PT84913B

PT84913B - Processo para o isolamento e a purificacao de uma nova linfocina supressora da activacao plaquetaria

Info

Publication number: PT84913B
Application number: PT84913A
Authority: PT
Inventors: Andre Capron; Michel Joseph; Claude Auriault; Veronique Pancre
Original assignee: Pasteur Institut; Inst Nat Sante Rech Med
Priority date: 1986-05-21
Filing date: 1987-05-20
Publication date: 1990-02-08
Also published as: EP0246967B1; ATE71663T1; GR3004289T3; DK25488D0; AU7432187A; JPH01501597A; DK25488A; US5071959A; DE3775982D1; FR2598917A1; FR2598917B1; AU608758B2; PT84913A; EP0246967A1; WO1987007303A1

Description

PROCESSO PjíRI O ISOLAMENTO E A PURIFICA Ç?O DE UK l NOVA LIxVFOCINA SUPRESSORA DA ACTIVAÇÃO PLAQUETÁRIA

A presente invenção diz respeito a um processo para o isolamento e a purificação de uma nova linfocina su pressora da activação plaquetária e aos medicamentos que a contêm.

Sabe-se que as células T estimuladas excretam um certo número de factores solúveis entre os quais alguns são capazes de regular as funções das células efectoras.

Foi recentemente demonstrado /~cf. M. JOSEPH,

C. AURIAULT, A. CAPRON, M. VORNG e P. VIENS, NATURE 303 : 810 J que as plaquetas sanguíneas colhidas em ratos infecta dos por Schistosoma mansoni, exprimem propriedades antiparasitas destrutivas in vitro, que aumentam durante a in fecção. 0 máximo de citotoxicidade foi observado quando os ratos exprimiram uma elevada taxa de imunidade relativamente à reinfecção» Esta citotoxicidade plaquetária declina ra pidamente após 8 semanas de infecção, apesar da presença de anticorpos IgE no soro destes ratos infectados. Esta é a r a zão pela qual os inventores foram levados a considerar que os factores das células T, produzidos após estimulação de células T supressoras pelos antigénios circulantes de S. mansoni, desempenham um papel importante nesta diminuição, podendo este mecanismo aparecer como uma regulaçao em torno das funções imunes das plaquetas em infecçoes do rato. Foi igualmente demonstrado que as plaquetas humanas podem ser induzidas em efectores citótoxicos contra os schistosomulos, mediante incubação com soro rico em IgE de pacientes com schistosomíase ou de pacientes alérgicos asmáticos, sendo o processo citotóxico retardado neste último caso mediante adição de anti-IgE ou de um alergeno específico /“c.f. M. JOSEPH, J.C. AMEISEN, J.P. KUSNIERZ, V. PANCRÈ, LI. CAPRON e

A. C/iPRON, 1984, C.R. ACAD. SC. PARIS 298 : 55J.

A presente invenção tem por objectivo isolar um factor supressor da. actividade das plaquetas sanguíneas, capaz de desempenhar, entre outros, um papel de imunomodula dor em infecçoes alérgicas.

A presente invenção tem por objectivo um factor obtido a partir de células T estimuladas pela Concanavalina A ou por um antigénio, capaz de inibir a citotoxicidade pia. quetária IgE-dependente em relação às larvas jovens de S. mansoni, de diminuir fortemente a quimioluminescência de plaquetas em uma reacção IgE/anti-IgE, que é um correlato da citotoxicidade antiparasitária, e de inibir a activação plaquetária em intolerâncias não-IgE dependentes, sendo o factor designado pelo nome de linfocina supressora da actividade plaquetária (PASL) e produzido por linfócitos T OKT8*.

De acordo com um modo de realização da PASL, esta isola-se do sobrenadante de culturas de linfócitos T OKT8⁺ estimulados pela Concanavalina A ou um antigénio.

De acordo com um outro modo de realização da PASL, no caso em que esta se isola de sobrenadantes de cul- 3 turas de linfócitos T 0KT8⁺ estimulados por um antigénio, os linfócitos T foram estimulados por antigénios de

Echinococcus granulosus ou de Schistcsoma mansoni”.

A presente invenção tem igualmente por objectivo um processo para a preparação da PAS1 que consiste em estimular células T de origem humana ou murina pela Concanavalina A ou um estimulante mitogénico análogo ou por um antigénio pertencente ao grupo que compreende os antigénios de S, mansoni e os antigénios de Echinococcus granulosus'’, em cultivar as células T estimuladas, durante um período apropriado, em recuperar os sobrenadantes de cultura e em filtrá-los, eventualmente após centrifugação, através de membranas de dimensão de poros da ordem de 0,22 jim, em purificá-los depois mediante filtração sobre gel e em submeter a fracção proteica activa recolhida, previamente iden tificada mediante pesquisa da actividade biológica ou imunológica e eventualmente liofilizada, a uma cromatografia em fase inversa sobre um gel de sílica enxertada, de granulometria e de porosidade calibradas, seguida de uma eluição com um gradiente de CH^-GN-HgO contendo 1%« de ácido trifluoroacético, compreendido entre 1 : 99 e 60 : 40, sendo a fracção proteica purificada que contém a PASL, em seguida, com vantagem, liofilizada após detecção mediante registo de densidade óptica a 215 nm e determinação da actividade biológica.

De acordo com um modo de realização vantajoso do processo para a obtenção da PASD de acordo com a presen te invenção, determina-se a actividade biológica da fracção proteica activa e da fracção proteica activa purificada con

tendo a PASL mediante obtenção de 60% de inibição da citotoxicidade para o sobrenadante de cultura de linfócitos T estimulados pela Concanavalina A ou pelos antigénios de E. granulosus, relativamente a plaquetas sanguíneas normais utilizadas como células efectoras, incubadas com soro de pacientes com schistosomíase ou com soro de pacientes alér gicos apresentando uma elevada taxa de IgE circulantes e estimulados por anti-IgE ou pelo alergeno específico.

presente invenção diz por outro lado respeito a um novo medicamento imunomodulador de manifestações alérgicas, caracterizado pelo facto do seu ingrediente actico ser a PASL isolada de sobrenadantes de culturas de lin fócitos T estimulados por um agente mitogénico tal como a Concanavalina A ou similar ou por um antigénio apropriado tal como particularmente um antigénio de E. granulosus ou de S. mansoni, que apresente as propriedades enunciadas antes e cujo peso molecular é da ordem de 15 a 20 KDa e o Pi é da ordem de 4,4 a 5,0 possuindo a dita linfocina uma estrutura de ligação específica do tipo de um receptor, à superfície das plaquetas sanguíneas, ou seja uma especificidade de adsorção sobre a.s plaquetas.

Os ensaios utilizados para verificar a actividade biológica do sobrenadante de culturas de linfócitos T estimulados de acordo com a. presente invenção permitiram chegar às seguintes conclusões:

Efeito do sobrenadante sobre a citotoxicidade das plaquetas

Os sobrenadantes obtidos após estimulação de linfócitos T, periféricos ou de amígdalas, humanos normais,

pela Concanavalina 4 (0,01 a 5 /ig/ml) ou de linfócitos T de baço de um paciente atingido por Echinococcose, por antigénios de E. granulosus (5 a 100 jig/ml), ensaiados em processos citotóxicos de plaquetas, relativamente a schistosomulos, permitiram obter os resultados reunidos no quadro I adiante.

QUADRO I

Efeito da PA3L sobre a citotoxicidade antiparasitária IgE-de|iendente de plaquetas sanguíneas murinas e humanas provenientes de indivíduos infectados e alérgicos.

Citotoxicidade	Homem (a)	Rato(b)
A	B
Em um meio activador	72,7 ± 2,9	81,7 ± 5,5	71,2 ± 5,2
.Com sobrenadante Con. A	20,5 ± 2,1	22,1 ± 4,0	19,5 ± 2,5
.Com sobrenadante Ag	35,0 ±15,0	33,6 ± 6,1	21,5 ±0,5
.Com meio de cultura de	70,2 ± 3,2	81,5 ± 4,6	78,0 ± 7,0
linfócitos

N.B. Em nenhum dos casos a citotoxicida.de com soros de ra to ou humanos normais, excede 9,5 ± 7,3»

a) As plaquetas purificadas foram incubadas com soro A (de pacientes atingidos por Schistosomíase mansoni) ou B (de dadores alérgicos) na presença de larvas de ”S. mansoni (Schistosomulos). 'dicionou-se o sobrenadante de linfócitos ou o meio de cultura de linfócitos e as anti-IgE ou o alergeno correspondente no caso de incubação no so

- 6 ro de dadores alérgicos e apreciou-se a citotoxicidade em percentagem de Schistosomulos mortos ao fim de ura período de incubação de 24 horas a 37°C (média ± desvio tipo).

b) Incubou-se as plaquetas purificadas com soro de ratos atingidos com Schistosomíase mansoni na presença de larvas de S. mansoni (schistosomulos). idicionou-se o sobrenadante de linfócitos ou o meio de cultura de linfócitos e apreciou-se a citotoxicidade em percentagem de shistosomulos mortos ao fim de um período de incubação de 24 horas a 37°C ( média ± desvio padrão ).

Qs Inventores evidenciaram que os sobrenadantes são directamente activos sobre as funções plaquetárias e não mediante protecção dos alvos, visto que a pré-incubação separada das plaquetas efectoras ou dos shistosomulos com os sobrenadantes de linfócitos I, seguida de um ensaio de citotoxicidade no qual as plaquetas e os parasitas foram separados por uma membrana em policarbonato de porosidade 0,2 ji, não determina a inibição esperada senão no caso em que as plaquetas foram pré-incubadas e nao no caso em que as larvas foram incubadas, tal como ressalta do quadro 2 que se segue.

QUADRO 2

Acção directa da PÂ3L sobre as plaquetas sanguíneas humanas.

Ui m .Μ.,-, ...................	p/s	P /S	P/S
Citotoxicidade IgE/anti-IgE íi. — -..... -.———	92,3 + 5,1	11,6 + 9,2	71,5± 6,3

- 7 As plaquetas (?) humanas e os schistosomulos (3), tratados (*) ou não com o sobrenadante de linfócitos, foram separados por um filtro (/) em policarbonato de porosidade igual a 0,22 /im em câmaras de Boyden. A citotoxicidade foi apreciada em percentagem de schistosomulos mortos decorrido um período de incubação de 24 horas a 37°C (média I.S.B.).

Os Inventores demonstraram, além disso, que esta inibição não é a consequência de um efeito tóxico do sobrenadante de linfócitos T visto que não se detectou LDH na suspensão de plaquetas (Láctico-desidrogenase).

A estimulação mitogénica de linfócitos T de baço de ratos quer pela Concanavalina Λ quer pela PHA £ (2 /ig/ml) ; P HA - BitohemaglutininaJ ou a estimulação antigénica de linfócitos T mesentéricos ou de baço de rato infectado por 3. mansoni pelo antigénio de Schistosoma adulto, produz sobrenadantes que inibem a citotoxicidade IgE-dependente de plaquetas de ratos (40 a 60$ de inibição), que mostra que os linfócitos T de ratos, segregam, do mesmo modo que os linfócitos T humanos, a linfoeina PASL que é um factor inibidor de plaquetas.

Como mostra a Figura I anexa que representa a percentagem de inibição da citotoxicidade em função da quan tidade de Concanavalina A (expressa emjug/ml) utilizada como estimulante, sendo o efeito inibidor proporcional à dose de Concanavalina A utilizada para a estimulação das células T e o efeito óptimo obtém-se com uma dose final de 1 jag/ml. Os sobrenadantes produzidos na ausência de Concanavalina A exprimem igualmente uma actividade supressora, mas sensível.

- 8 mente inferior à observada, com sobrenadantes activados com lectina (20-25%).

Como mostra a Figura 2, que representa a percentagem de inibição da citotoxicidade em função da quanti. dade de sobrenadante (expressa em jjI) utilizada, o sobrena dante age de uma maneira que é função da quantidade utilizada, para atingir um planalto a 50 jal (1 : 4 de diluição final), que é a dose utilizada para todas as experiências ulteriores. 0 efeito da adição de sobrenadantes em diferen tes períodos antes e depois do começo do processo citotóxi. co está representado na Figura 3 anexa na qual a. percentagem de inibição da citoxicidade é representada, em função da adição de sobrenadante no tempo, expressa em horas; a inibição óptima obtém-se mediante adiçao do sobrenadante de células T durante a primeira hora de contacto entre as plaquetas efectoras e os schistosomulos (nesta Figura Smules significa schistosomulos).

Estrutura de ligação sobre as plaquetas.

Três incubações sucessivas de sobrenadante de células T contendo o factor de acordo com a presente inven çao, capaz de inibir as propriedades destrutivas das plaquetas relativamente a schistosomulos, com plaquetas em comprimidos, suprimem a sua actividade inibidora da citoto xicidade das plaquetas : esta absorção do factor supressor pelas plaquetas sugere a existência de uma estrutura de li. gaçao. Pelo contrário, quando se utiliza linhas celulares de mieloma de IgE, de K562, de U937 ou de macrófagos bronco-alveolares, como absorventes, o efeito inibidor do sobre, nadante de linfócitos é preservado.

- 9 Efeito do sobrenadante sobre a quimioluminescência das pla quetas.

Os Inventores demonstraram anteriormente /C. R. ACAD. SC. PARIS, 1984, 298:55 já referido J que na, citoxicidade IgE-dependente relativamente a schistosomulos, é possível obter a produção de metabolitos de oxigénio pelas plaquetas humanas, medida por quimioluminescência.

Ensaiou-se o efeito do sobrenadante de linfócitos T estimulados pela Concanavalina A (1 jig/ml) sobre a quimioluminescência das plaquetas como mostra a Figura 4 anexa, uma incubação de plaquetas com sobrenadante de lin fócitos T durante uma hora, a uma diluição final de 1:4, diminui fortemente (de 60$) a produção de metabolitos de oxigénio que se observa normalmente no caso em que as plaquetas normais foram estimuladas por uma reacção IgE/anti-IgE ou no caso em que as plaquetas de pacientes alérgicos foram estimuladas pelo alergeno correspondente, o que confirma o papel directo da linfocina de acordo com a presente invenção, relativamente às próprias plaquetas.

Na Figura 4, as iniciais NS e AS têm os seguintes significados:

NS = incubadas em soro normal,

AS ₌ incubadas em soro de pacientes alérgicos,

AS + ConA Sup - incubadas em soro de pacientes alérgicos e sobrenadante de linfócitos.

A actividade máxima de quimioluminescência luminol/luciferina de 5.10 plaquetas em PBS foi registada nos cinco minutos que se seguiram à adição do meio (lê coluna de cada grupo) ou do agente retardador: anti-IgE (10 p.g de anticorpos/ml) (2§ coluna de cada grupo) ou alergeno (10 ^ug/ml) (3- coluna de cada grupo).

Caracterização das células implicadas na produção de linfocina supressiva.

Para definir o tipo de células responsável pela produção do factor inibidor de acordo com a presente invenção, os Inventores examinaram o efeito de uma depleção de sub-população T selectiva : trataram células T com o anticorpo monoclonal 0KT4 (para as sub-classes auxiliar/inductor) ou com o anticorpo monoclonal 0XT8 (para as sub-classes supressor/destruidor) na presença de complemento. As células foram então estimuladas pela Concanavalina A e examinou-se se a linfocina supressiva foi produzida.

Como mostra a Figura 5, a depleção de linfócitos 0KT6⁺ suprimiu a produção do factor inibidor, enquanto a depleção de células 0KT4⁺ não modificou a sua formação. A figura 5 ilustra a taxa de actividade supressiva respectiva de PA3L obtida a partir de células T, células 0KT8* 0KT4” θ de células ΟΚΤό-’ΟΚ'Μ⁴', estimuladas pela Concanavalina A. Os resultados exprimem-se em supressão % (média) da citotoxicidade IgE-dependente, relativamente aos schistosomulos.

Esta observação demonstra bem que uma sub-população de células T supressivas produz o factor responsável pela inibição observada das funções efectoras das plaquetas.

Efeito do tratamento de células T pela indometacina sobre a produção da linfocina (PASI·) inibidora de acordo com a _ presente invenção.

As prostaglandinas desempenham, como se sabe, um papel na indução de células T supressivas não-específicas, durante a estimulação mitogénica e antigénica de linfócitos. Os Inventores trataram pois linfócitos mediante indometacina (10^-¾ de concentração final) que é um inibidor da síntese das prostaglandinas e examinaram a produção de linfocina inibidora induzida pelo agente mitogénico. A produção deste factor permanece inalterada nestas condições (48,0 ± 3,0$ de actividade supressiva com a indometacina, para 45,0 ± 2,5$ sem a indometacina).

CaracterJ-sticas físico-químicas da linfocina inibidora plaquetária (PASL) de acordo com a presente invenção.

efeito supressor permanece inalterado após diálise do sobrenadante de linfócitos durante 24 horas con tra uma solução tampão de fosfato (PBS). 0 factor iníbidor é estável em relação ao calor (5b°C durante uma hora, ou 100°C durante 5 minutos) e a ácidos, visto que uma diálise durante 24 horas contra um tampão a pH2 não alterou o seu efeito supressor, tal como ressalta do Quadro 3 adiante que mostra as propriedades físico-químicas da PASE: a estabilidade da PA3L relativamente ao calor foi avaliada mediante aquecimento dos sobrenadantes em banho-maria a 56°C durante 120 minutos, ou a 100°C durante 5 a 10 minutos. Preparou-se a PASL dialisada mediante diálise do sobrenadante a 4°C durante 24 horas contra PES com trocas múltiplas de meio. Prepararam-se os sobrena.dantes tratados com um ácido mediante diálise a 4°C durante 24 horas contra tampão de glicina a pH2, seguida de uma diálise durante 24 horas suplementares contra PBS para eliminar o ácido em excesso.

QUADRO 3

Propriedades Físico-químicas da PASL

Tratamento	índice de inibição %
	64,0 ± 1,4
A.Aquecimento
120 minutos a 56°C	65,7 ± 5,6
5 minutos a 100°C	74,8 i 8,8
B.Diálise durante 24 horas	64,3 ±3,6
C.Tratamento ácido durante 24 horas	68,5 ± 2,5

Como mostra, a Figura 6 anexa, que representa a percentagem de inibição da citotoxicida.de de sobrenadantes tratados com diversos enzimas, respectivamente a tripsina, a protea.se K e a neuraminidase, a linfocina isolada de acordo com a presente invenção é sensível à tripsina e à protease K, enquanto a neuraminidase não tem nenhuma influência sobre a sua actividade.

Um perfil cromatográfico da linfocina inibidora das plaquetas sanguíneas, de acordo com a presente inven ção, sobre um peneiro molecular em Seph.adex-G-75, está representado na Figura 7. Fraccionou-se a PASL sobre uma colu

na de Sephadex-G-75 preparada, em. tampão de fosfato (pH 7,4). Testaram-se as fracções eluídas para determinar a sua actividade PASI na citotoxicidade piaquetária IgE-dependente, anti-schistosoma. A actividade supressiva foi detectada em dois picos, mas a actividade óptima foi encontrada no segun do pico, o menor, que migra na gama de peso molecular inferior ou igual a 25000 e de preferência compreendido entre 18000 e 20000 ; o primeiro e maior pico poderá corresponder a uma forma agregada da molécula.

Examinou-se a carga eléctrica de linfocina inibidora plaquetária PASL : a actividade é máxima a um ponto isoelécirico (Pi) compreendido entre 4,1 e 4,6, como mos+ra a Figu ra 8 que representa a percentagem de inibição da citotoxicidade em função do pH. A focalização do ponto isoeléctric-o da PASI realizou-se em uma coluna ce Sephadex-C-75 contendo 5$ de anfolinas suportes em uma gama de pH de 3,8 a 10, durante 16 horas, a uma potência constante de 8 Watts. Cada fracção de gel. foi eluída, dialisada durante uma noite contra PP3 contendo cloreto de sódio, para eliminar as amfolinas, após o que se examinou a sua actividade supressiva por avaliação da citotoxicidade plaquetária IgE-dependente rela tivamente a Schistosomulos.

Resulta do que precede que a linfocina P '₄S1 inibe as funções efectoras das plaquetas sanguíneas, o que sugere que ela desempenha um papel na regulação de acidentes imunopatológicos nos quais a taxa de IgE está aumentada, particularmente nas alergias atópicas e mais particularmente na asma. Por este facto, a PASL constitui uma substância imunofarmacológica de grande interesse para o tratamento de acidentes alérgicos em que as plaquetas apareçam implicadas. A descrição que se segue refere-se a um exemplo para a preparação da linfocina PASL de acordo com a pre sente invenção, dada a título de ilustração de um dos obje£ tivos da presente invenção e de modo nenhum com carácter limitativo.

Exemplo de preparação de linfocina PASL purificada.

1. Preparação de sobrenadantes de linfócitos T.

Os sobrenadantes de linfócitos T podem ser obtidos quer mediante estimulação mitogénica, quer mediante estimulação antigénica, como se descreve adiante.

A. Mediante estimulação mitogénica

- a partir de células humanas,

Incuba-se 3.10° células T periféricas ou de amígdalas, colhidas no homem, em meio HPMI-?GS β quer dizer do meio RPMI-1640 contendo 5/ de soro fetal de vitela inactivado pelo ca lor (FGS)J com a Concanavalina. \ (0,01 a 5 yug/ml) a. 37°C em placas de cultura comportando poços de fundo plano, durante 24 horas, em uma atmosfera humidificada contendo 5/ de C0₂· Lava-se em seguida as células para eliminar a Concanavalina A e cultivam-se durante 24 horas. Recupera-se os sobrenadantes de cada poço, centrifugam-se a 400xg e filtram-se através de membranas de porosidade 0,22 ₍,um, após o que, se não se utilizarem imediatamente, se

- 15 ( ’ armazenam a -20°C.

- a partir de células murinas

Utiliza-se 1.10° linfócitos de gânglios linfáticos e prepara-se os sobrenadantes de acordo com o processo descrito antes.

B. Mediante estimulação antigénica

- Efectua-se a estimulação de células T humanas provenientes de um paciente atingido com Echinococcose em meio RPMI-FOS mediante adição de extractos brutos de Eclánococcus granulosus (concentração final : 5,40 ou 100)na presença de células mononucleares de sangue periférico (PFL.C) autÓlogas irradiadas (2000 rads, 2 minutos). Após uma permanência, de 24 horas em uma atmosfera humidificada, lavam-se as células para eliminar os extractos referidos antes e cultivam-se durante 4 dias. Recupera-se o sobrenadante de cultura, filtra -se através de uma membrana de 0,22 pm e armazena-se a -20°C se não se utilizar imediatamente,

- Incubam-se células T obtidas a partir de gân glios linfáticos de ratos infectados com S. mansoni” (14, 35 ou 56 dias de infecçao) em meio RPíJI-FCS suplementado com a IL2 (interleucina 2), células tímicas de rato irradiadas (APC) e de antigénio de verme adulto de S. mansoni (50 jig/ml de concentração final) em placas de cultura com poços múltiplos de fundo plano, em uma atmosfera humidificada contendo 5/ de COg . Esta estimulação foi efectuada de 5 em 5 dias e no 15θ dia, recuperou-se os sobrenadantes, centrifugaram-se para eliminar todas as células contaminantes eventualmente presentes e filtraram-se através de membranas de 0,22 yim, antes de serem armazenados a -20°C, se necessário. Ao mesmo tempo, mede-se a resposta de multiplicação das células T nestas condições, após um estí mulo de 16 horas com 1 jaOi de ^H-Timidina (1 Ci/mmole), sendo a radioactividade ineorpo. rada determinada mediante filtração da cultu ra através das membranas liillipore e contagem dos filtros em um fluido de cintilação líquida, em um beta-espectrómetro.

2. Purificação dos sobrenadantes para extrair a lin- focina PASL activa.

2.1 Submete-se o sobrenadante, eventualmente descongelado após armazenamento, a uma diálise em célula Amicon (membrana UN5) para eliminar sais e pequenas moléculas.

2.2 Após diálise, purifica-se a linfocina PÂSL mediante gel-filtração sobre uma coluna de Biogel-P30 extra fina (granulometria 400 malhas)em meio de AcOH a 1/, com um débito linear de 2 cm/hora. 0 controlo dos efluentes efectua-se mediante leitura a 254 nm e mediante pesquisa da actividade biológi. ca ou imunológica como se descreve adiante. As

- 17 fracções assim localizadas são reunidas e liofilizadas.

2.3 Submete-se então a proteína (linfocina P’JL) a uma cromatografia em fase inversa (CLI-íP) sobre um gel de sílica enxertado ( tal como o octadecilsilano, por exemplo) cujas partículas sao de granulometria contro lada (5 /im) e cujos poros sao calibrados (3ΟΰΑ ). A eluição efectua-se com a ajuda de um gradiente de CH^CN-HgO compreendido entre 1:99 e 60:40, no decurso de 3 horas. A estas duas fases adiciona-se 1%« de ácido trifluoroacético para o emparelhamento iónico. A detecção efectua-se mediante registo de densidade óptica a 215 nm e determinação da actividade biológi ca. Asfracções assim localizadas são então liofiliza das e controladas: são constituídas pela linfocina PASL.

3. Detecção da actividade biológica

A actividade biológica é detectada pela capacidade das plaquetas em destruir larvas de schistosoma na presença de IgE específicas e mediante avaliação da quimioluminescência induzida pelo metabolito oxidati vo na presença de luminol e de luciferina.

4. Determinação do peso molecular da linfocina PASL de acordo com a presente invenção.

Piltra-se o sobrenadante estimulado pela Concanavali na A, no exemplo descrito, concentrado (2 ml), através de uma coluna de Sephadex G-75 (1,8x38 cm) e elui-se com PBS com um débito de 5 ml/hora. A activi dade linfocinica de cada fracção foi ensaiada de

acordo com o processo descrito no ponto 3 anterior.

Para determinar o peso molecular da linfocina, calibra-se o cromatograma com um Kit de calibração, de baixo peso molecular (fornecido por PHARMACIA, UPPSALA, Suécia) contendo seroalbumina bovina (BSA, p.m, 67000), ovalbumina (p.m. 43000), quimotripsinogénio A (p.m. 25000) e ribonuclease A (p.m. 13700).

peso molecular do polpeptido que constitui a linfocina, determinado como se indicou antes, está compreen dido entre 15000 e 20000.

Resulta assim do que se disse que se isola, de acordo com a presente invenção, uma linfocina que se distingue das linfocinas identificadas até hoje, tanto pelas suas propriedades biológicas como pelas suas propriedades fisico-químicas e que esta inibe as funções efectoras das plaquetas, fornecendo assim uma substância imunofarmacológica apropriada para desempenhar um importante papel na regulação de cistúrbios imunopatológicos em que a taxa de IgE esteja aumentada e, mais particularmente, nas alergias atópicas e, mais particularmente ainda, na asma

Claims

Reivindicações

1.- Processo para a preparação de uma nova linfocina supressora da activação plaquetâria, constituída por um factor obtido a partir de células T estimuladas pela concanavalina A ou por um antigénio, capaz de inibir a citotoxicidade plaquetâria IgE-dependente em relação às larvas jovens de S. Mansoni, de diminuir fortemente a quimioluminescência das plaquetas sanguíneas, em uma reacção IgE/anti-IgE, que é uma correlação da citotoxicidade antiparasitãria, e de inibir a activação plaquetâria em intolerâncias não -IgE dependentes, sendo este factor designado sob o nome de linfocina supressora da actividade plaquetâria (PASL) e produzido por linfócitos T OKT8t caracterizado pelo facto de se estimular células T de origem humana ou murina pela concanavalina A ou um estimulante mitogênico análogo ou por um antigénio tomado no grupo que compreende os antigénios de S. mansoni e os antigénios de Echinococcus granulosos, de se cultivar células T estimuladas, durante um intervalo de tempo apropriado, de se recuperar os líquidos sobrenadantes da cultura e de se filtrar estes últimos, eventualmente após centrifugação, através de membranas com uma dimensão dos poros da ordem de 0,22de se purificar depois mediante filtração sobre gel e de se submeter a fracção proteica activa recolhida, previamente identificada mediante pesquisa da actividade biológica ou imunológica e eventual mente liofilizada, a uma cromatografia em fase inversa sobre um gel de sílica enxertada, com granulometria e porosidade calibradas, seguida de uma eluição com um gradiente de CH^CN-H^O contendo l°/oo ^e ácido trifluoroacético, compreendido entre 1 : 99 e 60:40, sendo a fracção proteica purificada que contêm a PASL liofilizada, em seguida, com vantagem, após detecção mediante registo de densidade Õptica a 215 nm e determinação da actividade biológica.
2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se determinar a actividade biológica da fracção proteica activa e da fracção proteica activa purificada contendo a PASL mediante obtenção de 60 % da inibição da citotoxicidade pelo sobrenadante de cultura de linfócitos T estimulados pela concanavalina A ou pelos antigénios de E. granulosus, em relação a plaquetas sanguíneas normais utilizadas como células efectoras, incubadas com soro de pacientes atingidos por esquistosomíase ou com soro de pacientes alérgicos apresentando uma elevada taxa de IgE circulantes e estimulados por anti-IgE ou pelo alergeno específico.
3. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de uma nova linfocina, caracterizado pelo facto de se promover o isolamento a partir de sobrenadante de culturas de linfócitos T 0KT8⁺ estimulados pela concanavalina A ou um antigénio.
4. - Processo de acordo com a reivindicação 3, para a preparação de uma nova linfocina, caracterizado pelo facto de, quando se promove o isolamento de sobrenadantes de culturas de linfõcitos T 0KT8⁺ estimuladas por um antigénio, se estimular os linfócitos T por antigénios de Echinococcus granulosus ou de Schistosoma mansoni.
5. - Processo para a preparação de um novo medicamento imunomodulador das manifestações alérgicas, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade efectiva de um ingrediente activo obtido pelo processo de acordo com a reivindicação 1, a PASL iso21 lada de sobrenadantes de linfócitos T estimulados por um agente mitogénico tal como a concanavalina A ou análogo ou por um antigénio apropriado tal como, particularmente, um antigénio de E. Granulosus ou de S.mansoni, e cujo peso molecular é da ordem de 15 a 20 KDa e Pi é da ordem de 4,4 a 5,0, possuindo uma estrutura de ligação específica do tipo de um receptor à superfície das plaquetas sanguíneas, ou seja uma especificidade de adsorsão sobre as plaquetas, com agentes auxiliares de formulação apropriados .

Lisboa, 20 de Maio de 1987

O Agente Oficia! da Propriedade Industria!

RESUMO

Processo para o isolamento e a purificação de uma nova linfocina supressora da activação plaquetãria

Descreve-se um processo para a preparação de uma nova linfocina supressora da activação plaquetãria, constituída por um factor obtido a partir de células T estimuladas pela concanavalina A ou por um antigénio, capaz de inibir a citotoxicidade plaquetãria IgE- dependente em relação ãs larvas jovens de S. mansoni, de diminuir fortemente a quimioluminescência das plaquetas sanguíneas, em uma reacção IgE/ anti-IgE que constitui uma correlação da citotoxicidade antiparasitãria e de inibir a activação plaquetãria em intolerâncias não-IgE dependentes, sendo este factor designado pelo nome de linfocina supressora da actividade plaquetãria (PASL) e produzido por linfõcitos T 0KT8⁺, caracterizado pelo facto de se estimular células T de origem humana ou murina pela concanavalina A ou um estimulante mitogénico análogo ou por um antigénio tomado no grupo que compreende os antigênios de S. mansoni e os antigénios de Echiconococcus granulosus, de se cultivar células T estimuladas, durante um período apropriado, de se recuperar os sobrenadantes de cultura e de se filtrar, eventualmente após centrifugação, através de membranas com uma dimensão dos poros da ordem de 0,22yx m, de se purificar depois mediante filtração sobre gel e de se submeter a fracção proteica activa recolhida, previamente identificada mediante pesquisa da actividade biológica ou imunolõgica e eventualmente lio23 filizada, a uma cromatografia de fase inversa sobre um gel de sílica enxertado, de granulometria e porosidade calibradas, seguida de uma eluição com um gradiente de CH^CN-E^O contendo l°/oo de ácido trifluoroacético, compreendido entre 1:99 e 60:40, sendo a fracção proteica purificada contendo o PASL liofilizada, em seguida, com vantagem, após detecçao mediante registo de densidade óptica a 215 nm e determinação da actividade biológica.

A nova linfocina isolada e purificada de acordo com a presente invenção ê utilizada para a preparação de um medicamento imunomodulador das manifestações alérgicas.