PT832096E

PT832096E - Sintese de proteinas atraves de ligacao quimica nativa

Info

Publication number: PT832096E
Application number: PT95919029T
Authority: PT
Inventors: Stephen B H Kent; Tom W Muir; Philip E Dawson
Original assignee: Scripps Research Inst
Priority date: 1995-05-04
Filing date: 1995-05-04
Publication date: 2002-01-30
Also published as: MX9708500A; GR3036895T3; JPH11508874A; ATE203248T1; AU2474095A; CA2218620C; DE69521815D1; EP0832096B1; EP0832096A4; EP0832096A1; SI0832096T1; DK0832096T3; DE69521815T2; ES2161885T3; WO1996034878A1; CA2218620A1; AU711451B2; JP3599346B2

Description

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"Síntese de proteínas através de ligação química nativa"

Campo do Invento: O invento refere-se a métodos e intermediários para ligar quimicamente dois nligopéptidos. extremidade com extremidade, com uma ligação amida. Mais especificamente, o invento refere-se a métodos e intermediários para ligar quimicamente oligopéptidos em que uma cisteína N-terminal não oxidada de um primeiro oligopéptido condensa com um tioéster C-terminal de um segundo oligopéptido para formar um intermediário β-aminotioéster que se rearranja intramolecularmente de modo espontâneo para formar uma ligação amida e o produto de ligação.

Direitos do Governo: O invento aqui divulgado foi apoiado em parte pelas Bolsas Número R01 GM 48897-01, Número P01 GM 48870-03, e Número GM 50969-01 dos National Institutes of Health. O governo dos Estados Unidos pode ter alguns direitos neste invento.

Antecedentes:

As proteínas podem ser sintetizadas quimicamente, ribossomicamente num sistema isento de células ou ribossomicamente dentro de uma célula. Os avanços em cada uma destas áreas melhoraram significativamente o acesso a muitas proteínas mas estimularam também a procura de mais melhoramentos.

As proteínas devem as suas diversas propriedades às estruturas tridimensionais, dobradas com precisão, das suas cadeias polipeptídicas. A estrutura tridimensional de uma proteína determina os seus atributos funcionais. No entanto, actualmente, é difícil prever e/ou explicar completamente as propriedades biológicas de uma proteína somente a partir da sua estrutura tridimensional. Uma melhor compreensão de como a estrutura determina as propriedades biológicas de uma proteína pode ser alcançada variando sistematicamente a estrutura covalente da molécula e correlacionando os efeitos com a estrutura dobrada e a função biológica. De forma concordante, existe uma maior procura de melhores técnicas sintéticas para síntese de novas proteínas e análogos proteicos.

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Podem ser empregues técnicas derivadas da biologia molecular baseada em ADN recombinante para facilitar a expressão de proteínas em microorganismos geneticamente modificados. A utilização de mutagénese dirigida ao local, tal como divulgado por M. Smith (Angew. Chem. Int. Ed. Engl. (1994): vol. 33, pág. 1214), permite a preparação de um grande número de proteínas modificadas em quantidades úteis para estudo sistemático, p.ex., C. Eingenbrot e A. Kossiakoff, Current Opinion in Biotechnology (1992): vol. 3, pág. 333. A utilização de abordagens inovadoras aumenta a gama de aminoácidos que podem ser incorporados em sistemas de expressão e promete alargar significativamente a utilidade da modificação biossintética da estrutura covalente das proteínas. (C. J. Noren et al., Science (1989): vol. 244, pág. 182 (1989); J. A. Ellman et al., Science (1992): vol. 255 pág. 197). No entanto, parece haver limitações inerentes à natureza da síntese proteica ribossómica. (V. W. Cornish, et a/., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1994): vol. 91 pág. 2910). A síntese química de proteínas contribuiu também para a exploração da relação da estrutura proteica com a função. A síntese por passos em fase sólida permitiu a preparação de novo de pequenas proteínas. (T. W. Muir et al., Curr. Opin. Biotech. (1993): vol. 4, pág. 420). Existem também vários exemplos da utilização de síntese por passos em fase sólida de proteínas inteiras para explorar a base molecular da função biológica. (M. Miller, et al., Science (1989): vol. 246, pág. 1149; A. Wlodawer, et al., Science (1989): vol. 245, pág. 616; L.H. Huang, et a!., Biochemistry (1991): vol. 30 pág. 7402; e K. Rajarathnam, et al., Science (1994): vol. 264, pág. 90). A semi-síntese através de re-ligação de fragmentos peptídicos conformacionalmente assistida pode também ser empregue, em casos especiais, para estudar a relação estrutura/função das proteínas. (R. E. Offord, "Chemical Approaches to Protein Engineering", em Protein Design and the Development of New Therapeutics and Vaccines. J. B. Hook, G. Poste, Eds., (Plenum Press, New York, 1990) págs. 253-282; C. J. A. Wallace, et al., J. Biol. Chem. (1992): vol. 267, pág. 3852. Uma extensão importante da abordagem de semi-síntese é a utilização de ligação enzimática de segmentos peptídicos clonados ou sintéticos. (L. Abrahmsen, et al., Biochemistry (1991): vol. 30, pág. 4151; T. K. Chang, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1994): no prelo). Embora as metodologias de cima tenham sido aplicadas com sucesso à

87 041 ΕΡ 0 832 096/ΡΤ 3 síntese de proteínas e análogos proteicos, T. W. Muir et al., relatam que existe um interesse contínuo na aplicação mais vasta das ferramentas da química orgânica ao estudo de proteínas (Curr. Opin. Biotech. (1993): vol. 4, pág. 420).

Stephen Kent et al. introduziram recentemente a ligação química de segmentos peptídicos desprotegidos como uma via melhorada para a síntese total de proteínas. (M. Schnlzer, eia/., Science (1992): vol. 3256, pág. 221). A ligação química envolve a reacção quimiosselectiva de péptidos desprotegidos para dar um produto com uma estrutura de esqueleto não natural no local de ligação. A utilização de péptidos desprotegidos contornou as dificuldades inerentes à síntese química clássica, viz combinações complexas de grupos de protecção que conduzem a uma solubilidade limitada de muitos intermediários sintéticos, p.ex. K. Akaji, et al., Chem. Pharm. Buli. (Tokyo) (1985): vol. 33, pág. 184. Pelo contrário, a técnica de ligação química permitiu-nos fazer bom uso da capacidade de produzir, purificar e caracterizar rotineiramente péptidos desprotegidos com 50 ou mais resíduos de comprimento. Utilizando métodos por passos em fase sólida optimizados, a preparação com bom rendimento e elevada pureza de péptidos com até 60 resíduos é rotina. Em casos favoráveis, podem ser preparados péptidos com 80+ resíduos. (M. Schnolzer, et al., Int. J. Pept. Prot. Res. (1992): vol. 40, págs. 180-193). O aspecto chave da abordagem de cima à ligação química é a utilização de uma reacção quimiosselectiva para unir especifica e inequivocamente péptidos através da formação de uma estrutura de esqueleto não natural (i.e. não peptídica) no local de ligação. Permitiu a preparação fácil de uma grande gama de proteínas de esqueleto modificado, incluindo análogos de domínios proteicos, p.ex., 10F3 ligado, o módulo de ligação a integrina da fibronectina: 95 resíduos (M. Williams, et al., J. Am. Chem. Soc. (1994): no prelo). A contribuição catalítica das ligações de hidrogénio do substrato-uflap" na protease de HIV-1 foi elucidada através da síntese química de um homodímero de subunidades com 99 resíduos desta proteína através de ligação química. (M. Baca, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, (1993): vol. 90, pág. 11638). Provou-se também que a ligação química era útil para a síntese reprodutível de rotina de grandes quantidades de proteínas com elevada pureza com total actividade biológica (20). (R.C. deLisle Milton, et al., "Synthesis of Proteins by Chemical Ligation of Unprotected Peptide Segments: Mirror-lmage Enzyme Molecules, D- fl 87 04 1

EP 0 832 096/PT 4 & L-HIV Protease Analogs", em Techniaues in Protein Chemistrv IV. Academic Press, New York, págs. 257-267 (1992)). A ligação química pode também ser empregue para a produção directa de moléculas semelhantes a proteínas de topologia invulgar, p.ex., proteína sintética montada em molde em feixe de quatro hélices (PM 6647 Da) (P.E. Dawson, et a!., J. Am. Chem. Soc. (1993): vol. 115, pág. 7263); proteína artificial polivalente homogénea (PM 19916 Da) (K. Rose, J. Am. Chem. Soc. (1994): vol. 3116, pág. 30); neoproteína artificial imitadora dos domínios citoplasmáticos de um receptor de integrina de multicadeias (PM 14194 Da) (T.W. Muir, et a/., Biochemistry, (1994): vol. 33, págs. 7701-7708; e dendrímero peptídico (PM 24205 Da) (C. Rao, et aí., J. Am. Chem. Soc. (1994): vol. 116, pág. 6975. A gama de proteínas acessíveis através desta técnica é limitada pelo tamanho dos segmentos peptídicos sintéticos.

Um alargamento útil ocorreria se houvesse acesso sintético directo às cadeias polipeptídicas de esqueleto nativo até ao tamanho de domínios proteicos típicos. (A.L. Berman, et aí., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1994): vol.91, pág. 4044). A ligação química seria então empregue para unir estes domínios uns aos outros para explorar o mundo das proteínas de um modo geral.

Foi desenvolvida uma estratégia modular para a síntese total de proteínas, com base na ligação química convergente de péptidos desprotegidos divulgada por L.E. Canne, et aí. (apresentado em Annual Meeting of the Protein Society, San Diego, Julho de 1994). Foram preparados domínios proteicos (módulos) através de ligação química de segmentos de 50-70 resíduos; estes domínios foram então ligados uns aos outros para dar a proteína alvo. São necessárias químicas de ligação mutuamente compatíveis: a ligação intra-domínios deve, optimamente, produzir uma ligação estável semelhante à peptídica; a ligação inter-domínios permitirá uma maior variação de propriedades da estrutura formada no local de ligação. Dewson et aí., Science, 266, págs. 776-779, discutem um método mais simples de ligação química nativa. A síntese química total directa de proteínas representa a realização de um objectivo importante da química orgânica. Levanta a excitante perspectiva de variação não restrita da estrutura covalente proteica tornada possível através de 87 041 ΕΡ 0 832 096/ΡΤ 5

acesso sintético geral e dará novo ímpeto à exploração da base estrutural de propriedades tais como dobragem, estabilidade, actividade catalítica, ligação e acção biológica. O que é necessário é uma técnica de ligação química nativa que combine a formação de uma ligação peptídica nativa no local de ligação com as vantagens da reacção quimiosselectiva de péptidos desprotegidos. Esta química de ligação de segunda geração aumentaria significativamente o tamanho dos polipéptidos de esqueleto nativo directamente acessíveis através de síntese química total. Podia ser utilmente aplicada a uma grande variedade de alvos sintéticos, incluindo proteínas de tamanho moderado e permite acesso directo a domínios proteicos funcionais. A ligação química nativa é uma pedra basilar de uma abordagem modular geral à síntese química total de proteínas. Para além disso, é compatível com a utilização de péptidos quimicamente sintetizados e segmentos peptídicos derivados de outras fontes.

Sumário:

Um aspecto do presente invento é dirigido a um método de ligação química nativa. 0 método de ligação química nativa facilita a síntese química de proteínas e de oligopéptidos grandes. O princípio da "ligação química nativa" é mostrado no Esquema 1. O primeiro passo é a reacção quimiosselectiva de um péptido-a-tioéster sintético desprotegido com outro segmento peptídico desprotegido contendo um resíduo Cys N-terminal, para dar um intermediário ligado a tioéster como produto covalente inicial. Sem alterações nas condições de reacção, este intermediário sofre uma reacção intramolecular espontânea e rápida para formar uma ligação peptídica nativa no local de ligação. O produto polipeptídico inteiro alvo é obtido na forma final desejada sem mais manipulação. 0 acesso sintético geral proporcionado pelo método de ligação química nativa expande grandemente o âmbito de variação da estrutura covalente da molécula proteica. O presente invento proporciona um método para ligar um primeiro oligopéptido a um segundo oligopéptido, extremidade com extremidade, para produção de um produto oligopeptídico. Os primeiro e segundo oligopéptidos são misturados numa solução reaccional incluindo um tiol catalítico. O tiol catalítico é ligado directamente a um anel aromático ou heteroaromático e é diferente do tiol a partir do qual o tioéster C-terminal é racionalmente formado.

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Tióis catalíticos preferidos incluem tiofenol, 1-tio-2-nitrofenol, ácido 2-tiobenzóico, 2-tio-piridina, ácido 4-tio-2-piridinocarboxflico e 4-tio-2- nitropiridina. O primeiro oligopéptido inclui um tioéster C-terminal. O segundo oligopéptido inclui uma cisteína N-terminal possuindo uma cadeia lateral sulfidrilo não oxidada. A cadeia lateral sulfidrilo não oxidada da cisteína N-terminal é então condensada com o tioéster C-terminal para produzir um oligopéptido intermediário que liga o primeiro e o segundo oligopéptidos com uma ligação β-aminotioéster. A ligação β-aminotioéster do oligopéptido intermediário sofre então um rearranjo intramolecular para produzir o produto oligopeptídico que liga o primeiro e o segundo oligopéptidos com uma ligação amida. 0 oligopéptido possuindo um tioéster C-terminal acima referido é preparado de acordo com um método que mistura uma resina possuindo um ligante com um tiol não oxidado com um éster de succinimida de Boc-aminoácido sob condições de reacção para produzir resina Boc-aminotioéster. Um oligopéptido é então montado sobre a resina Boc-aminotioéster através de síntese peptídica por passos em fase sólida. Quando o oligopéptido está completo, a resina Boc-aminotioéster é clivada com HS para produzir um oligopéptido possuindo um tiol C-terminal. 0 tiol C-terminal é então convertido num oligopéptido possuindo um tioéster C-terminal. 0 tioéster oligopeptídico (porção α-COSR) ou o Esquema 1 pode ser prontamente gerado a partir de um tiol oligopeptídico correspondente (-aCOSH) preparado através de SPPS por passos altamente optimizada numa resina tioéster. A resina tioéster foi preparada através do método de L.E. Canne et al., Tetrahedron Letters (1995): vol. 36, págs. 1217-1220, aqui incorporado por referência. O método de Canne emprega a resina tioéster divulgada por Blake e Yamashiro (J. Blake, Int. J. Pept. Protein Res. (1981): vol. 17, pág. 273; D. Yamashiro, et al., Int. J. Pept. Protein Res. (1988): Vol. 31, pág. 322). Os produtos peptídicos foram clivados, purificados e caracterizados através de métodos convencionais. (M. Schnolzer, et al., Int. J. Pept. Protein Res. (1992): vol. 40, págs. 180-193.). A metodologia de Yamashiro activa um grupo tiocarboxilo num oligopéptido protegido com diarildissulf uretos para dar acildissulfuretos (Yamashiro, et al., Int. J. Peptide Protein Res. (1922): Vol. 31, págs. 322-334). 7 87 041 ΕΡ 0 832 096/ΡΤ

Estes acildissulfuretos peptídicos C-terminais são intermediários electrófilos altamente reactivos que são atacados e subsequentemente acoplados com um grupo α-amino no terminal N de um segundo péptido para formar ligações peptídicas nativas. Os rendimentos do acoplamento relatados utilizando dissulfureto de 2,2'-dipirridilo como activador do grupo tiocarboxilo produzem o produto a-IB-92 desejado com um rendimento de 45%. Os rendimentos globais rnm base na resina de partida para uma síntese de 3 segmentos de a-IB-92 são relatados como 8%, enquanto que uma síntese de 2 segmentos deu 11%.

Devido à elevada reactividade da ligação diarildissulfureto, a abordagem de Yamashiro requer protecção e desprotecção extensivas dos resíduos de aminoácido presentes na molécula peptídica. O grupo lisina por exemplo é protegido como derivado citraconilo devido à funcionalidade amina reactiva. Adicionalmente, é utilizado um grupo Msc ou tBOC para proteger quaisquer funcionalidades amina terminais presentes na molécula. O invento aqui apresentado não requer a utilização de quaisquer grupos protectores para o acoplamento de dois oligopéptidos porque é utilizado um tioéster electrófilo menos reactivo (e assim mais quimiosselectivo) em vez da porção acildissulfureto (abordagem de Yamashiro). No passo de acoplamento intramolecular, este tioéster electrófilo requer uma porção sulfidrilo mais nucleofílica em vez de uma amina livre. A porção sulfidrilo nucleofílica pode ser encontrada em resíduos de cisteína. Uma vez que as funcionalidades amino e hidroxilo são relativamente não reactivas para o electrófilo tioéster, um acoplamento selectivo dos dois oligopéptidos desprotegidos é alcançada com a porção sulfidrilo da cisteína. O grupo sulfidrilo na cisteína do péptido 2 atacará primeiro o tioéster do péptido 1 e forma um intermediário tioéster acoplado. Este intermediário tioéster acoplado é concomitantemente atacado pela porção α-amino livre da cisteína e rearranja-se espontaneamente para formar a ligação peptídica nativa. Os rendimentos são portanto aumentados pela eliminação dos passos de protecção e desprotecção, uma vez que são reduzidas reacções secundárias indesejadas (Esquema 1).

87 041 ΕΡ 0 832 096/ΡΤ 8 (segue esquema 1) ΕΡ Ο 832 096/ΡΤ 9 Féptido-1

Ο II

-C-SR ©,

ο II NH-CH-C Péptido-2

RECÇÃO QUÍMICA SELECTIVA

Péptido-1 Péptido-2

II

hC-NH-^H-CH SH

Esquema 1 87 041 ΕΡ 0 832 096/ΡΤ 10

A porção tioéster é preparada a partir de um tioácido percursor que é obtido através de síntese peptídica por passos em fase sólida optimizada num suporte de resina de aminometilo equipado com um ligante è resina tioéster. O tioácido percursor é subsequentemente gerado em HF líquido a 0°C numa hora (Yamashiro, et a!., Int. J. Pept. Protein Res. (1988): Vol.31, pág. 322).

Um procedimento para a síntese do ligante tioéster com utilização de uma síntese peptídica por passos em fase sólida foi relatado por Blake (Blake et a!., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1981): vol. 78, 4055) e Yamashiro (Yamashiro, et a/., Int. J. Pept. Protein Res. (1988): Vol. 31, pág. 322). No entanto, este método é indesejável porque requer a conversão de ésteres de succinimida de Boc-aminoácidos nos Boc-aminotioácidos correspondentes com sulfureto de hidrogénio. Uma metodologia melhorada aqui relatada, utiliza o éster de succinimida de Boc-aminoácidos directamente e evita portanto a inconveniência e perigos do gás sulfureto de hidrogénio (Kent et al., Tetrahedron Lett. (1995): vol. 36, pág. 1217).

Neste método (Esquema 2), o tiol 3 é gerado a partir da reacção do cloreto 2 (Yamashiro, et al., Int. J. Pept. Protein Res. (1988): vol. 31, pág. 322) com tioureia, seguida por hidrólise do sal tiourónio resultante em base aquosa. 0 tiol 3 é um intermediário geral que se pode fazer reagir com um amplo grupo de ésteres de succinimida de Boc-aminoácidos para produzir o ligante tioéster desejado 1 que é convenientemente isolado como o sal diciclo-hexilamina (DCHA).

Estudos modelo foram efectuados com pequenos péptidos para investigar a abordagem da ligação química nativa. Para ajudar a explorar o mecanismo da reacção, fez-se reagir o péptido Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-a-COSBz1 com Ac-Cys. A massa exacta do produto de ligação resultante foi determinada através de espectrometria de massa por electropulverização e era consistente com um péptido ligado a tioéster como produto de ligação gerado através do ataque nucleofílico da cadeia lateral de Ac-Cys na porção a-tioéster do péptido. A reacção de Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-a-COSBz1 com H-Cys-Arg-Ala-Glu-Tyr-Ser (contendo um grupo funcional a-NH2 desbloqueado) prosseguiu rapidamente a pH 6,8 (abaixo de pH 6 a reacção prosseguiu muito lentamente, sugerindo o envolvimento da forma tiolato ionizada da cadeia lateral Cys) e deu um único produto com a massa esperada. Este produto não tinha susceptibilidade a nucleófilos e tinha a capacidade de formar péptidos diméricos ligados por 11 a / 041 EP 0 832 096/PT dissulfureto, indicando inequivocamente a formação de uma ligação amida nativa no local de ligação. Estes estudos foram consistentes com o mecanismo mostrado no Esquema 1, no qual o produto da ligação por tioéster inicial não foi observado como um intermediário discreto devido ao rápido rearranjo para formar uma ligação peptídica estável. A fácil reacção intramolecular resulta do rearranjo geométrico favorável da porção a-NH2 em relação ao tioéster formado na reacção de ligação quimiosselectiva inicial. A utilização de tal "activação por eutropia" para a formação de uma ligação peptídica ba&eia-se em princípios enunciados por Brenner. (M. Brenner, em Peptides. Proceedinas of the Eiahth European Peptide Svmposium H. C. Beyerman, Eds. (North Holland, Amsterdam, 1967) págs. 1-7). 0 conceito de "activação por entropia" para formação de uma ligação peptídica foi mais recentemente adoptado por D.S. Kemp et aí., {J. Org. Chem. (1993): vol. 58, pág. 2216) e por C.-F. Liu, et aí. (J. Am. Chem. Soc. (1994): vol. 116, pág. 4149). Vários péptidos modelo foram sintetizados através do método de ligação química nativa. A síntese bem sucedida destes péptidos modelo estabelece que a ligação química nativa é geralmente aplicável a péptidos contendo a gama completa de grupos funcionais que normalmente se encontram nas proteínas. Mesmo resíduos Cys internos livres podem estar presentes em qualquer um dos segmentos reagentes. Os resíduos Cys internos podem sofrer troca de ésteres com o componente péptido-a-tioéster; no entanto, esta reacção é improdutiva porque não pode ocorrer rearranjo para a ligação amida; o tioéster formado é prontamente reversível e permanece uma parte produtiva do sistema reagente. Tal como aqui divulgado, a ligação química nativa está limitada a reacção num resíduo Cys N-terminal. É importante evitar a oxidação do tiol da cadeia lateral deste Cys para formar um dímero ligado por dissulfureto, porque este não é reactivo na ligação. Foi utilizado um excesso do tiol correspondendo ao grupo rejeitado tioéster para manter os resíduos Cys na forma reduzida sem interferir com a reacção de ligação. 0 segmento peptídico amino-terminal tem de ser preparado através de síntese química para o equipar com a funcionalidade α-COSR necessária. Para além disso, para uma ligação óptima, este componente deve ter um aminoácido C-terminal sem charneira (i.e., não β-ramificado). Agentes de solubilização tais como ureia ou cloridrato de guanidina não interferiram com a ligação e podiam ser utilizados para aumentar a concentração de segmentos peptídicos, e assim aumentar a velocidade de reacção. 12 87 041 ΕΡ 0 832 096/ΡΤ

Esquema 2 13 8/ 041 ΕΡ 0 832 096/ΡΤ

LIGAÇÃO QUÍMICA NATIVA - TAXA DE REACÇÃO

O

(46-76)-aSNB + [Cys77](77-95)

Progresso de ligação (%)

Esquema 5

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Outras reacções modelo demonstram que a utilização de melhores grupos rejeitados tioéster resulta em reacções de ligação mais rápidas. Aplicámos esta observação à ligação química nativa de péptidos do domínio extracelular de um receptor de citóquinas humano (R. D'Andrea, et al., B/ood, (1994): vol. 83, pág. 2802) tal como mostrado no Esquema 5. A utilização do grupo rejeitado ácido 5-tio-2-nitrobenzóico (-SNB), correspondendo à forma reduzida do reagente de Elman, deu uma rápida reacção de elevado rendimento. Tal como abaixo descrito em relação ao Esquema 5, observou-se que a reacção entre os segmentos peptídicos ficou essencialmente completa em menos de 5 minutos, dando o produto de 50 resíduos com uma ligação peptídica nativa no local de ligação. Assim, pode ser alcançada uma rápida ligação química nativa através da utilização de um grupo rejeitado tioéster com propriedades adequadamente afinadas. A aplicação do método de ligação química nativa à síntese total de uma molécula proteica foi ilustrada através da preparação da interleucina 8 humana (IL-8). (M. Baggiolini, et al., FEBS Lett. (1989): vol. 307, pág. 97; I. Clark-Lewis, et al., J. Biol. Chem. (1994): vol. 269, pág. 16075 (1994); I. Clark-Lewis, Biochemistry (1991): vol. 30, pág. 3128; e K. Rajarathnam, et al., Biochemistry (1994): vol. 29, pág. 1689). A cadeia polipeptídica de 72 aminoácidos contém quatro resíduos Cys, que formam duas pontes dissulfureto funcionalmente críticas na molécula proteica nativa. A síntese total de IL-8 é mostrada no Esquema 7. Os dois segmentos peptídicos sintéticos desprotegidos reagiram de forma limpa para dar a cadeia polipeptídica completa na forma reduzida sem mais manipulação química (9). Esta ligação bem sucedida foi particularmente significativa porque os segmentos de IL-8 de 33 e de 39 resíduos continham cada um dois resíduos Cys e juntos englobavam 18 dos 20 aminoácidos geneticamente codificados encontrados nas proteínas. O produto purificado foi dobrado e oxidado tal como anteriormente descrito, para dar IL-8 com uma massa de precisamente 4 Daltons menos que a do produto de ligação original, indicando a formação de duas ligações dissulfureto. As propriedades deste produto dobrado eram idênticas às de amostras de IL-8 autêntica anteriormente estudadas. A titulação num ensaio de libertação de elastase neutrófila demonstrou que as potências (DE50= 0,3 nM) e as respostas máximas de [Ala33]IL-8 dobrada, ligada e da molécula correspondente obtida através de síntese convencional eram indistinguíveis e idênticas às de IL-8 de sequência nativa. Este resultado confirmou inequivocamente a formação de uma

87 041 ΕΡ 0 832 096/ΡΤ 15 ligação peptídica no local de ligação, porque o rearranjo de tioéster para amida teve que ocorrer para dar a cadeia lateral de Cys34 livre que formou a ligação dissulfureto nativa (ver Esquema 7).

As proteínas são habitualmente estudadas através de expressão em microorganismos geneticamente modificados utilizando os métodos da biologia molecular baseada em ADN recombinante. Métodos tais como mutagénese dirigida ao local tiveram um importante impacto na capacidade para preparar um grande número de proteínas modificadas em quantidades úteis para estudo sistemático. Abordagens inovadoras aumentaram a gama de aminoácidos que podem ser incorporados em sistemas de expressão e prometem alargar significativamente a utilidade da modificação biossintética da estrutura covalente das proteínas. No entanto, parece haver limitações inerentes à natureza da síntese proteica ribossómica.

Wieland divulga um método para sintetizar dipéptidos utilizando um intermediário tioéster. (Wieland et a!., Liebigs Ann. Chem. (1953): vol. 580, pág. 159). Wieland utiliza a reacção de S-glicil-(ou outro aminoacilo não ramificado)tiofenóis com cisteína. Assim, o grupo sulfidrilo no resíduo de cisteína ataca primeiro o tioéster do S-glicil-tiofenol e forma um intermediário tioéster acoplado. Este intermediário tioéster acoplado é concomitantemente atacado pela porção α-amino livre da cisteína e rearranja-se espontaneamente para formar a ligação peptídica nativa.

Uma limitação da abordagem de Wieland é o tamanho das moléculas utilizadas (apenas mono-aminoácidos se acoplam à cisteína) e tem origem na metodologia utilizada para a síntese do tioéster. Para formar o tioéster, a abordagem de Wieland requer a activação do ácido carboxílico terminal como um anidrido misto, cloreto de ácido ou tioácido. Surge um problema se uma porção ácida estiver presente num resíduo de aminoácido tal como Asp(D) e Glu(E). Neste casos, o método de Wieland produz uma reacção lateral indesejada c requer portanto uma complexa estratégia de grupos protectores, particularmente se são sintetizados oligopéptidos. 16 87 041 ΕΡ 0 832 096/ΡΤ

Esquema 7

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Ο invento aqui descrito elimina a necessidade de uma estratégia elaborada de grupos protectores uma vez que a porção oligopéptido-tioéster é derivada de um lioácido percursor. Este tioácido percursor (péptido-a-COSH) é sintetizado através de uma síntese peptídica por passos em fase sólida Standard num suporte de resina aminometilo, equipado com um ligante à resina tioéster. O tioácido percursor é clivado do ligante/resina quase quantitativamente (99%) em HF líquido a 0°C durante 1 hora. 0 péptido tioéster (péptido-a-COSR) pode ser sintetizado de dois modos gerais: (1) Reacção de um péptido tioácido liofilizado bruto (péptido-a-COSH) com reagente de Ellman (ácido 5,5'-ditiobis-2-nitrobenzóico, disponível na empresa Aldrich) a pH 5,5 (2,0 equivalentes), guanidina 6M em tampão acetato de Na 100 mM. Isto dá o péptido SNB-tioéster (péptido-a-COSNB) que é subsequentemente purificado por cromatografia líquida de alta resolução de fase inversa (RPHPLC). (2) Reacção de um péptido tioácido liofilizado bruto (péptido-a-COSH) com brometo de benzilo a pH 4,0, guanidina 6 M e tampão acetato de Na 100 mM. 0 benziltioéster (péptido-a-COSBn) é então purificado através de RPHPLC.

As condições acima apontadas permitem a formação de um oligonucleótido desprotegido que está equipado com o tioéster activado. A reacção subsequente com um segundo péptido contendo um resíduo de cisteína terminal, permite um fácil acoplamento com a formação de uma ligação peptídica nativa e pode gerar cadeias oligopeptídicas de 100 ou mais resíduos de aminoácidos (Esquema 1).

Em casos favoráveis, a síntese química já teve contribuições importantes para a exploração da relação da estrutura proteica com a função. A síntese por passos em fase sólida permitiu a preparação de novo de pequenas proteínas (14) e houve vários exemplos notáveis da utilização deste método de síntese proteica total para explorar a base molecular da função biológica. Outro método que em casos especiais permitiu que a química fosse aplicada ao estudo de proteínas é a semi-síntese através de re-ligação conformacionalmente assistida de fragmentos peptídicos. Uma extensão importante da abordagem de

a / U4i

EP 0 832 096/PT 18 semi-síntese é a utilização de ligação enzimática de segmentos peptídicos clonados ou sintéticos. Embora estes métodos tenham actualmente graves limitações, continua a haver um sério interesse numa aplicação mais vasta das ferramentas da química orgânica ao estudo de proteínas. A ligação química nativa proporciona precisamente essa capacidade. Combina a formação de um ligação peptídica nativa no local de ligação com as vantagens da reacção quimiosselectiva de péptidos desprotegidos. Esta química de ligação de segunda geração aumenta drasticamente o tamanho dos polipéptidos de esqueleto nativo directamente acessíveis através de síntese química total. Pode ser utilmente aplicada a uma grande variedade de alvos sintéticos, incluindo proteínas de tamanho moderado e permite o acesso directo a domínios proteicos funcionais. A ligação química nativa é uma pedra basilar de uma abordagem modular geral à síntese química total de proteínas. Para além disso, é compatível com a utilização de péptidos sintetizados quimicamente e de segmentos peptídicos derivados de outras fontes. A síntese química total directa de proteínas representa a concretização de um importante objectivo da química orgânica. Proporciona variação sem restrições da estrutura covalente proteica tornada possível através do acesso sintético geral e proporciona um novo ímpeto à exploração da base estrutural de propriedades tais como dobragem, estabilidade, actividade catalítica, ligação e acção biológica.

Numa concretização alternativa, o segmento peptídico ou módulo proteico carboxi-terminal pode ser expresso através de meios Standard de ADNrec; desde que o produto contivesse um resíduo Cys N-terminal, podia fazer-se reagi-lo com o péptido-a-COSR sintético amino-terminal utilizando a ligação química nativa aqui descrita para dar um produto no qual parte da proteína foi derivada de síntese química e parte de síntese ribossómica.

Descricão Detalhada:

Formação do péptido-a-tioácido

Um procedimento típico para a formação e utilização do ligante à resina tioéster para utilização na síntese em fase sólida de péptido-a-tioácidos é tal como se segue: (Kent et a!., Tetrahedron Lett. (1995): vol. 36, pág. 1217).

87 041 ΕΡ 0 832 096/ΡΤ 19 Ácido 4-(a-mercaptobenzil)fenoxiacético, diciclo-hexilamina (3) Esquema 2. Uma mistura de 2, formada utilizando as condições estabelecidas por Yamashiro et el., Int. J. Pept. Protein Rcs. (1988): vol. 31, págs. 322-334, (7,5 gramas, 27 mmol), tioureia (2,3 g, 30 mmol) e etanol (100 ml) foi aquecida em refluxo (condições conforme relatadas por Koening et al., J. Org. Chem. (1958): vol. 23, págs. 1525-1530). Após 4 horas, a conversão em sal de tiourónio estava essencialmente completa tal como mostrado por TLC (clorofórmio:metanol:ácido acético 90:5:5). Foi adicionado NaOH 10 N (30 ml) e continuou-se o refluxo durante 2-3 horas. Após arrefecimento até temperatura ambiente, a mistura reaccional foi concentrada in vacuo para aproximadamente metade do volume original, acidificada com HCI concentrado (até pH 2,0) e extractada com acetato de etilo (4x30 ml). Os extractos de acetato de etilo combinados foram lavados com NaCI saturado (1x30 ml) e secos sobre MgS04. Os materiais voláteis foram removidos in vacuo. O óleo resultante foi dissolvido em acetato de etilo (100 ml) e qualquer material insolúvel foi filtrado. Foi adicionado ao filtrado DCHA (diciclo-hexilamina - disponível na empresa Aldrich), (6,0 ml, 30 mmol) com agitação. Em poucos minutos, começou a precipitar um sólido branco. Foi adicionado éter dietílico (150 ml) e a suspensão arrefecida para -20°C durante várias horas. O sólido branco resultante foi filtrado, lavado com éter dietílico e seco sob vácuo para dar 3 (10,3 g, 23 mmol, 84%): λΜΝ-’Η (CDCI3): δ 7,30 (m, 7H), 6,82 (d, 2H, J = 8,7 Hz), 5,39 (s Ig, 1 H)„ 4,40 (s, 2H), 2,81 (m, 2H), 2,23 (s Ig, 1H, ex D20), 1,88-1,02 (m comp, 20H); FAB MS (ião césio): calc. para [C27H37N03S, H+] 456,2572, verificado 456,2572. Anál. cal. para C27H37N03S: C, 71,17; H, 8,18; N, 3,07; S, 7,04. Verificado: C, 71,11; H, 8,41; N, 3,08; S, 7,09. Síntese geral do ligante Boc-aminotioéster (1), sal de diciclo-hexilamina (Esquema 2). Uma mistura de 3 (3,67 mmol), Boc-Ala-OSu (disponível em Novabiochem Corp.) (3,68 mmol), DIEA (diisopropiletilamina - 5,74 mmol), dimetilformamida (35 ml) e cloreto de metileno (4 ml) foi agitada à temperatura ambiente. Após várias horas, a suspensão branca inicial dissolveu-se complctamente para dar uma solução límpida incolor. Após 24 horas, a mistura reaccional foi vertida para HCI 1 N (150 ml) e extractada com acetato de etilo (4x35 ml). Os extractos de acetato de etilo combinados foram lavados com HCI 1 N (2x30 ml), H20 (1x30 ml), NaCI saturado (1x30 ml) e secos sobre MgS04. Os voláteis foram removidos in vacuo. O óleo resultante foi purificado por cromatografia flash (clorofórmio:MeOH:ácido acético 925:50:25) para dar um 20 87 041 ΕΡ 0 832 096/ΡΤ óleo contaminado com ácido acético. Para remover o ácido acético residual, o óleo foi dissolvido em clorofórmio (40 ml) e lavado com HCI 0,1 N (7x10 ml), NaCI saturado (1x10 ml) e seco sobre MgS04. Os voláteis foram removidos in vacuo para dar 1 na forma de um óleo. Este óleo foi dissolvido em éter dietílico (10 ml) ao qual foi adicionada diciclo-hexilamina (1 equivalente). Foi adicionado hexano (100 ml) com agitação para separar o sal de diciclo-hexilamina de 1 na forma de um óleo espesso de qualquer diciclo-hexilamina que não tenha reagido. Os solventes foram decantados do óleo e o óleo foi dissolvido em CH2CI2 (30-40 ml). A solução resultante foi concentrada in vacuo para dar o sal de diciclo-hexilamina 1 na forma de um sólido esponjoso branco (Esquema 2).

Um exemplo da ligação e síntese na resina é tal como se segue: é adicionado ácido 4-[a-(Boc-Ala-S)benzil]fenoxiacético (0,80 mmol) em 9 ml de cloreto de metileno a 1,00 g de aminometil-resina (0,40 mmol) e tratado a 0°C com 1,33 ml de DCCI 0,6 M (diciclo-hexilcarbodiimida) em cloreto de metileno durante 15 min. e a 24°C durante 30 minutos. 0 produto é então sujeito a condições de síntese peptídica em fase sólida Standard (Kent et al., Tetrahedron Letters (1995): vol. 36, pág. 1217; J. Blake, Int. J. Pept. Protein Res. (1981): vol. 17, pág. 273). Uma vez sintetizada a cadeia desejada, a resina peptídica (carga original de aprox. 45 pmol) é tratada em 8 ml de HF líquido (0,8 ml de anisolo) a 0°C durante 1 hora. Após evaporação com azoto, o resíduo é lavado com acetato de etilo. 0 sólido é subsequentemente agitado em água (aprox. 1 5 ml) a 0°C enquanto se ajusta o pH para 6,0 com bicarbonato de amónio sólido. A filtração e liofilização dão o produto tioácido bruto que pode ainda ser purificado por HPLC preparativa em lotes de 30 mg.

Preparação do segmento peptídico tioéster terminal O péptido tioéster α-COSR pode ser sintetizado de dois modos gerais: (1) Reacção de um péptido tioácido liofilizado bruto com reagente de Ellman (ácido 5,5'-ditiobis-2-nitrobenzóico, disponível na empresa Aldrich) a pH 5,5 (2,0 equivalentes), yuanidina 6 M em tampão acetato de Na 100 mM. Isto dá o péptido SNB-tioéster que é subsequentemente purificado por cromatografia líquida de alta resolução de fase inversa (RPHPLC). 21 87 041 ΕΡ 0 832 096/ΡΤ 1 Hora

LYRAGCRAEYS pH 6.8

CRAEYS LYRAG-SBenz

JL _Λ_n_A. Λ C 0 25.0 I Hora

CRAEYS pH 6.0 LYRAG-SBenz

LYRAGCRAEYS -va-

25.0 pH 4.7 0.0 25.0

Esquema 3

87 041 ΕΡ 0 832 096/ΡΤ 22 (2) Reacção de um péptido tioácido liofiiizado bruto com brometo de benzilo a pH 4,0, guanidina 6 M e tampão acetato de Na 100 mM. O benziltioéster é então purificado por RPHPLC.

As condições acima apontadas permitem a formação de um oligonucleótido desprotegido que está equipado com o tioéster activado. A subsequente reacção com um segundo péptido contendo um resíduo de cisteína terminal, permite um fácil acoplamento com a formação de uma ligação peptídica nativa e pode gerar cadeias oligopeptídicas de 100 ou mais resíduos de aminoácido (Esquema 1).

Exemplos

Exemplo 1 O péptido modelo Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-aCOSH (Sequência No.: 1) é preparado através de síntese peptídica por passos em fase sólida optimizada numa resina de aminometilo). O ligante à resina tioéster é preparado através de uma versão generalizada adoptada a partir de Kent et al., Tetrahedron Letters (1995): vol. 36, pág. 1217, J. Blake, Int. J. Pept. Protein Res. (1981): vol. 17, pág. 273; D. Yamashiro e C.H. Li, ibid. (1988): vol. 31, pág. 322. Uma vez sintetizada a cadeia desejada, a resina peptídica (carga original de aprox. 45 prnol) é tratada em 8 ml de HF líquido (0,8 ml de anisolo) a 0°C durante 1 hora. Após evaporação com azoto, o resíduo é lavado com acetato de etilo. O sólido é subsequentemente agitado em água (aprox. 15 ml) a 0°C enquanto se ajusta o pH para 6,0 com bicarbonato de amónio sólido. A filtração e a liofilização dão o produto tioácido bruto que pode ainda ser purificado por HPLC preparativa em lotes de 30 mg. O segmento peptídico tioéster terminal é subsequentemente preparado a partir do fragmento tioácido através de síntese química para o equipar com a funcionalidade α-COSR necessária onde R é um grupo alquilo tal como benzilo, ácido 5-tio-2-nitrobenzóico (-SNB), tiofenol, etc. A utilização de melhore.·? grupos rejeitados tioéster resultou em reacções de ligação mais rápidas. Assim, o péptido modelo Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-aCOSH (Sequência No.: 1) é primeiro convertido no éster tiobenzílico através de reacção com brometo de benzilo (15 equivalentes) em guanidina 6,0 M-HCI, pH 4,6, tampão acetato de sódio para formar Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-a-COSBn (Sequência No.: 3). O péptido resultante é

87 041 ΕΡ 0 832 096/ΡΤ 23 purificado sob condições Standard de cromatografia líquida de alta resolução de fase inversa (RPHPLC) utilizando aproximadamente 20-45% de acetonitrilo a 1% por minuto; monitorizado a 214 nm.

Para o péptido H-Cys-Arg-Ala-Glu-Tyr-Ser (Sequência No.: 2), os métodos em fase sólida permitem a preparação de péptidos com até 60 resíduos com bom rendimento e elevada pureza tal como descrito em M. Schnolzer, P. Alewood, D. Alewood, S.B.H. Kent, Int. J. Pept. Protein Res. (1992): vol. 40, 180.

Primeiro, para explorar o mecanismo da reacção, fez-se reagir o péptido Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-aCOSBn (Bn, benzilo; Sequência No.: 3) com Ac-Cys (contendo um grupo funcional a-NH2 bloqueado - comercialmente disponível em Novabiochem Corp.). A massa exacta do produto de ligação resultante, Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-a-C0S-CH2C(NHAc)C02H (Sequência No.: 4), foi determinada por espectrometria de massa por electropulverização e era consistente com um péptido ligado a tioéster tal como o produto de ligação gerado pelo ataque nucleofílico da cadeia lateral de Ac-Cys na porção α-tioéster do péptido.

Finalmente, a reacção de Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-a-COSBn (Sequência No.:3) com Cys-Arg-Ala-Glu-Tyr-Ser (Sequência No.: 2, contendo um grupo funcional a-NH2 desbloqueado) prosseguiu rapidamente a pH 6,8 (abaixo de pH 6,0 a reacção prosseguiu muito lentamente, sugerindo o envolvimento do tiolato ionizado da cadeia lateral de Cys a pH 6,8; Esquema 3) e deu um único produto com a massa esperada. Fizeram-se reagir os péptidos Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-a-COSBn + Cys-Arg-Ala-Glu-Tyr-Ser em tampão fosfato 0,1 M a pH 6,8, 6,0 e 4,7 a 25°C. Após 1 hora, as reacções tinham prosseguido tal como se segue: a pH 6,8 >95%; a pH 6,0 aproximadamente 10%; e a pH 4,7, aproximadamente 1,0% de produto ligado Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-Cys-Arg-Ala-Glu-Tyr-Ser (Sequência No.: 5). Tal como observado por HPLC, o Esquema 3 mostra a dependência do pH da reacção após 1 hora e a 25°C. Este produto não tinha susceptibilidade a nucleófilos e tinha a capacidade dc formar péptidos diméricos com ligações dissulfureto, indicando inequivocamente a formação de uma ligação amida nativa no local de ligação. 87 041 ΕΡ 0 832 096/ΡΤ 24

Data: Quarta-feira, Fev 2,1994 3:19 PM Dndoct I VRAn-SrH2rOO+rRAEYStO-001

Amostra: pH6.8 fosf 45 graus C

0 Hora Método: PbU047% Vol. delojcc: 20 lat. dc Amo* tracem: 0,2 segando» Dados: 3 CM « ca <B lyrag-sch2co2h d CRAEYS \ LYRAGCRAEYS • / 1 rt CD J__JL O o. -n, — - 37.0

Análise: Canal A

Pico N· Tempo Tipo Altura(pV) Área(pV-seg) Área % 1 1.506 NI 3161 10542 0.194 2 1.603 N2 9956 54777 1.011 3 2.230 N3 1465 14875 0.274 4 2.833 N 5628 53493 0.987 5 10.276 NI 10621 46495 0.895 6 10.410 N2 177905 958119 17.689 7 11.310 N 27080 145916 2.693 8 12.186 N1 5217 29312 0.541 9 12,376 N2 2379 13576 C.250 1 0 12.546 N3 127436 729096 13.460 1 1 13.076 N 2340 1 ·> - " · - ~

Esquema 4

87 041 ΕΡ 0 832 096/ΡΤ 25

Outro modelo não publicado utilizando o derivado de ácido 2-tioacético Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-SCH2COOH (Sequência No.: 6, formado a partir do ataque do tioácido Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-SH (Sequência No.:1) sobre o ácido 2-bromoacético em cloreto de metileno) + Cys-Arg-Ala-Glu-Tyr-Ser (Sequência No.:2) foi ligado a pH 6(8 em tampão fosfato 0,2 M, a 45°C. Após 1 hora a reacção tinha prosseguido até 80% tal como observado no Esquema 4 por HPLC. 0 isolamento dos produtos de oxidação do Leu-Tyr-Arg-Ala-Gly-Cys-Arg-Ala-Glu-Tyr-Ser ligado (Sequência No.:5) e do Cys-Arg-Ala-Glu-Tyr-Ser que não reagiu, demonstrou a presença de um produto de ligação tiol livre. O procedimento de ligação química nativa é geralmente aplicável a péptidos contendo toda a gama de grupos funcionais, normalmente encontrados em proteínas. Até mesmo resíduos Cys internos livres podem estar presentes em qualquer um dos segmentos reagentes. Os resíduos Cys internos podem sofrer trocas de ésteres com o componente péptido-a-tioéster; no entanto, esta reacção não é produtiva porque não podem ocorrer rearranjos na ligação amida, o tioéster formado é prontamente reversível e permanece uma parte produtiva do sistema reagente. 0 procedimento de ligação química nativa está limitado à reacção num resíduo Cys amino-terminal. Para evitar a oxidação do tiol da cadeia lateral deste Cys para formar um dímero ligado por dissulfureto, é utilizado um excesso de tiol correspondendo ao grupo rejeitado tioéster para manter os resíduos Cys na forma reduzida sem interferir com a reacção de ligação. Adicionalmente, são adicionadas à mistura reaccional de acoplamento pequenas quantidades de tióis de baixo peso molecular tais como tiofenol para manter um ambiente redutor. A adição de tióis aumenta a reactividade do tioéster, particularmente se o tiol adicionado é um grupo rejeitado melhor que o tioéster pré-formado. Um exemplo desta observação é quando o éster benzílico é convertido num éster fenílico através da adição de tiofenol à reacção. Os rendimentos e velocidades da reacção são substancialmente aumentados. Por exemplo, após 7 horas com benzilmercaptano, a reacção de Barnase rendeu 25%, enquanto que o tratamento com tiofenol da mesma mistura reaccional rendeu 90%. A adição de tióis à mistura de ligação mantém também a mistura reaccional numa forma reduzida. Isto evita a oxidação dos resíduos Cys

87 041 ΕΡ 0 832 096/ΡΤ 26 N-terminais reactivos e quando estão presentes resíduos Cys internos, os tióis reduzem a formação de pontes dissulfureto intramoleculares. Adicionalmente, o ambiente redutor aumenta a estabilidade do segmento tioóster (as reacções de ligação podem prosseguir durante a noite com pouca ou sem nenhuma hidrólise a pH 7,5).

Exemplo 2: Protease K41 de HIV-1 (condições não publicadas)

As reacções de ligação são efectuadas de vários modos. Um procedimento optimizado para uma reacção de ligação envolvendo um tioéster SNB (ácido 5-tio-2-nitrobenzóico) é pesar os dois péptidos, HIV (1-40)-C0SNB (Sequência No.: 11, formada a partir de condições Standard aqui apontadas) e HIV (41-99) (Sequência No.: 12, formada a partir de condições Standard aqui apontadas), na forma de sólidos no mesmo vaso reaccional e adicionar guanidina 6,0 M-HCI, pH 6,5 com acetato de Na 100 mM (a concentração peptídica aproximada é de 7-13 mg/ml de cada péptido).

Após 5 min., adiciona-se tiol aprox. a 2,0%. Foram utilizados dois catalisadores de tiol, viz. benzilmercaptano (forma o benziltioéster in situ; Sequência No.: 13) e tiofenol (forma o feniltioéster in situ; Sequência No.: 14). Na ligação de PR de HIV, a reacção com benzilmercaptano deu um rendimento de produto superior a 60% em 40 horas enquanto que o tiofenol deu um rendimento de produto superior a 80% em 10 horas para formar a protease K41 de HIV-1 (Sequência No.: 15).

Verificou-se que o tratamento subsequente com TCEP ajudava na purificação e análise do produto através da redução dos produtos dissulfureto de tiofenol e benzilmercaptano que tendem a co-eluir com produtos peptídicos. O produto foi purificado por HPLC de fase inversa Standard tal como descrito supra e caracterizado por espectroscopia de massa por electropulverização (Esquema 9).

Exemplo 3. Exemplo da Barnase (condições não publicadas)

Os dois péptidos Barnase(1-48)-SNB (Sequência No.: 16, formada a partir de condições Standard aqui apontadas) e Barnase(49-110) (Sequência No.: 17, formada a partir de condições Standard aqui apontadas) foram pesados na forma de sólidos no mesmo vaso reaccional e dissolvidos em tampão a pH 7,5 (guanidina 6 M fosfato 100 mM). Imediatamente após a dissolução dos

rc 87 041 ΕΡ 0 832 096/ΡΤ 27 péptidos, foi adicionado benzilmercaptano a 2% (forma o benziltioéster in situ; Sequência No.: 18) ou tiofenol a 4% (forma o feniltioéster in situ; Sequência No.: 19). Após 7 horas, a reacção de benzilmercaptano prosseguiu 25% e a reacção de tiofenol prosseguiu até >90% para formar Barnase(1-110) (Sequência No.: 20). O produto foi purificado por HPLC de fase inversa Standard tal como descrito supra (Esquema 10). A adição de tióis aumenta a reactividade do tioéster, particularmente se o tiol adicionado for um grupo rejeitado melhor que o tioéster pré-formado. Um exemplo desta observação é quando o éster benzílico é convertido num éster fenílico através da adição de tiofenol à reacção. Os rendimentos e velocidades da reacção são substancialmente aumentados. Por exemplo, após 7 horas com benzilmercaptano, a reacção de Barnase rendeu 25%, enquanto que o tratamento com tiofenol da mesma mistura reaccional rendeu 90% para formar Barnase (1-110) (Sequência No.: 20). A adição de tióis à mistura de ligação mantém também a mistura reaccional numa forma reduzida. Isto evita a oxidação dos resíduos Cys N-terminais reactivos e quando estão presentes resíduos Cys internos, os tióis reduzem a formação de pontes dissulfureto intramoleculares. Adicionalmente, o ambiente redutor aumenta a estabilidade do segmento tioéster (as reacções de ligação podem prosseguir durante a noite com pouca ou nenhuma hidrólise a pH 7,5). 87 041 ΕΡ 0 832 096/ΡΤ 28

Protease Κ41 de HIV-1 Mutante

Sintetizada por Ligação Química Nativa

1 -4C 41-99

NH;-COSR . Cys-COOH 1-4C «1-99

NH2-Cys-COOH 0.0

Esquema 9 29 87 041 ΕΡ 0 832 096/ΡΤ BARNASE Κ391-48COSR + 49(CYS)-110

Esquema 10 87 041 ΕΡ 0 832 096/ΡΤ 30

LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS

(1) INFORMAÇÃO GERAL (i) REQUERENTE: (A) NOME: The Scripps Research Institute (B) RUA: 10666 North Torrey Pines Road, Suite 220, Mail Drop TPC8 (C) CIDADE: Lo Jolla

(D) ESTADO: CA

(E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL: 92037 (G) TELEFONE: 619-554-2937 (H) TELEFAX: 619-554-6312

(ii) TÍTULO DO INVENTO: SÍNTESE DE PROTEÍNAS ATRAVÉS DE LIGAÇÃO

QUÍMICA NATIVA (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 20 (iv) FORMATO LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete

(B) COMPUTADOR: Compatível com IBM PC

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SUPORTE LÓGICO: Patentln Release #1.0, Versão #1.25 (EPO) (v) DADOS DO PRESENTE PEDIDO:

(A) NÚMERO DO PEDIDO: PCT/US (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 4-MAI0-1995 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICA PRINCIPAL: (A) NOME/CHAVE: Local modificado

87 041 ΕΡ 0 832 096/ΡΤ 31

(Β) LOCALIZAÇÃO: 5 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: l\abe\= COSH /nota= "Em que COSH é tioácido" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1:

Leu Tyr Arg Ala Gly 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 6 aminoácidos (A) TIPO: aminoácido (B) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2: Cys Arg Ala Glu Tyr Ser 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICA PRINCIPAL: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 5 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /label = COSBn /nota = "Em que COSBn é benziltioéster" 32 87 041 ΕΡ 0 832 096/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3:

Leu Tyr Arg Ala Gly 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA RFOIJFNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICA PRINCIPAL: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 5

(D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /label = X /nota = "Em que X é N-acetil-cisteína-tioéster" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4:

Leu Tyr Arg Ala Gly 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 11 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5:

Leu Tyr Arg Ala Gly Cys Arg Ala Glu Tyr Ser 1 5 10 33 87 041 ΕΡ 0 832 096/ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 5 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICA PRINCIPAL: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 5

(D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /label = SCH2COOH /nota = "Em que SCH2COOH é ácido 2-tioacético" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6:

Leu Tyr Arg Ala Gly 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICA PRINCIPAL: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 33 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /label = COSH /nota = "Em que COSH é tioácido" (ix) CARACTERÍSTICA PRINCIPAL: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 1 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /label = Msc /nota = "Em que Msc é 2-metil-sulfonil-etiloxi-carbonilo"

87 041 ΕΡ 0 832 096/ΡΤ 34 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 7:

Ser 1 Ala Lys Glu Leu 5 Arg Cys Gin Cys lie 10 Lys Thr Tyr Ser Lys 15 Pro Phe His Pro Lys 20 Phe lie Lys Glu Leu 25 Arg Vai lie Glu Ser 30 Gly Pro (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 33 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICA PRINCIPAL: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 33 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /label = COSBn /nota = "Em que COSBn é benziltioéster" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 8:

Ser 1 Ala Lys Glu Leu 5 Arg Cys Gin Cys lie 10 Lys Thr Tyr Ser Lys 15 Pro Phe His Pro Lys 20 Phe lie Lys Glu Leu 25 Arg Vai He Glu Ser 30 Gly Pro

Ala (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 39 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

87 041 ΕΡ 0 832 096/ΡΤ 35 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 9:

Cys Ala Asn Thr Glu lie lie Vai Lys Leu Ser Asp Gly Arg Glu Leu 1 5 10 15 Cys Leu Asp Pro Lys Glu Asn Trp Vai Gin Arg Vai Vai Glu Lys Phe 20 25 30 Leu Lys Arg Ala Glu Asn Ser 35 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 72 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICA PRINCIPAL: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 72 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /label = SH4 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 10:

Ser Ala Lys Glu Leu Arg Cys Gin Cys lie Lys Thr Tyr Ser Lys Pro 1 5 10 15 Phe His Pro Lys Phe lie Lys Glu Leu Arg Vai lie Glu Ser Gly Pro 20 25 30 Ala Cys Ala Asn Thr Glu lie lie Vai Lys Leu Ser Asp Gly Arg Glu 35 40 45 Leu Cys Leu Asp Pro Lys Glu Asn Trp Vai Gin Arg Vai Vai Glu Lys 50 55 60 Phe Leu Lys Arg Ala Glu Asn Ser 65 70 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 40 aminoácidos (B) . TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido

87 041 ΕΡ 0 832 096/ΡΤ 36 (ix) CARACTERISTICA PRINCIPAL: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 40

(D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /label = COSNB /nota = "Em que COSNB é éster de ácido 5-tio-2-nitrobenzóico" (ix) CARACTERISTICA PRINCIPAL: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 27 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /label = Xaa /nota = "Em que Xaa é ácido 2-aminobutírico" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 11:

Pro Gin lie Thr Leu Trp Lys Arg Pro Leu Vai Thr lie Arg lie Gly 1 5 10 15 Gly Gln Leu Lys Glu Ala Leu Leu Asp Thr Gly Ala Asp Asp Thr Vai 20 25 30 lie Glu Glu Met Asn Leu Pro Gly 35 40 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 59 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) Cadeia: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERISTICA PRINCIPAL: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 27 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /label = Xaa /nota = "Em que Xaa é ácido 2-aminobutírico (ix) CARACTERISTICA PRINCIPAL: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 55 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /label = Xaa /nota = "Em que Xaa é ácido 2-aminobutírico"

87 041 ΕΡ 0 832 096/ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 12:

Cys Trp Lys Pro Lys Met lie Gly Gly lie Gly Gly Phe lie Lys Vai 1 5 10 15 Arg Gin Tyr Asp Gin lie Pro Vai Glu lie Xaa Gly His Lys Ala lie 20 25 30 Gly Thr Vai Leu Vai Gly Pro Thr Pro Vai Asn lie lie Gly Arg Asn 35 40 45 Leu Leu Thr Gin lie Gly Xaa Thr Leu Asn Phe 50 55 60 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (D) COMPRIMENTO: 40 aminoácidos (E) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICA PRINCIPAL: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 40 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /label = COSBn /nota = "Em que COSn é ??" (ix) CARACTERÍSTICA PRINCIPAL: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 40 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /label = COSBn /nota = "Em que COSn é benzil-tioéster" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 13:

Pro Gin lie Thr Leu Trp Lys Arg Pro Leu Vai Thr lie Arg lie Gly 1 5 10 15 Gly Gin Leu Lys Glu Ala Leu Leu Asp Thr Gly Ala Asp Asp Thr Vai 20 25 30 lie Glu Glu Met Asn Leu Pro Gly 35 40 V 87 041 ΕΡ 0 832 096/ΡΤ 38

(2) INF0RMAÇA0 PARA SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 40 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICA PRINCIPAL: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 40 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /label = COSPh /nota = "Em que COSPh é feniltioéster” (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 14:

Pro 1 Gin lie Thr Leu 5 Trp Lys Arg Pro Leu 10 Vai Thr lie Arg lie 15 Gly Gly Gin Leu Lys 20 Glu Ala Leu Leu Asp 25 Thr Gly Ala Asp Asp 30 Thr Vai (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 99 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICA PRINCIPAL: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 67 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /label = Xaa /nota = "Em que Xaa é ácido aminobutírico" 87 041 ΕΡ 0 832 096/ΡΤ 39

&' <κί> (ιχ) CARACTERÍSTICA PRINCIPAL: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (Β) LOCALIZAÇÃO: 95 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /label = Xaa /nota = "Em que Xaa é ácido 2-aminobutírico" (xi) DESCRICÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 15:

Pro Gin lie Thr Leu Trp Lys Arg Pro Leu Vai Thr lie Arg lie Gly 1 5 10 15 Gly Gin Leu Lys Glu Ala Leu Leu Asp Thr Gly Ala Asp Asp Thr Vai 20 25 30 lie Glu Glu Met Asn Leu Pro Gly Cys Trp Lys Pro Lys Met lie Gly 35 40 45 Gly lie Gly Gly Phe lie Lys Vai Arg Gin Tyr Asp Gin lie Pro Vai 50 55 60 65 Glu lie Xaa Gly His Lys Ala lie Gly Thr Vai Leu Vai Gly Pro Thr 70 75 80 Pro Vai Asn lie lie Gly Arg Asn Leu Leu Thr Gin lie Gly Xaa Thr 85 90 95 Leu Asn Phe 100 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 48 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICA PRINCIPAL: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 48

(D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /label = COSNB /nota = "Em que COSNB é éster de ácido 5-tio-2-nitrobenzóico"

07 041 ΕΡ 0 832 096/ΡΤ 40 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 16:

Ala 1 Gin Vai lie Asn 5 Thr Phe Asp Gly Vai 10 Ala Asp Tyr Leu Gin 15 Thr Tyr His Lys Leu 20 Pro Asn Asp Tyr lie 25 Thr Lys Ser Glu Ala 30 Gin Ala Leu Gly 35 Trp Vai Ala Ser Lys 40 Gly Asn Leu Ala Asp 45 Vai Ala Pro Gly (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 62 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 17:

Cys Ser lie Gly Gly Asp lie Phe Ser Asn Arg Glu Gly Lys Leu Pro 1 5 10 15 Gly Lys Ser Gly Arg Thr Trp Arg Glu Ala Asp lie Asn Tyr Thr Ser 20 25 30 Gly Phe Arg Asn Ser Asp Arg lie Leu Tyr Ser Ser Asp Trp Leu lie 35 40 45 Tyr Lys Thr Thr Asp His Tyr Gin Thr Phe Thr Lys lie Arg 50 55 60 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 48 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (F) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICA PRINCIPAL: (A) NOME/CHAVE: Local modificado

87 0Ί1 ΕΡ Ο 832 096/ΡΤ 41 (Β) LOCALIZAÇÃO: 48 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /label = COSBn /nota = "Em que COSBn é benziltioéster" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 18:

Ala 1 Gin Vai lie Asn 5 Thr Phe Asp Gly Vai 10 Ala Asp Tyr Leu Gin 15 Thr Tyr His Lys Leu 20 Pro Asn Asp Tyr lie 25 Thr Lys Ser Glu Ala 30 Gin Ala Leu Gly Trp 35 Vai Ala Ser Lys Gly 40 Asn Leu Ala Asp Vai 45 Ala Pro Gly (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 48 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (ix) CARACTERÍSTICA PRINCIPAL: (A) NOME/CHAVE: Local modificado (B) LOCALIZAÇÃO: 48 (D) OUTRAS INFORMAÇÕES: /label = COSPh /nota = "Em que COSPh é feniltioéster" (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 19:

Ala Gin Vai lie Asn Thr Phe Asp Gly Vai Ala Asp Tyr Leu Gin Thr 1 5 10 15 Tyr His Lys Leu Pro Asn Asp Tyr lie Thr Lys Ser Glu Ala Gin Ala 20 25 30 Leu Gly Trp Vai Ala Ser Lys Gly Asn Leu Ala Asp Vai Ala Pro Gly 35 40 45 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 20: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 110 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (U) CAUtIA: simples 42 4 87 041 ΕΡ 0 832 096/ΡΤ (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 10:

Ala Gin Vai lie Asn Thr Phe Asp Gly Vai Ala Asp Tyr Leu Gin Thr 1 5 10 15 Tyr His Lys Leu Pro Asn Asp Tyr lie Thr Lys Ser Glu Ala Gin Ala 20 25 30 l ou Gly Trp Vai Ala Ser Lys Gly Asn Leu Ala Asp Vai Ala Pro Gly 35 40 45 Cys Sor llt! Gly Gly Asp lie Phe Ser Asn Arg Glu Gly Lys Leu Pro 50 55 60 Gly Lys Scr Gly Arg Thr Trp Arg Glu Ala Asp lie Asn Tyr Thr Ser 65 70 75 80 Gly Phe Ary Asn Ser Asp Arg lie Leu Tyr Ser Ser Asp Trp Leu lie 85 90 95 Tyr Lys Thr Thr Asp His Tyr Gin Thr Phe Thr Lys lie Arg 100 105 110

Lisboa,

Por THE SCRIPPS RESEARCH INSTITUTE - O AGENTE OFICIAL -

NTÓNIO JOÃO bA CUNHA FEBREIRA &g. OT ted* ! Rira -das iC i ores, Tí4r->-4^f __Jí£0&-ÍS5'IJ LSKSAí'.

Claims

87 041 PE 0 832 096/PT 1/2 REIVINDICAÇÕES 1. Método para ligar um primeiro oligopéptido com um segundo oligopéptido, extremidade com extremidade, para produzir um produto oligopeptídico, compreendendo o método os seguintes passos: Passo A: mistura do primeiro e segundo oligopéptidos numa solução reaccional, incluindo o primeiro oligopéptido um tioéster C-terminal, incluindo o segundo oligopéptido uma cisteína N-terminal com uma cadeia lateral sulfidrilo não oxidada; depois Passo B: condensação da cadeia lateral sulfidrilo não oxidada da cisteína N-terminal com o tioéster C-terminal para produzir um oligopéptido intermediário que liga o primeiro e o segundo oligopéptidos com uma ligação β-aminotioéster; e depois Passo C: rearranjo da ligação β-aminotioéster do péptido oligopeptídico intermediário do referido Passo B para produzir o produto oligopeptídico que liga o primeiro e o segundo oligopéptidos com uma ligação amida, caracterizado por ser adicionado um tiol catalítico à solução reaccional no Passo A, em que o tiol catalítico (a) é um tiol acoplado ou tiolato ligado directamente a um anel aromático ou heteroaromático, (b) está presente numa concentração catalítica e (c) é diferente do tiol a partir do qual o referido tioéster C-terminal hipoteticamente se forma.
2. Método de acordo com a reivindicação 1 em que o tiol catalítico é um grupo rejeitado melhor que o tiol a partir do qual o tioéster C-terminal hipoteticamente se forma.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2 em que, no referido passo A, o tiol catalítico é seleccionado a partir do grupo que consiste em tiofenol, 1-tio-2-nitrofenol, ácido 2-tio-benzóico, 2-tio-piridina, ácido 4-tio-2-piridinocarboxílico e 4-tio-2-nitro-piridina.
4. Método de acordo com a reivindicação 3 em que, no referido passo A, o tiol acoplado é tiofenol. 87 041 PE 0 832 096/PT 2/2
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o oligopéptido possuindo um tioéster C-terminal é produzido através de um método compreendendo os seguintes passos: Passo A: proporcionar uma resina possuindo um ligante com um tiol não oxidado; Passo B: proporcionar um éster de succinimida de Boc-aminoácido; depois Passo C: misturar a resina do referido Passo A e o éster de succinimida de Boc-aminoácido do referido Passo B sob condições de reacção para produzir uma resina Boc-aminotioéster; depois Passo D: montar um oligopéptido sobre a resina Boc-aminotioéster através de síntese peptídica por passos em fase sólida; depois Passo E: clivar a resina Boc-aminotioéster do referido Passo D com HF para produzir um oligopéptido com um tiol C-terminal; e depois Passo F: converter o oligopéptido com um tiol C-terminal do referido Passo E no oligopéptido com um tioéster C-terminal. Lisboa, Por THE SCRIPPS RESEARCH INSTITUTE - 0 AGENTE OFICIAL -

Rua das Flores, 74-4.a 1200-195 LISBOA Eng.° ANTÔNIO JOÃO DA CUNHA FERREIRA Ag. Of. Pr. índ.