PT824539E - Compostos de dialquiltiacumicina - Google Patents

Description

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DESCRICÀO “Compostos de dialquiltiacumicina”

Campo técnico O presente invento refere-se a compostos antibióticos alquilados, derivados de antibióticos de tiacumicina, e a métodos úteis para a preparação de tais compostos, assim como a composições farmacêuticas que contêm esses compostos e à sua utilização no tratamento de infecções bacterianas.

Antecedentes do invento

Sabe-se que certos antibióticos que são activos contra uma larga gama de bactérias gram-positivas e outras, são produzidos por espécies de microorganismos isolados de amostras de solo de todo o mundo. Existe uma necessidade, no entanto, de novos agentes anti-microbianos que apresentem maior actividade, tenham uma eficácia de espectro específica ou melhorada, e/ou exibam propriedades farmacocinéticas mais desejáveis, quando administrados a um paciente. Uma via de investigação envolveu a derivação de antibióticos num esforço para melhorar as suas propriedades anti-microbianas.

No caso de colites associadas a antibacterianos ou de outras nosocomiais, existe uma particular necessidade de agentes anti-microbianos que ofereçam uma melhoria na velocidade de cura de longa duração, i.e. que reduzam a incidência de recaídas, observada, muitas vezes, com drogas vulgarmente usadas tais como vancomicina ou metronidazolo. As colites associadas a antibióticos, que podem surgir quando a flora gastrointestinal é suprimida por terapias antibióticas, são muitas vezes causadas pelo organismo Clostridium difficile. Existe, portanto, um propósito do presente invento em proporcionar agentes anti-microbianos que sejam particularmente activos contra Clostridium ao mesmo tempo que permitam, ainda, o restabelecimento de alguma ou de toda a flora normal.

Sumário do invento

Estabeleceu-se agora que se podem obter novos agentes anti-microbianos por modificação química de tiacumicinas, que são antibióticos isolados a partir do caldo de fermentação e micélio de subespécie Dactylsporangium aurantiacum subespécie nova hamdenensis. Os antibióticos de tiacumicina são descritos na Patente dos Estados Unidos N° 4918174, e compreendem os antibiólicus de tiacumicina A, tiacumicina B, tiacumicina C, 2 86 474 ΕΡ Ο 824 539 / ΡΤ tiacumicina D, tiacumicina Ε e tiacumicina F. Verifica-se que os compostos do presente invento que são derivados das tiacumicinas acima têm actividade in vitro contra uma variedade de patogénicos bacterianos, e em particular contra Clostridium quando avaliados num ensaio utilizando ágar Wilkins-Chalgren em condições anaeróbias. Espera-se, por isso, que esses compostos sejam úteis no tratamento de infecções bacterianas em mamíferos, e em particular no tratamento de certos exemplos de colites.

Consequentemente, num aspecto do presente invento, revelam-se compostos que possuem a fórmula:

(I) assim como as suas prodrogas farmaceuticamente aceitáveis, onde R é um substituinte da fórmula:

onde R31, R32 e R33 são independentemente seleccionados de hidrogénio e alcanoílo Ci a C4; R1 é hidrogénio ou hidroxi; e R2 é um substituinte da fórmula: 3 86 474 ΕΡ Ο 824 539 / ΡΤ

.....OR42 CH30 OR41

(Ib) onde um de R41 e R42 é hidrogénio e o outro é um radical da fórmula:

OR5

Cl (Ic) onde R5 é alquilo inferior em cada ocorrência.

Num aspecto adicional do invento, apresentam-se composições farmacêuticas que compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto do invento em combinação com um transportador farmaceuticamente aceitável.

Num outro aspecto do invento, apresenta-se um método de tratar uma infecção bacteriana gram-positiva e, em particular, uma causada pelo patogénico Clostridium difficile, num paciente que necessita desse tratamento, e que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto do invento ao paciente.

Num outro aspecto do invento, apresenta-se um método para tratar colite num paciente a necessitar desse tratamento, que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto do invento ao paciente.

Ainda num outro aspecto do invento apresenta-se um processo para preparar os compostos do invento que compreende os passos de: (a) isolar a tiacumicina de um meio de fermentação; (b) purificar a tiacumicina por precipitação ou por outros métodos; e (c) alquilar a tiacumicina nas posições 3 ” ’ e 5 ” ’.

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Breve descrição dos desenhos A descrição do presente invento, que se segue, será mais facilmente avaliada em união com os desenhos em anexo, nos quais: A FIGURA 1 é o espectro de ressonância magnética nuclear de hidrogénio de 3”,,5’”-di-0-metiltiacumicina B em metanol d4. A FIGURA 2 é 0 espectro de ressonância magnética nuclear de carbono de 3”\5”’-di-0-metiltiacumicina B em metanol d4. A FIGURA 3 é o espectro de infravermelhos de 3”’,5’”-di-0-metiltiacumicina B pura (de aquisição microscópica).

Descrição detalhada do invento

Entre os compostos do presente invento, os exemplos preferidos incluem os que possuem as fórmulas:

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e quaisquer suas prodrogas farmaceuticamente aceitáveis. Entre os compostos do presente invento preferem-se, em particular, aqueles em que Rs é metilo ou etilo, e mais em particular aqueles em que Rs é metilo.

Exemplos representativos dos compostos do presente invento são os derivados de tiacumicina que se seguem: 3 ” ’ ,5 ” ’-di-O-metiltiacumicina B; 3 ’ ”,5 ’ ”-di-0-metiltiacumicina C;

Rfi 474 EP 0 824 539 / PT 7

3 ” ’ ,5 ” ’-di-O-metiltiacumicina D; 3 ” ’ ,5 ” ’-di-O-metiltiacumicina E; 3”’,5”’-di-O-mctiltiacumicina F; 3 ’ ” ,5 ” ’-di-O-etiltiacumicina B; 3 ” \5 ” ’-di-O-etiltiacumicina C; 3 ” ’ ,5 ” ’ -di-O-etiltiacumicina D; 3,”,5”’-di-0-etiltiacumicina E; e 3 ” ’ ,5 ” ’-di-O-eti ltiacumicina F, e as suas prodrogas farmaceuticamente aceitáveis. Destes, o mais preferido entre os compostos do presente invento é o composto 3’’’,5’’’-di-0-metiltiacumicina B, que tem a fórmula estrutural:

O

l3 e que é considerado como o melhor modo de efectuar o presente invento.

Na forma usada ao longo desta especificação e nas reivindicações anexadas, os termos que se seguem têm os significados específicos: O termo “alquilo” como aqui se utiliza refere-se a um radical monovalente de hidrocarboneto de cadeia linear ou de cadeia ramificada, de 1 a 12 átomos de carbono incluindo, mas não se limitando a metilo, etilo, «-propilo, isopropilo, «-butilo, s-butilo, isobutilo, /-butilo, pentilo, hexilo, heptilo e outros afim. 8 86 474 ΕΡ Ο 824 539 / ΡΤ Ο termo “alcanoílo” com aqui se utiliza refere-se a um radical monovalente da fórmula -C(0)R”, onde R” é hidrogénio ou um grupo alquilo como se definiu acima, incluindo mas não se limitando a acetilo, propionilo, isobutirilo e outros afim. O termo “alcanoílo Ci a C4” como aqui se utiliza refere-se a um radical alcanoílo como se definiu acima, onde R” é hidrogénio ou um grupo alquilo de 1 a 3 átomos de carbono. O termo “alquilo inferior” como aqui se utiliza refere-se a um radical alquilo como se definiu acima, possuindo de 1 a 6 átomos de carbono. O termo “prodroga farmaceuticamente aceitável” como aqui se utiliza refere-se às prodrogas dos compostos do presente invento que são, no âmbito do correcto julgamento médico, adequadas para utilizar em contacto com os tecidos de humanos e animais inferiores sem inconveniente toxicidade, inritação, resposta alérgica e outros do género, comensurado com uma razão beneficio/risco razoável, e eficaz para a sua utilização pretendida, assim como a formas zwitteriónicas, quando possível, dos compostos do invento. O termo “prodroga” referc-se a compostos que são rapidamente transformados in vivo para produzirem o composto originador da fórmula acima, por exemplo por hidrólise em sangue. Proporciona-se uma discussão minuciosa em T. Higuchi e V. Stella, Pro-drugs as Novel Delivery Systems, Vol. 14 do “A.C.S. Symposium Series” e em Edward B. Roche, ed., Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceuticals Association e Pergamon Press, 1987, ambos incorporados aqui por referência.

Quando apropriado, as prodrogas dos derivados dos compostos do presente invento podem ser preparadas por qualquer método adequado. Para aqueles compostos em que a porção prodroga é uma função aminoácido ou péptido, a condensação do grupo amino com aminoácidos e péptidos pode scr efectuada em conformidade com os métodos convencionais de condensação, tais como o método de azida, o método misto de anidrido ácido, o método de DCC (diciclo-hexilcarbodiimida), o método do éster activo (método de éster de p-nitrofenilo, método de éster de imida de ácido N-hidroxi-succínico, método de éster de cianometilo e outros afim), o método de reagente K de Woodward, o método de DCC-HOBT (1-hidroxi-benzotriazolo) e outros afim. Os métodos clássicos para reacções de condensação de aminoácidos estão descritos em M. Bodansky, Y. S. Klausner e Μ. A. Ondetti, Peptide Synthesis, 2a Ed., NY, 1976. 9 86 474 ΕΡ Ο 824 539/ΡΤ

Podem existir centros assimétricos nos compostos do presente invento. Excepto quando se faz notar o contrário, o presente invento contempla os vários estereoisómeros e as suas misturas. Consequentemente, sempre que se represente de forma não estereo-específioa uma ligação, pretende-se englobar ambas as orientações.

Quando utilizado no tratamento anterior ou em outros tratamentos, pode-se utilizar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um dos compostos do presente invento na forma pura ou, quando essas formas existem, nas formas de sal, éster ou prodroga farmaceuticamente aceitável. Em alternativa, pode-se administrar o composto como composições farmacêuticas contendo o composto de interesse em combinação com um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Por uma “quantidade terapeuticamente eficaz” de composto do invento entende-se uma quantidade de composto suficiente para tratar a perturbação apontada, numa razão benefício/risco razoável e aplicável a qualquer tratamento médico. Será entendido, no entanto, que a utilização diária total dos compostos e composições do presente invento será decidida pelo médico assistente no âmbito do correcto julgamento médico. O nível específico de dose terapeuticamente eficaz para qualquer paciente em particular dependerá de uma variedade de factores incluindo a perturbação a ser tratada e a gravidade da perturbação; a actividade do composto específico utilizado; a composição específica utilizada; a idade, o peso, a saúde geral, o sexo e a dieta do paciente; o período de administração, a via de administração, e a velocidade de excreção do composto específico utilizado; a duração do tratamento; as drogas usadas em combinação ou coincidentes com o composto específico utilizado; e factores semelhantes bem conhecidos na arte médica. Por exemplo, está bem no âmbito da arte iniciar as doses do composto a níveis inferiores aos requeridos para atingir o efeito terapêutico desejado, e aumentar gradualmente a dosagem até se atingir o efeito desejado. A dose diária total dos compostos deste invento administrados a um humano ou animal inferior por administração oral pode variar de cerca de 0,01 a cerca de 100 mg/kg/dia. Doses mais preferidas podem ser da gama de cerca de 0,1 a cerca de 10 mg/kg/dia. Se desejado, a dose diária eficaz pode ser dividida em doses múltiplas para a administração; consequentemente, as composições de dose única podem conter essas quantidades ou suas submúltiplas como constituintes da dose diária.

As composições farmacêuticas do presente invento compreendem um composto do invento e um transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável, que pode ser administrado por via oral, rectal, parentérica, intracistemal, intravaginal, intraperitoneal, tópica (como através de pós, pomadas ou gotas), bucal, ou como um aerossol oral ou nasal. Por “transpurladui farmaceuticamente aceitável” entende-se um enchimento, diluente, 10 86 474 ΕΡ Ο 824 539 / ΡΤ material de encapsulação ou auxiliar de formulação de qualquer tipo, sólido, semi-sólido ou líquido, não tóxico. O termo “parentérica” como aqui se utiliza refere-se a modos de administração que incluem injecção intramuscular, intraperitoneal, intra-extemal, subcutânea e intra-articular e infusão.

As composições farmacêuticas deste invento para injecção parentérica incluem soluções não aquosas ou dispersões aquosas, suspensões ou emulsões estéreis, farmaceuticamente aceitáveis, assim como pós para a reconstituição em soluções ou dispersões estéreis injectáveis imediatamente antes de utilizar. Exemplos de transportadores aquosos ou não aquosos, diluentes, solventes ou veículos adequados incluem água, etanol, polióis (tais como glicerol, propilenoglicol, polietilenoglicol, e outros afim), carboximetilcelulose e suas misturas adequadas, óleos vegetais (tais como azeite), e ésteres orgânicos injectáveis como o oleato de etilo. Pode-se manter a fluidez adequada, por exemplo, utilizando materiais de revestimento tais como a lecitina, mantendo o tamanho de partículas adequado no caso de dispersões, e utilizando tensioactivos.

Estas composições podem também conter adjuvantes tais como conservantes, agentes humidificantes, agentes emulsionantes, e agentes dispersantes. A prevenção da acção de microorganismos pode ser assegurada incluindo vários agentes antibacterianos e antifungicos, por exemplo parabeno, clorobutanol, ácido fenolsórbico, e outros afim. Pode também ser desejável incluir agentes isotónicos tais como açúcares, cloreto de sódio, e outros afim. A absorção prolongada da forma farmacêutica injectável pode ser ocasionada pela inclusão de agentes que retardam a absorção, tais como o monoestearato de alumínio e a gelatina.

Em alguns casos, para prolongar o efeito da droga é desejável abrandar a absorção da droga da injecção intramuscular ou subcutânea. Isto pode ser conseguido utilizando uma suspensão líquida de material amorfo ou cristalino com fraca solubilidade em água. A velocidade de absorção da droga depende então da sua velocidade de dissolução que, por sua vez, depende do tamanho do cristal e da forma cristalina. Em alternativa, a absorção retardada de uma forma de droga administrada parentericamente é conseguida dissolvendo ou suspendendo a droga num veículo oleico.

As formas de fornecimento injectáveis são produzidas formando matrizes de microcápsula da droga em polímeros biodegradáveis tais como polilactido-poliglicolido. Dependendo da razão de droga para polímero e da natureza do polímero utilizado, em particular, pode-se controlar a velocidade de libertação de droga. Exemplos de outros polímeros biodegradáveis incluem poli(ortoésteres) e poli(anidridos). As formulações de 11 86 474 ΕΡ Ο 824 539 / ΡΤ fornecimento injectáveis podem também ser preparadas aprisionando a droga em lipossomas ou microemulsões que sejam compatíveis com os tecidos do corpo.

As formulações injectáveis podem ser esterilizadas, por exemplo, por filtração através de um filtro retentor de bactérias, ou incorporando agentes esterilizantes na forma de composições sólidas estéreis que se possam dissolver ou dispersar em água estéril ou noutro meio estéril injectável, imediatamente antes de utilizar.

As formas de dosagem sólidas para administração oral incluem cápsulas, comprimidos, pílulas, pós e grânulos. Nessas formas de dosagem sólidas, o composto activo é misturado com pelo menos um excipiente ou transportador inerte, faimaceuticamente aceitável, tal como o citrato de sódio ou fosfato dicálcico e/ou: a) cargas ou dilatadores tais como amidos, lactose, sacarose, glucose, manitol, e ácido silícico, b) aglutinantes tais como, por exemplo, carboximetilcelulose, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarose e goma arábica, c) humectantes tais como glicerol, d) agentes desagregantes tais como ágar-ágar, carbonato de cálcio, amido de batata ou de tapioca, ácido algínico, certos silicatos e carbonato de sódio, e) agentes retardadores de solução tais como parafina, f) aceleradores de absorção tais como compostos de amónio quaternários, g) agentes molhantes tais como, por exemplo, álcool cetílíco e monoestearato de glicerol, h) absorventes tais como argila de caulino c de bentonite, e i) lubrificantes tais como o talco, estearato de cálcio, estearato de magnésio, polietilenoglicóis sólidos e laurilsulfato de sódio, e suas misturas. No caso de cápsulas, comprimidos e pílulas, as formas de dosagem podem também compreender agentes tamponizantes.

Podem também ser utilizadas composições sólidas de um tipo semelhante, como cargas em cápsulas de gelatina de enchimento dura ou mole, usando excipientes como a lactose ou açúcar do leite assim como polietilenoglicóis de elevado peso molecular e outros semelhantes.

As formas de dosagem sólida como comprimidos, drageias, cápsulas, pílulas, e grânulos podem ser preparados com revestimentos e invólucros tais como revestimentos entéricos e outros revestimentos bem conhecidos na arte de formulação farmacêutica. Estes podem conter opcionalmente agentes de opacidade e podem ter também uma composição tal que libertam o(s) componente(s) activo(s) apenas, ou preferencialmente, numa determinada parte do tracto intestinal, opcionalmente num modo retardado. Exemplos de composições de encaixe que podem ser utilizadas incluem substâncias poliméricas e ceras. 12 86 474

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Os compostos activos também podem estar na forma de microcápsulas, se apropriado, com um ou mais dos excipientes supracitados.

As formas de dosagem líquida para administração oral incluem emulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixires farmaceuticamente aceitáveis. Em adição aos compostos activos, as formas de dosagem líquidas podem conter diluentes inertes vulgarmente utilizados na arte como, por exemplo, água e outros solventes, agentes estabilizantes e emulsionantes tais como álcool etílico, álcool isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, álcool benzílico, benzoato de benzilo, propilenoglicol, 1,3-butilenoglicol, dimetilformamida, óleos (em particular, óleos de semente de algodão, de amendoim, de milho, de gérmen, de azeitona, de rícino e de sésamo), glicerol, álcool tetra-hidrofurfurílico, polietilenoglicóis e ésteres de ácidos gordos de sorbitano, e suas misturas.

Para além dos diluentes inertes, as composições orais podem também incluir adjuvantes tais como agentes molhantes, agentes de emulsão e de suspensão, e agentes edul corantes, aromatizantes e perfumantes.

As suspensões podem conter, em adição ao composto activo, agentes de suspensão como, por exemplo, álcoois de isoestearilo etoxilados, polioxietilenosorbitol e ésteres de sorbitano, celulose microcristalina, meta-hidróxido de alumínio, bentonite, ágar-ágar, e tragacanto, e suas misturas. A administração tópica inclui a administração à pele ou mucosa, incluindo superfícies do pulmão e olho. As composições para a administração tópica, incluindo as destinadas a inalação, podem ser preparadas na forma de pó seco que pode ser pressurizado ou não pressurizado. Em composições de pó não pressurizado, o componente activo na forma finamente dividida pode ser utilizado em mistura com um transportador inerte farmaceuticamente aceitável de maior tamanho, compreendendo partículas que possuem uma dimensão, por exemplo, de até 100 micrómetros em diâmetro. Os transportadores inertes adequados incluem açúcares como a lactose. De modo desejável, pelo menos 95% em peso das partículas do componente activo tem um tamanho de partícula eficaz na gama de 0,01 a 10 micrómetros.

Em alternativa, a composição pode ser pressurizada e conter um gás comprimido, tal como o azoto ou um propelente de gás liquefeito. O meio propelente liquefeito e, na realidade, a composição total é de preferência tal, que o componente activo não se dissolve nele de forma significativa. As composições pressurizadas podem também conter um agente lemioactivo. O agente tcnsioactivo pode ser um agente tensiooctivo líquido ou sólido não

86 474 ΕΡ Ο 824 539/ΡΤ 13 iónico ou pode ser um agente tensioactivo aniónico sólido. Prefere-se utilizar o agente tensioactivo aniónico sólido na forma de um sal de sódio.

As composições para administração rectal ou vaginal são, de preferência, supositórios que podem ser preparados misturando os compostos deste invento com excipientes ou transportadores não irritantes adequados, tais como manteiga de cacau, polietilenoglicol ou uma cera de supositório que seja sólida à temperatura ambiente mas líquida à temperatura do corpo e, desta forma, funda no recto ou na cavidade vaginal e liberte o composto activo.

Os compostos do presente invento podem também ser administrados na forma de lipossomas. Como se sabe na arte, os lipossomas derivam geralmente de fosfolípidos ou outras substâncias lipídicas. Os lipossomas são formados por cristais líquidos hidratados mono- ou multi-lamelares que se dispersam num meio aquoso. Pode-se utilizar qualquer líquido mctabolizável e não tóxico, fisiologicamente aceitável, capaz de formar lipossomas. As presentes composições na forma de lipossomas podem conter, em adição ao composto do presente invento, eslabilizantes, conservantes, excipientes e outros afim. Os lípidos preferidos são os fosfolípidos e as fosfatidileolinas (lecitinas), tanto naturais como sintéticas. Os métodos para fomiar lipossomas são conhecidos na arte. Veja-se, por exemplo, Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, New York, N.Y., 1976, pp. 33 et seq.

Os compostos do invento podem ser preparados usando um ou mais dos processos que se seguem. As tiacumicinas utilizadas como materiais reagentes são disponibilizadas via fermentação como se descreve na Patente dos Estados Unidos N° 4918174 referida acima. As tiacumicinas podem ser alquiladas por uma variedade de métodos conhecidos dos peritos na arte, desde que, no entanto, essa alquilação possa exigir um material reagente de elevada pureza e uma metodologia adequada a alquilação selectiva.

A purificação das tiacumicinas pode ser realizada por precipitação a partir da solução. O material não purificado é primeiro dissolvido num solvente orgânico adequado e depois separado por precipitação na forma purificada pela adição de um co-solvente orgânico adequado. Os solventes orgânicos adequados incluem halogenetos de alquilo, tais como diclorometano, dicloroetano e outros afim e solventes alquilo polares tais como metanol, acetato de etilo, acetona e outros afim. Os co-solventes adequados incluem éteres e alcanos não polares. A tiacumicina purificada pode facilmente ser alquilada com diazometano, dimetilsulfato, brometo de etilo, dietilsulfato, iodeto de metilo e outros afim. O 86 474 ΕΡ Ο 824 539 / ΡΤ 14

diazometano, por exemplo, pode ser produzido por vários métodos vulgarmente conhecidos, e trata-se de um agente de alquilação preferido. A preparação dos compostos do presente invento é apresentada nos Esquemas I e II abaixo. De acordo com o Esquema I, um composto de fórmula 7 (tal como tiacumicina B, tiacumicina C, tiacumicina E ou tiacumicina F) pode ser selectivamente alquilado no anel aromático fenol para originar um composto de fórmula 2. (A tiacumicina D pode ser alquilada de forma análoga). De acordo com o Esquema II, a tiacumicina B (5) pode ser tratada com diazometano em éter para originar 3”’,5”’-di-0-metiItiacumicina B (¥).

Esquema I

Os compostos, processos e utilizações do presente invento serão mais bem entendidos com respeito aos exemplos que se seguem, que se destinam a ilustrar e não a limitar o âmbito deste invento. Tanto a seguir como ao longo da especificação, pretende-se que as citações à literatura estejam expressam ente incorporadas para referência. 16 86 474 ΕΡ Ο 824 539 / ΡΤ

Exemplo 1

Purificação de tiacumicina B

Dissolveram-se 0,61 g (0,578 mmol) de tiacumicina B (obtida por fermentação) em 2 ml de cloreto de metileno. Adicionou-se gota a gota a solução âmbar escuro resultante a uma solução agitada de 15 ml de hexano à temperatura ambiente. Depois de terminada a adição, aqueceu-se a mistura até imediatamente abaixo do ponto de ebulição e depois deixou-se arrefecer até à temperatura ambiente, resultando na precipitação de tiacumicina B. Recolheu-se por filtração o material purificado e lavou-se com hexano, para produzir 158 mg de um sólido de castanho pálido. P.f. 106-110°C (decomposição). A RMN de protões era compatível com a estrutura atribuída.

Exemplo 2

3,”.5,”-di-Q-metiltiacumicina B (Eò

Preparou-se uma solução de diazometano por: (a) adição de 2,5 g de Diazald (N-metil-N-nitroso-p-toluenossulfonamida) em 25 ml de éter dietílico a uma solução, aquecida a 60-65°C, de 2,5 g de hidróxido de potássio dissolvido em 4 ml de água e 5 ml de etanol, e (b) recolhendo o destilado. Adicionou-se depois 4,5 ml do destilado de diazometano a uma solução de 158 mg do composto resultante do Exemplo 1, dissolvido em 4,5 ml de cloreto de metileno à temperatura ambiente. Depois de se agitar durante 15 minutos, arejou-se a solução com azoto e concentrou-se a pressão reduzida para produzir 410 mg do composto do título na forma de um sólido acastanhado. P.f. 101-107°C (decomposição). Os espectros de RMN de protões , de RMN de carbono e de infravermelhos apresentados nas Figuras 1-3 acerca destes, eram compatíveis com a fórmula estrutural atribuída.

Exemplo 3

Ensaio in vitro da actividade antibiótica contra bactérias aeróbias e facultativas

Para a análise primária dos compostos do invento contra bactérias aeróbias e facultativas, determinaram-se as concentrações inibitórias mínimas (MICs) pelo seguinte método de diluição de ágar: adicionaram-se a ágar de infusão de coração e cérebro séries de duplas diluições dos compostos de teste. Inocularam-se as placas de ágar com aproximadamente 104 organismos por local de cada um dos organismos a testar. Depois, incubaram-se a 37°C estas placas de ágar inoculadas durante aproximadamente 20 horas. Determinaram-se as MICs como concentrações mínimas de composto de teste (em pg/ml) que inibiam o crescimento visível. Os dados, apresentados no Quadro 1, mostram que o composto do presente invento, di-O-metiltiacumicina B, é substancialmente menos activo do

86 474 ΕΡ Ο 824 539 / ΡΤ que ο material reagente tiacumicina Β, contra duas bactérias vulgarmente encontradas na flora gastrointestinal normal, Enterococcus faecium e Streptococcus agalactiae.

Quadro 1Dados de MIC (pg/ml) para bactérias aeróbias e facultativas

Microorganismo Cultura # Tiacumicina B Di-O-metiltiacumicina B Vancomicina Slaphylococcus aureus 1662 6,2 100 3,1 S. aureus 1664 6,2 50 1,56 S. aureus 1600 12,5 100 1.56 S. aureus 2130 12,5 >100 3,1 S. aureus 2498 6,2 >100 3,1 S. aureus 2124 6,2 >100 3,1 S. aureus (cipro res.) 3384 12,5 100 1,56 S- epidermis 1666 3,1 50 3,1 Enterococcus faecium 1668 6,2 >100 3,1 Streptococcus bovis 1699 25 >100 0,78 S. agalactiae 1670 12,5 >100 3,1 S. pyogenes 1671 25 >100 3,1 S. pyogenes (const.) 1672 3,1 25 0,78 S. pyogenes (inducible) 2548 6,2 25 0,78 Micrococcus luteus 2517 0,2 0,1 3,1 M. luteus 2493 0,1 0,1 0,78 E. coli Juhl 1673 >100 >100 >200 E. coli SS 2489 >100 >100 50 E. coli DC-2 1674 >100 >100 >200 E. coli HS60 1675 >100 >100 >200 E. coli KNK437 1676 >100 >100 >200 Enterobacter aerogenes 1677 >100 >100 >200 Klebsiella pneumoniae 2518 >100 >100 >200 Providencia stuartii 1831 >100 >100 >200 Pseudomonas aeruginosa 1679 >100 >100 >200 P. aeruginosa 1680 >100 >100 >200 P. aeruginosa 1681 >100 >100 >200 P. aeruginosa 1682 12,5 100 >200 P. cepacia 1684 >100 >100 >200 Acinetobacter calcoaceticus 1845 >100 >100 >200 P. aeruginosa (cipro R) 1919 >100 >100 >200 P. aeruginosa (cipro R) 1920 >100 >100 >200 Candida albicans 3622 >100 >100 Mycobacterium smegmatis 5171 12,5 1,56 Nocardia asteroides 5173 0,39 0,39

Exemplo 4

Ensaio in vitro da actividade antibiótica contra bactérias anaeróbias

Para a análise primária dos compostos do invento contra bactérias anaeróbias como Clostridium, determinaram-se as concentrações inibitórias mínimas (MICs) pelo seguinte método de diluição de ágar: Adicionaram-se a ágar de Wilkins-Chalgren séries de duplas diluições dos compostos de teste Tnnrnlaram-se as placas de ágar com aproximadamente 105 18 86 474 ΕΡ Ο 824 539 / ΡΤ organismos por local de cada um dos organismos a testar. Depois, incubaram-se a 37°C as placas de ágar inoculadas, durante aproximadamente 48 horas. Determinaram-se as MICs como concentrações mínimas de composto de teste (em pg/ml) que inibiam o crescimento visível. Os dados, apresentados no Quadro 2, mostram que o composto do presente invento, di-O-metiltiacumicina B, tem uma substancial actividade contra patogénicos anaeróbios e em particular contra a espécie Clostridium.

Quadro 2

Dados de M] C (pg/ml) para bactérias aeróbias Microorganismo Cultura # Tiacumicina B Di-O-metiltiacumicina B Clindamicina Vancomicina Bacteriodcs fragilis 1756 >128 >2 1 32 B. frágil is 1757 >128 >2 1 32 B. fragilis 1758 >128 >2 0,5 16 B. fragilis 1999 >128 >2 1 B. vulgalus 1762 >128 >2 0,03 32 B. disiens 1763 32 >2 0,015 32 B. thetaioluomicron 1764 >128 >2 4 >64 B thctaiolaomicron 1765 >128 >2 4 >64 B. thetaiotaomicron 1766 >128 >2 4 >64 B. loescheii 1767 64 >2 0,06 32 B. vlgatus 2481 >128 >2 0,03 64 B. bivius 2483 128 >2 0,015 32 Fusobaclerium nuctealum 2478 >128 >2 0,12 >64 Fusobaclerium species 1770 >128 >2 0,12 >64 Veillonella parvula 2479 64 >2 0,06 >64 Propionibaclerium acnes 1775 4 >2 0,06 0,5 Peptostreptococcus asaccharolyticus 1777 1 >2 0,03 1 P. magnus 1778 0,5 >2 1 0,5 P species 1776 32 >2 0,06 1 P. anaeróbias 1780 0,008 >2 0,06 0,5 Clostridium perfringens 1771 0,008 0,06 0,06 >64 C. perfringens 1772 0,03 0,06 0,5 0,5 C. perfringens 1773 0,008 0,06 0,06 1 C. ramosum 2482 >128 >2 1 8 C. difficile 1496 0,06 0,25 >32 0,5 C. difficile 1497 0,06 0,5 >32 0,5 C. difficile 2025 0,06 0,5 4 0,5 C. difficile 2528 0,06 0,5 4 1 C. difficile 2529 0,06 0,5 4 1 C. difficile 1774 0,03 0,25 0,5 2 C. difficile 2480 0,06 0,25 4 >64

Exemplo 5

Actividade in vivo contra a colite induzida por Clostridium difficile pseudomembranoso

Testou-se um dos compostos do presente invento, di-O-metiltiacumicina B, num modelo hamster in vivo, da seguinte forma: Induziu-se uma infecção de Clostridum difficile em 32 hamster por tratamento oral com ciprofloxacina (200 mg/kg/dia) durante sete dias

86 474 ΕΡ Ο 824 539 / ΡΤ 19 consecutivos (dias 1-7). (A supressão das bactérias gastrointestinais normais pela ciprofloxacina permitiu que predominasse a C. difficile resistente à droga). Separaram-se mais cinco hamster como grupo de controlo não infectado.

Dividiram-se os animais infectados em três grupos compreendendo: (a) 10 animais não tratados; (b) 15 animais tratados com vancomicina (5 de cada a 20, 10 e 1 mg/kg/dia oralmente nos dias 8-14); e (c) 10 animais tratados com o composto do Exemplo 2 (5 de cada a 10 e 1 mg/kg/dia nos dias 8-14). Examinaram-se os animais em questão para (a) peso corporal (o hamster infectado perde massa corporal significativa), e (b) mortalidade (percentagem de mortes no dia 20).

Quadro 3

Modelo hamster in vivo de colite induzida por Clostridium difficile pseudomembranoso T ratamento Dose (mg/kg) % de Mortalidade % de variação de peso, dia 22 Composto do Exemplo 2 10 60 140 Composto do Exemplo 2 1 20 154 Vancomicina 20 100 ND Vancomicina 10 100 ND Vancomicina 1 100 ND Controlo infectado 90 139 Controlo não infectado _ 0 167 ND = sem dados; todos os animais tinham morrido.

Os resultados, apresentados no Quadro 3 acima, mostram a capacidade do composto de teste di-O-metiltiacumicina B para tratar eficazmente uma colite associada a antibióticos. Entre os animais de controlo não tratados, houve 90% de mortalidade com animais infectados, a maioria dos quais desenvolveu rapidamente diarreia aguada e morreram aproximadamente no dia 20. Os hamster tratados com vancomicina a 1 mg/kg sofreram de mortalidade mais rápida do que os hamster tratados a 10 ou 20 mg/kg; no total, a maioria dos hamster tratados com vancomicina morreram entre os dias 17 e 22. O tratamento com o composto do Exemplo 2, por outro lado, esteve associado a uma taxa de sobrevivência mais elevada que os controlos infectados não tratados ou que os hamster tratados com vancomicina.

Os hamster infectados sofreram diminuições significativas de peso durante a doença aguda. No geral, os animais sobreviventes ganharam massa corporal a uma velocidade normal a seguir à recuperação, mas permaneceram ainda atrás dos controlos não infectados em peso. Os hamster tratados com o composto do Exemplo 2 a 1 mg/kg mantiveram a mesma massa corporal mais próxima da dos controlos não infectados. 20 86 474 ΕΡ Ο 824 539 / ΡΤ

Deve perceber-se que a descrição anterior e os exemplos em anexo são meramente ilustrativos, e não devem ser tomados como limitações ao âmbito do invento, que é definido unicamente pelas reivindicações em anexo.

Lisboa,

Por ABBOTT LABORATORIES - O AGENTE OFICIAL -

Eng.° ANTÓNIO JOÃO DA CUNHA FERREIRÁ Ag. Of. Pr. Ind. Rua das Flores, 74-4.° 1200-195 LISBOA

Claims (8)

1. 86 474 ΕΡ Ο 824 539 / ΡΤ 1/5 REIVINDICAÇÕES 1. Composto que possui a fórmula

   ou uma sua prodroga farmaceuticamente aceitável, onde R é um substituinte da fórmula:

   onde R31, R32 e R33 são independentemente seleccionados do grupo que consiste em hidrogénio e alcanoílo C| a C4; R1 é seleccionado do grupo que consiste em hidrogénio e hidroxi; e R2 é um substituinte de fórmula 6'

   onde um de R41 e R42 é liidi ogénio e o outro c um radical da fórmula

   9~

   onde Rs é alquilo inferior em cada ocorrência.
2. 2. Composto de acordo com a reivindicação 1 seleccionado do grupo que consiste em:

   86 474 ΕΡ Ο 824 539 / ΡΤ 3/5
3. 3. Composto de acordo com a reivindicação 1 ou 2, onde R1 2 é seleccionado do grupo que consiste em metilo e etilo. 1 Composto 3”’,5’”-di-0-metiltiacumicma B ou uma sua prodroga 2 farmaceuticamente aceitável. 86 474 ΕΡ Ο 824 539/ΡΤ 5/5
4. 5. Composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de acordo com a reivindicação 1, em combinação com um transportador farmaceuticamente aceitável.
5. 6. Composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de acordo com a reivindicação 3, em combinação com um transportador farmaceuticamente aceitável.
6. 7. Utilização de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3 para produzir um medicamento para tratar uma infecção bacteriana num paciente com necessidade desse tratamento.
7. 8. Utilização de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3 para produzir um medicamento para tratar colite num paciente com necessidade desse tratamento.
8. 9. Utilização de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3 para produzir um medicamento para tratar uma infecção causada por Clostridium difficile num paciente com necessidade desse tratamento. Lisboa, Por ABBOTT LABORATORIES

   Eng.° ANTÓNIO JOÃC DA CUNHA FERREIR/ Ag. Of. Pr. Ind. Rua das Flores, 74-4. 1200-195 LISBOA