PT786011E - Processo microbiologico para a preparacao de 3-oxo-4-aza-androstan-3-onas carboxi-substituidas em posicao 17 e comportando uma ligacao dupla em posicao 1 - Google Patents
Processo microbiologico para a preparacao de 3-oxo-4-aza-androstan-3-onas carboxi-substituidas em posicao 17 e comportando uma ligacao dupla em posicao 1 Download PDFInfo
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Description
i 7 8éOt<
DESCRIÇÃO
“PROCESSO MICROBIOLÓGICO PARA A PREPARAÇÃO DE 3-OXO-4-AZA-ANDROSTAN-3-ONAS CARBOXI-SUBSTITUÍDAS EM POSIÇÃO 17 E COMPORTANDO UMA LIGAÇÃO DUPLA EM POSIÇÃO 1” A presente invenção diz respeito a um processo microbiológico para a transformação de 4-aza-androstan-3-onas substituídas em posição 17β. A classe de moléculas conhecidas como 4-azasteróides são conhecidas como sendo susceptíveis de inibir especificamente o processo de 5a-redução da testosterona. Até ao presente, um número de exemplos de inibidores da enzima 5a-redutase tendo uma tal estrutura são conhecidos na literatura (Rasmusson, G, H.; Reynolds, G.F.; Utne T.; Jobson R.B.; Primka R.L.; Broocks J. R.; Berman C. J. Med. Chem. 1984, 27, 1690 - 1701. Rasmusson, G, H.; Reynolds, G. F.; Steimberg, N. G.; Walton, E., Patêl G. F., Liang T.; Cacsieri Μ. A.; Cheung A. H.; Broocks J. R.; Berman C. J. Med. Chem. 1986, 29, 2298 - 2315, EP 155096, EP 538192, EP 468012, EP 484094). Muitas das moléculas estudadas de um tal ponto de vista têm a característica comum de possuírem uma insaturaçào na posição 1, tal como ilustrado na fórmula geral 1 seguinte :
na qual o símbolo Rt representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo inferior, o símbolo R2 representa um grupo OH, OR3, NHR3, em que o símbolo R3 representa um grupo alquilo C1-C9 de cadeia linear ou ramificada, cicloalquilo contendo eventualmente um ou mais heteroátomos escolhidos entre S, O, N, policicloalquilo C10-C20, ou arilo.
Os processos descritos para a introdução desta insaturação são numerosos : em alguns casos, utiliza-se o anidrido fenilselénico como reagente (Back T. G. J. Org. Chem. 1981, 46, 1442 - 1446), ou pode preparar-se os referidos compostos quer mediante uma reacção de sulfonilação (Zoretic P.A. et al. J. Org. Chem. 1978, 43, 1379 - 1382) ou, tal como referido mais recentemente, através de um processo de sililação e oxidação, via a formação de um produto de adição com DDQ (2,3-dicloro-5,6-diciano-l,4-benzoquinona). Todos estes processos exigem condições experimentais drásticas (por exemplo, as temperaturas da reacção variam, na dependência do processo seguinte, entre -78° e +120°C, devem ser tomadas precauções específicas quanto aos solventes utilizados, os quais têm de ser anidros, os reagentes utilizados são acentuadamente tóxicos). De maneira interessante, embora as percentagens de 3 conversão do produto desejado sejam em alguns casos satisfatórias, os reagentes utilizados são acentuadamente coloridos e não atóxicos, o que toma consideravelmente complexos os processos de purificação para se obter um produto aceitável sob o ponto de vista farmacêutico, em detrimento do rendimento real do processo. Além disso, o problema ambiental aquando da eliminação dos reagentes utilizados à escala industrial requer métodos novos e menos poluentes para realizar esta fase química.
Alguns tipos de microrganismos são conhecidos da literatura como sendo susceptíveis de transformar o radical esteróide tradicional (Phytochemistry, 1984, 23(10), 2131 - 2154; Microbial transformation of steroids and alkaloids, Iizuka H., Naito A. University of Tokyo Press, 1967; Yamanè T. et al. Biotechnology and Bioengineering, 22, 1979, 2133 - 2141; Sih C. J. et al. Biochem. Biophys. Acta 38, 1969, 378 - 379; Dodson R. M. et al. J. Am. Chem. Soc. 82, 1960, 4026) mas não se descobriu quaisquer provas na literatura de qualquer tipo de biotransformação em estruturas tais como 4-aza-androstan-3-onas carboxi-substituídas em posição 17β tal como descrita na fórmula geral 1.
Surpreendentemente, descobriu-se que alguns microrganismos são susceptíveis de biotransformar o radical aza-esteróide de modo a introduzir uma insaturação em posição 1. Deste modo, utilizando, por exemplo, a 17-N-t-butil-carbamoíl-4-aza-androstan-3-ona conhecida como substrato (Reynolds, G. F.; Steimberg, N. G.; Walton, E.; Patel G. F.; Liang T. Cacsieri Μ. A.; Cheung A. H., Broocks J. R.; Berman C. J. Med. Chem. 1986, 29, 2298 - 2315) e 4
Arthrobacter simplex. Nocardia sp. como os microrganismos, obteve-se com sucesso o derivado desidrogenado correspondente em posição 1, com rendimentos da ordem de 20 a 80 % (Esquema 1). CONHtBu
Esquema 1
Por consequência, um objecto da presente invenção é um processo para a preparação de compostos de fórmula geral (1) :
na qual o símbolo Ri representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo inferior, o símbolo Ri representa um grupo OH, ORj, NHR3, em que o símbolo R3 representa um grupo alquilo C1-C9 de cadeia linear ou ramificada, cicloalquilo contendo eventualmente um ou mais heteroátomos escolhidos entre S, O, N, policicloalquilo C10-C20 ou arilo; processo esse que compreende as 5 5
fases que consistem em : a) cultivar um microrganismo do género Arthrobacter ou Nocardia num meio de cultura apropriado, b) induzir a produção de Δ1 desidrogenase no referido microrganismo; c) separar as células do referido microrganismo; d) incubar o referido microrganismo com um composto de fórmula geral (2):
na qual os símbolos Ri e R2 têm os significados definidos antes, e) isolar 0 produto biotransformado; f) alquilar eventualmente o átomo de azoto esteróide.
Seguindo um processo geral, cultiva-se uma bactéria pertencente ao género Arthrobacter ou Nocardia num meio líquido apropriado que contém uma fonte de carbono, consistindo de uma maneira geral numa hexose, habitualmente glicose, em concentrações compreendidas entre 0,5 e 15 g/l, de preferência entre l e 10 g/l, e de uma mistura de substâncias complexas tais como peptonas, hidrolisados e extractos, por exemplo, carne, sangue, peptonas de gelatina; hidrolisados de caseína ou de albumina; extractos de levedura ou autolisados, em uma concentração total compreendida entre 10 e 100 g/l, de 6 6
preferência entre 20 e 50 g/1. Realiza-se a cultura a temperaturas compreendidas entre 25 e 35°C, de preferência a 27 - 29°C, durante um intervalo de tempo compreendido entre 20 e 72 horas (habitualmente igual a 24 horas). Decorridas 5 a 12 horas do inoculo, adiciona-se ao caldo de cultura uma solução ou suspensão que contém uma molécula susceptível de induzir a produção da enzima Δ1 desidrogenase em bactérias. Para esta finalidade, podem utilizar-se indutores esteróides, tais como progesterona ou hidrocortisona em concentrações compreendidas entre 10 mg e 1 g/1 (de preferência entre 100 e 500 mgd). No final da cultura, separam-se as células do líquido mediante filtração ou centrifugação e utilizam-se. Podem utilizar-se tanto as células in toto ou as fracções que têm uma actividade enzimática interessante. É igualmente possível manter a actividade celular intacta durante alguns meses, congelando a pasta de células à temperatura de -25°C. Realiza-se a reacção de transformação no seio de um tampão a pH 6,00 - 8,00 (de preferência a pH 7,00) e a uma temperatura compreendida entre 25 e 35°C, durante intervalos de tempo compreendidos entre 10 e 120 horas. Para se obter uma boa percentagem de conversão, é essencial utilizar um tampão previamente saturado com um solvente orgânico tal como CHCI3, tetradecanol, acetato de etilo, ciclo-hexano, benzeno, n-butanol e preferivelmente escolher dos referidos solventes aqueles com log P maior do que 1,5, tais como CHCI3, até um máximo de 10 % v/v. Ao meio de incubação resultante tem de se adicionar um co-factor externo tal como menadiona ou metassulfato de fenazma, de preferência menadiona em concentrações compreendidas entre 20 e 250 mg/1. Adiciona-se o substrato a 7 7
transformar à mistura reaccional em concentrações compreendidas entre 0,1 e 1 g/1, sendo o substrato adicionado de uma só vez, de maneira fraccionada ou de maneira contínua.
Processa-se então a reacção eliminando por filtração o micélio sobre Celite e extraindo o filtrado com CHCI3. Seca-se os extractos orgânicos resultantes sobre sulfato de sódio, filtra-se e evapora-se sob vazio para se obter um produto que se purifica subsequentemente mediante cromatografia sobre sílica : mediante eluição com diclorometano/metanol a 95/5, isola-se o produto desidrogenado com rendimentos compreendidos entre 20 e 80 %, e por eluição isocrática ulterior isola-se o produto não biotransformado com rendimentos compreendidos entre 60 e 10%. O processo de desidrogenação descrito pode ser igualmente realizado utilizando os microrganismos citados anteriormente imobilizados ou utilizando homogeneizados brutos obtidos a partir dos referidos microrganismos. As técnicas experimentais afins são fáceis de realizar e são conhecidas dos especialistas na matéria (Glass T. L. et al. J. Lipid. Res ~ 1982, 23, 352; Fukui S. et al. Acta Biotechnol. 1981, 1, 339; Omata T. et al. Eur. J. Microbiol. Biotechnol. 1979, 8, 143; Kim Μ. N. et al. Biotechnol. Letters 1982, 4, 233; Ohloson S. et al. Eur, J. Appl, Microbiol. Biotechnol. 1979, 7, 103). Além disso, podem efectuar-se igualmente as reacções mencionadas anteriormente utilizando enzimas purificadas a partir dos mesmos microrganismos. Neste caso, também, a possibilidade de isolar esta desidrogenase e de as utilizar como biocatalisadores no estado nativo ou 8 suportado sobre uma matriz polimérica encontra-se largamente descrita na literatura (Grunwald J. et al. J. Am. Chem. Soe. 1986, 108, 6732; Sniider--Kambers A. M et al. Red. Trav. Chim. Pavs-Bas 1991, 110, 226; Santaniello E. et al. Chem. Rev 92, 1992, 1071- 1140).
Os exemplos seguintes ilustram ainda a invenção.
Exemplo 1
Mantém-se o microrganismos sobre planos inclinados contendo 9 ml de um meio com a seguinte composição : Ingredientes Concentração (g/1) Extracto de carne (Difco) 1,500 Extracto de levedura (Difco) 3,000 Peptona (Difco) 6,000 Hidrolisado de caseína (Costantino) 4,000 Dextrose (Cerestar) 1,000 Agar (Difco) 18,000 O crescimento tem lugar no decurso de 18 a 20 horas a uma temperatura igual a 28°C. Realizam-se transplantes em cada 20 - 30 dias. Para a cultura vegetativa, preparam-se balões de 300 ml contendo cada um 50 ml de um banho com a composição seguinte : 9
Ingredientes Concentração (g/1) Dextrose (Cerestar) 1,000 Peptona bacteriológica (Costantino) 6,000 Hidrolisado de caseína (Costantino) 4,000 Autolisato de levedura (Costantino) 3,000
Ajusta-se ο pH (6,10 - 6,30) até 7,00 por meio de NaOH IN e esteriliza-se o meio a 121°C durante 15 minutos. Efectua-se o inoculo com 0,50 ml/balão de uma suspensão obtida mediante lavagem de um plano inclinado com 5 ml de uma solução de soro fisiológico. I.ncubam-se então os balões à temperatura de 28°C sobre um agitador rotativo a 200 rpm durante 17 horas. Realiza-se a fase subsequente num fermentador com um volume total de 3 litros, contendo 1,7 litros do meio indicado anteriormente e inocula-se com uma taxa de 6 % (120 ml). As condições operativas são as seguintes : temperatura 28°C, arejamento 0,5 vvm a 200 - 500 rpm. Decorridas 6 horas, adiciona-se 1,7 ml de uma suspensão de hidrocortosina em 2 ml de acetona (a uma temperatura de 60°C) e realiza-se a cultura durante mais 18 horas. Decorrido um total de 24 horas, isola-se as células mediante centrifugação a 4,800 xg (20 minutos) e volta a suspender-se em tampão de fosfato 0,1 Pví, pH 7,00, saturado com CHCI3 com uma velocidade de 50 g/1 de peso húmido. Distribui-se a suspensão de células em balões de 300 ml (20 ml/balão), a cada um dos quais se adiciona 0,125 ml de uma solução preparada a partir de 84 mg de 17p-t-butilcarbamoíl- 10 -4-aza-androstan-3-ona e 8,7 mg de menadiona em 2 ml de metanol (concentração final do substrato 260 mg/1). Incuba-se as culturas a uma temperatura de 30°C durante 72 horas no agitador rotativo a 250 rpm. Processa-se então a reacção filtrando o caldo de reacção sobre celite e extraindo o filtrado com CHCI3 (1:1 v/v para a fase aquosa). Secam-se os extractos orgânicos sobre sulfato de sódio, filtram-se e evaporam-se até à secura para se obter um produto bruto que se purifica subsequentemente mediante cromatografia sobre sílica : a eluição gradiente com CfkCk/MeOH a 95/5 permite isolar o produto desejado com rendimentos de 60 % e o produto inicial com rendimentos de 20 %. RMN-'H (60 MHz): 0,70 (s, 3H), 0,97 (s, 3H), 1,40 (s, 9H), 3,1 - 3,6 (m, 1H), 5,2 (m, 1H), 6,3 (m, 1H), 5,8 (d, J = 9 Hz, 1H), 6,7 (d, J = 9 Hz, 1H). P.F. 253 - 254°C.
Lisboa, 7 de Abril de 2000
Claims (8)
1 REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a preparação de compostos de fórmula geral (1): cor2
na qual o símbolo Ri representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo inferior, o símbolo Ri representa um grupo OH, OR3, NHR3, em que o símbolo R3 representa um grupo alquilo C1-C9 de cadeia linear ou ramificada, cicloalquilo contendo eventualmente um ou mais heteroátomos escolhidos entre S, O, N, policicloalquilo C10-C20 ou arilo; processo esse que compreende as fases que consistem em : a) cultivar um microrganismo do género Arthrobacter ou Nocardia num meio de cultura apropriado; b) induzir a produção de Δ1 desidrogenase no referido microrganismo; c) separar as células do referido microrganismo; d) incubar o referido microrganismo com um composto de fórmula geral (2) : 2 c cor2
H (2)
R1 na qual os símbolos Ri e R: têm os significados definidos antes; e) isolar o produto biotransformado; f) alquilar eventualmente o átomo de azoto esteróide.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caractenzado pelo facto de o microrganismo ser Arthrobacter simplex ou Nocardia sp..
3. Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de se realizar a fase b) por meio de indutores de tipo esteróide.
4. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de o referido indutor ser hidrocortisona.
5. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo facto de se realizar a fase d) no seio de um tampão a um pH compreendido entre 6 e 8 previamente saturado com um solvente tendo log P supenor a 1,5, até um máximo de 10 % v/v.
6. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de o referido solvente ser clorofórmio.
7. Processo de acordo com as reivindicações 5 e 6, caracterizado pelo facto de ao referido tampão se adicionar menadiona ou metassulfato de 3 fenazina.
8. Processo de acordo com as reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo facto de no referido composto de fórmula geral (1) o símbolo R2 representar um grupo terc-C4H9-NH-. Lisboa, 7 de Abril de 2000
1 RESUMO “PROCESSO MICROBIOLÓGICO PARA A PREPARAÇÃO DE 3-OXO-4-AZA-ANDROSTAN-3-ONAS CARBOXI-SUBSTITUÍDAS EM POSIÇÃO 17 E COMPORTANDO UMA LIGAÇÃO DUPLA EM POSIÇÃO 1” A presente invenção diz respeito a um processo microbiológico para a transformação de 4-aza-amndrostan-3-onas substituídas em posição 17β e à utilização dos produtos da biotransformação como inibidores da enzima 5a-redutase. Lisboa, 7 de Abril de 2000
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