PT810870E

PT810870E - Peptidos isolados derivados do mage-2 precursor de antigenios de rejeicao de tumores e suas utilizacoes

Info

Publication number: PT810870E
Application number: PT95914792T
Authority: PT
Inventors: Pierre Van Der Bruggen; Thierry Boon-Falleur; Cornelis J M Melief; M W Visseren; W M Kast
Original assignee: Univ Leiden; Ludwig Inst Cancer Res
Priority date: 1994-03-24
Filing date: 1995-03-21
Publication date: 2001-09-28
Also published as: CN1149257A; ATE201214T1; AU682597B2; FI963780L; DE69520959D1; FI963780A0; CA2186006A1; NZ283561A; NO963918D0; NO963918L; JPH10502329A; DE69520959T2; EP0810870A1; AU2189395A; FI963780A7; US5554724A; ZA952375B; JP3360137B2; ES2158943T3; EP0810870A4

Description

Descrição “Péptidos isolados derivados do MAGE-2 precursor de antigénios de rejeição de tumores e suas utilizações”

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção insere-se no domínio da imunogenética e da química peptídica. Mais particularmente, a invenção diz respeito a nonapeptidos úteis de diversas maneiras, quer como imunogénios quer como ligandos para a molécula ALH-A2 (em inglês HLA-A2). Mais particularmente, a invenção diz respeito ao chamado “antigénio de rejeição de tumores” obtido a partir do precursor do antigénio de rejeição de tumores codificado pelo gene MAGE-2 e que é apresentado pela molécula ALH-A2 de classe I do CPH (em inglês MHC).

ANTECEDENTES E TÉCNICA ANTERIOR O estudo do reconhecimento ou da falta de reconhecimento de células cancerosas por um organismo hospedeiro tem avançado em muitas direcções diferentes. A compreensão do fenómeno presume um certo conhecimento da imunologia e da oncologia básicas.

Pesquisas já efectuadas em tumores de murganhos revelaram que estes apresentavam moléculas que conduziam à rejeição das células tumorais quando transplantadas para animais singeneicos. Estas moléculas são “reconhecidas” pelas células T no animal que as recebe e provocam uma resposta citotóxica das células T com lise das células transplantadas. Chegou-se a esta conclusão pela primeira vez com tumores induzidos in vitro por agentes químicos carcinogénicos, tais como o metil-colantreno. Concluiu-se que os antigénios 2

expressos pelos tumores e que suscitam a resposta das células T eram diferentes de um tumor para o outro. Para saber os preceitos gerais sobre a indução de tumores com agentes químicos carcinogénicos e as diferenças dos antigénios da superfície das células veja-se Prehn et al, J. Natl. Canc. Inst. 18: 769-778 (1957); Klein et al, Câncer Res. 20: 1561--1572 (1960); Gross, Câncer. Res. 3: 326-333 (1943) e Basombrio, Câncer Res. 30: 2458--2462 (1970). Esta classe de antigénios passou a ser conhecida pela designação de “antigénios de transplantação específicos dos tumores” ou “ATET, em inglês TSTA”. A seguir à observação da apresentação de tais antigénios, quando induzidos por agentes químicos carcinogénicos, foram obtidos resultados semelhantes quando os tumores foram induzidos in vitro por meio de radiação ultravioleta. VerKripke, J. Natl. Canc. Inst. 53: 333-1336 (1974).

Embora as respostas imunitárias mediadas pelas células T tenham sido observadas nos tipos de tumores descritos supra, presume-se que os tumores espontâneos sejam genericamente não imunogénicos. Acreditou-se por isso que não apresentassem antigénios que provocassem uma resposta ao tumor no paciente portador do tumor. Ver Hewitt et al, Brit. J. Câncer 33: 241-259 (1976). A família das linhagens celulares que apresentam antigénios tuiri são variantes imunogénicas obtidas por mutagénese de células ou de linhagens celulares de tumores de murganho, conforme descrito por Boon et al, J. Exp. Med. 152: 1184-1193 (1980). Pormenorizando, obtém-se os antigénios tumf mutacionando células tumorais que não gerem uma resposta imunitária em murganhos singeneicos e que venham a formar tumores (isto é, células “tum+”). Quando estas células tum+ são mutagenizadas, são rejeitadas pelo murganho singeneico e não conseguem formar tumores (daí designadas por “tum'“). Ver Boon et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74: 272 (1977). Comprovou-se já que há muitos tipos de tumores que manifestam este fenómeno. Ver, v.g., Frost et al, Câncer Res. 43: 125 (1983).

Presume-se que as variantes tum' não sejam capazes de formar tumores progressivos uma vez que iniciam um processo de rejeição imunitária. Os argumentos a favor desta hipótese compreendem a capacidade de as variantes de tumores “tum'“, isto é, as que normalmente não formam tumores, passarem a formá-los em murganhos com sistemas imunitários suprimidos por irradiação subletal, Van Pel et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76: 5282-5285 (1979); e também a observação de que as células tum' do mastocitoma P815, injectadas intraperitonealmente, se multiplicam de forma exponencial durante 12 a 15 dias e depois são eliminadas apenas em alguns dias no meio de um influxo de linfócitos e macrófagos (Uyttenhove et al., J. Exp. Med. 152: 1175-1183 (1980)). Há outros argumentos entre os quais se refere a observação de que os murganhos adquirem uma memória imunitária que lhes permite resistir a estímulos subsequentes da mesma variante tum', mesmo quando quantidades imunossupressoras de radiação são administradas conjuntamente com o subsequente estímulo de células (Boon et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74: 272- -275 (1977); Van Pel et al, supra; Uyttenhove et al, supra).

Pesquisas mais recentes permitiram concluir que foram geradas variantes imuno-génicas que não geraram uma resposta quando os tumores expontâneos foram submetidos a mutagénese. Com efeito, estas variantes foram capazes de suscitar uma resposta protectora imunitária contra o tumor original. Ver Van Pel et al, J. Exp. Med. 157: 1992-2001 (1983). Assim sendo, demonstrou-se que é possível suscitar a apresentação daquilo a que se chama um “antigénio de rejeição tumoral” num tumor que constitua um alvo para uma resposta de rejeição singeneica. Foram conseguidos resultados idênticos quando os genes exógenos foram transfectados para dentro de tumores expontâneos. A propósito deste assunto veja-se Fearson et al, Câncer. Res. 48:2975-1980 (1988).

Foi já reconhecida uma classe de antigénios que se apresentam sobre a superfície de células tumorais e que são reconhecidos pelas células T citotóxicas, conduzindo à lise. Esta classe de antigénios irá ser referida doravante pela designação de “antigénios de rejeição tumoral” ou “ART, em inglês TRA”. Os ART podem suscitar ou não respostas de anticorpos. A abordagem ao estudo destes antigénios faz-se por meio de estudos de caracterização de células T citolíticas in vitro, isto é, o estudo da identificação do antigénio por um subconjunto particular de células T citolíticas, doravante designadas por “CTL”. O subconjunto prolifera ao reconhecer o antigénio de rejeição tumoral apresentado e as células que apresentem o antigénio são lisadas. Estudos de caracterização permitiram identificar clones de CTL que lisam de forma específica células que exprimem os antigénios. É possível encontrar exemplos deste trabalho nas obras de Levy et al., Adv. Câncer Res. 24: 1-59 (1977); Boon et al, J. Exp. Med. 152: 1184-1193 (1980); Brunner et al, J. Immunol. 124: 1627-1634 (1980); Maryanski et al, Eur. J. Immunol. 124: 1627-1634 (1980); Maiyanski et al, Eur. J. Immunol. 12: 406-412 (1982); Palladino et al, Canc. Res. 47: 5074-5079 (1987). Este tipo de análise é necessário para outros tipos de antigénios reconhecidos pelas CTL, incluindo os antigénios secundários da histocompatibilidade, os antigénios H-Y específicos do homem e a classe de antigénios designada por antigénios “tum'”, aqui descritos.

Como exemplo de um tumor que se insere no domínio descrito supra refere-se o P815. Ver DePlaen et al, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 2274-2278 (1988); Szikora et al, EMBO J. 9: 1041-1050 (1990) e Sibille et al, J. Exp. Med. 172: 35-45 (1990). O / 5 tumor P815 é um mastocitoma induzido num murganho DBA/2 com metil-colantreno e criado em cultura quer como um tumor in vitro quer como linhagem celular. A linhagem do P815 gerou muitas variantes tum' a seguir à mutagénese, incluindo as variantes designadas por P91A (DePlaen, supra), 35B (Szikora, supra) e PI98 (Sibille, supra). Em contraste com os antigénios de rejeição tumoral - e isto constitui uma distinção fundamental -os antigénios tum' apenas se encontram presentes depois de as células tumorais terem sido mutagenizadas. Os antigénios de rejeição tumoral encontram-se presentes nas células de um determinado tumor sem mutagénese. Assim sendo, tomando como referência a literatura, uma linhagem celular pode ser tum+, tal como a linhagem designada por “PI”, e pode ser estimulada a produzir variantes tum'. Uma vez que o fenótipo tum' difere do fenótipo da linhagem celular progenitora, admite-se que haja uma diferença no ADN das linhagens celulares tum' comparativamente com as suas linhagens progenitoras tum+ e esta diferença pode ser explorada para se localizar o gene relevante em células tum'. Em consequência, descobriu-se que os genes das variantes tum', tais como P91A, 35B e P198, diferem dos seus alelos normais por mutações pontuais nas regiões codificadoras do gene. Ver Szikora e Sibille, supra, e Lurquin et ai, Cell 58: 293-303 (1989). Demonstrou-se que não era este o caso com os ART da presente invenção. Nestes documentos também está demonstrado que os péptidos obtidos a partir do antigénio tum' são apresentados pela molécula Ld para reconhecimento pelas CTL. A variante P91A é apresentada pela molécula Ld, a P35 pela Dd e a PI98 pela Kd. O pedido de patente de invenção PCT/US92/04354, depositado a 22 de Maio de 1992, concedido ao mesmo requerente do presente pedido de patente de invenção, explicita o caso de uma família de genes codificadores dos precursores antigénicos de rejeição de tumores humanos, designada por família MAGE. Há vários destes genes que foram também estudados por Bruggen et al, Science 254: 1643 (1991). É agora evidente que os diversos genes da família MAGE são expressos em células de tumores e que podem servir de marcadores para o diagnóstico desses tumores e também para outros fins aqui descritos. Veja-se também Traversari et al, Immunogenetics 35: 145 (1992); Van der Bruggen et al, Science 254: 1643 (1991). O mecanismo pelo qual uma proteína é transformada e apresentada sobre uma superfície de uma célula está agora bastante bem documentado. É possível encontrar uma resenha sobre o desenvolvimento desta matéria, escrita por Barinaga, “Getting Some ‘Backbone’: How MHC Binds Peptides”, Science 257: 919 (1992); ver também Fremont et al, Science 257: 919 (1992); Matsumura et al, Science 257: 927 (1992); Latron et al, Science 257: 964 (1992). Estes documentos apontam geralmente para a necessidade de o péptido que se liga a uma molécula de CPH/ALH (em inglês MHC/HLA) ter um comprimento de 9 aminoácidos (ser um “nonapeptido”) e para a importância do primeiro e do nono resíduos do nonapeptido. O documento WO 94 03205 divulga o princípio geral das composições nona-peptídicas ou decapeptídicas com resíduos conservados nas posições 2 e 9 capazes de se ligarem de forma específica a alelos seleccionados do CPH e de induzirem a activação de células T em células T restringidas pelo alelo do CPH. Os péptidos são úteis para suscitarem uma resposta imunitária contra um antigénio desejado. Nesse documento são descritos epítopos provenientes de diversas proteínas destinatárias imunogénicas, incluindo os péptidos provenientes do antigénio específico do cancro da próstata, os antigénios da superfície e do núcleo da hepatite B, os antigénios do melanoma, os antigénios do vírus da imunodeficiência humana e os antigénios do vírus do papiloma humano.

Estudos feitos sobre a família de genes MAGE vieram agora revelar que há geralmente um nonapeptido particular que é apresentado sobre a superfície de algumas células tumorais e que a apresentação do nonapeptido exige que a molécula apresentadora seja a ALH-A1. Os complexos do antigénio de rejeição tumoral (o “ART” ou “nonapeptido”) de MAGE-1 conduz à lise das células que o apresentem, por acção das células T citolíticas (“CTL”).

Chama-se a atenção, v.g., para o pedido de patente de invenção depositado em simultaneidade com o n° de série 217 187 (patente de invenção n° 5 554 506) de Traversari et al. e também para o pedido de patente de invenção com o n° de série 217 186 (patente de invenção n° 5 585 461) de Townsend et al., documentos estes que apresentam um estudo sobre outros péptidos derivados de MAGE. O trabalho de pesquisa apresentado, v.g., no pedido de patente de invenção norte--americana com o n° de série 07/938 334 (patente de invenção norte-americana 5 405 940), depositado a 31 de Agosto de 1992, e no pedido de patente de invenção norte-americana com o n° de série 073 103 (patente de invenção norte-americana n° 5 462 871), depositado a 7 de Junho de 1993, nas partes em que são comparadas regiões homólogas de diversos genes de MAGE com a região do gene de MAGE-1 que codifica o nonapeptido relevante, conclui-se que há uma grande homologia. Com efeito, estas observações conduziram a um dos aspectos da invenção aqui descritos e reivindicados, designadamente uma família de nonapeptidos em que todos possuem os mesmos aminoácidos no terminal N e no terminal C. Sobres estes nonapeptidos se afirma que são úteis para diversos fins entre os quais se inclui a sua utilização como imunogénios, quer por si sós quer acoplados a péptidos portadores. Os nonapeptidos têm um tamanho suficiente para constituírem um epítopo antigénico e há textos que afirmam que os anticorpos contra eles gerados são úteis para a identificação do nonapeptido, quer este exista por si só quer exista como parte de um polipeptido maior.

Nestas obras, em especial na que tem o n° de série 073 103 (patente de invenção norte-americana n° 5 462 871), está demonstrada uma ligação entre a ALH-A1 e a MAGE-3; no entanto, apenas cerca de 26% da população caucasiana e 17% da população negróide apresenta moléculas ALH-A1 sobre as superfícies das células. Assim, seria útil se houvesse mais informação sobre os péptidos apresentados por outros tipos de moléculas do CPH, por forma a que partes adequadas da população pudessem beneficiar das pesquisas referidas supra.

Concluiu-se agora que a existência de antigénios de péptidos derivados de MAGE-2, conforme exarado no texto subsequente, identifica péptidos que formam complexos com a molécula ALH-A2 da classe I do CPH. As diversas ramificações desta descoberta, entre as quais estão incluídas as aplicações terapêuticas e de diagnóstico, fazem parte dos objectivos da presente invenção, conforme consta do texto subsequente.

DESCRIÇÃO MINUCIOSA DOS CASOS PREFERIDOS EXEMPLO 1

Condições experimentais

Todas as experiências foram realizadas à temperatura ambiente, salvo quando especificado de outro modo. Todos os aminoácidos protegidos com Fmoc, os polímeros de síntese, os péptidos e o ATF (o mesmo que TFA) foram guardados a -20°C. 9

Síntese de péptidos

Os péptidos foram sintetizados por meio de estratégias em fase sólida num sintetizador de péptidos automático e múltiplo (Abimed AMS 422) (ver Gausepohl e Frank, 1990; Gausepohl et ah, (1990)).

Os péptidos foram produzidos em várias experiências, tendo sido em cada uma delas sintetizados simultaneamente 48 péptidos diferentes.

Utilizou-se como resina o produto ‘Tentagel S AC’ (Rapp et al., 1990; Sheppard e Williams, 1982), que é um polímero de enxerto com braços separadores de polietileno-glicol numa matriz de polistireno (40-60 mg por péptido, carga de aminoácidos protegidos com Fmoc 10 μΜ).

Foram realizados acoplamentos repetitivos mediante a adição de uma mistura de 90 pL de BOP 0,67 M (Gausepohl et ah, 1988; Castro et ah, 1975) em NMP, 20 pL de NMM em NMP a 2/1 (v/v) e 100 pL de uma solução 0,60 M do aminoácido adequado protegido com Fmoc (Fields e Noble, 1990) em NMP (num excesso 6 vezes superior) a cada vaso de reacção. Depois de decorrido aproximadamente 70% do período de reacção, acrescentou-se a cada vaso de reacção 50 pL de diclorometano.

Efectuou-se a desprotecção por remoção do Fmoc adicionado 3 vezes 0,8 mL de piperidina/DMA a lA (v/v) a cada vaso de reacção.

Aumentou-se os períodos de acoplamento e de desprotecção à medida que a síntese foi progredindo, começando respectivamente com 30 minutos e 3 vezes 3 minutos.

As lavagens depois dos acoplamentos e das desprotecções por remoção do Fmoc foram realizadas com 6 vezes 1,2 mL de DMA. Depois de se ter obtido a sequência pretendida e de se ter removido a última protecção Fmoc, lavou-se a resina peptidílica

exaustivamente com DMA, diclorometano, diclorometano/éter a 1/1 (v/v) e éter, e depois secou-se.

Clivagem e isolamento do péptido

Efectuou-se a clivagem dos péptidos a partir da resina e a remoção dos grupos de protecção das cadeias laterais mediante a adição de 6 vezes 200 pL de ATF/água a 19/1 (v/v) a intervalos de 5 minutos a cada vaso de reacção, para assim se obter os péptidos carboxílicos livres. No caso dos péptidos que continham Trp utilizou-se ATF/água/etanotiol a 18/1/1 (v/v/v).

Decorridas 2 horas após a primeira adição de ATF aos péptidos, estes precipitaram a partir dos filtrados combinados por adição de 10 mL de éter/pentano a 1/1 (v/v) e arrefecimento para -20°C. Os péptidos foram isolados por centrifugação (-20°C, 2500 g, 10 minutos).

Após o tratamento da massa obtida com éter/pentano a 1/1 (v/v) e isolamento graças ao mesmo procedimento de centrifugação, efectuo-se a secagem dos péptidos a 45°C durante 15 minutos.

Dissolveu-se cada um dos péptidos em 2 mL de água (ou 2 mL de ácido acético a 10% em volume), congelou-se a solução em azoto líquido durante 3 minutos e liofilizou-se enquanto decorria a centrifugação (1330 r.p.m., 8-16 horas).

Análise e purificação 11

Determinou-se a pureza dos péptidos por CLER de fase inversa; dissolv'eu-se uma aliquota de cerca de 50 nmol em 100 pL de ácido acético a 30% em volume. Desta solução aplicou-se uma quantidade de 30 pL a um sistema de CLER-FI equipado com um sistema solvente ternário; A: água, B: acetonitrilo, C: ATF a 2% em volume em água.

Efectuou-se uma eluição em gradiente (1,0 mL/minuto) a partir de 90% de A, 5% de B e 5% de C até 20% de A, 75% de B e 5% de C durante 30 minutos. Efectuou-se a detecção a 241 nm.

As amostras obtidas aleatoriamente foram analisadas por espectrometria de massa num ‘PDMS’. Todos os 31 péptidos de ligação foram analisados por espectrometria de massa num ‘PDMS’ e por análise quantitativa dos aminoácidos após a hidrólise num equipamento ‘HP Aminoquant’. Para todas as amostras analisadas a diferença entre a massa calculada e a massa medida estava dentro do erro experimental (0,1%), conforme especificado pelo produtor do equipamento utilizado. Todas as composições de aminoácidos estavam em conformidade com as previstas. EXEMPLO 2 Péptidos

Da totalidade dos 71 péptidos de MAGE-2 que haviam sido liofilizados, pesou-se 1 mg e dissolveu-se em 10 pL de DMSO. De todos os péptidos dissolvidos fez-se uma diluição à razão de 0,5 mg/mL em NaCl a 0,9% e neutralizou-se o valor do pH para 7 com ácido acético a 5% diluído em água destilada (CH3COOH, Merck Darmstadt, Alemanha: 56--1000) ou comNaOH 1 N diluído em água destilada (Merck Darmstadt, Alemanha: 6498).

Células

Foram criadas em cultura células 174CEM.T2 em meio de Dulbecco modificado por Iscove (Biochrom KG Seromed Berlim, Alemanha: F0465) enriquecido com penicilina à razão de 100 UI/mL (Biocades Pharma, Leiderdoip, Holanda), canamicina na concentração de 100 pg/mL (Sigma St. Louis, E.U.A.: K-0254), glutamina 2 mM (ICN Biomedicals Inc. Costa Mesa, CA, E.U.A.: 15-801-55) e 10% de soro fetal de vitelo (SFV) (em inglês FCS, Hyclone Laboratories Inc. Logan, Utah, E.U.A.: A-1115-L). Criou-se as células em cultura com uma densidade de 2,5 x 105/mL durante três dias a 37°C em atmosfera de ar humidificado contendo 5% de CO2.

Ligação dos péptidos

As células 174CEM.T2 foram lavadas 2 vezes no meio de cultura com SFV e depois foram colocadas em meio de cultura isento de soro até à densidade de 2 x 106 células/mL. Desta suspensão introduziu-se uma quantidade de 40 pL numa placa de 96 cavidades com o fundo em forma de V (Greiner GmbH, Frickenhausen, Alemanha: 651101) conjuntamente com 10 pL de diluições sequenciais, à razão de 1 para 2 em NaCl a 0,9%, das diluições peptídicas individuais (variando entre 500 pg/mL e 15,6 pg/mL). As concentrações finais estavam compreendidas entre 200 pg/mL e 3,1 pg/mL para os péptidos com 8 x 104 células 174CEM.T2. Agitou-se esta solução suavemente durante 3 minutos após 0 que teve lugar um período de incubação de 16 horas a 37°C em atmosfera de ar humidificado contendo 5% de C02. A seguir efectuou-se a lavagem das células uma vez com 100 pL de NaCl a 0,9%, albumina do soro de bovino a 0,5% (Sigma St. Louis, E.U.A.: A-7409), NaN3 a 0,02% (Merck Darmstadt, Alemanha: 822335). Após uma 13 centrifugação a 1200 r.p.m. recolocou-se a massa obtida novamente em suspensão em 50 pL de quantidades saturantes de anticorpos BB7.2 monoclonais de murganho específicos de ALH-A2.1 durante 30 minutos a 4°C. A seguir efectuou-se a lavagem das células 2 vezes e realizou-se a sua incubação durante 30 minutos com fragmentos F(ac)2 (em inglês F(ab)2) de anti-IgG de murganho conjugada na cabra com isotiocianato de fluoresceína (Tago Inc. Burlingame, CA, E.U.A.: 4350) segundo uma diluição de 1:40 e um volume total de 25 pL.

Após a última incubação efectuou-se a lavagem das células 2 vezes e mediu-se a fluorescência a 488 nm num citómetro de fluxo de modelo ‘FACScan’ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, E.U.A.). A concentração para a qual se conseguiu 0,5 da extemalização máxima das ALH-A2.1 nas células 174CEM.T2 foi determinada utilizando os gráficos em que se traçou o índice de fluorescência em função da concentração dos péptidos. Os resultados estão agrupados no quadro I.

QUADRO I

Afinidades de ligação dos péptidos obtidos a partir de proteína MAGE-2 associada ao melanoma humano, que se ajusta ao padrão da ALH-A2.1 (compilação de Falk et al., 1991, Hunt et al., 1992 e Nijman et al, 1993).

Péptido n° Sequência resíduos Concentração peptídica que induz 0,5 do IF máximo GLEARGEALGL 15-25 >100 pg/mL GLEARGEAL 15-23 >100 pg/mL ALGLVGAQA 22-30 45 pg/mL GLVGAQAPA 24-32 >100 pg/mL 70 μg/mL f DLESEFQAA 100-108 > 100 pg/mL DLESEFQAAI 100-109 > 100 pg/mL AISRKMVELV 108-117 65 pg/mL AISRKMVEL 108-116 80 pg/mL 2 KMVELVHFL 112-120 >100 pg/mL KMVELVHFLL 112-121 100 pg/mL KMVELVHFLLL 112-122 LLLKYRAREPV 120-130 QUADRO I (cont.) Péptido n° Sequência resíduos Concentração peptídica que induz 0,5 do IF máximo LLKYRAREPV 121-130 VLRNCQDFFPV 139-149 3 VIFSKASEYL 149-158 4 YLQLVFGIEV 157-166 YLQLVFGIEW 157-167 5 QLVFGIEW 159-167 6 QLVFGIEWEV 159-169 GIEVVEWPI 163-172 PISHLYILV 171-179 HLYILVTCL 174-182 HLYILVTCLGL 174-184 YILVTCLGL 176-184 CLGLSYDGL 181-189 CLGLSYDGLL 181-190 VMPKTGLLI 195-203 VMPKTGLLII 195-204 VMPKTGLLIIV 195-205

s GLLIIVLAI 200-208 GLLIIVLAII 200-209 GLLIIVLAIIA 200-210 LLIIVLAII 201-209 LLIIVLAIIA 201-210 LLIIVLAIIAI 201-211 LIIVLAIIA 202-210 LIIVLAIIAI 202-211 7 IIVLAIIAI 203-211 IIAEIGDCA 208-216 QUADRO I (cont.) Péptido n° Sequência resíduos Concentração peptídica que induz 0,5 do IF máximo KIWEELSML 220-228 8 KIWEELSMLEV 220-230 LMQDL V QENYL 246-256 FLWGPRALI 271-279 9 ALIETSIVKV 277-286 ALIETSIVKVL 277-287 10 LIETSIVKV 278-286 LIETSIVKVL 278-287 TLKIGGEPHI 290-299 HISYPPLHERA 298-308 A linhagem de células 174CEM-T2 exprime a molécula ALH-A2.1 “vazia” e instável que pode ser estabilizada quando um péptido se está a ligar à depressão que apresenta o péptido, na hélice dupla dessas moléculas. Uma molécula estabilizada de ALH-A2.1 que não se degrade facilmente é o resultado da ligação de um péptido analisado. Isto leva a um aumento da expressão da molécula ALH-A2.1 na superfície celular. O índicejde fluorescência é uma medição da quantidade de extemalização das moléculas de ALH-A2.1. Calcula-se este índice de fluorescência de acordo com a expressão seguinte: FM = fluorescência média (fm) IF = índice de fluorescência = — 1 exp eriência (FM\ espontânea (FM), espontânea O índice de fluorescência correspondente à fluorescência espontânea é igual a 0.

Resultados

Para se identificar os péptidos de MAGE-2 com eventual capacidade para se ligarem às moléculas de ALH-A2.1 expressas por células 174CEM.T2, examinou-se a sequência de aminoácidos de MAGE-2 (4). Foram examinados todos os péptidos com um comprimento de 9, 10 ou 11 aminoácidos que correspondiam ao padrão de ligação publicado das ALH--A2.1 (quadro I).

Apenas os péptidos números 1-11 do quadro II foram capazes de extemalizar a expressão das moléculas de ALH-A2.1 para valores diminutos da concentração dos péptidos, indicando isso a sua ligação à molécula de ALH-A2.1, conforme descrito no exemplo 2. Nenhum dos outros 60 péptidos foi capaz de fazer isto. Os resultados das medições da fluorescência estão agrupados no quadro I. Determinou-se o valor igual a 0,5 do máximo de extemalização das moléculas de ALH-A2.1 em células 174CEM.T2 utilizando gráficos em que se traçou os valores de IF em função da concentração dos péptidos para cada péptido individualizado. <· ν

s

Ai (

Estas experiências indicam que apenas uma parcela limitada dos péptidos que correspondem ao padrão de ALH-A2.1 têm capacidade para se ligarem a esta molécula de ALH com elevada afinidade e que por tal motivo são os únicos candidatos da proteína de

MAGE-2 elegíveis para serem reconhecidos pela CTL humana, uma vez que a CTL reconhece péptidos apenas quando estes estão ligados às moléculas de ALH.

QUADRO II

Afinidades de ligação de outros péptidos obtidos a partir da proteína MAGE-2 associada ao melanoma humano que se adaptam ao padrão prolongado de ALH-A2.1 (Ruppert et al). Péptido n° Sequência resíduos Concentração peptídica que induz 0,5 do IF máximo 1

QTASSSSTL 37-45 >100 pg/mL QTASSSSTLV 37-46 >100 pg/mL STLVEVTLGEV 43-53 45 pg/mL VTLGEYPAA 48-56 >100 pg/mL VTKAEMLESV 130-139 70 pg/mL VTKAEMLESVL 130-140 >100 pg/mL VTCLGLSYDGL 179-189 >100 pg/mL KTGLLIIVL 198-206 65 pg/mL KTGLLIIVLA 198-207 80 pg/mL KTGLLIIVLAI 198-208 >100 pg/mL HTLKIGGEPHI 289-299 100 pg/mL

QUADRO III Ά

ιδ y Péptidos obtidos a partir da proteína MAGE-2 do melanoma que se liga à ALH-A2.1 Péptido n° Sequência região 1 STLVEVTLGEV resíduos 43-53 - LVEVTLGEV resíduos 43-53 3 VIFSKASEYL resíduos 149-158 5 QLVFGIEW resíduos 159-167 6 QLVFGIEWEV resíduos 159-169 7 IIVLAIIAI resíduos 203-211 8 KIWEELSMLEV resíduos 220-230 9 ALIETSYVKV resíduos 277-286 10 LIETSYVKV resíduos 278-286

SEQ ID NO EXEMPLO 3

Este exemplo ilustra a indução in vitro de uma resposta imunitária primária. Como ilustração da possibilidade de indução de respostas primárias em geral, incluindo os péptidos de MAGE-2, são apresentadas respostas desse tipo contra os péptidos VPH (em inglês HPV), utilizando para tal a linhagem de células 174CEM.T2 com insuficiências transformativas. A expressão das células ALH-A2.1 (T2) é aumentada pela incubação das células T2 num meio que contenha o péptido relevante. As células T2 irão apresentar o péptido relevante ligado às ALH-A2.1 em quantidade elevada e por tal motivo são boas células possuidoras de antigénios (CPA, em inglês APC). No método indutor de resposta recentemente descrito (Kast et al, 1993), utiliza-se a linhagem de células T2 como CPA e utiliza-se as células mononucleares pós-‘Ficoll’ como células respondedoras. Método 19 1) Carregamento peptídico de ALH-A2.1 em Τ2 1

Manteve-se células T2, numa concentração de 2 x 106 células por mL, a incubar durante 13 horas a 37°C num balão T25 (Becton Dickinson, Falcon, Plymouth Engeland n° de cat. 3013) em MDMI isento de soro (meio de Dulbecco modificado por Iscove: Biochrom KG Seromed Berlim, Alemanha: F0465) com glutamina (ICN Biomedicals Inc. Costa Mesa, CA, E.U.A.: 15-801-55), antibióticos (penicilina à razão de 100 UI/mL (Brocades Pharma, Leiderdorp, Holanda, canamicina (Sigma St. Louis, E.U.A.: K-0245)) e o péptido seleccionado MLDLQPETT numa concentração de 80 pg/mL.

2) Tratamento das T2 (APC) com mitomicina C

Estas células T2 incubadas foram centrifugadas e tratadas depois, para uma densidade de 20 x 106 células/mL, com mitomicina C (50 pg/mL) em meio RPMI isento de soro (Gibco Paislan Escócia, n° da cat. 041-02409) durante 1 hora a 37°C. Depois lavou-se as células T2 três vezes em meio RPMI. 3) Preparação para a indução da resposta imunitária primária

Efectuou-se o enchimento de todas as cavidades de uma placa de 96 cavidades com o fundo em forma de U (Costar, Cambridge, E.U.A., n° de cat. 3799) com 100 000 células T2 tratadas com mitomicina C em 50 pL de meio RPMI completo e isento de soro (glutamina (2 mM, ICN Biomedicals Inc. Costa Mesa, CA, E.U.A., n° de cat. 15-801-55), penicilina (100 UI/mL, Brocades Pharma, Leiderdorp, Holanda), canamicina (na concentração de 100 pg/mL, Sigma St. Louis, E.U.A., K-0245)) e o péptido seleccionado MLDLQPETT numa concentração de 80 pg/mL. 4) Células respondedoras 20

As células respondedoras são linfócitos mononucleares do sangue periférico (LSP) í de um dador de subtipo ALH-A2.1 (= C.B). Efectuou-se a separação dos LSP a partir de um revestimento amarelo-acastanhado, pelo procedimento de ‘Ficoll’ (preparação de Ficoll: ‘Lymphoprep of Nycomedpharma’, Oslo, Noruega, n° de cat. 105033), e efectuou-se a sua lavagem 2 vezes em meio RPMI. Após a separação e a lavagem colocou-se os LSP novamente em suspensão em meio RPMI completo com 30% de mistura de soro humano (MSH, em inglês HPS) (analisa-se o MSH para se pesquisar uma actividade de supressão em culturas mistas de linfócitos). 5) Incubação da resposta imunitária primária

Acrescentou-se 400 000 LSP-CB em 50 pL de meio (o meio descrito na alínea 4) a cada cavidade de uma placa de 96 cavidades de fundo em forma de U já preenchidas com células T2 e manteve-se tudo em cultura durante 7 dias a 37°C numa incubadora com atmosfera contendo 5% de C02 e humidade relativa de 90%. 6) Reestimulação (7o dia)

Ao 7o dia após a incubação dos LSP, do péptido MLDLQPETT e das células T2 (alíneas 1 a 5), reestimulou-se os LSP-CB com o péptido MLDLQPETT. Para este efeito efectuou-se a colheita de todas as células e do meio fora das 96 cavidades. Efectuou-se o isolamento das células viáveis pelo procedimento de ‘Ficoll’ e realizou-se a lavagem em meio RPMI. Inoculou-se uma nova placa de 96 cavidades de fundo em forma de U com 50 000 destas células viáveis em cada cavidade conjuntamente com 50 pL de meio RPMI completo contendo 15% de MSH. A cada cavidade acrescentou-se 20 000 LSP autólogos irradiados (3000 rad) e 50 000 linfócitos B autólogos, transformados por EBV e irradiados (10 000 rad) (= EBV-C.B.) conjuntamente com 50 pL de meio RPMI completj? contendo 15% de MSH e o péptido MLDLQPETT numa concentração de 80 pg/mL. Criou-se as células em cultura durante 7 dias a 37°C numa incubadora em atmosfera contendo 5% de CO2 e com uma humidade relativa de 90%. 7) Reestimulação (14° dia)

Ao 14° dia após a incubação dos LSP, do péptido MLDLQPETT e das células T2 (alíneas 1 a 5), reestimulou-se os LSP-CB com o péptido MLDLQPETT. Para o efeito repetiu-se o procedimento da alínea 6. 8) Clonagem por diluição limitante

Ao 21° dia após a incubação dos LSP, do péptido MLDLQPETT e das células T2, efectuou-se a colheita das células e do meio fora das 96 cavidades. Efectuou-se o isolamento das células viáveis pelo procedimento de ‘Ficoll’ e efectuou-se a sua lavagem em meio RPMI completo contendo 15% de MSH. Efectuou-se a clonagem desta massa de células viáveis por diluição limitante. A cada cavidade de uma nova placa de 96 cavidades com o fundo em forma de U (Costar, Cambridge, E.U.A., n° de cat. 3799) acrescentou-se 50 pL de meio RPMI completo contendo 15% de MSH conjuntamente com 100 células viáveis (= massa de HPV16 anti-MLDLQPETT). Com as outras novas placas de 96 cavidades com o fundo em forma de U repetiu-se exactamente este procedimento, excepto no que diz respeito ao número de células nas cavidades: as placas subsequentes continham, 10, 1 ou 0,3 células por cavidade. A todas as cavidades acrescentou-se 20 000 LSP reunidos e irradiados (3000 rad) provenientes de 4 dadores diferentes e 10 000 células B reunidas e irradiadas (10 000 rad), transformadas com EBV, provenientes de três dadores diferentes de subtipo ALH-A2.1 (VU-4/518/JY) conjuntamente com 50 pL de meio RPMf completo contendo 15% de MSH e o péptido MLDLQPETT numa concentração de 40 pg/niL, leucoaglutinina numa concentração de 2% (Pharmacia, Uppsala, Suécia, n° de cat. 17-063-01) e IL-2 recombinante humana numa concentração de 120 UI/mL (Eurocetus, Amsterdão, Holanda). 9) Expansão de clones

Acrescentar a cada cavidade, num volume final de 100 pL: - 25 000 células viáveis, - 20 000 LSP da mistura irradiada (tal como na alínea 8), - 10 000 EBY da mistura irradiada (tal como na alínea 8), - 2 pg de péptido MLDLQPETT, - 6 UI de IL-2 recombinante.

Ao 49° dia efectuou-se um ensaio de citotoxicidade com 65 clones e uma porção de células efectoras e uma porção de células T2 (na presença ou na ausência do péptido MLDLQPETT), enquanto células destinatárias. Define-se a aniquilação espontânea como sendo a aniquilação das células T2 incubadas com um péptido irrelevante GILGFVFTL, mas que se liga a ALH-A2.1. Este péptido derivado da proteína da matriz da gripe é o epítopo para as CTL específicas da gripe restringidas por ALH-A2.1. A maior parte dos péptidos que se ligam à ALH-A2.1 foi encontrada utilizando o padrão ALH-A2.1 (compilação de Rammensee et al, 1991, Hunt et al, 1992 e Nijman et al, 1993). Apenas foi encontrado mais um péptido de ligação a ALH-A2.1 utilizando o padrão ampliado de ALH-A2.1 (Ruppert et al, 1993). A presente invenção também diz respeito à utilização de polipeptidos gerados por todos os meios, quer sejam do âmbito da engenharia genética, da síntese peptídica com técnicas de fase sólida ou de outro tipo. Os péptidos anteriormente referidos podem experimentar diversas modificações químicas efectuadas nas extremidades dos terminais e mesmo assim continuarem abrangidos no âmbito da presente invenção. Também são possíveis outras modificações químicas, em particular as configurações cíclicas e diméricas. O termo “derivados” tem por objecto abranger todos estes péptidos modificados.

Os polipeptidos da presente invenção são úteis para o tratamento ou para a prevenção de doenças associadas a células que exprimam a molécula MAGE-2, incluindo as células dos melanomas e outras células cancerosas.

Em todas as aplicações os péptidos são administrados sob uma forma imunogénica. Uma vez que os péptidos são relativamente curtos, eventualmente poderá ser necessária a sua conjugação com um material portador que lhes confira imunogenicidade, por exemplo, lípidos ou outros materiais ou ainda a utilização de adjuvantes. A intensidade de uma dose profilática ou terapêutica de polipeptidos da presente invenção irá variar, como é evidente, com o grupo de pacientes (idade, sexo, peso, etc.), com a natureza e a gravidade da doença que se pretenda tratar, com o polipeptido particular da presente invenção e com a via para a sua administração. E possível utilizar qualquer via adequada de administração para se conseguir uma dosagem eficaz de um polipeptido identificado pela presente invenção e também é possível utilizar qualquer forma de dosagem bem conhecida na especialidade farmacêutica. Além disso, os polipeptidos também podem ser administrados por sistemas e/ou dispositivos de administração controlada. Os polipeptidos também podem ser administrados em combinação com outras substâncias 24 activas tais como, em particular, os agentes activadores das células T, tais como a inter-leucina 2, etc..

Os péptidos da presente invenção também podem ser úteis para outros fins, por exemplo, para efeitos de diagnóstico. Por exemplo, podem ser utilizados para se confirmar se uma vacinação com um péptido de acordo com a presente invenção foi bem sucedida. Isto pode ser feito in vitro, efectuando um teste para se pesquisar se o referido péptido é capaz de activar as células T da pessoa vacinada. Há outros aspectos da presente invenção que são evidentes para um especialista na matéria e que não é necessário repetir aqui.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTES: Melief, Comelis J. M.

Visseren, M. J. W.

Kast, W. M. van der Bmggen, Pierre

Boon-Falleur, Thierry (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 62 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) ENDEREÇO: Felfe & Lynch (B) RUA: 805 Third Avenue (C) CIDADE: Nova Iorque (D) ESTADO: Nova Iorque (E) PAÍS: E.U.A. 25 k 25 k

(F) CÓDIGO POSTAL: 10022 (v) FORMA LEGÍVEL POR COMPUTADOR: (A) SUPORTE: disquete, 5,25 polegadas, capacidade de armazenamento de 360 kb (B) COMPUTADOR: IBM PS/2

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS (D) PROGRAMA INFORMÁTICO: WordPerfect (vi) DADOS ACTUAIS DO PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE DEPÓSITO: (C) CLASSIFICAÇÃO: (vi) DADOS ACTUAIS DO PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: 08/ 217 188 (B) DATA DE DEPÓSITO: 24-MARÇO-1994 (viii) INFORMAÇÃO SOBRE O REPRESENTANTE/AGENTE: (A) NOME: Hanson, Norman D. (B) NÚMERO DO PEDIDO: 30 946

(C) REFERÊNCIA/NÚMERO DO PROCESSO: LUD 5340-PCT (ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: (212) 688-9200 (B) TELEFAX: (212) 838-3884 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA JD NO: 1 : (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 11 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO: 1:

Ser Thr Leu Vai Glu Vai Thr Leu Gli Glu Vai 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 resíduos de aminoácidos (B) TCPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2:

Leu Vai Glu Vai Thr Leu Gli Glu Vai 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:3 : (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3: lis Met Vai Glu Leu Vai His Phe Leu 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 27

Wi Λ ; (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO:4:

Vai De Phe Ser Lis Ala Ser Glu Tir Leu 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:5:

Tir Lai Gh Leu Vai Phe GD De Ghi Vai 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:6:

Gin Leu Vai Phe GD De Glu Vai Vai 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 11 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ Π) NO:7:

Gh Leu Vai Phe Gli He Ghi Vai Vai Glu Vai 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ DD NO:8:

He He Vai Leu Ala He He Ala He 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 11 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:9:

Lis He Trp Glu Glu Leu Ser Met Lai Glu Vai 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 29 29

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO.TO: Ala Leu De Glu Thr Ser Tir Vai lis Vai 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ED NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:l 1:

Leu De Glu Thr Ser Tir Vai Lis Vai 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 11 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 12: GD Leu Glu Ala Arg GD Glu Ala Leu GD Leu 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

I 30 I 30

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO:13:

Gli Lai Glu Ala Aig Gli Glu Ala Leu 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 14:

Ala Leu Gli Leu Vai Gli Ala Gin Ala 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 15:

Gli Leu Vai Gli Ala Gin Ala Pro Ala 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO: 16:

Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gin Ala Ala 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 17:

Asp Leu Ghi Ser Glu Phe Gin Ala Ala He 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 18:

Ala le Ser Arg lis Met Vai Glu Leu Vai 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO: 19:

Ala He Ser Arg Lis Met Vai Glu Leu 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:20: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:20: lis Met Vai Glu Leu Vai His Phe Leu Leu 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:21: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 11 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:21:

Lis Met Vai Glu Leu Vai His Phe Lai Leu Leu 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:22: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 11 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear 33 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO:22:

Loa Leu Leu Lis Tir Arg Ala Arg Glu Pro Vai 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:23: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:23:

Leu lis Tir Arg Ala Arg Glu Pro Vai 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:24: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 11 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ED NO:24: Vai Leu Aig Asn Cis Gin Asp Phe Phe Pro Vai 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:25: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 34 (A) COMPRIMENTO: 11 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO:25:

Tir Leu Gin Leu Vai Phe Gli He Glu Vai Vai 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:26: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:26:

Gli He Glu Vai Vai Glu Vai Vai Pto He 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:27: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:27: Ρω He Ser His Leu Tir He Lai Vai 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:28: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 resíduos de aminoácidos (B) TEPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:28: Hís Leu Tir He Leu Vai Thr Cis Lai 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:29: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 11 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:29: His Leu Tir He Leu Vai Thr Cis Leu Gli Leu 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:30: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO:30:

Tir De Lai Vai Thr Cis Leu Gi Leu 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:31: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ED NO:31:

Cis Leu Cli Leu Ser Tir Asp Gli Leu 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:32: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:32:

Cis Leu Gli Leu Ser Tir Asp GD Lai Leu 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:33: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO:33:

Vai Met Pro lis Thr Gli Leu Leu He 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:34: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:34:

Vai Met Pro Lis Thr Gli Leu Leu He He 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:35: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 11 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:35: Vai Met Pro lis Thr GH Leu Leu He He Vai 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:36: (Í) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO:36:

Gli Leu Leu He He Vai Leu Ala He 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA JD NO:37: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:37:

Gli Leu Lai He He Vai Lai Ala He He 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:38: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 11 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:38:

Gli Leu Leu He He Vai Lai Ala He He Ala 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:39: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:39:

Lai Lai He He Vai Leu Ala He He 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:40: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:40:

Leu Leu He He Vai Lai Ala He He Ala 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:41: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 11 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO:41: Leu Leu De De Vai Leu Ala De De Ala De 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:42: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ DD NO:42:

Leu De De Vai Leu Ala De De Ala 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:43: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 resíduos de aminoácidos (B) TDPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:43: Lai De De Vai Leu Ala De De Ala De 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:44: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO:44:

Ile De Ala De Glu GD Asp Cis Ala 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:45: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:45: lis De Tip Glu Glu Lai Ser Met Leu 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:46: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 11 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:46: Leu Met Gin Asp Leu Vai Gin Glu Asn Tir Leu 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:47: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO:47:

Phe Leu Tip Gli Pio Axg Ala Leu He 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA IDNO.-48: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:48:

Leu He Glu Thr Ser Tir Vai lis Vai 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:49: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 11 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:49:

Ala Leu He Glu Thr Ser Tir Vai lis Vai Leu 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:50: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:50:

Thr Leu Lis Fe GF GF Glu Pro Hs Fe 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:51: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 11 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:51:

His Fe Ser Tir Pro Pro Leu Hs Glu Arg Ala 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:52: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:52:

Gin Thr Ala Ser Ser Ser Ser Tbr Leu 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:53: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:53:

Gin Thr Ala Ser Ser Ser Ser Thr Lai Vai 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:54: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:54:

Vai Thr Leu Gli Glu Vai Pro Ala Ala 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:55: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO:55:

Vai Thr Lis Ala Glu Met Lai Glu Ser Vai 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:56: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 11 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:56:

Vai Thr lis Ala Glu Met Leu Glu Ser Vai Leu 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:57: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 11 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:57: Vai Th: Cis Leu Gli Leu Ser Tir Asp Gli Leu 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:58: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 9 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO:58: lis Thr Gli Leu Leu De De Vai Leu 1 5 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:59: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 10 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:59:

Lis Thr GD Leu Leu De De Vai Leu Ala 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ED NO:60 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 11 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TEPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:60:

Tis Thr GD Leu Leu De De Vai Leu Ala De 47 47 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:61: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 11 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO:61:

His Thr Leu Lis De Gli Gli Glu Pto His He 1 5 10 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:62: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 9 resíduos de aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ Π> NO:62:

Met Leu Asp Leu Gin Pro Glu Thr Thr 1 5

Lisboa, ! 9 JU1I. W

JLa_aJUI Aj) Agente Ο'ΆΙ de R.CkC .'0-··

Dra. Maria Silvína Ferrcira

v‘il . ,:0A

Claims

/ Reivindicações 1. Péptido isolado e seleccionado entre o conjunto constituído por SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 e SEQ ID NO:l 1.
2. Péptido isolado de acordo com a reivindicação 1, designado por SEQ ID NO:l.
3. Péptido isolado de acordo com a reivindicação 1, designado por SEQ ID NO:6.
4. Péptido isolado de acordo com a reivindicação 1, designado por SEQ ID NO:9.
5. Complexo isolado de ALH-A2 e o péptido isolado da reivindicação 1.
6. Complexo isolado da reivindicação 5, em que o referido péptido é designado por SEQ ID NO: 1.
7. Complexo isolado da reivindicação 5, em que o referido péptido é designado por SEQ ID NO:6.
8. Complexo isolado da reivindicação 5, em que o referido péptido é designado por SEQ ID NO:9.
9. Clone isolado de células T citolíticas, específico para um complexo de ALH-A2 e um péptido seleccionado entre o conjunto constituído por SEQ ID NO:l, SEQ ID 2 N0:2, SEQ ID N0:4, SEQ ID N0:6, SEQ ID N0:7, SEQ ID N0:8, SEQ ID N SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 11.
10. Clone isolado de células T citolíticas da reivindicação 9, em que o referido péptido é a SEQ ID NO:l.
11. Clone isolado de células T citolíticas da reivindicação 9, em que o referido péptido é a SEQ ID NO:6.
12. Clone isolado de células T citolíticas da reivindicação 9, em que o referido péptido é a SEQ ID NO:9.
13. Anticorpo monoclonal que se liga de forma específica a um complexo de ALH-A2 e de um péptido seleccionado entre o conjunto constituído por SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO: 10 e SEQ ID NO: 11.
14. Anticorpo monoclonal da reivindicação 13, em que o referido péptido é a SEQ ID NO:l.
15. Anticorpo monoclonal da reivindicação 13, em que o referido péptido é a SEQ ID NO:6.
16. Anticorpo monoclonal da reivindicação 13, em que o referido péptido é a SEQ ID NO:9.
17. Composição terapêutica que compreende pelo menos um clone de células T citolítícas, suficiente para efectuar a lise de uma célula cancerosa que apresenta um complexo de ALH-A2 e de um péptido seleccionado entre as SEQ ID NO:l, 2, 4, 6-11 sobre a sua superfície celular.
18. Composição terapêutica da reivindicação 17, em que o referido péptido é a SEQ ID NO:l.
19. Composição terapêutica da reivindicação 17, em que o referido péptido é a SEQ ID NO:6.
20. Composição terapêutica da reivindicação 17, em que o referido péptido é a SEQ ID NO:9. Lisboa, 1SJUH.Z0Õ1

na Ferreiro. - 1kSí30A • 2ijfiio0 50 2 Aj? j)ra ^ar{a ς;|,Γ| A' 3f;cb! * -iv.wís. 2138iiiói) -