PT84911B

PT84911B - Processo para a preparacao de esteroides uteis como agentes anti-cancerigenos e anti-obesidade

Info

Publication number: PT84911B
Application number: PT84911A
Authority: PT
Inventors: Arthur G Schwartz; Marvin Louis Lewbart
Original assignee: Research Corp
Priority date: 1986-05-21
Filing date: 1987-05-20
Publication date: 1990-02-08
Also published as: NO173278C; EP0246650B1; AU7329687A; DK173168B1; AU601184B2; JPS62283993A; IE60027B1; IE871312L; ES2039373T3; NO872115L; GR3003769T3; NO872115D0; PT84911A; CA1329195C; NO173278B; EP0246650A1; ATE71107T1; DE3775617D1; DK259387A; DK259387D0

Description

PATENTE DE INVENÇÃO

N2 84.911

NOME: RESEARCH CORPORATION, norte-americana, industrial, com sede em Suite 853, 25 Broadway, New York, N.Y., Estados Unidos da América do Norte

EPÍGRAFE: PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE ESTEROIDES ÚTEIS COMO AGENTES ANTI-CANCERÍGENOS E ANTI-OBESIDADE

INVENTORES: Arthur G. Schwartz

Maruin Louis Lewbart

Reivindicação do direito de prioridade ao abrigo do artigo 42 da Convenção da União de Paris de 20 de Março de 1883.

Estados Unidos d.a América do Norte, sob ο N2 867.112 em de Maio de 1986

MEMÓRIA DESCRITIVA

Resumo

O presente invento diz respeito a um processo para a preparação de um composto com a fórmula

RESEARCH CORPORATION

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE ESTEROIDES UTEIS COMO AGENTES ANTI-CANCERÍGENOS E ANTI-OBESIDADE $

útil como agente preventivo do cancro, como agente anti-obesidade, como agente anti-hiperglicémico, como agente anti-envelhecimento e como agente anti-hipercolesterolémico e útil na luta contra as doenças das coronárias e as doenças autoimunitárias.

No composto atrás indicado cada R-p R₂, R^, R5, Ηθ e Ry pode ser hidrogénio ou alquilo inferior;

Σ é halogénio, hidrogénio, alquilo inferior ou alcoxi inferior; Z é alquilo inferior ou hidrogénio; e n é 1 ou 2.

processo de preparação consiste, por exemplo, na redução facultativa da dupla ligação no anel B (segundo a contar da esquerda) de um composto de Fórmula IA, quando presente de modo a produzir-se um composto de Fórmula IA tendo 0 anel B saturado.

Fundamento do Invento

Este invento aqui descrito foi efectuado no decurso de um trabalho realizado ao abrigo de uma subvenção ou prémio patrocinados em parte pelo National Institutes of Health.

Este invento relaciona-se como novos esteroides e mais particularmente com derivados da androsterona úteis como agentes anti-cancerígenos, anti-obesidade, anti-diabetes e hipolipidémicos.

A desidroepiandrosterona (DHEA) e sulfato de DHEA são os principais produtos de secreção das glândulas supra-renais nos seres humanos. A concentração no plasma do sulfato de DHEA, o qual, a seguir ao colesterol, é o esteroide mais abundante no ser humano, sofre entre todos os esteroides conhecidos, o mais acentuado declínio relacionado com a idade.

Embora o sulfato de DHEA seja o principal precursor do estrogénio da placenta e possa ser convertido em androgénios activos no tecido periférico, não existe qualquer papel biológico óbvio quer para a DHEA quer para o sulfato de DHEA no individuo normal. Vários estudos retrospectivos e perspectivos sugerem que mulheres com níveis sub-normais destes esteroides podem apresentar uma predisposição para desenvolver cancro da mama. Por exemplo, ver Brownsey, et al., Plasma dehydroepiandrosterone sulfate leveis in patients with benign and malignant breast disease, Eur. J. Câncer, 8, 131-137 (1972); Bulbrook, et al., Relation between urinary androgen and corticoid excretion and subsequent breast câncer, Lancet, 2, 395-398 (1971); Rose, et al., Plasma dehidroepiandrosterone sulfate, androstenedione and cortisol, and urinary free cortisol excretion in breast câncer, Eur. J. Câncer, 13, 43-47 (1977); Wang, et al., Studies of the sulfate esters of dehidroepiandrosterone and androsterone in the blood of women with breast câncer, Eur. J. Câncer, 10, 477-482 (1974·); θ Zumoff, et al., Abnormal 24-hr mean plasma concentrations of dehidroisoandrosterone and dehidroisoandrosterone sulfate in women with primary operable câncer, Câncer Research, 41, 3560-3565, September 1981.

Foi também estabelecido que a DHEA é um inibidor potente não-competitivo da desidrogenase glicose-6-fosfato dos mamíferos (G6PDH). Por exemplo, ver Oertel, et al., The effects of ateroids on glucose-6-phosphate dehydrogenase, J. Steroid Biochem., J>, 495-4-96 (1972) and Marks, et al., Innibition of mammalian glucose-6-phosphate dehydrogenase by steroids, Proc. Nat’l Acad. Sei., USA, 46, 477-452 (1960). Além disso, Yen, et al., Prevention of obesity in A^/a mice by dehydroepiandrosterone, Lipids, 12, 409-415 (1977)» referiam que uma administração a longo prazo de DHEA a ratinhos VY-A⁷^/ a evitava o desenvolvimento da obesidade sem supressão do apetite.

Além disso, é também sabido que o tratamento a longo prazo de ratinhos C5H com DHEA, além de reduzir o aumento de peso sem supressão do apetite, inibe acentuadamente o desenvolvimento expontâneo do cancro da mama e pode atrasar o processo de envelhecimento. Foi observado que DHEA antagoniza a capacidade do promotor do tumor, 12-0-tetradecanoilforbol-15-acetato, para estimular a incorporação de timidma- Ξ na epiderme do ratinho e numa linha celular epitelial do rim de rato. Ver, Schwartz, Innibition of spontaneous breast câncer formation in female CõH-A^/a mice by long-term treatmente with dehydrosterone, Câncer Res., 59, 1129-1132 (1979); e Schwartz, et al., Dehydroepiandrosterone; and anti-obesity and anti-carcinogenic agent, Nut. Câncer 3, 46-55 (1981).

Ben-David, et al., Anti-hypercholesterolemic effect of dehydroepiandrosterone in rats”, Proc. Soc. Expt. Biol. Med., 125, 1136-1140 (1967) observaram que o tratamento com DHEA tem um efeito anti-hipercolesterolémico nos ratinhos, enquanto que Coleman, et al., (Diabetes 31, 830, 1982) referem que a administração de DHEA produz um efeito hipoglicémico acentuado em ratinhos C57BL/KsJ-db/db. Estes últimos autores sugerem que o efeito terapêutico de DHEA possa resultar do seu metabolismo em estrogénios.

Ê ainda sabido que a DHEA e 16 «x-bromoepiandrosterona são inibidores da transformação induzida pelo vírus Epstein-Barr dos linfócitos humanos e que a 16o<-bromoepiandrosterona é um inibidor mais potente da G6PDH dos mamíferos do que DHEA. Ver, Schwartz, et al. Carcinogenesis, Vol. 2 No. 7, 683-686 (1981)·

Embora se tenha verificado que DHEA era eficaz nas formas atrás descritas existe contudo evidência de um efeito estrogénico após administração prolongada. A DHEA não é um estrogénio per se mas é bem sabido que é convertivel em estrogénios. Além disso, a dose terapêutica da DHEA é bastante elevada. Seria assim altamente desejável proporcionar esteroides, os quais possuindo também a mesma vantagem atrás descrita da DHEA são mais potentes e não produzem um efeito estrogénico.

Sumário do Invento

Consequentemente, o presente invento proporciona novos esteroides.

Os esteroid.es do presente invento apresentam propriedades farmacológicas significativas e desejáveis, e são particularmente úteis como agentes preventivos do cancro.

Os esteroides atrás identificados são adicionalmente úteis como agentes anti-obesidade, como agentes anti-hiperglicémicos, como agentes anti-envelhecimento, e como agentes anti-hipercolesterolémicos.

Este invento proporciona ainda esteroides úteis como agentes anti-cancro, anti-obesidade, anti- j I -hiperglicémia, anti-envelhecimento, e anti-hipercolestero- | lemia, que não evidenciam efeitos estrógenicos. j i I presente invento também proporciona ί um processo para o tratamento e/ou prevenção do cancro, obe-j sidade, envelhecimento, diabetes, e hiperlipidemia.

presente invento também proporciona esteroides úteis para o tratamento e/ou prevenção de doenças; autoimunitárias, tais como anemia hemolítica positiva de Coomb e lupus eritematoso.

presente invento proporciona novos esteroides com a fórmula

H

I

em que e R_? indep endentemente cada um de entre R₁₅ R₂, ^Rzp ^5» ^{e B}g podem ser iguais ou diferentes e cada um deles são hidrogénio ou alquilo inferior;

X é halogénio, hidroxi, hidrogénio, alquilo inferior ou alcoxi inferior;

Z é alquilo inferior ou hidrogénio;

n é 1 quando o anel /³ é não saturado; e n é 2 quando o anel p é saturado;

com a condição de que pelo menos um de entre X e Z seja diferente de hidrogénio.

Na fórmula aqui atrás descrita, (Ν_&)2> em que a é um número inteiro 1, 2, 4, 5, 6 ou 7, significa ί que existem 2 substituintes no anel esteroidal numa deterI minada posição. Cada R_& em cada posição pode ser igual ou ! diferente e são quer hidrogénio quer alquilo inferior. Por exemplo, (RP2 ^siSⁿific^a que cada R·^ pode ser igual ou di- ί ferente e cada R, é independentemente hidrogénio ou alquilo ί inferior.

Na fórmula aqui atrás referida, os vários aneis são designados como se segue:

no que se refere aos compostos com a Formula IA, 0 anel po-8-

de ser saturado ou não saturado. 0 (-1-4-4 1-4+ indica que pode estar presente uma ligação extra. Se o anel ^3 contiver uma dupla ligação, n é 1, significando que existe apenas um substituinte sente invento.

ligado ao anel 5 dos esteroides do pre-

Se o anel for saturado, n e substituintes R ligados ao a seguir:

2, significando que existem anel A , tal como é indicado

Os vários substituintes são designados como situando-se na posição por meio de uma linha trace-9-

jada (---) ligando o substituinte ao núcleo esteroide. Os substituintes são designados como situando-se na posição por meio de uma linha contínua (---) ligando o substituinte ao núcleo esteroide. Nestes casos em que os substituintes podem situar-se nas posições ty ou , os substituintes são indicados como estando ligados ao núcleo esteroide por uma linha tracejada e uma linha contínua colocadas lado a lado. Além disso, de acordo com a nomenclatura I.U.P.A.C., os átomos de carbono dos esteroides do presente invento são numerados como se segue e os esteroides possuem a estereoquímica I.U.P.A.C. designada:

presente invento proporciona processos para a profilaxia do cancro, obesidade, envelhecimento, diabetes e hiperlipidémia e doenças autoimunitárias, tais como o lupus eritematoso e a anemia hemolítica positiva de Coomb compreendendo a administração ao hospedeiro, por exemplo mamíferos, de uma quantidade terapêuticamente eficaz dos presentes novos esteroides.

De acordo com o presente invento, descobriu-se surpreendentemente que os esteroides possuindo uma determinada estrutura, descritos aqui atrás e aqui a seguir mais detalhadamente, são caracterizados por propriedades

farmacológicas significativas sem efeitos tóxicos ou estrogénicos indesejáveis. Isto é, descobriu-se bastante inesperadamente, que os esteroides do presente invento são úteis como agentes preventivos do cancro, agentes anti-obesidade, anti-diabetes, anti-envelhecimento, anti-autoimunidade e anti-hipercolesterolemia, mas diferentemente da DHEA são mais potentes e apresentam pouco ou nenhum efeito estrogénico. Além disso, diferentemente da DHEA ou compostos do presente invento não induzem aumento do tamanho do figado e actividade aumentada da catalase.

No presente invento, os grupos alquilo são de preferência alquilo inferior, os quais podem ser de cadeia linear ou ramificada, e que contêm até 5 átomos de carbono. Exemplos incluem metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, pentilo, amilo etc. 0 grupo alquilo mais preferido é o metilo.

Os átomos halo são de preferência Br,

F ou Cl, especialmente F.

Podem ser efectuadas variações adicionais na fórmula estrutural representando os presentes compostos sem alteração significativa das propriedades terapêuticas. Por exemplo, as metades alquilo podem ser substituídas por um ou mais de uma série de substituintes, tais como hidroxi, halogénio, alcoxi, etc.

Uma apresentação do composto com a fórmula I tem a fórmula:

⁽V₂

em que çada um de entre R_1? Rg, ^S5» Rg ^eRy podem ser iguais ou diferentes e cada um deles são independentemente hidrogénio ou alquilo inferior;

X é halogénio, hidroxi, hidrogénio, alquilo inferior ou alcoxi inferior;

Z é alquilo inferior ou hidrogénio, e n é 1 ou 2;

Uma outra apresentação dos compostos com a Fórmula IA tem a fórmula: ;

í i

em que cada um de entre R_1? Rg, R^, R^, Κθ e Ry podem ser iguais ou diferentes e cada um deles são independentemente hidrogénio ou alquilo inferior;

X é halogénio, hidroxi, hidrogénio, alquilo inferior ou alcoxi inferior;

Z é alquilo inferior ou hidrogénio e com a condição de que pelo menos um de entre X e Z seja diferente de hidrogénio.

Uma apresentação preferida dos compostos com a Fórmula I tem a fórmula;

em que Z e X são tal como foram descritos aqui atrás.

Os compostos preferidos com a Fórmula

II são os derivados 5V-androstan-17-ona. Compostos especialmente preferidos têm a fórmula:

Compostos ilustrativos específicos de acordo com o presente invento incluem:

cV-hidroxi-5-androsten-ona;

A'-fluoro-5-androsten-17-ona;

sf-fluoro-16 jS-metil-5-androsten-17-ona;

o(-metil-5-androsten-17-ona;

j3>-metil-5-androsten-17-ona;

^f-hidroxi-5 Af-androstan-lZ-ona;

<-fluoro-5*><-androstan-17-ona;

o<-f luoro-16 /S-metil-5 °< -androstan-17-ona;

(X -metil-5 ^-androstan-17-ona;

^-metil-5 ®r-androstan-17-ona.

Os esteroides do presente invento podem ser preparados de acordo com sínteses orgânicas convencionais. Os processos que se seguem são ilustrativos de alguns processos que podem ser utilizados para preparar o esteroide aqui incluido.

Por exemplo os esteroides do presente invento podem ser preparados a partir de esteroides que são conhecidos ou que se podem obter rápidamente, tais como a desidroepiandrosterona (DHEA), por métodos de alquilação, halogenação, hidroxilação ou por reacções de substituição conhecidas nesta técnica. Para estes produtos finais que contêm tanto um grupo alquilo como um halogénio ou um grupo hidroxi podem ser adicionados os vários substituintes ao esteroide em qualquer ordem, mas é preferido que o passo de alquilação preceda o passo de halogenação, hidroxilação ou substituição.

Na reacção a seguir, os reagentes indicados são colocados num meio de reacção, por exemplo, solventes que são inertes em relação aos produtos e reagentes e que dissolvem os reagentes. Os solventes incluem, mas não são limitados a, éteres, por exemplo, éter dietílico, tetra-hidrofurano, dioxano, piridina, etc. As reacções são realizadas a temperaturas e pressões suficientes para efectuar a substituição indicada nos anéis descritos aqui a seguir. A uma pressão de 1 atm, as temperaturas podem variar entre -80^0 e até temperaturas de refluxo.

ALQ.UILAQÃQ

ALQ.UILAÇÃO NO CARBONO-1

Um processo representativo para alquilação no carbono-1 e especificamente a síntese de loç-metil -desoxi-DHEA é indicado no Esquema I.

ESQUEMA 1

A bromação alílica (por exemplo com N-bromosuccinimida (NBS) da 17]3>-acetoxiandrosta-l,4-dien-5-on.a 8 seguida por tratamento com zinco proporciona a enona não conjugada 9. A alquilação com agentes de alquilação organometálicos, tais como cuprato de litiodimetilo, proporciona a 1 «Y-metil-cetona 10a. Neste estádio o grupo ceto de 10a pode ser convertido em metileno por meio de uma redução Wolff-Kishner ou por uma sua modificação Huang-Minlon. Estas condições de reacção vigorosas resultam em hidrólise do acetato resultante no carbono-17, proporcionando desse modo o derivado hidroxi desoxi, 17 β-hidroxi-l- ^-metil-5-androsteno. 0 derivado desoxi pode ser convertido no produto final por oxidação com um agente de oxidação, tal como trióxido de crómio em piridina (11).

ALQUILAÇÃO NO CARBONO-2

Os processos que se seguem são ilustrativos para alquilação no carbono-2 e sao ilustrados figurativamente no Esquema 2 que se segue.

Ο)

A alquilação de testosterona (I) com um agente de alquilação, tal como iodeto de metilo, na presença de uma base forte, tal como t-BuOK, t-pentóxido de sódio, di-isopropilameto de litio (LDA), NaNH₂, Et₂Ni, n-butil-lítio, etc., dá origem a uma mistura de 2oc- e 2β-alquil-17-^-hidroxi-4-androsten-3-ona (2 e 3). 0 tratamento da mistura com uma base forte, tal como metóxido de sódio em metanol, epimeriza o alquilo 2 ^-axial na configuração 2 (^-equatorial. (2). A acetilação de 2 com um agente de acetilação, tal como anidrido acético (Ac₂0) e ácido p-toluenossulfónico (p-TSA) em tolueno proporciona o 3,17-diacetato de 2 ^-alquil-5,5-androstadieno. (4) 0 Tratamento do diacetato (4) com boro-hidreto de sódio em etanol a 9% proporciona o 17-acetato de 2 «Y-metil-3 ^S-hidroxi-5-androsteno (5)· A oxidação de 5 com um agente de oxidação, por exemplo, reagente de Jones, óxido crómico em piridina, etc., proporciona a cetona (6). 0 grupo ceto de 6 é convertido no grupo metileno por meio da redução Wolff-Kishner ou por meio da sua modificação Huang-Minlon. A hidrólise deste processo seguida por oxidação com um agente de oxidação, tal como trióxido de crómio, dá origem à 17-eetona (7) correspondente.

Alternativamente, 7. ροό-θ ser formado a partir de 5, por uma via diferente, tal como é indicado no Esquema 2A. _5 θ feito reagir com O-fenilenofosforocloridito (OPPC) para produzir o 17-acetato de c^-metil-õ-iodo-5-androsteno (8). A redução de 8 com metal zinco e ácido, seguindo-se hidrólise e oxidação com um agente de oxidação, tal como trióxidos de crómio, proporciona o produto final 7.

-19AIiQUILAQÃO NO CARBONO-4

Um processo para alquilação no carbono-4 e a síntese de 4 o^-metil-DHEA são indicados no Esquema 4.

ESQUEMA 4

No que se refere ao Esquema 4, a alquilação de testosterona la usando, por exemplo, t-butóxido de sódio e iodeto de metilo proporciona 4-metiltestosterona lb. A bromação alílica da 4-metiltestosterona usando N-bromosuccinimida em tetracloreto de carbono proporciona a 6 p>-bromo-4-metilandrost-4-en-17-ol“5-ona (2). A protecção do álcool C-l? usando um grupo protector padrão conhecido na técnica tal como o seu derivado t-butildimetil-sílilo proporciona .3. A redução da cetona em _5 usando, por exemplo, hidreto de alumínio e lítio, concomitante com migração da dupla ligação e perda de brometo, proporciona 4. A reacção de 4 com OPPC seguindo-se iodo e Zn/AcOH proporciona o produto desoxi A remoção do grupo protector e oxidação do álcool C-17 resultante proporciona a cetona em C-17 7.

ALQ.UILAQÃO NO CARBONO-6

Os esteroides podem ser alquilados no carbono-6 usando o método de U. Stache e W. Fritsch, Liebigs Analen 1966, 697, 204. Um processo para a alquilação é carbono-6 é como se segue:

3°<, 5-Cidosteroides tais como 3°r',5-ciclo-5^íV'-androstan-6,17-diona 17 cetal 1. ficam rapidamente disponíveis por solvólise dos 5-eno-3β -tosilatos e mesilatos esteroidais seguind-se oxidação do grupo hidroxilo C-6. A alquenilação de 1 pela reacção de Wittig, por exemplo, proporciona ô-metileno-Jaq 5-ciclo--5-o<-androstan-17-ona 17-cetal 2. 0 tratamento de 2 com ácido aquoso resulta na adição de água e na formação de 3β -hidroxi-6-metilandrost-5-en-17-ona, 3. 0 tratamento de 3 com OPPC/iodo se-22-

guido por zinco em ácido diluído, por exemplo, AcOH, proporciona o produto final 4.

AlQUILAÇÃO NO CARBONO-7

Um processo para alquilação no carbono-7 é como se segues

A alquilação de androsta-4,6-dien-3,17-diona 17 cetal 1. com brometo de magnésio e metilo na presença de um ácido de Lewis, tal como cloreto cuproso, realiza-se por meio de adição conjugada para proporcionar o 17-cetal da 7-'X-^metilandrost-5-en-3,17-diona 2. A bromação alílica de 2 usando N-bromosuccinimida em tetracloreto de carbono proporciona o 17-cetal da 6-^-bromo-7<¥'-metilandrost-4-en-3,17-diona A redução com hidreto de alumínio e lítio da cetona em 3, com concomitante migração da dupla ligação e perda do brometo deve proporcionar 4. Á desprotecção da cetona em 0-17 com ácido aquoso proporciona 3 ^-hidroxi-7-°('metil-androst-5-en-17-ona_} Podem ser sintetizados homólogos superiores usando o reagente de Grignard substituído isto é R=CH^, ^3^7’ ⁰ 7-/2-epímero pode ser sintetizado por tratamento de 2 com DDQ-(diclorodicianoquinona) para gerar outra olefina em 0-7. A redução catalítica desta olefina deve ocorrer a partir da face o<' do esteroide para proporcionar o esteroide 7/3 -metilo, isto é, 17-cetal da 7-β-metilandrost-5-en-3,17-diona. Seguindo a mesma sequência que foi atrás indicada obtem-se 3 jô-hidroxi-7^>-metilandrost-5-en-17-ona (5a). 0 derivado desoxi é preparado a partir de 5 ou 5a por reacções de substituição conhecidas nesta técnica, tal como por reacção de 5 ou 5a com 0-fenilenofósforocloridito e iodo, de acordo com o processo por Gorey and Anderson, em JOG, 32, 4160 (1967). 0 produto é então feito reagir com zinco em ácido, por exemplo, ácido acético, para proporcionar o derivado 7-metil-5-en-17-ona.

ALQUILAÇÃO NO CARBONO-11

Um processo para alquilação no carbono-11 é como se segue:

-25Devido à natureza impedida da cetona

C-ll, a redução selectiva da androst-5-en-3,ll,17-triona

1. com hidheto deve proporcionar o esteroide di-hidroxi em C-3, C-17 2a, R=H 0 qual é protegido, por exemplo, pelo

A adição de haleto de hidrogénio através da olefina C-5, tal como HC1, proporciona 5 Y-cloro-3 β,17 ^-di-hidroxiandrost-5-en-ll-ona, éter 5,17-bis-(dimetil-7-butilsilílico) _3. A alquilação com alquil-lítio, tal como metil-lítio, realiza-se a partir da face menos impedida para proporcionar 5-cloro-ll -metil-androstano-3 -11 p , 17 p> -triol, éter 3,17-bis(dimetil-t-butil-s£lilico) 4. A reacção de 4 com cloreto de tionil-piridina proporciona a desidratação do produto _5. A hidrogenação catalítica de .5 proporciona 0 produto llp-metilo 6. 0 tratamento do éter cloro silílico 6 com base seguido por fluoreto de tetrabutilamónio proporciona 11 -metil-5-androsten-3 ,17 [3-diol 7» A sililação selectiva proporciona 11 -metil-5-androsten-5,17-diol, éter

5-dimetil-t-butilsilílico 8_. A oxidação do álcool C-17 proporciona 9 e a desprotecção do alcool-3 proporciona 11-

Usando reacções de substituição e conversão tais como reacção do grupo hidroxi com OPPC, iodo e zinco em ácido diluído proporciona-se 0 produto final 11. ten-17-ona).

ALQUILAÇÃO NO CABB0N0-16

Um processo para alquilação 16 é como se segue:

A alquilação da 17-cetodimetil-hidrazona de éter 3-tetra-hidropiranílico de DHEA usando n-butil- i -lítio como base seguindo-se um haleto alquilo RX, proporcio-ina o esteroide 16o<-alquilado. A clivagem da hidrazona com í cloreto cuproso em tetra-hidrofurano aquoso levou à regeneração da cetona em C-17 θ a clivagem concomitante do éster tetra-hidropiranílico resulta na 16 JK-alquil-3-hidroxi-androst-5-en-17-ona (2). 2 é convertido em 3, por meio de processos conhecidos pelos especialistas nesta técnica, tal como por exemplo, por reacção de 2 com OPPCJ, depois com iodo, seguindo-se zinco em ácido.

HIDROXIBAÇÃO NO CARB0N0-16

Um processo para hidroxilação no carbono 16 é como se segue:

A halogenação da 3-desoxi DHEA com um agente de <-halogenação, tal como bromo, cloro, iodo, brometo cúprico em metanol, etc., proporciona a 16 -bromo DHEA 2, a qual é por sua vez hidrolisada com base aquosa em oxigénio para proporcionar o produto final.

HALOGENAQÃO NO CARB0N0-16

Um processo para halogenação no carbono-16 é como se segue:

A reacção de 16 ^-hidroxi-5-androsten-17-ona (1) com um agente de fluoração, tal como dietil(2-cloro-l,l,2-trifluoroetil)amina proporciona 16c<-fluoro-5-androsten-17-ona 2.

Altern.ativamen.te, 2 pode ser prepara- I do tratando uma enamida, por exemplo, a enamida com a fórmula com um agente de fluoração, tal como o fluoreto de perclorilo. A hidrólise do acetato de fluoro enamida com ácido aquoso dá origem a 4. 0 grupo J-hidroxi de 4 pode ser substituido com halogénio por reacções conhecidas nesta técnica, por exemplo, por reacção de 4 com 0PPC/I₂ para dar origem a J>. A redução de 5 com ácido na presença de um metal, tal como zinco em ácido acético, proporciona 2.

Finalmente, 2a pode ser sintetizado a partir do haleto correspondente preparado aqui a seguir em condições de reacção de Finkelstein usando agentes de fluorinação conhecidos nesta técnica, tais como AgF, HgF₂j ^F em N-metil pirrolidona ou tetrametileno-sulfona, etc.

A reacção de androst-5-en-17-ona 1, com brometo cúprico proporciona a 16 o(-bromo-androst-5-en-17-ona, 2cl· A reacção de 1L com cloreto cúprico e cloreto de lítio proporciona a 16 o<-cloro-androst-5-en-17-ona, 2b².

^E.R. Glazier J. Org. Chem. 1962, 27, 4-397

E.M. Kosover, et al., J. Org. Ghem., 1963, 28, 632

A reacção de 17-acetato de 17-hidroxiandrosta-5,16-dieno _1 com acetato mercúrico seguida por tratamento com iodeto de potássio proporcionou o «ac-iodeto em C-16 o qual hidrolisa com ácido para proporcionar 16 <V-iodoandrost-5-en-17-ona, 2d. A reacção de 2d com fluoreto de prata proporciona a 16o(-fluoroandrost-5-en-17-ona, 2a.

Além disso, a reacção de 2c com Nal/acetona durante a noite resulta numa mistura de 16 - e 16Ç> -I-androst-5-en-17-onas.

De um modo semelhante, usando os materiais de partida apropriados, pode também ser preparado o produto que se segue:

ρ metil-16 o< -f luoroandrost-5-en-17ona

AlCOXIDAÇÃO

Os grupos alcoxi são derivados dos álcoois correspondentes. 0 substituinte metoxi por exemplo é formado reagindo o álcool correspondente em cloreto de metileno com trifluoreto de boro e diazometano etéreo de acordo com o processo de Caserio, et al., JACS, 80, 2584 (1958). De um modo semelhante, o substituinte etoxi é formado por reacção do álcool correspondente em cloreto de metileno com trifluoreto de boro diazoetano etéreo, gerado in situ. Alternativamente, os substituintes alcoxi podem também ser adicionados ao anel esteroide por reacção do álcool em condições de reacção de Williamson com RX, onde X é um grupo separável orgânico tal como tosilato ou mesilato de haleto e E é alquilo inferior. Pode ser usado qualquer base utilizada normalmente para desprotonar um álcool, tal como hidreto de sódio, ameto de sódio, sódio, hidróxido de sódio, trietilamina ou disopropiletilamina. As temperaturas de reacção variam entre -7820 e a temperatura de refluxo. A reacção é realizada num solvente o qual vai dissolver ambos os reagentes e que é inerte tanto em relação a ambos os reagentes como em relação aos produtos. Os solventes incluem, mas não são limitados a, éter dietílico, tetra-hidrofurano, Ν,Ν-dimetilformamida, cloreto de metileno, etc.

Na síntese de Williamson, a cetona deve ser protegida com grupos protectores conhecidos nesta técnica. Exemplos de muitos dos grupos protectores possíveis que podem ser utilizados são encontrados em Protective Groups in Organic Synthesis, por T.W. Green, Jonh Wiley and Sons, 1981. Por exemplo, a cetona pode ser protegida sob a forma de etilenocetal.

HIDROGENAQÃO

Os derivados androstan-17-ona do presente invento podem também ser preparados usando vias sintéticas conhecidas nesta técnica. Por exemplo, a hidrogenação catalítica dos correspondentes derivados 5-androsten-17-ona usando agentes redutores tais como hidrogénio, paládio, platina ou níquel proporciona os vários derivados 5-androstan-17-ona. Alternativamente, o 16-halo e a 16-hidroxi-5-androstan-17-ona podem ser preparados substituindo o 5^-androsten-17-ona por 5-a-ndrostan-17-ona e seguindo os processos nas secções intituladas Hidroxilação no carbono-16 e Halogenação no carbono-16, discutidos supra.

A 5-ardrostan-17-ona pode ser por sua vez ser preparada a partir de hidrogenação catalítica da

3-desoxi-DHEA. Por sua vez os compostos 5-desoxi podem ser preparados a partir dos correspondentes compostos 3-hidroxi por meio de técnicas conhecidas nesta técnica. Por exemplo,

H₂/Pd

A DHEA dissolvida num solvente inerte, tal como o tetrahidrofurano foi feito reagir com O-fenileno-fosforcloroidito. 0 produto resultante foi feito reagir com iodo para formar o derivado 3-iodo o qual por sua vez é

feito reagir com um ácido de Lewis, tal como zinco em ácido acético para formar o correspondente composto 3-desoxi.

Os exemplos que se seguem ilustram ainda o invento:

EXEMPIO I

A. 16 o<-Fluoro-5~Androsten-17-ona

A uma solução de oxima (30,0 g) em 120 ml de piridina a 10^0 foram adicionados com agitação magnética 30,0 g de cloreto de p-acetamidobenzenossulfonilo. A solução foi agitada durante 2 horas mantendo-se entretanto a temperatura a 10² +, 2^0. A mistura da reacção amarelo alaranjado transparente foi adicionada a 1L de água gelada e a suspensão resultante côr de laranja, oleosa, foi extraí·

da com 500 ml de cloreto de metileno. A camada orgânica foi lavada com água, filtrada através de sulfato de sódio anidro, e concentrada até à secura. Varias adições de tolueno seguidas por secagem in vacuo serviram para remover a maior parte da piridina. 0 residuo côr de laranja, semi-cristalino foi sintetizado com 500 ml de cloreto de metileno. A fracção insolúvel foi separada por filtração, lavada com cloreto de metileno, e eliminada. Adicionou-se ao filtrado um volume igual de etanol. A concentração numa corrente de ar até aproximadamente 300 ml proporcionou

21,1 g de agulhas amarelas, p.f. 228-2302. A cristalização fraccionada dos líquidos mãe deu origem a 1,90 g adicionais, p.f. 227-2302. Produção = 23,0 g (76,7%); jL ^max 3320, 1530 I (NHCOCH^), 1732, 1240, 1030 cm^-1 (3 -acetato).

B. Reacção de Acetato de 17-acetamida-5,16-androstadien- | -3|β-ο1 com Fluoreto de Perclorilo em Piridina !

(Ver S. Nakanishi, J. Med. Chem. 7, 108 (1964))

359-49

Foi feito borbulhar fluoreto de perclorilo durante 4 minutos numa solução de enamida (7,50 g) em piridina (400 ml) a 0-5^s0. A mistura da reacção foi adicionada a 1.500 ml de água gelada e adicionou-se ácido clorídrico concentrado lentamente com agitação magnética até um pH 1-2. 0 precipitado incolor, cristalino foi separado por filtração e lavado cuidadosamente com água. A recristalização a partir de cloreto de metileno-iso-octano deu origem a 4,40 g de prismas amarelo claro, p.f. 165-169², Λ ^max3250, 1635 (NHCOCH^) 1735, 1240, 1030 cm¹ (acetato 3B). A cristalização fraccionada dos líquidos mãe deu origem a 0,52 g, adicionais, p.f. 162-165. Produção = 4,92 g (66%). 0 resíduo líquido mãe final (3,03 g) era suficientemente j puro para hidrólise acida afim de se obter a lõe^-fluoro-17-ona (ver C).

C. Hidrólise Ácida do Acetato de fluoroenamida para se ob- i ter 16-Fluoro-3-Hidroxi-5-androsten-17-ona I

306.41

A uma solução de acetato de fluoroenamida (4,20 g) em 150 ml de tetra-hidrofurano anidro e 150 ml de água adicionaram-se 15 ml de ácido clorídrico concentrado. A mistura foi submetida a refluxo durante 14 horas, sendo então dividida entre cloreto de metileno e água. A camada orgânica foi lavada com água, filtrada através de sulfato de sódio anidro, e concentrada até à secura. A cristalização a partir de acetona-iso-octano forneceu 3,16 g de agulhas finais, p.f. 145-147^ (produção de 96%), Ámax 3350 (hidroxilo), 1732 οπΤ^ (16-fluoro-17-ona).

D. Preparação de 3 A-Iodo-16^tV-Fluoro-5-Androsten-17-ona (Ver Corey and Anderson, JOC 32, 4160, 1967)

I

-Ύ1~

A uma solução de piridina (0,41 ml) e

I cloridite de 0-fenilenofósforo (0,6 ml) em THF anidro (10 j ml) a O² adicionaram-se 1,55 g (5 mmoles) da hidroxifluoro- j cetona em 10 ml de THF. Após agitação durante duas horas à temperatura ambiente, o cloreto de piridinio foi separado por filtração e lavado com THF. Após remoção do solvente in vacuo, o éster fosfito bruto foi dissolvido em 25 ml de cloreto de metileno e tratado com 1,27 g de iodo durante três horas à temperatura ambiente. A mistura da reacção foi lavada sucessivamente com 15 ml de hidróxido de sódio IN e água, filtrada através de sulfato de sódio anidro, e o produto foi cristalizado a partir de cloreto de metileno/metanol numa produção de 1,85 g (92,5%) p.f. I65-I672 (dec.) / max 1755 cm¹ (16-fluoro-17-ona).

E. Reacção da Iodofluorocetona com Zinco/Ácido Acético

-o

H

i

A uma solução de 3 -iodo-16 v-fluoro-5-androsten-17-ona (1310 mg, 3,28 mmoles) em 40 ml de ácido acético glacial adicionaram-se 2,62 g de poeira de zinco. A mistura foi agitada magnéticamente a 50-55² durante uma hora, sendo então dividida entre cloreto de metileno e água. A camada orgânica foi lavada com hidróxido de sódio diluido e água, filtrada através de sulfato de sódio anidro e concentrada até à secura. A cristalização a partir de cloreto de metileno-metanol deu origem a 630 mg de umas plaquetas incolores p.f. 167-169²· a cristalização fracciona da dos líquidos mãe deu origem a 140 mg adicionais, p.f. 165-167², elevando a produção para 770 mg (81,0%); jUmax 1752 cm^-^ (16-fluoro-17-ona).

EXEMPLO II

Preparação de 16.y Bromo-5-androsten-17-ona

Uma solução de 5~androsten-17-ona (10,88 g, 40 mmoles) em metanol (2L) foi submetida a refluxo com 26,8 g (120 mmoles) de CuB^ durante 17 horas. A mistura da reacção foi adicionada a 2L de água e a suspensão cristalina resultante foi agitada durante várias horas a 5²C. 0 produto foi separado por filtração, lavado com água e recristalizado a partir do metanol sob a forma de agulhas incolores: 7,95 g, p.f. 172-1742, 2,00 g, p.f. 165-1682. Cromatografia líquida de alta eficácia (HPLC) do líquido mãe usando acetato de etilo-n-hexano como eluente, proporcionou 0,58 g adicional de 16y-Brometo, elevando a produção para 10,55 g (75,0%). Obtiveram-se, adicionalmente, 800 mg (5,7%) de 16 -Bromo-5-androsten-17-ona, p.f. 149,5 a 152^Q. Obtiveram-se também 75 mg de 16, 16-dibromo-5-androsten-17-ona, p.f. 194-195²·

EXEMPLO III

Síntese de 16 yHidroxi-5-androsten-17-ona

CH

288.41

A uma solução de 16 o<-Bromo-5-androsten-17-ona (7,92 g, 20 mmoles) em piridina (300 ml) e água (64 ml) numa atmosfera de oxigénio adicionaram-se 36 ml (36 mmoles) de NaOH IN. Depois de agitar a mistura durante 15 minutos à temperatura ambiente sob 0₂, ela foi adiciona da e 1L de água gelada contendo 330 ml de HC1 concentrado. 0 precipitado cristalizado que se formou foi separado por filtração, lavado com água, e recristalizado a partir do metanol sob a forma de folhas pequenas (2,80 g) p.f. 168-172S. HPLC do líquido mãe sobre uma coluna de gel de síli ca usando álcool isopropílico-n-hexano como eluente forneceu 1,4 g adicionais de prismas amarelos claros, p.f. 170-1742. A produção total de 16 ol foi de 3,94 g (68,4%).

EXEMPLO IV

Preparação de 16 of-metil-5-androsten-17-ona, 16yS-metil-5-androsten-17-ona, e 16 (S-metil-16o<-fluoro-5-androsten-17-ona

Uma solução de 16-metil-3β-acetoxi-5,16-pregnadien-20-ona (3,70 g, 10 mmoles) foi submetida a refluxo numa mistura de etanol (100 ml) e piridina (10 ml) contendo 3,50 g (50 mmoles) de clorohidreto de hidroxilamina durante uma hora. A mistura da reacção foi adicionada a água e o produto bruto foi filtrado e lavado com água. Solução em cloreto de metileno, filtração através de sulfato de sódio anidro, e concentração até à secura in vacuo deu origem à oxima bruta.

II. Rearranjo de Beckmann de I.

tratamento da oxima bruta a partir de

5,70 g de 20-ona em 15 ml de piridina com 3,75 g de cloreto de p-acetamidobenzeno-sulfonilo foi realizado durante 2 horas a 10². A mistura da reacção foi adicionada a água gelada, fornecendo um sólido filtrável o qual foi lavado cuidadosamente com água. 0 produto seco foi acetato de 17-acetamido-16-metil-5,16-androstadien-3^>-ol (3), pesando 3,88 g.

III. Reacção de 3 com Fluoreto de Perclorilo/Piridina.

Uma solução de acetato de 16-metil enamida (1,94 g) em piridina (100 ml) foi tratada com PCIO^ durante 4 minutos tal como foi descrito no Exemplo IB. A mistura da reacção foi adicionada a água gelada e adicionou-se HC1 concentrado, frio até a mistura da reacção ter um pH 1. 0 precipitado resultante foi separado por filtração e lavado com água. 0 produto foi dissolvido em cloreto de metileno e filtrado através de sulfato de sódio anidro, proporcionando o acetato de fluoro-metil-enamida bruto (4).

IV. Preparação de 16 p-metil-16 °í-fluoro-3-hidroxi-5-androsten-17-ona (11).

Uma solução de (4) em tetra-hidrofurano (100 ml) e água (100 ml) foi submetida a refluxo em 10 ml de ácido clorídrico concentrado durante 14 horas. A mistura da reacção foi dividida entre cloreto de metileno e água e a camada orgânica foi filtrada através de sulfato de sódio anidro. A hidroximetil-fluoro-cetona bruta foi submetida a HPLC preparativa numa coluna de gel de sílica em álcool isopropílico/n-hexano. A cristalização do produto principal a partir do metanol deu origem a agulhas longas (420 mg, p.f. 177-180; 90 mg, p.f. 170-173). 0 resíduo de líquido mãe (350 mg) do produto cristalino foi utilizado no passo seguinte.

V. Preparação de 16-metil-16-fluoro-5-androsten-17-ona·

3-ol crú (4, 350 mg) do passo anterior foi adicionado em 5 ml de cloreto de metileno a 5 ml de cloreto de metileno contendo 90 jil de piridina e 130 jil de O-fenilenofosforocloridito a O^C. Depois de repousar durante 2 horas à temperatura ambiente o fosfito bruto foi tratado com 280 mg de iodo e a mistura resultante foi agitada magneticamente à temperatura ambiente durante 2 1/2 horas. A mistura da reacção foi lavada sucessivamente com NaOH IN (6 ml) e água (10 ml) filtrada através de sulfato de sódio e seca. A mistura 3-iodeto bruto (12) (140 mg) foi tratada em 2 ml de ácido acético com 300 mg de poeira de zinco durante 1 hora a 65-70-0· Após divisão da mistura da reacção entre cloreto de metileno e água, o produto bruto submetido a HPLC preparativa numa coluna de gel de sílica em acetato de etilo hexano. Um produto mais móvel, secundário cristalizou a partir de acetona aquosa sob a forma de plaquetas (12,5 mg), p.f. 122-123². 0 seu espectro infravermelho revelou ser consistente (estar de acordo) com uma es-44

trutura 16i\^z-metil-16^-fluoro-5-androsten-17-ona. 0 produto menos móvel, principal, cristalizou a partir do metanol sob a forma de agulhas (48,5 mg), p.f. 173-175²· 0 seu espectro infravermelho foi consistente (estava de acordo) com uma estrutura 16 ^-metil-16ò<-fluoro-5-androsten-17-ona (13).

VI. Preparação de 16-^ e 16β-metil-5-androsten-17-onas.

acetato de metil-enamida bruto (1,94 g) foi submetido a refluxo em 100 ml de THR e 100 ml de água com 10 ml de HC1 concentrado durante 3 V2 horas. Seguin do a técnica usual as hidroxi-metil-etonas brutas (5, e 6) foram analisadas como sendo os 3-acetatos. Em isooctano-acetato de etilo (21:4) existia uma mistura de aproximadamente 3:1 de produtos polar (Rf 0,17) e móvel (Rf 0,21), representando uma mistura das 16 o/-metil e 16^-metil-17-onas, respectivamente. A cristalização da mistura 3-hidroxi original deu origem a 425 mg de 16β-metil-5-androsten-17-ona pura (6), p.f. 168-1709. 0 resíduo de líquido mãe (660 mg) representou uma mistura de 16-Af e de 15β-metil-3-hidroxi-17-onas (J5 e 6). Uma solução desta mistura mais 6 ml de cloreto de metileno foram adicionados a 6 ml de cloreto de metileno contendo 180 p.1 de piridina e 260 jil de O-fenilenofosforocloridito a 0²C e a mistura permaneceu à temperatura ambiente durante 2 horas. Após a adição de iodo (560 mg) ao fosfito bruto, a reacção continuou durante 2 1/2 horas à temperatura ambiente. A mistura da reacção foi lavada com 10 ml de NaOH 1N e 10 ml de água. A mistura de iodeto (7. ^e87) foi submetida a HPLC preparativa numa coluna de gel de sílica em acetato de etilo hexano. 0 produto mais móvel, designado 16 <\-metil-3|^ -iodo-5-androsten-17-ona (?) cristalizou a partir do metanol sob a forma de agulhas (120 mg), p.f. 150-151, 5-· Xmax 1728 cm”¹ (16o<-metil-17-ona) (Ver Neef, et al., JOC 43, 4579, 1978).

-450 produto menos móvel, designado 16β-metil-3^>-iodo-5-androsten-17-ona (8) cristalizou sob a forma de agulhas (200 mg) a partir do metanol, p.f. 151-153, ^max 1734 cm”! (16 &-metil-17-ona de acordo com Neef)

tratamento de 16 '-Y-metil-3 ^-iodo-5-androsten-17-ona (7) (90 mg) em 2,5 ml de ácido acético com 180 mg de poeira de zinco foi realizado durante uma hora a 65-709. A cristalização do produto a partir da acetona aquosa deu origem a 40 mg de agulhas, p.f. 92-95-0- A análise infravermelha foi consistente com 16íV-metil-5-androsten-17-ona (9)· tratamento de 16yS-metil-3 p-iodo-5-androsten-17-ona (8, 200 mg) em 5 ml de ácido acético com 400 mg de zinco tal como na preparação 9 deu origem a 95 mg de plaquetas a partir do metanol, p.f. 102-103. A análise IV confirmou a estrutura 16 A-metil-5-androsten-17-ona (10).

EXEMPLO V

Preparação de 16 Bromo-5-androstan-17-ona

A. Método 1. Preparação de 3 -Iodo-5 °<'-Androstan-17-ona

Epiandrosterona (1,45 gma, 5 mmole) e ml de THF foram adicionados a 0,41 ml de piridina, 0,60 ml de O-Fenilenofosforo cloridito e 10 ml de THR a O^C. A mistura foi agitada durante duas horas à temperatura ambiente. Após separação por filtração do cloreto de piridínio pre cipitado, o solvente foi removido in vacuo, proporcionando o éster fosfito bruto. 0 resíduo foi tratado em 25 ml de cloreto de metileno com 1,27 gramas (5,0 mmole) de iodo, e

a mistura foi agitada à temperatura ambiente durante duas horas e meia. Lavagens sucessivas com 15 ml de NaOH IN e água seguidas por filtração da camada orgânica através de tiossulfato de sódio anidro proporcionaram o derivado -iodeto bruto. A cristalização a partir de metanol combinado com HPLC do líquido mãe proporcionaram um total de 0,82 gramas do produto atrás identificado, ponto de fusão 124-127^a. produtos derivados da desidrohalogenação significativos da reacção foram a 2-endrosteno-17-ona e a J-androsteno-17-ona.

Método 2. Preparação de 3^-Iodo-5<V-Androstan-17-on.a

A uma solução de 1,6 g de epiandrosterona em 12 ml de piridina adicionou-se 1,6 g de TaCl. A mistura permaneceu 13 horas à temperatura ambiente. Após a adição de água, 0 produto foi extraído com cloreto de metileno. A camada orgânica foi lavada com HC1 diluido frio, depois com água, proporcionando um tosilato semicristalino bruto. Este material foi submetido a refluxo em 100 ml de acetona contendo 10 gramas de iodeto de sódio durante 22 horas. A mistura da reacção foi dividida entre cloreto de metileno e água e o produto bruto foi cristalizado a partir do metanol, proporcionando 920 mg de prismas opacos de 3 (5 lodo-5- Y-androstan-17-ona, p.f. 147-150-C. A cromatografia de camada fina do material cristalino e 0 seu líquido mãe em iso-octano-acetato de etilo (22:3) revelou que o material cristalino era homogéneo. (Rf = 0,16).

material foi absorvido em U7 a 254 nm. (UV positivo).

líquido mãe consistia numa mistura ternária, sendo 0 produto cristalino o mais polar (Rf mais baixo). Foram também isolados um segundo componente UV positivo com um Rf semelhante (Rf = 0,20) como 0 3γ-iodeto e um terceiro componente mais móvel (UV negativo) com um Rf mais amplo (Rf = 0,25) como a mistura olefínica obtida no Método I.

B. Preparação de 5°^ androstan-17-ona

Método 1.

0,84 gramas de 5oq-iodoandrostano-17-ona em 25 ml de ácido acético foi aquecida com 1,68 gramas de poeira de zinco a 70-75- durante uma hora com agitação magnética. A mistura da reacção foi arrefecida, diluida com água e o precipitado cristalino dela resultante foi separado por filtração e lavado com água. 0 resíduo foi submetido à acção de cloreto de metileno e o produto foi cristalizado a partir de metanol aquoso sob a forma de plaquetas (480 mg) numa produção de 85,%· Ponto de fusão 121-121,%. Uma reacção semelhante de 5 ^-iodo-5^<3(-androstan-17-ona com zinco em ácido acético, proporcionou '-androstan-17-ona com produções comparáveis.

Método 2.

A uma solução de 2,5 g de 5^_androsteno-17-ona em 500 ml de etanol adicionaram-se 500 mg de Pd sobre C a 5% e a mistura foi exposta a uma atmosfera de hidrogénio mantendo-se a agitação durante 2,5 horas. 0 catalisador foi separado por filtração e o resíduo do filtrado tinha um espectro IV como o do material produzido em B, Método 1.

C. 16 <X -Bromo-5- o<-androstan-17-ona

2,5 gramas do produto da parte B em 450 ml de metanol foram submetidos a refluxo com 6,06 gramas (27,18 mmoles) de CuBr₂ durante 1? e 1/2 horas. Após a

adição de um volume igual de água, o precipitado cristalino foi separado por filtração e lavado com água. A cristalização a partir de cloreto de metileno/metanol deu origem a 2,03 gramas do brometo sob a forma de agulhas prismáticas incolores, ponto de fusão 194-19620 (produção de 63%).

Alternativamente, o produto atrás referido pode ser preparado por hidrogenação catalítica em paládio sobre carbono a 5% de 16 -Bromo-5-androsten-17-ona, de acordo com o processo em V B, Método 2 aqui atrás referido.

EXEMPLO VI

Preparação de 16 x -hidroxi-3 °<-androstan-17-OD-a

Uma solução de 16 °<-Bromo-5-androstan-17-ona (706 mg, 2 mmole) tal como foi preparada de acordo com o processo no Exemplo V, 60 ml de piridina e 16 ml de água foi tratada com 3,6 ml (3,6 mmoles) de hidróxido de sódio IN sob oxigénio. Após agitação magnética à temperatura ambiente durante 15 minutos numa atmosfera de oxigénio, a mistura da reacção amarela transparente resultante foi adicionada a água gelada contendo 66 ml de HC1 concentrado. 0 produto foi extraído com cloreto de metileno e cristalizado sob a forma de prismas grandes a partir de 375 mg de metanol, ponto de fusão 157-158-0·

EXEMPLO VII

Preparação de 16<y -fluoro-^c<-and.rostan-17-ona

Método I

A uma solução agitada de 500 mg de 16of -Bromo-5-androstan-17-ona, preparada de acordo com o proces so do Exemplo V, em 10 ml de DMSO adicionaram-se 500 mg de de 18-coroa-6-éter e 1.500 mg de KF. A solução foi aquecida a 85-90®. Após 6 horas, a mistura foi dividida entre cloreto de metileno e água e foi submetida a HPLC num sistema gradiente acetato de etilo-hexano. A cristalização a partir do metanol do componente mais móvel deu origem a 23 mg do material de partida (ponto de fusão 188-19020). A cristalização a partir do metanol do componente menos móvel deu origem a 41 mg de placas, cujo IV é consistente com o produto final.

Método 2.

250 mg de f luoro-5- <V-androstan-17-ona em 50 ml de etanol foram tratados com 50 mg de paládio sobre carvão a 5% e gás hidrogénio durante 2 1/2 horas. A mistura de reacção, tal como é indicado por IV, é compatível com 16 β -fluoro-5 ^<\^z-androstan-17-ona. Este produto bruto foi tratado com 5 ml de KOH metanólico IN durante uma hora. A mistura foi dividida entre cloreto de metileno e água e foi submetido a HPLC tal como foi atrás indicado. A cristalização do componente menos móvel a partir do metanol deu origem a 30 mg de 16ô/-fluoro~5o/-androstan-17-ona sob a forma de agulhas prismáticas, ponto de fusão 148-1502C.

Método 3A uma solução de 16 o<-fluoro-5 ^f-an-50-

drosteno-17-ona (1,100 mg) em etanol (220 ml) adicionaram-se 220 mg de Pd sobre carvão a 5%· A mistura foi agitada numa atmosfera de hidrogénio durante 1 hora à temperatura ambiente. 0 catalisador foi separado por filtração e lavado com metanol. 0 resíduo a partir do filtrado combinado foi recristalizado a partir do metanol, dando origem a 770 mg, p.f. 146-148,5-C. 0 espectro IV foi idêntico ao da 16 o<-fluoro-5- androstan-17-ona preparada tal como foi aqui atrás referido.

EXEMPLO VIII

CH_ol

-3—*

16,16-Dimetil-5-Androsten-17-on-a (20) e 16,16-Dimetil-5^-Androstan-17-ona (21) tratamento de J-desoxi^^V-androstan-17-ona em álcool t-butílico e t-butóxido de potássio com excesso de iodeto de metilo dá origem a dimetil-17-onas.

De um modo semelhante, o tratamento com 3-desoxi-5-aHdrosten-17-ona com excesso de iodeto de metilo de acordo com o processo discutido aqui atrás dá origem às correspondentes gem-dimetil-17-onas (20).

EXEMPLO IX

<κ- e 16 ^-Metoxi-5-Androsten-17-onas (14,16) e of- e 16 p>-Metoxi-5 °<-Androstan-17-onas (15,17)

Tratamento dos 16ou 16 ^-ol apropriados em cloreto de metileno com trifluoreto de boro e diazometano etéreo pelo processo de Caserio, et al., JACS 80, 2584, 1958, proporciona os correspondentes éteres metálicos.

Mais especificamente, lôov-hidroxi-ó⁰^-androstan-17-ona (1 mmol, 290 mg) em 100 ml de cloreto de metileno e 1 ml de diluição 1:40 de eterato-BF^ destilado recentemente em cloreto de metileno foi tratada com excesso de diazometano etéreo até a cor amarela persistir. A mistura da reacção foi lavada com hidróxido de sódio diluído, e a água foi filtrada através de MgSO^ anidro. A mistura da reacção bruta foi submetida a HPLC em coluna de gel de sílica; a cromatografia foi realizada num gradiente 0-20% de acetato de etilo/hexano em 10' num ritmo de corrente de 10 ml/min. 0 produto mais importante tinha um tempo de retenção de 7,5 min e foi recolhido. 0 solvente foi separado por evaporação e seco. 0 produto bruto foi cristalizado a partir do metanol, produzindo agulhas incolores, p.f. 87-8820. A análise infravermelha revelou uma banda éter a 1200 cm^-1 e a ausência de uma banda OH.

EXEMPLO X

A. 16-Hidroximetileu.o-5-An.drosten-17-ona (5) e

16-Hidroximetileno-5 -Androsten-17-ona (6)

A formilação das 17-onas pelo processo de C.H. Robinson, et al., J. Org. Gh.em. 28, 975, 1963, dá origem a 16-hidroxi-metilenos.

A hidrogenação catalítica quer de 5 quer de 6 dá origem a h.idroximetil-17-ona £.

B. 16,16-Difluoro-5-Androsten-17-ona (8) e 16,16-Difluoro-5 <*-androstan-17-oP-a (9)

A fluorinação das hidroximetileno-17

-54-onas num sistema álcool t-butilico/t-butóxido de potássio (seis moles de butóxido por mole de esteroide/com fluoreto de perclorilo (J00 28, 975, 1965) proporciona os gem-difluoretos 8 e 9 após HPLC em gel de sílica.

EXEMPLO XI

Preparação de 16-S>-isopropil-5-androsten-17-ona (Ver W.C.J. Ross, J. Chem. Soc., p-25, 1945)

Uma solução de 5-androsten-17-ona (2,0 g) em acetona (10 ml) e metanol (10 ml) foi submetida a refluxo durante uma hora com 2,0 g de hidróxido de potássio. A mistura da reacção foi arrefecida e diluída com água. A extracção do produto com cloreto de metileno e a cristalização a partir do metanol proporcionou 1,48 g (64,%) de agulhas, p.f. 185-185². A análise infravermelha revelou

uma banda carbonilo a 1701 cm”^· e uma banda olefínica forte a 1628 cm“\ formando desse modo 10 o-isopropil-5-androsten-17-ona. A 16-isopropilidinoandrosteno-17-ona formado atrás (2 mml, 624 mg) foi hidrogenada com hidrogénio em paládio sobre carvão a 5% em etano em Paar Shaker a 40 psi (libras por polegada quadrada) durante 10 min. 0 catalisador foi separado por filtração. A cristalização directa da mistura deu origem a 390 mg de agulhas longas (97,5~98-C)· líquido mãe foi submetido a cromatografia flash em gel de sílica e foi eluído com acetato

I de etilo a 8%-hexano. A produção foi de 20 mg, p.f. 98- I -992.

Assim, a produção total foi de 460 mg (73,2% de rendimento). 0 IV revelou que 0 anel D carbonilo foi não-conjugado e deu origem a uma faixa em 1751 cm^-1. ¹

Os compostos que se seguem foram ensa- j íos biológicos que se seguem. Estes compostos serão designados nos quadros que se seguem pela designação sob as formulas químicas:

Inibição de G6PDH

Os compostos indicados a seguir são analisados como inibidores da actividade G6PDH, das glândulas supra-renais, bovina, purificada como um vaticinador da acção preventiva em relação ao cancro. 0 ensaio para testar a inibição produzida por GôPDH, das glandulas supra-renais, bovina, purificada e executado de acordo com o processo por Oertell, G.W. and Rebelein, I. em Biochem. Biophys. Acta, 184, 459-460 (1969)· Os resultados são indicados a seguir no Quadro I:

TESTE DE INIBIÇÃO POR G6PDH QUADRO 1

Compostos Ensaiados

10^-¾

10^-¾_______ _

10^-¾

10^-¾_______

10^-¾

10^-¾_______

710

5-6

M

10^-¾_______

10^-¾

610

10^-¾

710

Inibição Percentual

53,57

17, 17

77, 77

30, 36, 29, 38

79, 83

75, 77

94, 94, 92, 91

72, 72 ________17,25

96, 96, 96, 96

82, 84 ________36,36

54,52

33, 31 _______20, 24______

44, 47

13, 20

-58QUADRO 1 (Cont.)

Compostos ensaiados

Inibição Percentual

82, 82

66, 69

28, 34

58, 58

28, 29

47, 47

23, 19

Actividade Estrogénica e Anti-Estrogénica

Ratazanas fêmeas CD, com 26-27 dias de 3 dias com em propileapenas proe os úte idade, foram injectadas subcutâneamente durante um dos compostos do presente invento a 60 mg/kg no glicol. Os controlos (testemunhas) receberam pileno glicol. No 42 dia, os ratos foram mortos ros foram dissecados e pesados. Os resultados são indicados nos Quadros que se seguem:

-59ACTIVIDADE DE ANTI-ESTROGÉNICA DO ÁCIDO

ESTROGÉNICO

Composto

QUADRO 2

Peso Uterino Médio +. D.P.

(mg/100 g peso corporal)

Controlo (60 mg/kg) (60 mg/kg)

2,02 + 0,28 (n=6)

4,1? + 0,48 (n=6)*

2,15 + 0,17 (n=6) *Significativamente maior do que o grupo de controlo, p< 0,001

ACTIVIDADE ESTROGÉNICA E ANTI-ESTROGÉNICA

QUADRO 2a composto 5 foi ensaiado quanto à sua acção estrogénica e anti-estrogénica:

Composto

Controlo (60 mg/kg) (60 mg/kg)

Peso Uterino líédio + D.P.

1.95 + 0,22 (n=6)

3.95 + 0,71 (n=5)*

1,93 + 0,29 (n=5) *Significativamente maior do que o grupo de controlo, p <0,001

INFORMAÇAO DE FUNDO SOBRE AS ACÇÕES DE DMBA E TPA

Podem ser induzidos tumores da pele no ratinho quer por aplicação semanal de um agente carcinogénico tal como 7,12-dimetilbenzilantraceno (DMBA), quer alternativamente, por meio de uma única dose limiar de agente carcinogénico seguindo-se duas aplicações semanais do promotor do tumor 13-acetato de tetradecanoilforbol (TPA). A fim de exercer o seu efeito carcinogénico, DMBA deve ser metabolizado por uma oxidase de função mista dependente de NADPH em relação a produtos intermediários quimicamente reactivos que se ligam covalentemente ao DNA e produzem mutações que conduzem à transformação maligna. A desidroepiandrosterona (DHEA) e a 3B-metilandrost-5-en-17-ona inibem a formação de papiloma em ratinhos iniciada por 7,12-dimetilbenz(a)antraceno (DMBA) e promovida por 13-acetato de 12-0-tetradecanoilforbol (TPA), 0 arc ino gene sis, 5, 464-466 e DHEA inibe o grau de ligação de ³H-DMBA aplicado tópicamente a DNA de pele de ratinho A/J (Quadro 4). 0 androgénio potente, testosterona, não apresenta efeito inibidor. Este efeito de DHEA é muito provávelmente um resultado da inibição de G-6PDH e diminuição da quantidade intracelular de NADPH, o qual é um co-factor para a activação da oxidase de função mista de DMBA. A aplicação tópica de DHEA ou 5^-metilandrost-5-en-17-ona também inibe os papilomas e carcinomas produzidos por DMBA no modelo de carcinogenese completo (Pashko, L.L. Hard, G.C.; Rovito, R.J.; Williame, J.R.; Sobel, E.L.; e Schwartz, A.G-. (1985). Inibição de papilomas e carcinomas da pele induzidos por 7,12-dimetilbenz- (a)antraceno pela dehidroepiandrosterona e JB-metilandrost-5-en-17-ona em ratinhos, Câncer Res., 45, 164-166).

Os promotores de tumores, tais como TPA, estimulam a hiperplasia e a sintese do DNA quando aplicados à pele, e pensa-se que esta estimulação constitui um passo importante no desencadeamento da tumorigenese. Esta

estimulação do grau de síntese do DNA epidérmico pelo TPA pode ser demonstrada por um grau aumentado da incorporação de ^H-timidina na epiderme de um ratinho 20 horas após a aplicação de TPA. De novo, o tratamento tópico com DHEA vai abolir esta estimulação (Quadro 5)·

A inibição da estimulação por TPA da incorporação epidérmica de ^?H-timidina pode também resultar da inibição de G6PDH. A via pentose-fosfato proporciona tanto ribose-fosfato para a síntese de ribonucleotído como NADPH que é necessário tanto para a redução do ácido fólico em ácido tetrahidrofólico (requerido para a síntese de ribonucleotídeo e de timidilato) como para a actividade da redutase do ribonucleotídeo. Contudo, DHEA, numa variação entre -5 -4 ⁷ e 10 M, retarda o crescimento de muitas diferentes linhas celulares na cultura. Uma estirpe celular HeLa, TCRC-2, é particularmente sensível à inibição do crescimento induzida por DHEA. Esta inibição do crescimento pode ser quase completamente ultrapassada adicionando ao meio de cultura uma mistura dos desoxinucleotídeos de adenina, guanina, citosina, e timina, o que está de acordo com a hipótese da DHEA inibir o crescimento celular através da inibição de G6PDH (Dworkin, C.R., Gorman, S.D., Pashko, L.L., Cristofallo, V.J. and Schwartz, A.G. (1986). Inibição do crescimento das células HeLa e Wi-38 pela desidroepiandrosterona e a sua inversão pelos ribo- e desoxiribonucleosídeos, Life Sei., 38, 1451-1457).

RESTRIÇÃO ALIMENTAR E PREVENÇÃO DG CANCRO

Sabe-se desde há 45 anos que a redução da ingestão de alimentos pelos ratinhos de laboratório inibe o desenvolvimento de um amplo espectro de tumores espontâneos e induzidos quimicamente (Tannenbaum, A. (1940); The Initiation and Growth of Tumors. Introduction. I. Effects

of Underfeeding, (Inicio e Crescimento de Tumores. Introdução: I. Efeitos da Sub-alimentação,) Am. J. Câncer, 38, 335-350), mas o mecanismo deste efeito não é claro. Parece que a restrição alimentar em ratinhos durante duas semanas inibe tanto a ligação de H-DMBA ao DNA da pele como a es~ z 3 timulação pelo TPA da incorporação epidérmica de H-DMBA (Quadros 4 e 6) num grau comparável ao observado com uma aplicação de 400 jig de DHEA. Ambos estes efeitos da restrição alimentar resultam muito provavelmente de uma depressão da actividade de G6PDH (Quadro 7). Assim a inibição da actividade de G6PDH pode constituir um componente importante dos efeitos preventivos quer da restrição alimentar quer do tratamento com DHEA.

A administração de DHEA numa dose diária de aproximadamente 400 mg/kg em experiências a longo prazo revelou inibir o desenvolvimento de tumores da mama, pulmão, e colon. Esta dose de DHEA, quando administrada repetidamente durante um período de algumas semanas, produz também um efeito anti-peso. Contudo, uma única administração de DHEA a 400 mg/kg a ratinhos não inibe a ligação de ³H-DMBA ao DNA da pele e não inibe a estimulação pelo TPA da incorporação epidérmica de ³H-tidina num grau comparável ao produzido quer pela restrição alimentar quer por uma aplicação tópica de 400 jig de DHEA. (Quadro 9 vs Quadro 5 e Quadro 6). Contudo, o tratamento de ratinhos durante quatro semanas com 400 mg/kg de DHEA inibe e ligação de ³H-DMBA ao DNA da pele, mas este regime terapêutico com DHEA também produz um efeito anti-peso, o qual é devido tanto à redução da ingestão alimentar como à diminuição na eficiência da utilização dos alimentos. Assim o efeito preventivo do cancro pelo DHEA pode resultar indirectamente da sua acção anti-peso e não de um efeito directo do DHEA sobre as células alvo.

Contudo, os compostos 2, 3, 4 e 5 quan-65-

do administrados oralmente a ratinhos, inibem a ligaçao de H-DMBA ao DNA da pele e a estimulação pelo TPA da incorporação de ³H-timidina (Quadros 3, 8 e 9) até um grau comparável ao produzido pela restrição alimentar em doses bastantes inferiores a 400 mg/kg, enquanto DHEA é inactivo. Nestas doses os novos compostos não produzem um efeito anti-peso com a possível excepção do composto 5 que parece ser várias vezes mais activo do que DHEA como um agente anti-obesidade. Assim, as actividades preventivas do cancro dos presentes compostos são mais potentes do que a actividade preventiva do cancro da DHEA, e além disso, a actividade preventiva do cancro dos presentes novos esteroides foi dissociada do efeito anti-obesidade.

QUADRO 5

EFEITO DE COMPOSTOS 4 e 5 ADMINISTRADOS NA

ESTIMULAÇÃO PELO TPA DA INCORPORAÇÃO DE ³H-TIMIDINA NA EPIDERME DE RATINHO

TRATAMENTO ACTIVIDADE ESPECÍFICA (cpm/jig DNA)

Nenhum esteroide	70,2 + 2,5 (n=2)
Nenhum esteroide mais TPA	154 + 16 (n=2)
TPA mais cpd 4 (100 mg/kg)	8,1 + 4,1 (n=5)
TPA mais cpd 4 (50 mg/kg)	55,2 + 1,8 (n=5)
TPA mais cpd 4 (25 mg/kg)	77,4 + 10,4 (n=5)
TPA mais cpd 5 (100 mg/kg)	7,2 + 5,8 (n=5)
TPA mais cpd 5 (50 mg/kg)	25,6 + 4,0 (n=5)
TPA mais cpd 5 (25 mg/kg)	66,1 + 9,8 (n=5)

ll I! ί ί

Ratinhos ICR foram intubados oralmente com esteroide suspenso em óleo de sésamo (0,5 ml/ratinho) na dose indicada. Aos ratinhos que não receberam esteroide administrou-se apenas óleo de sésamo. Uma hora mais tarde os ratinhos receberam uma aplicação tópica de TPA e z horas mais tarde o grau de incorporação de H-timidina na epiderme foi determinado tal como foi descrito em Pashko, L.L., Schwartz, A.G., Abou-Gharbia, M., and Swern, D. (1981), Inhibition of DNA synthesis in mouse epidermis and | breast epithelium by dehydroepiandrosterone and related steroids, Carcinogenesis, 2, 717~721.

QUADRO 4

EFEITO DO TRATAMENTO OOM ESTEROIDE OU DUAS SEMANAS DE RESTRIÇÃO ALIMENTAR SOBRE A LIGAÇÃO DE (¾) DMBA AO DNA (ADN) DA PELE

TRATAMENTO ACTIVIDADE ESPECÍFICA (cpm/ju.g DNA)

Alimento ad libitum 116 +.5,2

Alimento ad libitum mais DHEA 66 +. 13

Alimento ad libitum mais testosteronal64 + 8,4

Alimento restringido (duas semanas) 57 + 14

A ligação de /~³H_7dMBA ao DNA da pele do ratinho foi determinada tal como foi descrito em Pashko,

L.L., and Schwartz, A.G. (1983), Effect of food restriction, dehydroepiandrosterone, or obesity on the binding of H-7,12-dimetilbenz(a)antraceno to mouse skin DNA, (Efeito da restrição alimentar deshidroepiandrosterona, ou obesidade sobre a ligação de ³H-7,12-dimetilbenz(a)antraceno ao DNA da pele do ratinho,) J. Qerontol., 38, 8-12. Os valores são média + DP para 3 determinações individuais, com tecido recolhido de 2 ratinhos usados para cada determinação. DHEA ou testosterona (400 p.g em 0,2 ml de acetona) foi aplicada à pele uma hora antes de /“^HJTDMBA. 0 peso médio dos ratinhos com alimentação restringida foi de 18,5 +, 1,0 gm, ί n=6, alimentado ad libitum, 27,4 _+ 1,0 gm, n=6, alimentado ad libitum tratado com DHEA, 28,2 _+ 0,9 gm, n=6, e alimentado ad libitum tratado com testosterona, 28,3 +, 0,9 gm, n=6, a seguir a duas semanas de alimentação. 0 alimento médio consumido foi, em gm/ratinho/dia, 2,2, 3,8, 3,8 e 4,0 para os grupos com alimento restringido, alimento ad libitum, alimento ad libitum mais DHEA, e alimento ad libitum mais testosterona, respectivamente.

*Significativamente menos que os ratinhos com alimento ad libitum, p ^0,01;

ajz hje

Sigmficativamente maior do que os ratinhos com alimento ad libitum, p <0,01.

Q.UADRO 5

INIBIÇÃO DA ESTIMULAÇÃO PELO TPA DA INCORPORAÇÃO DE ³H-TIMIDINA NA EPIDERME POR DHEA

TRATAMENTO	ACTIVIDADE ESPECÍFICA (cpm/jig DNA)
Nenhum esteroide	66 + 1,8
Nenhum esteroide mais TPA	174 + 35
TPA mais DHEA (100 pg)	52 + 5,8
TPA mais DHEA (400 pg)	22 + 6,5
TPA mais testosterona (100 pg)	128 + 13
TPA mais testosterona (400 pg)	142 + 5,9

A incorporação de H-timidma no DNA (ADN) epidérmico de ratinho A/J foi determinada tal como foi descrito por Pashko, L.L., Schwartz, A.G., Abou-Gharbia, M. and Swern, D. (1981), Inhibition of DNA synthesis in mouse epidermis and breast epithelium by dehydroepiandrosterone and related steroids, Carcinogenesis, _2, 717“ -721. Os valores são média +. DP para 5 ratinhos tratados separadamente em cada grupo 20 horas após a aplicação de TPA. DHEA ou testosterona foi adicionada tópicamente em 0,2 ml de acetona uma hora antes da adição de TPA.

QUADRO 6

EFEITO DE RESTRIÇÃO ALIMENTAR DUAS SEMANAS

SOBRE A ESTIMULAÇÃO PELO TPA DA INCORPORA“I--------------- z -------------------ÇAO EPIDÉRMICA DE ⁷H-TIMIDINA

TRATAMENTO	ACTIVIDADE ESPECIFICA (cpm/pg DNA)
Alimento ad libitum	54+0,8
Alimento ad libitum	193 + 25
Alimento restringido	(duas sema-
nas) mais TPA	34 + 6,8

A incorporação de H-timidina no DNA (ADN) epidérmico do ratinho A/J foi determinada tal como foi descrito no Quadro 5· Os valores são média + DP para 5 ratinhos tratados separadamente em cada grupo. Os pesos médios dos ratinhos com alimentação restringida foi 18,3 +, ,6 gm n=3, e os dos alimentos ad libitum foi de 26,7 +. 1,4, n=6, a seguir a duas semanas de alimentação. O alimento médio consumido foi 2,4 g/ratinho/dia para os ratinhos com restrição alimentar e 4,9 g/ratinho/dia para os ratinhos com alimento ad libitum.

QUADRO 7

EFEITO DE DUAS SEMANAS DE RESTRIÇÃO APIMENTAR

SOBRE A ACTIVIDADE EPIDÉRMICA DO G6PDH

TRATAMENTO	ACTIVIDADE ESPECIFICA (nmoles NADPH/mg proteína min)
Alimento ad’ libitum	43,4 +_ 6,0
Alimento restringido (duas
semanas)	18,1 + 5,1

A actividade epidérmica de G6PDH foi determinada tal como foi descrito em Ziboh, V.A., Dreize,

M.A. and Hsia, S.L. (1970), Inhibition of lipid synthesis and glucose-6-phosphate dehydrogenase in rat skin by dehydroepiandrosterone, J. Lipid Res., 11, 346-351 and Glock, G.E. and McClean, P. (1953)· Estudos posteriores sobre as propriedades da deshidrogenase glucose-6-fosfato e da desidrogenase 6-fosfogliconato do fígado de ratazana, Biochem. _J., 55, 400-408. Os valores são média +. SD para três determinações separadas, com tecido epidérmico recolhido de 4 ratinhos usados para determinação. 0 peso médio dos ratinhos com alimento restringido era de 18,4 +_ 0,8 g, n=12. 0 alimento médio consumido foi de 2,4 g/ratinho/dia para os ratinhos com alimento restringido e 3·9 g/ratinho/dia para os ratinhos com.alimento restringido e 3,9 g/ratinho/dia para os ratinhos com alimento ad libitum.

QUADRO 8

EFEITO LO COMPOSTO 2 ADMINISTRADO ORALMENTE

SOBRE A ESTIMULAÇÃO PELO TPA DA INCORPORAÇÃO DA ^H-TIMIDINA NA EPIDERME DO RATINHO

TRATAMENTO

ACTIVIDADE ESPECIFICA (cpm/^g DNA)

TPA mais comp 2 (200 mg/kg, p.o.)

TPA mais comp 2 (150 mg/kg, p.o.)

TPA mais comp 2 (75 mg/kg, p.o.)

14,3 + 1,7 (n=3)

14,0 + 1,1 (n=3)

15,9 + 2,4 (n=3)

As condições experimentais são iguais às do Quadro 3.

QUADRO 9

EFEITO DO DHEA ADMINISTRADO ORALMENTE (COMPOSTO 1) OU COMPOSTO 3 NA ESTIMULAÇÃO PELO TPA

DA INCORPORAÇÃO DE ^H-TIMIDINA NA EPIDERME DO RATINHO

TRATAMENTO	ACTIVIDADE ESPECIFICA (cpm/pg DNA)
Nenhum esteroide	55,1 + 1,6 (n=3)
Nenhum esteroide mais TPA	118 +10,5 (n=3)
TPA mais DHEA (400 mg/kg)	50,9 + 3,2 (n=5)
TPA mais comp. 3 (100 mg/kg)	15,0 + 6,3 (n=3)
TPA mais comp. 3 (50 mg/kg)	36,2 + 1,4 (n=3)
TPA mais comp. 3 (25 mg/kg)	47,9 + 2,0 (n=3)

As condições experimentais são iguais às do Quadro 3.

-70QUADRO 10

ΑΝΤΙ-OBESIDADE DO COMPOSTO 2 E DO COMPOSTO 1 DHEA

Ratinhos machos A/J (com 5 semanas de idade) foram obtidos a partir do Jackson Laboratory e foram alojados em gaiolas de policarbonato (6 ratinhos/gaiola) em instalações animais mantidas a 24 _+ l^C com 12 horas de luz e 12 horas de escuridão cada dia. Uma semana após a chegada, os ratinhos foram submetidos a uma dieta contendo quer DHEA (Composto 1), Composto 2, ou sem esteroide. Os animais foram pesados semanalmente.

Semana Controlo(nenhum esteroide) Comp.l (0,4-5%)

Comp2 (0,4-5%) peso semanal médio em gramas + D.P. (n=6)

0	23 + 1,5
1	25,0	+ 1,6
2	27,0	+ 1,6
3	27,3	+ 1,6
4	27,5	+ 1,9

25,0 + 1,5

22,8 + 1,5

19,0 + 1,5

21,5 +. 1,1

21,4 + 1,2

25,3 + 1,6

21,1 + 1,4

21,9 + 1,0

23,6 + 1,5

23,5 + 1,5

QUADRO 1OA

Ratinhos fêmeas Balb/c (com 8 semanas de idade) foram obtidos a partir de Jackson Laboratory e foram alojados em gaiolas de policarbonato (6 ratinhos/gaiola) em instalações animais mantidas a 24 + 12C com 12 horas de luz e 12 horas de escuridão cada dia. Uma semana após a chegada, os ratinhos foram submetidos a uma dieta contendo quer DHEA (Composto 1), Composto 3, ou sem esteroide. Os animais foram pesados semanalmente.

Semana (Controlo(nenhum esteroide) Comp.l (0,25%)Comp.3 (0,25%)

peso semanal médio em gramas + D.P. (n=6)

0 17,5+1,4 17,5+1,5 17,4+0,6 1 19,9 + 1,2 20,0 + 0,9 16,9 + 1,0 2 20,6 + 1,0 20,6 + 0,9 17,8 + 0,8 3 21,8 + 0,8 21,3 + 1,3 18,0 + 1,3

-72INDUQÃ0 DE HEPATOMEGALIA E DE CATALASE DO FIGADO POR DHEA: FALTA DO EFEITO A SEGUIR AO TRATAMENTO COM COMPS 3 OU 5

Para além da inexistência de efeitos secundários de DHEA, verificou-se que os compostos 3, 4 e 5 não apresentavam um outro efeito secundário produzido pelo tratamento com DHEA. DHEA, quando administrada oralmente a ratinhos e a ratos numa dose variando entre 0,2% e 0,6%, produz aumento do tamanho do figado. Verifica-se um aumento de tamanho semelhante a seguir ao tratamento com a droga clofibrato que se pensa ser devido à proliferação de peroxisoma no figado. A proliferação de peroxisoma resulta em níveis aumentados de catalase no figado, e nos ratinhos e ratos esta condição pode faveorecer a formação de um tumor do figado. Verificamos que após três semanas de tratamento oral de ratinhos (0,25% da dieta) com DHEA, clofibrato, comps. 3, 4 ou 5, tanto DHEA como clofibrato fizeram aumentar o peso do figado e estimularam a actividade da catalase, enquanto que os compostos 3, 4 ou 5 &ão têm efeito sobre o peso do figado ou sobre a actividade da catalase.

aumento do tamanho do figado parece ser uma resposta característica nos animais de laboratório e no homem, exposto a uma série de drogas ou de agentes xenobioticos (Reddy, J.K. et al., Hepatic and Renal Effects of Peroxisome Proliferators: Biological Implications, Annals

N.Y. Acad. Sei. (1982), 386 81-110). São reconhecidos correntemente dois tipos de hepatomegalia:

1. As que ocorrem como resposta a drogas (fenobarbital, DDT, etc.) que estimulam a proliferação do reticulo endoplasmico liso nas células hepáticas e induzem os enzimas de metabolização microsomicos da droga, e 2. As que ocorrem como resposta à administração de proliferadores de peroxisoma. Proliferadores típicos de peroxisoma são várias drogas hipolipidémicas, tais como clofibrato, e o plastificador, di(2-73-

-etil-hexil)ftalato. 0 tratamento mantido (prolongado) de ratinhos ou de ratos com proliferadores de peroxisoma pode levar a um carcinoma hepatocelular.

nosso laboratório e outros (Cleary, M.P. Fox, N., Lazin, B., and Billheimer, J.T. Nutr. Res. _5, 1247-1257, 1985, A comparison of the Effects of Dehydroepiandrosterone Treatment to Ad Libitum and Pair Feeding in the Obese Zucker Rat) verificaram que o tratamento de ratazanas ou ratinhos com doses terapêuticas de DHEA (0,2% a 0,6% na dieta)produz hepatomegalia. Moore, et al. (Carcinogenesis 7, 311-316, Modifyng Influence of Dehydroepiandrosterone on the Development of Dihydroxi-di-n-propilnitrosamine-initiated Lesions in the Thyroid, Lung, and Liver of F344 Rats) verificaram que o tratamento de ratazanas com 0,6% de DHEA durante 20-22 semanas a seguir a 4 injecções do agente carcinogénico dihidroxi-di-n-propilnitrosamina inibiu a formação de focos pré-malignos enzimáticamente positivos no fígado. Contudo, também verificaram que DHEA promovia o desenvolvimento de lesões basófilas do figado que eram enzimáticamente negativas. Estas últimas lesões foram também produzidas por tratamento com ftalato de dietil-hexilo, e os autores sugeriram que DHEA pode ser activo como proliferador de peroxisoma.

Os peroxisomas contêm níveis elevados de catalase, e o aumento da actividade específica da catalase do fígado é caracteristico da hepatomegalia observada com tratamento de proliferadores peroxisoma.

Verificámos que o tratamento de ratinhos com DHEA ou clofibrato (0,25%) durante três semanas provoca tanto hepatomegalia como um aumento de três vezes da actividade específica da catalase do fígado. Estes resultados estão de acordo com as conclusões de Moore, et al. e indicam que DHEA é um proliferador peroxisoma. Contudo, os

-74compostos 3, 4 e 5 nem aumentaram o tamanho do figado nem estimularam a actividade da catalase (Quadro 11). Este achado surpreendente com os compostos 3 e 5 indicam que foi aparentemente eliminado um efeito secundário de DHEA potencialmente grave.

QUADRO 11

EFEITO DO TRATAMENTO COM ESTEROIDE OU CLOFIBRATO SOBRE 0 PESO DO FIGADO Ξ ACTIVIDADE DA CATALASE

TRATAMENTO	PESO DOFIGADO (g/g de peso corporal	ACTIVIDADE DA CATALASí (Unidades por mg de proteína)
DHEA (0,2%)	0,074 + 0,005*	97,8 + 24*
Comp. 3 (0,2%)	0,066 + 0,005	29,2 + 2,6
Comp. 4 (0,25%)	0,058 + 0,004	42,3 ± 7,2
Comp. 5 (0,2%)	0,061 + 0,002	32,2 £ 6,0
Clofibrato (0,25%)	0,084 + 0,006**	91,1 _± 8,9***
Controlo	0,057 + 0,006	31,1 + 6,7

Foram alojados ratinhos fêmeas Balb/c em gaiolas de policarbonato (6/ratinhos/gaiola) em instalações animais mantidas a 24 + 12C com 12 horas de luz e 12 horas de escuridão cada dia. Os ratinhos foram submetidos a uma dieta contendo quer DHEA, comps. 3, 4 e 5, clofibrato ou sem qualquer adição. Três semanas mais tarde os ratinhos foram mortos, os figados foram aspergidos com solução salina fria, pesados, e foram preparados produtos homogé neos para a determinação da actividade da catalase pelo má todo espectrofotométrico de Luck (H. Luck, em Method in Enzyme Analysis, H.U. Bergmeyer, Ed. (Verlag Chemie, Weinheim/Bergstrasse, Germany, 1965)). A proteína total foi medida pelo método de Lowry, et al. (O.H. Lowry, N.J. Rosebrough, A.L. Parr, R.J. Randall, J. Biol. Chem., 193, 265 (195D ).

Os valores são as médias +_ DP para três determinações separadas.

*	Signifi c ativament e P <0,05;	maior	do	que	valor do controlo,
	Significativamente p <0,002;	maior	do	que	valor	do	controlo,
***	Significativamente	maior	do	que	valor	do	controlo,

p < 0,001.

Actividade Anti-Autoimunitária

Ratinhos New Zealand Black (NZB) desenvolvem com a idade uma anemia hemolítica positiva de Coomb, progressiva, autoimunitária. Verificou-se anteriormente que o tratamento prolongado dos ratinhos NZB com DHEA inibe significativamente o grau de desenvolvimento da anemia autoi munitária. Tannen, R.H., Schwrtz, A.G., 1982 Reduced Weight Gain and Delay of Coomb’s Positive Hemolytic Anemia in NZB Mice Treated with Dehydroepiandrosterone (DHEA), Fed. Proc., 41, 463 (Abstract). Lucas et al. in J. Clin. Invest,, 75, 2091-2093 (1985) indicaram que a administração oral de deshidroisandrosterona prolongava a sobrevivênia dos ratinhos híbridos New Zealand Black/New Zealand White F, contra 0 lupus eritematoso murino. Noutros estudos aqui referidos, determinámos que os compostos do presente invento possuem uma acção fisiológica mantida, tal como a acção preventiva em relação ao cancro, de DHEA sem qualquer efeito estrogé-76-

nico aparente. Existe uma razoável probabilidade de que esses esteroides retenham também a actividade anti-autoimunitária de DHEA.

Os compostos, isto é agentes terapêuticos deste invento, podem ser administrados isoladamente ou em combinação com veículos farmacêuticamente aceitáveis, cuja proporção é determinada pela solubilidade e natureza química do composto, pela via de administração escolhida e pela técnica farmacêutica padrão. Por exemplo, podem ser administrados oralmente sob a forma de comprimidos, pílulas ou cápsulas contendo excipientes tais como amido, açúcar do leite, certos tipos de argila, etc. Podem ser administrados oralmente sob a forma de soluções que podem conter agentes corantes e aromatizantes ou podem ser injectados parentéricamente, isto é, intramuscularmente, intravenosamente ou subcutâneamente. Para a administração parentérica, podem ser usados sob a forma de uma solução estéril contendo outros solutos, por exemplo, suficiente solução salina ou glucose para tornar a solução isotónica.

I 0 médico determinará a dosagem dos presentes agentes terapêuticos que serão mais apropriados e ela variará de acordo com a forma de administração e com o composto particular escolhido, e além disso, variará de acordo com o doente em particular a ser tratado. Em geral o médico pretende iniciar o tratamento com pequenas doses subs tâncialmente inferiores à dose óptima do composto aumentando a dosagem por meio de pequenos acréscimos até se alcançar o efeito óptimo nessas circunstâncias. Verificar-se-á geralmente que quando a composição é administrada oralmente, serão necessárias maiores quantidades do agente activo para produzir o mesmo efeito que uma quantidade mais pequena administrada parentéricamente. Os compostos sao úteis do mesmo modo que agentes terapêuticos comparáveis e o nível de dosagem é da mesma ordem de grandeza que o destes outros agentes

-77terapêuticos.

Quando administradas oralmente, as doses terapêuticas dos compostos do presente invento variam geralmente entre cerca de 4 e cerca de 450 mg/kg/dia dependendo do particular hospedeiro mamífero e do particular efeito desejado, por exemplo preventivo do cancro, anti-obesidade, anti-diabetes, etc., quando administradas parentéricamente, os compostos são administrados geralmente em dosagens de, por exemplo, 0,5 a cerca de 15 mg/kg/dia, dependendo também do hospedeiro e do efeito desejado.

Óbviamente, são possíveis outras modifi-i i cações e variações do presente invento à luz dos ensinamentoá atrás referidos. Assim, deve ser compreendido que podem ser feitas alterações nas apresentações particulares deste invento que se situam no pretendido âmbito do invento tal como foi definido nas reivindicações apensas.

Claims

REIVINDICAÇÕES la. - Processo para a preparação de um composto com a fórmula em que cada um de entre R^, R₂, R^, R^, Rg e podem ser iguais ou diferentes e cada um deles é independentemente hidrogénio ou alquilo inferior; X é halogénio, hidróxi, hidrogénio, alquilo inferior ou alcóxi inferior; Z é alquilo inferior ou hidrogénio; e n é 1 quando o anel B é não saturado ou n é 2 quando o anel B é saturado com a condição de que pelo menos um de entre X e Z seja diferente de hidrogénio, caracterizado por compreender: (1) a protecção facultativa dos grupos reactivos necessários num material de partida apropriado, efectuando reacções, de substituição no anel num meio de reacção a temperaturas suficientes para introduzir quer grupos alquilo não presentes no anel básico do material de partida no carbono 1,2,4,6,7,11 ou 16, quer halogénio, hidróxi ou alcóxi no carbono 16 e remoção de quaisquer grupos protectores adicionados facultativamente, produzindo desse modo um composto com a fórmula IA ou (2) a redução facultativa da dupla ligação no anel B do composto com a fórmula IA, quando presente, produzindo desse modo o composto de fórmula IA que tem um anel B saturado.
2». - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de um composto com a fórmula I em que cada um de entre R-^, £2» ^szp R^, Rg ^e podem ser iguais ou diferentes e cada um deles é independentemente hidrogénio ou alquilo inferior; X é halogénio, hidroxi, hidrogénio, alquilo inferior ou alcoxi inferior; e Z é alquilo inferior ou hidrogénio; com a condição de que pelo menos um de entre X e Z seja diferente de hidrogénio, caracterizado por compreender a protecção facultativa dos grupos reactivos necessários num material de partida apropriado, efectuando reacções de substituição no anel num meio de reacção a temperaturas suficientes para introduzir quer grupos alquilo não presentes no anel básico dos materiais de partida no carbono 1, 2, 4, 6, 7, 11 ou 16, quer halogénio, hidroxi ou alcoxi no carbono 16, e remoção de quaisquer grupos prote ctores adicionados facultativamente, produzindo desse modo um composto com a fórmula I.

- Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por se preparar um composto com a fórmula em que X é halogénio, hidroxi, hidrogénio ou alquilo inferior; Z é alquilo inferior ou hidrogénio, com a condição de que pelo menos um de entre X e Z seja diferente de hidrogénio.
4^a. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por o referido alquilo ser alquilo inferior tendo entre 1 e 5 átomos de carbono.
5a. _ processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por o referido alquilo ser metilo.
6a. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por X ser flúor, hidroxi, hidrogénio, metilo ou metoxi.
7^a. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por Z ser hidrogénio ou metilo.
8a. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por se preparar um composto com a fórmula
9^. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por se preparar um composto com a fórmula loa. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por se preparar um composto com a fórmula
11^a. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por se preparar um composto com a fórmula:
12^a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, para a preparação de um composto com a fórmula II em que cada um de entre R^, Rg, R^, R^, Ηθ e R? podem ser iguais ou diferentes e cada um deles são independentemente hidrogénio ou alquilo inferior; X é halogénio, hidroxi, hidrogénio, alquilo inferior ou alcoxi inferior; e Z é alquilo inferior ou hidrogénio; com a condição de que pelo menos um de entre X e Z seja diferente de hidrogénio, caracterizado por compreender (a) a protecção facultativa dos grupos reactivos necessários num material de partida apropriado, efectuando as reacções de substituição no anel num meio de reacção a temperaturas suficientes para introduzir quer grupos alquilo não presentes no anel básico do material de partida do carbono 1, 2, 4, 6, 7, 11 ou 16, quer halogénio, hidroxi ou alcoxi no carbono 16, e remoção de quaisquer grupos protectores adicionados facultativamente, produzindo desse modo um composto com a fórmula II, ou (b) a redução do composto com a fórmula I aqui referido.
13a. - Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 12, caracterizado por se preparar um composto com a fórmula:

em que X é alquilo, hidroxi, hidrogénio ou alquilo inferior; e Z é alquilo inferior ou hidrogénio; com a condição de que pelo menos um de entre X e Z seja diferente de hidrogénio.
14a, - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 12-13, caracterizado por 0 referido alquilo ser alquilo inferior tendo 1 a 5 átomos de carbono.
15^· - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 12-a 14, caracterizado por o referido alquilo ser metilo.
16a. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 12 a 15, caracterizado por X ser fluor, hidroxi, hidrogénio, metilo ou metoxi.
17a. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 12 a 16, caracterizado por Z ser hidrogénio ou metilo.
18a. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 12 a 17, caracterizado por se preparar um composto com a fórmula:

,8519^. - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 12 a 17, caracterizado por se preparar um composto com a fórmula