PT849595E - Particulas sinteticas como reagentes de aglutinacao - Google Patents

Description

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DESCRICAO "Partículas sintéticas como reagentes de aglutinação" O presente invento refere-se a um processo para a detecção de um analito num líquido de amostra através de aglutinação, em que se coloca em contacto o líquido de amostra com um reagente de aglutinação e uma matriz inerte, submetendo a mistura reaccional à acção da gravidade e determinando a reacção entre o analito e o reagente de aglutinação. Além disso são revelados novos reagentes para a realização do processo de acordo com o invento.

Conhecem-se métodos para detecção de analitos através de testes de hemaglutinação assim como de aglutinação de partículas. Estes testes são aplicados sobretudo no diagnóstico de doenças infecciosas para a detecção de antigénios ou anticorpos. Todos estes métodos, no entanto, têm o inconveniente comum de exigirem muito dispêndio de tempo e pessoal, e de ser frequentemente muito difícil interpretar os seus resultados.

Para testes de hemaglutinação em que se utilizam eritrócitos não fixados como reagentes de aglutinação, conhecem-se processos de imunoensaio em gel, nos quais se separam hemaglutinados através de uma operação de centrifugação numa matriz inerte, de eritrócitos individuais não aglutinados (compare-se, p.ex., EP-A-0 194 212, EP-A-0 305 337, EP-A-0 557 546, EP-A-0 634 216, EP-A-0 485 228 e W095/31731). De acordo com estes processos, eritrócitos aglutinados são fixados sobre, ou no interior da matriz inerte, podendo, desta maneira, ser separados nitidamente de eritrócitos individuais que não reagem, os quais conseguem atravessar a matriz e sedimentam no fundo do recipiente reaccional.

Apenas em EP-A-0 305 337, que remonta a um pedido de patente de prioridade do ano 1987, se encontra a afirmação de que é possível utilizar também, como reagentes de aglutinação, partículas sintéticas como, por exemplo, látex ou agarose polimerizada. No entanto, não se encontram informações sobre as características de partículas sintéticas deste género. Além disso, esta proposta não foi aproveitada nos tempos que se seguiram, nem em patentes nem noutras publicações. Publicações mais recentes como, p.ex., a 85 926 ΕΡ Ο 849 595/ΡΤ ΕΡ-Α-0 557 546, referem-se, pelo contrário, a eritrócitos não fixados como reagentes de aglutinação.

Um inconveniente dos eritrócitos não fixados consiste, no entanto, na sua instabilidade que, sob determinadas condições reaccionais, conduz a hemólise. Esta instabilidade provoca muitas vezes curtos prazos de expiração não desejados de produtos de produtos com base em eritrócitos não fixados. Além disso, uma produção normalizada e reprodutível de preparações de eritrócitos, especialmente de preparações de eritrócitos acoplados a anticorpos ou antigénios, é muito dispendiosa. Desta maneira fica praticamente excluída uma uniformidade satisfatória de características físicas em preparações de eritrócitos.

Um dos problemas em que o presente invento assenta consistia, portanto, em eliminar, pelo menos parcialmente, os inconvenientes supramencionados que resultam da utilização de eritrócitos como reagentes de aglutinação. Pretende-se, especialmente, proporcionar através do presente invento, partículas sintéticas capazes de serem utilizadas como reagentes de aglutinação e que possam simular o comportamento de eritrócitos em imunoensaios em gel habituais. Além disso pretende-se que as partículas sintéticas permitam um acoplamento simples de substâncias biológicas e que sejam preparadas de modo a funcionarem como reagentes de aglutinação, pelo menos, equivalentes aos eritrócitos utilizados até agora, no que se refere à sua sensibilidade e especificidade. Pretende utilizar-se estas partículas sintéticas em processos de aglutinação que sejam mais simples de realizar e avaliar do que os processos que se conhecem até à data.

Este problema é resolvido através de um processo para detecção de um analito num líquido de amostra através de aglutinação, processo esse em que se coloca em contacto o líquido de amostra com um reagente de aglutinação e uma matriz inerte, submetendo a mistura reaccional à acção da gravidade e determinando a reacção entre o analito e o reagente de aglutinação, processo esse caracterizado por se utilizarem, como reagente de aglutinação, partículas sintéticas cujo diâmetro e densidade são escolhidos de modo a se comportarem, em relação à matriz, essencialmente como os eritrócitos. 85 926 ΕΡ Ο 849 595/ΡΤ 3

Surpreendentemente verificou-se que, no caso de se optimizar simultaneamente a densidade e o diâmetro, é realmente possível produzir partículas sintéticas capazes de passar sem problemas por uma matriz inerte num imunoensaio em gel, simulando assim de maneira perfeita eritrócitos frescos.

No âmbito das investigações que resultaram no presente invento mostrou-se que a passagem de partículas poliméricas rígidas é atrasada mais fortemente em relação aos eritrócitos (diâmetro 6-8 μιτι). Sob certas condições padrão, isto significava concretamente que partículas normalizadas de tipo comercial com um diâmetro de 3 - 7,5 pm sedimentavam de forma apenas incompleta na matriz de gel, enquanto que as maiores (11,9 pm) ou as mais pequenas (< 1pm) conseguiam penetrar no gel apenas fracamente. Um aumento dos parâmetros de duração da centrifugação (de 10 min a 50 min) ou da velocidade de centrifugação (de 1030 a 1300 rpm) resultou numa melhor sedimentação mais ainda não completa. Mesmo que tivesse sido possível conseguir, através destas duas medidas, uma sedimentação optimizada, uma alteração/aumento da duração e da velocidade de centrifugação representam graves convenientes, devido às razões seguintes: 1. Pretende-se que o sistema de acordo com o invento permita um processo com particularmente pouco dispêndio de tempo em relação aos métodos comparáveis. Numa possível duração de centrifugação de 50 minutos, a duração de 20 minutos pretendida no teste, incluindo a incubação, triplicar-se-ia portanto. 2. Como é conhecido dos peritos, a sensibilidade em processos de centrifugação em gel reduz-se com o aumento da velocidade de centrifugação. 3. No caso de se respeitarem os parâmetros preestabelecidos, existe no mercado uma centrífuga de tipo comercial para o sistema de acordo com o invento.

Inesperadamente verificou-se que é possível obter um comportamento comparável ao dos eritrócitos na passagem pela matriz inerte, com partículas sintéticas de diâmetro inferior ao dos eritrócitos e de densidade superior à 85 926 ΕΡ Ο 849 595/ΡΤ 4 habitual, sendo possível a utilização não apenas de partículas sintéticas esféricas como também assimétricas.

Revelaram-se essenciais para o processo de acordo com o invento, partículas sintéticas com um diâmetro médio < 5 um, especialmente de 1 a 5 uim. Prefere-se particularmente que o diâmetro médio se encontre entre os 2 e 4 um. A massa volúmica das partículas é superior ou igual a 1,1 g/cm3, ficando convenientemente no intervalo de 1,1 a 1,8 g/cm3. De preferência, a massa volúmica encontra-se no intervalo de 1,1 a 1,6 g/cm3, sendo o intervalo mais preferido o de 1,15 a 1,4 g/cm3, especialmente no caso do processo de detecção ser realizado sob condições normalizadas como as que estão predefinidas para imunoensaios em gel comerciais habituais com eritrócitos (p.ex. DiaMed).

As partículas sintéticas utilizadas no processo de acordo com o invento como reagente de aglutinação são, de preferência, partículas orgânicas poliméricas ou copoliméricas. Materiais particularmente preferidos são estireno e derivados de estireno como, por exemplo, estirenos bromados e, especialmente, copolímeros dos mesmos. Os peritos conhecem suficientemente bem a fabricação de partículas poliméricas uniformes no intervalo de tamanhos de interesse para os reagentes de aglutinação de acordo com o invento (Arshady (1992): Suspension, emulsion and dispersion polymerization: A methodological Survey. Colloid & Polymer Science 270, 717-732; Okubo e Shiozaki (1992): Production of micron-size monodispense polymer particles by seeded polymerization utilizing dynamic swelling method with cooling process. Polymer International 30, 469-474). Os métodos deste género servem-se habitualmente de uma combinação de polimerização em emulsão e em dispersão para produzir partículas com propriedades físicas definidas com exactidão.

Para a detecção visual da reacção de aglutinação no processo de acordo com o invento podem ser incorporados corantes nas partículas, especialmente corantes insolúveis em água. Assim, por exemplo, as partículas sintéticas com coloração azul, amarela, verde, preta ou encarnada revelam-se como optimamente apropriadas para a avaliação visual. Numa concretização particularmente preferida do presente invento trabalha-se com partículas encarnadas, devido à sua detectabilidade particularmente boa. 85 926 ΕΡ Ο 849 595/ΡΤ A robustez das partículas sintéticas torna possível a imobilização na sua superfície de um grande número de ligandos diferentes de acordo com métodos industriais normalizados conhecidos. Convenientemente são imobilizadas, neste caso, moléculas de ligandos com capacidade para se ligarem ao analito a determinar. As moléculas dos ligandos podem ser imobilizadas através de interacções adsorptivas, covalentes ou de elevada afinidade. O acoplamento covalente, por exemplo, pode ser realizado através de grupos quimicamente reactivos expostos na superfície. Exemplos destes grupos são os grupos carboxilo, amino, aldeído e epoxi. A imobilização através de interacções de elevada afinidade é efectuada através de dois parceiros de um par de ligação de elevada afinidade como, por exemplo, estreptavidina ou avidina/biotina, hapteno/anticorpos, sacárido/lectina, etc. Através destas interacções covalentes e de elevada afinidade é possível imobilizar moléculas de ligandos como, por exemplo, péptidos, p.ex. péptidos sintetizados, proteínas, p.ex. glicoproteínas, lipoproteínas, polipéptidos recombinantes, imunoglobulinas, ácidos nucleicos, p.ex. ADN ou ARN, compostos análogos aos ácidos nucleicos, sacáridos, p.ex. mono, di, oligo e polissacáridos, lípidos, hormonas, metabolitos ou outras substâncias biológicas. A imobilização pode realizar-se, neste caso, directamente ou através da utilização de ligantes para obter, de maneira controlada, uma orientação optimizada preferida das moléculas ligadas dos ligandos.

Mas é também possível, da mesma maneira, uma imobilização de moléculas de ligandos através de processos meramente adsorptivos. Isto é possível por exemplo, para membranas celulares como por exemplo, membranas de eritrócitos, trombócitos ou leucócitos, fragmentos de membranas celulares, ou lisados de células ou agentes patogénicos como por exemplo, vírus, bactérias ou parasitas. No caso de se utilizarem partículas sintéticas coloridas, uma coloração adicional das membranas torna-se desnecessária. O processo de acordo com o invento refere-se à detecção de um analito num liquido de amostra. Como líquidos de amostra servem, de preferência, líquidos corporais, podendo estes eventualmente estar diluídos, p.ex. sangue, soro, plasma, saliva ou urina. O volume do líquido de amostra para o processo de acordo com o invento pode variar num grande intervalo. De preferência utilizam-se, para microtestes, volumes de 1 a 200 ul. 85 926 ΕΡ Ο 849 595/ΡΤ

Como reagente de aglutinação utilizam-se no processo de acordo com o invento, as partículas sintéticas descritas. Estas partículas contêm de preferência, na sua superfície, uma molécula de ligando capaz de se ligar especificamente e com elevada afinidade ao analito. O reagente de aglutinação contém usualmente vários locais de ligação para o analito, o que torna possível a criação de complexos de aglutinação reticulados de analito e reagente de aglutinação.

Os analitos detectáveis através do processo de acordo com o invento são substâncias capazes de entrar numa interacção específica e de elevada afinidade com o reagente de aglutinação, p.ex. antigénios ou anticorpos, que podem ser determinados através de uma resposta imunológica, ou também ácidos nucleicos, que podem ser determinados através de uma reacção de hibridação. Uma primeira concretização preferida do presente invento refere-se à detecção de anticorpos como analitos no líquido de amostra, p.ex. anticorpos contra agentes patogénicos como, por exemplo, vírus (HIV, vírus de hepatite), bactérias ou protozoários, anticorpos contra auto-antigénios, anticorpos contra tumores ou anticorpos contra alergénios.

Além disso, consegue-se através do processo de acordo com o invento, realizar também uma detecção de anticorpos específica da sua classe, p.ex. uma distinção entre anticorpos IgG e IgM, o que muitas vezes tem uma importância considerável no diagnóstico, p.ex., de doenças infecciosas e doenças auto-imunes.

Por outro lado consegue-se determinar através do processo de acordo com o invento também antigénios, p.ex. antigénios livres como, por exemplo, proteínas do soro, metabolitos, hormonas, mediadores, etc., ou antigénios ligados a um suporte como, por exemplo, antigénios celulares de grupos sanguíneos, etc.

No processo de acordo com o invento utiliza-se um recipiente reaccional com uma matriz, de forma a ser possibilitada, após a acção de forças de gravidade, uma determinação qualitativa ou semi-quantitativa da reacção de aglutinação entre o analito a determinar e o reagente de aglutinação. Apesar da acção das forças de gravidade também poder ser efectuada através de uma sedimentação prolongada, é utilizada, de preferência, uma centrifugação, dado

85 926 ΕΡ Ο 849 595/ΡΤ que esta torna possível efectuar a sedimentação procurada em pouco tempo. As melhores condições em relação à duração da centrifugação e ao número de g para cada sistema analítico podem ser determinadas sem dificuldades pelo perito. Estas condições são determinadas especialmente pela natureza do complexo de aglutinação que se forma entre o reagente de aglutinação e o analito, dos componentes da mistura reaccional no estado não ligado, assim como da respectiva matriz utilizada.

No processo de acordo com o invento utiliza-se, de preferência, uma matriz inerte sob a forma de partículas. Por outro lado, é também possível utilizar, por exemplo, a matriz compacta descrita na EP 96 10 428.3.

De preferência, a matriz é uma matriz inerte sob a forma de partículas. A característica de "inerte" realça que a matriz não deve reagir de forma não específica com o analito ou o reagente de aglutinação. De preferência utilizam-se, como matriz, partículas como as que são comercializadas para a cromatografia em fase líquida (p.ex. de Merck, Pharmacia, Bio-Rad, Tosohaas). Exemplos específicos são Sephadex”, Sepharose‘, Sephacryr, Bio-Gef ou Toyopearl^. Tratam-se de produtos à base de polímeros ou copolímeros reticulados como, por exemplo, agarose, poliacrilamida, polidextrano, estireno/divinilbenzeno ou polimetacrilato. Interessam também contas de vidro. 0 tamanho dos grãos das partículas da matriz é, de preferência, 10 pm a 200 pm. Interessam também matrizes às quais já se encontram acoplados reagentes de detecção como, por exemplo, anticorpos, como as que são comercializadas, por exemplo, pelas firmas Pierce ou Pharmacia. O perito pode determinar através de ensaios preliminares simples, se as partículas são utilizáveis ou não num determinado método de detecção. A interpretação dos resultados do processo de acordo com o invento consiste em que, após a acção de forças de gravidade sobre a mistura reaccional, a) numa aglutinação forte, o produto da reacção entre o analito a determinar e o reagente de aglutinação não pode penetrar na matriz ou então só penetra muito pouco,

85 926 ΕΡ Ο 849 595/ΡΤ 8 b) numa aglutinação fraca, o produto da reacção penetra na matriz, mas não consegue atravessá-la completamente, e c) na ausência de aglutinação, os componentes contidos no recipiente reaccional conseguem atravessar a matriz de forma essencialmente completa.

Numa concretização preferida do processo de acordo com o invento trabalha-se com dois ou vários tipos diferentes de partículas sintéticas como reagentes de aglutinação. É que existem várias doenças associadas umas às outras, em que, quando se trabalha com métodos de teste tradicionais, é necessário realizar primeiro um chamado screening, no qual se verifica se a pessoa examinada é portadora de anticorpos contra uma doença pertencente a este grupo. Se o teste de screening do líquido corporal testado da pessoa examinada for positivo, esse liquido tem que ser submetido, numa segunda fase, segundo métodos tradicionais, a um chamado teste de diferenciação em que é diagnosticado contra que doenças do grupo se dirigem os anticorpos. Um exemplo típico deste género de procedimento é o diagnóstico do HIV. No screening é verificada a presença ou não de anticorpos específicos do HIV. Na diferenciação é verificado se estes se dirigem contra HIV-I, contra HIV-II ou HIV-1 e HIV-II.

No processo de acordo com o invento pode trabalhar-se, agora, com dois tipos diferentes de partículas sintéticas que, de preferência, não se distinguem um do outro no seu tamanho, forma, densidade e flexibilidade, mas que apresentam uma coloração diferente, p.ex. encarnado e azul, e que estão equipados com ligandos de superfície diferentes. Dado que com estas espécies diferentes de partículas sintéticas se forma uma suspensão homogénea com partes iguais de cada espécie, esta suspensão pode ser utilizada como num teste individual. Os resultados obtidos podem em seguida ser interpretados de maneira seguinte: No caso de ambos os analitos a determinar estarem presentes no líquido de amostra, resultam na matriz ou na sua área superior, após centrifugação, uma banda encarnada e uma azul. Se contiver só um analito, pode detectar-se na área superior da matriz uma banda da cor respectiva, enquanto que as partículas sintéticas da outra cor passam pela matriz e ficam abaixo da mesma. No caso do líquido de amostra não conter nem o primeiro nem o segundo analito, forma-se abaixo da matriz uma camada composta de ambas as partículas sintéticas. É evidente que é possível utilizar também,

85 926 ΕΡ Ο 849 595/ΡΤ 9 analogamente, três ou várias partículas sintéticas diferentes com cores distintas, para diferenciar simultaneamente o respectivo número de parâmetros.

Para a realização do processo podem ser utilizados, em princípio, quaisquer recipientes reaccionais apropriados para serem utilizados num teste de aglutinação em gel. Os recipientes reaccionais têm, de preferência, um volume de 50 μΙ a 2 ml. Os recipientes reaccionais estão equipados de preferência, com um funil para a alimentação dos reagentes. Numa concretização preferida utiliza-se um arranjo de vários recipientes reaccionais que estão dispostos juntos num cartão ou disco. Estes recipientes reaccionais existentes num cartão ou disco podem estar previstos para a detecção dos mesmos analitos ou para a detecção de analitos diferentes.

Para a realização do processo de acordo com o invento podem ser utilizados, por exemplo, os cartões comercializados pela firma DiaMed para a análise dos grupos sanguíneos, nos quais se encontram dispostos 6 micro-recipientes reaccionais. Da mesma maneira podem ser utilizados também produtos das firmas Ortho e Diagast. A acção da gravidade sobre a mistura reaccional é realizada, de preferência, através de centrifugação dos recipientes reaccionais numa centrífuga apropriada para este fim. Assim pode trabalhar-se, numa concretização preferida do processo de acordo com o invento, com a centrífuga do tipo comercial ID 12 S II da DiaMed, com os parâmetros já fixados (t= 10 min, v = 85g).

Numa outra concretização preferida do presente processo no entanto, pode trabalhar-se também com processos de centrifugação modificados particularmente adaptados às cinéticas das reacções que estão na base. Isto reflecte-se, sobretudo, num reforço das reacções fracas.

Além disso prefere-se, em determinadas concretizações do processo de acordo com o invento, trabalhar com matrizes que contenham um segundo anticorpo, por exemplo um chamado anticorpo específico de grupo como, por exemplo, anti-lgG. Neste caso dá-se uma reacção bifásica nos recipientes reaccionais. A primeira reacção dá-se na câmara reaccional quando, numa reacção positiva, a molécula do ligando sobre as partículas sintéticas, p.ex. um 85 926 ΕΡ Ο 849 595/ΡΤ 10

antigénio, reage com ο analito, p.ex. um anticorpo específico para o antigénio, na amostra. Já nesta ocasião podem ocorrer reticulações transversais entre diferentes partículas sintéticas (aglutinação), o que no caso das reacções do IgG, no entanto, resulta muitas vezes apenas em aglutinados muito fracos. Os anticorpos secundários existentes na matriz proporcionam, através de uma reticulação transversal adicional de complexos de aglutinação já formados, o efeito desejável de um reforço específico da reacção.

Numa duração total do teste de apenas 20 min., o sistema de teste descrito de acordo com o invento permite uma poupança de tempo significativa em comparação com os sistemas conhecidos. Em comparação com os sistemas de teste à base de eritrócitos fixados ou não fixados, como reagentes de aglutinação, uma vantagem adicional consiste na durabilidade consideravelmente maior das partículas sintéticas, assim como na melhor uniformidade do material de partida.

Com uma preparação adequada do sistema de teste, a sua realização é simples e os resultados podem ser lidos de forma inequívoca, podendo, desta maneira o teste ser realizado também por pessoal médico auxiliar. A sua aplicação é extremamente simples, dado que compreende apenas duas operações de transferência de material através de pipeta. Com uma centrífuga accionada por um acumulador e um aparelho de vórtex do mesmo género, as análises podem, além disso, ser facilmente realizadas fora das instalações de um laboratório fixo, sem ligação à rede de corrente eléctrica. Devido à quantidade reduzida de amostra, à ausência de operações de lavagem, assim como à possibilidade de fechar os recipientes reaccionais após a sua utilização, fica assegurada uma exposição tão curta quanto possível do pessoal a um material potencialmente infeccioso e um controlo tão amplo quanto possível dos resíduos potencialmente infecciosos.

Um outro objecto do presente invento são partículas sintéticas com um diâmetro médio <5 μηη, de preferência 1 - 5 μιτι, preferindo-se particularmente de 2 - 4 μηη, e com uma massa volúmica >1,1 g/cm3, de preferência 1,1 -1,8 g/cm3, preferindo-se particularmente 1,15 - 1,4 g/cm3, na superfície das quais estão imobilizadas moléculas de ligandos, por exemplo através de interacções covalentes, adsorptivas ou de elevada afinidade. Convém que as partículas sejam coloridas. Estas partículas podem ser utilizadas como reagentes 85 926 ΕΡ Ο 849 595/ΡΤ 11

de aglutinação num teste de aglutinação, de preferência num teste de aglutinação em gel.

Um outro objecto do presente invento consiste num estojo de reagentes para a detecção de um analito num liquido de amostra, compreendendo a) pelo menos, um recipiente reaccional contendo uma matriz inerte, de preferência uma matriz que consiste em partículas, e b) pelo menos, um género de partículas sintéticas em cuja superfície se encontram imobilizadas moléculas de ligandos.

Em determinadas concretizações do processo de detecção de acordo com o invento prefere-se adicionar um detergente à mistura reaccional. Exemplos de detergentes apropriados são detergentes iónicos como o SDS, ou detergentes não iónicos como Triton X-100 e Tween 20. Além disso pode preferir-se também a adição de mucinas. Através da adição de detergentes e/ou mucinas pode ser melhorada a uniformidade das partículas na suspensão ou durante a passagem pelo gel. Isto resulta numa sedimentação mais completa em caso de reacção negativa.

Pode revelar-se também conveniente, realizar a reacção sob adição de um agente redutor, p.ex. de um reagente de sulfidrilo como, por exemplo, 2-mercaptoetanol, ditiotreitol ou ditioneto de sódio, ou de um outro agente redutor como, p.ex., tributilfosfina. Através de agentes redutores podem ser reduzidas reacções não específicas indesejáveis como as que são provocadas, p.ex., pelos anticorpos IgM.

Além disso pode ser obtido, em determinados testes, um melhoramento dos resultados do teste através de uma modificação das condições de centrifugação. Isto é válido especialmente em testes em que se utiliza uma matriz revestida com um receptor, p.ex. com um segundo anticorpo. Uma modificação preferida das condições de centrifugação compreende uma centrifugação em intervalos, isto é, uma primeira fase de centrifugação, seguindo-se um intervalo, e depois mais uma segunda fase de centrifugação. Se for necessário, a centrifugação pode ser realizada em várias fases com intervalos. A primeira fase de centrifugação é, de preferência, apenas uma fase de centrifugação curta, com uma duração até 1 min, de preferência até 30 s.

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Segue-se um intervalo que pode ser de 1 - 10 min, ou cerca de 5 min. Em seguida é realizada uma segunda fase de centrifugação com uma duração maior e, eventualmente, também com um maior número de g.

Através dos exemplos e figuras seguintes pormenorizar-se-ão melhor determinados aspectos do invento. Apresentam-se:

Na figura 1: Os resultados do processo de acordo com o invento no caso de reacções positiva, fracamente positiva e negativa

Na figura 2: Uma representação esquemática da realização do teste

Na figura 3: As reacções que ocorrem num micro-recipiente reaccional em que a matriz contém anticorpos anti-lgG: a) na câmara reaccional e b) no sobrenadante do tampão da matriz ou na matriz

Na figura 4: 0 resultado esquemático de um diagnóstico diferencial de dois analitos diferentes (A1 e A2) num recipiente reaccional: a) amostra do paciente 1, anticorpos positivos para A1; b) amostra do paciente 2, anticorpos positivos para A2; c) amostra 3 (mistura dos soros dos pacientes 1 e 2), anticorpos positivos para A1 e A2; d) amostra do paciente 4, anticorpos negativos para A1 e A2, e

Na figura 5: A representação esquemática das zonas de reacção que são referidas na tabela 1. Zona 0 significa: as partículas formam, após a centrifugação, um sedimento como é desejável numa reacção negativa. Zona 5 significa: não há penetração na matriz de gel.

Exemplos: 1. Ensaios com partículas sintéticas do nível tecnológico actual que não funcionam no teste em gel (comparação)

Realização do Teste:

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As suspensões de partículas sintéticas coloridas de tipo comercial que se encontram usualmente em concentrações de 10% (p/v) de partículas sólidas, foram lavadas com uma solução de PBS 10 mM, pH 7,4 (Sigma P 4417), Tween-20 a 0,1% (Sigma P 7949) (v/v) e ajustadas, na mesma solução, a uma concentração de 0,15% de partículas sólidas.

Desta suspensão foram sempre transferidos 25 μΙ, com uma pipeta, para um microtubo reaccional que sedimentou sob as condições indicadas na tabela 1. (Segue tabela)

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Resultados

Lote Ν° Cor Diâmetro Comportamento de sedimentação no gel 10min, 85g 20min, 85g 40min, 85g 50min, 1 30g

Polymer Laboratories, Churchstretton, Reino Unido: Látex, não funcionalizado: SP-1130 Azul 0,10 um Zona 4-5 Zona 4-5 Zona 3-4 Zona 3-4 SP-1025 Encarnado 0,45 Lim Zona 4-5 Zona 4-5 Zona 3-4 Zona 3-4 SP-980 Encarnado 0,61 um Zona 4-5 Zona 4-5 Zona 3-4 Zona 3 SP-974 Encarnado 0,87 um Zona 4-5 Zona 4-5 Zona 3 Zona 2-3 Polymer Laboratories, Churchstretton, Reino Unido: Microspheres, não funcionalizadas: SP-1016 Azul 3,00 um Zona 3-4 Zona 2-3 Zona 0-1 Zona 0-1 SP-1 269 Azul 4,76 Lim Zona 3-4 Zona 1-2 Zona 0-1 Zona 1 SP-1024 Encarnado 11,9 um Zona 4-5 Zona 4 Zona 4 Zona 4 Molecular Probes: Carboxylate FluoSpheres: L-5191 Amarelo-verde 0,01 iim Zona 5 L-5201 Amarelo-verde 0,03 Lim Zona 5 L-5221 Amarelo-verde 0,10 Lim Zona 4-5 L-5261 Amarelo-verde 0,50 um Zona 4-5 L-5281 Amarelo-verde 1,00 iim Zona 4-5 L-5301 Amarelo-verde 2,00 iim Zona 3-4 Sulphate Fluospheres: L-5121 Amarelo-verde 4,00 um Zona 1-2 Rhone Poulenc, Lyon, França Estapor: K58 Verde 0,223 um Zona 4-5 K80 Encarnado 0,299 pm Zona 4-5 Estapor, Magnetic Particles: M180/12 1,00 um Zona 2-4

Tabela 1: Propriedades de diferentes partículas sintéticas de tipo comercial e comportamento de sedimentação no sistema ID da DiaMed; definição de zonas de acordo com a figura 5. 15 85 926 ΕΡ Ο 849 595/ΡΤ 2. Produção de partículas sintéticas apropriadas

As partículas sintéticas utilizadas nos exemplos seguintes foram produzidas através de polimerização em dispersão, dado que este método é geralmente o mais apropriado para a produção de partículas no domínio de 1 a 5 μητι. Numa primeira fase foram sintetizadas partículas de base em poliestireno (2a). Em seguida, as partículas de base foram intumescidas em partículas de alta densidade através de copolimerização com estireno/bromoestireno (2b). Na terceira fase seguinte realizou-se a coloração (2c). 2a. Polimerização das partículas de base Realização:

Pesaram-se 60 g de 1-hexadecanol (Aldrich 25, 874-1), 216 g de polivinilpirrolidona 40000 (PVP) (Aldrich 85, 656-8), 1744 g de estireno dest. (Aldrich S497-2) e 10261 g de álcool industrial (Banners IMS 99) e colocaram-se num balão reactor de fundo redondo de 20 I (equipado com agitador, condensador de água e alimentação com gás de azoto). A velocidade de agitação foi ajustada a 35 - 40 rpm. A mistura foi alimentada com gás azoto durante 16 horas à temperatura ambiente. Em seguida, a temperatura foi aumentada para 70°C. Foram depois adicionados à mistura reaccional 17,4 g de azo-bis-isobutironitrilo (Fisons A/9050/50), o que deu origem a uma emulsão branca. Depois de mais 24 horas, a mistura reaccional foi arrefecida à temperatura ambiente. As partículas resultantes foram lavadas através de centrifugação repetida em metanol (3000 rpm, 5 min) e, a seguir à última operação de lavagem, ressuspensas numa solução de SDS a 0,1% (p/v) (Fisons S/5200/53). Desta preparação foram obtidos 1573 g de partículas de poliestireno monodispersas com um diâmetro de 2,3 pm. 2b. Produção de partículas de "alta densidade"

Realização:

Pesaram-se 118,3 g de uma suspensão a 10% (p/v) de partículas de 2,3 pm (produzidas de acordo com o exemplo 2a) e 250 g de uma solução de poli(álcool vinílico) (Harco 26-88) (PVA) (5% p/v) e colocaram-se num balão reactor de fundo redondo de 1 I (equipado com agitador, condensador de água e alimentação com gás azoto), e a velocidade de agitação foi ajustada a 250 rpm. Dissolveram-se 1,5 g de peróxido de benzoílo (Aldrich 22, 887-7) em 21,6 g de 16 85 926 ΕΡ Ο 849 595/ΡΤ 4-bromoestireno (Avocado 17896). Esta solução foi emulsionada com 250 ml de uma solução de SDS a 0,5% (p/v). Em seguida adicionou-se a emulsão de bromoestireno ao balão reactor de fundo redondo. Ao fim de 3 horas adicionaram-se ao reactor 1 25 g de uma solução a 1 % (p/v) de dicromato de Na (Fisons S/3560/60) e a temperatura foi aumentada para 70°C. Após mais 16 horas, a temperatura foi aumentada para 80°C e a reacção continuou durante mais 3 horas. Em seguida, a mistura reaccional foi arrefecida para a temperatura ambiente. As partículas resultantes foram lavadas através de centrifugação repetida em água e obteve-se um rendimento de 26,98 g de partículas, agora com um diâmetro de 3,1 μιτι. O teor nominal de bromoestireno polimérico destas partículas era de 65% (p/v). A taxa de sedimentação de uma suspensão a 1% (p/v) destas partículas em água era de 5,7 mm/h, a massa volúmica teórica é de 1,28 g/cm3 (veja-se a tabela 2).

De acordo com este processo foram polimerizadas partículas diferentes, de diâmetro igual mas com proporções diferentes de bromoestireno/estireno e, em consequência, com massa volúmica diferente (tabela 2).

Diâmetro Massa Estireno Bromoestireno das Volúmica Comportamento de sedimentação no partículas [g/cm3] gel 5min, 85g 10min, 85g 20min, 85g 100% 0% 3,1 Lim 1,05 Zona 4 Zona 3-4 Zona 2-3 64% 36% 3,1 Lim 1,18 Zona 0-1 Zona 0 Zona 0 35% 65% 3,1 um 1,28 Zona 0 Zona 0 Zona 0 23% 77% 3,1 Lim 1,32 Zona 0 Zona 0 Zona 0

Tabela 2: Comportamento de sedimentação de partículas sintéticas com massa volúmica alterada, sob as condições de centrifugação padrão no sistema ID da DiaMed; definição de zonas de acordo com a figura 5. 2c. Coloração das partículas de alta densidade Realização:

Sudan IV (encarnado):

Pesaram-se 200 g de uma suspensão a 10% (p/v) de partículas sintéticas de alta densidade (produzidas como descrito em 2a, 2b) com um diâmetro de 3,1 μητι, 11,6 g de uma solução de poli(álcool vinílico) (Harco 26-88) a 5%

85 926 ΕΡ Ο 849 595/ΡΤ 17 (ρ/ν), 40 g de metanol (Hammond) e 240 g de água e colocaram-se num balão reactor de fundo redondo de 1 I (equipado com agitador PTFE e condensador de água). Dissolveram-se 0,4 g de corante Sudan IV (Kodak 112 6150) em 30 g de diclorometano (Fisons D/1852/25) e a solução foi emulsionada em 250 ml com uma solução de SDS a 0,5% (p/v). A emulsão de diclorometano foi adicionada em seguida, à temperatura ambiente, ao reactor. Ao fim de 4 horas, a emulsão resultante de partículas encarnadas foi vertida num copo de 2 I. Para evaporar o diclorometano tão depressa quanto possível, a superfície da suspensão foi alimentada, sob agitação, com gás azoto. Para maximizar a evaporação, a suspensão foi, adicionalmente, ligeiramente aquecida. As partículas encarnadas resultantes foram lavadas através de centrifugação repetida em água (1000 rpm, 5 min). Obteve-se um rendimento de 19,8 g.

Ferro FW 1263 (azul):

Pesaram-se 50 g de uma suspensão a 10% (p/v) de partículas sintéticas de alta densidade (produzidas como descrito em 2a, 2b) com um diâmetro de 3.1 μηη, 2,9 g de uma solução de poli(álcool vinílico) (Harco 26-88) a 5% (p/v) e 60 g de água e colocaram-se num balão reactor de fundo redondo de 1 I (equipado com agitador PTFE e condensador de água). Dissolveram-se 0,184 g de corante Ferro FW1263 (Ferro Normandy Plastics Ltd, Westgate, Aldridge, Grã-Bretanha) em 7,5 g de diclorometano (Fisons D/1852/25) e esta solução foi emulsionada com 62,5 ml de uma solução de SDS a 0,5% (p/v). A emulsão de diclorometano foi adicionada em seguida, à temperatura ambiente, ao reactor. Ao fim de 2 horas, a emulsão resultante de partículas azuis foi vertida num copo de 500 ml. Para evaporar o diclorometano tão depressa quanto possível, a superfície da suspensão foi alimentada, sob agitação, com gás azoto. Para maximizar a evaporação, a suspensão foi, adicionalmente, ligeiramente aquecida. As partículas azuis resultantes foram lavadas através de centrifugação repetida em água (1000 rpm, 5 min). Obteve-se um rendimento de 4,8 g. 3. Funcionalização e adição de estreptavidina na superfície das partículas a) Produção de partículas com aldeído

Uma parte alíquota de 1 ml de partículas encarnadas de alta densidade de 3.1 um (17,1%) (p/v) (produzidas como descrito no exemplo 2a a c) foi vertida num tubo de centrifugação de 15 ml e lavada três vezes através de centrifugação com água ultra-pura (18 MegOhm) (1000 rpm, 5 min). Às partículas lavadas desta maneira foram adicionados 1 5 ml de uma solução de

85 926 ΕΡ Ο 849 595/ΡΤ albumina de soro bovino (2,67 mg/ml) (Sigma A9647) em PBS 10 mM, pH 7,4, NaN3 a 0,05% e agitou-se durante 4 horas à temperatura ambiente. As partículas foram lavadas 4 vezes através de centrifugação com 15 ml de água (1000 rpm, 5 min). Em seguida, as partículas foram ressuspensas em 10 ml de água para se obter uma concentração de 1,7% (p/v). A um alíquota de 0,5 ml desta suspensão foram adicionados 3,75 ml de água, para obter uma suspensão a 0,2% (p/v). A esta foram adicionados 4,25 ml de uma solução de gluteraldeído a 2% em água, e a mistura reaccional foi agitada durante uma hora à temperatura ambiente. As partículas foram lavadas 4 vezes através de centrifugação com 1 5 ml de água (1000 rpm, 5 min). b) Produção de partículas com estreptavidina

Uma suspensão de 8 mg de partículas encarnadas de alta densidade de 3,1 Lim (produzidas como descrito em 2a - c e funcionalizadas como descrito em 3a) foi ressuspensa em 4 ml de água e incubada durante 1 min em banho-maria com ultra-sons (Sonomatic de Langford Ultra-sonics, Birmingham, Grã-Bretanha), Em seguida foram adicionados 4 ml de um tampão de acetato de sódio 50 mM, pH 3,25, seguidos por 1 ml de uma solução aquosa de estreptavidina (4 mg/ml). Após mais 2 min em banho-maria com ultra-sons foi adicionado logo de seguida 1 ml de uma solução 50 mM de cianoboro-hidreto de sódio (Aldrich 15, 615-9) em tampão de acetato. Esta mistura foi incubada durante a noite, sob ligeira agitação, à temperatura ambiente. As partículas foram lavadas 3 vezes através de centrifugação com 1 5 ml de água (1000 rpm, 5 min) e ressuspensas em 5,33 ml de PBS 10 mM, pH 7,4, de modo a ajustar a concentração de partículas para 0,15% (p/v). c) Produção de partículas de polilisina A uma suspensão de 500 mg de partículas encarnadas de alta densidade de 3,1 pm em 1 ml de água (produzidas como descrito em 2a - c e funcionalizadas como descrito em 3a) foram adicionados 4 ml de acetato de Na 50 mM, pH 3,25. Em seguida foram adicionados 4 ml de uma solução 1 mg/ml de poli-L-lisina (Sigma P 2636) em água. A mistura reaccional foi incubada durante 4 min em banho-maria com ultra-sons, antes de se adicionar 1 ml de cianoboro-hidreto de sódio 50 mM em tampão de acetato. A mistura reaccional foi incubada durante a noite, sob ligeira agitação, à temperatura ambiente. As partículas foram lavadas 3 vezes através de centrifugação com água (1000 rpm,

85 926 ΕΡ Ο 849 595/ΡΤ 19 5 min) a e ressuspensas em 333 ml de PBS 10 mM, pH 7,4, de modo a ajustar a concentração de partículas na suspensão para 0,15% (p/v). 4. Acoplamento de ligandos às partículas funcionalizadas a) Acoplamento covalente

Soluções de 0,1 ml de antigénios biotinilados foram adicionadas a 1 ml de uma suspensão a 0,15% (p/v) de partículas encarnadas de alta densidade de 3,1 μηη (produzidas como descrito em 2a - c e funcionalizadas e com estreptavidina como descrito no exemplo 3a e 3b) num microtubo Eppendorf e incubadas durante 30 min sob agitação. Os antigénios não ligados foram removidos realizando duas lavagens por centrifugação (1000 rpm, 5 min) e ressuspensão em 1 ml do tampão supracitado, de modo a que a concentração final da suspensão de partículas voltasse a ser de 0,15% (p/v). b) Acoplamento não covalente A 500 μΙ de uma suspensão a 0,15% (p/v) de partículas de polilisina encarnadas de alta densidade de 3,1 μιτι (produzidas como descrito em 2a - c e 3a, 3c) foram adicionados 10 μΙ de uma solução a 20 μς/ηηΐ de ADN ds (Sigma D 1501) em PBS 10 mM, pH 7,4. Após uma operação no vórtex (Bender & Hobein, Vortex Genie 2) de 5 s no nível 8, fez-se uma incubação de 12 horas sob ligeira agitação à temperatura ambiente. A suspensão foi lavada 2 vezes através de centrifugação com 1 ml de PBS 10 mM, pH 7,4 (1000 rpm, 5 min) e ressuspensa novamente em 500 μΙ de PBS 10 mM, pH 7,4. 5. Composição do tampão da matriz de gel A matriz de gel nos micro-recipientes reaccionais encontrava-se no seguinte meio de tampão aquoso: KH2P04 (Merck 4873)/Na2HP04 (Merck 6580) 5 mM, NaCI (Fluka 71381) 150 mM, NaN3 (Fluka 71290) a 0,024% (p/v), albumina (Miles 81-177) a 1,875% (v/v), EDTA (Fluka 03685) a 0,05% (p/v), Tris (Merck 8382) 1,3 mM, N-acetil-L-cisteína (Merck 12422) 1,25 mM, Mucina (Sigma M 1778) a 0,025% (p/v). Além disso, a matriz de gel continha, eventualmente, em função do teste, quantidades diferentes de anti-globulina humana.

85 926 ΕΡ Ο 849 595/ΡΤ 6. Teste a anticorpos contra Chagas (Ligação covalente de péptidos sintéticos) a) Antigénios

Os péptidos sintéticos Ag-2, TcD e TcE são provenientes de Alta Bioscience (Birmingham, Reino Unido) b) Acoplamento

Foi sempre acoplado 1 ml de uma suspensão a 0,15% (p/v) de partículas encarnadas de alta densidade de 3,1 ul (produzidas como em 2 a-c, funcionalizadas e com estreptavidina como descrito no exemplo 3a e 3b), a 2 ng de TcD, 35 ng de Ag-2 e 282 ng de TcE, os quais tinham sido sintetizados de acordo com técnicas Standard com uma lisina biotinilada, adicionalmente à sequência de antigénio, e purificados através de RP-HPLC, igualmente de acordo com técnicas Standard, até terem atingido uma pureza >90%. Para este efeito foi preparada uma solução-mãe 10x dos péptidos em H20 (20 ng de TcD, 350 ng de Ag-2, 2820 ng de TcE por ml). Para o acoplamento foi adicionado, em cada caso, 1 volume de solução peptídica a 1 0 volumes de uma suspensão a 0,15% (p/v) de partículas sintéticas e misturado rapidamente. Em seguida, a mistura reaccional foi incubada, sob ligeira agitação, durante 30 min à temperatura ambiente. Depois disso, a suspensão de partículas foi centrifugada durante 5 min a 1000 rpm, o sobrenadante foi decantado e lavado duas vezes com PBS 10 mM, pH 7,4. A concentração final das partículas na suspensão voltou a ser de 0,15% (p/v). As partículas assim sensibilizadas foram armazenadas a 4 °C. c) Realização do teste

Uma suspensão a 0,15% (p/v) das partículas sintéticas sensibilizadas como descrito em 4a, foi tratada durante 5 min em banho-maria com ultra-sons. Colocaram-se em seguida 25 μΙ da mesma, respectivamente, num cartão com 6 microtubos (veja-se o exemplo 5: cartão ID da DiaMed, Cressier sur Morat) previamente cheios com uma suspensão de gel contendo anti-globuiina humana (0,5%, v/v). Em seguida foram adicionados 1,5 μΙ de soro ou plasma do paciente. Após uma incubação de 10 min à temperatura ambiente, realizou-se uma centrifugação de 10 min a 85g numa centrífuga concebida especialmente para os microtubos (centrífuga ID 12 S II da DiaMed, Cressier sur Morat). Os resultados podem ser avaliados logo a seguir à centrifugação.

85 926 ΕΡ Ο 849 595/ΡΤ 21 d) Avaliação:

Os resultados positivos podem ser detectados sob a forma de bandas bem visíveis sobre o gel ou tendo penetrado 1 a dois mm no gel. Também, aglutinados distribuídos por todo o gel indicam reacções positivas. Os resultados negativos vêem-se através de um sedimento bem visível das partículas sintéticas sedimentadas no fundo do recipiente, neste caso não existe uma banda no interior ou sobre o gel. 7. Teste a anticorpos contra a leishmaniose visceral (Ligação covalente de antigénio recombinante) a) Antigénios:

Antigénio recombinante rK39 de Corixa Inc., Seattle, Estados Unidos b) Biotinilação e acoplamento

Dializou-se 1 ml de antigénio recombinante rK39 (0,6 mg/ml) em Tris 10 mM, pH 8,0 contra PBS 10 mM, pH 7,4 (Sigma P 4417) a 4°C e, em seguida, filtrou-se através de um filtro de membrana Puradisc 25 AS (Whatman). A biotinilação foi realizada com Su/fo-NHS-Biotina (Pierce 21217). A uma alíquota de 500 μΙ do rK39 em PBS 10 mM, pH 7,4 (300 μg) foram adicionados 17,5 μΙ de uma solução aquosa de 1 mg/ml de Sulfo-NHS-Biotina. A mistura reaccional foi incubada durante 1 50 min à temperatura ambiente. O rK39 biotinilado foi separado, em seguida, através de uma coluna de dessalinização KwikSep (Pierce) da biotina livre. A eluição foi realizada com PBS 10 mM, pH 7,4 e NaN3 a 0,05%.

Em seguida, foi sempre acoplado 1 ml de uma suspensão a 0,15% (p/v) de partículas encarnadas de alta densidade de 3,1 um (produzidas como em 2 a-c, funcionalizadas e com estreptavidina como descrito no exemplo 3a e 3b), a 160 ng de rK39 biotinilado. Para este efeito foi preparada uma solução-mãe 10x em H20 (1600 ng de rK39 por ml). O acoplamento propriamente dito foi realizado, em seguida, como descrito no exemplo 6b. c) Realização do teste A realização do teste é idêntica à do exemplo 6, só que se trabalha no presente caso com uma suspensão de partículas sintéticas sensibilizada com rK39.

85 926 ΕΡ Ο 849 595/ΡΤ 22 d) Avaliação: como no exemplo 6. 8. Teste ao antigénio de superfície da hepatite B (Ligação covalente de anticorpos monoclonais) a) Anticorpo: O anticorpo monoclonal (MAb) MIH9701 dirigido contra o antigénio de superfície da hepatite B detecta ambos os subtipos ad e ay, e era proveniente de Medix Biotech, Walchwil, Suiça. b) Biotinilação e acoplamento:

Diluíram-se 200 μΙ de uma solução de 3 mg/ml de MIH9701 com tampão de acetato de sódio 0,1 M, pH 5,5, para 1 ml, e dializaram-se durante a noite, a 4°C, contra o mesmo tampão. A uma alíquota de 900 μΙ da solução de MAb resultante foram adicionados 900 μΙ de uma solução gelada de metaperiodato de sódio 20 mM em água, e a mistura reaccional foi incubada durante 20 min a 0°C no escuro. A reacção foi interrompida através da adição de 11 μΙ de uma solução de glicerol a 10% (p/v). Os MAb foram separados dos restantes componentes da mistura reaccional através de uma operação de cromatografia numa coluna de dessalinização Kwiksep. A eluição foi realizada, neste caso, com tampão de acetato 0,1 M, pH 5,5. 0 volume dos MAb a seguir à eluição era de 2,7 ml. Foram adicionados, ao mesmo, 270 μΙ de uma solução 50 mM de EZ-Link-Biotina-LC-Hidrazida (Pierce 21340) em sulfóxido de dimetilo (Sigma D 8418) e incubou-se, sob ligeira agitação, durante 2 horas à temperatura ambiente. A mistura reaccional foi então dializada, a 4°C, contra PBS· 10 mM, pH 7,4 e NaN3 a 0,05% e, em seguida foi filtrada através de um filtro Puradisc AS 0,2 μιτι (Whatman). Com uma coluna de dessalinização KwikSep foi realizada uma operação final de dessalinização, mais uma vez contra PBS 10 mM, pH 7,4 e NaN3 a 0,05%.

Os MAb biotinilados desta maneira foram ajustados para 35 pg/ml no mesmo tampão de PBS. A 1 ml de uma suspensão a 0,15% (p/v) de partículas encarnadas de alta densidade de 3,1 μιτι (produzidas como em 2a - c, funcionalizadas e com estreptavidina como descrito em 3a e 3b) foram então adicionados 100 μΙ da solução diluída de MAb. Esta mistura reaccional foi incubada, sob ligeira agitação, durante 30 min à temperatura ambiente. Em 85 926 ΕΡ Ο 849 595/ΡΤ 23

seguida, as partículas foram lavadas 3 vezes através de centrifugação com o mesmo tampão (1000 rpm, 5 min). c) Realização do teste A realização do teste foi igual à do exemplo 6, com as diferenças seguintes: i) Trabalhou-se com uma suspensão de partículas sintéticas sensibilizadas com MAb MIH9701. ii) A matriz de gel não continha anti-globulinas humanas. d) Avaliação: como no exemplo 6. 9. Teste a anticorpos anti-dsADN (Ligação não covalente de ds-ADN) a) Antigénio: O (ds)-ADN de cadeia dupla, tipo I era proveniente da Sigma (D-1 501). b) Acoplamento: A 500 μΙ de uma suspensão a 0,15% (p/v) de partículas encarnadas de alta densidade de 3,1 μιτι (produzidas como em 2a - c e 3a, 3c) foram adicionados 10 μΙ de 20 μg/ ml de dsADN (Sigma D 1501) em PBS 10 mM, pH 7,4. Após uma operação no vórtex (Bender & Hobein, Vortex Genie 2) de 5 s no nível 8, fez-se uma incubação de 12 horas, sob ligeira agitação, à temperatura ambiente. A suspensão foi lavada 2 vezes através de centrifugação com 1 ml de PBS 10 mM, pH 7,4 e ressuspensa em 500 ul de PBS 10 mM, pH 7,4. A concentração final das partículas voltou a ser de 0,15% (p/v), e as partículas sensibilizadas foram guardadas a 4°C. c) Realização do teste: como no exemplo 6. d) Avaliação: como no exemplo 6. 10. Teste de diferenciação de anticorpos de HIV1/HIV2 (Utilização de duas espécies de partículas sintéticas sensibilizadas de modo diferente, com cores diferentes mas, de resto, com propriedades físicas iguais) a) Antigénios:

85 926 ΕΡ Ο 849 595/ΡΤ Péptidos sintéticos - sequências de HlV-1 gp41 e HIV-2 gp36 - de Alta Bioscience (Birmingham, Reino Unido). b) Acoplamento como no exemplo 6, com 72 ng de péptido gp41 e 40 ng de péptido gp36 de 1 ml de uma suspensão a 0,15% (p/v) de partículas. Foram sensibilizadas partículas encarnadas (produzidas como em 2a-c, funcionalizadas e com estreptavidina como descrito no exemplo 3a e 3b) com o péptido específico de HIV-2 (sequência de antigénio proveniente de gp36) e partículas azuis (produzidas como em 2 a-c, funcionalizadas e com estreptavidina como descrito no exemplo 3a e 3b) com o péptido específico de HIV-1 (sequência de antigénio proveniente de gp41). c) Realização do teste:

Como no exemplo 6, com as diferenças seguintes: Foram transferidos com uma pipeta, 10 μΙ da suspensão de partículas encarnadas e da suspensão de partículas azuis, respectivamente, para a câmara reaccional de um microtubo. Em seguida adicionaram-se 2,5 μΙ de soro do paciente. d) Avaliação:

Os resultados positivos de HIV-1/HIV-2 tornaram-se detectáveis sob a forma de nítidas bandas encarnadas/azuis sobre o gel ou tendo penetrado 1 a dois mm no gel. Neste caso não houve nenhum sedimento de partículas. Os resultados positivos indicando anticorpos de HIV-1 apresentaram uma banda azul sobre o gel ou tendo penetrado no gel, enquanto que as partículas encarnadas formaram um sedimento no fundo do recipiente reaccional. Os resultados positivos indicando anticorpos de HIV-2 apresentaram uma imagem inversa. Os resultados negativos de HIV-1/HIV-2 foram detectáveis através do sedimento encarnado-azul bem visível no fundo do micro-recipiente reaccional. 1 1. Detecção específica de anticorpos que não IgM a) Antigénios: A proteína A de S. aureus era proveniente da Sigma (P 6650); o conjugado fragmento F(ab)2 de anticorpo anti-lgM humano (específico de cadeias μ) de cabra - biotina era proveniente da Sigma (B 2641). 25 85 926 ΕΡ Ο 849 595/ΡΤ b) Biotinilação e acoplamento: A biotinilação da proteína A foi realizada como descrito no exemplo 8. Os anticorpos anti-lgM biotinilados foram ajustados em PBS 10 mM, pH 7,4, numa preparação a 40 pg/ml de partículas de alta densidade de 3,1 ,um (1,5%, p/v), numa outra preparação a 1 ,ug/ml de partículas (0,15%, p/v), e a proteína A biotinilada a uma concentração de 1 Ltg/ml de partículas (0,15%, p/v). A 1 ml de uma suspensão de partículas encarnadas de alta densidade de 3,1 μηη (produzidas como em 2a - c, funcionalizadas e com estreptavidina como descrito em 3a e 3b), foram sempre adicionados 100 μΙ de soluções, sempre concentradas 10 vezes, com anticorpo anti-lgM biotiniiado (400 μg/ml ou 10 pg/ml) ou proteína A (10 pg/ml), respectivamente.

Esta mistura reaccional foi incubada, sob ligeira agitação, durante 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, as partículas foram lavadas 3 vezes através de centrifugação com o mesmo tampão (1000 rpm, 5 min). c) Realização do teste

Centrifugou-se 1 ml das partículas sensibilizadas com anti-lgM durante 5 min a 1000 rpm e rejeitou-se o sobrenadante. Foram adicionados 20 μ! de uma diluição de 1 para 10 do soro de uma pessoa saudável. Após um vórtex de 5 s no nível 8, a mistura reaccional foi incubada, sob ligeira agitação, durante 30 min à temperatura ambiente para adsorver os anticorpos IgM do soro. Após uma outra centrifugação durante 5 min a 1000 rpm, removeu-se o sobrenadante. Agora foram transferidas por meio de uma pipeta, para um cartão (como o que foi descrito no exemplo 6) contendo anti-lgG, as seguintes substâncias:

Posição 1: 25 μΙ de partículas com proteína A (1 pg/ml)

Posição 2: 25 μΙ de partículas com proteína A (1 pg/ml)

Posição 3: 25 μΙ de partículas com anti-lgM (1 pg/ml)

Posição 4: 25 μΙ de partículas com anti-lgM (1 μg/ml)

85 926 ΕΡ Ο 849 595/ΡΤ 26

Nas posições 1 e 3 foram adicionados, em ambos os casos, 5 μΙ do soro diluído de 1 para 10 antes da adsorção e, nas posições 2 e 4, em ambos os casos, 5 μΙ do soro diluído de 1 para 10 depois da adsorção. Após uma incubação de 10 min à temperatura ambiente foi realizada uma centrifugação de 10 min a 85g, numa centrífuga concebida especialmente para os microtubos (Centrífuga ID 12 S II, DiaMed, Cressier sur Morat). d) Avaliação:

Ambos os tubos de controlo, 1 e 3, mostraram reacções nitidamente positivas, como descrito no exemplo 6. Das preparações de teste 2 e 4, 2 apresentou uma reacção positiva que não diferiu da do tubo 1, enquanto que na posição 4 as partículas formaram um sedimento no fundo do recipiente reaccional indicando, desta maneira, uma reacção negativa. Isto significa que foi possível detectar neste teste, especificamente, uma reacção de anticorpos que não IgM. 12. Centrifugação modificada para partículas sintéticas a) Antigénios e acoplamento: A origem e o acoplamento dos péptidos sintéticos como no exemplo 6. b) Realização do teste:

Convencional:

Como descrito no exemplo 6 foram transferidos, por meio de uma pipeta, 25 μΙ das partículas sintéticas sensibilizadas e, em seguida, 5 μΙ de soro/plasma, para a câmara de incubação de microtubos pré-fabricados. Após uma incubação de 10 min à temperatura ambiente foi realizada uma centrifugação de 10 min a 85 g, numa centrífuga apropriada para os microtubos (Centrífuga ID 12 S II, DiaMed, Cressier sur Morat).

Modificada:

Como descrito no exemplo 6, foram transferidos, por meio de uma pipeta, 25 μΙ das partículas sintéticas e, em seguida, 5 μΙ de soro/plasma, para a câmara de incubação de microtubos pré-fabricados. Após uma incubação de 5 min à temperatura ambiente, os cartões foram colocados numa centrífuga ID 27 85 926 ΕΡ Ο 849 595/ΡΤ modificada (DiaMed, Cressier sur Morat), com a qual foi realizado o programa especial seguinte: 1) centrifugação de 5 s, a 30g 2) intervalo de 5 min, a Og 3) centrifugação de 10 min, a 85g c) Avaliação: A avaliação foi realizada como no exemplo 6. Nos testes que operam com matrizes de gel contendo anti-lgG, é de observar um reforço geral, sobretudo, de resultados fracamente positivos.

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Claims (27)

1. 85 926 ΕΡ Ο 849 595/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a detecção de um analito num líquido de amostra através de aglutinação em que se coloca em contacto o líquido de amostra com um reagente de aglutinação e uma matriz inerte, submetendo em seguida a mistura reaccional à acção da gravidade e determinando a reacção entre o analito e o reagente de aglutinação, caracterizado por se utilizarem, como reagente de aglutinação, partículas sintéticas que se comportam, em relação à matriz, essencíalmente como eritrócitos, e que apresentam um diâmetro médio <5 pm e uma massa volúmica >1,1 g/cm3.
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as partículas sintéticas apresentarem um diâmetro médio no intervalo de 1 - 5 pm.
3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por as partículas sintéticas apresentarem um diâmetro médio no intervalo de 2 - 4 pm.
4. 4. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as partículas sintéticas apresentarem uma massa volúmica no intervalo de 1,1 -1,8 g/cm3.
5. 5. Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por as partículas sintéticas apresentarem uma massa volúmica no intervalo de 1,15 -1,4 g/cm3.
6. 6. Processo de acordo com uma das reivindicações 1-5, caracterizado por se utilizarem partículas sintéticas preparadas a partir de polímeros ou copolímeros orgânicos.
7. 7. Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por se utilizarem partículas sintéticas de estireno ou derivados de estireno.
8. 8. Processo de acordo com uma das reivindicações 1-7, caracterizado por se utilizarem partículas coloridas.
9. 9. Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por se utilizarem partículas coloridas de encarnado.

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10. 10. Processo de acordo com uma das reivindicações 1-9, caracterizado por na superfície das partículas estarem imobilizadas moléculas de ligandos capazes de se ligar ao analito a determinar.
11. 11. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por as moléculas de ligandos estarem imobilizadas através de interacções adsorptivas, covalentes ou de elevada afinidade.
12. 12. Processo de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado por na superfície das partículas estarem imobilizados péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, compostos análogos aos ácidos nucleicos, sacáridos, lípidos, hormonas ou metabolitos, através de interacções covalentes ou de elevada afinidade.
13. 13. Processo de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado por na superfície das partículas se encontrarem ligadas membranas celulares, fragmentos de membranas celulares, ou lisados de células ou agentes patogénicos, através de interacções adsorptivas.
14. 14. Processo de acordo com uma das reivindicações 1-13, caracterizado por a determinação do analito ser realizada através de uma reacção imunitária.
15. 15. Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o analito ser um anticorpo.
16. 16. Processo de acordo com a reivindicação 15, caracterizado por se realizar uma detecção de anticorpos específica da sua classe.
17. 17. Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o analito ser um antigénio.
18. 18. Processo de acordo com uma das reivindicações 1-13, caracterizado por a determinação do analito ser realizada através de uma reacção de hibridação de ácido nucleico.
19. 19. Processo de acordo com uma das reivindicações 1-18, caracterizado por se utilizar uma matriz que consiste em partículas. 85 926 ΕΡ Ο 849 595/ΡΤ 3/3
20. 20. Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por o diâmetro médio das partículas da matriz se encontrar no intervalo de 10 -200 μηη.
21. 21. Processo de acordo com uma das reivindicações 1-20, caracterizado por se determinarem simultaneamente vários analitos, utilizando para cada analito um reagente de aglutinação com coloração diferente.
22. 22. Processo de acordo com uma das reivindicações 1-21, caracterizado por a mistura reaccional conter detergentes e/ou mucinas.
23. 23. Processo de acordo com uma das reivindicações 1-22, caracterizado por a mistura reaccional conter um agente redutor.
24. 24. Processo de acordo com uma das reivindicações 1-23, caracterizado por a acção da gravidade que actua sobre a mistura reaccional compreender uma centrifugação.
25. 25. Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por a centrifugação ser realizada em vários intervalos.
26. 26. Estojo de reagentes para detecção de um analito num líquido de amostra, compreendendo (a) pelo menos, um recipiente reaccional contendo uma matriz inerte e, (b) pelo menos, uma espécie de partículas sintéticas com um diâmetro médio <5 μηη e uma massa volúmica >1,1 g/cm3, em cuja superfície se encontram imobilizadas moléculas de ligandos.
27. 27. Estojo de reagentes de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por vários recipientes reaccionais estarem dispostos num cartão ou disco. Lisboa, ^ 2Ô01 Por STIFTUNG FIJR DIAGNOSTISCHE FORSCHUNG - O AGENTE OFICIAL -