que codifica um polipéptido que é uma continuação do po94 lipéptido codificado na ORF que se estende através dos clones 35, 36, 81 e 32 que se sobrepõem.

IV.A.12 Isolamento do HCV cDNA que se Sobrepõe a cDNA no Cl£ ne 22 isolamento das sequências HCV cDNA a jusan te do clone 32 foi realizado como segue. Primeiro, o clone cia foi isolado utilizando uma sonda de hibridaçao sintética que foi baseada na sequencia de nucleótido da sequência HCV cDNA , » no clone 32. 0 método foi essencialmente aquele descrito na Secção IV.A.5» excepto em que a sequencia da sonda sintética foií

5· AGT GCA GTG GAT GAA CCG GCT GAT AGC CTT 3'.

Utilizando a sequência de nucleótido proveniente do clone cia, outro nucleótido sintético foi sintetizado, o qual tinha a sjb quência:

5’ TCC TGA GGC GAC TGC ACC AGT GGA TAA GCT 3’.

screening da libraria lambda-gtll utilizando a sequência derivada do clone cia como sonda produziu aproximadamente 1 em 50·00θ colónias positivas. Um clone isolado, purificado, que hibridou com esta sonda foi designado clone 33b.

IV.A.13 Sequência de Nucleótido de HCV cDNA no Clone 33b

A sequência de nucleótido do cDNA no clone 33b foi determinada essencialmente como descrito na Secção XV.A.2. A sequ,ência, a sua região de sobreposição com a do cDNA no clone 32, e o polipêptido putativo codificado na mes ma, estão representados na Fig, 11, clone 33b contém aparentemente uma ORF con tínua que é uma extensão das ORFs nos clones 37b, 35» 3^, 81 e 32 que se sobrepõem, 0 polipéptido codificado no clone 33b está na mesma estrutura translacional que 0 codificado na ORF prolongada destes clones que se sobrepõem,

IV. A. 14 Isolamento dos HCV cDNAs que se Sobrepõem ao Clone cDNA 37b e ao cDNA no clone 33b

A fim de isolar os HCV cDNAs que se sobrepõem aos cDNAs no clone 37b e no clone 33b, as seguintes sondas de oligonucleótido sintéticas, que derivaram dos cDNAs naqueles clones, foram utilizadas para peneirar a libraria lambda-gtll, utilizando essencialmente o método descrito na Secção IV,A,3. As sondas utilizadas foram;

5' CAG GAT GCT GTC TCC CGC ACT CAA CGT C 3’ e

5' TCC TGA GGC GAC TGC ACC AGT GGA TAA GCT 3' para detectar colónias contendo sequências HCV cDNA que se s£ brepõem às dos clones 37b e 33t>» respectivamente. Aproximadamente 1 em 50.000 colónias foram detectadas em cada sonda. Um clone que continha cDNA que estava a montante de, e que se S£ brepunha ao cDNA no clone 37b, foi designado clone 40b. Um clone que continha cDNA que estava a jusante de, e que se sobrepunha ao cDNA no clone 33b foi designado clone 25c.

IV,A,15 Sequências de Nucleótido de HCV cDNA no clone 40b e no clone 25c

As sequências de nucleótido dos cDNAs no cio.

ne 40b e no clone 25c foram determinadas essencialmente como descrito na Secção IV.A,2, As sequências de 40b e 25c, as suas regiões de sobreposição com os cDNAs nos clones 37b e 33b, e os polipéptidos putativos codificados nas mesmas, estão representados na Fig. 12 (clone 40b) e na Fig. 13 (clone 25c).

nucleotido 5’-terminal do clone 40b é um G. Todavia, os cDNAs provenientes de outros cinco clones indjs pendentes que foram isolados durante o processo em que o clone 40b foi isolado, descritos na Secção IV.A.14, foram também sequenciados, Os cDNAs provenientes destes clones contem também um T na sua posição. Assim, o G pode representar um artefacto de clonação (ver a discussão na Secção IV.A.ll).

5’-terminus do clone 25c é ACT, mas a sequência desta região no clone cia (sequência não representada) e no clone 33b é TCA. Esta diferença pode também representar um artefacto de clonação, como podem ser os nucleotidos 28 ex tra 5’-terminal no clone 5*1-1.

Os clones 40b e 25c contêm cada um, aparente mente, uma ORF que é uma extensão .da ORF contínua nos clones previamente sequenciados. A sequência de nucleotido da ORF que se estende através dos clones 4-Ob, 37b, 35, 36, 8l, 32, 33b e 25c, e a sequência de aminoácido do polipéptido putativo codi-. ficado na mesma, estão representadas na Fig, 14. Na figura, os artefactos potenciais foram omitidos na sequência, e em vez de les, as correspondentes sequências nas regiões não-5'-terminal de clones múltiplos de sobreposição estão representadas.

- 97 IV.A.ló. Preparação de um HCV cDNA Compósito a partir de cDNAs nos Clones 36, 81 e 32

HCV cDNA. compósito, C100, foi construído co- ’ mo segue. Primeiramente os cDNAs provenientes dos clones 36, e 32 foram extirpados com EcoRI, 0 fragmento EcoRI do cDNA proveniente de cada clone foi clonado individualmente no local EcoRI do vector pGEM3-azul (Promega Biotec). Os vectores recom binantes resultantes que continham os cDNAs provenientes dos clones 36, 81 e 32 foram designados pGEM3-azul/3ó, pGEM3-azul/ /81 e pGEM3-azul/32, respectivamente. 0 recombinante apropriada mente orientado de pGEM3-azul/8l foi macerado com Nael e NarI, e o fragmento grande (~2850 bp) foi purificado e ligado com o fragmento pequeno (~57O bp) Nael/NarI de restrição purificado a partir de pGEM3-azul/36. Este compósito dos cDNAs provenientes dos clones 36 e 81 foi utilizado para gerar outro vector pGEM3-azul contendo a ORF HCV contínua contida dentro do cDNA que se sobrepõe dentro destes clones. Este novo plasniídeo foi então macerado com PvuII e EcoRI para libertar um fragmento de aproximadamente 680bp, que foi então ligado com o fragmento pequeno (580bp) Pvuli/EcoRI isolado do plasmídeo, apropriadamente orientado pGEM3-azul/32, e o cDNA compósito proveniente dos cl£ nes 36* 81 e 32 foi ligado ao vector pSODc 1 linearizado EcoRI, que é descrito na secção IV.B.l, e que foi utilizado para expressar o clone 5-1-1 em bactérias. Os recombinantes contendo o fragmento ~127O bp EcoRI do HCV cDNA (ClOO) compósito foram seleccionados e o cDNA proveniente dos plasmídeos foi extirpado com EcoRI e purificado.

— 98— cDNAs

IV.A.17. Isolamento e Sequências de Nucleotido dos HCV nos Clones l4i, 11b, 7f, 7®, 8h, 33c, l4c, 8f, 33f,

Os HCV cDNAs nos clones l4i, 11b, 7f, 7®, 8b, 33c, 14c, 8f, 33f, 33g ® 39c foram isolados pela técnica de isolar fragmentos cDNA que se sobrepõem a partir da libraria lambda-gtll dos HCV cDNAs descritos na Secção IV.A.1. A tecni ca utilizada foi essencialmente como a descrita na Secção IV.A.3·, excepto em que as,sondas utilizadas foram concebidas a partir da sequência de nucleotido dos últimos clones isolados a partir do final 5' ® 3’ das sequências HCV combinadas. A frequência de clones que hibridaram com as sondas descritas mais adiante foi de aproximadamente 1 em 5θ·θθθ em cada caso.

As sequências de nucleotido dos HCV cDNAs nos clones l4i, 8h, 33c, l4c, 8f, 33f, 33g β 39c foram determinadas essencialmente como descrito na Secção IV.A.2., excepto em que o cDNA extirpado proveniente destes fages foi substituído pelo cDNA isolado do clone 5-1-1.

clone 33c foi isolado utilizando uma sonda de hibridação baseada na sequência de nucleotidos no clone 40b. A sequência de nucleotido do,clone 40b é apresentada na Fig. 12. A sequência de nucleotido da sonda utilizada para is£ lar 33c foií

5' ATC AGG ACC GGG GTG AGA ACA ATT ACC ACT 3'

A sequência do HCV cDNA no clone 33c, e a sobreposição com aquela no clone 4-Ob, está representada na Fig. 15, que também mostra os aminoácidos codificados na mesma.

clone 8h foi isolado utilizando uma sonda com base na sequência de nucleótidos no clone 33c, A sequência de nucleótidos da sonda foi

5' AGA GAC AAC CAT GAG GTC CCC GGT GTT C 3'

A sequência do HCV cDNA no clone 8h, e a sobreposição com aquela no clone 33c, e os aminoácidos codificados na mesma estão representados na Fig, l6, clone 7® foi isolado utilizando uma sonda baseada sobre a sequência de nucleótidos no clone 8h, A sequência de nucleótido da sonda foi

5’ TCG GAC CTT TAC CTG GTC ACG AGG CAC 3'.

A sequência do HCV cDNA no clone 7®» a sobreposição com o clone 8h, e os aminoácidos codificados na mesma, estão representados na Fig. 17.

clone l4c foi isolado com uma sonda baseada na sequência de nucleótidos no clone 25®. A sequência do clone 25c

I está representada na Fig. 13. A sonda no isolamento do clone l4c tinha a sequência

5· ACC TTC CCC ATT AAT GCC TAC ACC ACG GGC 3’.

A sequência do HCV cDNA no clone l4c, a sua sobreposição com a do clone 25c, e os aminoácidos codificados na mesma estão representados na Fig. 18.

clone 8f foi isolado utilizando uma sonda baseada na sequência de nucleótidos no clone l4c. A sequência de nucleótido da sonda foi

5· TCC ATC TCT CAA GGC AAC TTG CAC CGC TAA 3'.

A sequência do HCV cDNA no clone 8f, a sua sobreposição com a do clone l4c, e os aminoácidos codificados na mesma estão represen tados na Figura 19.

clone 33f foi isolado utilizando uma sonda ba seada na sequência de nucleotido presente no clone 8f, A sequência de nucleotido da sonda foi

5' TCC ATG GCT GTC CGC TTC CAC CTC CAA AGT 3'.

A sequência do HCV cDNA no clone 33f, a sua sobreposição com a do clone 8f, e os aminoácidos codificados na mesma estão repre sentados na Fig. 20.

clone 33 g foi isolado utilizando uma sonda baseada na sequência de nucleótidos no clone 33f. A sequência de nucleotido da sonda foi

5’ GCG ACA ATA-CGA CAA CAT CCT CTG AGC CCG 3’.

A sequência do HCV cDNA no clone 33g, a sua sobreposição com a do clone 33f, e os aminoácidos codificados na mesma estão representados na Fig. 21, clone 7f foi isolado utilizando uma sonda com base na sequência de nucleótidos no clone 7®· A sequência de nucleotido da sonda foi

5' AGC AGA CAA GGG GCC TCC TAG GGT GCA TAA T 3'.

A sequência do HCV cDNA no clone 7f, a sua sobreposição com o clone 7®, e os aminoácidos codificados na mesma estão represen tados na Fig. 22, clone 11b foi isolado utilizando uma sonda ba seada na sequência do clone 7f· A sequência de nucleotido da sonda foi

5' CAC CTA TGT TTA TAA CCA TCT fíAG TCC TCT 3'.

A sequência do HCV cDNA no clone 11b, a sua sobreposição com o

1Q1 clone 7f, e os aminoácidos codificados na mesma estão represen tados na Fig, 23, clone l4i foi isolado utilizando uma sonda ba seada na sequência de nucleotidos no clone 11b. A sequência de nucleótido da sonda foi

5' CTC TGT CAC CAT ATT ACA AGC GCT ATA TCA 3'.

A sequência do HCV cDNA no clone l4i, a sua sobreposição com o clone 11b, e os aminoácidos codificados na mesma estão representados na Fig. 24.

clone 39c foi isolado utilizando uma sonda ba seada na sequência de nucleotidos no clone 33g. A sequência de nucleótido da sonda foi

5' CTC GTT GCT ACG TCA CCA CAA TTT GGT GTA 3'.

A sequência do HCV cDNA no clone 39°, a sua sobreposição com o clone 33g, e os aminoácidos codificados na mesma estão representados na Fig, 25.

IV, A, 18. A sequência de HCV cDNA Compósita Derivada dos Clones

Isolados Contendo HCV cDNA

As sequências HCV cDNA nos clones isolados acima descritas foram alinhadas para criar uma sequência HCV cDNA com pósita. Os clones isolados, alinhados na direcção 5' a 3' são: l4i, 7f, 7e, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 81, 32, 33b, 25c, l4c, 8f, 33f, 33g, e 39c.

Uma sequência HCV cDNA compósita derivada dos clones isolados, e os aminoácidos codificados na mesma, estão representados na Fig. 26.

Criando a sequência compósita, as seguintes heterogeneidades de sequência foram consideradas. 0 clone 33c con tem um HCV cDNA de 800 pares de base, que se sobrepõe aos cDNAs nos clones 40b e 37c. No clone 33c, assim como em 5 outros clones que se sobrepõem, o nucleotido ^j= 7θ9 ® um G, Toda via, no clone 37b (ver Secção IV.A.ii), o nucleotido correspondente é um A. Esta diferença de sequência cria uma heterogeneidade aparente nos aminoácidos codificados na mesma, que poderia ser quer CYS quer TYR, para G ou A, respectivamente. Esta heterogeneidade pode ter ramificações importantes em ter mos de dobragem de proteína.

resíduo de nucleotido 2 no clone 8h HCV cDNA é um T. Todavia, como está representado mais adiante, o resíduo correspondente no clone 7® ® um A; alem disso, um A nesta posição é também encontrado em 3 outros clones Isolados que se sobrepõem. Assim, o resíduo T no clone 8h pode represen tar um artefacto de clonação. Portanto, na Fig. 26, o resíduo nesta posição é designado como um A, nucleotido 3'-terminal no clone 8f HCV cDNA é um G, Todavia, o resíduo correspondente no clone 33f, θ em dois outros clones que se sobrepõem é um T. Portanto, na Fig, 26, o resíduo nesta posição é designado como um T.

A sequência 3'-terminal no clone 33f HCV cDNA á TTGC. Todavia, a sequência correspondente no clone 33g e em 2 outros clones que se sobrepõem é ATTC. Portanto, na Fig.26, a região correspondente e representada como ATTC.

resíduo de nucleotido# 4 no clone 33g HCV cDNA é um T. Todavia, no clone 33f e em 2 outros clones que se sobrepõem ao resíduo correspondente é um A. Portanto, na Fig.26, o resíduo correspondente é designado como um A.

3'-terminal do clone l4i é um AA, ao passo

- X03 que o dinucleótido correspondente no clone 11b, e em três outros clones, é TA. Portanto, na Fig. 26, está desenhado o resíduo TA.

A resolução de outras heterogeneidades de sequência é discutida acima.

Um exame do HCV cDNA compósito indica que o mes· mo contém uma ORF grande . Isto sugere que o genorna virai é tran£ ladado num grande polipéptido que é processado concomitantemen te com, ou subsequentemente à translação.

IV.A.19. Isolamento e Sequências de Nucleótido dos HCV cDNAs nos Clones 12f, 35f, 19ff, 26g e 15θ

Os HCV cDNAs nos clones 12f, 35f, 19g, 26g e 15θ foram isolados essencialmente pela' técnica descrita na Secção IV.A.17, excepto em que as'sondas foram como se indica mais adiante. A frequência de clones que hibridaram com as sondas foi de aproximadamente 1 em 50,000 em cada caso. As sequências de nucleótido dos HCV cDNAs nestes clones foram determinadas essencialmente como se descreveu na Secção IV,A.2., excepto em que o cDNA proveniente dos clones indicados foi substituído pelo cDNA isolado a partir do clone 5-1-1.

isolamento do clone 12f, que contém cDNA a montante do HCV cDNA na Fig. 26, foi realizado utilizando uma sonda de hibridação baseada na sequência de nucleotidos no clone l4i. A sequência de nucleótido da sonda foi

5’ TGC TTG TGG ATG ATG CTA CTC ATA TCC CAA 3'.

A sequência HCV cDNA do clone 12f, a sua sobreposição com o clone l4i, e os aminoácidos codificados na mesma estão representados na Fig. 27.

104 isolamento do clone 35f, que contém cDNA a ju sante do HCV cDNA na Fig. 26, foi realizado utilizando uma sonda de hibridação baseada na sequência de nucleótidos no cl<3 ne 39c. A sequência de nucleótido da sonda foi

5’ AGC AGC GGC GTC AAA AGT GAA GGC TAA CTT 3'.

A sequência do clone 35f, a sua sobreposição com a sequência no clone 39c, e os aminoácidos codificados na mesma estão representados na Fig. 28.

isolamento do clone 19g foi realizado utilizando uma sonda de hibridação baseada na sequência 3' do clone 35f. A sequência de nucleótido da sonda foi

5' TTC TCG TAT GAT ACC CGC TGC TTT GAC TCC 3'.

A sequência HCV cDNA do clone 19g, a sua sobreposição com a sequência no clone 35f, ® os aminoácidos codificados na mesma estão representados na Fig. 29.

isolamento do clone 26g foi realizado utilizando uma sonda de hibridação baseada na sequência 3' do clone 19g. A sequência de nucleótido da sonda foi

5' TGT GTG GCG ACG ACT TAG TCG TTA TCT GTG 3'.

A sequência HCV cDNA do clone 26g, a sua sobreposição com a sequência no clone 19g, θ os aminoácidos codificados na mesma estão representados na Fig. 30.

clone 15θ foi isolado utilizando uma sonda de hibridação baseada na sequência 3* do clone 26g. A sequência de nucleótido da sonda foi

5' CAC ACT CCA GTC AAT TCC TGG CTA GGC AAC 3'

A sequência do HCV cDNA do clone 15θ, a sua sobreposição com

- 105 a sequência no clone 26g, e os aminoácidos codificados na mesma estão representados na Fig. 31.

Os clones descritos nesta Secção foram depositados na ATCC sob os termos e condições descritos na Secção II.A., e foram designados com os seguintes Números de Acessão.

lambda-gtll	No. ATCC	Data de Depósito
clone 12f	40514	10 de Novembro de 1988
clone 35f	40515	tf
clone 15e	40513	ff
clone K9-1	40512	fl

As sequências HCV cDNA nos clones isolados descritos acima, foram alinhadas para criar uma sequência HCV cDNA compósita. Os clones isolados, alinhados na direcção 5' para 3' são: 12f, l4i, ?f, 7θ, 8h, 33c, 40b, 37b, 35, 36, 8l, 32, 33b, 25c, l4c, 8f, 33f, 33g, 39c, 35f, 19g, 26g, e 15e.

Uma sequência HCV.cDNA compósita derivada dos clones isolados, e os aminoácidos codificados na mesma, estão representados na Fig, 32.

IV.A.20. Método Alternativo de Isolamento de Sequências cDNA a Montante da Sequência HCV cDNA no Clone 12f

Com base na maior parte da sequência HCV 5' na Fig. 32, que é derivado do HCV cDNA no clone 12f, pequenos primários de oligonucleÔtido sintético de transcriptase inversa são sintetizados e utilizados para se ligar à sequência cor respondente HCV RNA genómico, para a transcrição inversa prima ria das sequências a montante. As sequências primárias estão próximas da sequência 5’-terminal conhecida do clone 12f,mas suficientemente a jusante para permitir o desenho das sequências “106 υ

ο da sonda a montante das sequências primárias. São utilizados métodos padrão de carga e clonação. As librárias cDNA resultantes são peneiradas com sequências a montante dos locais de carga (como deduzido a partir da sequência elucidada no clone 12f). 0 HCV RNA genómico é obtido a partir quer de plasma quer de amostra de fígado de chimpanzés com NANBH, ou de amostras análogas de humanos com NANBH.

IV.A.21 Método Alternativo Utilizando Formador de Cauda para Isolar Sequências a partir da Região 5'-Terminal do

Genoma HCV

A fim de isolar as sequências extremas de 5'- terminal do genoma HCV RNA, o produto cDNA da primeira ron da de transcrição inversa, que é duplexado com o RNA padrão, é dotado de cauda com o oligo C. Isto é realizado incubando o produto com transferase terminal na presença de CTP. A s£ gunda ronda da síntese de cDNÁ, que proporciona o complemen to da primeira fibra de cDNA, é realizada utilizando oligo G como um primário para a reacção de transcriptase inversa.

As fontes do HCV RNA genómico são como as descritas na Secção IV,A,20. Os métodos para formar cauda com a transferase terminal, e para as reacções de transcriptase inversa são como indicados em Maniatis et al. (1982). Os produtos cDNA são então cionados, peneirados, e sequenciados,

IV.A.22, Método Alternativo Utilizando a Formação de Cauda para Isolar Sequências da Região 3'-Terminal do Genoma HCV

Este método é baseado nos métodos anteriormente utilizados para clonar cDNAs de Flavivirus RNA, Neste mé

107 ~

todo, o RNA é submetido a condições de desnaturação para r£ mover estruturas secundárias no 3’-terminus, e é então dota do com cauda com polimerase Poli A utilizando rATP como um substrato. A transcrição inversa do RNA dotado com cauda P£ li A é catalizada por transcriptase inversa, utilizando oli. go dT como um primário. As segundas fibras de cDNA são sintetizadas, os produtos de cDNA são cionados, peneirados, e sequenciados.

, IV,A.23 Criação de Librarias Lambda-gtll HCV cDNA Contendo

Maiores Suplementos cDNA >

método para criar e peneirar as librarias Lambda-gtll é essencialmente como descrito na Secção IV.A.1., excepto em que a libraria é gerada a partir de uma colheita de cDNA de tamanho maior eluida a partir da coluna Sepharose CL-4B.

IV,A.24 Criação de Librarias HCV cDNA Utilizando Oligómeros Sintéticos como Primários

I Novas librarias HCV cDNA Utilizando Oligómeros foram preparadas a partir de RNA derivado de colheita de pias; ma de chimpanzé infeccioso descrito na Secção IV,A,1., e a partir da fracção poli A⁺ RNA derivada do fígado deste animal infectado. 0 cDNA foi construído essencialmente como descrito por Gubler e Hoffman (1983), excepto em que os primários para a primeira síntese de fibra cDNA foram dois oligómeros sintéti. cos baseados na sequência do genoma HCV descrito acima. Os primários baseados na sequência do clone 11 b e 7e foram, res pectivamente,

108 5' CTG GCT TGA AGA ATC 3' e

5' AGT TAG GCT GGT GAT TAT GC 3’

Os cDNAs resultantes foram cionados em vectores de bacteric) fago lambda,’e peneirados com vários outros oligómeros sintáticos, cujas sequências foram baseadas na sequência HCV na Fig. 32.

IV. B, Expressão de Polipéptidos Codificados Dentro dos HCV cDNAs e Identificação dos Produtos Expressos como

Antigenes induzidos, por HCV.

IV.B.1. Expressão do Polipéptido Codificado no Clohe 5-1-1.

polipéptido HCV codificado dentro do clone 5-1-1 (ver Secção IV,A.2«, acima) foi expresso como um polipéptido de fusão com dismutase de superóxido (SOD). Isto foi realizado sub-clonando o suplemento do clone 5-1-1 cDNA no vector de expressão pSODcfl (Steimer et al. (1986)) como segue.

Primeiro, o DNA isolado a partir de pSODcfl foi tratado com BamHI e EcoRI, e os seguintes ligantes foram ligados dentro do DNA linear criado pelos enzimas de restrição:

5’ GAT CCT GGA ATT CTG ATA A 3'

3' GA CCT TAA GAC TAT TTT AA 5'

Depois da clonação, o plasmideo contendo o suplemento foi isolado.

plasmíde.o contendo o suplemento foi restrin109 'tl gido com EcoRI. 0 suplemento HCV cDNA no clone 5-1-1 foi ex tirpado com EcoRI, e ligado dentro deste EcoRI DNA plasmídéo linearizado. A mistura DNA foi utilizada para transformar a estirpe D1210 de E. coli (Sadler et al. (1980)). Os r£ combinantes com o 5-1-1 cDNA na orientação correcta para a expressão da ORF representada na Fig. 1 foram identificados por mapeamento de restrição e sequenciamento do nucleótido.

As bactérias recombinantes provenientes do cl<> ne foram induzidas para expressar 0 polipéptido SOD-NANB^^! por germinação das bactérias na presença de IPTG,

IV.B.2. Expressão do Polipéptido Codificado no Clone 8l

HCV cDNA contido dentro do clone 81 foi exI presso como um polipéptido de fusão SOD-ΝΑΝΒθ^. 0 método para a preparação do vector codificando este polipéptido de fu são foi análogo ao utilizado para a criação do vector codifi cando SOD-NANB^ excepto em que a fonte do HCV cDNA foi o clone 8l, o qual foi isolado como descrito na Secção IV.A.3, e para o qual a sequência cDNA foi determinada como descrito^!na Secção IV.A,4. A sequência de nucleétido do HCV cDNA no clone 81, e a sequência de aminoácido putativa do polipéptido codificada na mesma estão representadas na Fig. 4.

suplemento HCV cDNA no clone 81 foi extirpado com EcoRI, e ligado dentro do pSODcfl que continha o ligador (ver IV.B.l.) e que foi linearizado por tratamento com EcoRI.

A mistura DNA foi utilizada para transformar a estirpe D1210 de E, coli. Os recombinantes como clone 8l HCV cDNA na orien

110

tação correcta para expressão da ORF representada na Fig. 4 foram identificados por delineamento de restrição e sequenciamento de nucleótido.

As bactérias recombinantes provenientes de um clone foram induzidas para expressar o polipéptido SOD-NANBg^ germinando as bactérias na presença de IPTG.

IV,B.3. Identificação do Polipéptido Codificado Dentro do

Clone 5-1-1 como um HCV e Antigene NANBH Associado.

polipéptido codificado dentro do HCV cDNA do clone 5-1-1 foi identificado como um antigene NANBH associado demonstrando que os soros de chimpanzés e seres humanos infectados com NANBH reagiram imunologicamente com o polipéjj tido de fusão, SOD-NANB^· ₁ que é constituído por dismutase de superóxido no seu N-terminus e no antigene 5-1-1 em es trutura no seu C-terminus. Isto foi realizado por formação de manchas Ocidentais (Towbin et al. (1979)) como segue.

Uma estirpe recombinante de bactérias transformadas com um vector de expressão codificando o polipéptido SOD-NANB^ descrita na Secção IV.B.I., foi induzida para expressar o polipéptido de fusão por germinação na presença do IPTG. 0 lisolado bacteriano total foi submetido a electrjq forese através de geles de poliacrilamida na presença de SDS de acordo com Laemmli (l97O)· Os polipéptidos separados foram transferidos sobre filtros de nitrocelulose (Towbin et al. (1979)). Os filtros foram então cortados em tiras finas, e as tiras foram incubadas individualmente com os diferentes soros de chimpanzés e de seres humanos. Anticorpos limite fo.

111 à

5 ram detectados por posterior incubação com I-Ig anti-humano de carneiro classificado, como descrito na Secção IV,A,1.

A caracterização dos soros de chimpanzés utilizados para as manchas Ocidentais e os resultados, mostrados na fotografia das tiras autoradiografadas, estão presentes na Fig. 33. As tiras de nitrocelulose contendo polipéptidos foram incubadas com soros derivados de chimpanzés em momentos diferentes durante as infecções agudas de NANBH (estirpe Hutchinson) (passagens l-ló), infecções de hepatite A (passagens 17-24 e 26-33) θ infecções de hepatite B (passagens

As passagens 25 e 45 mostram controloes positivos em que as imuno-manchas foram incubadas com soro proveniente do paciente utilizado para identificar o clone recombinante

5-1-1 no screening original da libraria lambda-gtll cDNA (ver Secção IV.A.l.).

A banda visível nas passagens de controle, 25 e 45» na Fig, 23 reflecte a ligação dos anticorpos à metade NANBH^ 1 1 d° polipéptido de fusão SOD. Estes anticorpos não exibem ligação a SOD isolada, visto que este foi também incluído como um controle negativo nestas amostras, e teria aparecido como uma banda migrando significativamente mais rapidamente que o polipéptido de fusão SOD-NANB^

As passagens l-l6 da Fig, 33 mostra a ligação dos anticorpos nas amostras de soros de 4 chimpanzés; os S£ ros foram obtidos precisamente antes da infecçao com NANBH, e sequencialmente durante a infecçao aguda. Como se vê na fi gura, considerando que os anticorpos que reagiram imunológica

112

mente com o polipéptido SOD-NANB _ _Ί . estavam ausentes nas 5 - .1 -1 amostras de soro obtidas antes da administração de inóculo HCV infeccioso e durante a fase aguda anterior da infecção, todos os 4 animais induziram eventuaimente anticorpos de circulação para este polipéptido durante a última parte de, ou a seguir à fase aguda. Fitas adicionais observadas nas imuno-manchas nos casos <4os chimpanzés números 3 e 4 foram devidas à ligação de experiência a proteínas de bactérias hospedeiras.

Em contraste com os resultados obtidos com soros provenientes de chimpanzés infectados com NANBH, o desen volvimento dos anticorpos para a metade NANB^ do polipóp tido de fusão não foi observado em 4 chimpanzés infectados com HAV ou 3 chimpanzés infectados com HBV. A única ligação nestes casos foi a ligação de experiência a estas proteínas de bactérias hospedeiras, a qual também ocorreu nas amostras infectadas com HCV.

A caracterização dos soros humanos utilizados para as manchas Ocidentais, e os, resultados, que estão repr£ sentados na fotografia das tiras autoradiografadas, são apre? sentados na Fig. 3^. Tiras de nitrocelulose contendo polipéja tidos foram incubadas com soros derivados de seres humanos em diferentes momentos durante as infecções com NANBH (passagens 1-21),, HAV (passagens 33-^0) θ HBV (passagens 41-49). As passagens 25 e 5θ mostram controles positivos em que as imuno-manchas foram incubadas com soro proveniente do pacien te utilizado no screening original da libraria lambda113

-gtll, acima descrita. As passagens 22-24 e 26-32 mostram controles não infectados em que os soros eram provenientes de dadores de sangue normais.

Como se vê na Fig, 3^» os soros provenientes de nove pacientes com NANBH, incluindo o soro utilizado para o screening da libraria lambda-gtll, continha anticorpos para a metade NANB^ do polipéptido de fusão. Soros provenientes de três pacientes com NANBH não contêm estes anti^ corpos. É possível que os anticorpos anti-NANB_ , , se desen

5-1-1 — volverão numa data futura nestes pacientes. É também possível que esta falta de reacção tenha resultado de um diferente agente NANBV que é causador da doença nos indivíduos a partir dos quais o soro que não responde foi colhido.

A Fig. 3^ mostra que os soros provenientes de muitos pacientes infectados com HAV e HBV não contêm anticorpos anti-NANB^ χ ^e H^ue estes anticorpos também não ejs tavam presentes nos soros provenientes de controles normais Embora um paciente com HAV (passagem 36) pareça conter anticorpos anti-NANB^ χ χ» ® possível que este paciente tenha sji do previamente infectado com HCV, visto que a incidência de NANBH é muito elevada e visto que é muitas vezes sub-clínica.

Estes estudos serologicos indicam que o cDNA no clone 5-1-1 codifica epítopes que .são reconhecidos especificamente por soros provenientes de pacientes e animais infectados com BB-NANBV. Além disso, o cDNA não parece ser deriva do do genoma primário. Uma sonda.de hibridação feita a par tir do clone 5-1-1 ou a partir do clone 81 não hibridou as manchas Sul de controle genémico DNA de seres humanos e chimpanzés a partir de indivíduos não infectados sob condições onde genes únicos, de cópia-única são detectáveis. Estas sondas também não hibridam as manchas Sul do genómico DNA de bovino, de controle.

IV,B,4. Expressão do Polipéptido Codificado num Compósito dos HCV cDNAs nos Clones 36, 81 e 32 polipéptido HCV que é codificado na ORE que se estende através dos clones 36, 81 e 32 foi expresso como um polipéptido de fusão com SOD. Isto foi realizado por inser çao do compósito cDNA, C 100, numa cassete de expressão que contém 0 gene de dismutase de superóxido humano, inserindo a cassete de expressão num vector de expressão de levedura, e expressando o polipéptido em levedura.

Uma cassete de expressão contendo 0 C100 cDNA com pó sito derivado dos clones 36, 8l e 32, foi construída por inserção do fragmento ~1270bp EcoRI no local EcoRI do vector pS3-5Ó (também denominado pS35ú), proporcionando o plasmideo pS3-5Úg^QQ. A construção de C100 está descrita na Secção IV.A,l6, acima.

O vector pS3-5Ú, que é um derivado pBR322, con tém uma cassete de expressão que é constituída pelo promotor de levedura híbrido ADH2/GAPDH a montante do gene de dismutase de superóxido humano, e um finalizador de transcrição GAPDH a jusante. Uma cassete semelhante, que contém estes el£ mentos de controle e o gene de dismutase de superóxido foram descritos em Cousens et al. (1987), e no pedido EPO 196.056

115 co-pendente, publicado em 1 de Outubro de 1986, que é comumente propriedade da cessionária do presente pedido de pa. tente. A cassete em pS3-5ú, contudo, difere da de Cousens et al. (1987) pelo facto de o gene de proinsulina heterólogo e a articulação de imunoglobulina serem retirados, e pelo facto de o gln^^^j. da dismutase de superóxido ser seguido por uma sequência de adaptador que contém um local EcoRI. A sequência do adaptador é

5’-AAT TTG GGA ATT CCA TAA TGA G -3'

AC CCT TAA GGT ATT ACT CAG CT local EcoRI permite a inserção de sequências heterorélogas que, quando expressas a partir de um vector contendo a cassete, proporciona polipéptidos que são fundidos com dismutase de superóxido através de um ligador de oligopêptido contendo a sequência de aminoácido:

-asn-leu-gly-ile-arg-.

Uma amostra de pS35ú foi depositada em 29 de Abril de 1988 sob as condições do Tratado de Budapeste junto da American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Dr., Rockville, Marilândia 20853, θ foi designada Acessão No. 67.683, Os t ermos e condições para disponibilidade e acesso ao depósito, e para a manutenção do depósito são os mesmos que os especificados na Secção II.A, para estirpes contendo NANBV-cDNAs, Este depósito é efectuado apenas por conveniência, e não é exigido para a prática da presente invenção em virtude da descrição aqui feita, 0 material depositado é por isso aqui incorporado como referência.

- Il6 Depois de os recombinantes contendo o suplemento C100 cDNA na orientação correcta estarem isolados, a cassete de expressão contendo o C100 cDNA foi extirpada a partir de Ρ^5-56θ^θθ com BamHI, e um fragmento de ~3^OObp que contém a cassete foi isolado e purificado. Este fragmen to foi então inserido no local BamHI do vector de levedura pAB2U.

plasmídeo pAB24, cujas características signi^ ficativas estão representadas na Fig. 35, ® um vector de vai. vém de levedura que contém a sequência completa de 2 microns para replicação J_ Broach (l98lj_7 e sequências pBR3²²· 0 mesmo contém também o gene de lévedurà URA3 derivado do plasmídeo YE_p24 /jBotstein et al. (1979.27, e o gene de levedura LEU^ derivado do plasmídeo pCl/l, EPO pub. No. 116.201, 0 plasmídêo pAB24 foi construindo macerando YEp2U com EcoRI e religando o vector para remover as sequências parciais de 2 micron. 0 plasmídeo resultante, YEP2àdeltaRI, foi linearizado por digestão com Ciai e ligado com o plasmídeo completo de 2 micron que tinha sido linearizado com Ciai, O plasmídeo resultante, pCBou, foi então macerado com Xbal e o fragmento de vector 8605 bp foi isolado com gel. Este fragmento Xbal isolado foi ligado com um fragmento 4^60 bp Xbal contendo o 2d , gene LEU isolado a partir de pCl/l; a orientação do gene 2d ’

LEU esta na mesma direcção que o gene URA 3. A inserção da expressão foi no único local BamHI da sequência pBR322, interrompendo assim o gene para resistência bacteriana à tetra ciclina.

- 117 (,

' 0 plasmídeo recombinante que continha a cassete de expressão SOD-C1OO, pAB24C100-3, foi transformado na estirpe de levedura JSC 308, assim como em outras estirpes de levedura» As células foram transformadas como descrito por Hinnen et’al. (ΐ97θ), θ revestidas sobre placas ura-selectivas. Colónias simples foram inoculadas em meios leu-selectivos e germinadas até à saturação. A cultura foi induzida para expressar o polipêptido SOD-C1OO (denominado C100-3) por germinação em YEP contendo 1% de glucose.

A estirpe JSC 308 é do genotipo MAT , leu2, ura3(del) DM15 (GAP/ADRl) integrada no local ADR1. No JSC 3O8, a sobre-expressão do produto de gene activador positivo, ADR1, resulta em hiperdepressão (em relação a um controle do tipo selvagem ADRl) e em rendimentos significativamente mais elevados de proteínas heterólogas expressas quando tais proteínas são sintetizadas através de um sistema regulador ADH2 UAS. A construção da estirpe de levedura JSC 308 é revelada no pedido co-pendente norte-americano No. de Série (Attorney Docket No.23OO-O229) depositado simultaneamente com o presen te, e que é aqui incorporado como referência. Uma amostra de JSC 308 foi depositada em 5 de Maio de 1988 na ATCC sob as condições do Tratado de Budapeste, e foi-lhe atribuída a Acejs são No. 20879. Os termos e condições para a disponibilidade e acesso ao depósito, e para a manutenção do depósito são os mes mos que os especificados na Secção II.A, para as estirpes contendo HCV cDNAs.

polipêptido de fusão C100-3 completo codifica do em pAB24C100-3 deve conter 154 aminoácidos de SOD humano no

118

amino-terminal, 5 resíduos de aminoácido derivados do adapta dor sintético contendo o local EcoRI, 363 resíduos de aminoá eido derivados de C100 cDNA, e 5 aminoácidos carboxi-terminais derivados da sequência de nucleótido MS2 juntando a sequência HCV cDNA no clone 32. (Ver Secção IV.A.7). A sequência de aminoácido putativo do carboxi-terminal deste polipéj) tido, começando no penúltimo resíduo Ala de SOD, está representada na Fig. 3ú; também representada está a sequência de nucleótido codificando esta porção do polipéptido.

IV.B.5. Identificação do Polipéptido Codificado dentro de C100 como um Antigene Associado a NANBH polipéptido de fusão C100-3 expresso a partir do plasrnídio pAB24C100-3 na estirpe de levedura JSC 308 foi caracterizado em relação ao tamanho, e o polipéptido codificado em C100 foi identificado como um antigene NANBH-associado pela sua reactividade imunológica com soro a partir de um ser humano com NANBH crónica, polipéptido C100-3, que foi expresso como desí crito na Secção IV.B.4, foi analizado como segue. As células de levedura JSC 3θθ foram transformadas com pAB24, ou com pAB2UciOO-3, e foram induzidas para expressar o plasrnídio heterólogo de polipéptido codificado. As células de levedura in duzidas em 1 ml de cultura (0D/„_n ~20) foram transformadas em microesferas por centrifugação a 10.000 rpm durante 1 minu to, e foram lisoladas redemoinhando as mesmas vigorosamente (lOx x 1 min.) com 2 volumes de solução e 1 volume de microesferas de vidro (0,2 milimicron de diâmetro). A solução continha 50

119 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF), e 1 micrograma/ml de pepstatina. 0 mate rial insolúvel no lisato, que inclui o polipéptido C100-3» foi reunido por centrifugação (10,000 rpm durante 5 minutos) e foi dissolvido por fervura durante 5 minutos numa amostra tampão de Laemmli SDS. / Ver Laemmli (197.0.17· Uma quantidade equivalente de polipéptidos Kquela em 0,3 ml da cultura de 1 vedura induzida foi submetida a electroforese através de 10$ de geles de poliacrilamida na presença de SDS de acordo com Laemmli (ΐ97θ). Padrões de proteína foram submetidos a co-electroforese sobre os geles. -Os geles contendo os polipéptidos expressos foram quér manchados com Coomassie azul brilhante, quer submetidos a borrões Ocidentais como se descreveu na Secção IV.B.2, utilizando soro proveniente de um paciente com NANBH crónica para determinar a reactividade imunologica dos polipéptidos expressos a partir de pAB24 e de pAB24C100-3.

0s resultados estão representados na Fig. 37. Na Fig. 37A os polipéptidos foram manchados com Coomassie azul brilhante. 0(s) polipétido(s) insolúveis provenientes de 3SC 308 transformado(s) com pAB24 e provenientes de duas colónias diferentes de JSC transformadas com pAB24C100-3 estão representados na passagem 1 (pAB24), e passagens 2 e 3» respectivamente. Uma comparação das passagens 2 θ 3 com a passagem 1 mostra a, expressão induzida de um polipéptido correspondendo a um peso molecular de ~54.OOO daltons a partir de JSC 308 transformado com pAB24C100-3» que não é induzido em JSC 308 transformado com pAB24. Este polipéptido é indicado pela

120 seta

A Fig. 37B mostra os resultados das manchas Ocidentais dos polipéptidos insolúveis expressos em JSC 308 transformados com pAB24 (passagem l), ou com pAB24clOO-3 (passagem 2). Os polipéptidos expressos a partir de pAB24 não foram imunologicamente reactivos com soro provenientes de um ser humano com NANBH. Contudo, como indicado pela seta, o JSC 308 transformado com pAB24C100-3 expressou um polipéptido de ~54.OOO daltons de peso molecular que reagiram imunologicamente com 0 soro de NANBH humana. Os outros polipéptidos imunologicamente reactivos na passagem 2 podem ser produtos de degradação e/'ou agregação deste polipéptido ~54.OOO dalton.

IV.B,6. Purificação do Polipéptido de Fusão C100-3 polipéptido de fusão, C100-3» constituído por SOD no N-terminal e em estrutura do polipéptido ClOO HCV no C-terminal foi purificado por extracção diferencial da fracção insolúvel das células de levedura hospedeiras extraí das em que o polipéptido foi expresso.

polipéptido de fusão, C100-3, foi expresso em estirpe de levedura JSC 3θθ transformada com pAB24C100-3, como descrito na Secção IV,B.4. As células de levedura foram então lisoladas por homogenização, o material insolúvel no li sato foi extraído ao pH 12,0, e o C100-3 na fracção insolúvel remanescente foi solubilizado no tampão contendo SDS, lisato de¹ levedura foi preparado essencial121 -

mente de acordo com Nagahuma et al. (1984). Uma suspensão de célula de levedura foi preparada com 33$ de células (v/ /v) suspensas numa solução (Tampão A) contendo 20mM Tris HC1, pH 8,0, lmM de ditiotreitol, e 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF). Uma parte aliquota da suspensão (l5 ml) foi misturada com um volume igual de microesferas de vidro (0,45-0,50 mm de diâmetro), e a mistura foi redemoinhada à velocidade de topo de um Super Mixer (Lab Line Instruments, Inc,) durante 8 min, 0 homogenato e as microes feras de vidro foram separados, e as microesferas de vidro foram lavadas 3 vezes com o mesmo volume de Tampão A que as células originais embaladas. Depois de combinar as lavagens e o homogenato, 0 material insolúvel no lisato foi obtido por centri fugação do homogenato a 7.000 x g durante 15 minutos a 4° C, suspendendo de novo as microesferas no Tampão A igual a duas vezes o volume das células originais embaladas, e transformando de novo em microesferas o material por centrifugação a 7.000 x g durante 15 min. Este processo de lavagem foi re petido 3 vezes.

material insolúvel proveniente do lisato foi extraído ao pH 12,0 como segue. As microesferas foram suspen sas num tampão contendo 0,5 M de NaCl, 1 mM de EDTA, onde o volume de suspensão era igual a 1,8 vezes o das células originais embaladas. 0 pH da suspensão foi ajustado por adição de 0,2 volumes de 0,4 M de tampão de fosfato de Na, pH 12,0. Depois da mistura, a suspensã.o foi centrifugada a 7.000 x g durante 15 min, a 4·° C, e o sobrenadante removido. A extracção foi repetida 2 vezes. As microesferas extraídas foram la’

- 122 vadas suspendendo as mesmas em 0,5 M de NaCl, 1 mM de EDTA, utilizando um volume de suspensão igual a dois volumes das células originais embaladas, seguindo-se a centrifugação a 7.000 x g durante 15 min, a 4° C.

polipéptido C100-3 nas microesferas extraídas foi solubilizado por tratamento com SDS. As microesferas foram suspensas no Tampão Λ igual a 0,9 volumes do volume de células originais embaladas, e 0,1 volumes de 2$ de SDS foram adicionados. Depois da suspensão estar misturada, a mesma foi centrifugada a 7.000 x g durante 15 min. a 4° C. As microesferas resultantes foram extraídas 3 vezes mais com SDS. Os sobrenadantes resultantes, que continham C100-3 foram colocados em reservatório.

Este processo purifica o C100-3 mais que 10 ve zes a partir da fraeção insolúvel do homogenato de levedura, e a recuperação do polipéptido é maior que 50$.

A preparação purificada do polipéptido de fusão foi analizada por electroforese de gel de poliacrilamida de acordo com Laemmli (1970). Com base nesta análiâe, o polipéptido era superior em pureza a 80$, e tinha um peso molecular aparente de *”54,000 daltons.

IV,C. Identificação de RNA em indivíduos Infectados que Hi-. bridiza para HCV cDNA

IV.C.1. Identificação de RNA no Fígado de um Chimpanzé Com NANBH Que Hibridiza para HCV cDNA.

RNA proveniente do fígado de um chimpanzé

- 123a χ' ο

que tinha .NANBH mostrou conter uma espécie de RNA que hibri diza para o HCV cDNA contido dentro do clone 81 por criação de manchas a Norte, como segue.

RNA foi isolado de uma biópsia de fígado do chimpanzé a partir do qual o plasma de elevado título foi d£ rivado (ver Secção IV,A.1.) utilizando as técnicas descritas em Maniatis et al. (1982) para o isolamento do RNA total pro veniente de células de mamíferos, e para a sua separação em fracções poli A⁺ e poli A . Estas fracções RNA foram submetidas a electroforese sobre um gel de formaldeído/agarose (1% p/v), e transferidas para nitrocelulose. (Maniatis et al. (1982)). Os filtros de nitrocelulose foram hibridados com HCV cDNA rádio-classifiçado a partir do clone 81 (ver Fig.

para a sequência de nucleótido do suplemento). Para preparar a sonda rádio-classifiçada, o suplemento HCV cDNA isolado do clone 81 foi rádio-classifiçado com ^J p por translação de incisão utilizando a Polimerase' I de DNA (Maniatis et al. (1982)), A hibridação foi efectuada durante 18 horas a 42° C numa solução contendo 10% (p/v) de sulfato de Dextran, 50% (p/v) de formamida desionizada, 750 mM de NaCl, 75 mM de citrato de Na, 20 mM de NagHPO^, pH 6,5, 0,1% de SDS, 0,02% (p/v) de albumina de soro' de bovino (BSA), 0,02% (p/v) de Ficoll-400, 0,02% (p/v) de polivinilpirrolidona, 100 microgramas/ml de DNA de esperma de' salmão que tinham sido cisalhados por sonicação e desnaturados, e 10^ CPM/ml da sonda cDNA transladada por incisão.

Uma auto-radiografia do filtro sondado está r£ presentada na Fig, 38. A passagem 1 contém marcadores de frag

124 -

mento de restrição p-classifiçados. As passagens 2-4 contêm o RNA de fígado de chimpanzé como segue: a passagem 2 contém 30 microgramas de RNA total; a passagem 3 contém 30 micro gramas de poli A RNA e á conduta 4 contém 20 microgramas de poli A⁺ RNA, Como está representado na Fig. 3θ, θ fígado dos chimpanzés com NANBH contém uma população heterogénea de moz 4· .leculas A RNA relacionadas que hibridam para a sonda HCV cDNA, e que parecem ser de cerca de 5.000 nucleótidos a cerca de 11,000 nucleótidos em dimensão. Este RNA que hibrida para’ o HCV cDNA, poderia representar genomas virais e/ou transcrições específicas do genoma virai.

A experiência descrita na Secção IV.C.2,, aba.i xo, é compatível com a sugestão de que o HCV contém um genoma RNA,

IV.C.2. Identificação do RNA Derivado de HCV em Soro proveniente de Indivíduos Infectados.

Xcidos nucleicos foram extraídos de partículas isoladas a partir de plasma de NANBH de chimpanzés de elevado título como descrito na Secção IV.A.l.. Partes aliquotas (equivalentes a 1 ml de plasma original) dos ácidos nucleicos isolados foram suspensas de novo em 20 microlitros de 50 mM Ilepes, pH 7,5, I mm de EDTA e l6 microgramas/ml de levedura RNA solúvel. As amostras foram desnaturadas por fervura durante 5 minutos seguida por refrigeração imediata, e foram tratadas com RNase A (5 microlitros contendo 0,1 mg/ml de RNase A em 25 mM de EDTA, 40 mM de Hepes, pH 7,5) ou com DNase I (5 microlitros contendo 1 unidade DNasel em 10 mM de

125

MgCl₂, 25 mM de Hepes, pH 7,5) ; as amostras de controle foram incubadas sem enzima. A seguir à incubação, 230 microlji tros de 2XSSC gelado contendo 2 rnicrogramas/ml de levedura de RNA solúvel foram adicionados, e as amostras foram filtra_;das sobre um filtro de nitrocelulose. Os filtros foram hibri dados com uma sonda cDNA a partir do clone 8l, que tinha si32 do classificada ^J p por incisão-translação, A Fig, 39 mostra uma autoradiografia do filtro. Os sinais de hibridação foram detectados na DNase tratada e nas amostras de controle (passagens 2 e 1, respectivamente), mas não foram detectados na amostra tratada com RNase (passagem 3). Assim, visto que o tratamento com RNase A destruiu os ácidos nucleicos isolados a partir de partículas, e o tratamento com DNase I não teve efeito, a evidencia sugere fortemente que o genoma HCV e com posto por RNA.

IV.C,3» Detecção de Sequências de Ácido Nucleico de HCV Ampliadas derivadas de Sequências de ácido Nucleico de HCV no Fígado e Espécimes de Plasma provenientes de Chimpanzés com NANBH

Os ácidos nucleicos de HCV presentes no fígado e plasma de chimpanzés com NANBH, e nos chimpanzés de contro. le, foram ampliados utilizando essencialmente a técnica de reacção em cadeia de polimerase (PCR) descrita por Saiki et al, (1986). Os oligonucleotidos primários· foram derivados das sequências HCV cDNA no clone 81, ou clones 36 e 37· As sequên cias ampliadas foram detectadas pela electroforese de gel e formação de manchas a Sul, utilizando como, sondas o oligémero cDNA apropriado com uma sequência proveniente da região

126 -

entre, mas não incluindo, os dois primários.

Amostras de RNA contendo sequências de HCV a ser examinadas pelo sistema de amplificação foram isoladas a partir de biópsias de fígado de três chimpanzés com NANBH, e a partir de dois chimpanzés de controle. O isolamento da fracção RNA foi efectuado pelo'processo de tiocianato de gua nidínio descrito na Secção TV.C.l.

Amostras de RNA que eram para ser examinadas pelo sistema de amplificação foram também isoladas a partir de plasmas de dois chimpanzés com NANBH, e a partir de um chimpanzé de controle, assim como a partir de um reservatório de plasmas de chimpanzés de controle. Um chimpanzé infectado tinha um CID/ml igual a ou maior que 10^,. e o outro chimpan t* zé infectado tinha um CID/ml igual a ou superior a 10 .

Os ácidos nucleicos foram extraídos do plasma co mo segue. Quer 0,1 ml quer 0,01 ml de plasma foi diluído até um volume final de 1,0 ml, com uma solução de TENB/proteinase K/SDS (0,05 M Tris-HCl, pH 8,0,· 0,001 M EDTA, 0,1 M NaCl, 1 mg/ml de proteinase K, e 0,5$ de SDS) contendo 10 microgra mas/ml de ácido poliadenílico,· e incubado a 37° C durante 60 minutos. Depois esta digestão de proteinase K, as fracções de plasma resultantes foram desproteinizadas por extracção com TE (10,0 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) de fenol saturado. A fase de fenol foi separada por centrifugação, e foi extraída de novo com TENB contendo 0,1$ SDS. As fases aquosas resultantes de cada extracção foram colocadas em reservatório, e extraídas duas vezes com um volume igual de fe127 nol/clorofórmio/álcool isoarnílico / I:l(99i2j_7» θ depois duas vezes com um volume igual de uma mistura 99:1 de cloro, fórmio/álcool isoarnílico. Seguindo a separação da fase por centrifugação, a fase aquosa foi levada até à concentração final de 0,2 M de acetato de Na, e os ácidos nucleicos foram precipitados pela adição de dois volumes de etanol. Os ácidos nucleícos precipitados foram recuperados por ultra-centrifugação num rotor SW 4l a 38 K, durante ÓO minutos a 4° C.

Além do acima indicado, o plasma de chimpanzé de elevado título e o plasma de controle em reservatório fo ram alternativamente extraídos com 5θ microgramas de veículo poli A pelo processo de Chomcyzski e Sacchi (1987). Este processo utiliza uma extracção; de tiocianato de guanidínio ácido, 0 RNA foi recuperado por centrifugação a 10.000 rpm durante 10 minutos a 4° C num microfuge Eppendorf,

Em duas ocasiões, antes da síntese do cDNA na reacção PCR, os ácidos nucleícos extraídos do plasma pelo método proteinase K/SDS/fenol foram ainda purificados pela ligação a e eluição a partir de Colunas S e S Elutip-R. 0 processo seguido foi de acordo com as indicações do fabricante.

cDNA utilizado como um padrão para a reacção de PCR foi derivado dos ácidos nucleícos (quer ácidos nucleicos totais quer RNA) preparados como acima descrito, Se. guindo a precipitação de etanol, os ácidos nucleícos precipi. tados foram secados, e su'spensos de novo em água destilada

128 tratada com DEPC. As estruturas secundárias nos ácidos nucleicos foram rompidas por aquecimento a 65^o C durante 10 minutos, e as amostras foram imediatamente arrefecidas em gelo, 0 cDNA foi sintetizado utilizando 1 a 3 microgramas de RNA total de chimpanzé proveniente do fígado, ou de áci, dos nucleicos (ou RNA) extraído de 10 a 100 microlitros de plasma. A síntese utilizou a transcriptase inversa, e foi realizada numa reacção de 25 microlitros, utilizando 0 protocolo especificado pelo fabricante, BRL. Os primários para a sintêse de .cDNA foram também utilizados na reacção PCR, descritos abaixo. Todas as misturas de reacção para a síntese de cDNA continham 23 unidades do inibidor RNAase, RNASIN~ (Fisher/Promega). Seguindo a síntese cDNA, as misturas de reacção foram diluídas com água, fervidas durante 10 minutos, e rapidamente arrefecidas sobre gelo.

As reacções PCR foram realizadas essencialmente de acordo com as indicações do fabricante (Cetus-Perkin-Elmer), excepto para a adição de 1 micrograma de RNase A. As reacções foram executadas num volume final de 100 microlitros. 0 PCR l

foi realizado durante 35 ciclos, utilizando um regime de 37° C, 72° C, e 94° C.

Os primários para a síntese de cDNA e para as reacções PCR foram derivados das sequências HCV cDNA quer no clone 81, quer no clone 36, quer no clone 37b. (As sequências HCV cDNA dos clones 81, 36, e 37b estão representadas nas Figs. 4, 5 θ 10, respectivamente). As sequências dos dois primários ló-mer derivados do clone 81 foram:

9 . -=-4 r

5' CAA TCA TAC CTG ACA G 3’ e

5' GAT AAC CTC TGC CTG A 3’ a sequência do primário a partir do clone 36 foi:

5’ GCA TGT CAT GAT. GTA T 3’

A sequência do primário a partir do clone 37b foi:

5' ACA ATA CGT GTG TCA C 3’.

Nas reacções PCR, os pares primários consistiram quer em dois derivados l6-mer do clone 81, quer no l6-mer do clone 36 e no l6-mer do clone 37b.

Os produtos da reacção PCR foram analizados por separação dos produtos por electroforese de gel alcalino, seguida por criação de manchas a Sul, e detecção das sequen cias HCV-cDNA com uma sonda de oligonucleótido interno cias32 sificado p a partir de uma região do HCV cDNA que não se sobrepõe aos primários. As misturas de reacção PCR foram ex traídas com fenol/clorofármio, e os ácidos nucleícos precipitados a partir da fase aquosa com sal e etanol. Os ácidos nucleícos precipitados foram reunidos por centrifugação, e dissolvidos em água destilada. Partes alíquotas das amostras foram submetidas ε electroforese sobre 1,8$ de geles de agarose alcalina. Os DNA de fibra única de 6θ, 108, e lól comprimentos de nucleótido foram submetidos conjuntamente a electroforese sobre os geles como marcadores de peso molecular. Depois da electroforese, os DNAs no gel foram transferidos para papel Biorab Zeta Probe. A pré-hibridação e a

hibridação, e as condições de lavagem foram as especificadas pelo fabricante (Biorad).

As sondas utilizadas para a hibridação-detecção das sequências HCV cDNA aplicadas foram as seguintes, Quando o par de primários PCR era derivado do clone 81, a sonda era 108-mer com uma sequência correspondendo à que está loca lizada na região entre as sequências dos dois primários. Quando o par de primários PCR era derivado dos clones 36 e 37b, a sonda foi o suplemento HCV cDNA transladado por incisão derivado do clone 35» Os primários são derivados dos nucleótidos 155-170 do suplemento do clone 37b, e do suplemento 206-268 do clone 36. 0 3’-final do suplemento HCV cDNA no clone 35 sobrepõe-se aos- nucleótidos 1-186 do suplemento no clone 36; e o 5’-final do suplemento do clone 35 sobrepõe-se aos nucleótidos 207-269 do suplemento no clone 37b. (Comparar Figs, 5, 8 e Ιθ). Assim, o suplemento cDNA no clone 35 abarca parte da região entre as sequências dos primários derivados dos clones 36 e 37b, e é útil como uma sonda para as sequências ampliadas que incluem estes primários.

A análise do RNA proveniente dos espécimes de fígado foi de acordo com o processo acima utilizando ambos os conjuntos dos primários e sondas. 0 RNA proveniente do fí gado dos tres chimpanzés com NANBH proporcionou resultados de hibridação positivos para sequências de amplificação do tamanho esperado (l6l e 586 nucleótidos para 81 e 36 e 37b,

I respectivamente), enquanto os chimpanzés de controlo deram resultados de hibridação negativos. Os mesmos resultados foram conseguidos quando a experiência foi repetida três vezes.

131 -

A análise dos ácidos nucleicos e RNA proveniente do plasma foi também efectuada de acordo com o processo aci ma utilizando os primários e sonda provenientes do clone 81.

Os plasmas eram provenientes de dois chimpanzés com NANBH, de um chimpanzé de controle, e plasmas em reservatório provenien te de chimpanzés de controle. Ambos os plasmas NANBH continham ácidos nucleicos/RNA que deram resultados positivos no ensaio amplificado PCR, enquanto que ambos os plasmas de controle deram resultados negativos. Estes resultados foram repetidamente obtidos várias vezes.

IV,D, Radio-imunoensaio para Detectar Anticorpos de HCV no Soro proveniente de Indivíduos Infectados

Os radio-imunoensaios de fase solida paaa detectar anticorpos para antigenes de HCV foram desenvolvidos com base em Tsu e Herzenberg (1980). Placas Microtiter (immulon 2, faixas Removawell) são revestidas com polipéptidos purifica dos contendo epítopes HCV. As placas revestidas foram incubadas quer com amostras de soro humano suspeitas de conterem anticorpos para os epítopes HCV, quer para controles apropriados. Durante a incubação, o anticorpo, se estiver presente, é imunol£ gicamente ligado ao antigene de fase sólida. Depois da remoção do material não ligado e lavagem das placas microtiter”, complexos de anticorpo humano-antigene do NANBV são detectados por incubação com imunoglobulina anti-humana de carneiro classifica

5 , da I. 0 anticorpo classificado não ligado e removido por aspiração, e as placas são lavadas, A radioactividade em reservatórios individuais é determinada; a quantidade de anticorpo hu- I32 mano anti-HCV ligada e proporcional à radioactividade no reser vatório.

IV ,D, 1. Purificação do Polipéptido de Fusão SOD-NANB^. ₁ .

polipéptido de fusão SOD-NANB^ expresso nas bactérias recombinantes como descrito na Secção IV.B.l,, foi purificado a partir do recombinante E, coli por extracção dife rencial dos extractos de célula oom ureia, seguida pela cromatografia sobre colunas permutadoras de anião e catião como segue.

Células descongeladas,a partir de 1 litro de cultu ra foram suspensas de novo em 10 ml de 20$ (p/v) de sacarose contendo 0,01M de Tris HCl, pH 8,0, e 0,4 ml de 0,5M de EDTA, pH 8,0 foram adicionados. Passados 5 minutos a 0° C, a mistura foi centrifugada a 4.000 x g durante 10 minutos. As microesferas resultantes foram suspensas em 10 ml de sacarose a 25$ (p/ /v) contendo 0,05 M de Tris HCl, pH 8,0, lmM de fluoreto de fe nilmetilsulfonilo (PMSF) e 1 micrograma/ml de pepstatina A, s_e guindo-se a adição de 0,5 ml de llsozima (lO mg/ml) e incubação a 0° C durante 10 minutos. Depois da adição de 10 ml 1$ (v/v) de Triton X-100 em 0,05 M de Tris HCl, pH 8,0, 1 mM de EDTA, a mistura foi incubada durante 10 min. adicionais a 0°C com agitação ocasional. A solução viscosa resultante foi homogeneizada por passagem 6 vezes através de uma agulha hipodérmica estéril de calibre 20, e centrifugada a 13.000 x g durante 25 minutos. 0 material em forma de microesferas foi suspenso em 5 ml de 0,01 M de Tris HCl, pH 8,0, e a suspensão centrifugada a 4.000 x g durante 10 minutos. As microesferas, que continham a prote:

na de fusão SOD-NANB

p foram dissolvidas em 5 ml de ÓM de ureia em 0,02 M de Tris HC1, pH 8,0, 1 mM de ditiotreitol (Tam pão A), e foram aplicadas a uma coluna de Q-Sefarose equilibra da em Fluxo Rápido (Fast Flow) com o Tampão A. Os polipéptidos foram eluídos com um gradiente linear de 0,0 a 0,3 M de NaCl no Tampão A. Depois da eluição, as fracções foram analizadas por electroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS para determinar o seu teor de SOD-NANB^ As fracções contendo este polipéptido foram colocadas em reservatório, e dia lizadas contra 6 M de ureia em 0,02 M de tampão de fosfato de sódio, pH 6,0, 1 mM de ditiotreitol (Tampão B) . A amostra dia lizada foi aplioada sobre uma coluna de S-Sefarose equilibrada em Fluxo Rápido com o Tampão B, e o polipéptido eluído com um gradiente linear de 0,0 a 0,3 M de NaCl no Tampão B, As fracções foram analizadas por electroforese de gel de poliacrilami da quanto à presença de SOD-NANB^ j e as fracções apropriadas foram colocadas em reservatório.

A preparação final do polipéptido SOD-NANB^ fo examinada por electroforese sobre geles de poliacrilamida na presença de SDS, Com base nesta análise, a preparação era mais que 80$ pura.

IV.D.2. Purificação do Polipéptido de Fusão SOD-NANB^.

polipéptido de fusão SOD-NANBg^, expresso nas bactérias recombinantes como descrito na Secção IV.B,2, foi pu rificado a partir do recombinante E. coli por extracção diferencial dos extractos de células com ureia, seguida por cromatografia sobre colunas permutadoras de anião e catião utilizan.

134 do o processo descrito para o isolamento do polipêptido de fu são SOD-NANB₅_₁_₁ (Ver Secção IV.D.l.),

A preparação final do polipêptido SOD-NANBg₁ foi examinada por electroforese sobre geles de poliacrilamida na presença de SDS. Com base nesta análise, a preparação era mais que 50# pura.

IV,D,3. Detecção de Anticorpos para Epítopes HCV por Radio-Imunoensaio de Fase Solida

Amostras de soro provenientes de 32 pacientes que foram diagnosticados como tendo NANBH foram analisadas por radio-imunoensaio (RIA) para determinar se os anticorpos para os epítopes HCV presentes nos polipéptidos de fusão SOD-NANB.

5-1-1 e SOD-NANBqi foram detectados.

Placas ”microtiter” foram revestidas com SOD-NANB,. , ,

5-1-1 ou SOD-NANBg^, os quais tinham sido parcialmente purificados de acordo com as Secções IV.D.l. e 1V.D.2., respectivamente. Os en saios foram conduzidos como segue.

Uma centena de partes.aliquotas de microlitro contendo 0,1.a 0,5 microgramas de SOD-NANB^ χ χ ^ou SOD-ΝΑΝΒθ^ em 0,125 M de tampão de borato de Na, pH 8,3» 0,075 M de NaCl (BBS) foi adicionada a cada reservatório de uma placa microtiter^M (Dynatech Immulon 2 Removawell Strips). A placa foi incubada a 4° C durante a noite numa câmara húmida, depois do que, a solução de proteína foi removida e os reservatórios lavados 3 vezes com BBS contendo 0,02# de Triton X-100 (BBST). Para evitar uma ligação não específica, os reservatórios foram revesti- 135 -

dos com albumina de soro de bovino (BSA) por adição de 100 rni crolitros de uma solução de 5 mg/ml de BSA em BBS seguida pela incubação à temperatura ambiente durante 1 hora; depois de_s ta incubação a solução de BSA foi removida. Os polipéptidos nos reservatórios revestidos foram feitos reagir com soro por adição de 100 microlitros de amostras de soro diluídas 1:100 em Ο,ΟΙΜ de tampão de fosfato de Na, pH 7,2, 0,15 M NaCl (PBS) contendo 10 mg/ml de BSA, e incubando os reservatórios conten do soro durante 1 hora a 37° C. Depois da incubação as amostras de soro foram removidas por aspiração, e os reservatórios foram lavados 5 vezes com BBST, A ligação de anti-NANB^ χ χ ^eAnti-NANBgp aos polipéptidos de fusão, foi determinada pela ligação de IgG anti-humano de carneiro F'(ab)2 classificado ^l2^I aos reservatórios revestidos. Partes alíquotas de 100 mi crolitros da sonda classificada (actividade específica 5-20 microcuries/micrograma) foram adicionadas a cada reservatório, e as placas foram incubadas a 37° C durante 1 hora, seguindo-se a remoção da sonda em excesso por aspiração, e 5 lavagens com BBST. A quantidade de radioactividade ligada em cada reservatório foi determinada por contagem num contador que detecta radiação gama.

ti-NANB_gl

1.

Os resultados da detecção de anti-NANB^ χ χ ^{e a}S em indivíduos com NANBH estão apresentados na Tabela

- 136 -

Tabela 1

Detecção de Anti-5-1-1 ^e Anti-8l em Soros de Pacientes com Hepatite NANB, HAV e HBV

Número de Referência	Diagnose	s/n
do	paciente	Anti-5-1-1	Anti-8
1.	28¹	NANB Crónico, IVD²	0,77	4,20
		NANB Crónico, IVD	1,14	5,14
		NANB Crónico, IVD	2,11	4,05
2.	29¹	AVH^, NANB, Esporádico	1,09	1,05
		NANB,Crónico	33,89	11,39
		NANB, Crónico	36,22	13,67
3.	30¹	AVH, NANB, IVD	1,90	1,54
		NANB, Crónico, IVD	34,17	30,28
		NANB, Crónico, IVD	32,45	30,84
4.	31	NANB, Crónico, PT^	16,09	8,05
5.	32¹	AVH NANB, Tardio, IVD	0,69	0,94
		AVH NANB, Tardio, IVD	0,73	0,68
6.	33¹	AVH, NANB, IVD	1,66	1,96
		AVH, NANB, IVD	1,53	0,56
7.	34¹	NANB, Crónico, PT	34,40	7,55
		NANB, Crónico, PT	45,55	13,11
		NANB, Crónico, PT	41,58	13,45
		NANB,Crónico, PT	44,20	15,48
8.	35¹	AVH NANB, IVD	31,92	31,95
		Curado” recente	6,87	4,45
		NANB, AVH
9.	36	AVH NANB Tardio PT	11,84	5,79
10.	37	AVH NANB, IVD	6,52	1,33
11.	38	AVH NANB, tardio, PT	39,44	39,18
12.	39	NANB Crónico, PT	42,22	37,54
13.	40	AVH, NANB, PT	1,35	1,17

137

Tabela 1 (Cont.)

Número de

Referência S/N

do	paciente	Diagnose	Anti-5-1-1	Anti-8l
14.	41	NANB? Crónico PT	0,35	0,28
15.	42	AVH, NANB, IVD	6,25	2,34
16.	43	NANB, Crónico, PT	0,74	0,61
17.	44	AVH, NANB, PT	5,4o	1,83
18.	45	NANB, Crónico, PT	0,52	0,32
19.	46	AVH, NANB	23,35	4,45
20.	47	AVH, Tipo A	l,60	1,35
21.	48	AVH, Tipo A	1,30	0,66
22.	49	AVH, Tipo A	1,44	0,74
23.	50	AVH Determinado recentemente, Tipo Á	0,48	0,56
24.	51	AVH, Tipo A	0,68	0,64
		AVH Determinado, Tipo A	0,8c	0,65
25.	52	AVH Determinado Recentemente, Tipo A	1,38	1,04
		AVH Determinado Recentemente, Tipo A	0,80	0,65
26.	53	AVH, Tipo A	1,85	1,16
		AVH Determinado Recentemente, Tipo A	0,02	0,88
27.	54	AVH, Tipo A	1,35	0,74
28.	55	AVH, HBV tardio	0,58	0,55
29.	56	HBV Crónico	0,84	1,06
30.	57	AVH, HBV tardio	3,20	1,60
31.	58	HBV Crónico	0,47	0,46
32.	59¹	AVH, HBV	0,73	0,60
		AVH, HBV Curado	0,43	0,44
33.	6o¹	AVH, HBV	’ 1,06	0,92
		AVH, HBV Curado	0,75	0,68

138

Tabela 1 (Cont.)

Número de

Referência S/N

do	paciente	Diagnose	Anti-5-1-1	Anti-8l
3*.	61¹	AVH, HBV	1,66	o,6i
		AVH, HBV curado	0,63	0,36
35.	62¹	AVH, HBV	1,02	0,73
		AVII, HBV curado	0,4l	0,42
36.	63¹	AVH, HBV	1,24	1,31
		AVH, HBV curado	1,55	0,45
37.	64¹	AVH, HBV	0,82	o,79
		AVH, HBV curado	0,53	0,37
38.	65¹	AVH, HBV	0,95	0,92
		AVH, HBV curado	0,70	0,50
39.	66¹	AVH, HBV	1,03	0,68
		AVH, HBV curado	1,71	1,39

¹Amostras de soro sequenciais disponíveis a partir destes pacientes

IVD = Utilizador de Medicamento Intravenoso 3

AVH » Hepatite virai aguda lt »

PT = Pos-transfusâo

139

Como se vê na Tabela 1, 19 dos 32 soros provenien tes de pacientes diagnosticados como tendo NANBH foram positi vos em relação aos anticorpos dirigidos contra epítopes HCV presentes em SOD-NANB^ e SOD-ΝΑΝΒθ^.

Todavia, as amostras de soro que foram positivas não foram igualmente reactivas imunologicamente com SOD-NANB^ e SOD-NANBg^ As amostras de soro provenientes do paciente N⁹1 foram positivas para SOD-NANBg₁ mas não para SOD-NANB^ _{χ 4}, As amostras de soro provenientes dos pacientes números 10, 15 e 17 foram positivas para SOD-NANB^ mas não para SOD-NANBg^. Amostras de soro provenientes dos pacientes números 3, 8, 11 e 12 reagiram igualmente'com ambos os polipéptidos de fusão, ao passo que as amostras de soro provenientes dos pacientes números 2, 4, 7 θ 9 foram 2-3 vezes mais elevadas na reacção a SOD-NANB^ que a SOD-NANBg^. Estes resultados sugerem que NANB^ j j θ NANBg^ podem conter pelo menos 3 epítopes diferentes, isto é, é possível que cada polipêptido con tenha pelo menos 1 único epítope, e que os dois polipéptidos com partilhem pelo menos 1 epítope,

IV.D.4, Especificidade da Fase Solida RIA para NANBH

A especificidade da fase sólida RIAs para NANBH foi testada utilizando o ensaio sobre soro proveniente de pacientes infectados com HAV ou com HBV e sobre soros provenientes de indivíduos de controle. Os ensaios utilizando SOD-NANB^_₁_₁ e SOD-NANBg₁ parcialmente purificados foram conduzidos essencialmente como descrito na Secção IV.D.3, excepto em que os soros eram provenientes de pacientes previamente — 140 — diagnosticados como tendo HAV ou HBV, ou provenientes de indivíduos que eram dadores de bancos de sangue. Os resultados para soros provenientes de pacientes infectados com HAV e HBV estão apresentados na Tabela 1. A RIA foi testada utilizando 11 espécimes de soro provenientes de pacientes infectados com HAV, e 20 espécimes de soro provenientes de pacientes infectados com HBV. Como está mostrado na tabela 1, nenhum destes so ros deu uma reacção imunolégica positiva com os polipêptidos de fusão contendo epítopes BB-NANBV.

A RIA utilizando o antigene NANB^ foi usada pa ra determinar a reactividade imunolégica de soro a partir dos indivíduos de controle. Fora das 230 amostras de soro obtidas a partir da população de dadores de sangue normal., apenas duas deram reacçSes positivas na RIA (dados não representados), É possível que os dois dadores de sangue a partir dos quais estas amostras de soro são originárias tenham previamente sido expojs tos ao HCV.

IV.D.5. Reactividade de NANB^ , . Durante o Curso da Infec ................. 5 -i-ι —— ção NANBH.

A presença de anticorpos anti-NANB^ durante o curso da infecção de NANBH de 2 pacientes e 4 chimpanzés foi seguida utilizando RIA como descrito na Secção IV.D.3. Além disso a RIA foi utilizada para determinar a presença ou ausen cia de anticorpos anti-NANB^ durante o curso de infecção de HAV e HBV em chimpanzés infectados.

Os resultados, que são apresentados na Tabela 2, mostram que com chimpanzés e seres humanos, os anticorpos anforam detectados seguindo o começo da fase aguda de infecção da NANBH. Os anticorpos anti-NANB., , . não foram

5- i—i detectados nas amostras de soro proveniente de chimpanzés infectados quer com HAV quer com HBV. Assim, os anticorpos ant d. -MANB^ | | servem como um marcador para a exposição de um indivíduo a HCV.

Tabela 2

Seroconversão nas Amostras de Soro Sequenciais . provenientes de hepatite em pacientes e chimpanzés utilizando Antigene 5-1-1

Paciente/ 1	Data de Amostra (Dias)	Viroses de	Anti-5-1-1	ALT (mu/ml)
Chimp. 1	(0=dia	de inoculação)	Hepatite	(s/n)
Paciente 29		T	NANB	1,09	II80
	T+180		33,89	425
		T+208		36,22	——
Paciente 30		T	NANB	1,90	1830
	T+307		34,17	290
		T+799		32,45	276
Chimp. 1		0	NANB	0,87	9
	76		0,93	71
		118		23,67	19
		154		32,41	— —
Chimp. 2		0	NANB	1,00	5
	21		1,08	52
		73		4,64	13
		138		25,01	··
Chimp. 3		0	NANB	1,08	8
	43		1,44	205
		53		1,82	14
		159		11,87	6
Chimp, 4		-3	NANB	1,12	11
	55		1,25	132
		83		6,60	—
		140		17,51
Chimp. 5		0 25	HAV	1,50 2,39	4 147
		40		1,92	18
		268		1,53	5
Chimp. 6		-8 15	HAV	0,85 «w «*	106
		41		0,81	10
		129		1,33	W M,

142

Paciente/ Chimp.	Data de Amostra (Dias) (0=dia de inoculação)	Viroses de Hepatite	Anti-5-1-1 (S/N)	ALT (mu/ml)
Chimp. 7	0	HAV	1,17	7
	22		l,60	83
	115		1,55	5
	139		l,60	—
Chimp. 8	0	HAV	0,77	15
	26		1,98	130
	74		1,77	8
	205		1,27	5
Chimp, 9	-290	HBV	l,7*í	--
	379		3,29	9
	435		2,77	6
Chimp. 10	0	HBV	2,35	8
	111-118 (reserva-		2,74	96-156
	tório)		(reserva
				tório)
	205		2,05	9
	240		1,78	13
Chimp, 11	0	HBV	1,82	11
	28-56 (reserva-
	tório)		1,26	8-100 (
				servató
				rio)
	169		—	9
	223		0,52	10

* Τ = dia da amostragem inicial

IV. Ε. Purificação de Anticorpos de Soro Policlonal para nanb_5-i_i

Na base da reactividade imunologica específica do polipéptido do SOD-NANB^ com os anticorpos nas amostras de soro provenientes de pacientes com NANBH, foi desenvolvido um método para purificar anticorpos de soro que reagem imunologicamente com o(s) epítope(s) no NANB^ Este método uti liza a cromatografia de afinidade. 0 polipéptido SOD-NANB^ purificado (ver Secção IV,D,l) foi ligado ao suporte insolúvel; a ligação é tal que o polipéptido imobilizado retém a sua afinidade para o anticorpo· a NANB^ χ χ’ θ anticorpo em amostras de soro é absorvido até ao polipéptido matiriz-ligação. Depois da lavagem para remover materiais não especificamente ligados e materiais não ligados, o anticorpo ligado e liberta do do polipéptido SOD-HCV ligado por alteração no pH, e/ou reagentes caotrópicos, por exemplo ureia.

Membranas de nitrocelulose contendo SOD-NANB„ ₁ , ligado foram preparadas como segue. Uma membrana de nitrocelu lose, Sartorius de 2,1 cm com o tamanho de poro de 0,2 micron, foi lavada durante 3 minutos tres vezes com BBS, 0 SOD-NANB^_₁_₁ foi ligado à membrana por incubação da preparação purificada em BBS à temperatura ambiente durante 2 horas; alternativamente o mesmo foi incubado a 4° C durante a noite. A solução contendo antigene não ligado foi removida, e o filtro foi lavado três vezes com BBS durante três minutos por lavagem, Os locais activos remanescentes sobre a membrana foram bloqueados com BSA por incubação com uma solução de 5 mg/ml de BSA durante 30 minutos, 0 excesso de BSA foi removido por

144 lavagem da membrana por 5 vezes com BBS e 3 vezes com água destilada. A membrana contendo o antxgene virai e o BSA foi então tratada com 0,05 M de cloridrato de glicina, pH 2,5,

0,10 M de NaCl (GlyHCl) durante 15 minutos, seguindo-se 3 lavagens de três minutos com PBS,

Os anticorpos policlonais anti-NANB_ _Ί , foram iso

9— 1 — X ““ lados por incubação das membranas contendo o polipéptido de fusão com soro proveniente de um indivíduo com NANBH durante 2 horas. Depois da incubação, os filtros foram lavados 5 vezes com BBS, e duas vezes com água destilada. Anticorpos liga dos foram então eluídos a partir de cada filtro com 5 eluições de GlyHCl, a 3 minutos por eluição» 0 pH dos eluatos foi ajustado ao pH 8,0 reunindo cada eluato num tubo de ensaio con tendo 2,0 M de Tris HC1, pH 8,0, A recuperação do anticorpo anti-NANB^_₁ depois de cromatografia por afinidade é de apr£ ximadamente 5θ$·

As membranas de nitrocelulose contendo o antigene virai ligado podem ser utilizadas várias vezes sem diminuição apreciável na capacidade de ligação. Para a reutilização das membranas, depois dos anticorpos terem sido eluídos, as membranas são lavadas com BBS três vezes durante 3 minutos. As mesmas são então armazenadas em BBS a 4° C.

IV, F, A Captura de Partículas de HCV a partir de Plasma Infectado Utilizando Anticorpos Anti-HCV Policlonais Humanos Purificados; Hibridação do Ácido Nucleico nas Partículas Capturadas para HCV cDNA

- 145 IV. F, 1. A captura de Partículas de HCV a partir de Plasma Ih fectado Utilizando Anticorpos Anti-HCV Policlonais

Humano s

Complexos de ácido proteíno-nucleico presentes no plasma infeccioso de um chimpanzé com NANBH foram isolados utilizando anticorpos anti-HCV policlonais humanos purificados que foram ligados a microesferas de poliestireno.

policlonais foram pu de um ser humano com codificado no clone descrito na Secção

Os anticorpos anti-NANB^ rificados a partir de soro proveniente NANBH utilizando o polipéptido SOD-HCV

5-1-1. 0 método para purificação foi o

IV.E.

Os anticorpos anti-NANB^ purificados foram ligados a esferas de poliestireno (l/4 de diâmetro, acabamento especular, Precision Plastic Bali Co., Chicago, Illinois) incubando cada uma delas à temperatura ambiente durante a noite com 1 ml de anticorpos (l micrograma/ml em salmoura tamponada com borato, pH 8,5). Seguindo a incubação durante a noite, as esferas foram lavadas uma vez com TBST^/JO mM de Tris HC1, pH 8,0, 150 mM de NaCl, 0,05% (v/v) Tween 20^ e depois com salmoura tamponada com fosfato (PBS) contendo 10 mg/ml de BSA,

As esferas de controle foram preparadas de uma maneira idêntica, excepto em que os anticorpos anti-NANB^ purificados foram substituídos com imunoglobulina humana total ,

A captura de HCV a partir de plasma de chimpanzé infectado com NANBH utilizando os anticorpos anti-NANB_e . _Ί

5-1-1 ligados a esferas foi realizada como segue. 0 plasma proveniente de um chimpanzé com NANBH utilizado está descrito na Secção IV,A,1.. Uma parte aliquota (l ml) do plasma de chim panzé infectado com NANBV foi incubada durante 3 horas a 37°C com cada uma das 5 esferas revestidas com quer anticorpos anti-NANB^ quer com imunoglobulinas de controle. As esferas foram lava das 3 vezes com TBST,

IV,F«2. Hibridação do Ácido Nucleico nas Partículas Capturadas para NANBC-cDNA componente de ácido nucleico libertado a partir das partículas capturadas com anticorpos anti-NANB^ foi analizado para hibridação para HCV cDNA derivado do clone 81.

As partículas de HCV foram capturadas a partir de plasma de chimpanzé infectado com NANBH, como descrito em IV.F.l. Para libertar os ácidos nucleicos a partir de partículas, as esferas lavadas foram incubadas durante 60 minutos a 37° C com 0,2 ml por esfera de uma solução contendo protei. nase k (l mg/ml), 10 mM de Tris HC1, pH 7,5, 10 mM de EDTA,

0,25$ (p/v) SDS, 10 microgramas/ml de levedura solúvel RNA, e a solução sobrenadante foi removida. 0 sobrenadante foi ex traído com fenol e clorofórmio, e os ácidos nucleicos precipitados com etanol durante a noite a -20°C, 0 ácido nucleico precipitado foi reunido por centrifugação, secado, e dissolvido em 50 mM Hepes, pH 7,5· Partes alíquotas duplicadas dos ácidos nucleicos solúveis provenientes das amostras obtidas a partir de esferas revestidas com anticorpos anti-NANB e com esferas de controle contendo imunoglobulina humana total foram filtradas sobre filtros de nitrocelulose. Os filtros foram hibridados com uma sonda transladada por incisão, classificada p, fabricada a partir do fragmento HCV cDNA purificado no clone 81, Os métodos para a preparação da sonda e para a hibridação estão descritos na Secção IV.C.l..

Autoradiografias de um filtro sondado contendo os ácidos nucleicos provenientes de partículas capturadas por esferas contendo anticorpos anti-NANB^ são mostradas na

Fig, 40. 0 extracto obtido utilizando o anticorpo anti-NANB^ ! (A^,Ag) deu sinais claros de hibridação em relação ao extracto de anticorpo de controle (A^,A^) e à levedura de controle RNA Padrões consistindo em lpg, 5pg» e 10 pg do fragmento de clone 81 cDNA purificado, estão reprjs sentados em Cl-3, respectivamente.

Estes resultados demonstram que as partículas capturadas a partir do plasma NANBH pelos anticorpos anti-NANB^_^_^ contem ácidos nucleicos que hibridizam com HCV cDNA no clone 81, e assim proporcionam mais evidência de que os cDNAs nestes clones são derivados do agente etiológico pa ra NANBH.

IV.G. Reactividade Imunológica de C100-3 com Anticorpos Anti-NANB^ . . Purificados p-l—1 ......

A reactividade imunológica do polipéptido de fusão C100-3 com anticorpos anti-NANB^ foi determinada por um radio-imunoensaio, em que os antigenes que foram ligados a uma fase sólida foram postos em competição com anticorpos an ti-NANB purificados, e o complexo antigene-anticorpo de tectado com anticorpos de carneiro anti-humanos classificados ·» p K ’ΐ. A actividade imunológica do polipéptido C100-3 foi compa rada com a do antigene SOD-NANB., . .

polipéptido de fusão C100-3 foi sintetizado e purificado como descrito na Secção IV,B,5. e na Secção IV,B,6,, respectivamente, 0 polipéptido de fusão SOD-NANB^ foi sintetizado e purificado como descrito na Secção IV.B.l em Secção IV,D,1., respectivamente. Os anticorpos anti-NANB^^^ fo ram obtidos como descrito na Secção IV,E.

Uma centena de partes alíquotas de microlitro con tendo quantidades variáveis de antigene C100-3 purificado em O,125M de tampão de borato de Na, pH 8,3, O,O75M de NaCl (BBS) foi adicionada a cada reservatório de uma placa microtiter” (Dynatech Immulon 2 Removawell Strips). A placa foi incubada a 4° C durante a noite numa câmara húmida, depois do que, a solu ção de proteína foi removida e os reservatórios lavados 3 vezes com BBS contendo 0,02$ de Triton X-100 (BBST), Para evitar a ligação não específica, os.reservatórios foram revestidos com BSA por adição de 100 microlitros de uma solução de 5 mg/ml de BSA em BBS seguida por incubação à temperatura ambiente durante 1 hora, depois do que o excesso de solução de BSA foi re movido. Os polipéptidos nos reservatórios revestidos foram fei tos reagir com anticorpos anti-NANB^_^_^ adicionando 1 micrograma de anticorpo/reservatório, e incubando as amostras durante 1 hora a 37° C· Depois da incubação,a solução em excesso foi removida por aspiração, e os reservatórios foram lavados 5 vezes com BBST. A ligação do anti-NANB^ aos polipéptidos de fusão foi determinada pela ligação do IgG anti-humano de car π o c neiro F’(ab)2 classifioado ³I aos reservatórios revestidos. Partes aliquotas de 100 microlitros da sonda classificada (acti vidade específica 5-20 microcuries/micrograma) foram adicionadas a cada reservatório, e as placas foram incubadas a 37° C durante 1 hora, seguindo-se a remoção do excesso de sonda por aspiração, e 5 lavagens com BBST, À quantidade de radioactivi. dade ligada em cada reservatório foi determinada por contagem num contador que detecta a radiação gama.

Os resultados da reactividade imunológioa de C100 com anti-NANB₅_₁_₁ purificado, quando comparados com os do NANB^·^ com os anticorpos purificados estão representados na Tabela 3.

TABELA 3

Reactividade Imunológioa de C100-3 comparada com NANB^__{1 1} por Radio-imunoensaio

RIA (cpm/ensaio)

AG(ng)	400	320	240	l60	60	0
nanb₅_i-i	7332	6732	4954	4050	. 3051	57
C100-3	7450	6985	5920	5593	4096	67

Os resultados na Tabela 3 mostram que o anti-ΝΑΝΒ^ ι i reconhece um (uns) epítope(s) na metade C100 do polipéptido C100-3, Assim os NANB^ e C100 repartem um (uns) epítope(s) comum(uns), Os resultados sugerem que a sequência cDNA codificando este(s) epítope(s) NANBV é uma que está presente tanto no clone 5-1-1 como no clone 81,

150 IV.Η, Caracterização de HCV

IV.Η·1. Caracterização da Fibrosidade do Gflnoma HCV genoma HCV foi caracterizado em relação à sua fibrosidade por isolamento da fracção de ácido nucleico proveniente de partículas capturadas sobre esferas de poliestireno revestidas com o anticorpo anti-NANB^ p ^θ determinan do se o ácido nucleico hibridado com mais e/ou menos fibras de HCV cDNA,

As partículas foram capturadas a partir de pla_s ma de chimpanzé infectado com HCV utilizando esferas de poliestireno revesti das com o anticorpo anti-NANB„ . _n imunopurifiçado como des5-1-1 crito na Secção IV.F.l, 0 componente de ácido nucleico das partículas foi libertado utilizando o método descrito na Secção IV,F,2. Partes alíquotas do ácido nucleico genómico isola do equivalente a 3 ^ml^s d® plasma de elevado título foram de_i tadas sobre filtros de nitrocelulose. Como controles, partes alíquotas de HCV cDNA desnaturado provenientes do clone 81 (2 picogramas) foram também deitadas sobre os mesmos filtros. Os filtros foram sondados com uma mistura de mais ou uma mistura 32 de menos fibras classificada p de DNA de fibra simples clonado a partir de HCV cDNAs; os cDNAs foram extirpados dos cl£ nes 40b, 81, e 25c.

As sondas com fibra única foram obtidas por extir pamento dos HCV cDNAs dos clones 81, 40b, e 25c com EcoRl, e clonando os fragmentos de cDNA em vectores M13, mpl8 e mpl9 / Messing (1983J.7· Os clones M13 foram sequenciados para determinar se os mesmos continham as fibras mais ou menos

151 foi do DNA proveniente dos, HCV cDNAs. 0 sequenciamento efectuado pelo método de terminação de cadeia dideoxi de Sanger et al. (1977).

Cada um de um jogo de filtros em duplicado conten do partes alíquotas do genoma de HCV isolado proveniente das partículas capturadas foi hibridado com sondas quer de fibra . mais_f quer de fibras menos derivadas do HCV cDNAs.

A Fig. 41 mostra as autoradiografias . obtidas a partir da sondagem do genoma NANBV com a mistura de sondas derivadas dos clones 81, 40b, e 25c, Esta mistura foi utilizada para au mentar a sensibilidade do ensaio de hibridação. As amostras no painel I foram hibridadas com a mistura de sonda de fibara mais. As amostras no painel II foram sondadas por hibridação com a mistura de sonda de fibra menos. A composição das amostras nos painéis da imunomancha estão apresentados na tabela 4.

Tabela 4

A B

Passagem genoma HCV *

------- x

X cDNA 81

-------- cDNA 81 x é uma amostra não descrita.

Como se vê a partir dos resultados indicados na Fig, 4l, apenas a sonda DNA de fibra menos hibrida com 0 geno

- 152 -

ma HCV isolado. Esto resultado, em combinação com o resultado mostrando que o genoma e sensível a RNase e não a DNase (Ver Secção IV.C.2,), sugere que o genoma do NANBV é RNA fibrado positivo.

Estes dados, e dados provenientes de outros lab£ ratórios respeitantes a propriedades físico-químicas de um NANBV(s) putativo, são compatíveis com a possibilidade de o HCV ser um membro do Flaviviridae. Todavia, a possibilidade de o HCV representar uma nova classe de agente virai não foi eliminada.

IV,H.2. Detecção de Sequências em Partículas Capturadas Que

Quando Ampliadas por PCR Hibridam para HCV cDNA Derivado do Clone 81

RNA nas partículas capturadas foi obtido como descrito na Secção IV.H.l. A análise para as sequências que hibridam para o HCV cDNA derivado do clone 81 foi realizada utilizando o processo de ampliação. PCR, como descrito na Se£ ção IV,C.3, excepto em que a sonda de hibridação foi um oligonucleétido cinestizado derivado da sequencia do clone 81 cDNA. Os resultados mostraram que as sequências ampliadas que bibridaram com q clone 81 derivaram da sonda HCV cDNA.

IV.H.3. Homologia entre a Proteína Não-Estrutural de Dengue Flavivirus (MNVWVDl) e Polipéptidos de HCV Codificados pela ORF combinada dos clones 14i a 39c

Os HCV cDNAs combinados de clones l4i a 39c contêm uma ORF contínua, como mostrado na Fig, 26, 0 polipéptido

153 codificado na mesma foi analisado para homologia de sequência com a região do(s) polipéptido(s) não-estrutural(ais) em Dengue Flavivirus (MNWVDl), A análise utilizou a base de dados da proteína Dayhoff, e foi realizada num computador. Os resultados estão indicados na Fig. 42, em que o símbolo (s) indica uma homologia exacta, e o símbolo (.) indica uma subs. tituição conservadora na sequência; as linhas tracejadas indi cam espaços inseridos na sequência para realizar as homologias maiores. Como se vê na figura, existe homologia signifl. cativa entre a sequência codificada no HCV cDNA e o(s) polipéptido (s) não-estrutural(ais) do vírus Dengue. Além da homologia representada na Fig. 42, a análise do segmento de polipéptido codificado numa região na direcção do final 3' do cDNA também continha sequências que são homólogas das sequências na polimerase de Dengue. Como consequência verifica-se que a sequência canónica Gly-Asp-Asp (GDD), embora seja essencial pa ra polimerases de RNA, RNA- dependentes está contida no polipóptido codificado em HCV cDNA, num local que ó compatível com o do vírus Dengue 2. (Dados não mostrados).

IV.H.4. 0 HCV-DNA ó Não-Detectável em Tecido Infectado com

NANBH

Dois tipos de estudos proporcionaram resultados sugerindo que o HCV-DNA não ó detectável em tecido provenien te de um indivíduo com NANBH. Estes resultados, em conjunto com aqueles descritos em IV.C e IV.H.l. e IV.H,2 proporcionam a evidência de que o HCV não ó um vírus contendo DNA, e que esta replicação não envolve cDNA,

- 154 -

XV.Η.4.a. Processo de Produção de Manchas a Sul

A fim de determinar se o fígado de chimpanzé infectado com NANBH contém HCV-DNA detectável (ou HCV-cDNA), fragmentos de enzima de restrição de DNA isolados desta fonte foram manchados a Sul, e as manchas sondadas com HCV cDNA classificado p. Os resultados mostraram que o HCV cDNA clajs sificado não hibridou para o DNA manchado a partir do fígado de chimpanzé infectado. 0 mesmo também não hibridou para controlar o DNA manchado, a partir do figado de um chimpanzé normal. Em contraste, num controle positivo, uma son da classificada do gene beta-interferon hibridou fortemente pa ra manchas a Sul do enzima de restrição de DNA de placenta humana macerada. Estes sistemas foram concebidos para detectar uma única cópia do gene que era para ser detectada com a sonda classificada.

Os DNAs foram isolados a partir de fígados de dois chimpanzés com NANBH. Os DNAs de controle foram isolados do fígado de chimpanzé não-infectado, e a partir de placentas humanas. 0 processo para extrair DNA foi essencialmente de acordo com Maniatis et al. (1982), e as amostras de DNA foram tratadas com RNAse durante o processo de isolamento.

Cada amostra de DNA foi tratada quer com EcoRI, Mbol, quer com HincII (l2 microgramas), de acordo com as indd. cações do fabricante. Os DNAs macerados foram submetidos a electroforese sobre gels de agarose neutrais a 1#, manchados a Sul sobre nitrocelulose, e o material manchado hibridado com a sonda cDNA traduzida por incisão, apropriada, (3xl0⁶ cpm/ml de mis- I55 tura de hibridação), 0 DNA proveniente de fígado de chimpanzé infectado e de fígado normal foram hibridados com HCV cDNA classificado ^J p, a partir dos clones 36 mais 81; o DNA proveniente de placenta humana foi hibridado com DNA classi32 ficado ^J p,a partir do gene beta-interferon, Depois da hibridação, as manchas foram lavadas sob condições rigorosas, isto é, com uma solução contendo 0,1 x SSC, 0,1$ SDS, a 65° C.

gene DNA beta-interferon foi preparado como descrito por Houghton et al. (ΐ9θΐ).

IV,Η,4.b, Ampliação pela Técnica PCR

A fim de determinar se o HCV-DNA pode ser dete£ tado no fígado a partir de chimpanzés com NANBH, o DNA foi isolado do tecido, e submetido à técnica POR de ampliação-detecção utilizando primários e polinucleotidos de sonda deriva dos de HCV cDNA provenientes do clone 81. Os controles negati vos foram amostras de DNA isolados a partir de células de cuj. tura de tecido HepG2 não infectadas, e a partir presumivelmen te de placenta humana não infectada. Os controles positivos foram amostras dos DNAs de controle negativos às quais uma quantidade relativamente pequena conhecida (250 moléculas) do suplemento HCV cDNA proveniente do clone 81 foi adicionada.

Além disso, para confirmar que as fracções RNA isoladas a partir dos mesmos fígados de chimpanzés com NANBH continham sequências complementares da sonda HCV-cDNA, o sijs tema PCR de ampliação-detecção foi também utilizado sobre as amostras de RNA isoladas.

Nos estudos, os DNAs foram isolados pelo proce£

- 156 so descrito na Secção IV.H.4.a, e os RNAs foram extraídos es sencialmente como descrito por Chirgwin et al. (ΐ9θΐ).

Amostras de DNA foram isoladas a partir de 2 fí gados de chimpanzé infectados, provenientes de células HepQ2 não infectadas, e de placenta humana. Um micrograma de cada DNA foi macerado com HindIII, de acordo com as indicações do fabricante. As amostras maceradas foram submetidas a ampliação e detecção PCR para HCV cDNA ampliado essencialmente como descrito na Secção IV.C.3, excepto em que a fase de trans criptase inversa foi omitida. Os primários PCR e a sonda eram provenientes de HCV cDNA clone 8l, e estão descritos na Secção IV.C,3.. Antes da ampliação, para controles positivos, uma amostra de um micrograma de cada DNA foi eriçada” pela adição de 250 moléculas de suplemento HCV cDNA isoladas a partir do clone 81.

A fim de determinar se as sequências HCV estavam presentes no RNA isolado a partir dos fígados de chimpanzés com NANBH, amostras contendo 0,4 microgramas do RNA total foram submetidas ao processo de ampliação essencialmente como descrito na Secção IV.C,3., excepto em que a transcriptase in versa foi omitida a partir de algumas das amostras como um con trole negativo. Os primários de PCR e a sonda eram provenientes de HCV cDNA clone 81, como descrito acima.

Os resultados.mostraram que as sequências amplia das complementares da sonda HCV cDNA não foram detectáveis nos DNAs provenientes de fígado de chimpanzé infectado, pem foram os detectáveis nos controles negativos. Em contraste, quando

157 as amostras, incluindo o DNA proveniente de fígado de chimpanzé infectado, foram eriçadas” com o HCV cDNA antes da ampliação, as sequências do clone 81 foram detectadas em todas as amostras de controle positivo. Além disso, nos estudos de RNA, as sequências ampliadas de HCV cDNA clone 8l foram detectadas apenas quando foi utilizada a transcriptase inversa, sugerindq fortemente que os resultados não foram devidos a uma contaminação de DNA.

Estes resultados mostram que os hepatocitos pr£ venientes de chimpanzés com NANBH não contêm, ou contêm apenas níveis indectáveis de HCV DNA. Com base no estudo do eri çamento, se o HCV DNA estiver presente, o mesmo está a um ní^ vel multo abaixo de 0,06 cópias por hepatocito. Em contraste, as sequências do HCV no RNA total proveniente das mesmas amos tras de fígado foram facilmente detectadas com a técnica PCR.

IV.X. Determinações ELISA para Infecçâo HCV Utilizando HCV clOO-3 como Antigene de Teste

Todas as amostras foram ensaiadas utilizando o

HCV cl00-3 ELISA. Este ensaio utiliza o antigene HCV cl00-3 (que foi sintetizado e purificado como descrito na Secção IV,B,5), e uma peroxidase de rábano (HRP) conjugado de IgG anti-humano monoclonal de rato.

Placas revestidas com o antigene HCV cl00-3 foram preparadas como segue,' Uma solução contendo tampão de r£ vestimento (50 mM de borato de Na, pH 9,0), 21 ml/placa, BSA (25 microgramas/ml), cl00-3 (2,50 microgramas/ml) foi prepara

V, da precisamente antes da adição às placas Removeawell Immulon I (Dynatech Corp.). Depois de se misturar durante 5 minutos, 0,2 ml/reservatório da solução foi adicionado às placas, as mesmas foram cobertas e incubadas durante 2 horas a 37° C, depois do que a solução foi removida por aspiração. Os reservatórios foram lavados uma vez com 400 microlitros de Wash Buffer (tampão de lavagem) (100 mM de fosfato de sódio, pH 7,4, l40 mM de cloreto de sódio, 0,1% (p/v) de caseína, 1% (p/v) de Triton x-100, 0,01% (p/v) de Thimerosal), Depois da remoção da solução de lavagem, 200 microlitros/reservatório de solução de Postcoat (10 mM de fosfato de sódio, pH 7,2,

150 mM de cloreto de sódio, 0,1% (p/v) de caseína e 2mM de fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSF) foram adicionados, as placas foram cobertas livremente para evitar a evaporação, e fjo ram deixadas repousar à temperatura ambiente durante 30 minu tos. Os reservatórios foram então aspirados para remover a solução, e liofilizados a seco durante a noite, sem aquecimento em prateleira. As placas preparadas podem ser armazena das a 2-8° C em bolsas de alumínio vedadas,

A fim de realizar a determinação ELISA, 20 microlitros de amostra de soro ou amostra de controle foram adi cionados a um reservatório contendo 200 microlitros de amostra de diluente (100 mM de fosfato de sódio, pH 7,4, 500 mM de cloreto de sódio, 1 mM de EDTA, 0,1% (p/v) de caseína, 0,015 (p/v) de Therosal, 1% (p/v) de Triton X-100, 100 micr£ gramas/ml de extracto de levedura). As placas foram seladas, e incubadas a 37° C durante duas horas, depois do que a solu ção foi removida por aspiração, e os reservatórios foram la159 vados com 4-00 microlitros de tampão lavado (salmoura de fosfato tamponada (PBS) contendo 0,05$ de Tween 20). Os reserva tórios lavados foram tratados com 200 microlitros de conjuga do IgG-HRP anti-humano de rato .contido numa solução de conju gado Ortho diluente (10 mM de fosfato de sódio, pH 7»2, 150 mM de cloreto de sódio, 5θ$ (v/v) d® soro de bovino fetal, 1$ (v/v) de soro de cavalo tratado pelo calor, 1 mM K^Fe(CN)^,

0,05$ (p/v) de Tween 20, 0,2$ (p/v) de Thimerosal). 0 tratamento foi efectuado durante 1 hora a 37° C, a solução foi re movida por aspiração, e os reservatórios foram lavados com tampão de lavagem que foi também removido por aspiração. Para determinar a quantidade dé conjugado de enzima de ligação,

200 microlitros da solução de substrato (10 mg de dicloridrato de 0-fenilenodiamina por 5 ml de solução de Revelador) foram adicionados. A solução de Revelador contém 50 mM de citra to de sódio ajustada ao pH 5,1 com ácido fosfórico, e 0,6 microlitros/ml de H₂0₂ a 30$· As placas contendo a solução de substrato foram incubadas no escuro durante 30 minutos à tem peratura ambiente, as reacções foram paradas pela adição de 50 microlitros/ml de ácido sulfúrico 4N, e os ODs determinado s.

Os exemplos abaixo proporcionados mostram que a placa microtiter descreening ELISA que utiliza o antigene HCV clOO-3 tem um elevado grau de especificidade, como evidencia do pela proporção inicial de reactividade de cerca de 1$, com uma proporção reactiva de repetição de cerca de 0,5% sobre dadores ao aca so. 0 ensaio e capaz de detectar uma imuno-resposta tanto na fase pós aguda da infecção, como durante a fase crónica da doença. Além disso, o ensaio é capaz de detectar algumas amostras que contam negativamente nos testes substitutos para NANBH; estas amostras provêm de indivíduos com uma história de NANBH, ou de dadores implicados na transmissão de NANBH,

Nos exemplos descritos abaixo, são utilizadas as abreviaturas seguintes:

ALT	Transferase de amino alanina
Anti-HBc	Anticorpo contra HBc
Anti-HBsAg	Anticorpo contra HBsAg
HBc	Antigene de núcleo de Hepatite B
ABsAg	Antigene de superfície de Hepati te B
IgG	Imunoglobulina G
IgM	Imunoglobulina M
IU/L	Unidades Internacionais/Litro
NA	Não disponível
NT	Não testado
N	Tamanho da amostra
Neg	Negativo
OD	Densidade éptica
Pos	Positivo
s/co	Sinal/cutoff
SD	Desvio padrão
X	Média ou meio
WNL	Dentro dos limites normais

IV.I.1. Infecção de HCV numa População de Dadores de Sangue ao Acaso

Um grupo de I.O56 amostras (soros frescos) provenientes de dadores de sangue ao acaso foi obtido a partir do Irwin Memorial Blood Bank, São Francisco, Califórnia.

Os resultados do teste obtidos com estas amostras estão resumidos num histograma mostrando a distribuição dos valores OD (Fig. 43). Como se vê na Fig. 43, 4 amostras lêem-se >3, 1 amostra lê-se entre 1 e 3» 5 amostras lêem-se entre 0,4 e 1, e as restantes 1,046 amostraslêem-se <0,4 com mais de 90$ destas amostras lendo-se <0,1,

Os resultados sobre as amostras reactivas ao acaso são apresentados na Tabela 5« Utilizando um valor eut-off igual a metade mais 5 desvios padrão, dez amostras fora das 1,056(0,95%) foram inicialmente reactivas. Destas, cin co amostras (0,47%) repetiram-se como reactivas quando as mesmas foram ensaiadas uma segunda vez utilizando a ELISA. A Ta bela 5 mostra também a ALT e o estado do Anti-HBd de cada uma das amostras reactivas repetidamente. De interesse part^L cular e o facto de todas as cinco amostras reactivas repetidas serem negativas em ambos os testes substitutos para NANBH, enquanto houver a numeração positiva no HCV ELISA.

162

TABELA 5

RESULTADOS SOBRE AMOSTRAS REACTIVAS AO ACASO

N = 1051 x = 0,049*

SD = + 0,074

Cut-off: x +	5SD = 0,419 (o,4oo +	Controle	Negativo)
Amostras	Reagentes Iniciais OD	Reagentes Repetidos OD	JKK ALT (IU/L)	Anti HBc*** (OD)
4227	0,462	0,084	NA	NA
6292	0,569	0,294	NA	NA
6188	0,699	0,326	NA	NA
6157	0,735	0,187	NA	NA
6277	0,883	0,152	NA	NA
6397	1,567	1,392	30,14	1,433
6019	>3,000	>3,000	46,48	1,057
6651	> 3,000	>3,000	48,53	1,343
6669	>3,000	>3,000	60,53	1,165
4003	>3,000	3,000	WNL	Negativo

10/1056=0,95$ 5/1056 = 0,47$ *Leituras de amostras >1,5 não foram incluídas no cálculo deMeane SD.

**ALT > 68 IU/L está acima dos limites normais.

***Anti-HBc < 0,535 (ensaio de competição) é considerado positivo.

W WWW

WNL: Dentro dos limites normais

- 163 IV,I.2, Amostras de Soro de Chimpanzé

Amostras de soro de onze chimpanzés foram testa das com o HCV cl00-3 ELISA, Quatro destes chimpanzés foram infectados com NANBH prov.eniente de uma porção contaminada de Factor VIII (presumivelmente estirpe Hutchinson), seguindo um processo estabelecido numa colaboração com o Dr. Daniel Bradley nos Centros para Controle da Doença. Como controles, quatro outros chimpanzés foram infectados com HAV e três com HBV, Amostras de soro foram obtidas em diferentes momentos de pois da infecção.

Os resultados, que estão resumidos na Tabela 6, mostram a sero-conversão do anticorpo, documentada em todos os chimpanzés infectados com a estirpe Hutchinson de NANBH. Seguindo a fase aguda de infecção (como evidenciado pela elevação significativa e subsequente retorno ao normal de níveis de ALT), anticorpos para HCV cl00-3 tornaram-se detectáveis nos soros dos chimpanzés infectados com NANBH em 4/4. Estas amostras tinham anteriormente sido mostradas, como discutido na Secção IV.B,3. como sendo positivas por uma análise Ocidental, e por um RIA. Em contraste, nenhum dos Chimpanzés de controle que tinha sido infectado com HAV ou HBV mostrou a evidência de reactividade na ELISA

TABELA 6

	AMOSTRAS	DE SORO DE	CHIMPANZÉ
OD	S/CO	Data de 1 Inoculaçã	Data de 0 Sangria	ALT (IU/L)	Ino cu lados
Controle 0,001 Negativo
Controle 1,504 Positivo
Cutoff’' 0,401
Chimp, 1 -0,007	0,00	24/05/84	24/05/84	9	NANB
0,003	0,01		07/08/84	71
7-3,000	77,48		18/09/84	19
>3,000	-7 7,48		24/10/84	—
Chimp, 2	—	O7/o6/84	—	—	NANB
-0,003	0,00		31-05/84	5
-0,005	0,00		28/06/84	52
0,945	2,36		20/08/84	13
z3,ooo	77,48		24/10/84	—
Chimp, 3 0,005	0,01	14/03/85	14/03/85	8	NANB
0,017	0,04		26/04/85	205
0,006	0,01		06/05/85	14
1,010	2,52		20/08/85	6
Chimp, 4-0,006	0,00	11/03/85	H/03/85	11	NANB
0,003	0,01		09/05/85	132
0,523	1,31		06/06/85	—
1,574	3.93		OI/O8/85	—
Chimp.5 -0,006	0,00	21/11/80	21/11/80	4	HAV

- 165 -

TABELA 6 (Cont.)

		Data de	Data de	ALT	Inocu
OD	s/co	Inoculação	Sangria		laçâo
Chimp. 5 0,001	0,00		16/12/80	147
0,003	0,01		3O/12/8O	18
0,006	0,01		29/07-21/08/81	5
Chimp. 6 ---	—	25/05/82'	—	—	HAV
-0,005	0,00		17/05/82	—
0,001	0,00		10/06/82	106
-0,004	0,00		06/07/82	10
0,290	0,72		01/10/82	—
Chimp. 7 -0,008	0,00	25/05/82	25/05/82	7	HAV
-0,004	0,00		17/06/82	83
-0,006	0,00		16/09/82	5
0,005	0,01		09/10/82	—
Chimp. 8 -0,007	0,00	21/11/80	21/H/8O	15	HAV
0,000	0,00		16/12/80	130
0,004	0,01		03/02/81	8
0,000	0,00		O3/O6-IO/O6/8I	M
Chimp. 9 ---	— ·*·	24/07/80	—	—	HBV
0,019	0,05		22/08-10/10/79	—
—	—		II/03/8I	57
0,015	o,o4		01/07-05/08/81	9
0,008	0,02		01/10/81	6
Chimp. 10 -—	—	12/05/82	—	—	HBV
0,011	0,03		21/04-12/05/82	9

166 TABELA 6 (Cont.)

	OD	’ s/co	Data de Data de Inoculação Sangria	ALT Inocu (IU/L) lação
Chimp.10	0,015	0,04	01/09-08/09/82	126
	0,008	0,02	02/12/82	9
	0,010	0,02	06/01/83	13
Chimp.ll	—	—	12/05/82	--- HBV
	. 0,000	0,00	06/01-12/05/82	11
	—	—	23/06/82	100
	-0,003	0,00	09/06-07/07/82	—
	-0,003	0,00	28/10/82	9
	-0,003	0,00	20/12/82	10

167 -

IV.I.3. Painel 1: Soros Infecciosos Provados Provenientes de

Portadores de NANBH Humanos Crónicos

Um painel codificado consistiu em 22 amostras simples, cada uma em duplicado, para um total de 44 amostras. As amostras eram provenientes de soros infecciosos provados a partir de transportadores de NANBH crónicos, soros infecciosos provenientes de dadores implicados, e soros infecciosos provenientes de pacientes com NANBH em fase aguda. Além disso, as amostras eram provenientes de controles negativos altamente puros, e outros controles de doença. Este painel foi pr<3 porcionado pelo Dr, H. Alter do Departamento de Saúde e Serviços Humanos, Institutos Nacionais de Saúde, Bethesda, Marilândia. 0 painel foi construído pelo Dr. Alter há vários anos, e tem sido utilizado pelo Dr. Alter como um painel de qualifica ção para ensaios de NANBH putativa.

painel total foi ensaiado duas vezes com o ensaio ELISA, e os resultados foram enviados ao Dr, Alter para serem anotados. Os resultados estão apresentados na Tabela 7.

Embora a Tabela se refira a resultados de apenas um jogo de du plicados, os mesmos valores foram obtidos para cada uma das amostras em duplicado.

Como se mostra na Tabela 7» 6 soros que pro varam ser infecciosos num modelo de chimpanzé foram fortemente positivos. 0 sétimo soro infeccioso correspondeu a uma amostra para um caso de NANBH aguda, e não foi reactivo na ELISA. Uma amostra proveniente de um dador implicado tanto como ALT normal como com resultados equívocos nos estudos com chimpanzé

168 foi não-reactiva no ensaio. Tres outras amostras de série pro venientes de um indivíduo com NANBH aguda foram também não-reactlvas. Todas as amostras que vieram de controles negativos altamente puros, obtidos a partir de dadores que tinham pelo menos 10 doações de sangue sem implicação de hepatite, fo.· ram não-reactivas na ELISA. Finalmente, quatro das amostras testadas tinham previamente sido marcadas como positivas em en saios de NANBH putativos desenvolvidos por outros, mas estes ensaios não foram confirmáveis. Estas quatro amostras foram marcadas negativamente com a ELISA HCV.

- 169 TABELA 7

PAINEL 1 de H, ALTER:

	Painel	19 Resul- tado	22 Resul tado
1)	Prova Infecciosa por Transmissão de Chimpanzé A, NANB Crónico: Pés-Tx JF	+	+
	EB	+	+
	PG	+	+
	B, Dadores Implicados com ALT Elevado BC	+	+
	JJ	+	+
	BB	+	+
	C, NANB Agudos Pés-Tx WII	*
2)	Equivocamente infeccioso por Transmissão de Chimpanzé A, Dador Implicado com ALT Normal CC
3)	NANB Agudos Pés -Tx JL 1 Semana	«»
	JL 2 Semanas	-	-
	JL 3 Semanas	-	-
	Controles de Doença A, Cirrose Biliar Primária EK
	B, Hepatite Alcoéiica em Recuperação IIB	—
5)	Controles Negativos Registados DM
	DC	-	-
	LV	-	-
	ML	-	-
	AII	-	-
6)	Antigenes” NANB potenciais JS-80-01T-0 (Ishida)
	Asterix (Trepo)	-	-
	Zurtz (Arnold)	-	-
	Becassdine (Trepo)	-	-

170

O

IV.I.4. Painel 2: NANBH Dador/Receptor painel codificado consistiu em 10 casos inequívocos de dador/receptor de transfusão de NANBH associada, com um total de 188 amostras. Cada caso consistiu em amostras de alguns ou de todos os dadores para o receptor e de amostras em serie (colhidas 3» ó e 12 meses depois da transfusão) prove( nientes do receptor. Também incluída foi uma sangria prévia, colhida do receptor antes da transfusão. 0 painel codificado foi proporcionado pelo Dr. H, Alter, a partir de NXH, e os rç? sultados foram enviados para ele para marcação.

Os resultados, que estão sumarizados na Tabela 8, mostram que a ELISA detectou seroconversão de anticorpo em de 10 casos de transfusão associada com NANBH. Amostras pr£ venientes do caso 4 (em que não foi detectada seroconversão) reagiram compativelmente de maneira pobre na ELISA. Duas das amostras de receptores foram reactivas 3 meses depois da transfusão. Aos seis meses, 8 amostras de receptores foram reac tivas; e aos 12 meses, com a excepção do caso 4, todas as amostras foram reactivas. Além disso, pelo monos um dador positivo de anticorpo foi encontrado em 7 fora dos 10 casos, tendo o caso 10 dois dadores positivos. Também, no caso 10, a pré-sangria de receptores foi positiva para anticorpos HCV. A sangria de um mes proveniente deste receptor foi gotejada para níveis de reacção fronteiriços, enquanto a mesma foi eleva da para positiva a sangrias de 4 e 10 meses. Geralmente, um S/CO de 0,4 é considerado positivo. Assim, este caso pode r£ presentar uma infecção anterior do indivíduo com HCV.

171 Amostras do estado ALT e HBc para todos os reactivos, isto e, positivo, estão sumarizadas na Tabela 9. Como se vê na Tabela, amostras de 1/8 de dador foram negativas para os marcadores substitutos e reactivos na ELISA de anticorpo HCV. Por outro lado, as amostras de recep tor (seguidas ate 12 meses depois da transfusão) tinham quer ALT elevado, Anti-HBc positivo, ou ambos.

172 TABELA 8

PAINEL DADOR/RECIPIENTE DE NANB

PAINEL H, ALTER DADOR/RECIPIENTE DE NANB

RECIPIENTE · POS-TX

CASO DADOR PRE-SANGRIA 3 MESES 6 MESES 12 MESES

	JHL	SZC£L	JU	SZ£Q	JL.	,M2	_2SL_ ·		00	S/CO
1 .			.032	0.07	.112	0.26	>3.000	>6.96	>3.000	>6.96
2.	---	—	.059	0,14	.050	0.12	1.681	3.90	>3.000	>6.96
3.	,403	0.94	.049	0.11	,057	0.13	>3.000	>6.96	>3.000	>6.96
4.	---	___	.065	0.15	.073	0.17	.067	0.16	.217 ,	0.50
5.	>3.000	>6.96	.034	0.08	,096	0.22	>3.000	>6.96	>3.000	>6.96
6.	>3.000	>6.96	.056	0.13	1.475	3.44	>3.000	>6.96	>3.000	>6.96
7.	>3.000	>6.96	.034	0.08	.056	0.13	>3.000	>6.96	>3.000	>6.96
8.	>5.000	>6.96	.061	0.14	: .078	0.18	2.262	5.28	>3.000	>6.96
9,	>3.000	>6.96	.080	0.19	.127	0,30	.055	0.13	>3.000	>6.96
10.	>3.000	>6.96	>3.000	>6.96	.517’	0.74	>3.000”	>6.96	>3.000··’	>6.96

>5.000 >6.96 *1 Mês, Meses, ***10 Meses

173

TABELA 9

ESTADO ALT E HBc PARA, AMOSTRAS REACTIVAS NO

PAINEL 1 DE H. ALTER

Amostras_Anti-ALT*HBc**

Dadores

Caso 3	Normal	Negativo
Caso 5	Elevado	Positivo
Caso 6	Elevado	Positivo
Caso 7	Não disponível	Negativo
Caso 8	Normal	Positivo
Caso 9	Elevado	Não disponível
Caso 10	Normal	Positivo
Caso 10	Normal	Positivo

Recipientes

Caso	1 12	6 mo Elevado	Elevado Não testado	Positivo
Caso	2 12 mo	6 mo Elevado	Elevado Não testado	Negativo
Caso	3 12 mo	6 mo Elevado	Normal Não testado	j *** Não testado
Caso	5 12 mo	6 mo Elevado	Elevado Não testado	Não testado
Caso	6 6 mo 12 mo	3 mo Elevado Elevado	Elevado Negativo Não testado	Negativo
Caso	7	6 mo	Elevado	Negativo
	12 mo	Elevado	Negativo
Caso	8 12 mo	6 mo Elevado	Normal Não testado	Positivo
Caso	9	12 mo	Elevado	Não testado
Caso	10 10 mo	4 mo Elevado	Elevado Não testado	Não testado
	ALT > 45	IU/l está	acima 'dos limites	normais.

Anti-HBc < 50$ (ensaio dé competição) é considerado positivo Pré-Sangria e 3 amostras mo foram negativas para HBc.

174

IV,I,5. Determinação da Infecçao HCV em Amostras de Grupo de

Alto Risco

Amostras provenientes de grupos de alto risco foram controladas utilizada a ELISA para determinar a reactividade para o antigene HCV cl00-3· Estas amostras foram obtidas a partir do Dr, Gary Tegtmeier, Community Blood Bank, Kan sas City, Os resultados estão sumarizados na Tabela 10.

Como está mostrado na tabela, as amostras com ¹ a reactividade mais elevada são obtidas a partir de hemofílicos (76$). Além disso, amostras provenientes de indivíduos com ALT elevado e positivos para Anti-HBc, marcados 51$ reactivos, um valor que é compatível com o valor esperado a partir de dados clínicos e prevalência de NANBH neste grupo, A incidência de anticorpo para HCV foi também mais elevada em dadores de sangue com apenas ALT elevado, dadores de sangue positivos para anticorpos para núcleo de Hepatite B apenas, e em dadores de sangue rejeitados por razões diferentes de elevado ALT ou anticorpo anti-núcleo quando comparados com dadores voluntários ao acaso.

5 TABELA 10

AMOSTRAS DE GRUPOS DE ALTO RISCO COM NANBH

ORUPO		N	Distribuição N OD	de Reagente
ALT Elevado		35	3	>3,ooo	11,4%
	1	0,728
Anti-HBc		24	5	>3,000	20,8%
ALT elevado, Anti-HBc		33	12	>3,000	51,5%
	1	2,768
	1	. 2,324
	1	'0,939
	1	o,95l
	1	0,906
Dadores Regeitados		25	5	->3,000	20,0%
Dadores com História	de	150	19	>3,000	14,7%
Hepatite
•	1	0,837
	1	0,714
	1	0,469

Hemofílicos

31 >3,000 76,0%

2,568

2,483

2,000

1,979

1,495 ·

1,209

0,819

- 176

IV.I.6 Estudos Comparativos Utilizando Anticorpos Monoclonais

Anti-IgG ou Anti-IgM, ou Anticorpos Policlonais como um Segundo Anticorpo no HCV clOO-3 ELISA

A sensibilidade da determinação ELISA que utiliza o conjugado monoclonal anti^igG foi comparada com a obtida pela utilização quer do conjugado monoclonal anti-IgM, quer substituindo ambos com um antisoro policlonal reportado para ser, tanto de cadeia pesada como leve,específica. Foram realiza dos os seguintes estudos.

IV,I.6,a, Amostras de Série Provenientes de Seroconversores

Amostras de serie provenientes de três casos de seroconversores NANB foram estudadas no ensaio HCV clOO-3 ELISA utilizando no conjugado de enzima quer o monoclonal anti-IgG isoladamente, quer em combinação com um monoclonal anti-IgM, quer utilizando um antisoro policlonal. As amostras foram proporcionadas pelo Dr, Cladd Stevens, N.Y. Blood Center, N.Y.G., N.Y.. As histórias da amostra estão apresentadas na Ta bela 11.

Os resultados obtidos utilizando um conjugado an ticorpo-enzima monoclonal anti-IgG estão apresentados na Tabela

12. Os dados mostram que uma reactividade forte e inicialmente detectada nas amostras 1-4, 2-8, e 3-5» dos casos 1, 2,e 3 respectivamente .

Os resultados obtidos utilizando uma combinação de um conjugado monoclonal anti-IgG e um conjugado anti-IgM e.s tão apresentados na Tabela 13. Três diferentes proporções de

177 anti-IgG para anti-IgM foram testadas; a diluição de 1:10.000 de anti-IgG foi constante em todas. As diluições testadas para o conjugado monoclonal anti-IgM foram de 1:30.000 , 1:60.000, e 1 :120.000, Os dados mostram que, de acordo com os estudos com anti-IgG isolado, uma forte reactividade inicial é detectada nas amostras 1-4, 2-8, e 3-5·

Os resultados obtidos com a ELISA utilizando o conjugado monoclonal anti-IgG (diluição 1:10,000), ou conjugado policlonal Tago (diluição 1:8θ,θθθ), ou conjugado policlonal Jackson (diluição l:80.000) estão apresentados na Tabela l4. Os dados indicam que uma forte reactividade inicial é detectada nas amostras 1-4, 2-8, e 3-5 utilizando todas as tres configurações; os anticorpos policlonais Tago deram os sinais mais baixos.

Os resultados apresentados acima mostram que to. das as tres configurações detectam amostras reactivas ao mesmo tempo depois da fase aguda da doença (como evidenciado pela elevação ALT). Alem disso, os resultados indicam que a sensibilidade do HCV clOO-3 ELISA utilizando o conjugado monoclonal-enzima anti-IgG é igual, a ou melhor que a obtida utilizan do as outras configurações testadas para o conjugado enzima.

- 178 -

TABELA 11

DESCRIÇÃO DE AMOSTRAS A PARTIR DO PAINEL CLADD

STEVENS

Data HBsAg Anti-HBsAnti-HBc ALT Bilirubina

Caso	1
1-1		5/8/81	1,0	91,7	12,9	4o,0	-1,0
1-2		2/9/81	1,0	121,0	15,1	274,0	ιΛ
1-3		7/10/81	1,0	64,0 1	23,8	261,0	0,9
1-4		19/11/81	1,0	67,3	33,8	75,0	0,9
1-5		15/12/81	1,0	50,5	27,6	71,0	1,0
Caso	2
2-1		19/10/81	1,0	1,0	116,2	17,0	-1,0
2-2		17/11/81	1,0	0,8	89,5	46,0	1,1
2-3		02/12/81	1,0	1,2	78,3	63,0	1,4
2-4		14/12/81	1,0	0,9	90,6	152,0	13
2-5		23/12/81	1,0	0,8	93,6	624,0	1,7
2-6		20/1/82	1,0	0,8	92,9	66 ,0	1,5
2-7		15/2/82	1,0	0,8	86,7	70,0	1,3
2-8		17/3/82	1,0	0,9	69,8	24,0	-1,0
2-9		21/4/82	1,0	0,9	67,1	53,0	1,5
2-10		19/5/82	1,0	0,5	74,8	95,0	1,6
2-11		14/6/82	1,0	0,8	82,9	37,0	-1,0
Caso	3
3-1		7/4/81	1,0	1,2	88,4	13,0	-1,0
3-2		12/5/81	1,0	1,1	126,2	236,0	0,4
3-3		30/5/81	1,0	0,7	99,9	471,0	0,2
3-4		9/6/81	1,0	1,2	110,8	315,0	0,4
3-5		6/7/81	1,0	1,1	89,9	273,0	0,4
3-6		10/8/-81	1,0	1,0	118,2	158,0	0,4
3-7		8/9/81	1,0	1,0	112,3	84,0	0,3
3-8		14/10/81	1,0	0,9	102,5	180,0	0,5
3-9		II/II/8I	1,0	1,0	84,6	154,0	o,3

179

TABELA 12

RESULTADOS ELISA OBTIDOS UTILIZANDO UM CONJUGADO ΑΝΓΙ-Ϊ G

MONOCLONAL

Amostra	Data	ALT	OD	s/ço
Controle Negativo			0,076
Cutoff			0,476
PC (1:128)			1,390
Caso # 1
1-1	5/8/81	40,0	0,178	0,37
1-2	02/09/81	274,0	0,154	0,32
1-3	07/10/81	261,0	0,129	0,27
1-4	19/11/81	75,0	0,937	1,97
1-5	15/12/81	71,0	>3,000	>6,30
Caso Ψ 2
2-1	19/10/81	17,0	0,058	0,12
2-2	17/11/81	46,0	0,050	0,11
2-3	02/12/81	63,0	0,047	0,10
2-4	14/12/81	152,0	0,059	0,12
2-5	23/12/81	624,0	0,070	0,15
2-6	20/01/82	66,0	0,051	0, LI
2-7	15/02/82	70,0	0,139	0,29
2-8	17/03/82	24,0	1,867	3,92
2-9 '	21/04/82	53,0	>3,000	>6,30
2-10	19/05/82	95,0	>3,000	>6,30
2-11	14/06/82	37,0	>3,000	>6,30
Caso =H= 3
3-1	07/04/81	13,0	0,090	0,19
3-2	12/05/81	236,0	0,064	0,13
3-3	30/05/81	471,0	0,079	0,17
3-4	09/06/81	315,0	0,211	0,44
3-5	06/07/8J.	273,0	1,707	3,59
3-6	10/08/81	158,0	>3,000	>6,30
3-7	08/09/81	84,0	>3,000	>6,30
3-8	14/10/81	180,0	>3,000	> 6,30
3-9	11/11/81	154,0	>3,000	>6,30

- 180 TABELA 13

RESULTADOS ELISA OBTIDOS UTILIZANDO CONJUGADOS e ANTI-IgG e ANTI-IGM MONOCLONAIS

ELISAs NANB

Monoclonais	Monoclonais	Monoclonais
IgG lílOK	IgG lílOK	IgG lílOK
IgM 1:3OK	IgM ljóOK	IgM l:120K

Amostra	Data	ALT	OD	S/CO OD	S/CO OD S/CO
Con trole			0,100	0,080	0,079
Negativo
CUTOFF
PC (1:128)			1,083	1,328	1,197
Caso 41=1
1-1	05/08/81	40	0,173	0,162	0,070
1-2	02/09/81	27^	0,194	o,i4i	0,079
1-3	07/10/81	26l	0,162	0,129	0,063
1-4	I9/II/8I	75	0,812	0,85	0,709
1-5	15/12/81	71	>3,00	>3,oo	>3,00
Caso 44 2
2-1	19/10/81	17	0,442	0,045	0,085
2-2	17/11/81	46	0,102	0,029	0,030
2-3	02/12/81	63	0,059	0,036	0,027
2-4	14/12/81	152	0,065	0,041	0,025
2-5	23/12/81	624	0,082	0,033	0,032
2-6	20/01/82	66	0,102	0,042	0,027
2-7	15/02/82	70	0,188	0,068	0,096
2-8	17/03/82	24	1,728	1,668	1,541
2-9	21/04/82	53	>3,00	2,443	>3,00
2-10	19/05/82	95	>3,00	>3,00.	> 3,00
2-11	14/06/82	37	>3,00	>3,00	> 3,00
Caso 41= 3
3-1	07/04/81	13	0,193	0,076	0,049
3-2	12/05/81	236	0,201	0,051	0,038
3-3	30/05/81	471	0,132	0,067	0,052
3-4	09/06/81	315	0,175	0,155	0,140
3-5	06/07/81	273	1,335	1,238	1,260
3-6	10/08/81	158	>3,00	>3,00	>3,00
3-7	08/09/81	84	>3,00	>3,00	>3,00
3-8	14/10/81	180	>3;00	>3,00	> 3,00
3-9	H/ll/81	154	>3,00	>3,00	> 3,00

181

TABELA l4

RESULTADOS ELISA OBTIDOS UTILIZANDO CONJUGADOS POLICIONAIS

ELISAs NAxNB

MONOCLONAL	TAGO	JACKSON
1: 1OK	1: 8OK	líbOK

AMOSTRA	DATA	ALT	OD	s/ço	OD	s/co	OD	s/co
Con trole			0,076		0,045		0,154
Negativo
Cutoff			0,476		0,545		0,654
PC (1:128)				OxlSi		.X5·¹'
Caso 44 1
1-1	05/08/81	40	0,178	0,37	0,067	0,12	0,153	0,23
1-2	02/09/81	274	0,154	0,32	0,097	0,18	0,225	0,34
1-3	O7/IO/81	261	0,129	0,27	0,026	0,05	0,167	0,26
1-4	19/11/81	75	0,937	1,97	0,324	0,60	0,793	1,21
1-5	15/12/81	71	7*3,00	>6,30	1,778	3,27	>3,00	>4,59
Caso 44 2
2-1	19/10/81	17	0,058	0,12	o,.o?3	0,04	0,052	0,08
2-2	I7/H/8I	46	0,050	0,11	0,018	0,03	0,058	0,09
2-3	02/12/81	63	0,047	0,10	0,020	o,o4	0,060	0,09
2-4	14/12/81	152	0,059	0,12	0,025	0,05	0,054	0,08
2-5	23/12/81	624	0,070	0,15	0,026	0,05	0,074	0,11
2-6	20/01/82	66	0,051	0,11	0,018	0,03	0,058	0,09
2-7	15/02/82	70	0,139	0,29	0,037	0,07	o,i46	0,22
2-8	17/03/82	24	1,867	3,92	0,355	0,65	1,429	2,19
2-9	21/04/82	53	73,00	>6,30	0,748	1,37	>3,00	>4,59
2-10	19/05/82	95	>3,oo	>6,30	1,025	1,88	>3,00	^4,59
2-11	14/06/82	37	₇3,oo	>6,30	0,917	1,68	>3,00	>4,59
Caso 44 3
3-1	07/04/81	13	0,090	0,19	0,049	0,09	0,138	0,21
3-2	12/05/81	236	0,064	0,13	o,o4o	0,07	0,094	0,i4
3-3	30/05/81	471	0,079	0,17	0,045	0,08	o,i44	0,22
3-4	09/06/81	315	0,211	0,44	0,085	0,16	0,275	0,42
3-5	06/07/81	273	1,707	3,59	0,272	0,50	1,773	2,71
3-6	10/08/81	158	73,00	>6,30	1,347	2,47	>3,00	>4,59
3-7	08/09/81	84	>3,00	>6,30	2,294	4,21	>3,00	>4,59
3-8	14/10/81	180	>3,00	>6,30	>3,00	>5,50	>3,00	>4,59
3-9	n/ll/81	154	>3,00	>6,30	>3,00	>5,50	>3,00	>4,59

182

IV. 1.6, b. Amostras provenientes de Dadores de Sangue ao Acaso

Amostras provenientes de dadores de sangue ao acaso (Ver Secção IV.I.l) foram peneiradas para infecção do HCV utilizando o HCV cl00-3 ELISA, em que o conjugado anticor po-enzima foi quer um conjugado monoclonal anti-IgG, quer um conjugado policlonal. 0 número total de amostras penêiradas foi de 1077 ® 1056, para o conjugado policlonal e o conjugado monoclonal, respectivamente. Um sumário dos resultados do screeningestá apresentado na Tabela 15, e as distribuições da amostra no histograma na Fig. 44.

cálculo da média e desvio padrão foi realiza do excluindo amostras que deram um sinal acima de 1,5, isto é, valores 1073 00 foram utilizados para os cálculos utilizando o conjugado policlonal, e 1051 para o conjugado monoclonal anti-IgG. Como se vê na Tabela 15, quando o conjugado policlonal foi utilizado, a média foi alterada de 0,0493 para 0,0931, e o desvio padrão foi aumentado de 0,074 para 0,0933. Além disso, os resultados mostram também que se for empregado o critério x + 5SD para definir o ensaio cut-off, a configuração do con jugado policlonal-enzima na ELISA exige um elevado valor de cut-off. Isto indica uma especificidade de ensaio reduzida em comparação com o sistema monoclonal. Por outro lado, como representado no histograma na Fig. 44, uma separação maior dos resultados entre distribuições negativas e positivas ocorre quando dadores de sangue ao acaso são passados na ELISA utilizando o conjugado monoclonal anti-IgG como comparado com o ensaio que utiliza uma classificação policlonal comercial.

- 183 TABELA 15

COMPARAÇÃO DE DUAS CONFIGURAÇÕES ELISA EM AMOSTRAS

DE TESTE A PARTIR DE -DADORES DE SANGUE AO ACASO

CONJUGADO POLICLONAL MONOCLONAL ANTI-IgG (jackson)

Número	de amostras	1073	1051
Media	(*)	0,0931	0,04926
Desvio	padrão (su)	0,0933	0,07427
5 3D		0,4666	0,3714
CUT-OFF (5 SD + x)	0,5596	0,4206

184 IV.J. Detecção de Seroconversão do HCV em Pacientes com NANBH a partir de uma Variedade de

Localizações Geográficas

Soros provenientes de pacientes que eram suspeitos de ter NANBH com base nos elevados níveis de ALT, e que f£ ram negativos em testes de HAV e HBV foram peneirados utilizan do o RIA essencialmente como descrito na Secção IV,D., excepto em que o antigene HCV cl00-3 foi utilizado como o antigene de screening nas placas microtiter. Como se vê pelos resulta dos apresentados na Tabela 16, o RIA detectou amostras positivas numa elevada percentagem dos casos.

TABELA 16

Frequências de Seroconversão para Anti-clOO-3 Entre

	Pacientes com	NANBH em Diferentes	Países
País	Holanda	Itália	Japão
No.
Examinado	5	36	26
No.		1
Positivo	3	29	19
$
Positiva	60	80	73
IV.K. Detecção de Seroconversão do HCV em	Pacientes ,

munidade Adquirida¹¹ NANBH

Soros que foram obtidos a partir de 100 pacien tes com NANBH, para os quais não existia via de transmissão qb via (isto é, nenhumas transfusões, uso de medicamentos por via i.v,, promiscuidade, etc. foram identificados como factores de

185 -

risco), foram proporcionados pelo Dr. M. Halter do Centro para o Controle de Doenças, e pelo Dr. J. Dienstang da Universi dade de Harvard. Estas amostras foram peneiradas utilizando um RIA essencialmente como descrito na Secção XV,D,, excepto em que o antigene HCV clOO-3 foi utilizado como o antigene de screening ligado às placas microtiter. Os resultados mos traram que das 100 amostras de soro, 55 continham anticorpos que reagiram imunologicamente com o antigene HCV clOO-3»

Os resultados descritos acima sugerem que a

Comunidade Adquirida NANBH é também provocada por HCV. Além disso, visto que foi aqui demostrado que o HCV está relaciona do com Flavivírus , a maior parte dos quais são transmitidos por artrópodes, pensa-se que a transmissão de HCV nos casos de Comunidade Adquirida também resulte da transmissão por artrópodes.

IV. L. Comparação de Incidência de Anticorpos do HCV e Marcadores Substituídos em Dadores Implicados em Transmissão de NANBH _z

Um estudo prospectivo foi realizado para determinar se os receptores de sangue proveniente de dadores suspeitos de NANBH positiva, que desenvolveram NANBH, s_e seroconverteram para anticorpo anti-HCV positivo. Os dadores de sangue foram testados para as anormalidades do marcador substituído que são correntemer te utilizados como marcadores para infecção NANBH, isto é, ní veis elevados de ALT, e a presença do anticorpo anti-núcleo.

Além disso, os dadores foram também testados em relação à pre sença de anticorpos anti-HCV, A determinação da presença de an

186 ticorpos anti-HCV foi determinada utilizando um radioimuno-ensaio como descrito na Secção IV ,K. Os resultados do estudo estão apresentados na Tabela 17, que mostras o número do pacien. s.

te (coluna l)a presença de anticorpos anti-HCV no soro do pa ciente (coluna 2); o número de doações recebidas pelo paciente, sendo cada doação proveniente de um dador diferente (coluna 3); a presença de anticorpos anti-HCV no soro dador (coluna 4), e a anormalidade do substituto do dador (coluna 5) (NT ou — significa não testado) (ALT é transaminase elevada, e ANTI-HBc an ticorpo anti-núcleo).

Os resultados na Tabela 17 demonstram que o teste do anticorpo HCV e mais exacto na detecção de dadores de sangue infectados que os testes marcadores substituídos. Nove em dez pacientes, que desenvolveram sintomas de NANBH, tiveram teste positivo para a seroconversão anticorpo anti-HCV. Dos 11 dadores suspeitos, (o paciente 6 recebeu doações de dois indivíduos diferentes suspeitos de serem portadores de NANBH), 9 foram positivos para anticorpos antiI

-HCV, e 1 foi positivo incerto, e portanto equívoco (dador para o paciente l). Em contraste, utilizando o teste ALT elevado, dos 10 dadores deram teste negativo, e utilizando o teste anti-núcleo-anticorpo 5 dos dez dadores deram teste negativo. De maior consequência, não obstante, nos três casos (dadores para os pacientes 8, 9' e 10) o teste ALT e o teste ANTI-HBc deram resultados inconsistentes.

- 187 -

TABELA 17

Paciente	DESENVOLVIMENTO DE ANTICORPOS ΑΝΤΙ-HCV EM PACIENTES RECEBENDO SANGUE DE DADORES SUSPEITOS DE SEREM
PORTADORES DE NANBH	Anormalidade do Substitut Alt Anti-HB
Seroconversão	. de es/Dadores	Dador Anti-HCV Positivo
Anti-HCV em Paciente	Np DoaçÕ
1	sim		18	equiv.	não	não
2	sim		18	sim	NT	sim
3	sim		13	sim	não	não
4	não		18	não	—	—
5	sim		16	sim	sim	sim
6	sim		11	sim( 2)	não	não
7	sim		15	sim	NT	não
8	sim		20	sim	não	sim
9	sim		5	sim	sim	não
10	sim		15	sim	não	sim

188

IV,Μ, Ampliação para Cionar Sequências de HCV cDNA Utilizando PCR e Primários Derivados de Regiões Conservadas de Sequências Genómicas de Flavivirus

Os resultados apresentados acima, que sugerem que o HCV é um flavivirus ou vírus flavi análogo, permitem uma estratégia para a clonação de sequências HCV cDNA não caracterizadas utilizando a técnica PCR, e primários derivados das regiões codificando sequências de aminoácido conservadas em flavivirus. Geralmente, um dos primários é derivado de uma sequência genómica de HCV definida, e o outro primário que flanqueia uma região de polinucleótido de HCV não sequenciada é derivado de uma região conservada do genorna de flavivirus.

Os genomas de flavivirus são conhecidos para conter sequências conservadas dentro dos polipéptidos NS1 θ E, que são codificados na região 5’ do genorna flavivirus. Sequências correspondeu tes que codificam estas regiões estão a montante da sequência HCV cDNA representada na Fig, 26. Assim, para isolar sequências cDNA derivadas desta região do genorna do HCV, primários a montante são delineados os quais são derivados das sequências conservadas dentro destes polipéptidos de flavivirus. Os primários a jusante são derivados de uma extremidade a montante da porção conhecida do HCV cDNA.

Devido à degeneração do código, é provável que venham a existir más combinações entre as sondas de flavivirus e a correspondente sequência genómica de HCV, Portanto, uma e^ tratégia que é semelhante à descrita por Lee (1988) é utilizada. 0 processo de Lee utiliza primários de oligonucleotido mis

- I89 turados complementarmente aos produtos de translação inversos de uma sequência de aminoácido; as sequências nos primários misturados têm em conta qualquer degeneração de codão para a sequência de aminoácido conservada.

Três conjuntos de misturas primárias são gerados, com base nas homologias de aminoácido encontradas em vários flavivírus, incluindo Dengue-2,4 (D-2,4), Japanese Encephalitis Virus (JEV), Yellow Fever (YF) e West Nile Virus (WN) A mistura primária derivada da sequência (5'-l) conservada a montante, é baseada na sequência de aminoácido gly-trp-gly, que faz parte da sequência conservada asp-arg-gly-trp-gly-aspN encontrada na-proteína E de D-2, JEV, YF, e WN. A mistura primária seguinte (5’-2) é baseada numa sequencia conservada a ju sante na proteína E, phe-asp-gly-asp-ser-tyr-ileu-phe-gly-asp-ser-tyr-ileu, e é derivada de phe-gly-asp; a sequencia conser vada está presente em D-2, JEV, YF, e WN. A terceira mistura primária (5’-3)» © baseada na sequência de aminoácido arg-ser-cys, que faz parte da sequência conservada cys-cys-arg-ser-cys na proteína NS1 de D-2, D-4, JEV, YF, e WN. Os primários individuais que formam a mistura em 5'-3 estão representados na Fig. 45. Além das sequências variadas derivadas da região conservada, cada primário em cada mistura também contém uma região constante na extremidade 5’ que contem uma sequência codificando locais para enzimas de restrição, HindIII, Mbol, e EcoRl.

primário á jusante, ssc5b2OA, é derivado de uma sequência de nucleotido no clone 5h, que contém HCV cDNA

190 com sequências que se sobrepõem às dos clones l4i e 11b, A s£ quência de ssc5h20A é

5' GTA ATA TGG TGA CAG AGT CA 3' .

Um primário alternativo, ssc5h3^A, pode também ser utilizado. Este primário é derivado de uma sequência no clone 5h, e contém além disso nucleótidos na extremidade 5' que criam um local de restrição de enzima, facilitando assim a clonação. A sequencia de ssc5h3^A é

5’ GAT CTC TAG AGA AAT CAA TAT GGT GAC AGA GTC A 3'.

A reacção PCR, que foi inicialmente descrita por Saiki et al. (1986), é realizada essencialmente corno descrito em Lee et al. (1988), excepto em que o padrão para o cDNA é RNA isolado a partir de fígado de chimpanzé infectado com HCV, como descrito na Secção IV.C.2, ou a partir de partículas virais isoladas de soro de chimpanzé infectado com HCV, como de_s crito na Secção IV.A.1. Além disso, as condições de têmpera são menos rigorosas na pritoeira ronda de ampliação (O,óM NaCl, e 25°C) visto que parte do primário que irá temperar-se com a sequencia HCV e de apenas 9 nucleótidos, e pode haver más com binações. Mais ainda, se fôr utilizado ssc5h34A, as sequências adicionais não derivadas do genoma de HCV tendem a desee. tabilizar o primário-padrão híbrido. Depois da primeira ronda de ampliação, as condições de têmpera podem ser mais rigorosas (Ο,ΟόόΜ NaCl, e 32°C-37°C), visto que as sequências amplia das contem agora regiões que são complementares para, ou dupM cados dos primários. Alem disso, os primeiros 10 ciclos de ampliação são tratados com enzima I de Klenow, sob condições PCR

- 191 adequadas para aquele enzima. Depois de completados estes ciclos, as amostras são extraídas, e tratadas com polimerase Taq, de acordo com as instruções da embalagem (kit), tal co, mo fornecida por Cetus/Perkin-Elmer.

Depois da ampliação, as sequências HCV cDNA amplia das são detectadas por hibridação utilizando uma sonda deriva da do clone Esta sonda e derivada de sequências a montante das utilizadas para derivar o primário, e não se sobrepõem às sequências dos primários derivados do clone 5h. A sequência da sonda é

5’ CCC AGC GGC GTA CGC GCT GGA CAC GGA GGT GGC CGC GTC GTG TGG

CGG TGT TGT TCT CGT CGG GTT GAT GGC GC 3 ’ .

IV.N.1 Criação da Librária HCV cDNA a partir do Fígado de um Chimpanzé com NANBH Infecciosa

Uma librária HCV cDNA foi criada a partir de fíga do proveniente de chimpanzé a partir do qual a librária HCV cDNA na Secção IV.A.l foi criada. A técnica para a criação da librária foi semelhante à da Secção IV,A.24, excepto para esta diferente fonte do RNA, e por um primário baseado na sequên cia de HCV cDNA no clone 11b ter sido utilizado. A sequencia do primário foi

5' CTG GCT TGA AGA ATC 3'

IV.N.2, Isolamento e Sequência de Nucleótido de Sobreposição de HCV cDNA no Clone k9-l para cDNA no Clone 11b ’clone k9-l foi isolado a partir da librária HCV cDNA criada a partir de fígado de um chimpanzé infectado com

192

NANBH, como descrito na Secção IV,A,25, A libraria foi penei^ rada para clones que se sobrepõem à sequência no clone 11b, utilizando um clone que se sobrepõe ao clone 11b no terminal 5’, clone lie. A sequência do clone 11b está representada na Figura 23. Clones positivos foram isolados com uma frequência de 1 em 500.000. Um clone isolado, k9-l, foi submetido a estudo posterior. A natureza de sobreposição do HCV cDNA no cljo ne k9-l para a extremidade 5’ da sequência HCV-cDNA na Fig.

foi confirmada sondando 0 clone com 0 Alex46; ®ste último clone contem uma sequência HCV cDNA de 30 pares de base que corres ponde aqueles - pares de base no terminal 5’ do HCV cDNA no clone l4i, descrito acima,

A sequência de nucleotido do HCV cDNA isolado do clone k9-l foi determinada utilizando as técnicas descritas acima. A sequência do HCV cDNA no clone k9-l, a sobreposição com o HCV cDNA na Fig, 26, e os aminoácidos codificados nos mesmos estão representados na Fig. 46,

A sequência HCV cDNA no clone k9-l foi alinhada com as dos clones descritos na Secção IV,A.19. para criar uma sequência HCV cDNA compósita, sendo a sequência k9-l colocada a montante da sequência representada na Fig, 32. 0 HCV cDNA compósito que inclui a sequência k9-l, e os aminoácidos codificados no mesmo, estão representados na Fig, 47.

A sequência do,s aminoácidos codificados na região 5' do HCV cDNA representado na Fig. 47 foi comparada com a r_e gião correspondente de uma das estirpes de vírus Dengue, descrita acima, em relação ao perfil de regiões de hidrofobicida

193 de e hidrofilicidade. Esta comparação mostrou que os polipéptidos provenientes de HCV e Dengue codificados nesta região, que corresponde à região codificando NS1 (ou uma porção do mesmo), tem um perfil hidrofóbico/hidrofílico semelhante.

A informação proporcionada abaixo permite a iden tificação de estirpes HCV. 0 isolamento e caracterização de outras estirpes HCV podem ser realizados isolando os ácidos nucleicos dos componentes de corpo que contem partículas virais, criando librárias cDNA utilizando sondas de polinucleó. tido com base nas sondas HCV cDNA descritas abaixo, peneiran do as librárias para clones contendo sequências HCV cDNA desj critas.abaixo, e comparando os HCV cDNAs provenientes dos no vos isolados com os cDNAs descritos abaixo. Os polipéptidos codificados nos mesmos, ou no génoma virai podem ser controlados para reactividade-cruzada imunológica utilizando os po lipéptidos e anticorpos descritos acima. Estirpes que se ajustam dentro dos parâmetros do HCV, como descrito nas Definições acima, são facilmente identificáveis. Outros métodos para identificar estirpes de HCV são óbvios para os entendidos na arte, com base na informação aqui proporcionada.

Descrição das Figuras (Continuação)

A Fig. 46 mostra a sequência HCV cDNA no clone k9-l» o segmento que se sobrepõe ao cDNA na Fig, 26, e os arni noácidos codificados no mesmo.

A Fig, 47 mostra a sequência num cDNA compósito que foi derivada alinhando os clones k9-l a 15e na direcção

5’ para 3’, θ também mostra os aminoácidos codificados contínua.

na

ORF

Aplicabilidade Industrial

A invenção, nas várias manifestações aqui revela das, tem várias utilizações industriais, algumas das quais são as seguintes. Os HCV cDNAs podem ser utilizados para prt> jectar as sondas para a detecção de ácidos nuoleícos de HCV em amostras. As sondas derivadas dos cDNAs podem ser utiliza das para detectar ácidos nucleícos de HCV em, por exemplo,reac-ções sintéticas químicas .As mesmas podem também ser utilizadas para programas de screening para agentes anti-virais, para determinar o efeito dos agentes na inibição de replicação virai em sistemas de cultura de células, e sistemas modelo de animais. As sondas de polinucleótido de HCV são também úteis para detectar ácidos nucleícos virais em seres humanos, e assim, podem servir como uma base para diagnóstico de infecções de HCV em seres humanos.

Além do acima enumerado, os cDNAs proporcionados aqui proporcionam informação e meios para sintetizar polipój) tidos contendo epítopes de HCV. Estes polipêptidos são úteis na detecção de anticorpos para antigenes HCV. Uma série de imuno-ensaios para infecção de HCV, com base em polipêptidos recombinantes contendo epítopes HCV está aqui descrita, e en contrará utilização comercial no diagnóstico de NANBH induzi, da de HCV, no screeningde dadores de banco de sangue para hepati tes infecciosas causadas por HCV, e também para detectar san gue contaminado a partir de dadores de sangue infecciosos.

195

'V

ο

Os antigenes virais terão também utilidade no controle da eficácia de agentes anti-virais em sistemas de modelo animal. Além disso, os polipéptidos derivados dos HCV cDNAs aqui revelados terão utilidade como vacinas para tratamento de infecções de HCV.

Os polipéptidos derivados dos HCV cDNAs, além das utilizações acima indicadas, são também úteis para elevar an ticorpos anti-HCV. Portanto, os mesmos podem ser utilizados em vacinas anti-HCV, Contudo, os anticorpos produzidos como um resultado da imunização com os polipéptidos de HCV são tam bem úteis na detecção da presença de antigenes virais em amos tras. Assim, os mesmos podem ser utilizados para ensaio da produção de polipéptidos de HCV em sistemas químicos. Os anti. corpos anti-HCV podem também ser utilizados para controlar a eficácia dos agentes anti-virais em programas de screening em que estes agentes são testados em sistemas de cultura de tecido. Os mesmos podem também ser utilizados para imunoterapia passiva, e para diagnostico de NANBH causada por HCV permitindo a detecção do antigene (s) virai (ais) tanto nos dadores como nos receptores de sangue. Outra utilização importante para anticorpos anti-HCV é uma afinidade cromatográfica para a purificação de vírus e polipéptidos virais, vírus purificado e preparações de polipêptido virai podem ser utilizados em vacinas^ Todavia, o vírus purificado pode também ser útil para o desenvolvimento dos sistemas de cultu ra de células em que o HCV replica.

Sistemas de cultura de células contendo células

- 196 infectadas com HCV poderão ter várias utilizações. Os mesmos podem ser utilizados para a produção numa escala relativamen te larga de HCV, que é normalmente um vírus de baixo título. Estes sistemas serão também úteis para uma elucidação da bio. logia molecular do vírus, e conduzem ao desenvolvimento dos agentes anti-virais. Os sistemas de cultura de células serão também úteis no screening para a eficácia de agentes anti. -virais. Além disso, os sistemas de cultura de células permissivas de HCV são úteis para a produção de estirpes atenua das de HCV.

Por conveniência, os anticorpos anti-HCV e os p£ lipeptidos de HCV, quer naturais quer recombinantes, podem ser embalados em conjuntos (kits).

método utilizado para isolar HCV cDNA, que e constituído pela preparação de uma libraria cDNA derivada de tecido infectado de um indivíduo, num vector de expressão, e clones seleccionados que produzem os produtos de expressão, que reagem imunologicamente com anticorpos, em componentes de corpo contendo anticorpo, a partir de indivíduos infectados e não a partir de indivíduos não infectados, pode também ser aplicável ao isolamento de cDNAs derivados de outros agentes de doença-associados, até agora não carac terizados, que são constituídos por um componente genomico. Isto, por sua vez, pode conduzir ao isolamento e caracterização destes agentes, e aos reagentes de diagnóstico e vacinas para estes outros agentes de doença associados.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1 - Um método para produzir um polipetídeo HCV, caracterizado pelo facto de compreender a incubação das células hospedeiras transformadas com um vector de expressão,' que contém uma sequência que codifica um polipetídeo HCV, sob condições que permitem a expressão do polipetídeo.
2- 0 método conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto da sequência que codifica o polipetídeo HCV ser proveniente de um genoma HCV.
3- 0 método conforme reivindicado na reivindicação 1, caracterizado pelo facto da sequência que codifica a polipetídeo HCV ser pro198 veniente de HCV cDNA.
4- 0 método copforme reivindicado na reivindicação 3, caracterizado pelo facto da sequência que codifica o polipetídeo HCV ser derivado da sequência HCV. cDNA na Figura 32.
5- 0 método conforme reivindicado na reivindicação 3, caracterizado pelo facto da sequência de DNA estar contida no clone 5-1-1.

I
6-0 método conforme reivindicado na reivindicação 3, caracterizado pelo facto da sequência de DNA estar contida no clone 81.
7 - Método conforme reivindicado na reivindicação 3, caracterizado pelo facto da sequência de DNA estar contida no clone 100.
8 - Um método para produzir um polipetídeo compreendendo um epítope imunologicamente identificável com um epítope contido em HCV, caracterizado pelo Tacto de compreender a incubação das células hospedeiras transformadas com um vector de expressão, contendo uma sequência que codific.a_:xo polipetídèOi sob condições que permitem a expressão do polipetídeo. .
9 - Um método de produção dum polipetídeo de fusão contendo um polipetídeo HCV, caracterizado pelo factode compreender-a incubação das células hospedeiras transformadas com um vector de expressão, contendo uma sequência que codifica o polipetídeo de fusão, sob condições que permitem a expressão do polipetídeo.
10-0 método conforme reivindicado na reivindicação 9, caracterizado pelo facto do polipetídeo conter um polipetídeo de dismutase superóxido fundido até um polipetídeo HCV.
11 - Um método para produzir um polipetídeo HCV, caracterizado pelo facto de se obter uma preparação de HCV, e isolando-se o referido

199 antigene da dita preparação de HCV.
12 - Um método para produzir um polipetídeo HCV, caracterizado pelo facto de compreender a ligação de aminoácidos, sob condições que permitem a formação da junção do péptido, em que a sequência do polipetídeo é proveniente do genoma HCV.
13- 0 método,conforme reivindicado na reivindicação 12, caracterizado pelo facto do polipetídeo ser proveniente de HCV cDNA,
14- 0 método, conforme reivindicado na reivindicação 13, caracterizado pelo' facto do polipetídeo ser proveniente de HCV cDNA, na Figura 32.
15 - Um método de isolamento de HGV, caracterizado pelo facto de compreender a incubação duma preparação contendo HCV, com anticorpos anti-HCV,' sob condições que permitem a formação dum complexo anticorpo-HCV anti-HCV, e isolando-se o complexo.
16 - Um método de preparação de anticorpos policlonais purificados destinados a combater um antigene HCV, caracterizado pelo facto-ide compreender a obtenção de um antioorpo contendo componente de corpo de um indivíduo que tenha reagido imunologicarnetne ao antigene; a interacção do anticorpo contendo componente de corpo com antigene HCV, sob condições que permitem a formação de um complexo antigene-anticorpo HCV, isolando-se o dito'complexo,-e isolando-se o dito anticorpo do dito complexo.
17 - Um método para preparação de anticorpos monoclonais dirigidos contra um antigene HCV, caracterizado pelo facto de compreender a obtenção de um hibridoma proveniente de células produtoras de anticorpos de um indivíduo imunizado com o antigene HCV, e incuban200 do-se o hibridoma sob condições que permitem a expressão do anti corpo.
18 - Um método de preparação de um polinucleotídeo HCV, caracterizado pelo facto de compreender a obtenção de uma célula hospedeira transformada com um vector que contém o polinucleotídeo HCV, e desenvolvimento das células hospedeiras sob condições que permitem a replicação do polinucleotídeo.
19 - Um método de preparação de um polinucleotídeo HCV, caracterizado pelo facto de compreender a obtenção de uma preparação de HCV, e isolando-se o pol inucleotídeo HCV.
20 - Um método de preparação de um pol inucletídeo HCV, caracteri zado pelo facto de compreender a ligação de nucleotídeos sob con dições que resultam na formação de ligações fosfodiéster , entre os nucleotídeos, e em que a sequência do polinucleotídeo é prove niente de um genoma HCV.
21 - Um método de preparação de um polinucleotídeo HCV, caracterizado pelo facto de compreender a ligação de nucleotídeos, sob condições que resultam na formação de ligações fosfodiéster , entre os nucleotídeos, e em que a sequência do polinucleotídeo é proveniente de HCV cDNA.
22-0 método, conforme reivindicado na reivindicação 21, caracterizado pelo facto da sequência do polinucleotídeo ser proveniente de HCV cDNA, na Figura 32.
23 - Um método de produção de HCV, caracterizado pelo facto de compreender a obtenção de uma célula infectada por HCV, e o desenvolvimento da célula em cultura, sob condições que permitem

201 a replicação virai.
24 - Um método de preparação de um polipetfdeo HCV imobilizado, caracterizado pelo facto de compreender a junção do polipetídeo HCV aum substrato sólido.
25 - Um mé'todo de preparação de um polipetídeo imobilizado contendo um epítope HCV, caracterizado pelo facto de compreender a junção do polipetídeo, contendo o polipetídeo HCV, a um substrato sólido.
26 - Um métodode preparação de um anticorpo anti-HCV imobilizado, caracterizado pelo facto de compreender a junção do anticorpo a um substrato sólido.
27 - Um método de preparação de um anticorpo imobilizado dirigido contra um epítope que é imunologicamente identificável com um epítope em HCV, caracterizado pelo facto de compreender a junção do anticorpo a um substrato sólido.
28 - Um método para detecção de ácidos nucleicos HCV numa amostra, caracterizado pelo facto de compreender:

a) a reacção dos ácidos nucleicos da amostra com uma sonda, para um polinucleotídeo HCV, sob condições que permitem a formação de um duplex polinucleotídeo entre a sonda e o ácido nucleico HCV da amostra; ,e

b) a detecção de um duplex pol inucleotídeo que contêm a sonda;
29 - Um método, conforme reivindicado na reivindicação 28, caracterizado pelo facto da reacção serealizar com uma sonda de poli202 β

nucleotídeo proveniente·de HCV cDNA.
30 - Um método para detectar um antigene HCV por imunoensaio, caracterizado pelo facto de compreender:

a) a incubação de uma amostra que se suspeita conter um antigene HCV com uma sonda anticorpo dirigida contra um epítope num antigene para ser detectado sob condições que permitem a formação de um complexo antigene HCV- sonda anticorpo; e

b) a detecção do complexo antigene HCV-sonda anticorpo.
31- 0 método, conforme reivindicado na reivindicação 30, caracterizado pelo facto do antigene HCV ser codificado no HCV cDNA.
32- 0 método, conforme reivindicado na reivindicação 30, caracterizado pelo facto do antigene, contra o .qual o anticorpo é dirigido, estar codificado no clone 5-1-1.
33- 0 método conforme reivindicado na reivindicação 30, caracterizado pelo facto do antigene, contra o qual o anticorpo é dirigido, estar codificado na Figura 32.
34 - Um método para detecção de anticorpos dirigidos contra um antigene HCV, mediante imun.oensaio, caracterizado pelo facto de compreender:

a) a incubação de uma amostraque se suspeita conter anticorpos anti-HCV, com um polipetídeo sonda que contém um epítope de HCV sob condições que permitem a formação de um complexo anticorpo anti-HCV - polipetídeo sonda; e

b) detecção do complexo anticorpo anti-HCV - polipetídeo sonda .
35-0 método, conforme reivindicado na reivindicação 34, caracte203 rizado pelo facto do polipetídeo sonda ser proveniente de .um genoma HCV .
36- 0 método, conforme reivindicado na reivindicação 34, caracterizado pelo facto de o polipetídeo sonda ser proveniente de HCV cDNA.
37- 0 método, conforme reivindicado na reivindicação 36, caracterizado pelo facto do polipetídeo sonda ser derivado do clone 5-1-1
38- 0 método, conforme reivindicado na reivindicação 36, caracterizado pêlo facto do polipetídeo sonda ser proveniente do clone 81
39- 0 método, conforme reivindicado na reivindicação 36, caracterizado pelo facto do polipetídeo sonda ser proveniente do clone C100.
40- 0 método, conforme reivindicado na reivindicação 37, caracterizado pelo facto do polipetídeo sondaser NANBg_^_p'
41- 0 método, conforme reivindicado na reivindicação 38, caracterizado pelo facto do polipetídeo sonda ser ΝΑΝΒθρ
42 - 0 método, conforme reivindicado na reivindicação 39, caracterizado pelo facto do polipetídeo sonda ser C100-3.
43 - Método para isolar cDNA derivado do genoma de um agente infeccioso não identificado, caracterizado pelo facto de compreender:

a) fornecimento de células hospedeiras transformadas com vectores de expressão que contêm um património cDNA preparado a partir de ácidos nucleícos isolados a partir de tecido infectado com o agente e desenvolvimento das referidas células hospedeiras sob condições que permitam a expressão de polipetídeo(s) codifica-•204 dos em cDNA.

b) interacção dos produtos de expressão de cDNA com um anticorpo que contém componente de corpo de um indivíduo infectado pelo referido agente infeccioso, sob condições que permitem uma imunoreacção, e detecção dos complexos anticorpo-antigene, formados como resultado da interacção;

c) desenvolvimento das células hospedeiras que expressam polipetídeos que formam complexos anticorpo-antigene na fase (b), sob condições que permitem o seu desenvolvimento como clones individuais e isolamento dos referidos· clones;

I

d) desenvolvimento· de células a partir de clones de (c), sob condições que permitem a expressão de polipetídeo (s) codificados dentro de cDNA, e interacção· dos produtos de expressão com um anticorpo que contém componentes de corpo, de indivíduos diferentes do indivíduo da fase (a),que estão infectados com o agente infeccioso, e com indivíduos de controle riãoiinfectados oom o agente, e detecção de complexos anticorpo-antigene formados como resultado da interacção;

e) desenvolvimento de células hospedeiras que expressam polipetídeos que formam complexos anticorpo-antigene, contendo o anticorpo componentes de corpo de indivíduos infectados e de indivíduos suspeitos de estarem infectados, e não com os referidos componentes de indivíduos de controle, sob condições que permitam o seu 'desenvolvimento como clones individuais e isolamento dos referidos clones; e

f) isolamento de cDNA a.partir dos clones da célula hos- 205 pedeira de (e).

Lisboa, 18 de Novembro de 1988