PT781342E - Plantas e sementes transgénicas resistentes aos vírus de adn fitopatogénicos e seus processos de obtenção - Google Patents

Description

ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ DESCRIÇÃO "Plantas e sementes transgénicas resistentes aos vírus de ADN fitopatogénicos e seus processos de obtenção" 0 presente invento refere-se a plantas transgénicas resistentes ou tolerantes aos vírus de ADN patogénicos em plantas. 0 invento refere-se mais concretamente às sementes emitidas por estas plantas transgénicas e susceptíveis de germinar em plantas gue apresentam este critério de resistência ou de tolerância aos vírus de ADN fitopatogénicos. 0 invento visa igualmente os procedimentos de obtenção destas plantas e sementes.

Os vírus de ADN fitopatogénicos são essencialmente representados pelos vírus de ADN em cadeia simples (ss) e pelos vírus de ADN em cadeia dupla (ds).

Os vírus de ADN em cadeia dupla incluem principalmente os Badnavírus e os Caulimovírus.

Os vírus de ADN em cadeia simples incluem principalmente os geminivírus e outros vírus de ADN ss exóticos.

De entre estes vírus de ADN fitopatogénicos, os geminivírus foram especialmente estudados. Estes são vírus de plantas cujo impacto na produção agronómica é considerável em várias regiões tropicais e subtropicais (Harrison, 1985). São vírus de ADN circular em cadeia simples, caracterizados por uma estrutura única no mundo dos vírus: uma cápside em forma de icosaedro duplo (Francki et al., 1980). De acordo com a sua organização genómica distinguem-se por um lado os geminivírus com genoma bipartido constituído por duas moléculas de ADN, A e B com cerca de 2,8 quilobases (kb) cada uma (como é o caso do vírus do mosaico da mandioca africana ("African Cassava Mosaic Virus", ACMV) e do vírus do mosaico dourado do tomate ("Tomato Golden Mosaic Virus", TGMV); por outro lado os geminivírus com genoma monopartido com uma só molécula de ADN com cerca de 2,8 kb (como é o caso do vírus do estriado do 2 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ milho ("Maize Streak Virus", MSV), do vírus do nanismo do trigo ("Wheat Dwarf Virus", WDV) e do vírus do ápice encaracolado da beterraba ("Beet Curly Top Virus", BCTV). Identificam-se dois subgrupos de acordo com o vector de transmissão dos vírus. Determinados geminivírus são transmitidos pela aleurode (ou mosca branca) Bemisia tabaci, e até recentemente consideravam-se todos de genoma bipartido (ACMV, TGMV). Os outros geminivírus são transmitidos pelas cicádias (Cicadulina sp.) e têm todos um genoma monopartido (MSV, WDV e BCTV); para uma revisão consultar Lazarowitz, 1992a. 0 vírus do amarelecimento e do enrolamento das folhas do tomate (ou vírus TYLC, "Tomato Yellow Leaf Curl Virus", também designado TYLCV) constitui uma excepção a esta classificação. De facto, apesar de ser transmitido por Bemisia tabaci, o seu genoma é monopartido (Kheyr-Pour et al., 1991; Navot et al., 1991). Apenas um isolado de TYLCV tailandês foi descrito como apresentando um genoma bipartido (Rochester et al., 1990). O TYLCV é responsável por importantes prejuízos nas culturas de tomate, podendo as perdas atingir 50 a 60% (Allex et al., 1994). Nessa espécie, os sintomas característicos incluem estiolamento da planta, enrolamento e amarelecimento das folhas, aspecto em forma de moita devido ao encurtamento dos entrenós e paragem de crescimento floral. Esta doença, que afecta já numerosas regiões (bacia mediterrânica, próximo e médio Oriente, extremo sul asiático e África saheliana), encontra-se actualmente em expansão (Czosnek et al., 1990). A França metropolitana tem sido até ao momento poupada mas as Antilhas francesas já são afectadas desde há dois anos (Hostachy e Allex, 1993). A análise da sequência do genoma vírico de TYLCV revelou a existência de seis quadros de leitura aberta (ou ORF, "Open Reading Frame") podendo codificar para produtos de tamanho superior a 10 kDa. Estes ORF encontram-se tanto na cadeia vírica (ORF VI e V2) como na cadeia complementar (ORF Cl, C2, C3 e C4) (Kheyr-Pour et al., 1991); consultar figura 1. A transcrição do genoma vírico de geminivírus é bidireccional (Hanley-Bowdoin et al., 1988; Accotto et al., 3 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ 1989) . Esta ocorre de um lado e doutro da região intergénica (RI), ou região comum às duas componentes do ADN dos vírus com genoma bipartido. A RI com cerca de 200 nucleótidos (nt) apresenta uma seguência com cerca de 30 nt gue poderia adoptar uma estrutura em haste-ansa. Por análise mutacional esta estrutura potencial em haste-ansa revelou-se essencial para a replicação do ADN vírico. A replicação do genoma vírico passa por uma forma intermediária em cadeia dupla nos núcleos das células infectadas (Davies e Stanley, 1989). A presença ao nível da estrutura potencial em haste-ansa de um nonanucleótido muito conservado em todos os geminivírus (TAATATTAC) e semelhante ao local de clivagem do produto do gene A do bacteriófago DX174, sugere um modo de replicação segundo o modelo do círculo rolante (Stenger et al., 1991; Saunders et ai., 1991). O gene Cl (ou AL1) é o único gene vírico essencial à replicação do ADN vírico (Elmer et ai., 1988). Todos os outros factores necessários à replicação do ADN vírico são de origem celular. A proteína Cl não apresenta qualguer homologia de sequência com as ADN polimerases conhecidas. A análise da sequência deduzida de aminoácidos da proteína Cl revela a existência de um motivo consensual de fixação de nucleósidos-trifosfato (NTP) ou "P-loop" (de "phosphate loop" ou ansa de fosfato), GXXXXGKT/S (G= glicina, K= lisina, T= treonina, S= Ser, X= qualquer aminoácido) que é conservado entre as ADN- e ARN-helicases (Gorbalenya e Koonin, 1989). Os papéis da proteína Cl na replicação não são ainda conhecidos. Porém, várias publicações convergem no sentido de funções múltiplas associadas à proteína Cl. A proteína AL1 do TGMV fixa-se a uma sequência específica de cerca de 50 nt ao nível da região comum (Fontes et al., 1992). Esta proteína possui igualmente uma actividade de auto-regulação por repressão da sua própria transcrição (Sunter et al., 1993). Recentemente demonstrou-se uma actividade ATPase assim como uma capacidade de fixação específica ao ATP in vitro para a proteína Cl de TYLCV expressa sob a forma de fusão com glutationa-S-transferase (GST) em Escherichia coli. No entanto, o(s) possível(eis) papel/papéis dessa actividade ATPase in vivo ainda não foi/foram elucidado(s). Além disso, demonstrou-se uma actividade in vitro de corte e ligação da proteína GST-C1 de 4 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ TYLCV ao nível do nonanucleótido conservado. Esta dupla actividade de clivagem e de ligação in vitro é independente da actividade ATPase, dado que mutantes com deficiência na actividade ATPase in vitro apresentam sempre a capacidade de clivar e de ligar in vitro o ADN vírico.

Todos os cultivares de tomate são sensíveis ao TYLCV. Actualmente, a luta contra o vírus assenta, sem grande sucesso, no vector B. tabaci por utilização de insecticidas e por protecção dos campos e das estufas com redes de malha muito fina. É portanto urgente desenvolver outros métodos de luta mais eficazes. É por isso que se investigam resistências naturais em espécies selvagens de tomate (Lycopersicon chilense, L. hirsutum, L. peruvianum) com vista a introduzi-las na espécie doméstica L. esculentum (Zakay et al., 1990). Mapeou-se por RFLP um gene de tolerância (ausência de sintomas mas ocorrência de replicação do ADN vírico) no cromossoma 6 de L. chilense e denominou-se Ty-1 (Eshed et al., 1992) . Estes programas de introgressão são de muito longa duração devido aos numerosos retrocruzamentos a efectuar. Foram então adoptadas novas estratégias por utilização de engenharia genética paralelamente com genética clássica. Utilizaram-se duas abordagens para obter plantas transgénicas tolerantes ou resistentes aos geminivírus (Frischmuth e Stanley, 1993). A primeira consiste em exprimir sequências anti-sentido do gene AL1 de TGMV em plantas de tabaco desencadeando assim uma redução dos sintomas devidos a esse vírus (Day et al., 1991). A segunda abordagem baseia-se na inibição do movimento do ACMV in planta por expressão de uma proteína de movimento recombinante e na qual o TGMV apresenta deficiência (von Arnim et al., 1992).

Constitui um dos objectivos do presente invento proporcionar um novo procedimento de obtenção de plantas modificadas geneticamente que sejam resistentes ou tolerantes aos vírus de ADN patogénicos para as plantas.

Constitui um outro objectivo do presente invento proporcionar plantas transgénicas resistentes ou tolerantes aos vírus de ADN. 5 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ

Constitui um outro objectivo do presente invento proporcionar sementes transgénicas susceptiveis de darem origem à formação, por germinação, de plantas transgénicas resistentes ou tolerantes aos virus de ADN. 0 invento é ilustrado com o auxilio das figuras seguintes: - figura 1: organização genómica do TYLCV de Sardenha (TYLCVsar), também denominado no presente documento "STYLCV"; - figura 2: representação dos plasmideos pTY Ala, His, Arg, do plasmideo pBMCl-S e dos plasmideos pCl Ala, His, Arg; - figura 3: mutações construídas no genoma de STYLCV; - figura 4: replicação dos mutantes no local de ligação aos NTP de STYLCV; - figura 5: gráfico representativo do estudo de um efeito dominante em trans da mutação K para R, ensaio de actividade NPT II; - figura 6: gráfico representativo do efeito da transfecção dos genomas víricos mutantes (pTYAla, pTYHis, pTYArg) sobre a replicação do vírus selvagem (pTYLCV); - figura 7: gráfico representativo do efeito da co- transfecção de construções que permitem expressão a níveis elevados das proteínas Cl mutadas (pClAla, pClHis, pClArg) sobre a replicação do vírus selvagem (pTYNeo); - figura 8: representação dos plasmideos pTYLCV e pGEXCl; - figura 9: clonagem do ORF Cl a jusante do promotor 35S no plasmideo pGA492; - figura 10: transformação de discos foliares de N. benthamiana e obtenção de plantas transgénicas que exprimem o ORF Cl selvagem ou mutado; - figura 11: esquema simplificado de explicação da obtenção das plantas da primeira geração Fl; - figura 12: replicação do ADN de STYLCV em protoplastos de tomate. - figura 13: sequências nucleotídicas mutadas Cl* (derivadas por mutação da sequência, nomeadamente da ORF de Cl que codifica a proteína Cl ou Rep de STYLCV) que codifica as proteínas mutadas RepK227A, RepK227H e RepK227R, também 6 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ denominadas no presente documento como mutação Ala, His e

Arg, respectivamente. O invento refere-se à utilização da sequência nucleotídica mutada que codifica para uma proteína Cl inactiva correspondente à proteína Cl activa (também designada proteína Rep ou AL1) com um peso molecular de cerca de 40 kDa, essencial para a replicação do genoma dos geminivírus na qual a lisina situada entre as posições 220 e 235 da referida proteína Cl activa é substituída por alanina, arginina ou histidina para a obtenção de plantas resistentes ou tolerantes aos geminivírus.

As sequências nucleotídicas mutadas segundo o invento correspondem às sequências nucleotídicas que codificam para uma proteína Cl dos seguintes geminivírus: • o subgrupo I (membro tipo MSV, "Maize streak vírus"), incluindo os seguintes isolados: ..MSV, ou vírus do estriado do milho, ..CSMV ("Chloris striate mosaic virus"), ou vírus do mosaico estriado de Chloris, ..DSV ("Digitaria streak virus"), ou vírus do estriado de Digitaria, ..MiSV ("Miscanthus streak virus"), ou vírus do estriado de Miscanthus, ..WDV ("Wheat dwarf virus"), ou vírus do nanismo do trigo, ..PanSV-Ken ("Panicum streak virus-Kenya") ..SSV-N ("Sugarcane streak virus-Natal"), ou vírus Natal do estriado da cana-de-açúcar, • o subgrupo II (membro tipo BCTV, "Beet curly top virus"), incluindo os seguintes isolados: ..BCTV, ou vírus do enrolamento do ápice da beterraba, ..TPCTV ("Tomato pseudocurly top virus"), ou vírus do pseudoenrolamento do ápice da beterraba, ..BSDV ("Bean summer death virus"), ou vírus da morte estival do feijão ..TYDV ("Tobacco yellow dwarf virus"), ou vírus do nanismo e amarelecimento do tabaco, 7 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ ..TLRV ("Tomato leafroll vírus"), ou vírus do enrolamento das folhas do tomate, • o subgrupo III (membro tipo BGMV, "Bean golden mosaic vírus"), incluindo os seguintes isolados: ..BGMV, ou vírus do mosaico dourado do feijão, ..AbMV ("Abutilon mosaic virus"), ou vírus do mosaico de Abutilon, ..ACMV ("African Cassava mosaic virus"), ou vírus do mosaico da mandioca africana, ..CLCV ("Cotton leaf crumple virus"), ou vírus do amarrotamento das folhas de algodão, ..EuMV ("Euphorbia mosaic virus"), ou vírus do mosaico de Euphorbia, ..HYVMV ("Honeysuckle yellow vein mosaic virus"), ou vírus do mosaico e nervuras amarelas da madressilva, ..ICMV ("Indian Cassava mosaic virus"), ou vírus do mosaico da mandioca indiana, ..MLCV ("Melon leaf curl virus"), ou vírus do enrolamento das folhas do melão, ..MYMV ("Mungbean yellow mosaic virus"), ou vírus do mosaico amarelo do feijão, ..PYMV ("Potato yellow mosaic virus"), ou vírus do mosaico amarelo da batata, ..SLCV ("Squash leaf curl virus"), ou vírus do enrolamento das folhas da aboboreira, ..TGMV ("Tomato golden mosaic virus"), ou vírus do mosaico dourado do tomate, ..TLCV ("Tomato leaf curl virus"), ou vírus do enrolamento da folha do tomate, nomeadamente TLCV-Aus e TLCV-Ind, para "Tomato leaf curl virus Australia" e "Tomato leaf curl virus índia", respectivamente ..TYDV ("Tomato yellow dwarf virus"), ou vírus do nanismo e amarelecimento do tomate, ..TYLCV ("Tomato yellow leaf curl virus"), ou vírus do enrolamento e do amarelecimento da folha do tomate, nomeadamente o STYLCV, para TYLCV da Sardenha, do qual os subconjuntos, nomeadamente STYLCV-Sp (Espanha), como o STYLCV-Sp-Murcia, o STYLCV-Si (Sicília) ou ainda o ITYLCV, para TYLCV de Israel do qual nomeadamente os subconjuntos ITYLCV-Eg 8 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ (Egipto) e ITYLCV-Jo (Jordânia), ThTYLCV para TYLCV da Tailândia, ..AToLCV ("Australian tomato leaf curl virus"), ..IToLCV ("Indian tomato leaf curl virus"), dos quais nomeadamente as subespécies IToLCV-ND (New Delhi) e IToLCV-Bg (Bangalore), ..TYMV ("Tomato yellow mosaic virus"), ou vírus do mosaico amarelo do tomate, ..Tom GV ("Tomato geminivirus MX3"), ..ToLCrV ("Tomato leaf crumple virus"), ..ToMoV-Flo ("Tomato mottle virus Florida"), ..Vírus do "Chino del Tomate", ..WCSV ("Watermelon chlorotic stunt"), ou vírus do estiolamento da clorose da melancia, ..CLCV ("Cotton leaf curl virus"), ou vírus do enrolamento das folhas do algodão, ..CGMV ("Cowpea golden mosaic virus"), ou vírus do mosaico dourado do grão-de-bico, ..EYMV ("Eggplant yellow mosaic virus"), ou vírus do mosaico amarelo da beringela, ..BCaMV ("Bean calico mosaic virus MoV2"), ..PhVCMV ("Bean calico mosaic virus P. vulgaris") , ..BDMV ("Bean dwarf mosaic virus"), ..PepGV ("Pepper geminivirus MX1"), ..PHV ("Pepper huasteco virus"), ..BYVMV ("Bhendi (Okra) yellow vein mosaic virus"), ..CYVMV ("Croton yellow vein mosaic virus"), ..HYMV ("Horsegram yellow mosaic virus"), ..DYMV ("Dolichos yellow mosaic virus"), ..PMTV-T ("Pepper mild tigre virus-T"), ..SGMV ("Serrano golden mosaic virus"), ..JMV ("Jatropa mosaic virus"), ..LIYV ("Lettuce infectious yellow virus"),

Para uma revisão dos vírus de ADN, nomeadamente em cadeia simples, fitopatogénicos e que apresentam sequências nucleotídicas das quais são susceptíveis de serem derivadas por mutação as sequências nucleotídicas do invento, podemos referir-nos às seguintes obras: - "Classification and Nomenclature of Viruses", Fifth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses, 9 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ editado por Francki, Fauquet, Knudson e Brown, Archives of Virology, Suplemento 2, Springer-Verlag Wien, Nova Iorque, 1991. - "Viruses of Tropical Plants", Alan Brunt, Karen Crabtree and Adrian Gibbs, 1990, editado por C.A.B. International, Wallingford, Oxon, 0X10 8DE, R.U. - "Virus Taxonomy, the VIth report of the ICTV"; Murphy FA,

Fauquet CM, Bishop DHL, Ghabrial SA, Jarvis AW, Martelli GP, Mayo MA, Summers MD (ed.) (1995), Springer-Verlag,

Wien, Nova Iorque, p. 570. O invento refere-se mais concretamente à utilização das sequências nucleotidicas mutadas que codificam uma proteína Cl inactiva correspondente à proteína Cl activa dos diferentes isolados do vírus TYLC, tais como as sequências nucleotídicas Cl* representadas na figura 13, nas quais a lisina na posição 227 é substituída por alanina, arginina ou histidina (com excepção de um isolado israelita do vírus TYLC (ITYLCV) para o qual pareceria que a lisina em questão estaria na posição 225) , para a obtenção de plantas, nomeadamente de tomates, resistentes ou tolerantes aos vírus TYLC.

De preferência, a proteína Cl inactiva mencionada supra de geminivírus, nomeadamente dos vírus TYLC, correspondente à proteína Cl activa na qual a lisina, situada numa das posições indicadas supra, é substituída por uma alanina. O invento refere-se igualmente à utilização de pelo menos uma sequência nucleotídica mutada tal como definida supra, para a transformação de células de plantas com vista à obtenção de plantas transgénicas resistentes ou tolerantes aos geminivírus.

Entende-se como plantas transgénicas resistentes aos geminivírus, qualquer planta na qual, após infecção com os referidos vírus, não se detectam por um lado os sintomas patológicos característicos da infecção de uma planta não transgénica sensível aos referidos vírus e por outro lado não se detecta o ADN dos referidos vírus no interior das células das referidas plantas transgénicas. 10 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ

Entende-se como plantas transgénicas tolerantes aos geminivírus, gualguer planta na gual, após infecção com os referidos vírus, não se detectam os sintomas patológicos característicos da infecção de uma planta não transgénica sensível aos referidos vírus, mas nas quais o ADN dos referidos vírus pode ser detectado nas células das referidas plantas transgénicas (em menores quantidades que no caso de infecção de uma planta sensível a esses vírus).

As sequências nucleotídicas mutadas segundo o invento são vantajosamente utilizadas para a transformação de protoplastos ou ainda para a construção de vectores, tais como plasmídeos, ou para a transformação de bactérias tais como Agrobacterium tumefaciens, susceptíveis de transformar por sua vez células de plantas. 0 invento refere-se igualmente à utilização supra mencionada de qualquer sequência nucleotídica mutada tal como descrito supra, derivada por mutação de uma sequência nucleotídica presente no genoma de um geminivírus, para a obtenção de plantas transgénicas resistentes ou tolerantes a uma ou a várias subespécies e/ou espécies víricas pertencentes aos geminivírus e mais particularmente a uma ou a várias subespécies e/ou espécies víricas pertencentes a um mesmo subgrupo dos geminivírus tal como o subgrupo III ou pertencentes a um mesmo membro de um subgrupo determinado dos geminivírus, tal como os TYLCV.

Neste contexto, o invento refere-se mais particularmente à utilização supra mencionada da sequência nucleotídica mutada que codifica uma proteína Cl inactiva correspondente à proteína Cl activa da espécie STYLCV, para a qual a lisina na posição 227 é substituída por alanina, arginina ou histidina (tal como representado na figura 13) , para a obtenção de plantas, nomeadamente de tomates, resistentes ou tolerantes aos geminivírus tais como os que pertencem aos TYLCV, nomeadamente aos vírus como o STYLCV e o ITYLCV, nomeadamente o ITYLCV—Jo, ou ainda aos geminivírus não TYLCV, nomeadamente O ACMV ou o BGMV. O invento refere-se igualmente a qualquer procedimento de obtenção de plantas, nomeadamente de tomates, transgénicas 11 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ resistentes ou tolerantes aos geminivírus, caracterizado em que inclui uma etapa de transformação de células de plantas com o auxilio de pelo menos uma sequência nucleotidica mutada segundo o invento, se for caso disso, inserida num vector ou numa bactéria tal como definido supra, seguido de regeneração das plantas a partir das células assim transformadas. A titulo ilustrativo, um procedimento tal como descrito supra consiste na introdução de uma sequência nucleotidica mutada segundo o invento numa célula de planta, nomeadamente num protoplasto, se for caso disso por intermédio de um vector (tal como um plasmídeo), sendo obtida a planta transgénica por divisão de células assim transformadas (procedimento por utilização de ADN nu).

Um outro procedimento consiste em transformar células de plantas com auxilio de bactérias tais como Agrobacterium tumefaciens, elas próprias transformadas por pelo menos uma sequência nucleotidica mutada segundo o invento, nomeadamente seguindo o método de co-cultura ou de discos foliares.

Para uma revisão dos métodos utilizáveis para a obtenção de plantas transgénicas do invento, podemos referir o artigo de Potrykus publicado em Biotechnology, Junho de 1990, 535- 542 . 0 procedimento segundo o invento, é efectuado vantajosamente por transformação de células de um fragmento de uma planta, nomeadamente de discos foliares, com auxilio de bactérias Agrobacterium tumefaciens transformadas por um vector tal como definido supra, seguida de regeneração das plantas a partir de células assim transformadas, nomeadamente a partir de rebentos formados na periferia dos discos foliares supra mencionados. 0 invento refere-se igualmente a células transgénicas de plantas apresentando um ADN heterólogo integrado de modo estável no seu genoma, contendo o referido ADN heterólogo, se for caso disso, um promotor reconhecido para as polimerases das referidas células de plantas e pelo menos uma sequência nucleotidica mutada tal como definida supra, sendo a referida sequência nucleotidica mutada capaz de inibir total ou 12 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ parcialmente a replicação e/ou a difusão e/ou a distribuição de geminivírus, nomeadamente capaz de codificar sob o controlo do referido promotor uma proteína susceptível de inibir total ou parcialmente a replicação e/ou a difusão e/ou a distribuição de geminivírus nas referidas células transformadas, estando excluídas as células de Nicotina tabaccum cultivar BY2 ("bright yellow 2", descritas por Nagata et al., 1992) . 0 invento visa mais especificamente as células de plantas tal como definidas supra, que podem ser regeneradas numa planta transgénica resistente ou tolerante a uma ou a várias estirpes de vírus de ADN fitopatogénicos e capaz de produzir sementes, que são elas próprias resistentes ou tolerantes aos referidos vírus.

Vantajosamente, as células de plantas segundo o invento são transformadas segundo um procedimento tal como descrito supra. 0 invento refere-se igualmente às sementes transgénicas apresentando um ADN heterólogo integrado de modo estável no genoma das suas células, em que o referido ADN heterólogo contém, se for caso disso, um promotor reconhecido pelas polimerases das referidas células e pelo menos uma sequência nucleotídica mutada tal como definida supra, sendo a referida sequência nucleotídica mutada capaz de inibir total ou parcialmente a replicação e/ou a difusão e/ou a distribuição de geminivírus, nomeadamente capaz de codificar sob o controlo do referido promotor uma proteína susceptível de inibir total ou parcialmente a replicação e/ou a difusão e/ou a distribuição de geminivírus no interior das referidas células transformadas.

Vantajosamente, as sementes segundo o invento são capazes de germinar numa planta resistente ou tolerante aos geminivírus, mais particularmente aos definidos supra.

De preferência, as sementes segundo o invento são transformadas por um procedimento tal como descrito supra. 13 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ Ο invento refere-se igualmente a plantas transgénicas resistentes ou tolerantes aos geminivirus apresentando um ADN heterólogo integrado de modo estável no genoma das suas células, em que o referido ADN heterólogo contém, se for caso disso, um promotor reconhecido pelas polimerases das referidas células de plantas e pelo menos uma sequência nucleotidica mutada tal como definida supra, sendo a referida sequência nucleotidica mutada capaz de inibir total ou parcialmente a replicação e/ou a difusão e/ou a distribuição de geminivirus, nomeadamente capaz de codificar sob o controlo do referido promotor uma proteína susceptível de inibir total ou parcialmente a replicação e/ou a difusão e/ou a distribuição de geminivirus no interior das referidas células transformadas, estando excluídas as plantas de Nicotina benthamiana assim transformadas.

Vantajosamente, as plantas segundo o invento, são capazes de produzir sementes resistentes aos geminivirus. 0 invento visa mais particularmente as plantas supra mencionadas tal como obtidas pela aplicação de um procedimento tal como descrito supra.

As plantas transgénicas segundo o invento resistentes ou tolerantes aos geminivirus, tal como obtidos por transformação das suas células com pelo menos uma sequência nucleotidica mutada segundo o invento, são vantajosamente seleccionadas entre as seguintes plantas: Ageratum spp., nomeadamente Ageratum conyzoides, Arabidopsis spp., nomeadamente Arabidopsis thaliana, Arachis spp., nomeadamente Arachis hypogaea, Asparagus spp., nomeadamente Asparagus officinalis, Avena spp., nomeadamente Avena sativa e Avena byzantina, Beta spp., nomeadamente Beta vulgaris, Brassica spp., nomeadamente Brassica oleracea vars capitata, Brassica napus e Brassica rapa, Cajanus spp., nomeadamente Cajanus cajan, Cannabis spp., nomeadamente Cannabis sativa, Capsicum spp., nomeadamente Capsicum annuum, Castanospermum spp., nomeadamente Castanospermum australe, Citrullus spp., nomeadamente Citrullus colocynthis e Citrullus lanatus, Cocos spp., nomeadamente Cocos nucifera, Cola spp., nomeadamente Cola chlamydantha e Cola gigantea var. glabrescens, Croton spp., nomeadamente Croton lobatus, Cucumis spp., nomeadamente 14 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ

Cucumis melo var. cantalupensis e Cucumis melo, Curcubita spp., nomeadamente Cucurbita maxima, Cucurbita moschata e Cucurbita pepo, Cynanchum spp., nomeadamente Cynanchum acutum, Datura spp., nomeadamente Datura stramonium, Dioscorea spp., nomeadamente Dioscorea alata, Euphorbia spp., nomeadamente Euphorbia fulgens, Euphorbia heterophylla, Euphorbia peplus e Euphorbia pulcherrima, Glycine spp., nomeadamente Glycine max e Glycine hispida, Gossypium spp., nomeadamente Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum, Gossypium thurberi e Gossypium herbaceum, Helianthus spp., nomeadamente Helianthus annuus, Hibiscus spp., nomeadamente Hibiscus cannabinus, Hibiscus esculentus e Hibiscus sabdariffa, Hordeum spp., nomeadamente Hordeum vulgare e Hordeum distichon, Indigofera spp., nomeadamente Indigofera hirsuta, Ipomoea spp., nomeadamente Ipomoea batatas, Jatropha spp., nomeadamente Jatropha gossypifolia, Jatropha multifida e Jatropha podagrica, Lablab spp., nomeadamente Lablab purpureus, Linum spp., nomeadamente Linum usitatissimum, Lonicera spp., nomeadamente Lonicera japonica, Lycopersicon spp., nomeadamente Lycopersicon esculentum, Lycopersicon hirsutum e Lycopersicon pimpinellifolium, Macroptilium spp., nomeadamente Macroptilium lathyroides, Macrotyloma spp., nomeadamente Macrotyloma uniflorum, Malva spp., nomeadamente Malva parviflora, Malvastrum spp., nomeadamente Malvastrum coromandelianum, Manihot spp., nomeadamente Manihot esculenta e Manihot glaziovii, Medicago spp., nomeadamente Medicago sativa, Musa spp., nomeadamente Musa sapientum, Nicotiana spp., nomeadamente Nicotiana tabacum, Oryza spp., nomeadamente Oryza sativa, Phaseolus spp., nomeadamente Phaseolus acutifolius, Phaseolus lunatus e Phaseolus vulgaris, Pisum spp., nomeadamente Pisum sativum, Raphanus spp., nomeadamente Raphanus sativus, Saccharum spp., nomeadamente Saccharum officinarum, Secale spp., nomeadamente Secale cereale, Sida spp., nomeadamente Sida rhombifolia, Solanum spp., nomeadamente Solanum melongena e Solanum tuberosum, Sorghum spp., nomeadamente Sorghum bicolor e Sorghum vulgare, Spinacia spp., nomeadamente Spinacia oleracea, Theobroma spp., nomeadamente Theobroma cacao, os triticales (híbrido de trigo e centeio), Triticum spp., nomeadamente Triticum aestivum, Triticum durum e Triticum vulgare, Vicia spp., nomeadamente Vicia faba e Vicia sativa, Vigna spp., nomeadamente Vigna angularis, Vigna mungo, Vigna radiata e Vigna unguiculata, 15 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ

Vitis spp., nomeadamente Vitis vinifera, Zea spp., nomeadamente Zea mays. O invento será adicionalmente ilustrado com auxilio da descrição detalhada seguinte da obtenção de N. benthamiana e de tomates transgénicos resistentes à infecção pelos TYLCV, mais particularmente pelos STYLCV e pelos ITYLCV.

I) OBTENÇÃO DE MUTANTES NEGATIVOS DOMINANTES NO LOCAL DE LIGAÇÃO AOS NTP DA PROTEÍNA Cl DE TYLCV, UM GEMINIVÍRUS

A) MATERIAL E MÉTODOS a) Mutagénese dirigida pTYLCV é um clone infeccioso do isolado de Sardenha do TYLCV (STYLCV) no qual o genoma virico completo é clonado no local SstI do vector pUC118. A mutagénese dirigida foi efectuada neste clone produzindo os plasmídeos pTYAla, pTYHis, pTYArg; que apresentam a mutação correspondente à mudança de K227 para A, H e R, respectivamente (figura 2).

Principio (Kunkel, 1985): Hibrida-se um oligonucleótido mutagénico com o ADN em cadeia simples circular com uridina submetido à mutagénese. A síntese da segunda cadeia efectua-se in vitro, seguida de contra-selecção da cadeia com uridina por transformação em E. coli e reparação do híbrido em cadeia dupla in vivo. A etapa in vitro é efectuada na presença de fragmentos de restrição que abrangem o plasmídeo de modo a minimizar o comprimento da cadeia complementar sintetizada de novo o que diminui os riscos de introdução de novas mutações. 1/- Obtenção do ADN em cadeia simples com uridina:

Transforma-se a estirpe E. coli BW313 (Hfr lysA dut-ung-thi-1 recA spoTl), infectada pelo fago auxiliador M13K07, com o plasmídeo a mutar (pTYLCV). Estas bactérias produzem então ADN em cadeia simples com uridina, sendo a bactéria deficiente nas funções dUTPase e Uracilo-N-Glicosilase e encapsulado sob a forma em cadeia simples graças às funções codificadas pelo fago M13K07 e à sua acção em trans sobre a origem de replicação de M13 contida em pUC118. Os fagemídeos obtidos são 16 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ recolhidos por uma primeira centrifugação da cultura bacteriana (10 000 rpm, 10 min), tratamento do sobrenadante com PEG 8000 a 20% e NaCl 2,5 M (300 ml/ml) , seguido de uma segunda centrifugação (6000 rpm, 20 min). As proteínas são extraídas por tratamento com fenol/clorofórmio e o ADN é precipitado com etanol (Sambrook et al., 1989). 2/-Hibridação com o oligonucleótido mutagénico e síntese da segunda cadeia: A sequência dos oligonucleótidos utilizados é a seguinte: mutação de K para A : CCGGACAGGAGCGAC(CACGTG)GGCC. mutação de K para H : CCGGACAGGAÇATAC(CACGTG)GGCC. mutação de K para R : CCGGACAGGAAGGAC(CACGTG)GGCC.

Os parênteses indicam a localização do novo local de restrição Pmll.

Hibridam-se fragmentos de restrição de pTYLCV assim como o oligonucleótido fosforilado (em excesso molar de 25 relativamente ao fragmento de restrição correspondente) com o ADN em cadeia simples com uridina. A segunda cadeia é então sintetizada (Klenow 10 unidades, Ligase 800 unidades, ATP 500 μΜ, dNTP 500 μΜ, Tris 10 mM, MgC12 5 mM, DTT 500 μΜ) . Transforma-se seguidamente uma estirpe de E. coli DH5D (supE44 □lacU169 (□eOlacZDMlS) hsdR17 recAl endAl gyrA96 thi-1 relAl) que vai reparar o ADN por degradação preferencial da cadeia com uridina. A cadeia sintetizada de novo utiliza como matriz a cadeia complementar contendo a mutação, introduzindo-a assim em ambas as cadeias. b) Cassetes de expressão dos ORF Cl mutados

A expressão a níveis elevados das proteínas Cl mutadas é efectuada por subclonagem dos fragmentos que apresentam a mutação no plasmídeo pBMCl-S, por substituição dos ORFC1 dependentes de um promotor forte derivado do promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV). O plasmídeo pBMCl-S 17 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ contém ο ORF de Cl clonado num vector não replicativo representado na figura 2. O local S st I2860 foi destruído neste vector pela ADN polimerase do fago T7. Substitui-se o fragmento HindlII-Scal, no qual o local SstI se encontra suprimido, no fragmento HindIII-Scal correspondente em pBMCl-S: obtém-se assim o plasmídeo pBMCl-S(SstI). Seguidamente, o fragmento Sstl365-BamHIuvo deste último plasmídeo foi substituído por um fragmento SstI-BglII de pTYAla, pTYHis ou pTYArg dando origem aos plasmídeos pClAla, pClHis e pClArg, respectivamente. Cria-se então um novo local na posição 1170 clivável por Mbol ou BstYI (figura 2). c) Determinação da sequência dos mutantes obtidos

Utilizou-se o método de terminação de cadeia (Sanger et al., 1977; Sanger, 1981) (Kit Pharmacia - T7 Sequencing kit) tendo por molde o ADN em cadeia dupla obtido por uma preparação maxi de ADN plasmídico (Sambrook et al., 1989). Depositam-se as reacções num gel de acrilamida a 6% desnaturante para o qual se efectua um gradiente de espessura (0,2 mm de altura e 0,6 mm na base das placas) de modo a obter uma boa resolução das bandas na maior parte do gel. A migração efectua-se em tampão TBE a 2000 V com um dispositivo de termostato que permite manter as placas a 50 °C o que permite uma migração mais regular. d) Linha celular e preparação de protoplastos A linha celular BY2 é uma suspensão celular derivada de Nicotiana tabacum L cv Bright Yellow 2 (Kato et al, 1972;

Nagata et al, 1992). Esta foi diluída (2 : 100) de 7 em 7 em dias num meio derivado do meio de Murashige e Skoog (Sigma) suplementado com KH2P04 (200 mg/1), mio-Inositol (100 mg/1)

tiamina-HCl (1 mg/1), sacarose (30 g/1), 2,4-D (0,2 mg/1) MES (2 g/1), pH 5,8. Mantém-se a cultura em agitação constante (130 rpm) a 26°C e às escuras.

Para a preparação de protoplastos, recolhem-se por filtração as células de uma suspensão de 100 ml com três a quatro dias (inoculação de 2 a 3 ml em 100 ml) , lavam-se em 18 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ manitol 0,4 Μ e seguidamente transferem-se para 50 ml da seguinte solução enzimática: celulase Onozuka RS a 1%, pectoliase a 0,1%, manitol 0,4 M, pH 4,5 a 5,5. A digestão da parede celular efectua-se a 28 °C com agitação (60 rpm) e às escuras. A obtenção dos protoplastos (1 a 2 h) é controlada ao microscópio (aparecimento de células esféricas). Os protoplastos são seguidamente recolhidos por centrifugação (100 g, 2 min), lavados, contados numa câmara de Fuchs-Rosenthal e retomados em meio MaMg (manitol 450 mM, MgCl2 15 mM, MES a 0,1%, pH 5,6) para uma densidade final de 2 x 106 protoplastos em 300 ml. e) Transfecção dos protoplastos

Cada transfecção é efectuada com 2 x 106 protoplastos e 15 mg de ADN (plasmídeo circular ou ADN virico linear em cadeia dupla). Incuba-se a mistura ADN/protoplastos 20 min com 600 ml de PEG 1500 a 25% na seguinte solução: MgCl2, 6H2O 0,1 M; manitol 0,45 M, Hepes 0,02 M, pH 6. Seguidamente lavam-se os protoplastos, retomam-se em 10 ml de meio K3 (Nagy et alr 1976) e transferem-se para duas caixas de Petri de 5,5 cm de diâmetro.

Incubam-se os protoplastos transfectados a 28°C às escuras sem agitação e recolhem-se após 3 e 5 dias de cultura. f) Extracção do ADN total das células transfectadas

Recolhem-se as células por centrifugação (100 g, 5 min), lavam-se e ressupendem-se em 300 μΐ de tampão de extracção (NaCl 0,1 M, Tris-HCl 0,1 M pH 8, EDTA 50 mM, SDS a 0,5%) e seguidamente colocam-se a -20°C.

Seguidamente, partem-se as células nesse tampão (homogeneizador Heidolph). Extraem-se as proteínas por tratamento com fenol-clorofórmio (Sambrook et al, 1989) e precipitam-se os ácidos nucleicos com etanol (Sambrook et al, 1989) . Retomam-se os ADN em tampão TE e determina-se a sua concentração por densidade óptica medida a 260 nm. 19 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ g) Electroforese, transferência para membrana e hibridação dos ADN extraídos

Efectua-se a electroforese em gel de agarose a 1% sem brometo de etídio por deposição de 10 μρ de ADN por poço. As condições de migração são as seguintes: 30 min a 60 volts seguido de cerca de 16 horas a 25 volts em tampão TBE. Despuriniza-se o gel na presença de HC1 0,25 N e trata-se para uma transferência alcalina para membrana Hybond-N (Amersham). A sonda utilizada corresponde ao genoma total do STYLCV. Obtém-se marcação com 32P por escorvamento aleatório (Kit Amersham Megaprime). h) Extracção das proteínas e ensaio de actividade de neomicina fosfotransferase O método utilizado deriva do método descrito por Reiss et al, 1984. A actividade NPT II é revelada in situ num gel de proteínas não desnaturante por fosforilação de canamicina marcada com [D-32P] ATP.

Centrifugam-se os protoplastos (meia caixa de Petri) e retomam-se num tampão contendo glicerol a 60%, □-mercaptoetanol a 8%, Tris 100 mM pH 6,8, SDS a 0,1%, azul de bromofenol a 1%, azul de xilenocianol a 1%. Quantificam-se as proteínas totais pelo método de Bradford (BIO-RAD); depositam-se então quantidades iguais de proteínas num gel de acrilamida sem SDS (gel de concentração: acrilamida a 3,5%; bisacrilamida a 0,12%; Tris-HCl 0,1 M pH 6,8/ gel resolvente: acrilamida a 10%; bisacrilamida a 0,33%; Tris-HCl 0,4 M pH 8,8). Efectua-se a migração a 13,5 mA num tampão contendo Tris-OH 25 mM, pH 8,8; glicina 191 mM durante cerca de 16 horas. Lava-se então o gel com água e equilibra-se no tampão de reacção (Tris-maleato 67 mM; MgCl2 42 mM; NH4C1 400 mM; pH 7,1). Seguidamente coloca-se sobre o gel de proteínas um gel de agarose a 1% contendo sulfato de canamicina (10,5 μρ/ιηΐ) e 50 a 100 μCi de [□-32P] ATP. Após 30 min de reacção, transfere-se a canamicina fosforilada por capilaridade para papel de transferência iónica Whatman P81. Seguidamente trata-se o papel P81 (1 mg/ml 20 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ proteinase Κ, SDS a 1%) para diminuir as bandas parasitas de fosforilação de proteínas celulares, lava-se em tampão fosfato (K2P04 10 mM, pH 7,4), seca-se a 80°C e coloca-se em autorradiografia.

B) RESULTADOS a) Obtenção e sequenciação dos mutantes no motivo de ligação aos NTP da proteína Cl. A proteína Cl de TYLCV contém o motivo GX4GKT de ligação aos NTP (resíduos 221 a 228) .

Introduziram-se três mutações no clone infeccioso pTYLCV para substituir a Lys227 (K) por três aminoácidos diferentes: Ala (A) , His (H) e Arg (R) (figura 3) . Os oligonucleótidos mutagénicos foram concebidos de modo a introduzir na vizinhança da mutação investigada um local de restrição único para a enzima Pmll (mutação silenciosa) a fim de facilitar a selecção dos clones que apresentam a mutação. A fim de confirmar a presença da mutação pretendida e de assegurar que não se produziu qualquer outra mutação nessa região, sequenciaram-se vários clones independentes para cada uma das mutações (Ala, His e Arg). b) Dois dos mutantes obtidos são deficientes relativamente à replicação.

A replicação dos mutantes foi estudada por transfecção de protoplastos obtidos a partir da suspensão celular de tabaco BY2. Excisam-se os diferentes genomas víricos selvagem (pTYLCV) ou mutados (pTYAla, pTYHis, pTYArg) do respectivo plasmídeo vector com a enzima Sst I e são seguidamente transfectados sob a forma de cadeia dupla linear. Após 3 e 5 dias de cultura, verifica-se se ocorre aparecimento de formas replicativas do vírus por extracção dos ácidos nucleicos totais, electroforese, transferência para membrana e hibridação com uma sonda correspondente ao ADN vírico. Apresentam-se na figura 4 os resultados para o clone vírico infeccioso e para os mutantes pTYAla e pTYArg. O autorradiograma resultante da análise "Southern" foi quantificado na analisador de imagens (Bio-Image, Millipore). 21 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ

Os valores apresentados no gráfico correspondem à razão entre a densidade óptica (DO) das bandas correspondentes às formas replicativas e a soma das DO das bandas correspondentes às formas víricas transfectadas e às formas replicativas. Seguidamente, estudamos a percentagem das formas replicativas relativamente às formas víricas totais. A figura 4 representa a percentagem de formas replicativas após três (a preto) e cinco (a branco) dias de cultura das células transfectadas. pTYLCV: genoma vírico selvagem; pTYAla, pTYArg: genomas víricos mutados correspondentes à alteração de K para A e R, respectivamente.

Verifica-se que o mutante pTYAla apresenta uma taxa de formas replicativas bastante menor do que a do vírus selvagem (em cerca de um factor de 12) . Relativamente ao mutante pTYArg, este apresenta um redução de um factor 3 relativamente ao selvagem. Verificou-se um efeito semelhante numa outra experiência. Não se efectuaram estas experiências com o mutante pTYHis. A replicação dos mutantes pTYAla e pTYArg é alterada, o que indica que o local potencial de ligação em NTP desempenha um papel importante no funcionamento da proteína Cl. c) Pesquisa de um efeito dominante em trans das proteínas Cl mutadas sobre a replicação através de desvio da expressão do gene repórter NPT II: 0 efeito dominante em trans sobre a replicação do ADN vírico pode ser verificado de duas formas, quer pela acumulação do ADN vírico neo-sintetizado, quer por acumulação de uma "proteína-repórter" codificada por um vírus recombinante. 0 gene repórter aqui utilizado é o gene que codifica a neomicina fosfotransferase II (NPTII), introduzido no local das fases de leitura VI e V2 de TYLCV. Um tal genoma vírico modificado (pTYneo) tem as mesmas capacidade de replicação dum genoma não modificado nas células isoladas. 0 ensaio de actividade de NPT II é quantitativo: o produto fosforilado da reacção, e consequentemente a intensidade da mancha em autorradiografia no caso de utilização de D-32P ATP, é proporcional à quantidade de enzima presente (Reiss et ai, 22 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ 1984). Supondo que a intensidade da actividade de NPT II aumenta com o número de genomas viricos replicados, estudamos a actividade de NPT II na presença das diferentes construções. A fim de investigar um efeito dominante em trans, co-transfectamos protoplastos de tabaco por um lado com os genomas viricos selvagens e mutantes (pTYLCV, pTYAla, pTYHis, pTYArg) e por outro lado com os genomas viricos selvagens e as cassetes de expressão dos ORF Cl mutados (pClAla, pClHis, pClArg). Verificamos uma diminuição global da expressão do gene NPT II na presença do virus mutante pTYArg (num factor de 37 aos 3 dias) . De igual modo, a expressão da proteína Cl mutada (pCl Arg) em nível elevado inibe a replicação por um factor de 2,5 (figura 5).

Contudo, podemos verificar que, em todos os casos, os valores da expressão de NPT II diminuem entre os 3 e 5 dias. Se a construção que continha o NPTII fosse replicativa, não se deveria verificar uma tal diminuição da expressão. Esta cinética sugere que o promotor de VI e V2 é regulado em função do ciclo vírico. Este método de detecção da replicação vírica é portanto demasiado indirecto e desadequado e não será seguida para o estudo dos mutantes pTYHis e pTYAla. d) Os genomas viricos mutados no local de ligação aos NTP inibem a replicação do genoma selvagem.

Desta vez, a replicação vírica é estudada por quantificação das formas víricas replicativas acumuladas nas células co-transfectadas com os genomas viricos selvagens (pTYLCV) e mutados (pTYAla, pTYHis, pTYArg). A metodologia utilizada é a mesma utilizada no estudo da replicação dos mutantes. A presença dos vírus mutantes influencia a replicação do vírus selvagem (figura 6):

Com efeito, os mutantes pTYAla e pTYArg diminuem a replicação vírica por um factor de 30 e 5,5, respectivamente. Para o mutante pTYHis, o efeito não é muito importante (factor de 1,4). Estes resultados foram obtidos numa única experiência, excepto para o mutante pTYArg em que a experiência foi repetida tendo-se obtido resultados concordantes. 23 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ

Podemos verificar, com os mutantes pTYAla e pTYArg, que aos 5 dias, a diferença da taxa das formas replicativas entre o virus selvagem e os mutantes é menos pronunciada do que aos 3 dias. Tal pode ser explicado por uma acumulação progressiva de moléculas que escapam à inibição, que não seria portanto completa neste sistema.

Assim, os mutantes pTYAla e pTYArg parecem inibir a replicação do virus selvagem. No entanto, é difícil atribuir de forma rigorosa este efeito inibidor às proteínas Cl mutadas. De facto, deve ocorrer um fenómeno de diluição das proteínas Cl funcionais e interferir com a eficácia de replicação. A proteína Cl produzida pelo genoma selvagem vai de facto assegurar a replicação do seu próprio genoma, mas também a dos genomas mutantes e portanto vai se repartir no dobro das moléculas matrizes do que no controlo aqui utilizado (pUC 118) em que o genoma vírico selvagem é co-transfectado com um plasmídeo ao qual Cl não se liga. Será interessante efectuar um controlo suplementar, no qual um vírus selvagem é co-transfectado com um vírus mutado que não produz qualquer proteína Cl (por deleção do ORF Cl ou por introdução dum codão STOP). Caso a replicação vírica seja igualmente diminuída, trata-se portanto de um fenómeno de titulação de proteínas Cl e não dum efeito negativo dominante. e) As proteínas Cl mutadas sobre-expressas têm um efeito negativo dominante: são capazes de inibir em trans a replicação do genoma vírico selvagem.

De modo a verificar se as proteínas Cl mutadas no local de ligação aos NTP expressas em nível elevado podem inibir a replicação do genoma vírico selvagem, os ORF correspondentes foram colocados sob controlo de um promotor forte (pClAla, pClHis, pClArg). As construções assim obtidas foram ensaiadas relativamente ao seu efeito sobre a replicação por co-transfecção de protoplastos com um genoma vírico selvagem.

Os plasmídeos pClAla e pClHis exercem uma forte inibição da replicação do vírus selvagem (diminuição por um factor de 38,5 e 14,5, respectivamente relativamente ao controlo utilizado). Outras experiências demonstraram uma variação no 24 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ mesmo sentido, apresentando desta vez pClHis um efeito mais forte do que pClAla. Relativamente ao plasmideo pClArg, o seu efeito não é significativo dado que o factor de diminuição é apenas de 1,4. Tal aponta para a hipótese de diluição das moléculas no caso da co-transfecção dos genomas viricos completos. De facto, com esta mesma mutação, pudemos verificar um efeito de diminuição da replicação vírica que curiosamente não verificamos no caso de uma sobre-expressão.

Efectuou-se uma co-transfecção controlada com pTYneo e uma cassete de expressão da proteína GUS (□-glucuronidase), sendo o promotor então utilizado o promotor 35S de CaMV. Esta transfecção foi efectuada com o objectivo de avaliar as consequências da sobre-expressão duma proteína qualquer. Nas duas experiências efectuadas, os resultados foram antagónicos dado que num caso o efeito parece nulo enquanto que no outro caso provocou uma diminuição das formas replicativas por um factor de 4 (figura 5 e figura 7).

Conclusão A alteração do local potencial de ligação aos NTP da proteína Cl de TYLCV resulta na obtenção de genomas viricos deficientes para a sua replicação. Tal demonstra a importância deste local para o funcionamento da proteína Cl e sugere fortemente que a proteína Cl é sem dúvida capaz de se ligar a um NTP. Além disso, os genomas viricos mutados (pTYAla e pTYArg) podem travar a replicação do seu homólogo selvagem. Pôde ser evidenciado um efeito semelhante com um vector de expressão das proteínas Cl mutadas, para as mutações Ala e His .

Parece assim que o fenótipo negativo das proteínas Cl mutadas seja efectivamente dominante sobre o seu homólogo selvagem e leve assim a uma inibição da replicação vírica. De facto, a inibição da replicação observada no caso da co-transfecção dos genomas viricos completos não pode ser explicada unicamente por um efeito de diluição das proteínas Cl selvagens, dado que o mutante pTYHis não induz uma variação muito importante. No entanto, fica por definir o efeito da sobre-expressão duma proteína exógena (GUS). 25 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ Vários mecanismos podem explicar um efeito negativo dominante das proteínas Cl mutadas. É possível que a proteína Cl seja multimérica e que todas as subunidades mutadas se associem ao seu homólogo selvagem, tornando os multímeros heterólogos não funcionais. Uma outra possibilidade é que as proteínas Cl mutadas entrem em competição com as proteínas selvagens para um substrato limitativo. Este substrato pode ser uma proteína celular ou o próprio ADN vírico. 0 complexo hipotético assim formado seria transitório e produtivo quando contém a proteína Cl selvagem, mas seria incapaz de evoluir se não ocorre ligação aos NTP ou hidrólise destes. A obtenção de fenótipos negativos dominantes no caso da co-transfecção de genomas víricos é um facto surpreendente. De facto, é difícil conceber um efeito de inibição tão radical com as proteínas Cl não mutadas e mutadas expressas a um mesmo nível. Pode ocorrer sobre-expressão espontânea das proteínas Cl mutadas, que pode ocorrer caso a proteína Cl regule a sua própria expressão. De facto, é possível que a proteína Cl interactue normalmente com um cofactor celular para efectuar um retro-controlo negativo sobre a sua produção; por outro lado pudemos verificar que as transcrições de Cl se encontram presentes em baixas quantidades relativamente às transcrições codificadas pela cadeia vírica. As proteínas Cl mutadas possivelmente perderam a sua capacidade de interactuar com um cofactor para formar um complexo de regulação negativa. Resultaria então uma sobre-expressão das proteínas mutadas que se amplificam pouco a pouco e adquirem então a capacidade de inibir as proteínas selvagens, como é o caso para as proteínas Rep do vírus adenoassociado («Adeno Associated Virus», AAV) (Chejanovsky e Cárter, 1990).

II) EVIDÊNCIA DE UMA ACTIVIDADE ATPase IN VITRO NA PROTEÍNA Cl DE UM GEMINIVÍ RUS, TYLCV. ESTUDO DAS MUTAÇÕES NO LOCAL DE LIGAÇÃO AOS NTP

A) MATERIAIS E MÉTODOS

Foram utilizados vários métodos clássicos de biologia molecular seguindo os protocolos indicados em Sambrook et al. (1989), Ausubel et al. (1989) ou pelos fornecedores; eles não serão aqui descritos detalhadamente. 26 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ 1. Estudo bioquímico da actividade ATPase in vitro da proteína Cl selvagem ou mutada 1.1 Obtenção da proteína Cl selvagem ou mutada

Obteve-se uma proteína de fusão GST-C1 "selvagem". Coloca-se a construção expressa em E. coli no plasmídeo pGEX3 (Amrad), sob controlo de um promotor lac indutível por IPTG (consultar a figura 8).

Para obter a mesma construção com as diferentes mutações estudadas, substitui-se o fragmento de 500 pb SalI-SstI do plasmídeo pGEX-Cl pelo fragmento correspondente dos plasmídeos pTY-Ala, Arg, His e Pml (figura 8). A obtenção destes plasmídeos está descrita no parágrafo 2 infra. O vector pGEX-Cl, bem como as diferentes inserções, são purificados após digestão com as enzimas Sall e SstI em gel de agarose a 1% com baixo ponto de fusão. A ligação faz-se utilizando ligase de T4 (Ligase: 400 unidades; vector: 50 ng; inserção: 150 ng) durante a noite a 16°C. Transforma-se a estirpe de E. coli DH5D com as construções obtidas e seguidamente extrai-se o ADN bacteriano através de lise alcalina. Digerem-se as construções com a enzima Pmll, de modo a pôr em evidência a existência do local correspondente nos mutantes.

Após cultura das bactérias na presença do indutor (IPTG 0,2 mM) , extraem-se as proteínas por tratamento com ultra-sons ("sonicação") (VibraCell 3x30", ajuste a 4,5). Retêm-se as proteínas que contêm uma parte de GST funcional em pérolas de agarose-glutationa, lavam-se com tampão MTPBS# (#: consultar anexo) para eliminar as proteínas bacterianas contaminantes e seguidamente eluem-se com uma solução de glutationa 5 mM, Tris 15 mM, pH 8. A presença da proteína GST-C1 selvagem ou mutada é controlada antes e após purificação por deposição de uma alíquota em gel desnaturante de Laemmli a 10%# e coloração com azul de Coomassie*. 27 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ 1.2 Estudo da actividade ATPase in vitro da proteína Cl selvagem ou mutada (segundo Traut, 1990)

Misturam-se vinte ml de tampão ATPase (x2) (composição: consultar infra) com 20 ml de fracção proteica purificada (cerca de 50 ng) . Coloca-se a mistura em incubação a 25°C. Para-se a reacção após o tempo pretendido por adição de 200 ml de carvão activado (carvão activado a 7,5% em HC1 50 mM, H3PO4 5 mM) . O carvão activado liga o ATP, mas não o fosfato inorgânico libertado por uma eventual actividade ATPase.

Seguidamente elimina-se o carvão por centrifugação (5' a 13 000 rpm em tubo Eppendorf) . Mede-se a radioactividade do sobrenadante num contador de cintilações (Beckman LS 7500) após adição de 4 ml de liquido de cintilação.

Tampão ATPase x2: Pipes/NaOH 50 mM, pH 7,0; NaCl 200 mM;

MgCl2 10 mM; NP40 a 0,02%; ATP 10 mM.

Adiciona-se antes de utilização 0,37 MBq (10 mCi) de γ-32ρ-ATP a 400 μΐ desta solução 2 Mutagénese dirigida 2.1 Selecção dos mutantes A obtenção dos plasmídeos pTYAla, pTYHis e pTYArg encontra-se descrita no parágrafo I)A)a) supra. Foram obtidos dois outros mutantes: - um mutante "sem sentido" no qual se introduz um codão Ochre (TAA) 30 nucleótidos a jusante do codão de iniciação do ORF Cl. Este mutante permite estudar o efeito do ARN de Cl sozinho, sem produção da proteína correspondente. Denomina-se mutante Stop. - um mutante Pml, no qual só é introduzido o local Pmll, criado nos mutantes Ala, Arg e His para facilitar a sua selecção. Esta construção permite confirmar a ausência de efeito desta mutação silenciosa na proteína Cl. 28 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ 2.2 Obtenção dos mutantes Pml e Stop 0 princípio do método utilizado foi descrito por Kunkel em 1985: a mutação pretendida é obtida por hibridação de um oligonucleótido mutagénico com o ADN vírico de cadeia simples seguido de síntese in vitro da cadeia complementar. 0 ADN não mutado é seguidamente contra-seleccionado (como descrito supra).

Utilizaram-se dois oligonucleótidos mutagénicos: Oligonucléotido "Stop": 5'GTATCAAGGCT(AGATCT)TAATTCCTTACATATCCC 3'

Oligonucléotido "Pml": 5' CCGGACAGGAAAGAC(CACGTG)GGCC 3' 0 novo local de restrição criado pela mutagénese (BglII para o mutante "Stop", Pmll para o mutante "Pml") encontra-se indicado entre parênteses. 0 codão sem sentido Ochre (TAA) introduzido encontra-se sublinhado. 2.3 Sequenciação dos mutantes obtidos A sequenciação dos mutantes foi efectuada através do kit Pharmacia (Sequenase) que utiliza o método de terminação de cadeia de Sanger et al (1977).

As reacções obtidas são depositadas num gel de acrilamida a 6% desnaturante com espessura constante de 0,4 mm. A migração efectua-se em tampão TBE (Sambrook et al., 1989) a 60 W. 0 ADN marcado com a33P-dCTP ou cc35S-dCTP é revelado por autorradiografia. 3. Estudo da replicação do ADN vírico nos protoplastos de tabaco (Como descrito supra) 3.1 Obtenção dos protoplastos (Como descrito supra) 29 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ 3.2 Transfecção dos protoplastos e hibridação «Southern» (Como descrito supra) 4 Obtenção de plantas transgénicas apresentando um gene que codifica a proteina Cl selvagem ou mutada 4.1 Construções introduzidas

Clona-se o ORF Cl completo, selvagem ou mutado, no vector binário pGA492 (An et al., 1987), a jusante do promotor 35S do virus do mosaico da couve-flor, o que permite uma expressão constitutiva do ORF Cl nas plantas transformadas. A construção utilizada apresenta-se detalhadamente na figura 9.

Transfere-se a construção 35S-C1, bem como o gene NPTII que confere resistência a canamicina, situadas entre as extremidades do T-DNA de Agrobacterium tumefaciens, para o genoma das células vegetais onde eles se integram de forma não controlada (local e número de cópias). 4.2 Transformação de discos foliares de Nicotiana benthamiana e obtenção de plantas transgénicas A figura 10 indica o protocolo seguido para a transformação de N. benthamiana por A. tumefaciens e a regeneração de plantas transgénicas. As plântulas podem ser aclimatadas em estufa durante cerca de dois meses após a transformação dos discos foliares. 4.3 Controlo da expressão do ORF Cl nas plantas obtidas

As plantas obtidas foram mantidas, durante todo o seu período de cultura in vitro, num meio selectivo (canamicina a 70 mg/1), o que permite em princípio conservar somente as que integraram a construção em estudo.

No entanto, devem efectuar-se determinados controlos para nos assegurarmos. 30 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ

Efectuou-se um "ensaio ΝΡΤΙΙ'" como descrito supra a partir do extracto das plantas regeneradas aclimatadas em estufa.

B) RESULTADOS 1. Actividade ATPase in vitro da proteína Cl selvagem ou mutada. 1.1 Actividade ATPase da proteína Cl selvagem A proteína Cl utilizada é uma proteína de fusão GST-C1. O método utilizado para medir a actividade ATPase da proteína Cl permite evidenciar a libertação de fosfato inorgânico a partir de ATP. No caso da proteína GST-C1 selvagem, várias experiências demonstraram a existência de tal actividade: de 20 a 40% da radioactividade total introduzida encontra-se libertada para o sobrenadante no final da reacção descrita supra, o que indica a hidrólise duma percentagem próxima do ATP introduzido. Nas experiências de controlo com GST sozinho ou apenas com o tampão de enzima, somente 2 a 4% da radioactividade introduzida se encontra no sobrenadante em experiências efectuadas em paralelo, nas mesmas condições.

Estes resultados parecem indicar uma actividade ATPase da própria proteína Cl. A técnica utilizada não permite determinar se a actividade da proteína Cl leva à obtenção de ADP ou de AMP. A percentagem limite de ATP hidrolisado pode estar relacionada quer com uma concentração de produto libertado que inibe o funcionamento da enzima, quer com a degradação desta após 15 a 30 min de reacção. Para determinar a causa deste limite, devem efectuar-se experiências de variação da concentração da enzima ou de ATP. Também falta determinar se a proteína Cl é capaz de hidrolisar outros nucleótidos, nomeadamente GTP.

Se a actividade ATPase detectada for efectivamente de Cl e não de um contaminante de origem bacteriana, a proteína Cl deve ligar ATP. O local de ligação aos NTP parece portanto funcional, o que permite supor que as mutações neste local podem ser a causa de fenótipos negativos dominantes, como é o 31 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ caso de outros modelos (Chejanovsky e Cárter, 1990; Han e Sternberg 1991).

As proteínas mutadas Ala, Arg, His e Pml foram então construídas, expressas em E. coli e purificadas. 1.2 Obtenção e actividade ATPase das proteínas Cl mutadas * Obtenção das proteínas Cl contendo as mutações Ala, Arg, His e Pml

As proteínas contendo as mutações Ala, Arg, His e Pml foram obtidas utilizando o protocolo descrito anteriormente.

As proteínas GST ou GST-C1 obtidas são extraídas das bactérias e purificadas em pérolas de agarose-glutationa. Contrariamente ao caso da GST sozinha, a quantidade das proteínas GST-C1 obtida após purificação é pequena e os contaminantes ainda numerosos. No entanto, o grau de pureza e a concentração proteica parecem comparáveis para as proteínas Cl selvagem e mutada. As proteínas mutadas não parecem ser afectadas pela sua estabilidade relativamente à proteína Cl selvagem. * Actividade ATPase das proteínas Cl mutadas sozinhas A actividade ATPase das proteínas mutadas é medida segundo o protocolo utilizado para a proteína Cl selvagem. A actividade ATPase dos mutantes Ala e His é comparável à de GST sozinha, ou seja da ordem do "ruído de fundo". O mutante Arg apresenta uma actividade que atinge quase metade da actividade da proteína Cl selvagem. O mutante Pml, que é semelhante à proteína selvagem dado que a mutação introduzida é silenciosa, apresenta efectivamente uma actividade ATPase comparável à da proteína selvagem. A redução da actividade ATPase no caso do mutante Arg e a sua perda total no caso dos mutantes Ala e His demonstram a importância de uma mutação pontual no suposto local de ligação aos NTP da proteína Cl de TYLCV. Este local parece portanto 32 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ ser funcional na proteína Cl e a lisina desempenha um papel chave no seu funcionamento. A purificação limitada da proteína Cl permite prever a possibilidade de uma actividade ATPase relacionada com a presença de contaminantes bacterianos. No entanto, parece pouco provável que os contaminantes eventuais sejam eliminados de forma específica no caso das proteínas mutadas.

Para eliminar totalmente a hipótese de uma actividade relacionada com contaminantes bacterianos, o método concebido é a marcação de ATPase com j^5S-ATP, capaz de se ligar às enzimas mas não de ser hidrolisado. Após migração em gel e autorradiografia, deve aparecer uma marcação para uma proteína do tamanho da fusão GST-C1 (65 kDa) e, após clivagem da proteína de fusão por uma enteroquinase, para uma proteína com o peso molecular aparente da proteína Cl (42 kDa).

Este método deveria também permitir determinar se os mutantes que perderam a sua actividade ATPase são ainda capazes de ligarem ATP, como é o caso para a proteína RAD3 de levedura (Sung et ai., 1988). * Actividade ATPase das proteínas Cl selvagem e mutadas

Estudou-se a actividade ATPase de uma mistura de proteínas Cl selvagem e mutadas. A mistura Cl selvagem e GST é considerada um controlo, dado que não é esperado qualquer efeito negativo dominante da GST.

As proteínas mutadas parecem não ter qualquer efeito sobre o funcionamento da proteína selvagem, sendo a actividade total obtida quase igual à soma das actividades de cada um dos componentes da mistura.

Os resultados obtidos com as proteínas Cl selvagem e mutadas parecem indicar uma actividade ATPase da proteína Cl selvagem, relativamente à ligação do ATP no local definido por Walker (1982). 33 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ A hidrólise do ΑΤΡ fornece provavelmente a energia necessária a uma outra actividade de Cl, que permanece por determinar. A actividade ATPase não parece ligada à clivagem de ADN em cadeia simples dado que esta não necessita da quota-parte de ATP. Além disso, as proteínas que perderam a sua capacidade de clivagem devido a uma mutação localizada num domínio que se supõe ser independente do local de ligação aos NTP mantêm a sua actividade ATPase.

III) RESISTÊNCIA DERIVADA DO PATOGÉNIO: UMA PROTEÍNA NEGATIVA DOMINANTE PROTEGE AS PLANTAS DE NICOTIANA BENTHAMIANA CONTRA O VÍRUS STYLC

A) MATERIAIS E MÉTODOS 1. ESTUDO DA REPLICAÇÃO DO ADN VÍRICO NOS PROTOPLASTOS la. Transfecção de protoplastos de tomate

Cultiva-se uma suspensão celular do híbrido inter-específico Lycopersicon esculentum x L. pennellii, durante quatro dias em meio MSI* (*: consultar o anexo infra) a 25°C e com agitação a 100 RPM. Recolhem-se as células por centrifugação (200 g, 5 min.) e lavam-se duas vezes com meio CPW*. Digerem-se seguidamente as paredes celulares com três volumes de solução enzimática* durante 3 horas com agitação, a 25°C e às escuras.

Seguidamente, os protoplastos assim obtidos são filtrados duas vezes em filtros de 300 μιη e seguidamente 140 μιη, recolhem-se por centrifugação (90 g, 5 min.) e lavam-se duas vezes com meio TM2*. Contam-se os protoplastos em câmara de Fuchs-Rosenthal e retomam-se a uma concentração de 106 protoplastos/ml.

Adicionam-se a 5xl05 protoplastos, 50 μρ de ADN de timo de vitelo, 10 μρ de ADN vírico em cadeia dupla linearizado por SstI e 0,5 ml de solução de PEG 1500 (a 40% em meio F*) . Seguidamente, dilui-se a suspensão de protoplastos em intervalos de 10 min com meio F* (volume final de 10 ml) . 34 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ

Recolhem-se os protoplastos (90 g, 5 min.) e cultivam-se a uma concentração de 105/ml em meio TM2* em luminosidade difusa e a 25°C. Recolhem-se as células sete dias mais tarde para extracção do ADN total. lb. Extracção do ADN total de protoplastos transfectados (Como descrito supra) lc. Análise do ADN por hibridação «Southern» (Como descrito supra)

2. PESQUISA DE PLANTAS TRANSGÉNICAS RESISTENTES AO STYLCV 2a. Agro-inoculação de plantas transgénicas (regenerantes primários)

As plantas transgénicas de N. benthamiana (Ala, His, Arg e Stop) foram obtidas por transformação com os diferentes genes Cl mutados (Ala, His, Arg e Stop) (Desbiez, DEA 1993) . A descendência obtida após auto-fecundação (Fl) dos primeiros regenerantes (R) foi semeada sem selecção e as plantas obtidas (Fl) foram ensaiadas para a sua sensibilidade ou resistência a STYLCV selvagem; consultar figura 11.

Como o STYLCV não pode ser transmitido mecanicamente, utilizou-se a técnica de agro-inoculação ou agro-infecção (Grimsley et al., 1986) para infectar as plantas Fl transgénicas de N. benthamiana. Esta técnica permite a introdução do genoma vírico nas plantas devido ao T-DNA de Agrobacterium tumefaciens.

Clonou-se o STYLCV selvagem sob a forma de 1,8-mero no vector binário pBinl9, tornando-se assim o plasmídeo pBINl9/TYLCV-S 1,8-mero (Kheyr-Pour et al., 1991).

Seleccionaram-se as bactérias transformadas em meio YEB* sólido suplementado com canamicina (100 μρ/ιηΐ) , rifampicina (150 μρ/ιηΐ) e neomicina (20 μρ/ιηΐ) . Cultivaram-se os A. tumefaciens LBA4404/pBinl9/TYLCV-S 1,8 mero em 20 ml de YEB* liquido (suplementado com antibióticos tal como indicado supra), a 28°C com agitação (200 RPM) e às escuras. Após 48 h de incubação, lavaram-se as bactérias duas vezes com água estéril e ressuspenderam-se em 10 ml de água estéril. 35 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ

Para a agro-inoculação, utilizam-se plantas com cerca três a quatro semanas de idade. Injecta-se a suspensão de A. tumefaciens LBA4404/pBinl9/TYLCV-S 1,8-mero com o auxilio de uma seringa de 1 ml ao nível dos pecíolos de três folhas jovens. Colocam-se as plantas nos seus locais a 24°C, 16 h de fotoperíodo e 70% de higrometria (com desinfecção das águas de drenagem, para evitar a contaminação do ambiente).

Para cada experiência agro-inoculam-se 25 plantas. Inoculam-se duas plantas transgénicas e 2 plantas de N. benthamiana normais com água estéril (controlo negativo). Adicionalmente, inoculam-se duas plantas de N. benthamiana normais nas mesmas condições com a estirpe de A. tumefaciens descrito supra (controlo positivo). Seguem-se as plantas regularmente para observar o aparecimento de sintomas. Um mês após agro-inoculação, aparecem os primeiros sintomas característicos (enrolamento e amarelecimento das folhas) nas plantas de controlo não transgénicas. 2b. Detecção das diferentes formas de ADN virico A presença de ADN virico em cadeia simples nas plantas agro-inoculadas é detectada pelo método de «squash» foliar (Navot et al., 1989): comprime-se uma folha jovem numa membrana de nylon e fixa-se o ADN com UV. Sem desnaturação prévia, hibrida-se a membrana com uma sonda correspondente ao ADN total de STYLCV marcado com [(X-32P ] dCTP.

Para confirmar a presença das outras formas de ADN virico, efectuou-se uma hibridação «Southern». Extrai-se o ADN total segundo o método de Matzeit et al. (1991), seguido de uma série de extracções fenólicas e finalmente precipita-se o ADN com etanol. Depositam-se cinco μρ de ADN num gel de agarose a 1% (TAExl*) a 2V/cm e analisa-se por hibridação «Southern» (consultar supra § l.c). 2c. Agro-inoculação de discos foliares

Mantém-se uma cultura de A. tumefaciens LBA4404/pBinl9/TYLCV-S 1,8-mero durante 48 h (consultar supra agro-inoculação de plantas transgénicas). Lavam-se as 36 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ agrobactérias e ressuspendem-se em meio MS 30*. Para cada planta, descontaminam-se duas folhas novas com dicloroisocianuranato de sódio (Bayrochlor, 1 comprimido por litro) durante 15 min. Cortam-se discos foliares e imergem-se durante 1 min na suspensão de agrobactérias. Secam-se então os discos em papel estéril e seguidamente depositam-se em meio A*. Após 48 h, transferem-se os discos para meio B*. Extrai-se o ADN total sete dias após agro-inoculação (consultar infra).

2d. Extracção do ADN total de plantas transgénlcas ou de discos foliares agro-inoculados com STYLCV

Quebra-se um grama de folhas novas (ou de discos foliares) em azoto liguido e suspende-se em 5 ml de solução TNES*. Efectuam-se duas extracções fenólicas para eliminar os resíduos celulares e as proteínas. Precipitam-se os ácidos nucleicos (ADN e ARN) na presença de acetato de sódio 0,3 M (pH 5,2) e de etanol a 70% (% final), secam-se e retomam-se em 200 μΐ de TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM) estéril. Eliminam-se os ARN por tratamento com ARNase A (concentração final 200 μρ/ιηΐ) durante lha 37°C. Mede-se a densidade óptica a 260 nm. Depositam-se cinco μρ de ADN num gel de agarose a 1% em TAExl (migração 2V/cm, 15 h) e analisam-se por hibridação «Southern». 3. DETERMINAÇÃO DO NÚMERO DE INSERÇÕES NAS PLANTAS F1 ALAI 3a. Segregação in vitro em canamicina

Para determinar a concentração necessária de canamicina para parar o crescimento das plantas, efectua-se uma gama de concentrações em N. benthamiana não transformada (70, 100, 150, 200 e 300 μg/ml) . Semeiam-se os grãos F1 em meio MS30* contendo canamicina a 150 μg/ml e observam-se regularmente para descoloração das folhas. 3b. Hibridação «Southern»

Digerem-se cinco μg de ADN genómico extraído de folhas de plantas transgénicas F1 Alai antes de agro-inoculação com HindiII (a selecção desta enzima baseia-se no facto de ela cortar uma só vez ao nível da inserção 35S-C1). Separam-se os 37 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ fragmentos de ADN digeridos em gel de agarose a 1% em TAExl* (5 V/cm durante 5 h) e seguidamente transferem-se para membrana de nylon Hybond-N (Amersham) durante 6 h por capilaridade com SSCx20*. Seguidamente hibrida-se a membrana com uma sonda de ADN Cl PflMI-BglII (obtida por corte com PflMI e Bglll do ADN virico clonado para pUC118 ao nivel do local SstI e separação em gel de agarose de baixo ponto de fusão) marcado por escorvamento aleatório com [cc-32P]dCTP e tratado de forma idêntica à descrita supra (consultar análise de ADN por «Southern» § l.c). 4. ANÁLISE DAS PROTEÍNAS POR HIBRIDAÇÃO «WESTERN» 4a. Extracção das proteínas totais de plantas

Quebram-se quinhentos mg de folhas jovens em azoto líquido e precipitam-se as proteínas totais com ácido tricloroacético a 10% (4 ml/g). Lava-se o depósito uma vez com acetona a 100% e seguidamente três vezes com acetona a 90%, antes de secar toda a noite num Speed-Vac (Savant). Retoma-se o depósito em 400 μΐ de tampão Tris-Glicina (Tris 25 mM, glicina 250 mM) . Determina-se a concentração em proteínas totais a 280 nm. A 20 μΐ de sobrenadante (contendo 50..μg de proteínas totais) adicionam-se 4 μΐ de tampao 6xSDS* e leva-se o conjunto a 100 °C durante 4 min e carrega-se imediatamente em gel de poliacrilamida (12,5%) na presença de SDS a 0,1%. Continua-se a migração durante 1 h a 20 V/cm. Seguidamente, transfere-se o gel para uma membrana de nylon Hybond-C extra (Amersham), na presença de tampão Tris-Glicina, durante 16 h a 2 V/cm. 4b. Pré-adsorção do anticorpo anti-Cl com extracto proteico de N. benthamiana não transgénica

Preparou-se o anticorpo policlonal anti-Cl no laboratório por purificação em gel de poliacrilamida da banda correspondente à proteína de fusão GST-C1 (produzida em E. coli) e inoculação num coelho. Incubam-se dez μΐ de anticorpo policlonal anti-Cl com 50 μΐ de extracto proteico total de N. benthamiana não transgénica durante toda a noite à temperatura ambiente. Seguidamente, centrifuga-se a solução a 17000 g durante 5 min, à temperatura ambiente e recupera-se o sobrenadante. 38 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ 4c. Incubação da membrana com anticorpo anti-Cl pré-adsorvido

Incuba-se a membrana durante uma hora com uma solução de PBS*, Tween20 a 0,1 %, leite magro Gloria a 5% (para saturar os locais de fixação não específicos da membrana ao anticorpo). Adicionam-se os anticorpos anti-Cl previamente pré-adsorvidos à membrana durante 2 h à temperatura ambiente (diluição 1/10000). Seguidamente efectuam-se três lavagens com PBS, Tween20 a 0,1%. Incuba-se então a membrana em soro de cabra anti-IgG-coelho conjugado com fosfatase alcalina (Sigma) (diluição 1/9500) durante 2 h à temperatura ambiente. Seguidamente, lava-se a membrana com PBS, Tween20 a 0,1%. A revelação do complexo antigénio-anticorpo é efectuada em 15 ml de tampão substrato* na presença de 100 μΐ de Nitro Blue Tetrazolium (NBT: solução mãe a 50 mg/ml, Sigma) e de 50 μΐ de 5-bromo-4-cloro-3-indoilfosfato (BCIP: solução mãe a 50 mg/ml, Sigma). Aparece um precipitado de cor escura e para-se a reacção em água bidestilada, tudo à temperatura ambiente e à luz .

B) RESULTADOS

a) REPLICAÇÃO DE GENOMAS VÍRICOS SELVAGEM E MUTANTES EM PROTOPLASTOS DE TOMATE A fim de analisar um eventual efeito negativo dominante in vivo da proteína Cl mutada ao nível da ansa P sobre a replicação do ADN vírico selvagem, co-transfectam-se os genomas víricos (selvagem e mutados) para protoplastos de tomate. O interesse de tal sistema é o de permitir estudar a replicação do ADN vírico independentemente de fenómenos de movimento sistémico do vírus. O plasmídeo pTY apresenta o genoma em cadeia dupla vírico selvagem completo de STYLCV clonado no local SstI do vector pUC118. Os plasmídeos pTYAla, pTYHis e pTYArg são idênticos a pTY, excepto que apresentam uma mutação pontual de substituição da Lys227 por alanina, histidina e arginina, respectivamente. O plasmídeo pTYStop contém uma mutação "sem sentido" 30 nt a jusante do codão de iniciação de tradução da ORF Cl. Devido às ligases celulares, os monómeros de genomas 39 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ víricos introduzidos linearizados por SstI são recircularizados e servem assim como formas replicativas intermediárias no ciclo virico.

Quando os protoplastos de tomate são transfectados com o ADN virico selvagem sozinho, as diferentes formas do ADN virico em cadeia simples (ss) e em cadeia dupla super-enrolada (ds) acumulam-se e são detectadas. Este facto revela uma replicação de novo do genoma virico selvagem nos protoplastos (consultar figura 12) . 0 mutante pTYStop, tal como esperado, não se replica (dado não ocorrer tradução do ARN) . 0 mutante pTYArg replica-se mas menos bem que o selvagem. Pelo contrário, os mutantes pTYAla e pTYHis (que são deficientes relativamente à sua actividade ATPase in vitro) não se replicam (ou replicam-se a um nível não detectável) (figura 11). Estes resultados sugerem que a ansa P (e provavelmente a actividade ATPase) é necessária à replicação do ADN virico e confirmam os resultados apresentados na figura 4 supra mencionada.

Quando o ADN virico selvagem é co-transfectado com os ADN víricos mutados, obtêm-se resultados interessantes. Na presença de pTYArg ou pTYHis, a replicação do ADN virico selvagem não é aparentemente alterada (presença das formas ss e ds) . Pelo contrário, pTYAla afecta consideravelmente a replicação do ADN virico selvagem dado que a forma ss se encontra ausente (ou não é detectável) e a forma ds encontra-se presente em menor quantidade (figura 12). Esta forma ds é provavelmente gerada pela circularização do ADN virico linear introduzido graças às ligases celulares. Estes resultados mostram claramente um efeito negativo dominante do genoma virico mutado pTYAla sobre a replicação do ADN virico selvagem, o que confirma os resultados apresentados na figura 6 supra mencionada.

b) AGRO-INOCULAÇÃO DE PLANTAS Fl PELO STYLCV SELVAGEM A fim de verificar se as plantas transformadas pelos diferentes genes Cl mutados são resistentes ao STYLCV selvagem, efectuam-se experiências de agro-inoculação (Grimsley et al., 1986). Transformaram-se plantas de N. benthamiana com os diferentes genes Cl mutados (Cl-Ala, 40 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ

Cl-His, Cl-Arg e Cl-Stop) colocados sob o controlo do promotor 35S do "Cauliflower Mosaic Virus" (CaMV). Obtiveram-se os regenerantes correspondentes (Ala, His, Arg e Stop, respectivamente) (Desbiez, DEA 1993). A primeira descendência F1 destas plantas obtidas por auto-fecundação é semeada e as plantas com cerca de um mês de idade são agro-inoculadas com o STYLCV. Após a agro-inoculação libertam-se monómeros de virus do 1,8-mero provavelmente por recombinação homóloga. Os monómeros viricos libertados replicam-se e infectam a planta de modo sistémico. Três a guatro semanas após a agro-inoculação aparecem os primeiros sintomas (enrolamento das folhas). A presença de ADN virico ss é detectada pela técnica de "squash" foliar (Navot et al., 1989) e confirmada por análise do ADN total dessas plantas por hibridação "Southern".

As N. benthamiana não transgénicas (controlo positivo) estão doentes e apresentam por "squash" foliar um sinal forte de hibridação com um sonda de ADN total de STYLCV. Todas as plantas Argl, His21 e Stop6 estão doentes e apresentam todas um forte sinal de hibridação com a mesma sonda. Pelo contrário, de entre as 14 plantas Alai agro-inoculadas nas mesmas condições, sete não apresentam nem sintomas nem hibridação com a sonda. A análise do ADN total por hibridação "Southern" demonstra para estas plantas uma ausência total das diferentes formas do ADN virico, ao passo gue as plantas sensíveis apresentam de modo evidente as diferentes formas de ADN virico (ss, ds e forma circular relaxada (oc)).

Para confirmar estes resultados, agro-inoculam-se discos foliares de plantas potencialmente resistentes com o STYLCV. Sete dias após a agro-inoculação, detectam-se as diferentes formas do ADN virico (ss e ds) nos discos foliares de N. benthamiana não transgénica. Esta observação demonstra uma boa infecciosidade do clone utilizado para inocular os discos foliares. Três plantas apresentam uma replicação muito reduzida relativamente ao controlo positivo: são plantas resistentes (ausência de sintomas, ocorrendo replicação residual do ADN virico). Duas plantas não apresentam qualguer forma de ADN virico: são plantas totalmente resistentes. Curiosamente duas plantas apresentam as diferentes formas do ADN virico, enquanto que não foi visível qualquer sinal nem em hibridação "squash", nem em hibridação "Southern". Este 41 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ resultado poderia ser explicado pela "pressão no inoculo" utilizada nas experiências de agro-inoculação de discos foliares. Esta "pressão no inoculo" é mais elevada relativamente à utilizada na agro-inoculação de plantas completas e conduzirá portanto a uma modificação da razão de proteínas Cl mutadas:selvagens em favor da proteína selvagem e consequentemente à replicação do ADN vírico. Por outro lado este comportamento (ambíguo) poderia corresponder a uma inibição do movimento (a longa distância) do vírus in planta, dado que a agro-inoculação de discos foliares permite obter informação sobre fenómenos de movimento a longa distância.

Por outro lado, estão disponíveis três outras descendências F1 de plantas Ala obtidas de regenerantes independentes (Alal4, Ala30 e Ala44). A agro-inoculação de 35 plantas F1 Ala30 com o STYLCV revelou a existência de 29 plantas potencialmente resistentes. Este resultado apoia o resultado obtido com a descendência F1 de Alai.

C) CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DAS PLANTAS ALAI RESISTENTES AO TYLCV A presença e número de cópias do gene Cl-Ala presentes no genoma das plantas Alai é determinada por duas abordagens complementares. A primeira, genética, baseia-se no estudo da segregação do fenótipo de resistência à canamicina (kanR). Esse fenótipo é conferido pelo gene neomicina fosfotransferase (NPTII do transposão Tn5) introduzido com o gene Cl mutado para facilitar a selecção dos transformantes. A segunda, molecular, consiste em digerir o ADN genómico e em efectuar uma hibridação "Southern". A expressão do gene Cl-Ala é analisada ao nível proteico por hibridação "Western". 1. Determinação do número de cópias do gene Cl-Ala * abordagem genética

Efectua-se uma gama de concentrações de canamicina para N. benthamiana a fim de determinar a concentração necessária para parar o crescimento das plantas (descoloração das 42 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ folhas). Os resultados demonstraram que para obter efeitos visíveis seria necessário utilizar uma concentração de canamicina superior a 100 mg/1. Utiliza-se então uma concentração de 150 mg/1.

Uma segregação do tipo 3 kanR:l kanS corresponderia teoricamente à inserção de uma cópia única de T-DNA no genoma da planta, enquanto que uma segregação do tipo 15 kanR:l kanS corresponderia à inserção de duas cópias de T-DNA.

De entre as 89 plantas Alai semeadas, 7 são kanS e 82 são kanR. O ensaio 02 demonstra que estes valores estão de acordo com uma segregação do tipo 15:1 (D2 =0,45 e a <0,001, portanto o desvio não é significativo e existe uma probabilidade inferior a um em mil da nossa hipótese não ser válida). Estes resultados sugerem que o regenerante primário Alai continha pelo menos duas cópias de T-DNA nas quais os genes NPTII são expressos.

Este método é contudo criticável por duas razões: - O fenótipo kanR é conferido pelo gene NPTII, ou poderia ter ocorrido uma modificação ou perda desse gene: teríamos então um fenótipo kanS apesar do gene Cl estar presente. Poderia igualmente ter ocorrido a situação inversa, com perda do gene Cl e presença do gene NPTII (kanR) . - Se a planta contém mais de duas cópias do gene Cl, os resultados da segregação tornam-se difíceis de interpretar. Seria necessário ou aumentar o tamanho da amostragem ou estudar a segregação kanR/kans da descendência F2. * abordagem molecular A fim de determinar o número exacto de cópias do gene Cl-Ala presente nas plantas transformadas Alai, digere-se o ADN dessas plantas com HindIII. Como essa enzima só corta uma vez ao nível do gene Cl, o número de bandas que será revelada corresponde ao número de inserções Cl-Ala. O tamanho mínimo esperado é de 1530 pb. Para obter uma digestão enzimática completa, a enzima utilizada encontra-se em grande excesso (10 vezes a recomendada pelo fornecedor) e o tempo de digestão 43 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ é de cinco horas em vez de uma hora. A digestão é seguidamente verificada em gel.

Revelam-se três bandas: 1600 pb, 1800 pb e 2200 pb. Estes resultados mostram que as plantas analisadas são de facto transgénicas, dado que contêm uma ou duas cópias do gene

Cl-Ala. Os resultados sugerem também que o regenerante primário (Alai) continha pelo menos três cópias do gene Cl. 2. Detecção da proteína Cl-Ala nas plantas transgénicas A proteína Cl-Ala nas plantas transgénicas Alai é analisada por hibridação "Western". Uma experiência preliminar revelou numerosas bandas não específicas mesmo no extracto proteico de N. benthamiana não transgénica. Consequentemente efectua-se uma etapa de pré-adsorção do anticorpo anti-Cl com um extracto proteico total de N. benthamiana não transgénica antes de incubação com o anticorpo anti-Cl com a membrana.

Esta etapa torna-se necessária para consumir os anticorpos anti-Cl da solução, permanecendo os que reconhecem de modo específico os antigénios de N. benthamiana de anticorpos anti-Cl. O anticorpo dirigido contra a proteína Cl reconhece uma banda de cerca de 40 kDa, tamanho esperado para essa proteína. Esta banda encontra-se presente nas plantas transgénicas Alai, D, S, U e V mas está ausente de N. benthamiana não transgénica e da planta Alai B sensível ao STYLCV. Note-se que a planta Alai seria "resistente" segundo ”squash" mas "sensível" segundo os resultados de agro-inoculação de discos foliares. Este comportamento "ambíguo" poderia corresponder à produção dessa banda de 40 kDa.

Estes resultados demonstram que a proteína Cl-Ala se exprime nas plantas transgénicas Alai. Estes resultados demonstram uma correlação entre a expressão da proteína mutada Cl-Ala e a resistência ao STYLCV.

Conclusão a) A ansa P da proteína Cl é essencial para a replicação

Os protoplastos proporcionam um meio poderoso e rápido para o estudo da replicação do ADN vírico independentemente 44 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ dos processos de movimento sistémico do vírus. Após transfecção de protoplastos pelo genoma vírico selvagem, as diferentes formas do ADN vírico em cadeia simples (ss) e em cadeia dupla super-enrolada (ds) acumulam-se e são detectados. A forma ds corresponde a uma síntese de novo, mais que a uma ligação do ADN vírico linear introduzido. Este facto foi demonstrado pelo WDV (Matzeit et al., 1991). Os autores utilizaram uma enzima de restrição (DpnI) que reconhece e corta apenas a sequência GAmTC cuja adenina se encontra metilada na posição N6. 0 ADN vírico amplificado em E. coli é digerido por Dpnl, sendo que a forma ds das células de trigo transfectadas é resistente à digestão. Este facto demonstra que a forma ds é sintetizada de novo nas células transfectadas. Contudo, não se deve excluir uma desmetilação do ADN introduzido nas células transfectadas. A utilização de plasmídeo contendo um dímero em tandem (em vez de um ADN linearizado) dá origem à formação das mesmas formas (ss e ds) que correspondem portanto a uma síntese de novo.

Evidenciou-se uma actividade ATPase in vitro para a proteína Cl do STYLCV selvagem (Desbiez, DEA 1993). Esta actividade encontra-se ausente nas proteínas mutadas Cl-Ala e Cl-His e é reduzida na proteína mutada Cl-Arg. Aqui demonstramos uma correlação evidente entre a actividade ATPase e a replicação desses mutantes nos protoplastos de tomate. De facto, os dois mutantes pTYAla e pTYHis não se replicam nos protoplastos de tomate transfectados. Estes resultados demonstram que o local de ligação ao NTP (ansa P) está implicado, directa ou indirectamente, na replicação do ADN vírico. Contrariamente, o mutante pTYArg (que apresenta uma substituição da lisina 227 por arginina) replica-se menos bem que a selvagem. A substituição do resíduo lisina 227 por arginina, aminoácido com uma estrutura e carga (positiva ao pH fisiológico) próximas do resíduo lisina, parece afectar ligeiramente a actividade da proteína Cl. Tal não é o caso para os resíduos alanina e histidina. Estes resultados sugerem um papel essencial da lisina 227 da ansa P na replicação do ADN vírico.

Numerosos exemplos, noutros sistemas animais e víricos, salientaram a importância desta ansa P e particularmente do resíduo conservado lisina. A proteína RAD3 de Saccharomyces 45 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ cerevisiae está implicada na reparação das lesões do ADN. Uma substituição da lisina 48 da ansa P por um resíduo arginina implica uma perda das actividades ATPase e ADN-helicase dessa proteína (Sung et al., 1988) . A proteína Rep do AAV está implicada na replicação do ADN vírico. Uma substituição da lisina 340 por uma histidina produz um vírus mutante incapaz de se replicar (Chejanovsky et al., 1990). b) A proteína Cl do TYLCV: que papéis na replicação do ADN vírico? A proteína Cl (ou o seu homólogo AL1 dos geminivírus de genoma bipartido) é essencial à replicação do ADN vírico. De entre os diferentes geminivírus, é a proteína AL1 do TGMV que é a mais estudada. No entanto, os papéis dessa proteína na replicação não se encontram bem elucidados. Demonstrou-se que a proteína AL1 do TGMV reconhece especificamente uma sequência com cerca de 50 nt ao nível da região comum e de preferência o ADN em cadeia simples (Lazarowitz et al., 1992b; Thõmmes et al., 1993). Esta interacção específica é necessária à iniciação da replicação. Para a proteína Cl do TYLCV, demonstrou-se que possuía uma actividade endonuclease específica do local ao nível do nonanucleótido muito conservado na estrutura potencial em haste-ansa de todos os geminivírus conhecidos. A proteína AL1 do TGMV apresenta igualmente uma actividade de auto-regulação negativa sobre a sua própria transcrição (Sunter et al., 1993). O domínio proteico responsável pela actividade de repressão foi identificado para a proteína AL1 do TGMV. O significado dessa retro-regulação permanece desconhecido. A hipótese que avançamos é que a proteína Cl seria suficiente para o ciclo vírico em quantidade muito reduzida e desse facto adviria o fenómeno de retro-regulação observado. A sobre-expressão da proteína Cl poderia ser prejudicial à célula hospedeira e consequentemente ao próprio vírus que apenas utiliza a maquinaria celular. A presença na proteína Cl (e AL1) de um motivo conservado GxxxxGKT/S, correspondente ao local de ligação aos NTP (ansa P) , conduziu à atribuição a essa proteína de um papel potencial de ADN-helicase (Gorbalenya e Koonin, 1993). Essa actividade de ADN-helicase poderia, por exemplo, facilitar a 46 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ fixação do complexo celular de ADN polimerase como é o caso para o antigénio T de SV40 (Dodson et al., 1987). A revelação de uma actividade ATPase in vitro para a proteína Cl do TYLCV reforçou esta hipótese. No entanto, todas as ADN-helicases conhecidas com excepção da ADN-helicase do vírus vaccinia (Traktman et al., 1993), apresentam uma actividade ATPase dependente do ADN. Ensaios in vitro da actividade ATPase da proteína Cl de TYLCV demonstraram que esta era independente do ADN (em cadeia simples e dupla) . É possível que as condições utilizadas não sejam óptimas para evidenciar essa dependência. Por outro lado, a proteína Cl utilizada encontra-se sob a forma de fusão GST-C1 expressa num procariota, E. coli. Consequentemente, poderiam ser necessárias modificações pós-tradução (fosforilação, glicosilação, miristilação, etc.) e/ou oligomerizações para a expressão dessa actividade ADN-helicase potencial (ou topoisomerase ou outra(s) desconhecida(s)) e essas modificações não ocorrem em E. coli. Finalmente, é igualmente possível que a fusão com a GST influencie o funcionamento normal da proteína Cl. É interessante referir que existem pelo menos dois locais potencialmente fosforiláveis ao nível da ansa P: RXXT (local consensual das proteína quinases dependentes da calmodulina e local consensual RTKG reconhecido pelas proteína quinases do tipo C (Hofer et al., 1992). A actividade ATPase determinada in vitro apresenta uma actividade específica (a.s.) da ordem de 3xl0~2 mol de ATP hidrolisado/min/mol de proteína, que é muito reduzida comparativamente com as ATPase adenilato quinases por exemplo, que apresentam uma a.s. da ordem de 2xl06 (Hampton e Slotin, 1975). Se existe de facto uma actividade ATPase in vivo e com um valor de a.s. comparável ao determinado in vitro, esta não serviria sem dúvida para fornecer a energia necessária para uma função, por exemplo helicase ou topoisomerase, mas permitiria provavelmente uma alteração de conformação da própria proteína Cl que induziria quer a formação de um multímero de Cl, quer a interacção com factores do hospedeiro. A proteína Hsp70 de E. coli apresenta uma actividade do tipo "chaperon", ou seja, capaz de se ligar a outras proteínas (Buchberger et al., 1994). Esta função encontra-se acoplada com uma actividade ATPase com uma a.s. da ordem de 3,5xlCT2. A fixação e provavelmente a hidrólise do ATP induziriam uma 47 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ alteração de conformação da proteína Hsp70 necessária à sua actividade de "chaperon". É possível que uma alteração de conformação ocorra igualmente na proteína Cl e que seja necessária à sua actividade. c) Efeito negativo dominante sobre a replicação do ADN virico selvagem

Quando os protoplastos de tomate são co-transfectados com pTY e pTYArg, a replicação do ADN virico não é alterada: 0 ADN de pTY replica-se e o de pTYArg replica-se igualmente sozinho a um nível inferior ao do genoma selvagem. Observa-se o mesmo resultado com pTY e pTYHis, apesar deste último não se replicar sozinho nos protoplastos de tomate. A proteína Cl-His não tem portanto efeito dominante detectável sobre a replicação da selvagem. É possível que a substituição do resíduo lisina pelo aminoácido histidina tenha efeito sobre a oligomerização ou sobre a sua interacção potencial com outros factores (consultar mais abaixo). Por outro lado, pode pensar-se que a proteína Cl selvagem "complementaria" a deficiência de replicação do mutante pTYHis. Para demonstrar este facto seria necessário co-transfectar protoplastos de tomate com, por um lado pTYHis e por outro uma construção plasmídica que contenha o ORF Cl selvagem sob o controlo de um promotor forte (35S do CaMV, por exemplo). Caso se confirme a nossa hipótese, deveríamos observar uma replicação do ADN virico mutado pTYHis. A co-transfecção de protoplastos de tomate com pTY e pTYAla, cujo genoma não se replica sozinho, provoca uma redução notável da replicação da selvagem. Este resultado corresponde a um efeito negativo dominante em trans do mutante pTYAla relativamente à replicação da selvagem e confirma resultados preliminares e semelhantes obtidos com protoplastos de tabaco (Mettouchi, DEA 1992). Recentemente, obteve-se um exemplo de mutação negativa dominante para um vírus de ARN, o Potato Virus X (PVX) (Longstaff et al., 1993). A proteína de 188 K do PVX contém um motivo GDD conservado entre as ARN polimerases. A expressão dessa proteína modificada ao nível do motivo GDD em plantas transgénicas de N. tabacum (cv. Samsun NN) acarreta uma resistência ao PVX (ausência de acumulação do ARN virico). 48 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ

Dois modelos podem explicar o efeito negativo dominante observado (Herskowitz, 1987) . Pode ser que a proteína mutada Cl-Ala entre em competição com a proteína selvagem correspondente relativamente a um substrato ou um factor (activador? repressor?) que esteja presente em quantidade limitada, ou pode ser que a proteína mutada Cl-Ala se associe com a proteína correspondente selvagem (ou um factor hospedeiro) para formar um hetero-multímero não funcional (ou seja, inactivo ou muito rapidamente degradável). 0 efeito negativo dominante da proteína mutada sobre a proteína selvagem foi investigado in vitro relativamente à actividade ATPase. Os resultados obtidos não demonstraram qualquer efeito negativo relativo à utilização do ATP. Contudo, não pode concluir-se relativamente a um efeito in vivo dado que a proteína Cl encontra-se sob a forma de fusão GST-C1 expressa em E. coli. Se este modelo de titulação de um factor limitativo (por exemplo, um activador ou um repressor) pela proteína mutada ocorre realmente in vivo, será suficiente sobre-expressar a proteína selvagem sob um promotor forte para contrabalançar o efeito negativo dominante (desde que se garanta que a proteína mutada não apresente uma afinidade demasiado elevada para o factor limitativo). 0 segundo modelo propõe a formação de um hetero-multímero não funcional entre a proteína selvagem e mutada (e/ou um outro factor do hospedeiro). Pode pensar-se que o hetero-multímero deixou de reconhecer a sequência específica da região intergénica, que tenha perdido a capacidade de auto-regulação negativa, que seria instável ou muito rapidamente degradável. Para verificar este segundo modelo, seria necessário antes de mais demonstrar a existência num sistema eucariota de tais oligómeros ou hetero-multímeros da proteína Cl.

Na ausência de funções bioquímicas claramente atribuíveis à proteína Cl, é difícil escolher entre os dois modelos. A identificação de factor(es) do hospedeiro que interage(m) com a proteína Cl assim como a determinação das estruturas terciárias e quaternárias deste(s) permitiria escolher melhor o modelo apropriado para justificar o efeito negativo 49 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ dominante observado e consequentemente elucidar os papéis da proteína Cl na replicação do ADN vírico.

d) As plantas transgénicas que exprimem Cl-Ala são resistentes ao TYLCV

Obtiveram-se dois tipos de resultados ao analisar a resistência ao TYLCV da descendência Fl das plantas transformadas com os diferentes genes Cl mutados. As plantas Fl His21, Argl e Stop6 são todas sensíveis ao STYLCV. A descendência Fl Alai apresenta resistência a esse vírus para cinco plantas das 14 analisadas. Estes resultados apoiam os resultados obtidos com as experiências de co-transfecção, nas quais apenas o mutante pTYAla inibe a replicação do genoma selvagem.

Utilizámos três métodos experimentais para ensaiar a resistência dessas plantas relativamente ao TYLCV. 0 primeiro nível de resposta baseia-se na detecção da forma vírica em cadeia simples (ss) pelo método de "squash" foliar. 0 segundo nível consiste na extracção do ADN total da planta e análise das diferentes formas do ADN vírico por hibridação "Southern". Finalmente, o terceiro nível refere-se ao método de agro-inoculação de discos foliares dessas plantas pelo STYLCV. Este último método é muito utilizado nos programas de selecção de resistência ao TYLCV (e aos geminivírus em geral).

Utilizando estas três abordagens, podemos obter dois tipos de resposta. Três plantas Alai apresentaram uma resistência incompleta ao STYLCV, dado que a agro-inoculação de discos foliares dessas plantas leva a um nível reduzido de replicação relativamente às plantas sensíveis. Duas plantas Alai apresentam resistência total (ausência de replicação observada nas três experiências).

Curiosamente, duas plantas Alai que, tendo em consideração os resultados de "squash" e de "Southern", seriam resistentes, comportam-se como as plantas sensíveis (com um nível elevado de replicação) após agro-inoculação de discos foliares. Interpretámos este fenótipo como correspondente quer a uma "pressão do inoculo" elevada levando à modificação da razão proteína Cl mutada : proteína Cl selvagem, quer provavelmente devido a uma inibição de movimento vírico in planta. 50 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ

Note-se que as sete plantas Alai supra citadas não apresentaram qualquer sintoma característico do TYLCV mesmo três meses após a sua agro-inoculação.

Estes resultados sugerem um efeito negativo dominante in planta e em trans da proteína Cl-Ala mutada sobre-expressa sobre a replicação do ADN vírico selvagem. O mecanismo que explica este efeito in planta é provavelmente o mesmo que o que ocorre nos protoplastos.

Analisámos a presença e a expressão do gene Cl-Ala introduzido nestas plantas resistentes. O gene encontra-se efectivamente presente como uma ou duas cópias nas plantas resistentes mas também em determinadas plantas sensíveis analisadas. Não pode ser estabelecida uma correlação entre a presença e número de cópias do gene Cl-Ala por um lado e a resistência por outro. Este facto pode ficar a dever-se quer a um efeito de posição (inserção numa região "silenciosa" do genoma), quer a uma alteração do gene que leva a sensibilidade ao TYLCV.

As plantas Alai resistentes ao TYLCV exprimem todas a proteína Cl-Ala, ao passo que uma planta sensível, com excepção de uma delas, não a exprime. Com o objectivo de analisar um maior número plantas Alai (e outras plantas F1 Ala disponíveis), podemos dizer que existe uma correlação entre a expressão da proteína e a resistência.

ANEXO meio para protoplastos de tomate

meio MSI meio CPW

Sais MS (Sigma) 4, 6 g manitol 440 mM vitaminas Morei 1 ml MES 100 mM sacarose 20 g CaCl2 10 mM mioinositol 100 mg kh2po4 0,19 mM 2,4 D 1 mg kno3 1 mM CaCl2 · 2 H20 7 mM MgS04 1 mM H20 (q. b . p . ) 11 H20 (q.b.p.) 1 1 pH 5,7 pH 5,7 51 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ solução enzimática para protoplastos de tabaco (em CPW) celulase 2% macerozima 0,1% pectoliase 0,01% meio TM2 meio F macroelementos 100 ml NaCl 140 mM microelementos 1 ml KC1 5 mM vitamina 1 ml Na2HP04 0,75 mM sacarose 68,4 g glucose 54 mM manitol 4, 6 g CaCl2 150 mM xilitol 3,8 g MES 1 mM sorbitol 4, 6 g pH 5,5 tampões de extracção

Tampão TE: TRIS 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,5-8

Tampão X (extracção do ADN de protoplastos de tabaco e de tomate)

Tampão TNES (extracção do ADN de plantas)

Tris-HCl (pH8) 100 mM

NaCl 100 mM

EDTA 10 mM SDS 1%

Tris-HCl (pH8) 100 mM

NaCl 100 mM

EDTA 50 mM SDS 0,5% meios de cultura meio MS30 meio YEB (para as agrobactérias)

Bacto-beef extract 5 g Bacto-yeast extract 1 g peptona 6 g sacarose 5 g MgS04 o, 5 g H20 (q.b.p.) pH 7,2 1 1 sais MS (macro- e microelementos) 4, 6 g (Sigma) Sacarose 30 g H20 (q.b.p.) 1 1 pH 5, 8 (MS = Murashige e Skoog) 52 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ meio Α meio Β MS30 + ΑΝΑ 0,1 g/1 ΒΑΡ 1 g/1 Vitaminas de Morei meio A + canamicina cefotaxima 70 mg/1 500 mg/1 soluções para "Southern' TAE x 1 SSC x 20

Tris-acetato EDTA

0, 04 M 0,001 M

NaCl Na-citrato H20 (q.b.p. 175 g 8 8 g 1 1 TBE x 1

0, 09 M 0,002 M

Tris-borato

EDTA solução de hibridação

NaH2P04 SDS EDTA BSA 0,5 M 7% 1 mM 10 g/1 soluções para "Western'

PBS

Tampão substrato (Phosphate-Buffered Saline) NaCl 140 mM KC1 2,7 mM Na2HP04 10 mM KH2P04 1,8 mM pH 7,3

(para fosfatase alcalina) NaCl 100 mM MgC12 5 mM Tris-HCl (pH 9,5) 100 mM

Tampão 6 x SDS

Tris-HCl (pH 6,8) 350 mM SDS 0,3% glicerol 36% DTT 9%

Azul de bromofenol 0,012% 53 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ

Meios e géis utilizados para o estudo da proteína Rep in vitro

Meio MTPBS

100 mM 16 mM 4 mM * NaCl * Na2HP04 * NaH2Po4 pH 7,3

Composição dos géis utilizados: Gel Laemmli a 10%

Gel de concentração (2,5 ml) Gel resolvente (5 ml) H20 1, 9 ml H20 1,67 ml Tris 1 M pH 6,8 0,31 ml Tris 1 M pH 8,8 1,63 ml SDS a 20% 30 μΐ SDS 30 μΐ Acrilamida- 0, 32 ml Acrilamida- 1,65 ml bisacrilamida a 30% bisacrilamida a 30% APS a 10% 25 μΐ APS 25 μΐ TEMED 4 μΐ TEMED 4 μΐ

Solução de Azul de Coomassie * 2,5 mg/1 de Azul de Commassie Brilhante R250 * Etanol a 20% * Ácido acético a 10%

Colocam-se os géis a corar durante a noite nesta solução, seguidamente elimina-se o excesso de coloração por lavagem numa mistura de etanol a 20% - ácido acético a 10% durante pelo menos uma hora.

Meio I: MS30 + ANA 0,1 mg/ml BAP 1 mg/ml 1 mg/1 100 mg/1 0,01 mg/1 1 mg/1 1 mg/1 1 mg/1

Vitaminas de Morei: Pantotenato de Ca Meso-inositol Biotina Ácido nicotínico Piridoxina (Vit. B6) Tiamina (Vit. Bl) 54 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ

Meio II: Meio I + Canamicina 70 mg/1

Cefotaxima 500 mg/1

Meio III: Meio II sem ANA e sem BA

Os três meios são utilizados sólidos (ágar-ágar 9 g/1).

IV) CONSTRUÇÃO DE TOMATES TRANSGÉNICOS (L. esculentum) QUE EXPRIMEM AS PROTEÍNAS REP MUTADAS E PROTEGIDOS CONTRA AS PATOLOGIAS PROVOCADAS PELOS STYLCV 1) Protocolo utilizado para a transformação genética do tomate (Lycopersicon esculentum) 0 protocolo seguinte baseia-se em duas publicações.

Por um lado a de S. McCornick et ai. (1986); leaf disk transformation of cultivated tomato (Lycopersicon esculentum) using Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Reports _5 :81-84, por outro lado, a de J.J. Fillati et al. (1987) : Efficient transfert of a glyphosate tolerance gene into tomato using a binary Agrobacterium tumefaciens . vector. Bio/technology _5:726-730 .

Os explantes utilizados sao cotilédones jovens ainda em crescimento antes da emergência das primeiras folhas.

Os explantes são provenientes de germinações estéreis in vitro.

Cultivam-se as estirpes de Agrobacterium gue contêm os plasmideos apresentando o gene de interesse (ou seja, as sequências nucleotidicas mutadas Cl* tal como representadas na figura 13) em meio liquido durante dois dias a 28°C no escuro e com agitação. A sucessão de operações é a seguinte:

Dia 1: inoculação das bactérias em meio mínimo com antibióticos. Preparação de caixas de Petri (meio sólido) contendo uma suspensão celular de tabaco em pleno crescimento: tratam-se de camadas-nutrientes. 55 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ

Dia 2: corte minucioso dos fragmentos de cotilédones (dois fragmentos por cotilédone), evitando qualquer oxidação dos tecidos (debaixo de água). Inoculação desses fragmentos com a face superior virada para baixo sobre as camadas-nutrientes recobertas com o auxilio de um papel de filtro Whatman n° 1. Esta incubação deve prosseguir durante uma duração mínima de 8 horas a 25°C em condições de luz fraca.

Dia 3: centrifugação das agrobactérias e retoma destas num meio adaptado aos tecidos vegetais tendo o cuidado de ajustar a D.0. (a 590 nm) da suspensão entre 0,4 e 0,5.

Imersão rápida dos explantes de tomate nessa suspensão e inoculação sobre as mesmas camadas-nutrientes: trata-se de co-cultura plantas-bactérias que se efectua durante 40 horas a 25°C em condições de luz fraca.

Dia 5: transferência dos explantes para um meio que permita a regeneração de rebentos (reguladores do crescimento) e a selecção de células transformadas (antibióticos apropriados). Os fragmentos de cotilédones são então depositados segundo uma polaridade normal. Seguidamente são transferidos para um novo meio cada duas ou cada três semanas, até ao aparecimento de rebentos.

Uma vez que os rebentos estejam bem desenvolvidos, são colocados num meio que permita o enraizamento. Estando bem enraizadas, as plantas são aclimatadas em estufa.

Meios utilizados para a transformação do tomate:

Meio para bactérias:

Meio mínimo para a cultura de Agrobacterium, para 1 litro: 10.5 g 4.5 g 1,0 g 0,5 g K2HP04 K2HPO4 (NH4) 2so4

Citrato de sódio, 2H20 56 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ

Autoclavar a 120 °C, 30 min, para um volume total de 990 ml. Antes de utilizar, adicionar os seguintes compostos estéreis: igualmente esterilizados no autoclave

MgS04, H20 1 ml (120°C, 30 min)

Glucose a 20% 10 ml (110°C, 30 min)

Esterilizado por filtração (0,45 μιη) .

Tetraciclina a uma concentração final de 5 mg/1 relativamente ao vector utilizado.

Meio liquido para ressupender as agrobactérias:

Elementos minerais de Murashige e Skoog, já descritos supra para a transformação de Nicotiniana benthamiana:

Sacarose 30 g pH 5, 8

Autoclavar a 110°C, durante 20 min.

Meio para as plantas:

Meio para a germinação de grãos de tomate:

Para 1 litro:

Elementos minerais de Murashige e Skoog

Sacarose 30 g Agarose 6 g PH 5, 8

Autoclavar a 110°C, durante 20 min. Verter para tubos de cultura estéreis.

Meio para a suspensão BY2: É o já descrito supra para a conservação dessa suspensão celular utilizada igualmente para a transfecção de protoplastos de tabaco. 57 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ

Este meio é simplesmente solidificado com agarose a 0,6% e vertido em caixas de Petri. Amostra-se 1 ml de suspensão sobre esta superfície.

Meio que permite a selecção das células transformadas e a regeneração de rebentos:

Para 1 litro:

Elementos minerais de Murashige e Skoog

Mio Inositol 100 mg

Sacarose 20 g

Gelrite (Serva) 2 g pH 6, 0

Autoclavar a 110°C, durante 20 min.

Antes de utilizar, adicionar os seguintes compostos, esterilizados por filtração:

Ribósido de zeatina 2 mg

Vitaminas de Nitsch:

Tiamina

Glicina Ácido nicotínico Piridoxina Ácido fólico Biotina

Prepara-se uma solução : mistura, divide-se em alíquotas 0,5 mg 2.0 mg 5.0 mg 0,5 mg 0,5 mg 0,05 mg 000 vezes concentrada desta de 1 ml e armazena-se a -20°C.

Para 1 1 de meio, adicionar 1 ml de solução-mae. Antibióticos:

Cefotaxima 500 mg (para eliminar as agrobactérias) Canamicina 100 mg (selecção das células transformadas) 58 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ

Meio de enraizamento:

Para 1 litro:

Elementos minerais de Murashige e Skoog diluídos para metade

Sacarose 5 g

Gelrite 2 g pH 6,0

Autoclavar a 110°C, durante 20 min.

Antes de utilizar adicionar os seguintes compostos esterilizados por filtração:

Cefotaxima 200 mg

Canamicina 50 mg

2) Agro-inoculação de tomates (Lycopersicon esculentum) com o STYLCV

As experiências de agro-inoculação foram efectuadas seguindo o procedimento descrito supra para N. benthamiana.

Plantas inoculadas: regenerantes primários T0 perfeitamente enraizados in vitro sobre o meio de cultura in vitro selectivo contendo canamicina (50 mg/1).

Resultados obtidos após hibridação molecular segundo a técnica de hibridação "squash" utilizando como sonda o ADN total do STYLCV, marcado com 32P.

Conclusão geral: num conjunto de 11 regenerantes primários T0 independentes, 4 obtidos com a construção Ala e 7 com a construção His, 4 (2 com uma das construções e 2 com a outra) encontram-se isentos de ADN vírico após agro-inoculação sendo portanto bons candidatos para resistência ao vírus STYLCV (consultar a tabela 1 seguinte). 59 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ

Tabela 1

Regenerantes primário TO inoculados Total inoculado eficaz Ensaio de 21/07/95 Total inoculado eficaz Ensaio de 11/08/95 S R S R Cultivar I Ala a 9 4 5 25 16 9 b 1 1 0 2 2 0 c 1 1 0 3 1 2 Cultivar II a não ensaiado 1 1 0 Cultivar I His a 1 0 1 2 2 0 Cultivar II a 1 0 1 1 1 0 b 1 1 0 1 1 0 c 1 1 0 2 0 2 Cultivar III a 1 1 0 2 2 0 Cultivar IV a 2 1 1 0,5 3 2 b 1 1 0 1 1 10 S: Planta sensível, ; R: Planta resistente presença de ADN virico , ausência de ADN. em hibridação " 1squash" Os efeitos são fracos dado tratarem-se das primei plantas obtidas de tomates transgénicos, aclimatados pouco a pouco em estufa. V) AGRO-INOCULAÇÃO DE NICOTIANA BENTHAMIANA COM O ISOLADO DA JORDÂNIA DO ITYLCV (ITYLCV-Jo):

As experiências de agro-inoculação foram efectuadas segundo o protocolo descrito supra.

Plantas inoculadas: descendência T2 ou segunda geração obtida após auto-fecundação de plantas TI contendo as mutações Ala e His gue são resistentes ao STYLCV e gue produzem a proteína Rep mutada em quantidade importante.

Resultados obtidos após hibridação molecular segundo a técnica de hibridação "squash" utilizando como sonda o ADN total de ITYLCV-Jo marcado com 32P.

Conclusões gerais: num conjunto de plantas T2 originárias de quatro plantas TI seleccionadas relativamente à presença de Rep e resistência ao STYLCV e aquando de duas repetições da mesma experiência, algumas delas apresentam uma resistência relativamente a outro vírus, o ITYLCV-Jo cuja sequência 60 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ nucleotídica apenas apresenta 75% de homologia com a do STYLCV. A resistência conferida pela produção de uma proteína Rep alterada codificada por uma sequência Cl mutada do STYLCV parece induzir portanto uma resistência na presença de outro geminivírus, o ITYLCV-Jo (consultar a tabela 2 seguinte). Além disso, estes vírus são suficientemente afastados para que não possa haver complementação cruzada relativamente às funções da proteína Rep (Jupin I., Héricourt F., Benz B. e Gronenborn B. (1995), DNA replication specificity of TYLCV geminivírus is mediated by the aminoterminal 116 amino acids of the Rep protein, FEBS Letters, 362: 116-120.

Tabela 2

Plantas TI Número de T2 inoculadas Ensaio de 23/06/95 Número de T2 inoculadas Ensaio de 03/08/95 S R S R His a 11 (10) 1 (6) 10 (4) 12 11 1 b 10 (12) 5(10) 5(2) 23 21 2 Ala a 11 (8) 6 (4) 5(4) 22 18 4 b 10 (9) 7 (2) 4(7) 23 23 0 S: Planta sensível, presença de ADN vírico em hibridação "squash" R: Planta resistente, ausência de ADN.

(X): resultados obtidos em paralelo após inoculação do STYLCV

Legendas das figuras: - figura 1: organização genómica do STYLCV. As setas pretas representam os ORF das cadeias víricas (VI e V2) e complementares (Cl, C2, C3, C4) . A posição da estrutura em gancho de cabelo está assinalada com ( ; ) . O ORF VI parece codificar para uma proteína implicada no movimento sistémico, o ORF V2 codifica para a proteína de cápside, o ORF Cl codifica para a única proteína indispensável à replicação, o ORF C2 codifica para um activador de transcrição dos ORF da cadeia vírica, os ORF C3 e C4 não têm funções conhecidas; 61 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ - figura 2: representação esquemática dos plasmídeos pTY Ala, His, Arg, do plasmideo pBMC-S e dos plasmídeos pCl Ala, His, Arg; indicam-se os principais locais de restrição destes diferentes plasmídeos; - figura 3: as mutações atingem o codão da lisina na posição 227 (codificada por AAG) e resultam na sua substituição por Ala (codificada por GCG) , His (codificada por CAT) e Arg (codificada por AGG) ; - figura 4: replicação dos mutantes no local de ligação aos NTP do STYLCV; o autorradiograma resultante da análise de "Southern" é quantificado com o auxílio de um analisador de imagens (Bio-Images, Millipore), que atribui às manchas um valor de densidade óptica. 0 gráfico representa a percentagem de formas replicativas após três (a preto) e cinco (a branco) dias de cultura das células transfectadas. pTYLCV: genoma vírico selvagem; pTYAla, pTYArg: genomas víricos mutados correspondentes à alteração de K por A e R, respectivamente; figura 5: gráfico procedente da quantificação do autorradiograma obtido aquando do estudo de um efeito dominante em trans da mutação K para R, através de um ensaio de actividade NPT II. As construções indicadas no documento foram co-transfectadas com o genoma vírico recombinante que codifica para a neomicina fosfotransferase (pTYNeo) . Investiga-se a actividade NPT II após 3 e 5 dias de cultura das células transfectadas. As intensidades foram normalizadas relativamente ao sinal correspondente à co-transfecção do genoma recombinante com o vector pUC. figura 6: gráfico procedente da quantificação do autorradiograma obtido aquando do estudo do efeito da transfecção dos genomas víricos mutados (pTYAla, pTYHis, pTYArg) sobre a replicação do genoma vírico (pTYLCV). A percentagem de formas replicativas é representada pelas diferentes amostras após 3 e 5 dias de cultura das células transfectadas. 0 padrão corresponde à co-transfecção do vírus selvagem com o vector pUC de modo a transfectar a mesma quantidade de ADN; 62 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ figura 7: gráfico procedente da quantificação do autorradiograma obtido aquando do estudo do efeito da co-transfecção de construções que permitem a expressão a nível elevado das proteínas Cl mutadas (pClAla, pClHis, pClArg) sobre a replicação do genoma vírico (aqui pTYNeo); - figura 8: os plasmídeos pTYLCV e pTY-Ala, Arg, His, Pml,

Stop são compostos do plasmídeo pUC118 no qual o genoma completo do TYLCV selvagem ou mutado é clonado no local único SstI. 0 plasmídeo pGEXCl é constituído pelo plasmídeo pGEX3 (Amrad) no qual o gene Cl é clonado no local BamHI. 0 repressor lac, produto do gene lacl, liga-se ao promotor Ptac e reprime a expressão da proteína de fusão GST-C1. Na presença de IPTG, a expressão da proteína de fusão é desreprimida; - figura 9: clonagem do ORF Cl a jusante do promotor 35S no plasmídeo pGA492. Este plasmídeo binário apresenta os elementos (ao longo do T-DNA de A. tumefaciens) necessários em cis para a transferência de ADN para as plantas. Os outros elementos são fornecidos por um plasmídeo auxiliar presente na estirpe de A. tumefaciens LBA4404. Os plasmídeos contendo as mutações introduzidas foram obtidos por substituição de um fragmento SstI-BglII (Sstl-Pflml para o mutante Stop) do gene Cl selvagem por um gene mutado. A construção é seguidamente clonada no local único EcoRl do plasmídeo pGA492; figura 10: transformação de discos foliares de N. benthamiana e obtenção de plantas transgénicas que expressam o ORF Cl selvagem ou mutado. Partindo de uma planta jovem de N. benthamiana com cerca de três semanas de idade, efectuamos uma amostragem de folhas jovens e uma esterilização. Os discos foliares são recortados com um punção e seguidamente imersos 30 segundos numa cultura de A. tumefaciens contendo a construção a introduzir.

Seguidamente os discos são postos em cultura 2 dias em meio de germinação (meio I) sem antibióticos. Efectuamos uma repicagem em meio II (com canamicina + cefotaxima) de dez em dez dias até ao aparecimento de rebentos. As plântulas obtidas são repicadas em meio III (sem hormonas) de enraizamento e seguidamente em estufa sobre vermiculite com 63 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ irrigação de solução nutritiva. A composição dos meios I, II e III é apresentada em anexo. - figura 11: esquema simplificado de explicação da obtenção de plantas da primeira geração Fl; figura 12: replicação do ADN virico em protoplastos de tomate. Os protoplastos são quer transfectados (poços 1 a 4 e 8), quer co-transfectados (poços 5 a 7 e 9) com o genoma virico selvagem ou mutado. Após sete dias extrai-se o ADN total, separa-se num gel de agarose e transfere-se para membrana de nylon. Efectua-se a hibridação com uma sonda correspondente ao ADN total de TYLCV-Sar marcado com 32P. Exposição de 15 h a -70°C. ss: forma em cadeia simples; ds: forma super-enrolada em cadeia dupla; lin: forma linear. - figura 13: sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos dos ORF Cl mutados (Cl*) do STYLCV e das proteínas Rep alteradas correspondentes. A sequência nucleotidica começa no ATG iniciador. A proteína Rep inclui 359 aminoácidos. Indicam-se os ácidos nucleicos e os aminoácidos selvagens com maiúsculas. Indicam-se os ácidos nucleicos mutados com minúsculas e indicam-se os aminoácidos mutados com maiúsculas e em itálico. 0 codão n° 227 (AAG) que codifica para a lisina (K) da proteína Rep selvagem foi substituído pelo codão gcG para obter a proteína Rep K227A em que a alanina substitui a lisina. Este mesmo codão foi substituído pelo codão cAt para obter a proteína Rep K227H, na qual a histidina substitui a lisina. Finalmente, a substituição desse codão pelo codão AgG permite obter a proteína Rep K227R, na qual a arginina substitui a lisina. (Pmll) indica o local de restrição cACGTG introduzido para selecção dos mutantes. Trata-se de uma mutação silenciosa que não altera a sequência proteica.

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(A) NOME: CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (B) RUA: 3, rue Michel-Ange

(C) CIDADE: PARIS

(E) PAÍS: FRANCE (F) CÓDIGO POSTAL: 75794 CEDEX 16

(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: PLANTAS E SEMENTES TRANSGENICAS RESISTENTES AOS VÍRUS DE ADN FITOPATOGÉNICOS, E SEUS PROCESSOS DE OBTENÇÃO (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 8 (iv) FORMATO LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE SUPORTE: disquete

(B) COMPUTADOR: PC compatível com IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versão #1.25 (OEB) (v) DADOS DO PRESENTE PEDIDO: NÚMERO DO PEDIDO: PCT/FR95/01192 (vi) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: FR 94.11040 (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: 15-SEP-1994 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1080 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico (ix) CARACTERÍSTICA ADICIONAL:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..1077 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: SílííÃlIllliíSlifTC^ GGT CGT TTT AGÍliliilllljè GCT AAftliAAT TAt ':|||Í|||11?:' 48

Met Pro Arg Ser Gly Arg Phe Ser Ile Lys Ala Lye Asn Tyr Phe Leu

......li!!!!!!!!!!!...............;'s.............................!!!!!!!i|o.............. ..................lllllP

:!ú!iÍAC^!|Ãl!||l:: AAA TGT GAT TTA Ac|!ÃM!1aA AAT ^||!|||| TCC CAR.....ÂTA

Thr Tyr Pro Lys Cys Asp Leu Thr Lys Glu Asn Ala Leu Ser Gin Ile !!!!!!! 20 i!!!!li!i !!!!!!!!!!!!: 3 o 96 70 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ ACA AAC CTA CAA ACA CCC ACA AAC AAA TTA TTÇs ATC AAA ATT TGC AGftiiii Thr Asn jjlHu Gin Thr Pro Thr aSÍÍ: Lys Leu Phe Ile Lys Ile Cys ArgSSSS: 35 11 45 SAA CTA CAT GAA AAT GGG GAA CCT CAT CTC CAT ATT CTC ATC CAA TTC 192 Glu Leu HÍS GlU Asn. Gly Glu Pro HÍS Leu His ile Leu Ile Gin phe 5C 55 5 60 GAA GGA AAA TAC AAT TGT ACC AAT CAA CGA TTC TTC GAC CTG GTA TCC 240 Glu Gly Lys Tyr Asn Cys Thr Asn Gin Arg Phe Phe Asp Leu Vai Ser 65 70 75 80 CCA ACC AGG TCA GCA CAT TTC CAT CCG AAC ATT CAG GGA GCT AAA TCG 288 Pro Thr Arg Ser Ala His Phe Kis Pro Asn Ile Gin Gly Ala Lys Ser 85 90 95 AGC TCC GAC GTC AAG TCC TAT ATC GAC AAG GAC GGA GAT GTT CTT GAA 336 Ser Ser Asp Va 1 Lys Ser Tyr lie Asp Lys Asp Gly Asp Vai Leu Glu 100 105 110 TGG GGT ACT TTC CAG ATC GAC GGA CGA TCT GCT AGG GGA GGA CAA CAG 384 Trp Gly Thr Phe Gin Ile Asp Gly Arg Ser Ala Arg Gly Gly Gin Gin 115 120 125 ACA GCC AAC GAC GCT TAC GCA AAG GCA ATT AAC GCA GGA AGT AAG TCG 432 Thr Ala Asn Asp Ala Tyr Ala Lys Ala Ile Asn Ala Gly Ser Lys Ser 130 135 140 CAG GCT CTT GAT GTA ATT AAA GAA TTA GCG CCT AGA GAT TAC GTT CTA 480 ΓίΊ n Ala sfesw Asp Vai TI e Lys Glu Leu Ala Pro Arg Asp Tyr Vai Leu 145 150 155 160 CAT SSíSiS CAT AAT ATA AAT AGT WÊê TTA GAT AAG GTT TTC CAG GTG CCT 528 Hie Phe His Aon Ile Asn Ser Asn Asp Lys :.:ys.£; Gin Vai Pro 155 170 'ÊMí: CCG GCA CCT TAT 3TT TCT CCT TTT TTA TCT TCT TCT Éii G§lf CAA GTT 576 Pro Ala Pro Tyr Val· Ser Pro Phe neu Ser Sei Ser Phe ASp Gin Vai L90 185 130 CCT sGAT GAA "cli G.AA CAC í;|gg' cri TCC GAG AAC GTC |§§b' 'G§1$ GCC GCT 624 Pro Asp Glu Leu Glu Ki R Trp vai Ser Glu Vai Met Asp Ala Ala 195 200 lais GCG CGG CCT TGG AGA CCG GTG AGT ATA GTG ATT GAG GGT GAC AGC CGG 672 Ala Arg Pro Trp Pro Vai Ser Ile Vai ile Glu Gly Agi: Ser Arg &io 215 220 ACA GGA AAG ACA AC 3 íípfâ GCC CGT TCA ilii GGC CCA iiftT AAT TAT TTG 720 Thr íifly Lys Thi| Thr Érp Ala Arg Ser Leu Gly Pro ijiiis ABhi: sIysí Leu 225 230 235 240 TGC GGC CAT CTT GAC CTC AGT CAA AAA GTA TAC AGC IÍat A$$ GCT TGG 768 Cys iilly His Leu Asp Leu Ser Gin Lys Vai Tyr Ser Asn Asn Ala Trp 245 250 255 71 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ TAT AAC GTC ATT GAT GAC GTC GAC CCG CAT TAT TTA AAA CAC :TTT: AAA 816 Tyr Asn Vai Ile Asp Asp Vai Asp Pro His Tyr Leu Lys His Phe Lys 260 265 270 GAA ssi ATG GGG GÇC CAA AGA GAT TGG CAA AGC AAC ACA AAG :|i§ iitlll 864 Glu Phe Met Gly Ala Gin Arg Asp Trp sis Ser Asn Thr Lys Tyr Gly 275 280 285 AAG ccc ATT CAA ATT AAA GGA GGC ATT CCC ACT ATC TTC CTA TGC 'MÈ. f 912 Lys Pro Ile Gin Ile Lys Gly Gly ile Pro Thr Ile Phe Leu Cys Asn 290 295 300 CCA GGC CCA CAA TCA TCA TTT AAA GAA TAT CTC GAC GAA GAA AAA AAT 960 Pro Gly Pro Gin Ser Ser Phe Lys Glu Tyr Leu Asp Glu Glu Lys Asn 305 310 315 320 CAA GCA TTA AAA AAC TGG GCT ACT AAG AAT GCA ATC TTC GTC ACC ATC 1008 Gin Ala Leu Asn Trp Ala Thr Lys Asn Ala Ile Phe Vai Thr Ile 325 330 335 CAC CAG CCA TTG TTC GCA GAT ACC AAT CAA AAT ACA ACA TCA CAT CGC 1056 His Gin Pro Leu Phe Ala Asp Thr Asn Gin Asn Thr Thr Ser His Arg 340 345 350 CAA GAA GAG GCA AGT GAG GCG TAG 1080 Gin Glu Glu Ala Ser Glu Ala 355 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 359 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA . SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 2: Met Pro Arg Ser Gly Arg Phe Ser Ile Lys Ala Lys Asn Tyr Phe Leu 1 5 10 15 Thr Tyr Pro Lys Cys Asp Leu Thr Lys Glu Asn Ala Leu Ser Gin Ile 20 25 30 Thr Asn Leu Gin Thr Pro Thr Asn Lys Leu Phe Ile Lys Ile Cys Arg

Glu Leu His Glu Asn Gly Glu Pro His Leu His Ile Leu Ile Gin Phe 50 55 60

Glu Gly Lys Tyr Asn Cys Thr Asn Gin Arg Phe Phe Asp Leu Vai Ser iisllllll ........... 80

Pro Thr Arg Ser Ala His Phe His Pro Asn Ile Gin Gly Ala Lys Ser 85 90 95 72 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ

Ser Ser Asp Vai Lys Ser Tyr Ile Asp Lys Asp Gly Asp Val Leu Glu 100 105 110 Trp Gly Thr Phe Gin Ile Asp Gly Arg Ser Ala Arg Gly Gly Gin Gin 115 120 125 Thr Ala Asn Asp Ala Tyr Ala Lys Ala Ile Asn Ala Gly Ser Lys Ser 130 135 140 Gin Ala Leu Asp Vai Ile Lys Glu Leu Ala Pro Arg Asp Tyr Val Leu |i|l 150 155 160 His Phe His Asn Ile Asn Ser Asn Leu Asp Lys Vai Phe Gin Val Pro 165 170 175 Pro Ala Pro Tyr Vai Ser Pro Phe Leu Ser Ser Ser Phe Asp Gin Val 180 185 190 Pro Asp Glu Leu Glu His Trp Vai Ser Glu Asn Vai Met Asp Ala Ala 195 200 205 Ala Arg Pro Trp Arg Pro Vai Ser Ile Vai Ile Glu Gly Asp Ser Arg 210 215 220 Thr Gly Lys Thr Thr Trp Ala Arg Ser Leu Gly Pro His Asn Tyr Leu 225 230 235 240 Cys Gly His Leu Asp Leu Ser Gin Lys Vai Tyr Ser Asn Asn Ala Trp 245 250 255 Tyr Asn Vai Ile Asp Asp Vai Asp Pro His Tyr Leu Lys His Phe Lys 260 265 270 Glu ::§íie Met Gly Ala Gin Arg Asp Trp Gin Ser Asn Thr Lys Tyr Gly 275 280 285 SyS: Pro Ile Gin Ile Lys Gly Gly Ile Pro Thr Ile Phe Leu Cys Asn 290 295 300 Gly Pro Gin Ser Ser Phe Lys Glu Tyr Leu Asp Glu Glu Lys Asn 305 310 315 320 Gin Ala Leu Lys Asn Trp Ala Thr Lys Asn Ala Ile Phe Val Thr Ile 325 330 335 His d|li Prc Leu Phe Ala Asp Thr Asn Gin Asn Thr Thr Ser His Arg 340 345 350 Gin Glu Glu Ala Ser Glu Ala :3:5:5: (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1080 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico 73 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ (ix) CARACTERÍSTICA ADICIONAL: (Α) ΝΟΜΕ/CHAVE: CDS (Β) LOCALIZAÇÃO: 1..1077 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 3: ATG CCA AGA TCA GGT CGT TTT AGT ATC AAG GCT AAA AAT TAT TTC CTT 48 Met Pro Arg Ser Gly Arg Phe Ser Ile Lys Ala Lys Asn Tyr Phe Leu mm 5 10 15 ACA TAT CCC AAA TGT GAT TTA ACA AAA GAA AAT GCA CTT TCC CAA ATA 96 Thr Tyr Pro Lys Cys Asp Leu Thr Lys Glu Asn Ala Leu Ser Gin ile 20 25 30 ACA AAC CTA CAA ACA CCC ACA AAC AAA TTA TTC ATC AAA ATT TGC AGA 144 Thr Asn Leu Gin Thr Pro Thr Asn Lys Leu Phe Ile Lys Ile Cys Arg 35 40 45 GAA CTA CAT GAA AAT GGG GAA CCT CAT CTC CAT ATT CTC ATC CAA TTC 192 Glu Leu HlíJ Glu Asn Gly Glu Pro His Leu His Ile Leu Ile Gin Phe 50 55 60 GAA GGA ΛΑΑ TAC AAT TGT ACC AAT CAA CGA TTC TTC GAC CTG GTA TCC 240 :|lu' Gly Lys IJIyj. Asn Cys Thr Asn Gin Arg Phe Phe Asp Leu Vai Ser 70 75 sn ÍCA ACC AGG •icÃ: GCA CAT TTC CAT CCG AAC ATT CAG GGA GCT AAA TCG 288 Pro Thr Arg Ser Ala Qis Phe His Pro Asn Ile Gin Gly Ala Lys Ser 85 90 95 ilise TCC GAC íiic AAG TCC TAT ATC GAC AAG GAC GGA GAT GTT CTT GAA 336 Ser Ser Asp vai Lys Ser Tyr Ile Asp Lys Asp Gly Asp Vai Leu Glu 103 105 110 TGG GGT ACT TTC CAG ATC GAC GGA CGA TCT GCT AGG GGA GGA CAA CAG 384 Trp Gly ÍThr Phe Gin Ile Asp Gly Arg Ser Ala Arg Gly Gly Gin Gin siÍ'5 120 125 ACA GCC AAC GAC GCT TAC GCA AAG GCA ATT AAC GCA GGA AGT AAG TCG 432 Thr Ala Asn Asp Ala Tyr Ala Lys Ala Ile Asn Ala Gly Ser Lys Ser 130 135 140 CAG GCT CTT GAT GTA ATT AAA GAA TTA GCG CCT AGA GAT TAC GTT CTA 480 Gin Ala Leu Asp Val Ile Lys Glu Leu Ala Pro Arg Asp Tyr Val Leu 145 150 155 160 CAT TTT CAT AAT ATA AAT AGT AAT TTA GAT AAG GTT TTC CAG GTG CCT 528 His Phe His Asn Ile Asn Ser Asn Leu Asp Lys Val Phe Gin Val Pro 165 170 WM CCG GCA CCT TAT GTT TCT CCT TTT TTA TCT TCT TCT TTC GAT CAA GTT 576 Pro Ala Pro Tyr Val ser Pro Phe Leu Ser Ser :Ser Phe ASp Gin Val 180...................................185................... ...190 74 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ CCT GAT GAA CTT GAA CAC TGG GTT TCC GAG AAC GTC ATG GAT GCC GCT 624 Pro Asp Glu Leu Glu HlS Trp val Ser Glu Asn Val Met Asp Ala Ala 195 200 20b GCG CGG CCT TGG AGA CCG GTG AGT ATA GTG ATT GAG GGT GAC AGC CGG 672 Ala Arg Pro Trp Arg Pro Vai Ser Ile Val Ile Glu Gly Asp Ser Arg 210 215 220 ACA GGA GCG ACC ACG TGG GCC CGT TCA TTA GGC CCA CAT AAT TAT TTG 720 Thr Gly Ala Thr Thr Trp Ala Arg Ser Leu Gly Pro His Asn Tyr Leu 225 230 233 240 TGC GGC CAT CTT GAC CTC AGT CAA AAA ΠΤΑ TAC AGC AAT AAT GCT TGG 768 Cys Gly His Leu Asp Leu Ser Gin Lys Val Tyr Ser Asn Asn Ala Trp 245 250 255 TAT AAC GTC ATT GAT GAC GTC GAC CCG CAT TAT TTA AAA CAC TTT AAA 816 Tyr Asn Vai lie Asp Asp Vai Asp Pro Hls Tyr Leu Lys His Phe Lys 260 265 270 GAA TTT ATG GGG GCC CAA AGA GAT TGG CAA AGC AAC ACA AAG TAT GGC 864 Glu Phe Met Gly Ala Gin Arg Asp Trp Gl n Ser Asn Thr Lys Tyr Gly 275 280 285 AAG CCC ATT CAA ATT AAA GGA GGC ATT CCC ACT ATC TTC CTA TGC AAT 912 Lys Pro Ile Gin lli; Lys Gly Gly Ile Pro Thr ile Phe Leu Cys Asn 290 295 300 CCA C-GC CCA CAA TCA TCA TTT AAA GAA TAT CTC GAC GAA GAA AAA AAT 960 Pro Gly Pro Gin Ser Ser Phe Lys Glu Tyr Leu Asp Glu Glu Lys Aon 305 310 315 320 CAA GCA TTA AAA AAC TGG GCT ACT AAG ::^At" GCA ATC TTC GTC ACC ATC 1008 Gin Ala Leu Lys Asn íSsp; Ala Lys Asn Ala Ile Phe Val Thr Ile 325 330 335 :&$$: CA3 CCA TTG TTC GCA GAT ACC AAT CAA AAT ACA ACA TCA CAT CGC !!lCf;5:6:! KÍ5 C-lr. Pro Leu Phe Ala Asp Thr Asn Gin Asn Thr Thr Ser His Arg 340 345 350 Cí^:: iii AGT ί;§|ί|: GCG TAG 11 iOio Glh: Glu Glu Ala Ser ϋϋΐΐί: Ala :3:55: (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 359 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 75 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 4:

Met Pro Arg Ser Gly Arg PKè: Ser Ile SyS: Ala Lys Asn Tyr Phe Leu 1 :5 10 15 Thr Tyr: Pro Lys Cys Asp Leu Thr Lys Glu Ala Leu É|r Gin Ile 20 25 ||° Thr Aon Leu Gin Thr Pro Thr Asn Lys Leu Phe Ile Lys ÉÉe Cys Arg ||| 40 45 Glu Leu His Glu Asn Gly Glu :Pr& His Leu His Ile Leu Ile Gin Phe 50 55 6§; Glu Lys Tyr Asn Cys Thr Asn Gin Arg Phe Phe Asp Leu Val Ser 65 70 75 80 Pro Thr Arg Ser Ala His Phe: HiB Pro Asn ile Gin Gly Ala Lys Ser 85 90 95 Ser ÍSèl: jijSiSjb Val Lys Ser Tyr Ile Asp Lys Asp Gly Asp Val Leu Glu 100 105 110 Trp Phe Gin Ile Asp Gly Arg Ser Ala Arg Gly Gly Gin Gin :I:15· 120 125 Thr: Ala Asn Asp Ala Tyr Ala Lys Ala Ile Asn Ala Gly Ser Lys Ser 130 135 14 C Gin Ala Leu Asp vil Ile Lys Glu Leu Ala Pro Arg Asp Tyr val Leu 145: 150 155 160 His Phe His Asn lii Aah: Ser Ish leu: Asp Lys Val Phe Gin Val Pro ISS: 170 175 Pro Ala: Pro Tyr iai Ser Pro Phe Leu Ser Ser Ser Phe Asp Gin Val íac 185 190 Pro Asp Glu Leu Glu His Trp Val Ser Glu Asn Val Met :|!:á Ala i|| 200 205 Ala Arg Pro Trp Arg Pro val Ser Ile Val Ile Glu Gly Asp j:8|ir Asfejíçç 210 215 220: Thr Gly Ala ÍÍÍ Thr Trp AÍS: Arg Ser Leu Gly Pro: His ÃSti: :lyr Leu 225 230 235 240 Cys Gly Kis Leu Asp Leu sSÈ: Gin Lys Val Tyr Ser Asn Asn :ÃÍa TtfpíS: 245 250 255 Tyr Asn Val ||e Asp Asp Val Asp Pro His Tyr Leu Lys His Phe Lys || 0 2 |i 270 Glu Phe: Met Gly Ala Gin Arg Asp Gin Ser Asn Thr Lys Tyr Gly i2AS: 280 285

Lys Pro lie Gin lio Lys Gly Gly Ile Pro Thr iiSCgWélgBiileys Asn 290 295 300 76 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ

Pro Gly Pro Gin Ser Ser Phe Lys Glu Tyr Leu Asp ÍGli Glu 'iy| Asn 305 310 311 320 Gin ílla Leu Lys Asn ;l^í> Ala #1 i|ys Asn Ala Ile iphè Vai Thr Ile 325 330 335 His l!n Pro Leu Phe Ala Asp t|! Asn Gin Asn Thr Thr Ser His Arg 340 II5 350 Gin Élu Glu Ala Ser Glu Ala 355 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1080 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico (ix) CARACTERÍSTICA ADICIONAL:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..1077 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 5: ATG RCAí: AGA ilSÃi: GGT CGT TTT AGT ATC AAG GCT AAA AAT TAT TTC CTT 48 ÍMet Pro Arg Ser Gly ÃSSÍ: Phe Ser Ile Lys Ala Lys Asn Tyr Phe Leu 1 5 10 15 ACA τϋ CCC AAA TGT GAT TTA ACA AAA GAA AAT GCA CTT TCC CAA ATA 96 Thr Prc Lys Cys Asp Lou Thr Lys Glu Asn Ala Leu Ser Gin Ile 2C 25 30 ACA i|§§ CTA CAA ACA 111 ACA AAC AAA TTA TTC ATC AAA atU TGC AGA | 144 Thr Asn Leu Gin Thr Pro Thr Asn ίίιϋϋ Leu Phe Ile Lys Hl; ϋϋ!ί Arg 35 40 45 GAA CTA CAT GAA AAT ||g· GAA CCT CAT CTC CAT ATT CTC ATC a|p· ttc li·; 192 Glu His Glu Asn Gly Glu His Leu His Ile Leu Ile Gin Phe:::S 50 55 50 G3A AAA Wk AAT |GT ACC AAT CAA CGA TTC TTC GAC CTG GTA TCC;! 240 Glu Gly iilyg: Tyr Asn Cys Thr Asn Gin Arg Phe Phe Asp Leu Vai Ser "li :7Ò 75 80 CCA ACC AGG TCA cm CAT TTC CAT CCG AAC ATT CAG GGA GCT AAA Tc|| 1 288 Pro Thr Arg :§|r Ala His Phe Eis Pro Asn Ile Gin Gly Ala Lys 85 90 95 ASC TCC GAC iíC AAG TCC TAT ATC GAC AAG GAC GGA GAT GTT CTT GAA 336 |er Lys Ser Tyr Ile Asp Lys Asp Gly Asp Vai Leu Glu 100 105 110 77 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ :TGG: GGT íAGT TTC CAG ATC GAC GGA CGA TCT GCT AGG GGA GGA cftfts CAG ssssssi:8:4 Trp C-ly Thr Phe Gin Ile Asp Gly Arg Ser Ala ®rgK Gly slly o|hi: Gin :§|s 120 125 GCC AAC GAC GCT TAC GCA AAG GCA ATT AAC GCA GGA ISSt AAG TCG 432 Thr Ala Asn Asp Ala Tyr Ala Lys Ala Ile Asn Alâií Gly Ser Lys Ser 130 135 140 WÉ& GCT ί&Φί’ GAT GTA ATT AAA GAA TTA GCG CCT AGA GAT TAC GTT 480 jliSilft; Ala Leu Asp Val Ile Lys Glu Leu Ala Pro Arg Asp Tyr vajÊj sliShs. 145 150 155 CAT TTT iiiÃí AAT ATA AAT AGT AAT TTA GAT AAG GTT ÍSii CAG GTG CCT ....................... His Phe His Asn ile Asn Ser Asn Leu Asp Lys Val phe:: Gin Val Pro 165 17 0 175 GCA ϋθΐ TAT GTT TCT CCT TTT TTA TCT TCT TCT TTC GAT CAA GTT 576 íProi: Ala ÍPrò Tyr Val Ser Pro Phe Leu Ser Ser Ser Phe Asp Gin Val 180 185 190 !Éjg|! GAT GAA CTT GAA CAC TGG GTT TCC GAG AAC GTC ATG GAT GCC GCT IP'' 624 ÍPiS: Asp IjSlSi: Leu Glu His Trp Val Ser Glu Asn Val Met Asp Ala WMW 195 200 205 CGG WM TGG AGA ÇCG GTG AGT ATA GTG ATT GAG GGT GAC AGC CGG 672 Ala Arg Pro Trp Arg Pro Val Ser Ile Val Ile Glu Gly Asp Ser Arg 210 ,2M:Í 220 MÉ&·· GGA CAT ACC a<§Íí; TGG GCC ilir TCA TTA GGC CCA CAT AAT TAT TTG 720 ÍThÈÍ Gly His Thr Thr Íííps íAláí Arg Ser Leu Gly Pro His Asn Tyr í^Ssíss: 225 230 235 240 isdes GGC CAT CTT GÁC CTC AGT CAA AAA GTA TAC AGC AAT AAT GCT TGG 768 Gly His jijlijéu Asp Leu Ser Gin Lys Val Tyr Ser Asn Asn Ala Trp 245 250 255 TAT AAC GTC ATT GAT GAC GTC GAC CCG CAT TAT TTA AAA CAC TTT AAA 816 Tyr Asn Vai Ile Asp Asp Val Asp Pro His Tyr Leu Lys His Phe Lys 260 265 270 GAA TTT ATG GGG GCC CAA AGA GAT TGG CAA AGC AAC ACA AAG TAT GGC 864 Glu .Phe. Met Gly Ala Gin Arg Asp Trp Gin Ser Asn Thr Lys Tyr Gly 275 280 285 AAG ccc ATT CAA ATT AAA GGA GGC ATT CCC ACT ATC TTC CTA TGC AAT 912 Lys Pro Ile Gin Ile Lys Gly Gly Ile Pro Thr Ile Phe Leu Cys Asn 290 295 300 CCA GGC CCA CAA TCA TCA TTT AAA GAA TAT CTC GAC GAA GAA AAA AAT 960 Pro Gly Pro Gin Ser Ser Phe Lys Glu Tyr Leu Asp Glu Glu Lys Asn :3Q5 310 315 320 CAA GCA TTA AAA AAC TGG GCT ACT AAG AAT GCA ATC TTC GTC ACC ATC 1008 Gin Ala Leu Lys Asn Trp Ala Thr Lys Asn Ala Ile. Phe Val Thr Ile 325 330 335 CAC CAG CCA TTG TTC GCA ACC AAT CAA AAT ACA ACA TCA CAT CGC 1056 His Gin Pro Leu 340 Phe Ala Asp í||r Asni 345 Gin Asn Thr Thr Ser 350 His Arg

CAA GAA GAG GCA AGT GAG GCG TAG ίφ|η..G1 ι . Glu Ala Ser 355 1080 78 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 359 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 6:

Met Pro Arg Ser Gly Arg Phe Ser Ile Lys sftia Lys Asn ISjjS: Phe :Íièu mm 5 10 15 Thr Tyr Pro Lys Cys Asp Leu Thr Lys Glu Asn Ala Leu Ser Gin Ile 20 25 30 Thr Asn Leu Gin Thr Pro Thr Asn Lys Leu Phe Ile Lys Ile Cys Arg 40 45 Glu Leu tlis Glu Asn Gly Glu Pro His Leu His Ile Leu Ile Gin Phe 50 55 60 Glu Gly Lys Tyr Asn Cys Thr Asn Gin Arg Phe Phe Asp Leu Vai Ser 65 70 75 80 Pro Thr Arg Ser Ala His Phe His Pro Asn Ile Gin Gly Ala Lys Ser 85 90 95 Ser Ser Asp Vai Lys Ser Tyr Ile Asp Lys Asp Gly Asp Vai Leu Glu 100 105 110 Trp Gly Thr Phe Gin 1 : e Asp Gly Arg Ser Ala Arg Gly Gly Gin Gin 115 120 125 Thr Ala ιίΑΒη: Asp Ala Tyr Ala Lys Ala Ile Asn Ala Gly Ser Lys Ser 130 135 140 Gin AÍ:&:: Leu Asp :Val Ile Lys Glu Leu Ala Pro Arg Asp Tyr Vai Leu 145 150 155 160 His Phe iiiHsS Asn ille Asn Ser Asn Leu Asp Lys Vai Phe Gin Vai Pro 165 170 175 Pro Ala Pro Tyr Vai Ser Pro Phe Leu Ser Ser Ser Phe Asp Gin Vai 180 185 190 Pro Asp !l!u Leu Glu His Trp Vai Ser Glu Asn Vai Met Asp Ala Ala ϊΙ:ά'5· 200 205 79 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ

Ala Arg Pro Trp Arg Pro Vai Ser Ile Vai Ile Glu Gly Asp Ser Arg 210 215 220 Thr Gly His Thr Thr Trp Ala Arg Ser Leu Gly Pro HlS Asn Tyr Leu 225 230 235 240 Cys Gly HÍS Leu Asp Leu Ser Gin Lys Vai Tyr Ser Asn Asn Ala Trp 245 250 255 Tyr Asn Vai Ile Asp Asp Vai Asp Pro His Tyr Leu Lys His Phe Lys 260 265 27 0 Glu Phe Met Gly Ala Gin Arg: Asp Trp Ml Ser Asn Thr Lys Tyr: :|iy 275 280 285 Lys sIkp Ile Gin Ile Lys Gly Gly Ile Ml Thr Ile Phe Leu Cys Asn 290 2° = 300 Pro Gly Pro Gin Sér Ser Phe Lys Glu :¾¾¾ iLllÇÁsp Glu Glu Lys Asn 305 310 315 320 Gin Ala Lys Asn Ala Lys Asn Ala Ile Phe Vai Thr Ile 325 330 33·| His g||i Pro iistí Plie Ala £ íífh®:: HS Gin Asn Thr Thr Ser His: Arg 340 345 350 ÍGln Glu Glu Ala Ser Glu Ala :3|| (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1080 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: dupla (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico (ix) CARACTERÍSTICA ADICIONAL:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..1077 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 7: ATG CCA AGA TCA GGT CGT TTT AGT ATC AAG GCT ASA AAT TAT TTC CTT 48

Met Pro Arg Ser Gly Arg Phe Ser Ile Lys Ala Lys Asn Tyr Phe Leu 15 10 15

ACA TAT CCC AAA TGT GAT TTA ACA AAA GAA AAT GCA CTT TCC CAA ATA

Thr Tyr Pro Lys Cys Asp Leu Thr Lys Glu Asn Ala Leu Ser Gin Ile iiiiiiióiçà ........................25.............Illlllllllllllllisllllllllli;;: 96 80 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ ACA AAC CTA CAA ACA CCC ACA AAC AAA TTA TTC ATC AAA ATT TGC AGA 144 Thr Asn Leu Gin Thr Pro Thr Asn Lys Leu Phe Ile Lys Ile Cys Arg 35 40 45 GAA CTA CAT;: GAA AAT GGG GAA CCT CAT CTC CAT ATT CTC ATC CAA TTC 192 Glu Leu His Glu Asn Gly Glu Pro His Leu His Ile Leu Ile Gl ii Phe 50 55 1 60 GAA GGA AAA TAC àí,® TGT ACC ϋϋϋι CAA CGA TTC TTC GAC CTG GTA TCC ί;ί;ί;ί 240 Glu Gly Lys Tyr Asn Cys Thr Asn Glu Arg iiiS: Phe Asp Leu iài Ser 65 70 75 80 ÇCA ACC AGG TCA GCA CAT TTC KAE: CCG AAC ATT CAG GGA iS! AAA TCG i: 288 SSÓ: Thr Arg Ser Ala HiiS' Phe: His Pro Asn ile Gin Gly Ala Lys Ser b| 90 95 AGC TCC GAC GTC AAG TCC TAT ATC GAC AAG GÀl GGA GAT GTT GAA 1 336 Ser :Ser: Asp Éái Lys Ser TyÈ: Ile Asp Lys Asp Gly Asp Val Leu Glu 100 105 110 TGG GGT ACT TTC CAG ATC GAC GGA CGA TCT GCT AGG GGA ííi CAG 384 Trp Gly iiSSe Gin Ile Asp Gly Arg Ser Arg Gly Gly :§lh Gin 115 120 i2|: ACA GCC AAC GAC GCT TAC GCA AAG GCA ATT rM GCA gSí AGT AAG TCG 432 Thi·: iMii: Asn Asp Í|a Tyr Ala Lys Ala Ile Asn Ala Gly Ser Lys Ser 130 135 111 C§Í GCT Itfr :i&| GTA ATT AAA GAA TTA GCG CCT AGA GAC TAC GTT CTA 11 480 gM. Ala Leu ASp Vai Ile Lys Glu Leu Ala Pro Arg Wt&i VS1 Leu 145 150 155 160 CAT TTT CAT AAT ATA AAT AGT AAT TTA GAT AAG GTT TTC CAG CCT 528 Hie Phe HiS Asn I;le Asn Ser Asn Leu Asp Lys Val Phe Gin VSl: Pro JSS: 1~0 175 CCG GCA CCT TAC GTT TCT CCT TTT TTA TCT TCT TCT TTC GAT CAA GTT 576 ?ro Ala Pro Tyr ÍVSI: Ser Pro Phe Leu Ser Ser Phe Asp Gin Val 13C 185 190 CCT GAT :§&Α ill GAA CAC TGG GTT TCC GAC AAC GTC ATG GAT GCC iciiiii 624 ?ro Asp Glu IiSU Glu His Trp Vai Ser Glu Asn Val Het Asp Alã Ala 195 200 205 g|§: CGG CCT TGG AGA CCG GTG AGT ATA GTG ATT GAG GGT GAC AGC CGG 672 Ala Arg pro Trp Arg Pro Vai Ser lie val Ile Glu Gly Asp Ser Arg 210 215 220 ACA GGA AGG ACC ACG TGG GCC CGT TCA TTA GGC CCA CAT AAT TAT TTG 720 Thr Gly Arg Thr Thr Trp Ala Arg Ser Leu Gly Pro IIiS Asn Tyr Leu 225 230 235 240 TGC GGC CAT CTT GAC CTC AGT CAA ΛΛΛ GTA TAC AGC AAT AAT GCT TGG 768 Cys Gly His Leu Asp Leu Ser Gin Lys Val Tyr Ser Asn Asn Ala 245 250 255 81 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ TAT AAC GTC ATT GAT GAC GTC íGAGí CCG CAT TAT TTA AAA CAC STTTí AAA 816 Tyr Asn Ile Aisp Asp Vai Asp Pro His Tyr Leu sLyss His iiShe: Lys 260 265 270 GAA TTT ATG GGG GCC CAA AGA GAT TGG CAA AGC AAC ACA AAG TAT jgc: 864 Glu Phe Met Gly Ala Gin Arg Asp Trp Gin Ser Asn Thr Lys Tyr GlygSS:: 275 280 285 AAG CCC ATT CAA ATT AAA GGA GGC ATT CCC ACT ATC TTC CTA TGC AAT J!Í ÍS:: 912 Lys Pro Ile Gin Ile Lys Gly Gly Ile Pro Thr Ile Phe Leu Cys Asn 290 295 300 CCA GGC CCA CAA TC A TCA TTT AAA GAA TAT CTC CAC GAA GAA AAA AAT 960 Pro Gly Pro Gin Ser Ser Phe Lys Glu Tyr Leu Asp Glu Glu Lys Asn 305 310 315 320 CAA GCA TTA AAA AAC TGG GCT ACT AAG AAT GCA ATC TTC GTC ACC ATC 1008 Gin Ala Leu Lys Asn Trp Ala Thr Lys Asn Ala Ile Phe Vai Thr Ile 325 330 335 CAC CAG CCA TTG TTC GCA GAT ACC AAT CAA AAT ACA ACA TCA CAT CGC 1056 Kls Gin Pro Leu Phe Ala Asp Thr Asn Gin Asn Thr Thr Ser His Arg 340 345 350 CAA GAA GAG GCA AGT GAG GCG TAG 1080 Gin Glu Glu Ala Ser Glu Ala 355 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 359 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA : SEQ ID N0: 8 : Met Pro Arg :ÍÍr: Gly Arg Phe Ser Ile Lys Ala iyig;: Asn íítyt Phe 1 5 !!|ò 15 :§fir Tyr Pro Lys Cys Asp Leu 'ΐ!§ Lys Glu Asn Ala Leu Ser Gin Ile 20 25 30 Thr Asn: Leu Gin Thr Pro Thr Lys Leu Phe Ile Lys Ile Cys Arg 35 40 11:4.5 Glu Leu His Glu Asn Gly Glu Pro His L#ji§: His il| Leu ||e Gin Phe 50 55 60 Glu Gly Tyr Asn Cys Thr Asn ::<|ín Arg Phe : Phe Asp Leu Vai Ser 65 70 75 80 :Pr8: ::|hr Arg Ser Ala His Phe His Pro iÃàn:: Ile Gin Gly Ala Lys Ser 85 llsolllllllllllli 95 82 ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ

Ser Ser Asp Vai Lys Ser Tyr Ile Asp Lys Asp Gly Asp Vai Leu Glu 100 105 110 Trp Gly Thr Phe Gin Ile Asp Gly Arg Ser Ala Arg Gly Gly Gin Gin : 115 120 125 Thr Ala Asn Asp: Ala Tyr Ala Lys Ala Ile Ala Gly Ser Lys Ser 130 135 :::140::: Gin sftli Leu Asp! Vai iii Lys Glu Leu Ala Pro Arg Asp Tyr Vai Leu 150 155 160 His Phe His Asn Ile Asn Ser Asn Leu Asp Lys Vai Phe Gin Vai Pro 165 170 175 Pro Ala Pro Tyr Vai Ser Pro Phe Leu Ser Ser Ser Phe Asp Gin Vai 180 185 190 Pro Asp Glu Leu Glu His Trp Vai Ser Glu Asn Vai Met Asp Ala Ala 195 200 205 Ala Arg Pro Trp: Arg Pro Vai Ser Ile Éai Ile Glu Gly Asp SéiííArg 210 215 :::2:2:0... Thr Gly Arg Thr! Thr Trp Ala Arg Ser Leu Gly Pro His gASil: siyr: Leu 22 5 230 235 liil Cyg Gly His Leu Asp Leu Ser Gin Lys Vai Tyr Ser Asn Asn Ala Tip 245 250 255 Tyr Asn Vai Ile: Asp Asp Vai Asp Pro His Tyr Leu Lys His Phe Lys 260! 265 270 Glu Phe Met Gly: Ala Gin Arg Asp Trp Gin Ser Asn Thr Lys Tyr Gly 275 280 285 Lys Pro Ile Gin Ile Lys Gly Gly Ile Pro Thr Ile Phe Leu Cys Asn 290 295 300 Pro Gly Pro Gin Ser Ser Phe Lys Glu Tyr Leu Asp Glu Glu Lys Asn 305 310 315 320 Gin Ala Leu Lys Asn Trp Ala Thr Lys Asn Ala Ile Phe Vai Thr Ile 325 330 335 His Gin Pro Leu Phe Ala Asp Thr Asn Gin Asn Thr Thr Ser His Arg 340 345 350 Gin Glu Glu Ala Ser Glu Ala

Lisboa 355

Claims (15)

1. ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de uma sequência nucleotidica mutada que codifica para uma proteína Cl inactiva correspondente à proteína Cl activa dos qeminivírus, na qual a lisina situada entre as posições 220 e 235 da referida proteína Cl activa é substituída por alanina, arginina ou histidina e de preferência por alanina, para a obtenção de plantas resistentes ou tolerantes aos geminivírus.
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a proteína Cl inactiva corresponder à proteína Cl activa do vírus TYLC, na qual a lisina na posição 227 é substituída por uma alanina.
3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada por pelo menos uma sequência nucleotidica mutada ser utilizada para a transformação de células de plantas de modo a obter plantas transgénicas resistentes ou tolerantes aos geminivírus.
4. 4. Utilização de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por as sequências nucleotídicas mutadas serem utilizadas para a transformação de protoplastos ou ainda para a construção de vectores tais como plasmídeos, ou para a transformação de bactérias tais como Agrobacterium tumefaciens, capazes de, por seu lado, transformar células de plantas.
5. 5. Método para obter plantas transgénicas que são resistentes a geminivírus, caracterizado por incluir uma etapa de transformação de células de plantas através de pelo menos uma sequência nucleotidica mutada tal como definida nas reivindicações 1 ou 2, se necessário, inserida num vector ou numa bactéria, tal como definido na reivindicação 4, seguida de regeneração das plantas a partir das células assim transformadas.
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por ser efectuado por transformação das células de um fragmento de uma planta, nomeadamente discos foliares, utilizando bactérias de Agrobacterium tumefaciens, que são por ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ 2/3 sua vez transformadas com pelo menos uma sequência nucleotídica mutada de acordo com a reivindicação 1 ou 2, seguida de regeneração das plantas a partir das células assim transformadas, nomeadamente a partir de rebentos formados na periferia dos discos foliares supra mencionados.
7. 7. Células transgénicas de plantas que apresentam um ADN heterólogo integrado de forma estável no seu genoma, contendo o referido ADN heterólogo um promotor reconhecido pelas polimerases das referidas células de plantas e pelo menos uma sequência nucleotídica mutada tal como definido na reivindicação 1 ou 2, sendo a referida sequência nucleotídica mutada capaz de inibir total ou parcialmente a replicação e/ou difusão e/ou distribuição de geminivírus, nomeadamente capaz de codificar, sob o controlo do referido promotor, uma proteína susceptível de inibir total ou parcialmente a replicação e/ou a difusão e/ou a distribuição de geminivírus no interior das referidas células transformadas, estando excluídas as células de Nicotina tabaccum cultivar BY2 ("bright yellow 2") .
8. 8. Células de plantas de acordo com a reivindicação 7 que podem ser regeneradas numa planta transgénica resistente ou tolerante a uma ou a várias estirpes de geminivírus e capazes de produzir sementes que são elas próprias resistentes ou tolerantes aos referidos vírus.
9. 9. Células de plantas de acordo com a reivindicação 7 ou a reivindicação 8 que são transformadas de acordo com o procedimento da reivindicação 5 ou da reivindicação 6.
10. 10. Sementes transgénicas apresentando um ADN heterólogo integrado de forma estável no genoma das suas células, contendo o referido ADN heterólogo, se for caso disso, um promotor reconhecido pelas polimerases das referidas células e pelo menos uma sequência nucleotídica mutada tal como definido na reivindicação 1 ou 2, sendo a referida sequência nucleotídica mutada capaz de inibir total ou parcialmente a replicação e/ou a difusão e/ou a distribuição de geminivírus, nomeadamente capaz de codificar, sob o controlo do referido promotor, uma proteína susceptível de inibir total ou parcialmente a replicação e/ou a difusão e/ou a distribuição ΕΡ Ο 781 342 /ΡΤ 3/3 de geminivírus fitopatogénicos no interior das referidas células transformadas.
11. 11. Sementes de acordo com a reivindicação 10 que são capazes de germinar numa planta resistente aos geminivírus.
12. 12. Sementes de acordo com a reivindicação 10 ou 11 que são transformadas pelo procedimento de acordo com a reivindicação 5 ou com a reivindicação 6.
13. 13. Plantas transgénicas resistentes ou tolerantes aos geminivírus compreendendo um ADN heterólogo integrado de forma estável no genoma das suas células, contendo o referido ADN heterólogo, se for caso disso, um promotor reconhecido pelas polimerases das referidas células de plantas e pelo menos uma sequência nucleotídica mutada de acordo com a reivindicação 1 ou 2, sendo a referida sequência nucleotídica mutada capaz de inibir total ou parcialmente a replicação e/ou a difusão e/ou a distribuição de geminivírus, nomeadamente capaz de codificar, sob o controlo do referido promotor, uma proteína susceptível de inibir total ou parcialmente a replicação e/ou a difusão e/ou a distribuição de geminivírus, no interior das referidas células transformadas, estando excluídas as plantas de Nicotina benthamiana assim transformadas.
14. 14. Plantas de acordo com a reivindicação 13 capazes de produzir sementes resistentes aos geminivírus.
15. 15. Plantas de acordo com a reivindicação 13 ou 14, tais como as obtidas levando à prática um procedimento segundo a reivindicação 5 ou a reivindicação 6. Lisboa,