PT85364B - Metodo para a producao de polipeptideos relacionados com factores de ligacao - Google Patents

Description

presente invento diz respeito a polipeptideos relacionados com factores de ligaçao a imunoglobulina E (IgE-BFs) humanos, mRNAs, DNAs e vectores híbridos codificadores dos referidos polipeptideos, hospedeiros possuidores dos referidos vectores híbridos, processos para a preparaçao dos referidos polipeptideos, mRNAs, DNAs, vectoCIBA-GEIGY AG

MÉTODO PARA A PRODUÇÃO DE POLIPEPTIDEOS RELACIONADOS COM FACTORES DE LIGAÇÃO _

res híbridos e hospedeiros. Os polipeptideos podem ser usados para a prevenção e/ou tratamento de doenças alérgicas e deste modo o invento também se relaciona com preparações farmacêuticas que os incluem.

processo para a preparaçao dos referidos polipeptideos consiste em se cultivar um hospedeiro transformado contendo um vector híbrido compreendendo a sequência de DNA codificadora do referido polipeptideo ou se traduzir num sistema de traduçao adequado o mRNA codificador do referido polipeptideo.

invento diz respeito a polipej^ tideos relacionados com factores de ligaçao a imunoglobulina E (IgE-BFs) humanos, mRNAs, e DNAs e vectores híbridos codificadores dos referidos polipeptideos, hospedeiros possuidores dos referidos vectores híbridos, processos para a preparaçao dos referidos polipeptideos, mRIJAs DIIAs, vectores hibridos e hospedeiros. Os polipeptideos podem ser usados para a prevenção e/ou tratamento de doenças alérgicas e deste modo o invento também se relaciona com preparações farmacêuticas que os incluem.

Fundamento do invento

As doenças alérgicas sao ainda um importante problema de saúde devido à sua alta insidência (20 a 307 da populaçao) e à falta de tratamento que as curem. Geralmente a terapia está restringida ao uso de anti-histaminas ou de processos de imunização mais ou menos eficazes. As drogas anti-alérgicas clássicas têm certas desvantagens, especialmente por causarem vários efeitos secundários no doente tratado. 0 processo de imunização está limitado a uni ou dois alergénios enquanto que a maior parte dos pacientes sao sensíveis a uma larga gama de alergénios. Além disso, o tratamento por hipossensibilizaçao nao cura nem protege.

A vasta maioria das doenças alérgicas sao mediadas por anticorpos imunoglobulina E (IgE) dirigidos contra uma multidão de alergénios provenientes do ar, e.g. polens, pêlos de animais, ácaros do pó, antigénios alimentares, agentes farmacológicos, e.g. penicilinas, ou veneno de himenópteros. Os mecanismos de regulaçao da produção

de IgE foram extensivamente investigados em animais de laboratório / K. Ishizaka, Ann. Rev. Immunol. 2, 159 (1984)7. Estes estudos indicaram claramente a existência de mecanismos de controle da produção de IgE nao específicos de antigénio mas específicos de isotipo de IgE em modelos animais. As moléculas efectoras destes mecanismos reguladores foram designadas factores de ligaçao a IgE (IgE-BFs) devido à sua afinidade para IgE. Os IgE-BFs podem ser divididos em factores supressores de IgE (IgE-SFs) e factores potenciadores de IgE (IgE (IgE-PFs). Estas moléculas diferem apenas nó seu teor em hidratos de carbono. Os IgE-PFs nao sao glicosilados ou sao menos glicosilados que os correspondentes IgE-PFs. A produção real de IgE em modelos animais é determinada pela proporção entre estes dois tipos de IgE-BFs.

As mesmas células sao capazes de secretar IgE-SFs ou IgE-PFs dependendo da influência de factores inibidores ou indutores da glicosilaçao que sao secretados por subpopulaçoes distintas de linfécitos T reguladores.

M. Sarfati et al / Immunology 53, 197, 207, 783 (1984)7 documentaram a existência de linhas de células B humanas secretoras de IgE-BFs dotadas de actividades biológicas semelhantes às descritas em roedores. Outros investigadores descreveram a produção de IgE-BFs por células T humanas / T.F. Huff e K. Ishizaka, Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 81, 1514 (1984)7 e por métodos de engenharia genética / Pedido de Patente Europeia 155 1927. As relações entre IgE-BFs com origem em células T e os que têm origem em células B nao eram até agora conhecidas. Conforme será evidente a partir do presente invento os IgE-BFs com origem em células B tem menos do que homologia estatística com os IgE-BFs com origem em células T.

Os IgE-BFs purificados sao importantes para o diagnóstico e terapia de doenças alérgicas e doenças de regulaçao imune relacionadas com elas. Em particular os IgE-BFs com actividade supressora de IgE devem ser úteis no tratamento de doenças alérgicas, enquanto que os IgE-BFs com actividade potenciadora de IgE devem aumentar a resistência a infecçoes, por exemplo resistência a infecçoes por parasitas.

Os ensaios para a detecçao de IgE-BFs de células B sao baseados num teste de inibição de rosetas em que células RPMI 8866 (numa linha linfoblastóide de células B) expressando receptores para IgE (Fc R) sao rosetados com eritrócitos bovinos revestidos com IgE. Se os últimos forem primeiro incubados com IgE-BFs eles nao seram mais capazes de se ligarem às células RPMI 8866 e a proporção de células formadoras de rosetas é portanto reduzida. Este ensaio nao é quantitativo, é tecnicamente delicado devido à variabilidade no acoplamento de IgE a eritrócitos bovinos e é maçador porque as rosetas devem ser examinadas ao microscópio, deve-se ter permanentemente à disposição linha celulares, os eritrócitos revestidos com IgE devem ser preparados regularmente, etc., de modo que apenas um pequeno numero de testes (20-40) podem ser efectuados razoavelmente por uma pessoa num dia. Num ensaio mais adequado, quantitativo é facil de efectuar, utilizam-se anticorpos monoclonais contra Fc R de linfócitos os quais dao reacçao cruzada com IgE-BFs. Tais anticorpos monoclonais foram preparados por G. Delaspasse et al., EP 86810244.3, e as linhas celulares de hibridoma que os produzem estão depositadas na Collection Nationale de Culturas de Microorganismes, Instituto Pasteur, Paris e estão disponíveis com o numero de acesso 1-425 (clone 208.25 A. 4,3/135), 1-420 (clone 208.25 D. 2,1/176), I-451 (clone 207.25 A. 4,4/30), 1-420 (clone 207.25 A. 4,4/45) e 1-486 (clone 208.25 D. 2/94). Os anticorpos monoclonais correspondentes sao designados Mab-135, Mab-176, Mab-30, Iíab-45 e Mab-94, respectivamente. Eles permitem também uma purificação eficaz de IgE-BFs por cromatografia de afinidade.

Apesar do uso dos anticorpos monoclonais referidos foi até aqui impossivel determinar a sequência de aminoácidos de um único IgE-BF isolado a partir de umã linha natural de células B humanas. Para fins terapêu ticos seria altamente desejável possuir um único polipeptideo limpo com uma sequência de aminoácidos defenida tendo a desejada propriedade de ligaçao a IgE e que fosse fácilmente preparada em grandes quantidades.

progresso rápido dos métodos de DNA recombinante nos últimos anos proporcionou os métodos gerais para se atingir este objectivo. Nos casos em que se desconhece a estrutura do polipeptideo, o sucesso da técnica de DNA recombinante depende da identificação de um mRNA ou de um DNA codificador do polipeptideo pretendido a partir de uma fonte natural. Após identificação de um mRNA através de un ensaio adequado, pode-se preparar um DNA complementar. 0 cDNA pode ser incorporado num vector adequado, quando da transformaçao de um hospedeiro adequado com o vector hibrido obtido, selecçao e cultura dos hospedeiros transformados pe£ mite a produção e finalmente isolamento do polipeptideo. 0 isolamento do cDNA codificador do polipeptideo pretendido e sequênciaçao permite determinar a sequência de aminoácidos do polipeptideo. Pode-se usar o cDNA ou partes dele para o despiste de mRNA ou do genoma de DNA da fonte natural para outras sequências de nucleotideos codificadoras dos polipeptideos pretendidos.

Deste modo, no presente invento a medida que eram conhecidas as estruturas dos IgE-BFs, o

primeiro objectivo foi identificar um mRNA de células B humanas codificadoras do polipeptideo por transformaçao de ovos de Xenopus laevis com mRNA fraccionado das referidas células B e determinação dos clones que contêm o mRNA pretendido por um ensaio que utilizasse os anticorpos monoclonais. Outros objectivos foram a preparaçao de cDNAs e vectores híbridos, a transformaçao de hospedeiros adequados e finalmente cultura dos referidos hospedeiros e isolamento dos polipeptideos pretendidos. Os últimos nao sao necessariamente idênticos aos polipeptideos naturais porque pode haver modificações pós-traduçao após expressão do polipeptideo.

Objectivos do invento

Os objectivos do invento sao polipeptideos relacionados com IgE-BFs de células B humanas, vectores hibridos compreendendo como inserção uma sequência de DNA codificadora dos referidos polipeptideos, hospedeiros transformados contendo os referidos vectores hibridos, moléculas de RNA e DNA codificadoras dos referidos polipeptideos e preparações farmacêuticas contendo quantidades eficazes dos referidos polipeptideos.

Outros objectivos sao os métodos para a produção dos referidos polipeptideos, vectores hibridos, hospedeiros transformados, moléculas de RNA e DNA, preparações farmacêuticas e o uso dos referidos polipeptideos.

Um outro objectivo do invento é proporcionar um método para a prevenção e/ou tratamento de

alergias pela administração de uma quantidade eficaz de um presente polipeptideo relacionado com IgE-BFs.

Estes objectivos foram conseguidos pela preparaçao de um DNA codificador do polipeptideo com a fórmula I e seus fragmentos.

Descrição do invento

Os polipeptideos do invento invento diz respeito a um polipeptideo tendo a sequência de aminoácidos com a fórmula (I)

ME E G T A A L A R N V E L E E S S F K

10 YSEIEELP

R R

20

30 L L G L V

R

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CRRGTQIV

if 0

50

60

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160 V C

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170 N F

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220 S W

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290 I P

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300 S M

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D

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D

P

310 D G

R

L

P

I

P

S

A

P

320 L H S 321

(I)

um seu fragmento, mutante ou derivado.

As letras isoladas na fórmula (I) representam os seguintes L-aminoacidos naturais:

(A)alanina, (C)císteina, (D)ácido aspartico, (E)ácido glutâmico, (F)fenilalanina, (G)glicina, (H)histidina, (I)isoleucina, (K)lisina, (L)leucina, (M)metionina, (N)asparagina, (P)prolina, (Q)glutamina, (R)arginina, (S)serina, (T)treonina, (V)valina, (W)triptofano, (Y)tirosina.

Os polipeptideos com a fórmula I, seus fragmentos, mutantes e derivados sao aqui agrupados conjuntamente sob a expressão polipeptideos do invento. Eles estão relacionados com os receptores para IgE nas células B humanas e, se nao possuírem a sequência de ancoragem a membrana, com os IgE-BFs de Sarfati et al., referido atrás.

Os fragmentos dos polipeptideos do invento sao partes do polipeptideo completo com a fórmula (I) tendo pelo menos 10 e até 320 aminoácidos sucessivos numa sequência correspondente à fórmula (I). Tais fragmentos sao por exemplo polipeptideos com a fórmula (I), em que o de 133 aminoácidos começaii Este extremo com delecçao primeiro aminoácido, ou ate cerca do no extremo N foram eliminados.

sequência de ancoragem à membrana que liga o polipeptià membrana citoplasmática das células B. Outros fragmensao polipeptideos entre o extremo e a deo tos dos aproximadamente 110 e por exemplo os aminoá estão eliminados.

cular com a Fórmula (I) em que os arainoacipor exemplo os aminoácidos entre ou os aminoácidos no extremo C, entre aproximadamente 250 e C,

130, eidos e 321, invento relaciona-se em com um fragmento do polipeptideo com a fórmula estar eliminada a sequência de aminoácidos ser seleccionado do grupo consistindo nos parti(I), por por caracterizado

106 a 127; ou

polipeptideos que começam	com	qualquer um dos aminoácidos
120,	121,	123, 124,	125,	126,	127,	128, 129, 130,	131, 132,
133,	134,	135, 136,	137,	138,	139,	140, 141, 142,	143, 144,
145,	146,	147, 148,	149,	150,	151,	152, 153, 154,	155, 156,
157,	158,	159 ou 160	e terminando	com qualquer um	dos amino-

ácidos entre 281 e 321, de preferência 321.

do polipejq tideo com a formula (I) quência de aminoácidos 321.

Um fragmento preferido é caracterizado por consistir na seentre o aminoácido 119 e o aminoácido

Um outro fragmento preferido do polipeptideo com a fórmula (I) é caracterizado por consistir na sequência de aminoácidos entre os aminoãcidos 148 ou 150 e o aminoácido 321. Estes dois fragmentos podem ser encontra, dos nos sobrenadantes de células RPMI 8866 e portanto corres ponde ao IgE-BF natural.

Os fragmentos podem ter uma metionina ligada ao extremo N especialmente quando obtidos a par. tir de expressão em E.coli.

Os mutantes dos polipeptideos do invento sao caracterizados pela troca de um (mutante pontual) ou mais, até cerca de 10, dos seus aminoácidos contra um ou mais de outros aminoácidos. Eles sao a consequência das correspondentes mutações ao nivel do DNA conduzindo a diferentes codoes.

Derivados do polipeptideo do invento sao aqueles em que grupos funcionais, tais como grupos amino, hidroxilo, mercapto ou carboxilo, sao derivatizados, e.g, glicosilados, acilados, amídados ou esterifiçados respectivamente. Nos derivados glicosilados um oligossacárido é geralmente ligado à asparqgina, serina, treonina e/ou lisina. Os derivados acilados sao especialmente acilados por um ácido natural orgânico ou inorgânico, e.g. ácido acético, ácido fosforico ou ácido sulfurico, o que normalmente ocorre no grupo amino do extremo N ou em grupos hidroxilo, especialmente de tirosina ou serina, respectivamente. Os ésteres sao de álcoois naturais, e.g. metanol ou etanol.

Ainda outros derivados podem ser sais, especialmente sais farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo sais de metais, tais como sais de metais alcalinos e de metais alcalino-terrosos, e.g. sais de sódio, potássio, magnésio, cálcio ou zinco, ou sais de amónio formados com amónia ou com uma amina orgânica adequada, como seja uma alquilamina inferior, e.g. trietilamina, hidroxi-alquil inferior-amina, e.g. 2-hidroxietilamina e similares.

Os polipeptideos com a formula

(I) têm actividade de ligaçao a IgE como pode ser demonstrado pelo ensaio de:inibiçao de rosetas e a ligaçao a anticorpos monoclonais, e.g. a Mab-135 e Mab-176, os quais sao específicos para IgE-BFs. Entre os fragmentos, mutantes e derivados sao preferidos aqueles que possuem actividade de ligaçao a IgE.

Os polipeptideos do invento sao preparados por técnicas de DNA recombinante compreendendo a identificação de um mRNA codificador de tal polipeptideo, preparaçao de um DNA ou cDNA, construção de um vector híbrido cora cDNA, tarnsformaçao de uma célula hospedeira que permita a expressão do referido vector e isolamento dos referidos polipeptideos.

Deste modo o invento diz respeito ainda a um método para a produção de um polipeptideo com a fórmula (I), um fragmento, um mutante ou um seu derivado, caracterizado por

a) cultivar-se ura hospedeiro transformado contendo um vector hibrido compreendendo uma sequência de DNA codificadora de um polipeptideo com a fórmula (I), um seu fragmento ou mutante, ou

b) traduzir-se num sistema de traduçao adequado o mRNA codificador de um polipeptideo com a fórnuLa (I), ura seu fragmento ou mutante e, quando necessário, transformaçao de um polipeptideo com a fórmula (I), um seu fragmento ou mutante, num seu derivado .

a) Os hospedeiros transformados sao seleccionados entre células procarióticas ou eucarióticas, e.g. bactérias, fungos, e,g. leveduras ou células de organismos superiores, incluindo linhas de células humanas. Sao preferidas estirpes de E. coli, e.g. HB 101, BZ 234, B1472 ou estirpes disponíveis de S.cerevisiae, e.g. RH 971, as quais sao transformadas com um vector hibrido codificador de um polipeptideo do invento e contendo promotores, estimuladores, marcas e sequências sinal adequadas e similares.

As células hospedeiras adequadas sao cultivadas por métodos conhecidos na especialidade, geralmente num meio liquido contendo fontes assimiláveis de carbono, azoto e sais inorgânicos e, se necessário factores de crescimento adequados.

Para o crescimento de microorganismos pro e eucarióticos transformados podem ser usadas várias fontes de carbono. Sao exemplos de fontes de carbono preferidas os açúcares assimiláveis, tais como glucose, maltose, manitol ou lactose, ou um acetato, os quais podem ser usados por si só ou em misturas adequadas. Sao exemplos de fontes de azoto adequadas os aminoácidos, proteínas, por exem pio triptona, peptona ou extratos de carne, extratos de levedura, extratos de malte e também sais de amónio, por exemplo cloreto ou nitrato de amónio, os quais podem ser usados por si sós ou em misturas adequadas.

meio contem ainda micronutrientes, por exemplo ioes K⁺, Ca^⁺, Mg^⁺, Fe^⁺, Mn^⁺, Cu^⁺, NO^ , SO^ _s HPOg^ , ^2^4 ’ Cl j » ^e · be preferência adicionam-se substâncias que exerçam uma pressão selectiva e que evitem o crescimento de células que tenham perdido o vector de expressão. Assim, por exemplo, adiciona-se ampicilina ao meio se o vector de expressão hibrido possuir um ge ne amp . A adiçao de substâncias antibióticas também têm o efeito de nao deixar sobreviver microorganismos contaminantes sensíveis ao antibiótico. Se se usar como microorganismo hospedeiro uma estirpe de levedura que seja auxotrofica por exemplo para um aminoácido essencial, o plasmídeo contem de preferência um gene codificador de uma enzima que complemente o defeito do hospedeiro. A cultura da estirpe de levedura é efectuada num meio mínimo deficiente no referido aminoácido .

As células de vertebrados sao cul_ tivadas era condiçoes de cultura de tecidos usando meios comerciais (e.g.Gibco, Flow Laboratories) suplementados na maioria dos casos com soro de um mamifero. As células sao crescidas em larga escala ligadas a um suporte sólido, como sejam frascos rolantes (roller botles'¹), microveículos ou fibras de vidro poroso ou podem crescer livres em suspensão em recipientes adequados.

A cultura é efetuada por processos que sao conhecidos, As condiçoes de cultura, tais como temperatura, valor do pH do meio e tempo de fermentação, sao escolhidos de modo a obter-se um titulo máximo do polipeptideo do invento. Assim, numa estirpe de E.. coli ou de levedura é de preferência cultivada em condiçoes de aerobiose em cultura submersa com agitaçao a uma temperatura de cerca de 20 a 40°C, de preferência cerca de 30°C e um valor de pH de 4 a 8, de preferência à volta de pH7, durante cerca de 4 a 30 horas, de preferência até se atingirem produçoes máximas do polipeptideo do invento.

b) 0 mRNA codificador de polipeptideo do invento pode ser traduzido e expresso num sistema de traduçao adequado como sejam oócitos de Xenopus laevis. 0 mRNA codificador dos po15

lipeptideos do invento é microinjectado em oócitos de Xenopus laevis. Os oócitos transformados sao incubados em solução de Barth, suplementada com FCS a cerca de 20°C durante cerca de 45 horas. Após remoção do meio de incubaçao os oóci. tos foram homogeneizados em tampao de lise de oócitos e centrifugados. 0 sobrenadante contem os polipeptideos do invento como se pode mostrar por um ensaio de RIA usando anticorpos monoclonais. Este método para produção dos polipeptideos do invento é útil principalmente para fins de identificação.

Quando o nivel do polipeptideo do invento atinge um máximo, a cultura é interrompida e pode-se isolar o polipeptideo. Se o polipeptideo fôr usado com uma sequência de peptideo sinal adequada, ele e secretado pela célula directamente para o sobrenadante. Se assim nao fôr as células têm de ser destruídas, por exemplo por tratamento, com um detergente, como seja SDS ou triton ou lisadas com lisozima ou uma enzima que actue de modo semelhante. Se se usar a levedura como microorganismo hospedeiro a parede celular pode ser removida por digestão enzimática com uma glucosidase. Como alternativa ou em adiçao pode-se usar para rebentar as células forças mecanicas, por exemplo forças de acisalhamento (por exemplo prensa X, prensa Francesa, moinho Dyno) ou agitaçao com contas de vidro ou óxido de alumínio ou alternando congelação, por exemplo em azoto liquido, e descongelação, assim como ultra-sons. As proteínas do sobrenadante de células ou a mistura obtida quando do rebentamento de células, incluindo os polipeptideos do invento, sao enriquecidos por métodos bem conhecidos na especialidade, era particular o tratamento com polietileneimina, centrifugação e precipitação com sais, e.g. sulfato de amonio ou sais de zinco. Outros passos de purificação sao por exemplo, ul_ tracentrifugaçao, diafiltraçao, electroforese em gel, processos cromatograficos como seja cromatografia de permuta ió16

nica, cromatografia por exclusão de tamanho, cromatografia liquida de alta pressão, (HPLC), HPLC em fase reversa, cromatografia liquida de pressão rápida (FPLC) e similares, a separaçao dos constituintes da mistura de acordo com o peso molecular por meio de uma coluna de filtraçao com gel adequ<a do, dialise, cromatografia de afinidade, por exemplo cromatografia de afinidade usando anticorpos, especialmente anticorpos monoclonais, em particular Mab-135 e Mab-179 e outros processos conhecidos.

Numa execução preferida os polipeptideos do invento sao isolados a partir dos sobrenadantes de células por filtraçao do sobrenadante através de um ^?'affigel com anticorpos monoclonais, e.g. Mab-45-affigel, elui_ çao do polipeptideo IgE-BF ligado, e.g. com um tampao 0,1 M glicina-HCl de pH2,5, aplicaçao das fracçoes contendo o polipeptideo pretendido numa coluna de permuta aiiónica, e. g Synchropak AX300, lavagem da coluna e.g. com um tampao Tris-HCl, pH 7,4, eluiçao da proteína, e.g. com uma solução de cloreto de sódio, como seja 111 NaCl, diálise e liofilizaçao das fracçoes contendo o polipeptideo pretendido, sujeição das fracçoes dializadas a uma cromatografia de fase reversa, e.g. numa coluna Synchropak RP-4 e eluiçao do polipeptideo preten. dido, e.g. com um gradiente de acetonitrilo/0,1% TFA. Este método é particularmente adequado para a purificação de IgE-BF natural a partir de sobrenadante de células RPIÍI 8866. 0 IgE-BF natural purificado por este método estava suficienteiaente puro para um processo de sequênciaçao de aminoácidos o qual revelou que ele consiste era duas proteínas, as sequêii cias de aminoácidos N-terminais sendo como se segue:

1 4 8 L	149 X	M	E	L Q	V	155 X
e
150	151
M	X	L	Q	V	s	s	G

S	G F	V	160 X	N	T	163 X	P
F	160 V X	N	T	163 X	P	E	K.

A numeraçao corresponde à numeração da fórmula (I). Os aminoácidos designados por 1 nao foram determinados, no entanto por comparaçao com as sequências de DNA da fórmula II ou III podem-se fazer as seguintes desi_tn_eç.oes, a₁₅₁ - ^₁₅₅ - b, a_16q - b, ^₁₅₃ - b.

A análise permite a conclusão de que IgE-BF natural consiste em pelo menos dois polipeptideos com as sequências de aminoácidos estendendo-se entre L^g e ^^21 ^{e entre} ^150 ^e ^3⁹1 (fórmula I) e que ocorrem numa proporção de cerca de 40 a 60.

Finalmente, a actividade de ligaçao a IgE da proteína isolada pode ser determinada por métodos bem conhecidos, e.g. pelos ensaios de inibição de rosetas, pelo bloqueamento da ligaçao de IgE a anticorpos anti-IgE, experiências de cromatografia de afinidade e experiências que meçam a supressão da sintese in vitro de IgE por linfócitos de indivíduos alérgicos.

Polipeptideos do invento tendo a sequência correcta, apesar do enrolamento tridimensional errado, sao úteis como intermediários em experiências de renaturaçao.

invento está também relaccionado com um polipeptídeo da fórmula (I), um seu fragmento, mutante ou derivado, sempre que obtido de acordo com um proces so do invento.

Preparaçao de hospedeiros transformados invento relaciona-se ainda com

um método de passos múltiplos para a preparaçao de um hospedeiro transformado capaz de expressar um polipeptideo do invento, caracterizado por

1. preparaçao de um DNA codificador de um polipeptideo com a fórmula (I), um seu fragmento, mutante ou derivado,

2. incorporação do DNA obtido num vector adequado,

3. transformaçao de um hospedeiro adequado com o vector híbrido obtido,

4. selecçao dos hospedeiros transformados de entre os nao transformados e, facultativamente, isolamento do vector híbrido a partir do hospedeiro transformado, modificação da re_ giao codificadora ou nao codificadora do vector hibrido e realizaçao dos passos 3 e 4 outra vez.

Os passos envolvidos na preparaçao dos hospedeiros estão discutidos mais detalhadamente abai_ xo. 0 invento inclui também os passos isolados.

1. Preparaçao de um DNA codificador de um polipeptideo do invento invento diz respeito a um DNA codificador de um polipeptideo da fórmula I, um seu fragmen19

DNA codificador de um polipepobtido a) por transcrição reversa ) por isolamento a partir de DNA tideo do invento pode ser de mRNA isolado em cDNA, b genómico ou c) por sintese quimica.

No presente invento, desde que fosse desconhecida a estrutura do DNA, este tinha de ser obtido a partir de DNA genómico ou de uma biblioteca de cDNA através do mRNA. Uma biblioteca de cDNA contem a informação genética que é complementar do mRNA isolado a partir de células .

a) Transcripcao reversa de mRNA isolado para cDNA

Para se obter uma biblioteca de cDNA isola-se mRNA a partir de células que expressem actividade de ligaçao a IgE, especialmente células B humanas e linhas celulares que delas derivem. Este mRNA é convertido em cDNA de cadeia dupla. Uma linha de células B humana preferida é RPMI 8866. Outras linhas de células B uteis podem ser preparadas por imortalizaçao de células B naturais com o virus Epstein-Barr. Na preparaçao de mRNA aplicam-se métodos convencionais bem conhecidos. A membrana celular e rebentada e o conteúdo da célula libertado e a partir dele isolado o mRNA. A membrana celular é de preferência rebentada por métodos físicos ou por lise com detergentes tais como SDS, tiocianato de guanidinio, condiçoes salinas definite ou homogeneização, de preferência por mistura. 0 mRNA e isolado pelos métodos convencionais de extracçao com fenol, precipitação com etanol, centrifugação e cromatografia, de preferêri cia uma combinação de vários métodos. A centrifugação é de preferência feita em gradientes por exemplo sobre um gradiente de CsCl. Para cromatografia usam-se depreferência colunas, especialmente colunas de oligo-dT.

mRNA total pode ser convertido directamente em ds-cDNA seguindo os métodos convencionais. De preferência o mRNA codificador de um polipeptideo do invento é ainda enriquecido usando várias técnicas, tais como electroforese, cromatografia e centrifugação, de preferência centrifugaçao em gradientes de sacarose.

As fracçoes contendo mRNA codificador de um polipeptideo do invento podem ser detectadas por vários métodos, como seja traduçao in vivo ou in vitro seguido de detecção da actividade de factor de ligaçao a IgE ou, uma vez conhecida a sequência de nucleotideos por hibridação com um oligonucleotideo sonda.

Os sistemas de traduçao in vivo podem ser sistemas prócarioticos ou eucarióticos. Um sistema de traduçao in vivo preferido é o sistema de oócitos de Xenopus laevis conforme descrito por Ilaniatis et al (1). Os sistemas de in vitro podem ser por exemplo lisados de reticulócitos de coelho ou de gérmem de trigo ambos comerciais.

Os sistemas de detecção para rastreio da propriedade de factor de ligaçao a IgE usam de prferência anticorpos monoclonais contra o polipeptideo da fórmula (I), especialmente Mab-135 ou Mab-176. Um outro sistema possivel usa imunoglobulinas do tipo IgE em imunoensaios convencionais .

A partir de qualquer conjunto de mRNA derivado de mRNA nao fraccionado ou fraccionado pode-es obter ds-cDNA por métodos bem conhecidos na especialidade. Os métodos gerais preferidos estão descritos por Iíaniatis etal. (1), Okayama e Berg (2) e Heidecker et al. (3). Em geral o mRNA é convertido primeiro em ss-cDNA usando a enzima transcriptase reversa e depois em cDNA de cadeia dupla usando as enzimas transcriptase reversa ou DNA polimerase I (fra& mento Klenow). Neste invento o processo é de preferência fei. to de acordo com o método descrito por Iíaniatis et al (1). Em alternativa podem ser usados dois métodos para iniciar a sintese do ds-cDNA. 0 primeiro método usa a formaçao de uma ansa natural do ss-cDNA. 0 segundo método é feito dotando o ss-cDNA com uma cauda homopolimérica como seja poli-dC ou poli-dT.

A fracçao de mRNA da qual o correspondente polipeptideo mostre a actividade mais alta no sistema de detecçao é transcrita em cDNA complementar por métodos bem conhecidos. Misturam-se o mRNA e o oligo-dT como iniciador. Depois, adicionam-se dlíTPs como material de partida e a sintese da molécula híbrida de cDNA-mRNA é realizada pela enzima transcriptase reversa. As moléculas de RNA sao degradadas pela adiçao de NaOII. Mistura-se DNA polimerase, de preferência o fragmento Klenow da DNA polimerase I e a mistura é incubada a uma temperatura adequada, de preferên. cia 12-15°C. A mistura é incubada com nuclease SI e obtido o ds-cDNA correspondente ao mRNA codificador de um polipept£ deo do invento.

Para amplificaçao e elucidação da estrutura o ds-cDNA obtido é introduzido num vector adequado, e.g. o plasmídeo pUC-KO e o vector hibrido obtido é multiplicado pelo uso de um hospedeiro adequado, e.g. E.coli IIB101, conforme aqui é descrito mais detalhadamente. 0 reisolamento

dos vectores hibridos e recuperação do cDiíA inserido a partir deles permite a determinação da estrutura do DMA codificador do polipeptideo do invento. Os vectores hibridos obtidos pCL-2 e pCL-1 contêm inserções com as fórmulas (II) e (III), res pectivamente. A inserção de cDHA do pCL-2 tem a sequencia com a fórmula (II):

AATCGCTCTGGTC1GACCCCAACACA -145 -140-130

CTAGGAGGACAGACACAGGCTCCAAACTCCACTAACCAGAGCTGTGATTGTGCCCGCTGA -120 -110 -100 -90 -80-70

GTGGACTGCGTTGTCAGGGAGTGAGTGCTCCATCATCGGGAGAATCCAAGCAGGACCGCC

-60 -50 -40 -30 -20 -10-1

20

MEEGQYSEIEELPRRRCCRR ATGGAGGAAGGTCAATATTCAGAGATCGAGGAGCTTCCCAGGAGGCGGTGTTGCAGGCGT 1 10 20 30 40 50 60

Q

GGGACTCAGATCGTGCTGCTGGGGCTGGTGACCGCCGCTCTGIGGGCTGGGCTGCTGACT

100 110 120

Q Q

CTGCTTCTCCTGTGGCACTGGGACACCACACAGAGTCTAAAACAGCTGGAAGAGAGGGCT

130 140 150 160 170 180

80

ARNVSQVSKNLESHHGDQMA

GCCCGGAACGTCTCTCAAGTTTCCAAGAACTTGGAAAGCCACCACGGTGACCAGATGGCG

190 200 210 220 230 240

250

260

270

280

290

110

RLKSQDLELSWNLNGLQA

120 D L AGATTGAAATCTCAGGACTTGGAGCTGTCCTGGAACCTGAACGGGCTTCAAGCA1GATCTG

310 320 330 340 350 ^b 360

130 11» 0

SSFKSQELNERNE ASDLLER AGCAGCTTCAAGTCCCAGGAATTGAACGAGAGGAACGAAiGCTTCAGATTTGCTGGAAAGA

370 380 390 400 410 420

Q

CICCGGGAGGAGGTGACAAAGCTAAGGATGGAGTTGCAGGTGTCCAGCGGCTTTGTGTGC

430 440 450 460 470 480

170180

NTCPEKWINFQRKCYYFGKG AACACGTGCCCTGAAAAGTGGATCAACTTCCAACGGAAGTGCTACTACTTCGGCAAGGGC

490 500 510 520 530540

190200

TKQWVHARYACDDMEGQLVS

ACCAAGCAGTGGGTCCACGCCCGGTATGCCTGTGACGACATGGAAGGGCAGCTGGTCAGC

550 560 570 580 590600

Q

ATCCACAGCCCGGAGGAGCAGGACTTCCTGACCAAGCATGCCAGCCACACCGGCTCCTGG

610 620 630 640 650 660

2k0

ATTGGCCTTCGGAACTTGGACCTGAAGGGAGAGTTTATCTGGGTGGATGGGAGCCATGTG

670 680 690 700 710 720

250

260

Q

GACTACAGCAACTGGGCTCCAGGGGAGCCCACCAGCCGGAGCCAGGGCGAGGACTGCGTG

730 740 750 760 770 780

ATGATGCGGGGCTCCGGICGCTGGAACGACGCCTTCIGCGACCGTAAGCTGGGCGCCTGG

790 800 810 820 830 840

GTGTGCGACCGGCTGGCCACATGCACGCCGCCAGCCAGCGAAGGTTCCGCGGAGTCCATG

850 860 870 880 890 900

310

320

GGACCTGATTCAAGACCAGACCCTGACGGCCGCCTGCCCACCCCCTCTGCCCCTCTCCAC910 920 930 940 950 960

TCTTGAGCATGGATACAGCCAGGCCCAGAGCAAGACCCTGAAGACCCCCAACCACGGCCT

970 980 990 1000 10101020

AAAAGCCTCTTTGTGGCTGAAAGGTCCCTGTGACATTTTCTGCCACCCAAACGGAGGCAG

1030 1040 1050 1060 10701080

CTGACACATCTCCCGCTCCTCTATGGCCCCTGCCTTCCCAGGAGT1ACACCCCAACAGCAC

1090 1100 1110 1120 ^K 11301140

CCTCTCCAGATGGGAGTGCCCCCAACAGCACCCTCTCCAGATGAGAGT1ACACCCCAACAG

1150 1160 1170 1180 1Í901200

CACCCTCTCCAGATGCAGCCCCATCTCCTCAGCACCCCAGGACCTGAGTATCCCCAGCTC 1210 1220 1230 1240 12501260

AGGGTGGTGAGTCCICCTGTCCAGCCTGCATCAATAAAATGGGGCAGTGATGGCC

1270 1280 1290 1300 13101315

Na sequência de DNA com a fórmula II a região codificadora do polipeptideo com a fórmula (I) está marcada pelos símbolos de aminoácidos. As regiões delinitantes nao codificadoras também sao partes da região nao codificadora do mRMA isolado. Os locais de restrição e

I estão apresentados.

outro cDNA obtido a partir do mRNA tem a sequência da fórmula (III), em que os nucleotideos codificadores dos aminoácidos 106 a 127 do polipeptideo da fórmula (I), i.e. nucleotideos 316 a 378 da formula (Ií), estão eliminados e em que aliás a região codificadora e parte das duas sequências delimitantes sao idênticas a sequência de DNA da fórmula (II). Esta inserção de cDNA foi encontrada em pCL-1 e tem a sequência com a fórmula (III):

CTAACCACGCTAGTGAGTCAGATTGTAGACTAAACAAAATCAGCCAA -227 -220 -210 -200-190

ATCGGCCCCTGAGTGCCACCAAGTCCCAGATGCTATCCTGTCCTGGTAACTAGGGTTTGA -180 -170 -160 -150 -140-130

TGGCTCACCCTAACCATCATTAAATTCCAAATCAGCCAGAGCTGTGATTGTGCCCGCTGA -120 -110 -100 -90 -80-70

GTGGACTGCGTTGTCAGGGAGTGAGTGCTCCATCATCGGGAGAATCCAAGCAGGACCGCC

-60 -50 -40 -30 -20 -10-1

10 20

MEEGQYSEIEELPRRRCCRR ATGGAGGAAGGTCAATATTCAGAGATCGAGGAGCTTCCCAGGAGGCGGTGTTGCAGGCGT 1 10 20 30 40 5060

3040

GTQIVLLGLVTAALWAGLLT GGGACTCAGATCGTGCTGCTGGGGCTGGTGACCGCCGCTCTGTGGGGTGGGCTGCTGACT

80 90 100 110120

5060

LLLLWHWDTTQSLKQLEERA CTGCTTCTCCTGTGGCACTGGGACACCACACAGAGTCTAAAACAGCTGGAAGAGAGGGCT

130 140 150 160 170180

7080

ARNVSQVSKNLESHHGDQMA

GCCCGGAACGTCTCTCAAGTTTCCAAGAACTTGGAAAGCCACCACGGTGACCAGATGGCG

190 200 210 220 230240

90100

QKSQSTQISQELEELRAEQQ CAGAAATCCCAGTCCACGCAGATTTCACAGGAACTGGAGGAACTTCGAGCTGAACAGCAG

250 260 270 280 290300

110 120

RLKSQELNERNEASDLLERL AGATTGAAATCTCAGGAATTGAACGAGAGGAACGAAGCTTCAGATTTGCTGGAAAGACTC

310 320 330 340 350360

130mo

REEVTKLRMELQVSSGFVCN CGGGAGGAGGTGACAAAGCTAAGGATGGAGTTGCAGGTGTCCAGCGGCTTTGTGTGCAAC

370 380 390 400 410420

T CPEKWI N F ⁵Q R K C Y Υ F G K G*⁶]?

ACGTGCCCTGAAAAGTGGATCAACTTCCAACGGAAGTGCTACTACTTCGGCAAGGGCACC

430 440 450 460 470480

170180 kqwvharyacddmegqlvsi

AAGCAGTGGGTCCACGCCGGGTATGCCTGTGACGACATGGAAGGGCAGCTGGTCAGCATC

490 500 510 520 530540

190200

HSPEEQDFLTKHASHTGSWI CACAGCCCGGAGGAGCAGGACTTCCTGACCAAGCATGCCAGCCACACCGGCTCCTGGATT

550 560 570 580 590600

210 220

GLRNLDLKGEFIWVDGSHVD GGCCTTCGGAACTTGGACCTGAAGGGAGAGTTTATCTGGGTGGATGGGAGCCATGTGGAC

610 620 630 640 650660

230240

YSNWAPGEPTSRSQGEDCVM TACAGCAACTGGGCTCCAGGGGAGCCCACCAGCCGGAGCCAGGGCGAGGACTGCGTGATG

670 680 690 700 710720

250260

MRGSGRWNDAFCDRKLGAWV ATGCGGGGCTCCGGTCGCTGGAACGACGCCTTCTGCGACCGTAAGCTGGGCGCCTGGGTG

730 740 750 760 770780

270280

CDRLATCTPPASEGSAESMG

TGCGACCGGCTGGCCACATGCACGCCGCCAGCCAGCGAAGGTICCGCGGAGTCCATGGGÀ

790 800 810 820 830840

290300

PDSRPDPDGRLPTPSAPLHS CCTGATTCAAGACCAGATCCTGACGGCCGCCTGCCCACCCCCTCTGCCCCTCTCCACTCT

850 860 870 880 890900

TGAGCATGGATACAGCCAGGCCCAGAGCAAGACCCTGAAGACCCCCAACCACGGCCTAAA

910 920 930 940 950960

AGCCTCTTTGTGGCTGAAAGGTCCCTGTGACATTTICTGCCACCCAAACGGAGGCAGCTG

970 980 990 1000 10101020

ACACATCTCCCGCTCCTCTATGGCCCCTGCCTTCCCAGGAGTACACCCCAACAGCACCCT 1030 1040 1050 1060 10701080

CTCCAGATGGGAGTGCCCCCAACAGCACCCTCTCCAGATGAGAGIACACCCCAACAGCAC

1090 1100 1110 1120 11301140

CCTCTCCAGATGCAGCCCCATCTCCTCAGCACCCCAGGACCIGAGTATCCCCAGCTCAGG 1150 1160 1170 1180 11901200

GTGGTGAGTCCTCCTGTCCAGCCTGCATCAATAAAATGGGGCAGTGATGGCC

1210 1220 1230 12401250

b) Um outro meio adequado para a obtenção do DNA codificador de um polipeptideo do invento consiste no Isolamento do referido DNA a partir do DNA genómico de tecido ou de cultura de células. As células são lisadas, de preferência com SDS e pro.

teinase K e o DNA é desproteinizado por extracçoes repetidas cora fenol. 0 RIíA é de preferência digerido com Rliase. 0 DNA bruto obtido é parcialmente digerido com enzimas de restrição adequadas, e.g. Hae III e Alu I e isolam-se os fragmentos de 15-20 kb, multiplicam-se num fago ou cosmideo adequado, e.g. em Charon 4A o.u no fago EMBL-3 e testam-se relativamente às sequências pretendidas, e.g. com uma sonda de DNA marcada radioactivamente ou conforme aqui já foi descrito.

c; Ura terceiro método para a preparaçao do DNA codificador de um polipeptideo do invento é a sintese quimica. A sintese quimica de DUA está apresentada de forma sumária por S.A. Narang (4). As técnicas de sintese conhecidas permitem a preparaçao de polinucleotideos até 40 ou 60 bases com bom rendimento, pureza elevada e num tempo relativamente curto. Os nucleotideos adequadamente protegidos sao ligados pelo método fosfotriéster de K.L. Agarwal et al. (5), pelo método fosfotriester de C.B. Reesem (6) ou pelo método de fosfito triester de R.L. Letsinger et al. (6a). A simplificação da sintese de oligonucleotideos e polinucleotideos é possivel pelo método de fase sélida, no qual as cadeias de nucleotideos sao ligadas a um polímero adequado. Ê vantajoso a utilização de uma máquina sintetizadora de DNA

DNA de cadeia dupla pretendido pode ser construído enzimáticamente a partir de pequenos f raj* mentos sobreponiveis preparados por sintese quimica. Por exem pio, de acordo com Khorana et al. (7), usam-se sequências de polinucleotideos sobreponiveis de ambas as cadeias, as quais sao mantidas juntas no arranjo correcto por emparelhanento de bases e sao então ligadas quimicamente pela enzima DNA ligase. Uma outra possibilidade compreende a incubaçao em ca da caso de uma sequência polinucleotidica das duas cadeias

de DNA com um pequeno segmento sobreponivel na presença dos quatro trifosfatos de desoxinucleosideo com uma DNA-polimerase, por exemplo DNA polimerase I, o fragmento Klenow da polimerase I ou DNA polimerase de T4 ou com transcriptase reversa. As duas sequências de nucleotideos sao assim mantidas juntas do arranjo correcto por emparelhamento de bases e sao suplementadas com os nucleotideos necessários pela enzima para dar um DNA de cadeia dupla completo (S.A. Narang et al (8)).

d) Preparaçao de DNAs codificadores de um fragmento do polipeptideo com a fórmula (I)

Obtêm-se DNAs codificadores de um fragmento do polipeptideo com a fórmula (I) em que o DNA com a fórmula (II) ou (III), ou um vector que os contenha é digerido com uma enzima de restrição adequada e/ou uma exonuclease adequada e, quando necessário, o fragmento de DNA obtido é suplementado com um fragmento de DNA sintetizado por métodos químicos, ou o fragmento pretendido é totalmente sintetizado por métodos químicos.

Na fórmula (II) estão apresentadas as enzimas de restrição adequadas e os seus sitios de restrição. Para a preparaçao dos fragmentos de DNA codificadores da sequência polipeptidica D119 a S321 da fórmula (I), sao adequadas BglII e Rsal. 0 fragmento de DNA codificador da sequência polipeptidica A a pode ser obtido por restrição cora EindIII e Rsal (ver Fórmula II, Fig. 4). A preparaçao dos fragmentos de DNA também pode ser conseguida passo por passo, em que primeiro se prepara um fragmento maior, e.g. por restrição com HincII e Rsal, o qual é subclonado num vector adequado, que é consequtivamente cortado com BglII e Bam29

Hl, ou HindIII, respectivamente (ver Fig. 3 e 4).

A sintese química, total ou parcial, era combinação com a utilização de enzimas de restrição e/ou exonucleases, permite a preparaçao de qualquer fragmento de DNA pretendido incluído na fórmula (II).

invento diz ainda respeito a fra_g, mentos de DNA do DNA da fórmula (II). Os fragmentos sao codificadores de um polipeptideo tendo actividade de ligaçao a IgE ou podem ser usados como sondas para identificação de tal DNA a partir de fontes naturais ou sintéticas. Sao preferidos os fragmentos de DNA que codificam os fragmentos polipeptidicos preferidos incluídos na fórmula (I). As sondas de DNA têm pelo menos 7, de preferência cerca de 15, nucleotideos na sequência.

2. Preparaçao de um vector híbrido

Preparou-se um vector hibrido do invento era que um DNA codificador de um polipeptideo com a fórmula (I), um seu fragmento, mutante ou derivado foi introduzido num vector adequado.

Vectores adequados sao veículos para DNA passageiro integrado, os quais podem ser usados para transformar um microorganismo hospedeiro, incluindo células humanas e que se podem replicar dentro do hospedeiro. Sao adequados como vectores, os plasmideos, fagos ou cosmideos. Os vectores adequados transportam o DNA da inserção numa posição defenida.

Sm geral, tais vectores contêm um replicao e uma sequência de controle, i.e. um promotor, que sao derivados de espécies compatíveis com a célula hospedeira em que sao usados. 0 vector normalmente transporta um sitio de replicaçao, assim como sequências (marcas genéticas) que sao capazes de proporcionar selecçao fenotipica em células transformadas. Marcas genéticas adequadas conferem ao hos_ pedeiro, por exemplo, resistência a antibióticos ou a metais pesados ou podem complementar um defeito genetico do hospedeiro. Outras sequências uteis em tais vectores sequências estimuladoras e activadoras.

Os vectores de partida sao adequados ao uso em células hospedeiras numa larga gama de organismos procarióticos e eucarióticos. 0 vector é seleccionado dependendo das células hospedeiras destinadas a transformaçao.

Os vectores de partida preferidos sao DNA de plasmideos e DNA de bacteriófagos fácilmente adqui ridos. Sao particularmente úteis o plasmideo pBR322 e seus derivados. Tais derivados sao por exemplo, os plasrnideos pUC-3, pUC-9, pI'iB-9, pGEIi -1 e pGEH^-11-2. De entre os vectores bacteriófagicos sao preferidos os DNAs dos fagos lambda, por exemplo, o DNA do fago lambda gt-11. Outros fagos adequados sao Charon 4A e o fago EMBL-3. Os sistemas de clonagem em lambda estão descritos por Maniatis et al. (1).

Um vector transportando um DNA pajs sageiro como seja o da fórmula (II) ou (III) é designado como vector hibrido.

DNA obtido é introduzido no vector de partida por métodos convencionais.

Um plasmídeo de partida, por exemplo, é primeiro linearizado por uma enzima de restrição adequada, e.g. o plasmídeo pUC-KO por PstI, depois provido de caudas dG na presença de dGTP e transferase terminal de desoxinucleotiddos. A inserção de cDNA de cadeia dupla é dotada de caudas dC na presença de dCTP e transferase terminal de desoxinucleotidilos. Combinando ambos, cDNA e vector, resulta no vector hibrido. Preferem-se os bacteriófagos, como seja lambda, para a construção de bibliotecas genómicas. Os sistemas de clonagem em lambda estão descritos por Maniatis et al. (1). 0 DNA vector adequado é digerido totalmente com a enzima de restrição adequada e os braços esquerdo e direito sao separados dos fragmentos centrais por centrifugação em gradientes por velocidade ou electroforese em gel. Un outro método é digerir partes dos fragmentos stuffer com enzimas de res triçao que nao possuam locais de reconhecimento no braço esquerdo e direito. 0 DNA genómico isolado é parcialmente digerido em fragmentos de 15-20 kb de comprimento. Depois disto os braços sao ligados com os fragmentos de DNA estranho tendo extremos compatíveis com os dos braços.

A inserção de DNA adequada é reclo_ nada a partir do vector original usado para a clonagem original num vector de expressão adequado. Para tal, usara-se enzimas de restrição adequadas (Fig. 3 e 4), eventualmente em combinação com exonucleases, em partículas Bal31, para produzir os fragmentos de DNA pretendidos. Estes fragmentos sao integrados num vector de expressão adequado usando os extremos coesivos directamente ou pela adiçao de fontes oligonucleotidicas adequadas obtidas por síntese química. Para a modificação dos extremos pode-se usar por exemplo HindIII e BglII. 0 método nao está limitado a estas enzimas de restrição eia especial. Qualquer elo de ligaçao que se pretenda pode ser feito entre o vector de expressão e a inserção de DNA usando

enzimas de restrição adequadas em combinação com oligonucleo tideos obtidos por síntese quimica.

invento também está relacionado com um vector hibrido com um DNA codificador de um polipeptideo com a fórmula (I), um seu fragmento mutante ou derivado, operacionalmente ligado a uma sequência de controle da expres.

Para a expressão usa-se um vector hibrido de expressão adequado. 0 termo vector hibrido de expressão inclui vectores especiais os quais sao capazes de expressar as sequências de DNA neles contidas, sempre que tais sequências estejam operacionalmente ligadas a outras sequências capazes de efectuar a sua expressão, i.e., sequências de operador, estimulador e promotor. Resumindo, os vectores de expressão sao caracterizados numa difiniçao funcional:

qualquer sequência de DNA que seja capaz de efectuar a expres. sao da sequência de DNA especifica nele incluída. 0 invento contendo as inserções do invento.

pretende incluir todas as formas de vectores híbridos de expressão que possam ser feitas a partir de um vector de expre£ sao conhecido e equivalentes funcionais de

DNA codificadoras de um polipeptideo

Pode-se usar várias sequências de controle da expressão para a regulaçao da expressão gené tica. Os vectores de expressão microbianos contêm normalmente promotores que sao usados pelo hospedeiro microbiano para a expressão das suas próprias proteínas. Os promotores mais vulgarmente usados nas construções de DNA recombinante inclu em os sistemas de promotores da ^-lactamase e da lactose (Ch ang et al. (9); Goeddel et al.(10), o sistema promotor do triptofano (trp) (Goeddel et al (11)) ou um sistema promotor de bacteriófago como seja o promotor P^ de lambda. Se bem que estes sejam os mais vulgarmente usados, foram descobertos

e utilizados outros promotores microbianos e publicados os detalhes respeitantes às suas sequências de nucleotideos permitindo ao técnico especializado liga-los funcionalmente com plasmídeos vectores (Sielbenlist et al. (12)). Em principio, são adequados todos os vectores que se repliquem e expressem os polipeptideos do invento no hospedeiro escolhido. Sao exem pios de vectores adequados à expressão do referido polipeptideo os plasmídeos pKK223-3, pDR720 e pPL-lambda ou os vectores do bacteriofago lambda tais como λ-gtll, todos comerciais (Pharmacia, Sweden; Promega Biofec, USA). Os vectores preferidos do presente invento sao os vectores de expressão e secreção do tipo pIN-ompA (Gharayeb et al (13)) e vectores contendo o promotor PL.

Os vectores que sao adequados à replicaçao e expressão em levedura comtem um ou mais, e.g. dois, origem de replicaçao de levedura e uma ou mais marcas genéticas selectivas para levedura. Os vectores hibridos que contem uma origem de replicaçao de levedura, por exemplo um segmento de replicaçao autónoma (arsl) ou a 2 ji ori, sao mantidos extracromossómicamente dentro da célula de levedura após transformaçao e sao replicados autonomamente. As marcas genéticas adequadas para leveduras sao particularmente as que conferem resistência a antibióticos ao hospedeiro ou no caso de mutantes de levedura auxotróficos, genes que complementem lesões do hospedeiro. Genes correspondentes conferem, por exem pio, resistência ao antibiótico ciclo-heximida ou proporcionam protrofia num mutante de levedura auxotrófico por exemplo os genes URAS, LEU2, HIS3 ou, em particular o gene TRP1. Os vectores hibridos de levedura contêm ainda, de preferência, uma origem de replicaçao e uma marca genética para um hospedeiro bacteriano, em particular E.coli, de modo a que a construção de clonagem dos vectores hibridos e seus intermediários possa ter lugar também num hospedeiro bacteriano

(vectores vai-vem). As sequências de controle que sao adequadas à expressão em levedura sao, as de genes de levedura usados os promotores do gene da fosfatase (PHO3 ou um promotor envolvido na via glicolítica, motor da enolase, (GAPDH) altamente gene TRP1, ou PH05), da expressão por exemplo, ssim podem ser I ou ADHII, do isocitocrómio da gliceraldeido-3-fosfato ou 3-fosfoglicerato cinase (PGK).

como seja o pro_ desidrogenase

Os motores que podem ser ligados condiçoes de crescimento. Por ser reprimido ou desreprimido vectores preferidos contêm prg ou desligados por variaçao das exemplo o promotor PH05 pode apenas aumentando ou diminuindo a concentração de fosfato inorgânico no meio.

is aos genes locais splicing, locais de poliadenilaçao e eventualmente uma em células

Os vectores de expressão para tacélulas geralmente incluem uma unidade estimulador/promotor versátil e forte situada antes do gene a ser expresso. Se o cDNA tiver de ser expresso, adiciona-se de sequência terminadora da transcrição. Para usar de mamifero as funções de controle nos vectores sao muitas vezes fornecidas por material virai. Por exemplo as unidades estimulador-promotor vulgarmente usadas vadas do virus Simio 40 (SV40), do Adenovirus 2 ou citomegalóvirus de particular sao adequados a unidade sao deri^ de Rous,

Em virus do sarcoma murganho ou humano, estimulador-promotor do gene precoce imediato de citomegalovirus de murganho e o estimulador de SV40 combinado com o promotor dací-globina hu mana. Em adiçao sao úteis os promotores induziveis como sejam os derivados dos genes de choque térmico ou de metalotionina. Ainda é também possível utilizar sequências de promotor ou de controle que normalmente estão associadas à sequência do gene pretendido. Uma origem de replicaçao pode ser

proporcionada quer pela construção do vector de modo a incluir uma origem exógena, como seja uma derivada do SV40 ou de outra fonte virai (e.g. polioma, adeno, VSV, SPV, etc) ou proporcionada pelo mecanismo de replicaçao cromóssomica da célula hospedeira. Se o vector fôr integrado no cromossoma da célula hospedeira este ultimo método é muitas vezes suficiente .

reisolamento do DNA do vector contendo a inserção de DNA clonado a partir de um hospedeiro é conseguido de acordo com métodos convencionais, em particular pela lise da célula hospedeira e purificação do DNA por centrifugação em particular centrifugação em gradientes de densidade de CsCl e extracçao com fenol/clorofórmio.

invento está também relacionado com vectores híbridos compreendendo como inserção uma sequência de DNA codificadora de um polipeptideo com a fórmula (I) ou um seu fragmento, mutante ou derivado.

Em particular, o invento diz respeito a um vector híbrido compreendendo como inserção uma sequência de DNA codificadora de um fragmento do polipeptideo com a fórmula (I), caracterizado por a inserção:codificar:

um polipeptideo com a fórmula (I), em que a sequência de aminoácidos compreendendo os aminoácidos 106 a 127 foi eliminada ; ou um fragmento do polipeptideo com a fórmula (I), o qual é seleccionado do grupo constituído por polipeptideos que começam com qualquer um dos aminoácidos 120, 121, 122, 123, 124,

125,	126,	127,	128,	129,	130,	131,	132,	133,	134,	135,	136,
137,	138,	139,	140,	141,	142,	143,	144,	145,	146,	147,	148,
149,	150,	151,	152,	153,	154,	155,	156,	157,	158,	159	ou 160

e terminando com qualquer um dos aminoácidos entre 282 e 321; ou um fragmento do polipeptideo com a fórmula (I), o qual consiste na sequência de aminoácidos entre o aminoácido 119 e o aminoácido 321; ou um fragmento do polipeptideo com a fórmula (I), o qual consiste na sequência de aminoácidos entre o aminoácido 134 e o aminoácido 321; ou um fragmento do polipeptideo com a formula (I) o qual consiste na sequência de aminoácidos entre o aminoácido 148 e o aminoácido 321; ou um fragmento do na sequência de noácido 321.

polipeptideo com a fórmula (I) que aminoácidos entre o aminoácido 150 consiste e o amipeito com a

Em particular o invento diz resa um vector hibrido compreendendo uma sequência de DNA fórmula (II) ou (III) ou um seu fragmento ou mutante.

Vectores híbridos específicos sao pCL2, pCLl, pFK-1, /ND, pCAL8-BF/ND e pFK-2, pPL-BF, pJDB207R/PH05-BF, pCAL5-R/ pPL.PTIS-BF (Fig. 1 a 8).

Outro vector híbrido de acordo com o invento compreende uma sequência de DIÍA de pelo menos 12 ácidos nucleicos que sao 100% homólogos de uma parte da inserção com a fórmula (II).

3. Transformaçao de um hospedeiro

A seguir a um vector de expressão forte usa-se uma célula hospedeira compatível para a expressão do polipeptídeo pretendido do invento. Em geral preferem-se os procariotas para a clonagem das sequências de DNA e montagem dos vectores. Os vectores montados sao então transferidos para células hospedeiras adequadas, pelo que podem ser usadas células procarióticas assim como eucarióticas. As espécies microbianas que podem ser usadas incluem E.coli, Bacillus subtilis, Bacillus staerothermophilus e outras enterobacteriáceas, como sejam Salmonella typhimurium ou Serratia marcesans e várias espécies de pseudomonas. Em particular sao úteis as estirpes de Ξ. coli tais como E. coli B, I-IBIOI, BZ234, X1776, W3110, JA221 e K12. Certamente que estes exemplos sao apenas ilustrativos e nao limitantes.

Além de procariotas também podem ser usados microorganismos eucarióticos, por exemplo leveduras. Saccharomyces cerevisiae, ou a vulgar levedura de padeiro é o microorganismo eucariótico mais usado, ainda que possam ser usadas uma série de outras espécies. Para a expressão em Saccharomyces, pode-se usar por exemplo o plasmídeo YR 7 (Stinchomb et al. (14); Kingsman et al. (14a), Tschemper et al. (15)).

Além dos microorganismos podem ser usadas como hospedeiros culturas celulares derivadas de organismos multicelulares. Em principio pode-se trabalhar com qualquer uma dessas culturas, quer de vertebrados quer de invertebrados; no entanto, sao de maior interesse as culturas de células de vertebrados. Sao exemplos de tais linhas de células hospedeiras úteis, as células Vero e Hela, as linhas celulares de ovário de hamster Chinês (COH), linhas celulares de melanoma de Bowes, e as linhas celulares RPMI 8866 e Cos-7.

A transformaçao de uma célula recipiente com o DNA do vector hibrido obtido é conseguida por métodos bem conhecidos,

e.g. como descrito por ϊ-íaniatis et al (1). As bactérias sao hibrido e.g. pelo método transformadas com o DNA do vector de transformaçao com CaCl.

Um outro método de transformaçao adequado para a bactéria hospedeira E.coli, em ligaçao com o DNA de fagos lambda como vector, é o empacotamento in vitro do DNA do vector hibrido e infecçao da referida bactéria. 0 empacotamento in vitro é principalmente conseguido usando Kits” de empacotamento comerciais (Pharmacia, Sweden; Boehringer, Mannheim). Λ infecçao é feita pelo método de MgCl? conforme descrito por Maniatis (1), página 275,

A transformaçao de leveduras compreende, por exemplo, os passos de remoção enzimatica da parede celular de levedura por meio de glucosidases, tratamento dos esferoplastos obtidos com o vector na presença de po-2+ lietilenoglicol e ioes Ca e regeneração da parede celular por embebiçao dos esferoplastos em agar. De preferência o agar de regeneração é preparado de modo a permitir a regeneração e selecçao das células transformadas em simultâneo.

A transformaçao das células de vertebrados crescidos em cultura de tecidos e conseguida usaii do um de vários métodos bem conhecidos. Pode-se usar a microinjecçao directa do DNA para o núcleo da célula, fusão dos protoplastos de E.coli com a futura :célula hospedeira ou a adiçao de coprecipitados entre DNA e fosfato de cálcio. Pode-se fazer a selecçao subsequente de células transformadas usando uma marca selectiva que está covalentemente integrada no vector de expressão ou é adicionada como uma entidade separada. As marcas selectivas incluem genes que conferem resistência a anticorpos tais como G418 e higromicina ou genes que complementem uma lesão genética da célula hospedeira como seja a ausência de timidina cinase ou de hipoxantina fosforribosilo transferase.

4. Selecçao de hospedeiros transformados

Os hospedeiros portadores de propriedades das unidades de selecçao integradas nos vectores sao seleccionados de entre hospedeiros não transformados especialmente por crescimento das bactérias em condiçoes de selecçao adequadas nas quais apenas os hospedeiros transformados sobrevivem. Um outro método de selecçao em relaçao aos bacteriofagos é a formaçao de placas numa sementeira de bactérias hospedeiras E.coli.

despiste de hospedeiros portadores de um vector hibrido compreendendo como inserção uma sequência de DNA codificadora de um polipeptideo do invento pode ser conseguido usando sondas oligonucleotidicas marcadas radioactivamente codificadoras de um fragmento de tal po40

lipeptideo ou por despiste do produto polipeptidico da referida inserção de DNA, A hibridaçao é feita especialmente com mRNA ou qualquer outra sonda oligonucleotidica contendo cerca de 12 ou mais nucleotideos cosequtivos codificadores de um fragmento de um polipeptideo do invento.

Em particular, a selecçao de hospedeiros E.coli transformados pelos vectores hibridos, portadores de uma inserção codificadora de um polipeptideo do invento pode ser efectuada por meio de hibridaçao de uma sonda oligonucleotidica com réplicas em filtros derivados de uma biblioteca de cDNA que é espalhada em placas de agarose. 0 oligonucleotideo pode ser marcado no extremo 5’ com P-x/ATP usando a enzima T4-cinase ou internamente através de sintese com iniciador com polimerase Klenow usando qualquer fragmento do cDNA codificador de um polipeptideo do invento clonado no fago M13.

produto proteico para fins de despiste é obtido por traduçao in vitro ou in vivo em particular usando o sistema de oócitos de Xenopus laevis, conforme descrito por Maniatis et al. (1). 0 produto proteico traduzido detecta-se utilizando anticorpos monoclonais, como seja Mab-45, Mab-176 e Mab-135 ou usando um sistema de testes funcional como seja ligaçao da IgE, ao polipeptideo como é feito no teste de inibição de rosetas por Sarfati et al. (17).

Os fagos recombinantes portadores de uma sequência de DNA para um polipeptideo do invento sao identificados por hibridaçao pela qual uma sequência de ácido nucleico marcada radioactivamente compreendendo um fragmento de DNA codificador do referido polipeptideo é usado na hibridaçao. Como alternativa eles sao detectados por despiste imunológico usando anticorpos monoclonais, como sejam

Mab-135 e Mab-176.

ra ou nao métodos aqui descritos, e.g.

Modificação da região codificadocodificadora do vector hibrido consegue-se e.g. por em ld) .

doenças os tipos *

invento está ainda relacionado com a utilização de polipeptideos do invento com actividade de ligaçao a IgE para o tratamento ou prevenção de alérgicas em pacientes que sejam alérgicos a todos de antigénios, por exemplo pólens, pelos de gatos, ácaros do pó da casa e similares. Será particularmente importante o tratamento de pacientes de alto risco durante periodos críticos, incluindo especialmente recém-nascidos de alto risco que nao sao alimentados ao peito. Os polipeptideos do presente invento sao administrados enteralmente, via nasal, intramuscular, por rectal ou oral, ou parenteralmente, subcutânea ou intravenosamente, exemplo por por exemplo geralmente em formas de unidade de dosagem tais como comprimidos, drageias, ampolas, frascos ou supositórios. A quantidade do polipeptideo a ser administrada depende da sua actividade especifica, do peso e do estado geral do paciente, da gravidade da doença, do modo de administraçao e tem de ser baseada na avaliaçao do médico. Em geral pode-se administrar uma dose entre cerca de 100 jig e cerca de 5000 |ig por Kg de peso do corpo e por dia.

invento está ainda relacionado com preparações farmacêuticas contendo os polipeptideos do invento tendo actividade de ligaçao a IgE numa quantidade antialergicamente eficaz facultativamente em conjunto com vei^ culos convencionais farmaceuticamente aceitáveis que sejam adequados à administraçao oral, rectal, nasal ou parenteral, i.e. administraçao intramuscular, subcutânea ou intraperito42

neal e que nao interfiram prejudicialmente com os ingredien tes activos.

Existem comprimidos, capsulas, ampolas contendo um pó sólido ou nebulizadores, vaporizadores, frascos, ampolas e similares contendo soluçoes de infusão, de preferência soluçoes aquosas ou suspensões sendo possível prepara-las antes de usar, por exemplo a partir de preparações liofilizadas que contem o ingrediente activo sozinho ou juntamente com um veiculo, como seja manitol, lactose, glucose, albumina e similares. A preparaçao farmacêutica pode ser esterilizada e, caso se pretenda, misturada com aditivos, por exemplo preservativos,estabilizantes, emulsionantes, solubilizantes, tampões e/ou sais para regulaçao da pressão osmótica. A esterilização pode ser conseguida por filtraçao estéril através de filtros de poro pequeno (0,45 um de diâmetro ou menos) depois do que a preparaçao pode ser liofilizada, caso se pretenda. Também se pode adicionar antibióticos para assegurar a preservação da esterilidade.

As preparações farmacêuticas de acordo com o presente invento sao distribuídas em formas unitárias de dosagem, por exemplo ampolas, compreendendo 1 a 2000 mg de um veículo farmaceuticamente aceitável por unidade de dosagem e cerca de 1 a 100 mg, de preferência cerca de 2 a 50 mg do ingrediente activo por unidade de dosagem.

invento também está relacionado com um método para a produção de uma preparaçao farmacêutica caracterizada por um polipeptideo do invento ser misturado com um veículo farmaceuticamente aceitável.

As preparações farmacêuticas sao produzidas de modo conhecido per se, por exemplo por mistura

dissolução, liofilizaçao e processos similares convencionais e contem entre cerca de 0,1% e 100%, especialmente entre cerca de 1% e 50 % de sibstâncias activas.

Ê também objectivo do presente invento a utilização de novos polipeptideos do invento no tratamento profilático e terapêutico do corpo humano.

As abreviaturas usadas ao longo da descrição têm os seguintes significados:

pb	pares de bases
BSA	albumina do soro bovina
cDNA	DNA complementar
cpm	contagens por minuto (decaimento radioactivo)
dA	2'-desoxiadenosina
dATP	trifosfato de 2’-desoxiadenosina
dC	2*-desoxicitidina
dCTP	trifosfato de 2’-desoxicitidina
dG	2’-desoxiguanosina
dGTP	trifosfato de 2’-desoxiguanosina
dT	2'-desoxitimidina
dTTP	trifosfato de 2’-desoxitimidina
DNA	ácido desoxirribonucleico
dNTP	mistura de dATP, dCTP, dGTP, e dTTP
ds	cadeia dupla
DTT	1,4-ditiotreitol
EDTA	acido etilenodiaminotetracético, sal di-sodico

FCS	soro fetal de vitela
HAT	hipoxantina / aminopterina / timidina
HBSS	solução salina equilibrada de Hank
HT	hipoxantina/aminopterina
Hepes	Ãcido N-2-hidroxietilpiperazina-N’-2-etenossulf nico
IgE	imunoglobulina E
mRNA	RNA mensageiro
min	minutos
PBS	soro fisiólogico tamponado com fosfatos
Pipes	piperazino-N,N’-bis (ácido 2-etanossulfónico)
PMSF	fluoreto de fenilmetilsulfonilo
RIA	ensaio radioimune
RNA	acido ribonucieico
rpm	revoluções por minuto
SDS	dodecilsulfato de sódio
ss	cadeia simples
Tris	tris (hidroximetil)aminometano
tRNA	RNA de transferência
ug	micrograma

Os exemplos que se seguem servem para ilustrar o presente invento mas nao devem ser pensados como uma limitaçao dele.

Exemplos

Usaram-se as seguintes soluçoes tampao e meios:

agar tampao de eluiçao caldo LB solução de lise

HBSS

HBSS-FCS meio HT meio HAT

MBS-H agar Mc Conkey caldo LB suplemento com 2% de agar mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,2% de SDS

1% Bacto-triptona (Difco), 0,5% Extrato de levedura Bacto (Difco),

170 mM NaCl, ajustado a pH 7,5 com NaOH

0,5 M NaOH, 1,5N NaCl

8g NaCl, 400 mg ICC1, 48 mg Na₂HP0₄ 350 mg NaHCOg, 60 mg KH₂PO₄, 100 mg de vermelho de fenol em 1 litro de h₂o.

HBSS suplentado com 10% FCS, 0,01% NaN₃, 66 mM Tris-HCl pH 7,2 meio RPMI/c suplementado com 40 pl de 2-mercaptoetanol, 100 hipoxantina, 1 jiM timidina meio HT suplementado com 10 pM aminopterina mM NaCl, 1 mM KC1, 0,33 mM (CaN0₃)₂, 0,41 mM CaCl₂, 0,82 mM MgSO₄, 2,4 mM NaHC0_3> 10 mM Hepes (pH 7,4) g de agar Mc Conkey pré-misturado (Becton Dickinson) para um litro de água destilada tampao de lise de

PBS meio RPMI 1640 meio RPMI 1640/c tampão RVT meio SOC tampao SSC tampao TBE tampao TE tampao TNE tampao de lavagem oócitos 20 mM Tris-HGl pH 7,5, 50 mM NaCl,

0,5% Triton X-100,0,5% desoxicolato de sódio, 0,1% de me tionina, mM PMSF litro contem 8 g de NaCl, 0,2 g de KC1, 1,44 g Na.HPO,.2H_?0, 0,2 g kh₂po₄ comercializavel pela Gibco meio RPMI 1640 suplementado com 1% penicilina-estreptomicina (Gibco), 1% L-glutamina (Gibco) e 15% (v/v) FCS (Gibco)

200 mM Tris-HCl, pH 8,3 a 42°G, mM MgCl₂, 280 mM KC1, 20 mM DTT

2% Triptona Bacto (Gibco), 0,5%

Extrato de levedura (Gibco), 10 mM NaCl, 2,5 mM KC1, 10 mM MgCl₂,5 mM MgSO^, 20 mM Glucose mM citrato de sódio, 150 mM

NaCl litro contem 10,8 g Tris, 5,5 g ácido bórico, 4 ml 0,5M EDTA (pH 8,0) mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 0,lM NaCl, ajustado a pH 7,8 com NaOH mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA

0,5M NaCl, 0,2% SDS

Uso de enzimas de restrição e isolamento de DNA

Todas as enzimas de restrição sao usadas nas condiçoes de tamponizaçao recomendadas pelo fornecedor na folha de dados da enzima. Em geral, usam-se 3 Unidades de uma enzima para digerir 1 jig de DNA. As incubações sao deixadas durante 2 horas a 37°C. Para parar a reacçao enzimatica adiciona-se EDTA e Na-acetato para concentrações finais de 15 mM e 200 mM respectivamente. Para extrair o DNA adiciona-se um volume de uma mistura a 1:1 de clorofórmio/ /fenol, pré-saturado com TNE,e agita-se vigorosamente a mistura. As fases orgânicas e aquosa sao separadas por centrifugação a 5000 g durante 5 min. (temperatura ambiente). A fase aquosa é transferida para um novo tubo e extraída com 1 volume de clorofórmio. Após centrifugação o DNA é precipitado pela adiçao de 2,5 volumes de etanol. A amostra é incubada pelo menos 2 horas a -20°C e centrifugada a 10000 g durante 10 minutos. 0 sedimento de DNA é lavado uma vez com 70% de etanol, seco durante 10 minutos num excicador de vácuo e finalmente dissolvido num volume adequado de tampao TE.

Utilizaram-se as seguintes estirpes:

E.coli estirpe HB101; F , hsdS20 (r „, m B), recA13, aral4, proA2, lacYl, galK2, rspL20 (Sm’), xyl-5, mtl-1, supE44,A (Boyer e Rouland-Dussoix 1969 ; Bolivar e Backman 1979).

Linha celular RPMI 8866; As células RPMI 8866 (ATCC N^SCCL 107) sao de uma linha de células B linfoblastoides que expressam os receptores para IgE. A linha celular foi recebida do Dr. P.Ralph, Sloan-Kettering Research Institute, NY, USA.

Usaram-se os seguintes plasmideos;

pUC-9: Comercializavel pela Pharmacia, P-L Biochemícas Upsall Suécia. 0 plasmídeo pUC-9 consiste num gene para ampicilinase derivado do pBR 322 e uma origem de replicaçao de DNA ligada a uma porção do gene lac Z de E. coli. Na região lac Z deste plasmídeo foi introduzida uma inserção de DNA contendo um arranjo de sitios únicos de reconhecimento por enzimas de restrição.

pUC-KO: Este plasmídeo é um derivado de pUC-9 em que a região do promotor / operador do gene lac Z foi eliminada entre o sitio de restrição HaelI imediatemente fora da sequência do promotor e o sitio de restrição HindIII, dentro do poli-adaptador, deixando as outras sequências do plasmídeo pUC-9 inalteradas .

TM pGEM -1: Comercializavel pela Promega Biotec, Madison, USA. Este plasmídeo é um vector de transcrição especial. Foi construído usando o plasmídeo pSP64 contendo o promotor bacteriofago SP6 (Melton, D.A., et al (16)) e um promotor do bacteriofago T7. 0 plasmídeo resultante tem dois promotores opostos SP6 e T7, separados por um pequeno pedaço de DNA contendo múltiplos locais de clonagem.

Plasmideos pIN-III-ompA; Descritos por Gharayeb et al. (13). Estes plasmideos sao vectores de clonagem especiais para secreção em E.coli. A secreção do produto do gene clonado atra vés da membrana citoplasmática pode ser conseguida fundindo os polipeptideos sinal adequados ao extremo amino do produto

do gene. Nestes plasmideos o fragmento de DNA codificador do peptideo sinal da proteína ompA, uma das principais proteínas de membrana de E.coli, foi inserida num vector de alta ejí pressão. Pode-se clonar um fragmento de DNA estranho em qualquer uma das três grelhas de leitura nos sitios únicos EcoRI, HindIII ou BamHI imediatamente após a sequência do peptideo sinal ompA. Os plasmideos pIN-III-ompÁ do tipo 1, 2 e 3 trigger diferentes grelhas de leitura para traduçao.

EXEMPLO 1

Isolamento de mRNA a partir de células RPMI 8866

As células RPMI 8866 cultivam-se em frascos de cultura de tecidos (Falcon 175

2. cm ) com 50 ml de meio RPMI

1640 suplementado com 15% FCS,

100 unidades/ml de penicilina e 100 ug/ml de estreptomicina frascos confluentes (aproximadamente 10

As células de células/frasco) colhem-se por centrifugação e lavam-se uma vez com 50 ml de PBS. 0 sedimento de células (5 g) é dissolvido em 25 ml de uma solução preparada a partir de 100 g de tiocianato de guanidinio, 100 ml de 1^0, 10,6 ml de 1M Tris-HCl, pH 7,5, 4,2 ml de EDTA 0,5M, 21,2 ml de 20% N-laurilsarcosina e 2,1 ml de 2-mercaptoetanol. 0 lisado celular é homogeneizado num omnimixer durante 90 segundos a toda a velocidade. Adiciona-se dois volumes de uma mistura a 1:1 de clorofórmio e fenol. A mistura é agitada vigorosamente durante 1 min e depois centrifugada a 5000 g durante 10 min numa centrífuga Sorvall a 10°C. A fase aquosa é recuperada e repetida a extracçao mais 4 vezes. Adicionam-se dois volumes de etanol à fase aqii osa. Recupera-se o precipitado por arrefecimento a -20°C du50

rante 15 minutos seguido de centrifugação a 10000 rpm a 4°C num rotor Sorvall SS34 durante 10 minutos. 0 sedimento é d is, solvido em 4 ml de tampao TE. Adiciona-se 7,5 g de CsCl (Merck) e 50 pl de O,1NHC1 e a solução é ajustada a 7,5 ml e colocadas sobre uma almofada de 2 ml de 5,7M CsCl num tubo de centrífuga de 12 ml. 0 tubo é cheio até acima com E^O e centrifugado durante 16 horas a 29000 rpm 20°C num rotor TST 41 (Kontron). No fim da corrida a maior parte do sobrenadante é removido e o tubo escorrido por inversão rápida. 0 sedimento de RNA transparente é dissolvido em 1 ml de tampao TE e 0,2% de SDS agitando com vortex e aquecendo ocasionalmente (2 minutos) a 37°C. 0 RNA é precipitado com etanol como descrito por Maniatis et al. (1) p. 461-462. 0 mRNA pretendido é dissolvido em 1 ml de tampao de eluiçao. Após aqu£ cimento durante 2 min a 68°C e arrefecimento em gelo, adiciona-se 130 p.1 de 5M NaCl e a solução e aplicada a uma coluna de 2 ml de oligo-dT celulose (2 ml de volume de leito numa seringa de 5 ml tipo 7, P-L Biochemicals) equilibrada em tam pao de lavagem. Após duas aplicações subsequentes da amostra a coluna é lavada com 15 ml de tampao de lavagem e o mRNA ligado eluido com 4 ml de tampao de eluiçao. 0 material eluido é aquecido durante 2 min a 68°C, arrefecido em gelo e adiciona-se 0,44 ml de 5M NaCl. A solução é aplicada duas vezes á coluna de oligo-dT celulose re-equilibrada. Após lavagem com 15 ml de tampao de lavagem o mRNA ligado é eluido com 4 ml de tampao de eluiçao. A recuperação do mRNA é determinada medindo a observância a 260 nm (0D«,_n =1 está de acordo com uma concentração de 40 pg/ml). 0 mRNA (150 jig) é precipitado com etanol. 0 precipitado é colhido por centrifugação (15 min a 16000 g), dissolvido em 0,4 ml de e re-precipitado com etanol. 0 sedimento de mRNA é seco ao ar e dissolvido em 150 jil de tampao TE suplementado com 0,1% de SDS.

	EXEMPLO 2
Enriquecimento em mRNA	codificador dos polipeptideos receptor

de IgE e relacionados com IgE-BF.

(1 |ig/ml) sao aquecidos em gelo e aplicados sobre

130 jig de mRNA poli-A do Exemplo durante 5 min a 70°C, arrefecidos um gradiente linear de 5-20% de sacarose, em 0,lM NaCl, mM Tris-HCl pH 7,5, mM EDTA e 0,5S

SDS. 0 gradiente é centrifugado durante 5 horas a 41000 rpm num rotor TST41 a 25°C.

Colheram-se 30 fraccoes (volume 0,4 ml/fracçao) e testaram-se por injecçao em oócitos de Xenopus laevis, conforme descrito no Exemplo 3.

EXEMPLO 3 traduçao in vivo de mRNA em oócitos de Xenopus laevis

Pode-se obter Xenopus laevis adul tos macho e fêmea a partir de uma variedade de fornecedores de animais, incluindo K. Evans (716 Northside, ann Arbor, MI 48109). As ras podem ser mantidas em qualquer tipo de tanque com água, sem arejamento, a 18-22°C. A alimentaçao regular (duas vezes por semana) com fragmentos de fígado ou de coraçao ajudará a manter uma colónia saudável. 0s oócitos devem ser obtidos a partir de fêmeas adultos e saudáveis de Xenopus. Isto é facilmente conseguido por anestesia da ra numa solução de 1:1000 (p/v) de m-aminobenzoato de etilo em água durante 10-30 minutos. Uma pequena incisão (1 cm) no lado ventral posterior da fácil acesso ao ovário da ra. Após remoção de um segmento de ovário a incisão pocb ser suturada e

a ra recuperará rápidamente na agua. 0 ovário deverá ser colocado imediatamente em siluaçao salina de Barth modificada (MBS-H) e os oócitos individuais sao separados uns dos outros com uma ansa de platina. Injectam-se oócitos grandes já completamente crescidos usando um micropipeta fina, uma seringa micrométrica e qualquer esteriomicroscópio de dissecação convencional. A construção de uma pipeta de injecçao adequada está descrita por Gurdon (18). Os oócitos sao colocados numa lâmina de microscópio, secos por capilaridade usando uma toalha de papel e a lâmina é então colocada no stage do microscópio. Antes e durante a inserção da pipeta os oócitos podem ser manipulados com blunt watchmaker's fórceps. Após a pipeta ter penetrado nos oocitos introduz-se uma aliquota de 30-50 ml das soluçoes de mRNA (1 mg/ml) do Exemplo 2 usando a seringa do micrómetro. Grupos de 40 ovos contendo o mRNA da mesma fracçao sao incubados em 0,5 ml de solução de Barth, suplementada com 6% FCS durante 45 horas a 20°C. Remove-se o meio de incubaçao e os oócitos sao homogeneizados em 900 jil de tampao de lise de oócitos. 0 homogenato é centrifugado numa centrífuga Eppendorf durante 10 minutos. A fase superior é recuperada e aliquotas de 50 jil testadas numa RIA, como descrito no Exemplo 7.

EXEMPLO 4

Preparaçao de células de hibridoma produtoras de anticorpos monoclonais contra FC^-R

Imunizaram-se ratinhos Balb/c com três injecçoes intraperitoneais de 5x10? células RPMI 8866 viáveis em PBS com intervalos de 4 semanas. Colheram-se amostras individuais de soro de ratinho 2 dias após a ultima injecçao e testaram-se quanto a actividade anti-FcgR. Juntaram-se as células do baço de dois animais com os titulos mais altos e usaram-se para fusão no dia seguinte. Os baços sao raspados e para cada fusão 1x10 células do baço lavadas sao sedimentadas com 25χ10θ células de mieloma de ratinho NSI/l-Ag4 (obtidas da American Type Tissue Culture Collection) durante 5 min a 350 xg. 0 sedimento de células é suavemente ressuspenso durante 30 seg em 2 ml de solução de polietilenoglicol (PEG-1540, Baker) consistindo em 20 g de PEG dissolvido em 28 ml de meio RPMI 1640 (Gibco) contendo 15% (v/v) de dimetilsulfoxido.

rante um periodo de 90 seg seguido de

A suspensão celular é misturada repouso durante 2,5 min e centrifugada a 350 xg ml de meio RPMI/c duadição rápida de mais invertendo o tubo, deig durante 5 min. 0 sedimento é ressuspenso em 5 ml de meio RPMI/ /c e aliquotas de 50 jul sao distribuídas por cada poço de 4 placas Costar 3596 de 24 poços também contendo 1x10 las normais do baço de Balb/c em culturas sao mantidas por adiçao alternada ou substituição do meio HAT com começando no 5^Ώ substituído por meio HT e passados 28 dias por RPMI/c. Os so brenadantes de poços individuais (192 culturas) relativamente a anticorpos anti-Fc^R uma a duas a fusão. Clonaram-se por diluição limite 21 culturas produtoras dos anticorpos pretendidos; elas sao diluídas em RPMI/c para uma concentração de 10 células viáveis/ml e aliquotas destas suspensões sao colocadas em poços de placas de 96 poAdiciona-se ml.

xada em célu1 ml de meio HAT. Todas as poucos dias de intervalo conforme necessário, dia após a fusão. Passados 14 dias o HAT é sao testados semanas apos ços (Linbro 76-003-05, Flow Labs), contendo 100 ul de meio HT e 1x10 células normais de baço de BALB/c. Os poços sao examinados ao microscópio para assegurar que as culturas em crescimento sejam monoclonais. Amostras de sobrenadantes das culturas sao testadas para actividade de anticorpos; as cill- 54

turas positivas sao seleccionadas e expandidas em recipientes maiores para cultura de tecidos. No final obtiveram-se 14 linhas celulares monoclonais secretoras de anticorpos com a especificidade necessária. Usaram-se aqui três clones, designados 207.25.A.4.4/45, 208.25A.4.3/135 e 208.25D.2.1/176, depositadas na Collection National de Cultures de Microorganismes of the Institute Pasteur, Paris, disponíveis com os numeros de acesso 1-452, 1-425 e 1-420, respectivamente. Os anticorpos monoclonais produzidos por eles sao designados Mab-45, Mab-135 e Mab-176.

EXEMPLO 5

Isolamento e purificação de anticorpos monoclonais

Ratinhos Balb/c pretrataram-se intraperitonealmente com 0,5 ml de pristano (Aldrich). 2 semanas mais tarde, 5x10 células de hibridoma clonadas do Exemplo 4 sao injectadas intraperitonealmente. Após 8-10 dias o fluido de ascites é colhido, centrifugado a 800 xg e guardado a -20°C. 0 liquido de ascites descongelado é centrifugado a 50000 xg durante 60 min. Uma camada de gordura que flutua na superfície é cuidadosamente removida e a concentração pro teica é ajustada a uma concentração de 10-12 mg/ml. A imunoglobulina bruta é precipitada pela adiçao gota a gota de 0,9 equivalentes de volume de sulfato de amónio saturado a 0°C, depois dissolvido em 20 mM Tris-HCl/50 mM NaCl (pH 7,9) e depois dializado contra o mesmo tampao. Obtem-se uma fracçao de imunoglobulina G por cromatografia em DEAE-D52 celulose (Whatman) usando um sistema de gradiente de tampao de 20 mM Tris HC1/25-400 mM NaCl, pH 7,9.

EXEMPLO 6

Preparaçao do anticorpo monoclonal Mab-135 marcado com____I

Iodinaram-se 40 pg de Mab-135 (so luçao em PBS do Exemplo 5) com 0,5 mli de iodeto de sódio maj?

125 cado com I e cloramina T seguindo o processo geral de F.

C. Greenwood et al. (19). A solução contendo a proteína Mab-135 iodinada foi dialisada 4 vezes, 6 horas cada, contra 1 litro de tampao PBS. 0 produto final tem uma actividade especifica de aproximadamente 2x10? cpm/ug de proteina. 0 an' 126 ticorpo monoclonal Mab-176 marcado com I foi preparado de modo idêntico.

EXEMPLO 7

Radioimunoensaio para a detecçao de IgE-BF em sobrenadantes de células e soro

Incubaram-se poços de placas de microtitulaçao em cloreto de polivinilo durante a noite a temperatura ambiente com 150 jil de tampao carbonato 0,01M, pH9, contendo 5 jil/ml de Mab-176 do Exemplo 5. As placas foram então lavadas uma vez com PBS e feitas reagir durante 2 horas a temperatura ambiente com 200 jil de solução salina equilibrada de Hanks contendo 10% de soro fetal de vitela (HBSS-FCS), depois lavadas de novo 10 vezes com PBS e incubadas com 100 jil da amostra a testar durante 8 horas a temperatura ambiente. Determinou-se o branco usando HBSS-FCS.

As placas foram lavadas 10 vezes com PBS e incubadas durante

a noite à temperatura ambiente com 100 jil por poço de I-Mab-135 (2 a 4xl0³ cpm em HBSS-FCS, Exemplo 6), depois lavadas 10 vezes com PBS e contadas num contador gama.

EXEMPLO 8

Síntese de ss-cDNA a partir de mRNA ^ul (0,5 mg/ml) da solução de mais foi mRNA do Exemplo 2 apresentando a capacidade de ligaçao

125 alta para I-Mab-135, detectado na RIA do Exemplo 7, adicionado a 25 jil de tampao RVI, 2,5 ^11 da mistura de dNTP (dATP, dTTP e dGTP, 20 mM cada) 5 jul de 1 mg/ml de oligo”^^12-18 (P-L-Bio-chemicals) 1 ^ulí><li/mmol), 3 p.1 de RNasina^^ dison, USA) e 3 pl de transcriptase reversa (66 Promega reacçao ³²P-dCTP (10 jili, 3000 (60 unidades, Promega Biotec, Maunidades, Biotec). Incluiu-se dCTP radioactivo na mistura de para facilitar a recuperação e a determinação do ren dimento do cDNA em todos os passos da síntese. Incubou-se a mistura durante 1,5 h a 42°C. Parou-se a reacçao pela adiçao de 2 pi de EDTA 0,5M pH 7,5. 0 mRNA foi degradado pela adiçao de 25 pl de 0,15M NaOH e incubaçao a 45°C durante 1 hora. Neutralizou-se a solução pela adiçao de 25 jil de 1M Tris-HCl (pH 8,0) e 6 p.1 de 1M HC1. Adicionou-se 2 jil de 20% SDS e extraiu-se a solução com o,15 ml de mistura fenol.clorofórmio (volumes iguais de fenol e clorofórmio equilibrados com tampao TNE). A fase aquosa foi aplicada numa coluna de 2 ml de Sephadex^ G-50 numa pipeta de Pasteur equilibrada com tam pao TNE, para separar o cDNA sintetizado de novo dos nucleotideos nao incorporados e do mRNA degradado. Colheram-se doze fracções de 200 ul cada e determinou-se a radioactividade aproximada de cada fracçao com um contador Geiger. As três primeiras fracçoes contendo radioactividade foram reunidas. Recuperou-se 1,5 ^ig de ss-cDNA e precipitou-se com etanol como descrito por Maniatis et al (1), p.461-462. 0 ss-cDNA foi dissolvido em 20 ul de B^O.

EXEMPLO 9

Síntese de ds-cDNA e digestão com SI ss-cDNA obtido foi incubado em

100 jil volume final de 100 mM Hepes, pH 6,9, 10 mM MgC^,

2,5 mM DTT, 70 mM KG1, dNTP 0,5 mM cada (dATP, dCTP, dTTP, dGTP) e 20 unidades de DNA polimerase I fragmento maior, enzima Klenow (Boehringer Mannheim) durante 3 horas a 15°C. Adicionou-se então mais 20 unidades da mesma enzima e a incubação continuou durante 10 horas a 15°C. Parou-se a reacçao adicionando EDTA até 20 mM. A mistura foi extraida com fenol-clorofórmio e precipitada com etanol como descrito por Maniatis et al (1), p.461-462 e 458-459. 0 ds-cDNA resultante foi tratado numa mistura de incubaçao de 100 ^ul contendo 250 mM NaCl, 50 mM acetato de sódio pH 4,5, 1 mM ZnSO^, 200 unidades de nuclease sl (Boehringer, Mannheim) a 30°C durante 30 minutos. Parou-se a reacçao adicionando EDTA para 25 mM. Após adiçao de 1M Tris-HCl, pH 8,0 para 100 mM e SDS para 1%, extraiu-se a reacçao com fenol/clorofórmio e passou-se atrvés de uma coluna de Sephadex G-200 numa pipeta de Pasteur de 2 ml de volume, equilibrada com tampao TNE. Determinou-se quais as fracçoes que continham ds-cDNA medindo a radioactividade e reuniram-se e precipitaram-se com etanol e dissolveram-se em 15 jil de l^O. Obtiveram-se 3,2 jug de ds-cDNA.

EXEMPLO 10

Colocaçao de caudas 3^,-oligo (dG) no plasmideo pUC-KO

Cortaram-se 20 |il do plasmideo pUC-KO com 50 unidades de PstI (Boehringer, Mannheim) em 200 jil de 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgCl₂ e 50 mM NaCl. Adicionou-se EDTA para 20 mM e a mistura de reacçao foi extraída com um volume igual de clorofórmio/fenol (1:1). 0 DNA de plasmideo cortado foi precipitado pela adiçao de 2,5 volumes de etanol e recuperado por centrifugação a 10000 g durante 10 minutos. Rejeitou-se o sobrenadante e dissolveu-se o sedimento em 50 jul de H₂0. Incubou-se a sonda em 150 jil de uma solução com 200 mM de cacodilato de potássio pH 6,9, 1 mM CoCl, 2 mM DTT, 10 um dGTP e 80 unidades de transferase terminal de desoxinucleotidilos (Pharmacia P-L Biochemicals, Upsalla Sweden) durante 5 minutos a 37°C. Para parar a reacçao, adicionou-se EDTA para 10 mM e extraiu-se a mistura uma vez com fenol/clorofórmio (1:1). Precipitou-se o DNA com eta_ nol e recuperou-se por centrifugação a 10000 g. Dissolveu-se o sedimento de DNA em 200 pl de tampao TE e aplicou-se um gel horizontal de 0,8% de agarose em tampao TBE usando um poço com uma largura de 3 cm. Após electroforese durante 16 horas a IV/cm recuperou-se o DNA por electroeluiçao a 5V/cm durante 20 minutos e recuperou-se do saco por pipetagem vigorosa. 0 DNA foi extraído com fenol-clorofórmio e precipitado com etanol como descrito no exemplo 1. Após centrifugação o DNA foi dissolvido em tampao TE e guardado a -20°C.

EXEMPLO 11

Preparaçao de um plasmídeo contendo ds-cDNA codificador do polipeptideo relacionado com receptores de IgE e transformação de E. coli HB1O1 com ele

Incubaram-se 800 ng de ds-cDNA do Exemplo 5 em 40 jil de uma solução contendo 200 mM cacodilato de potássio, pH 6,9, 1 mM CoC^, 2 mM DTT, 100 pmoles de -dCTP e 12 unidades de transferase terminal de desoxinucleotidilos (P-L Biochemicals) durante 5 minutos a 37°C. Para parar a reacçao adicionou-se EDTA para 10 mM. Extraiu-se a mistura com fenol/clorofórmio e precipitou-se o DNA com etanol. Dissolveu-se em I^O o ds-cDNA com caudas dC e guardou-se a -20°G. Uma mistura de 50 ng de ds-cDNA com caudas dC e 150 ng de pUC-KO com caudas dG do Exemplo 10 em 200 jil de tampao TNE foi incubada durante .5 minutos a 65°C, 60 min a 55°C e depois arrefecida lentamente até 30°C num banho-maria durante um período de 3-5 horas. Adicionou-se aliquotas de 2 jul desta mistura de emparelhamento a 200 ^il de células E_. coli HB101 competentes, as quais foram preparadas para trans; formaçao por tratamento com cloreto de cálcio conforme descrito por Maniatis et al (1). p.250. As misturas sao mantidas em gelo durante 30 minutos e aquecidas a 42°C durante 2 min, depois diluídas com 1 ml de meio SOG e incubadas a 37°C durante 1 hora. Reuniu-se o conteúdo de 10 tubos e colheram-se as células por centrifugação a 2000 g durante 5 min. Cada sedimento de células foi ressuspenso em 1 ml de meio SOC e espalhado numa placa de 10 cm com agar contendo meio LB e 50 pg/ml de ampicilina. As placas foram incubadas a 37°C durante 16 horas. Obtiveram-se cerca de 5000 colónias transformadas, caracterizadas pela sua resistência à ampicilina.

EXEMPLO 12

Identificação de clones contendo ds-cDNA codificador dos receptores de IgE e do polipeptideo relacionado com factores de ligaçao a IgE por traduçao de hibridos seleccionados.

Cultivaram-se colonias individuais do Exemplo 11 até à saturaçao em 2 ml de caldo LB contendo 100 |ig/ml de ampicilina. Reuniram-se 96 culturas e isolou-se o DNA de plasmideo usando o método de lise alcalina (Maniatis, T. et al. , p. 90 (1)) 100 jug de DNA de plasmideo desnaturado pelo método alcalino foram ligados covalentemente a 50 mg de ATP-celulose activada preparada pelo método de Seed (20).

Dissolveu-se mRNA poliA (60 ^ig) de células RPMI 8866 (Exemplo 1) em 300 jil de Pipes 15 mM pH 6,4, 1,5 mM EDTA, 600 mM NaCl, 0,2% SDS, 50% de formamida e hibridou-se com DNA de plasmideo ligado a celulose a 37°C durante 16 horas com agitaçao suave. Lavou-se a celulose 10 vezes em 50 % de formamida, 45 mM NaCl, 4,5 mM citrato de sódio, 20 mM Pipes pH 6,4 e 1 mM EDTA. 0 mRNA hibridado foi eluído em celulose incubando duas vezes a 65°C durante 2 minutos em 100 jil de 90% formamida, 0,2% SDS, 10 mM Pipes 6,4, 5 mM EDTA, 20 jig/ml de tRNA de figado de vitela. 0 mRNA eluído foi precipitado duas vezes com etanol. 0 mRNA poliA precipitado obtido de cada conjunto foi dissolvido em 6 pl de água e usado para injecçao em oocitos de Xenopus laevis e analisado como descrito no Exemplo 3. As proteínas traduzidas foram testadas por RIA conforme descrito no Exemplo 7. Dos dez conjuntos de 96 colónias cada, um é positivo. Estas 96 colónias foram combinadas em 12 conjuntos novos de oito colónias e testadas da mesma maneira. Finalmente identificou61

contendo 100 jag/ml de ampiciIsolou-se DNA de plasmídeo desta clonia, 1 enzima de restrição entre o DNA a sequência com a as fronteiras determinou-se do DNA PstI, uma vector da insersequên-se uma colónia isolada, a proteína da qual dá um sinal positivo na RIA após a traduçao do mRNA em oócitos de ra. 0 clone foi expandido em caldo LB lina.

de plasmídeo foi digerido enzima que cliva em ambas e a inserção de ds-cDNA e çao de cDNA de extremo a extremo usando o método de ciaçao de terminação de cadeias didesoxi de Sanger et al. (21). A sequênciaçao foi feita conforme descrito detalhadamente no manual de Amersham M13 cloning do os

N 4501 e N 4502). A inserção de ds-cDNA tem 417 pb de compri. mento e a sua sequência está apresentada na Fórmula II entre o pb η^δ 878 e

C-terminal do receptor de IgE e do factor de ligaçao a IgE foi usado como sonda de DNA para encontrar por hibridaçao um clone dora dos o factor reagentes incluídos no kit and sequencing usan de sequênciaçao (Amersham parte de cDNA maior contendo toda a informação codificapolipeptideos relacionados de com o receptor de IgE e ligaçao a IgE humanos.

EXEMPLO 13

Clonagem de um cDNA contendo toda a sequência codificadora do receptor de IgE humano.

Isolou-se mRNA poliA a partir de células RPMI 8866 conforme descrito no Exemplo 1. Os primeiros passos de sintese de cDNA foram feitos de acordo com o Exemplo 2-8. Então, o protocolo foi alterado para enriquecimento em ds-cDNA de tamanho completo. 0 ss-cDNA foi dissolvido em 32 pl de Η₂θ· θ ss-cDNA foi prolongado com caudas oligo-dC numa mistura de reacçao contendo 32 jil de ss-cDNA (2,8 |ig), 10 yl de 1M cacodilato de potássio, pH 7,0, 5 jil de 10 mM CoC^, 5 jil de 1 mM DTT e 1 nmole de dCTP. Após pré-incubaçao durante 5 minutos a 37°C, adicionou-se 3 ^ul de transferase terminal de desoxinucleotidilos (81 unidades, P-L Biochemicals) e a incubaçao continuou durante mais 10 min. Adicionou-se mais 50 jil de tampao TNE e o ss-cDNA foi extraído com clorofórmio/fenol e precipitado com etanol. 0 sedimento foi lavado com 70% etanol, seco ar ar e dissolvido em 15 jil de Η₂θ’ 25 |il de tampao RVT, 2,5 jil de mistura de dNTP (dATP, dTTP, e dGTP 20 mM cada) e 5 jul de 0,2 mg/ml de oligo dGiR (P-L Biochemicals). Adicionou-se 3 jil de transcriptase reversa (66 unidades, Promega Biotec) e incubou-se a mistura a 42°C durante 90 minutos. Parou-se a reacçao pela adiçao de 2 pl de 0,5M EDTA, pH 7,5 e 50 pl de tampao TNE e extraiu-se a mistura com 0,15 ml de fenol-clorofórmio (1:1). Aplicou-se a fase aquosa numa coluna de Sephadex^ G-50 (2,5 ml em tampao TNE) e colheu-se a fracçao do volume de exclusão (0,4 ml) contendo 1,1 ^ig de ds-cDNA foi precipitado com etanol. Suspendeu-se o sedimento resultante em 32 jil de E^O e o ds-cDNA foi prolongado com caudas oligo-dC marcadas radioactivamente como descrito no Exemplo 11. Parou-se a reacçao pela adiçao de 1 jil de 0,5M EDTA, pH 7,5 e aplicou-se a amostra num gel horizontal de 1% de agarose em tampao TBE usando poços com uma largura de 0,5 cm. Num poço paralelo, aplicou-se 1 jug de DNA do bacteriófago lambda (digerido com EcoRI e HindIII) para servir como marcador de tamanho. Apos electroforees durante 2 h a 2,5V/cm o gel foi embebido em tampão TBE contendo 0,5 jug/ml de brometo de etídio para corar o ds-DNA. A região contendo ds-cDNA com um tamanho entre aprjo ximadamente 1,4 e 2 kilobases foi removida e colocada em dois sacos micro-colódico (Sartorius) pré-embebidos em E^O. Adicionou-se 0,3 ml de E^O e colocaram-se os sacos num apa63

relho horizontal de electroforese (Bio-Rad) contendo tampao TBE a metade da concentração normal. 0 ds-cDNA foi electroeluido a 5V/cm durante 20 min e recuperado do saco por pipetagem vigorosa. 0 ds-cDNA foi extraído com fenol-clorofórmio e precipitado com etanol. Após centrifugação dissolveu-se o ds-cDNA em 10 jil de tampao TNE. Recuperou-se 100 ng de ds-cDNA (determinado a partir da recuperação de radioactivida de).

EXEMPLO 14

Emparelhamento de pUC-KO com caudas dG com ds-cDNA com caudas poli (dG) e transformação de E.coli com o plasmídeo obtido.

ul de ds-cDNA (40 ng de material fraccionado por tamanho do Exemplo 13) foi misturado

damente incubado a 65°C durante 10 min., a 46°C durante 1 hora e à temperatura ambiente durante 1 h. Usou-se o DNA emparelhado para transformar células competentes E. coli HB101 (estirpe LM 1035), as quais foram preparadas para transformação como descrito no Exemplo 11. Adicionou-se aliquotas de 2 jil da mistura de emparelhamento a tubos paralelos contendo 200 jil de células competentes. Deixa-se os tubos em gelo durante 30 min. Após um choque térmico de 90 seg a 42°G e arrefecimento em gelo durante 2 min, adicionou-se o,8 ml de meio SOC por tubo e incubou-se em seguida durante 60 min a 37°C. Após incubaçao reuniu-se o conteúdo de 10 tubos. Colheram-se as células por centrifugação a 2000 g durante 5 min e semearam-se em placas de agar Mc Conkey (15 cm de diâmetro) contendo 100 |ig/ml de ampicilina. As placas foram incubadas durante a noite a 37°C. Obtiveram-se aproximadamente 1000 colónias resistentes à ampicilina por placa. Estas foram trans. feridas para membranas de nylon (Pall-Biodyne, Glen Cove, New York - USA) e as membranas foram colocadas sobre placas de agar Mc Conkey com as colónias para baixo. Após incubaçao durante 5 horas a 37°C, fizeram-se duas replicas em membranas de nylon. A membrana principal foi guardada a 4°C numa placa de agar. As réplicas foram processadas para hibridaçao de cólonias colocando-as sucessivamente em papel 3MM (Whatman Ltd., Maidstone, USA) saturado com 0,5M NaOH, 1,5M NaCl durante 5 minutos e com 0,5M Tris-HCl, pH 8,0, 1,5M NaCl durante 10 minutos. Entre cada incubaçao os filtros foram transferidos para filtros Whatman 3MM secos. Os filtros réplica foram incubados a 80°C numa estufa sob vácuo durante 2 horas e imediatamente usados para hibridaçao de DNA.

EXEMPLO 15

Hibridaçao em filtros

A inserção de cDNA de 10 jig de plasmideo codificadora de parte do receptor de IgE obtido a partir do clone positivo do Exemplo 12 foi preparada por digestão com a endonuclease de restrição PstI. A inserção de cDNA (450 pb) foi separada do DNA do vector pUC-KO (2900 pb) por electroforese num gel de 1,5% de agarose em tampao TBE e recuperado por electroeluiçao e precipitação com etanol como descrito no Exemplo 13. A inserção de cDNA purificada (200 ng) foi tomada radioactiva usando um sistema de nick translation da Amersham (N. 5000) seguindo as instruções

dadas pelo fornecedor. A sonda de cDNA marcada radioactivamente tem uma actividade especifica de 5x10 dpm (jig). 0 cDNA marcado radioactivamente foi desnaturado por incubaçao a 95°C durante 10 minutos e imediatamente arrefecido em gelo. Os filtros réplica do Exemplo 14 foram pré-hibridados num saco de plástico fechado durante 2 h em 100 ml de uma solução contendo 0,9M NaCl, 0,18M Tris-IICl, pH 8,0, 6 mM EDTA, 0,02% Ficoll 400, 0,02% polivinilpirrolidona, o,o2% BSA, 0,2% SDS e 50 jug/ml de DNA desnaturado de timo de vitela. Fez-se a hibridaçao durante a noite num saco de plástico fechado contendo 5 ml da mesma solução suplementada com a inserção de cDNA marcado radioactivamente e desnaturado pelo calor referida atrás. Após hibridaçao os filtros foram lavados em 2xSSC/0,2% SDS, seguido de três lavagens a 65°C com 200 ml de 0,2xSSC/0,2% SDS. Os filtros foram secos e expostos a um filme de raios X Kodak (XAR-5) durante a noite. Os filtros foram marcados com tinta radioactiva para parmitir o alinhamento dos filtros com o autorradiograma. Encontraram-se dois clones positivos, os DNAs dos quais hibridam com o fragmento de DNA marcado radioactivamente codificador do receptor de IgE. Eles foram designados pCL-1 e pCL-2.

EXEMPLO 16

Isolamento e análise do DNA de pCLl e pCL2

Cultivaram-se os clones pCLl e pCL2 e os DNAs dos seus plasmideos foram isolados usando o método de lise alcalina (Maniatis, T., et al.(1) , p.90). Digeriu-se o DNA com PstI, uma enzima que corta o cDNA nas fronteiras entre o DNA do vector e as inserções de DNA. Os frag mentos foram separados por electroforese e as inserções de cDNA completas isoladas por electroeluiçao como descrito no Exemplo 13. As inserções de cDNA destes dois plasmideos foram sequênciados de extremo a extremo usando o método de Sanger et al(21) descrito detalhadamente no manual da Amersham. Na Figura 2 e Formula II está apresentado um sumário de análise de restrição e sequênciaçào.

	EXEMPLO 17
Transferência do cDNA	relacionado com o receptor de IgE para

um plasmídeo adequado á transcrição.

jig de DNA do plasmídeo pCL-2 foram digeridos com as enzimas de restrição PstI e HindII (Boehringer Mannheim). A inserção de cDNA de 1,5 kb e o DNA vector de plasmídeo de 2,9 kb foram separados num gel de 1% de agarose em tampao TBE usando um poço com 3 cm de largura. Após electroforese durante 16 horas a lV/cm, recuperou-se o DNA por electroeluiçao como descrito no exemplo 13 ParalalaTM mente digeriu-se 10 jig do plasmídeo pGEM -1 com PstI e HindII extraiu-se uma vez com fenol/cloroformio e precipitou-se com ~ TM etanol 10 ng da inserção de cDNA de 1,5 kb e 10 ng de pGEM -1 clivado com PstI foram ligados num volume de 10 jil durante 4 horas a 15°C. A mistura de reacçao contem ainda 10 mM Tris -HC1 pH 7,5, 10 mM MgGl_2> 2 mM DTT, 0,1 mM ATP e 100 unidades de ligase de T4 (Boehringer Mannheim). Usou-se 5 pl da mistura para transformar células competentes E.coli HB101 (estirpe LM 1035) conforme descrito por Maniatis et al (1), p. 250. Obtiveram-se cerca de 100 colónias resistentes à ampicilina. Cultivaram-se 24 colónias e isolou-se o DNA de plasmideo a partir das culturas. Aproximadamente 1 ^ug de DNA de pia mideo de cada cultura foi digerido com HindIII e o tamanho dos fragmentos do DNA digerido analisado num gel de 1% de agarose, usando DNA de lambda digerido com HindIII (Pharmacia, Sweden) como marcador de tamanho. 0 DNA de plasmídeo digerido de várias colónias deu fragmentos de DNA com 1,0 kb e 3,3 kb de comprimento. Estes plasmideos foram designados pGEM -1/CL2 (ver Fig. 3). Eles contem o extremo amino do receptor de IgE perto do promotor da polimerase de T7 no DNA

TM vector pGEM -1.

EXEMPLO 18

Transcrição do cDNA relacionado com o receptor de IgE.

jig do plasmídeo pGEM^^-l/CL2 do Exemplo 17 foram digeridos com a enzima de restrição Rsal (Boehringer, Mannheim). Adicionou-se 5 pl de 0,5M EDTA e a mistura foi extraida uma vez com fenol/cloroformio (1:1, V:V) e uma vez com clorofórmio. 0 DNA foi concentrado por preci pitação com etanol e dissolvido em 20 pl de tampao TE. Adicionou-se 4 pl da solução de DNA a 100 μΐ de uma solução contendo 40 mM Tris-HCl pH 7,5, 6 mM MgC^, 2 mM espermidina, 10 mM NaCl, 10 mM DTT, 1 unidade/|il de RNasina, 0,5 mM dNTP e 20 unidades de Riboprobe da RNA polimerase de T7 (Promega

Biotec). A mistura foi incubada durante 1 hora a 37 C. Apos a reacçao de

RQI TM DNAse

37°C durante síntese de DNA, adicionou-se duas (Promega Biotec) e continuou-se a 1 hora.

unidades de incubaçao a A mistura foi extraida uma vez com fenol/cloroformio e uma vez com clorofórmio e o RNA sintetizado de novo recuperado por precipitação com etanol. 0 sedimen to de RNA foi lavado com etanol a 70% e finalmente dissolvido

EXEMPLO 19

Tradugao do mRNA do receptor de IgE derivado de plasmídeo em _ oócitos de ra e detecçao da proteína receptor de IgE. _ mRNA obtido no Exemplo 18 foi usado directamente para injecçao em oócitos de ra como descrito no Exemplo 3. A síntese da proteína receptor de IgE foi testada numa RIA conforme descrito no Exemplo 7. Usou-se como amostra testemunha o mRNA poliA do Exemplo 1. Os resultados estão resumidos na Tabela que se segue:

Tipo de mRNA injectado	^^I-Mab-135 ligado na RIA
em oocitos de ra	(entrada 3x10^ cpm)
mRNA derivado de plasmídeo	15%
(Exemplo 18)
mRNA poliA (Exemplo 1)	1,5%
sem RNA	0,1%

EXEMPLO 20

Montagem do plasmídeo pFK-1 e pFK-2 para a expressão em E.coli de um polipeptideo com actividade de factor de ligaçao a

Exemplo contruiram-se plasde polipeptideos em E.coli em que terminal amino que inclui o local de DNA do plasmiObtivesecreção de IgE

Neste mideos que permitem a produção e relacionados com factor de ligaçao estão eliminados os aminoácidos da região entre de ancoragem á membrana, deo pCL-2 com as enzimas ram-se fragmentos de 1,6 as posiçoes Meti e ou

Glu ^Alal18 Digeriu-se 10 p restrição HincII e Rsal.

0,46, e 0,23 kb que se

133 σ o de

25,

0,72, separaram por electroforese num gel de 1% de agarose em tampao TBE. Recuperou-se o fragmento de DNA de 1,25 kb como descrito no Exemplo 13. Paralelamente linearizou-se 10 ^ig do plasmídeo pGEM 50 pl de 10 mM 5 mM DTT. Após plementada com 20 unidades de ehringer) e a incubaçao continuou A mistura foi extraída três vezes depois submetida a electroforese num gel de 1% de agarose em tampão TBE. 0 DNA de plasmídeo foi recuperado do gel por electroeluiçao como descrito no Exemplo 13. 10 ng do fragmento de cDNA de 1,25 kb e 10 ng do pGEM foram mistura de reacçao contem ainda 10 mM Tris-HCl pH 7,5 MgCl_2> 2 mM DTT, 0,5 mM ATP e 100 unidades (Boehringer). Usou-se 5 pl da mistura para las competentes E.coli HB101 como descrito al. (1), p. 250. Semearam-se as bactérias

TM —1 com 20 unidades de HincII (Boehringer)

Tris-HCl pH 7,6, 50 2 horas a 37°C, a mistura de |il de 1M Tris-HCl pH 8,5, 10 pl de H₂0 e fosfataes alcalina mM NaCl, em mM MgCl₂ e reacçao foi sude intestino de vitela (Bodurante 30 minutos a 37°C. com fenol/clorofórmio e

TM -1 clivado com HincII ligados num volume de 10 pl durante 10 horas a 15°G.A , 10 mM de T^- ligase transformar célupor Maniatis et em placas de agar

suplementado com 100 jig/ml de ampicilina. Obtiveram-se cerca de 50 colónias resistentes à ampicilina. Cultivaram-se 24 colónias e isolou-se o DNA de plasmídeo de cada cultura. Aprc> ximadamente 1 |ig de DNA de plasmídeo de cada cultura foi digerido com HindIII e o comprimento dos fragmentos de DNA digerido analisado num gel de 1% de agarose, usando DNA de lambda digerido com HindIII (Pharmacia, Sweden) como marcador de tamanho. 0 DNA de plasmídeo digerido de várias colónias deu fragmentos de DNA com 0,5 kb e 3,6 kb, outros com 0,7 kb e 3,4 kb de comprimento, correspondendo às duas orientações possíveis das inserções. Estes plasmideos foram designados respectivamente pCAL-3 e pCAL-4 (Figura 4). Cultivaram-se um clone pCAL-3 e um clone pCAL-4 e os DNAs de plasmídeo foram isolados usando o método de lise alcalina conforme descrito por Maniatis et al. (1), p.90 do plasmídeo pCAL-4 com a enzima de

Digeriu-se 10 restrição HindIII de DNA e 10 do

BglII

DNA do plasmídeo pCAL-3 com as enzimas e BamHI. Os fragmentos foram separados deirestriçao por electroforese e os fragmentos BglII a BamHI de 0,8 kb e HindIII a HindlH de 0,75 kb recuperados por electroeluiçao como descrito no

Exemplo 13. Paralelamente digeriu-se 10 ^ug de DNA do plasmideo pIN-III-ompA-2 (Gharayeb et al. (5)) e 10 jig de DNA do plasmídeo pIN-III-ompA-3 com HindIII e BamHI respectivamente. Estes dois plasmideos sao vectores de clonagem para secreção em E.coli os quais permitem a clonagem de fragmentos de DNA estranho em duas grelhas de leitura fundidos a sequências codificadoras do peptideo sinal da proteína OmpA. Em seguida, os plasmideos linearizados foram tratados com fosfatase alcalina de intestino de vitela e o DNA linear foi purificado num gel de 0,8 de agarose conforme descrito acima. Fizeram-se duas misturas de ligaçao contendo num volume de 20 jul, ng de pIN-III-ompA-2 clivado com HindIII e 10 ng do fragmento HindIII a HindIII de 0,8 kb (mix 1) e 10 ng do fragmento BglII a BamHI de 0,75 kb juntamente com 10 ng de pIN-III71

-ompA-3 clivado com BamlII (mix 2). As misturas de reacçao comtem ainda 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 nM MgC^, 2 mM DTT, 0,1 mM ATP e 100 unidades de ligase (Boehringer Mannheim). Após 12 horas a 15°C, usou-se 5 jil das misturas para transformar células competentes E.coli HB101 conforme descrito por Maniatis et al. (1), p.250. Obtiveram-se 50 a 100 colónias resistentes a ampicilina a partir da mix 1 e da mix 2. Cultivaram-se 12 colonias de cada mix e isolou-se o DNA de plasmídeo a partir das culturas. Aproximadamente 1 jig do DNA de plasmídeo de cada cultura foi digerido com PstI EcoRI (mix 1) e com BamHI e EcoRI (mix 2). 0 comprimento dos fragmentos de DNA foi analisado num gel de 1% de agarose usando DNA de lambda digerido com HindIII (Pharmacia, Sweden) como marcador de tamanho. Vários plasmideos derivados da mix 1 pro duziram um fragmento de 0,75 kb. Estes plasmideos foram designados pFK-2. Eles contem o DNA codificador dos aminoácidos ^Ala134 OmpA.

a Ser₃₂₁ do

Analogamente receptor de IgE fundido à sequência sinal vários plasmideos derivados da mix 2 pro duziram um fragmento de 0,8 kb. Estes plasmideos foram designados pFK-1. Eles contem o DNA codificador dos aminoácidos Aspn9 a Ser₃2j fundido à suquência sinal OmpA.

EXEMPLO 21

Detecçao do plasmídeo relacionado com o factor de ligaçao a IgE em estirpes de E.coli portadoras dos plasmideos pFK-1 e pFK-2.

Usaram-se para transfectar células competentes E. coli BZ 234 e E. coli BZ 1472 , 10 ng do pias, mideo pFK-1, pFK-2 e como testemunha o plasmídeo pIN-III

-ompA-2. Tornaram-se as células competentes e transfectaram-se como descrito por Maniatis et al. (l),p.25O. Obtiveramse cerca de 100 colónias resistentes à ampicilina a partir de cada transfecçao. Transferiu-se uma colónia para 2 ml de caldo LB suplementado com 100 pg de ampicilina/ml e cultivou -se a 37°C durante a noite. Transferiu-se 1 ml das culturas para 100 ml de caldo LB suplementado com 100 pg de ampicilina/ml. As células cresceram com agitaçao forte (250 rpm) a 37°C. Removeram-se aliquotas de 10 ml após 4, 7, 10, e 24 ho ras. As aliquotas foram processadas imediatamente. Colheram-se as células por centrifugação com 1000 g à temperatura ambiente durante 10 minutos. Rejeitou-se o sobrenadante e suspenderam-se as células em 2,5 ml de 20% sucrose, 0,1 M Tris-HCl pH 8,0. As misturas foram deixadas à temperatura ambiente durante 20 minutos e colheram-se de novo por centri fugaçao. Rejeitaram-se os sobrenadantes e suspenderam-se as células em 1,5 ml de EI^O arrefecida em gelo. As misturas sao incubadas em gelo durante 20 minutos e centrifugadas a 4 C com 12000 g durante 10 minutos. Adicionou-se 5 fil dos sobrenadantes a 100 ul de HBSS-FCS e estas amostras foram analisadas com a RIA descrita no Exemplo 7. Usou-se pIN-III-ompA2 como testemunha. Obtiveram-se os seguintes resultados:

tempo	BZ 234	BZ 234	BZ 234	B 1472	B 1472	B 1472
de	+pFK-l	+pFK-2	+pIN-III-	+pFK-l	+pFK-2	+pIN-III
cultura			ompA-2			ompA-2

4	h	4355	3516	-	3432	2255	50
7	h	6869	5066	120	4853	2754	0
10	h	8396	5706	-	6084	5281	0
24	h	7890	5206	89	5595	5088	76

Os valores sao dados em cpm medidos por poço na RIA conforme descrito no Exemplo 7. A radioactividade inoculada por poço foi de 325000 cpm.

EXEMPLO 22

Preparaçao de um gel de imunoafinidade para a purificação da proteína do factor de ligaçao a IgE

Ώ

Lavou-se material Affi-Gel 10 (Bio-Rad) conforme indicado pelo fabricante com água destilada fria e tampao de acoplamento pH 8,0 (solução 0,lM NaHCO^.Um suspensão a 50% de gel em 2 ml de tampao de acoplamento foi introduzida num tubo de plástico e misturado com o mesmo volume de uma solução que contem 10 mg de Mab-135 ou Mab-176 e a mistura foi agitada durante 4 horas à temperatura ambiente. Lavou-se novamente o gel com tampao de acoplamento. Para bloquear os sitios activos ainda livres, o gel foi tratado durante 2 horas à temperatura ambiente com 0,1 ml de 1M etanolamina-HCl, pH 8,0, depois lavado com PBS contendo 10 mM azida de sódio e mantido nele a 4°C.

EXEMPLO 23

Fermentação das células transformadas e isolamento da proteína factor de ligaçao a IgE a partir da cultura bacteriana

Uma colónia de E.coli BZ 234 con74

tendo o plasmídeo pFK-1 do Exemplo 20 foi transferida para ml de meio LB suplementado com ampicilina (100 ^ig/ml) e crescida a 37°C com agitaçao vigorosa durante a noite. Aliquotas de 1 ml da cultura foram transferidas para 6 frascos, cada lina (250 rpm) a 37°C durante 8 horas e colheram-se por centrifugação a 1000 Rejeitaram-se 300 ml de uma pH 8,0 e 1 mM ambiente durante 20 minutos e as células colhidas de novo e as células

A suspencentrifugada um contendo 800 ml de caldo LB suplementado com ampiciAs células cresceram com agitaçao forte à temperatura ambiente durante 10 minutos, o sobrenadante e suspenderam-se solução contendo 20% de sucrose, EDTA. A suspensão foi deixada a g, as células em mM Tris-HCl temperatura por centrifugação. Rejeitou-se o sobrenadante suspenderam-se em 200 ml de E^O arrefecida em gelo, sao foi incubada em gelo durante 20 minutos e a 4°C com 10000 g durante 15 minutos num rotor de uma centrífuga Sorvall. 0 sobrenadante (cerca de 180 ml) foi cuidadosamente recuperado, suplementado com azida de sodio (0,1 mg/ /ml) e filtrada através de uma unidade de esterilização por filtro Nalgene^ USA). A solução de Mab-135 ou Mab-176 acoplado a Affi-Gel^R10, me descrito no Exemplo 22, a um fluxo de 50 ml/hora. 0 gel foi lavado sucessivamente com 20 volumes de PBS suplementado com 0,5M NaCl e de NaCl 0,9%. 0 testado medindo çao completa de eluida com aliquotas de 1 ml de glicina-HCl, 0,lM NaCl, tendo proteína e neutralizou-se (0,2 micron; Nalge Company, Rochester, filtrada foi aplicada numa coluna de obtido

N.Y.

ml confor0,05% Tween^R20, teor proteico das soluçoes de lavagem foi a absorvância volumes de PBS e 5 volumes proteínas nao pH 2,6.

remopara assegurar

A coluna foi então cada, contendo 0,lM a 280 nm ligadas.

volume

Reuniram-se as fracçoes con com 1M

Tris.

As soluçoes polipeptídeo purificado do invento obtiveram-se por tratamen.

concentradas de um to com um concentrador electroforético ISCO Modelo 1750 (Isco Inc.) e com uma membrana Spectrafor^v (Spectrum Medicai Industries) com uma exclusão de 3,5 KD. As soluçoes foram dializadas contra acetato de amonio 25 mM, pH 8,3 e depois concentardas para um volume de 0,2 ml.A proteina purificada foi analizada do seguinte modo: As fracçoes foram incubadas com tampao Laemmli, depois separadas em proteínas individuais por 12% SDS-PAGE e coloração com prata conforme descrito no manual Bio Rad. Encontraram-se proteínas com um peso molecular aproximado de 25 KD. Elas foram transferidas electrofo réticamente durante 4 horas a 0,12 amperes com tampao de transferência para uma membrana de nitrocelulose. A membrana foi bloqueada com soro fisiológico tamponado com Tris contendo 10% de FCS. As tiras foram cortadas e postas a reagir individualmente com Mab-135 e Mab-176, 10 ^ug/ml de cada. Após 6 horas de incubaçao as tiras foram lavadas e postas a reagir durante a noite com IgG de cabra anti-ratinho conjugada com peroxidase de rábano silvestre. Lavaram-se as tiras e revelaram-se com 4-cloro-l-naftol (substrato da peroxidase) conforme detalhado no manual de instruções da Bio Rad. Os anticorpos monoclonais Mab-135 e Mab-176 reagiram ambos com o fragmento de proteina de 25 KD.

EXEMPLO 24

Expressão do polipeptideo com actividade de factor de ligaçao a IgE em E.coli sob o controle do promotor do fago

24.1 Construção do plasmídeo de expressão: Uscu-se como vector intermediário o plasmídeo pHRil48 (Pedido de Patente Eu76

ropeia EP 146 785). 10 ^ig de DNA do plasmídeo pIIRil48 foi digerido com Ncol, depois tratado com polimerase Klenow e dNTP (50 juM) para tornar os extremos cegos. 0 DNA foi ainda digerido com BamHI e tratado com fosfatase alcalina. Isolou-se o DNA vector de 4,3 kb por rose. Paralelamente, clivou-se (Exemplo 20) com BglII, depois electroforese em gel de aga10 jig de DNA do plasmídeo pCAL3 tratou-se com polimerase Klenow e dNTP (50 jilV). 0 DNA foi ainda clivado com BamHI e o fragmento de DNA inserção de 0,78 kb isolado por electroforese em gel de agarose. 10 ng de vector purificado e 3 ng de DNA da inserção purificado foram ligados e a mistura usada para transformar células competentes E.coli HB101. Seleccionou-se un clone com o plasmídeo recombinante correcto baseado na analise com enzimas de

DNA de um plasmídeo correcto

DNA da inserção de 0,79 kb restrição (Figura 5). 10 de foi digerido com BamHI e EcoRI. foi isolado por electroforese em gel de plasmídeo com EcoRI agarose.

Paralelamente pPLc24 / Remant, digeriu-se

E. et al (1981), jug de DNA do

Gene 15, 81-937 e BamHI, depois tratou-se com fosfatase alcalina e purificou-se o DNA vector de 2,9 kb por electroforese em gel de agarose. 10 ng do DNA vector de 2,9 kb e 3 ng de DNA da inserção de 0,79 kb foram ligados e depois usados para transformar células competentes E.coli K12. Fez-se análise de restrição convencional para seleccionar um plasmídeo correcto (pPL-BF; Figura 5). Este plasmídeo possui a sequência de DNA com a fórmula II codificadora dos aminoácidos 119 a 321 do polipeptideo com a fórmula I a jusante do promotor P^ activável pelo calor. 0 aminoácido 119 é precedido por uma metionina que foi adicionada durante o passo de clonagem intermédio no plasmídeo pHRil48.

transformar as estirpes doras de Xcl 857(Remaut

Usou-se o plasmídeo pPL-BF para W3110 e HB101 de E.coli ambas possuiet al., loc. cit.). Semearam-se os transformantes em placas de LB contendo 40 ^ig/ml de canamicina e ampicilina e cultivaram-se por incubaçao a 30 C durante 24 horas. As colónias recombinantes resultantes foram usadas para fermentação.

24.2 Fermentação

As estirpes recombinantes de E. coli obtidas no Exemplo 24.1 foram cultivadas a 30°C durante a noite em caldo LB contendo 40 |ig/ml de ampicilina e canamicina. As culturas foram diluidas a 1:5 com o mesmo meio e incubadas a 42°C durante 4 horas. Colheram-se as células por centrifugação.

24.3 Purificação dos polipeptideos com actividade de ligaçao a

22,5 ml de uma suspensão celular (D0ó50⁼20) em 50 mM Hepes pH 8,0, 30 mM NaCl e 0,1% de etanolamina, preparada a partir de um sedimento bacteriano do Exemplo 24.2, foram misturados com 18 g de ureia. Sonicou-se a suspensão 3x30 seg com intervalos de 30 seg com um SoR niprep^x 150 MSE usando uma sonda de 9,5 mm e uma amplitude de 24 microns. Clarificou-se o lisado por centrifugação a 17000 rpm num rotor Sorvall SS34 durante 30 min a 20°C. Dializou-se o sobrenadante a 4°C contra três mudas de 10 mM Hepes pH 7,5 e 130 mM NaCl. 0 dialisado foi clarificado por centrifugação durante 30 minutos a 17000 rpm num rotor SS34 (Sorvall) a 4°C e suplementou-se o sobrenadante com azida de sódio (0,1 mg/^ml). Os polipeptideos com actividade de ligaçao a IgE foram ainda purificados e analisados como aqui descrito, e.g. no Exemplo 22 e 23.

EXEMPLO 25

Expressão de um polipeptideo com actividade de factor de ligação a IgE na levedura Saccharomyces cerevisiae

25.1 Constrtuçao do plasmideo de expressão pJDB207 R/PH05-BF (Fig. 6)

Para preparar o DNA vector, digeriu-se totalmente 10 pg de DNA do plasmideo pJDB207 R/PHO5-TPA (12-2) (Pedido de Patente Europeia EP 143081 com BamIII. 0 DNA digerido foi tratado com fosfatase alcalina. 0 fragmento grande BamHI de 6,85 kb foi separado do fragmento pequeno num gel de 1% de agarose em tampao TBE e o fragmento de DNA de 6,85 kb foi recuperado do gel por electroeluiçao. Derivou-se do plasmideo pJDB207/PH05-TPA 18 (Pedido de Patente Europeia 143’081) um fragmento de DNA codificador do promotor induzivel PHO5 e da sequência sinal PHO5. Digeriu-se totalmente 50 yug deste plasmideo com BamIII e HindIII e isolou-se o fragmento de 2,3 kb. 5 jug deste fragmento foram ainda digeridos com Bali isolado o fragmento de 0,58 kb. 20 ng do DNA vector descrito atrás, 4 ng do fragmento de 0,58 kb, 8 ng do fragmento de cDNA BglII/BamHI de 0,8 kb derivado de pCAL3 (Exemplo 20) e 0,1 ng de um adaptador de dsDNA obtido por sintese quimica com a sequência de ácido nucleico: 5’ pCCAATGCA-3’/3'-GGTTACGTCTAGp-5’ foram misturados e lisados durante 24 horas a 15°C num volume de 20 jil. 0 DNA ligado foi usado para transformar células competentes E,coli HB10L 0 DNA de plasmideo de cerca de 100 colónias resistentes à ampicilina foi analisado por digestão com enzimas de restrição. Encontraram-se algumas colónias que interiorizaram os três fragmentos de DNA inserção na orientação pretendida (pias, mideo pJDB207 R/PHO5-BF; Figura 6). A estrutura correcta da construção nas junções entre adaptador obtido por sintese verificada por sequênciaçao.

a sequência quimica e o o DNA sinal de PH05, cDNA de IgE-BF foi

25.2 Transformaçao e fermentação de leveduras plasmideo pJDB207/PH05-BF foi usado para transformar Saccharomyces cerevisiae estirpe GRF18 (<□<·, his 3-11, his 3-15, leu 2-3, leu 2-112, Kan^R) usando o protocolo de transformaçao descrito por Hinnem et al. (Proc. USA 1978, 75, 1979). As células de levedura transformadas foram seleccionadas em placas com meio minimo para leveduras deficientes lónias individuais de leveduras se Saccharomyces cerevisiae GRF 18 / pJDB207 R/PH05-BF/. Tais transformadas foram crescidas em 50 ml

Natl. Acad. Sei.

em leucina. Isolaram-se cotransformadas e designaramcélulas de levedura de meio minimo para leveduras (Difco Yeast Nitrogen Base sem aminoácidos ao qual se adicionou 2% de

L-histidina e 10 g/1 de L-asparagina com agitaçao a 30°C dude 3x10? células/ml. As cée usadas para inocular 100 de Pi preparado glucose, 20 mg/1 de rante lulas ml de horas até uma densidade foram lavadas em 0,9% meio minimo com baixo receita do meio Difco ) com 0,03 g/1 de Kl^PO^,

4'2°°4’

600

MaCl teor

Yeast Nitrogen Base g/1 de KC1, 10 g/1 de L2% e 1 g/1 de L-histidina.

de partida de 0,25. As células cresceram a 30°C até 38 horas e foram colhidas a uma DO^qq de cerca de 10. As células de 35 ram colhidas por centrifugação e tal de 4 ml de tampao fosfato de (v/v) de Triton X-100^R. Transferiu-se a suspensão para um tubo Corex de 30 ml. Adicionou-se 8 vidro com a ácidos -asparagina em vez de (NH₄)₉S0 0 meio foi inoculado para DO de acordo (sem aminoml de meio de Pi ressuspensas num sódio 66 mM pll 7 baixo fovolume to4 e 0,1% de células érolas de g de p (0,4 mm de diâmetro) e a suspensão foi agitada num Vortex Mixer (Scientific Instruments Inc.,USA) a toda a velocidade durante 4 min e depois arrefecido num banho de gelo. Mais de 90^ das células ficaram rebentadas por este processo.

Os detritos celulares das por centrifugação e as pérolas de vidro durante 10 min a 8000 foram sedimentarprn a 4°C num rotor Sorvai de ligaçao

HB4. Os polipeptídeos com a IgE foram purificados a actividade partir dos de factor tes usando cromatografia de afinidade conforme descrito nos

Exemplos 22 e 23.

EXEMPLO 26

Montagem dos plasmideos pCAL5-R/ND e pCAL8-BF/ND para a expressão de polipeptídeos com actividade de ligaçao a IgE em culturas de células de mamíferos

Neste exemplo é descrita a construção dos plasmideos pCAL5-R/ND e pCAL8-BF/ND (ver Figura 7). Eles permitem aproduçao de receptor de IgE ligado a membranas ou factor de ligaçao de IgE secretado em culturas de células de mamífero. Ainda, estes plasmideos foram projectados para a selacçao de amplificaçao de genes nas células hospedeiras, um processo que conduz a altos rendimentos do polipeptideo pretendido.

26.1

Construção do plasmídeo pCAL5

Para preparar o DNA vector usouse o plasmídeo pSV2911 neo / Asselbergs, F.A.M., et al (1986)

J. Mol. Biol. 184, 401-4117. Digeriu-se com as enzimas de restrição HindIII e Sall. Obtiveram-se fragmentos de 3,9 e 1,8 kb. A mistura foi tratada com fosfatase alcalina e isolado o fragmento de 3,9 kb após electroforese num gel de 1% de agarose. Paralelamente, prepararam-se duas inserções de DNA que codificam o receptor de IgE e a metade 3' do gene da beta-globina de coelho, respectivamente. Por um lado 10 jig do plasmídeo pCAL3 (Exemplo 20; Figura 4) foram digeridos parcialmente com HindIII e completamente com BamHI. A inserção de cDNA de 1,26 kb foi isolada por electroforese em gel de agarose e eluição do gel. Por outro lado, 10 pg do plasmideo pUp (Weber, F. e Schaffner,W. (1985) Nature 315, 75-77) foram digeridos completamente com BamHI e Sall. 0 fragmento de DNA de 1,2 kb foi isolado. Ele contem um intrao grande e o sinal poli (A) do gene da beta-globina de coelho.

Ligaram-se 10 ng do DNA vector referido atrás e 10 ng de cada uma das inserções de DNA. Usoii -se o DNA resultante para transfectar células competentes E,coli EB101. SEleccionou-se um plasmídeo recombinante (pCAL5; Figura 7) que apresenta o padrao de restrição esperado após introdução de ambas as inserções de DNA no DNA vector.

26.2

Construção do plasmídeo pCAL5-R/ND

Digeriu-se parcialmente com Sall 10 ng de DNA do plasmídeo pCAL5. As moléculas de DNA que sao cortadas num único sitio e portanto representam DNA linearizado de tamanho completo, foram purificados por electroforese em gel de agarose. Paralelamente, 10 yug de DNA do plasmideo pND2 (Asselbergs et al; loc. cit.) foram totalmente clivados com Xhal e Sall. Estes plasmídeos contem duas marcas selectivas, neomicina (neo) e di-hidrofolato redutase (dhfr)

as quais permitem seleccionar integração e amplificaçao, respectivamente, de DNA estranho no genoma de hospedeiros mamíferos, 0 DNA de pND2 clivado foi tratado com fosfatase alcalina. Depois, misturaram-se e ligaram-se 10 ng de pCAL5 clivado com Sall e 10 ng de DNA do plasmídeo pND2 clivado com Sall/Xhol. 0 DNA resultante foi usado para transformar las competentes E.coli HB101. As células transformadas espalhadas numa placa de agar contendo caldo LB e 50 ^ig/ml de canamicina. Escolheram-se um -R/ND, Figura 7) tendo o padrao para a expressão do receptor de Ele possui as marcas selectivas do receptor de Ige. três céluforam genes.

plasmídeo recombinante (pCAL5de restrição do DNA esperado IgE em hospedeiros mamíferos, neo e dhfr a jusante do cDNA

A direcçao da transcrição é idêntica nos

26.3 Construção do plasmídeo pCAL8-BF/ND plasmídeo pCAL8-BF/ND é um derivado do plasmídeo pCAL5-R/ND descrito atrás, em que a sequência de DNA codificadora dos aminoácidos 1 a 147 do polipeptideo com a fórmula I foi substituída por uma nova sequência de DNA codificadora da sequência sinal da hemaglutinina da influenza aviária. Esta alteraçao permite a secreção dos factores de ligaçao a Ige compreendendo os aminoácidos 148 a 321 do polipeptideo da fórmula I.

Para tal, sintetizou-se quimicamente um fragmento de dsDNA de acordo com os métodos convencionais descritos nas referencias 4, 5, 6, 6a, 7, 8 tendo a fórmula:

5’-pAGCTTACCATGGCTACCCAGATCTTGGTGTTCGCTCTGGTGGCCGTCATTCCTACAAACGCGC

ATGGTACCGATGGGTCTAGAACCACAAGCGAGACCACCGGCAGTAAGGATGTTTGCGCGATTP-5’

ng do DNA vector

0,7 kb. por (a) rilaçao

Ligou-se 0,2 ng deste DNA com 10 e 2 ng de uma inserção de cDNA Ddel/Xbal de vector é obtido a partir do DNA do plasmídeo pCAL5 digestão com fosfataes alcalina e (c) purificação em gel de do DNA vector de 5,9 kb. 0 fragmento inserção de cDNA de DNA do plasa inserção gel de agadeste fragmento de 0,8 kb foi digerido com D de I, Finalmencompleta com Xbal e HindIII, (b) desfosfode pCAL3 (Exemplo 20). 30 jig digeridos com HindIII e Xbal e foi isolada por purificação em agarose de 0,7 kb derivou mideo pCAL3 foram de cDNA de 0,8 kb rose 3 jig produzindo assim fragmentos de DNA de 0,1 e 0,7 kb.

te isolou-se o fragmento de 0,7 kb por electroforese em gel de agarose e purificação.

DNA ligado

E.coli HB101.

foi usado para transSeleccionou-se um formar células competentes plasmídeo recombinante (pCAL8; Figura 7) fragmentos de restrição esperados após integração da inserção de DNA no DNA que apresentava os vector.

Digeriu-se 10 jig de DNA do plasmideo pCAL8 foram totalmente digeridas com Sall. As moléculas de DNA linear foram purificadas por electroforese em gel de agarose. Ligaram-se 10 ng de pCAL8 clivado com Sall com 10 ng do plasmídeo pND2 clivado com Sall/Xhol (Exemplo 26.2). 0 DNA ligado foi usado para transformar células competentes E.coli HB101 que se semearam em placas de agar contendo meio LB suplementado com 50 ^ug/ml de canamicina. Seleccionou-se um plasmídeo recombinante (pCAL8-BF/ND; Figura 7) para a expressão e produção de IgE-BFs em hospedeiros mamíferos transformados .

EXEMPLO 27

Selecçao de linhas celulares de mamífero transformadas expressando polipeptideos com actividade de ligaçao a IgE

Os métodos usados para a transfecçao de células de mamífero com DNA, assim como selecçao de células transformadas e selecçao da amplificaçao de genes estão descritos detalhadamente (Patente dos Estados Unidos 4 395 216 (1983); Kaufman, R.J. e Sharp, P.A. (1982), J. Mol Biol. 159, 601-621) e sao bem conhecidos dos que trabalham no assunto. Usou-se como hospedeiro um mutante negativo para a dihidrofolato redutase (dhfr ) de uma linha celular de ovário de hamster Chinês (Linha celular DUIC X-Bl; Chasin, L.A. e Urlaub, G., (1980) Proc. Nat. Acad. Sei. USA 77, 4216-4220). As células sao mantidas em meio MEM (Gibco, Paisley, Scotland) suplementado cora 5% de FCS dialisado e 0,1 mg/ml de gentamicina (Gibco). Transfectaram-se células CHO subconfluentes com 10 jig de DNA dos plasmideos pCAL5-R/ND ou pCAL8-BF/ND usando o método de coprecipitaçao com Ga-fosfato. As células transfectadas sao cultivadas em meio Alfa-MEM suplementado com 5% FCS, gentamicina e 0,5 mg/ml de G41o (Gibco).

Após duas semanas surgiram colónias isoladas de células resistentes a G418. 48 colónias foram transferidas individualmente para os poços de placas de microtitulaçao de 24 poços e cultivadas até à confluência do meio de selecçao descrito atrás. Removeram-se então aliquotas do meio e testaram-se quanto à presença da actividade de ligaçao a IgE usando a RIA descrita no Exemplo 7. Cerca de 50% das colonias sao positivas e produzem aproximadamente 0,1-10 ng de polipeptideo recombinante por ml. As colónias transformadas derivadas do plasmídeo pCAL8-BF/ND sao

geralmente melhores produtores do que as obtidas com o plasmideo pCAL5-R/ND. As cinco melhores colónias produtoras foram usadas para amplificaçao de genes com metotrexato (Kaufman e Sharp op.cit.). Após vários círculos de amplificaçao, obtiveram-se linhas celulares que produzem até 1 |ig/ml de polipeptideo recombinante. 0 melhor produtor, a linha celular CIIO-BF/ND, cultivou-se por cultura em bloco. Semeou-se aproximadamente 3χ10θ células por frasco de cultura de teci2 ~ , dos (Falcon, 175 cm ) com 50 ml de meio de selecçao. Apos a camada celular ter atingido a confluência, o meio foi removido e substituído por 50 ml de meio Alfa-MEM suplementado com 1% FCS e 0,1 mg/ml de gentamicina. Colheu-se o meio duas vezes por semana durante várias semanas. Centrifugou-se durante 10 minutos a 5000 g e guardou-se a -20°C. Finalmente, os polipeptideos recombinantes com actividade de ligaçao a IgE foram purificados a partir dos sobrenadantes combinados por cromatografia de afinidade conforme aqui já foi descrito, e.g. nos Exemplos 22 e 23.

Purificação de IgE-BF natural de células RPMI 8866 e análise da sequência

Através da purificação a partir das fracçoes contendo IgE-BF de sobrenadantes da linha celular RPMI 8866 (EP 86810244.3) de acordo com os Exemplos B e D que se seguem é possível obter um IgE-BF que seja suficientemente puro para sequênciaçao e determinação do extremo amino.

EXEMPLO A

Ensaio imunoadsorvente ligado a enzima (ELISA) de IgE-BF

Testaram-se as fracçoes de IgE-BF do seguinte modo: Revestiram-se poços de placas de microtitulaçao em PVC com Mab-176 (5 jig ml em PBS; 100 jig por poço) durante a noite numa câmara húmida à temperatura ambiente. Lavaram-se as placas duas vezes com PBS antes do bloqueio dos locais de ligaçao nao específicos com PBS contendo 0,2% de gelatina (150 jil/poço; lha 37°C). As placas foram lavadas de novo duas vezes com PBS. As fracçoes das experiencias de cromatografia foram diluídas a 1/50 em PBS, adicionadas aos poços (100 jil/poço) e incubadas durante a noite à temperatura ambiente numa câmara húmida. Lavaram-se as placas 4 vezes com PBS. 0 IgE-BF ligado foi detectado pela adiçao do Mab-135 ao qual se ligou covalentemente biotina (Exemplo 19, EP 86810244.3) (0,5 ug/ml em PBS contendo 0,2% de gelatina; 100 jil/poço) e incubado 4 h a 37 C numa camara húmida. Apos lagem com PBS (4 vezes) as placas foram incubadas com 100 pi de um conjugado de avidina e fosfatase alcalina (Sigma Cat. N² A 2527 0,5 pg/ml) em PBS contendo 0,2% de gelatina durante 2 h a 37°C. Após lavagem adicional com PBS as placas foram reveladas com 1 mg/ml de p-nitrofenilfosfato di-sódico em tampao substrato (100 mg MgCl₂ x 6H_?0, 200 mg NaN^, 97 ml de dietanolamina dissolvida em 800 ml de H₂0, pH ajustado a 9,8 com 37% HC1). A reacçao de cor amarela fica óptima apos 20-40 min a 37°C. Parou-se então a reacçao com 50 jil de NaOH (1M) por poço. Determinou-se a densidade óptica usando um Leitor EIA Modelo 2550 (Bio-Rad) a 405 nm.

EXEMPLO B

Purificação de IgE-BF a partir de sobrenadantes de células B humanas por cromatografia de imunoafinidade

Filtrou-se 10 litros de sobrenadante de culturas de células RPMI 8866 através de uma coluna de 20 jil de Mab-45-affigel (Exemplo 10 de EP 86810244.3) a um fluxo de 120 ml/h. 0 gel foi lavado com PBS. 0 teor proteico do volume de exclusão foi controlado por absorvância a 280 nm usando um espectofotometro Uvicord ^v para assegurar remoção completa das proteínas nao ligadas. Eluiu-se a coluna com 50 ml de glicina-HClO,1M, pH 2,6. Colheram-se fracçoes em tubos contendo igual quantidade de 1M Tris-HCl, pH 8,0 e 0,5% Tween 20. As fracçoes contendo IgE-BF foram reunidas e dializadas contra 10 mM Tris-HCl, pH 7,4.

EXEMPLO C

Purificação de IgE-BF por cromatografia de permuta jónica

IgE-BF purificado do EXemplo B foi aplicado numa coluna de permuta aniónica SynChropak AX 300 (SynChron Inc. hiden, IN). Lavou-se a coluna com 10 mM

Tris-HCl, pH 7,4 e a proteína foi eluida com um gradiente de 0 a 1M NaCl em 100 min a um fluxo de 1 ml/min.

A eluiçao foi controlada por absorção de UV a 254 nm. Colheram-se as fracçoes em 1% de octilpiranoglucosido (Sigma) e testaram

-se para IgE-BF conforme descrito no Exemplo A.

/

EXEMPLO D

Posterior purificação de TgE-BF por cromatografia de fase reversa

Dialisou-se 50 ml de IgE-BF do Exemplo C contra 0,5 1 de PBS e duas vezes contra 0,5 1 de PBS contendo 0,1% de octilpiranosido. Após liofilizaçao, solubilizou-se o IgE-BF em 1,5 ml de I-^O e dialisou-se de novo contra 2 x 0,5 1 de PBS contendo 0,1 de octilpiranoglu_ cosido. A cromatografia em fase reversa efectuou-se numa coluna Synlhropak RP-4 (Synlhrom) em 0,1% TFA (Pierce) e 5% de acetonitrilo la aplicaçao, de

0,1% TFA durante 30 minutos a um fluxo de 0,5 ml/min. A eluiçao foi controlada por absorçao de UV a 254 nm. ram-se fracçoes de 1 ml para 0,05 SDS e testaram-se para IgE-BF como descrito no controlada por (EP (Merck). A eluiçao de IgE-BF foi obtida peum gradiente de 5 - 60% de acetonitrilo em

86810244.3

ColheExemplo A. A pureza de IgE-BF SDS-PAGE com subsequente coloraçao com Exemplo 22).

f oi prata

EXEMPLO E

Análise da sequência de aminoácidos de IgE-BF

IgE-BF purificado do Exemplo D foi sujeito a análise da sequência do extremo amino usando um sequênciador de proteínas de fase positiva modelo 470 (Applied Biosystems) de acordo com o método de M. W. Hunkapillar e L. E. Hood, Methods in Enzymology 91, 399, 1983. Os derivados amino-tiozolinona foram rearranjados para ami89

noácidos feniltio-hidantoina (PTH) por tratamento com TFA aquoso a 25% a 50°C. Os aminoácidos PTH foram analisados numa coluna de HPLC Zorbax CN^A (Du Pont, 200x4,6 mm) (R. Knecht et al., Anal. Biochem.130, 65, 1983). Encontrou-se a seguinte sequência de aminoácidos N-terminal para 40% do material :

148 149	155	160	163
L X	Μ E L Q V X S	G F V X N T	X P

^X149’ ^X155’ nados. Esta ^X160

^X163 representam aminoácidos nao determisequência está de acordo com a sequência do receptor de IgE determinado por analise do cDNA, começando no aminoácido N² 148 do receptor.

Para 60% do material encontrou-se a seguinte sequência de aminoácidos N-terminal:

160

QVSSGFVXN

163

T X P E K ^X151’ ^X160’ ^{e X}163 representam aminoácidos nao determinados. Esta sequência está de acordo com a sequência do receptor de IgE determinado pela análise de cDNA, começando no aminoácido N² 150 do receptor.

EXEMPLO 28

Elevados niveis de expressão em E.coli de um polipeptideo com actividade de factor de ligaçao de IgE.

28.1 Construção do plasmídeo de expressão: 10 ng de DNA vector de 2,9 kb purificado do Exemplo 24.1 (plasmídeo pPLc24 cortado com EcoRI e BamHI) foi misturado com 0,1 ng do oli gonucleotideo 5’-pAATTTGGAGGAAAAAATTATG (Pharmacia, Ν^Ώ27-4878 -01) e 0,1 ng do oligonucleotideo 5’-pGATCCATAATTTTTTCCTCCA (Pharmacia, N² mM Tris-HCl e 100 unidades

Após 16 horas a 4°C, usou-se las competentes E.coli K12.

27-4898-01) em 20 jil d pl-l 7,5, 10 mM de DNA ligase e uma solução contendo mM DTT, 0,1 mM ATP, (Boehringer, Mannheim), : MgCl₂ , de T4 amistura para transfromar céluCultivaram-se colónias individuais e o DNA de plasmideo foi isolado a partir delas. Fezse analise de restrição convencional para seleccionar um plajs mideo correcto (pPL.PTIS; ver Figura 8) o qual foi cortado por BamHI mas nao por EcoRI. A inserção correcta dos oligonucleotideos foi confirmada por sequênciaçao do DNA. 0 fragmento de DNA inserido de novo codifica um sitio de iniciaçao da traduçao (PTIS, Pharmacia).

Digeriu-se 10 |ig de DNA do plasmídeo pPL PTIS com Bam Hl, depois tratou-se com fosfatase alcalina e o DNA vector de 2,9 kb foi purificado por electroforese em gel de agarose. Ligou-se 10 pg deste DNA vector com 3 ng do fragmento BglII a Bam Hl de 0,8 kb derivado do plasmídeo pCAL-3 (exemplo 20) e depois usou-se para trans. formar células competentes E. coli k!2. 0 DNA de plasmídeo foi isolado a partir de colónias individuais: e a análise de restrição convencional efectuada para seleccionar um plasmídeo, pPl. PTIS-BF, tendo a inserção de 0,8 Kb na orintaçao correcta (Figura 8).

Usou-se o plasmídeo pPLPTIS-BF para transformar E. coli estirpes U3110 e HB101, ambas portadoras de λΐΒ57 (Remaut et al., loc. cit.). Os transformantes foram semeados em placas LB contendo 40 -pg/ml de canamicina e ampicilina e crescidos por incubaçao a 30°C durari te 24 horas. As colónias recombinantes resultantes foram usadas para fermentação.

28.2 Fermentaçao_ç_ As estirpes recombinantes de E. coli obtji das no Exemplo 28.1 foram cultivadas como descrito no Exemplo 24.2. Após 3 horas de indução a 42°C as culturas foram arrefecidas durante 30 minutos num banho de gelo/água e colhidas por centrifugação.

28.3 Purificação de polipeptídeos com actividade de ligaçao a IgE: o sedimento de células obtido a partir de 11 de cultura induzida pelo calor foi ressuspenso em 20 ml de 50 mM tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA a 4°C. A suspensão de células foi sonicada ao mesmo tempo que era constantemente arrefecida em gelo (MSE Soniprep ¹ 150, sonda de 9,5 mm amplitude de 24 microns) durante 4 x 30 segundos com intervalos de um minuto. A suspensão foi então centrifugada durante 10 minutos (centrífuga Sowall, rotor HB-4, 9000 rpm, 4°C). 0 sedimento foi ressuspenso em 20 ml de 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA a 4°C e sonicada durante 30 segundos como descrito atrás. A suspensão foi centrifugada como descrito atrás e o ciclo de lavagem repetido mais duas vezes.

Breve descrição das Figuras

Figura 1:	Preparaçao dos plasmideos pCL-1 e pCL-2 contendo como inserção ds-cDNA de mRNA isolado de células B RPMI 8866. 0 cDNA da inserção codifica polipeptideos relacionados com receptores de IgE e fact£ res de ligaçao a IgE.
Figura 2:	As duas inserções dos plasmideos pCL-1 e pCL-2 sao comparadas, mostrando as regiões codificadoras idênticas em ambas as inserções, as regiões nao codificadoras idênticas em ambas as inserções, a região codificadora presente apenas em pCL-2 e regiões nao codificadoras diferentes em ambas as inserções, assim como os sitios de restrição.
Figura 3:	- - TM Construção do plasmídeo pGEM -1/CL2 a partir de TM pCL-2 e pGEM -1 e transcrição da inserção de DNA em mRNA.
Figura 4:	A construção dos plasmideos pFK-1, com a inserção codificadora da sequência de aminoácidos a Ser^Ri e pFK-2, codificador da sequência de amino. ácidos de Ala^^ a $er321 ^arinula I» começando com o plasmídeo pCL-2.
Figura 5:	A construção do plasmídeo pBL-BF para expressão de IgE-BF em E. coli w3110 e HB1O1. Sao expressos os aminoácidos 119 a 321 sob o promotor P^ do fago λ ·
Figura 6:	A construção do plasmídeo pJDB207R/PH05-BF para expressão de IgE-BF em Saccharomyces cerevisiae.

Sao expressos os aminoácidos 119 a 321 sob o con trole do promotor pHO5.

Figura 7: A construção dos plasmídeos pCAL5-R/ND e pCALSBF/ND para a expressão do receptor de IgE ligado a membranas ou do IgE-BF secretado, respectivamente, em células de mamifero em cultura (células de ovário de hamster Chinês).

Figura 8:

A construção do plasmídeo pPL.PTIS-BF para transformação e expressão de IgE-BF em E. coli.

Legente: Enzimas de restrição

A = HaelI	G	= BglIII
B = BamHI	H	= HindiII
C = HinsII	N	= Ncol
E = EcoRI	P	= PstI

R = Rsal sequência codificadora do polipeptideo relacionado com receptores de IgE e/ou IgE-BFs sequência codificadora especifica de pCL-2 (Fig. 2) sequência nao codificadora diferente em pCL-1 e pCL-2 r

sequência nao codificadora, idêntica em pCL

-1 e pCL-2 (Fig. 2) mRNA

Disposição de Microorganismos

A Escherichia coli HB101/pCL-2 contendo o plasmídeo pCL-2 foi depositado em 30 de Julho, 1986 no Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen, Grisebachstrasse 8, D-3400 Gottingen, com o número de Acessão DSM 380 7.

-94-Α

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Claims (3)

REIVINDICAÇÕES lâ. - Método para a produção de um polipeptídeo tendo a sequência de aminoácidos com a fórmula 10 20 30 M E E G Q Y S E I E E L P R R R C C R R G T Q I V L L G L V 1» 0 50 60 T A A L w A G L L T L L L L W H W D T T Q S L K Q L E E R A 70 80 90 A R N V s Q V S K N L E S H H G D Q Μ A Q K S Q s T Q I S Q 100 110 120 E L E E L R A E Q Q R L K S Q D L E L S W N L N G L Q A D L 130 140 150 S S F K S Q E L N E R N E A S D L L E R L R E E V T K L R M 160 170 180 E L Q V S s G F V c N T C P E K W I N F Q R K C Y Y F G K G 190 200 210 T K Q W V H A R Y A C D D M E G Q L V s I H S P E E Q D F L 220 230 240 T K H A s H T G S W I G L R N L D L K G E F I W V D G S H V 250 260 270 D Y S N w A P G E P I S R S Q G E D C V M M R G S G R W N D 280 290 300 A F C D R K L G A W V C D R L A T C I P P A S E G S A E S M 310 320 G P D S R P D P D G R L P T P S A P L H S 9 (I) 321 de um seu fragmento, mutante ou derivado caracterizado por a) se cultivar um hospedeiro transformado contendo um vector híbrido compreendendo uma sequência de DNA codificadora de um polipeptideo com a fórmula (I), um seu fragmento ou mutante, ou b) se traduzir num sistema de traduçao adequado o mRNA codificador de um polipeptideo com a formula (I), um seu fragmento ou mutante, e quando necessário, se transformar um polipeptideo com a fórmula (I), um seu fragmento ou mutante, num seu derivado.

1. BslII CG)

1. Ncol (N)

1. se preparar um DNA codificador de um polipeptideo com a fórmula (I) um seu fragmento, mutante ou derivado,

2. Klcngv Pol. ♦ dNTP

2. Klenou Pol. ♦ <JNTP

3. BtnHI (B)

t.fosfatase alcalina

2. se incorporar o DNA obtido num vector adequado,

3. se transformar um hospedeiro adequado cora o vector hibrido obtido,

4. se seleccionar os hospedeiros transformados de entre os hospedeiros nao transformados e, facultativamente, se isolar o vector hibrido a partir do hospedeiro transformado, se modificar a região codificadora ou nao codificadora do vector hibrido e se realizar de novo os passos 3 e 4.

ll^â. - Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por se usar um vector hibrido, compreendendo uma inserção codificadora de um polipeptideo com a formula (I) em que a sequência de aminoácidos compreendendo os aminoacidos 106 a 127 foi eliminada.

12^ã. - Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por se usar um vector hibrido, compreendendo uma inserção codificadora de um fragmento do polipeptideo com a formula (I), que é seleccionado do grupo constituído pelos polipeptideos que começam com qualquer um dos aminoácidos 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151,

152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159 ou 160 e terminando com o aminoácido 321.

13^a. - Método de acordo com a reivindicação 10, caraeterizado por se usar um vector híbrido, compreendendo uma inserção codificadora de um fragmento do polipeptideo com a formula (I) o qual é seleccionado do grupo constituído por polipeptideos que começam com qualquer um dos aminoácidos 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127,

128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159 ou 160 e terminando

com qualquer um dos aminoacidos entre 282 e 321.

14^a. - Método de acordo com a reivindicação 10, caraeterizado por se usar um vector hibrido, compreendendo uma inserção codificadora de um fragmento do polipeptideo com a formula (I), que consiste na sequência de aminoácidos do aminoácido 119 ao aminoácido 321.

15^a. - Método de acordo com a reivindicação 10, caraeterizado por se usar um vector hibrido, compreendendo uma inserção codificadora de um fragmento do polipeptideo com a fórmula (I) que consiste na sequência de aminoácidos do aminoácido 134 ao àminoácido 321.

16^a. - Método de acordo com a reivindicação 10, caraeterizado por se usar um vector hibrido, compreendendo uma inserção codificadora de um fragmento do polipeptideo com a formula (I) que consiste na sequência de %

100 aminoácidos do aminoácido 148 ao aminoácido 321.

17^a. - Método de acordo com a rei vindicaçao 10, caracterizado por se usar um vector hibrido, compreendendo uma inserção codificadora de um fragmento do polipeptideo com a formula (I), que consiste na sequência de aminoácidos do aminoácido 150 ao aminoácido 321.

18^a. - Método de acordo com a rei vindicaçao 10, caracterizado por se usar um vector hibrido, compreendendo uma sequência de DNA com a formula (II) ou (III) ou um seu fragmento ou mutante.

19^a. - Método de acordo com a rei vindicaçao 10, caracterizado por se usar o vector hibrido pCL2.

20^a. - Método de acordo com a rei vindicaçao 10, caracterizado por se usar o vector hibrido pCLl.

21^a. - Método de acordo com a rei vindicaçao 10, caracterizado por se usar o vector hibrido pPL-BF.

22^a. - Método de acordo com a rei vindicaçao 10, pCAL8-BF/ND. caracterizado por se usar o vector hibrido

101

23^â. - Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por se usar o vector hibrido pPL.PTIS-BF.

24^â. - Método para a preparaçao de um vector hibrido de acordo com a reivindicação 10, caraç terizado por um DNA codificador de um polipeptideo com a fór_ mula (I), um seu fragmento, rnutante ou derivado ser enlaçado (spliced) num vector adequado.

25^â. - Método para a preparaçao de um vector hibrido de acordo com a reivindicação 24, caraç terizado por se preparar qualquer um dos vectores hibridos das reivindicações 11 a 24.

Lisboa, 20 de Julho de 1987

J. PEREIRA DA CRUZ

Agente Oficial da Prepricdcílc Industrial RUA VICTOn CORDON. 10-A, 1?

1200 LISBOA'

FOLHA 1 (8 FOLHAS)

r.SNA

FIGURA 1

Transcriptase reversa + oligo(dT)

Pst I (P)

Transferase + dGTP terminal |

Condições alcalinas

E.coli poli- Transferase merase / \ terminal· + (frag.Klenow dCTP

0 --.-:....7- -,: --=: CCCC—----------------------ΤΤΓ os-cDM

Nuclease SI /Transcriptase reversa + oligo(dG)

Transferase terminal

- + dCTP •<eccc pCL-1 pCL-2

FOLHA 2 (8 FOLHAS)

FIGURA 2 pCL-1 pCL-2

FOLHA 3 (8 FOLHAS)

FIGURA 3

Pst I (P) I

Hínc II (C) I

P

O D-H IFOLHA 4 (8 FOLHAS)

FIGURA 4 pIN-III-ompA-3 com BamHI (B) pIN-III-ompA-2 cortado com Hind IIIZ (H) \ /

Γ

FOLHA 5 (8 FOLHAS)

FIGURA 5

2-, - Método para a produção de um fragmento de um polipeptideo com a fórmula (I) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a sequência de aminoácidos compreendendo os aminoácidos 106 a 127 ser eliminada.

3^â. - Método para a produção de um fragmento de um polipeptideo com a fórmula (I) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ele ser seleccionado do grupo constituído por polipeptideos começando com qual.

quer um dos aminoácidos 120, 121, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129 , 130, 131, 132, 133, 134, 135, , 136, 137, 138, 139, 140, 141 , 142, 143, 144, 145, 146, 147, , 148, 149, 150, 151, 152, 153 , 154, 155, 156, 157, 158, 159 ou 160 e terminando

com o aminoácido 321.

4^a. - Método para a produção de um fragmento de um polipeptideo com a formula (I) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ele ser seleccionado do grupo constituído pelos polipeptideos que começam em qualquer um dos aminoácidos 120, 121, 123, 124, 125, 126,

127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149 , 150 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159 ou 16 0 e termi nando com qualquer um dos aminoáci dos entre 282 e 321 .

5^a. - Método para a produção de um fragmento de um polipeptideo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ele consistir na sequência de aminoácidos entre o aminoácido 119 e o aminoácido 321.

6^a. - Método para a produção de uin fragmento de um polipeptideo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ele consistir na sequência de aminoácidos entre o aminoácido 134 e o aminoácido 321.

7^a. - Método para a produção de um fragmento de um polipeptideo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ele consistir na sequência de aminoácidos entre o aminoácido 148 e o aminoácido 321.

8-. - Método para a produção de um fragmento de um polipeptideo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ele consistir na sequência de aminoácidos do aminoácido 150 ao aminoácido 321.

9^a. - Método para a produção de um mutante ou de um derivado de um fragmento de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 8.

de um tideo para a preparaçao hospedeiro transformado capaz de expressar um polipepde acordo com a reivindicação 1, caracterizado por

10^s

Método

3. B.nHI (8)

EcoRI (E) B.»HI (B) fosfatase calina pPL-BF

FOLHA 6 (8 FOLHAS)

FIGURA 6 pJBr2C7Ã/r“< <FA;ií-2 g

BimHI (B> fosfatase alcalina ρ;Γ5ίΟ7/ΞΒΟ5-Τ?Α18 BanHl (B)

HíndIII (H) ''

Bar,Hl (B)

Bglll (G)

PJDB2O7R/PHO5-BF

FOLHA 7 (8 FOLHAS)

FIGURA 7 pSVneo2911 pU/3

PCAL3 pND2 (Β)

BamHI