PT768887E

PT768887E - Composicoes com propriedades antivirais e processo de preparacao

Info

Publication number: PT768887E
Application number: PT96904129T
Authority: PT
Inventors: Alix-Roland Commin
Original assignee: Commin Alix Roland
Priority date: 1995-03-06
Filing date: 1996-02-13
Publication date: 2001-11-30
Also published as: FR2731354B1; ATE201825T1; AU711634B2; EA000112B1; EP0768887A1; FR2731354A1; AU4834096A; AP705A; ES2171653T3; DK0768887T3; EA199600087A1; JPH10506124A; GR3036556T3; OA10332A; CA2189474C; DE69613190T2; CA2189474A1; WO1996027383A1; DE69613190D1; EP0768887B1

Description

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DESCRIÇÃO "COMPOSIÇÕES COM PROPRIEDADES ΑΝΤΙVIRAIS E PROCESSO DE PREPARAÇÃO" A invenção tem por objectivo composições que possuem especialmente propriedades antivirais e, em particular, antiretrovirais. A luta contra as doenças provocadas pelos retrovírus tem mobilizado numerosas equipas de investigadores, em todo o mundo. Em particular, fazem-se esforços consideráveis para lutar contra a epidemia da SIDA (Síndrome da Imunodeficiência Adquirida).

Sabe-se que o agente responsável pela SIDA é um retrovírus, designado por VIH, por Vírus de Imunodeficiência Humana, ou mais comummente HIV, de acordo com a designação abreviada em inglês.

Os medicamentos antivirais mais utilizados são derivados de nucleósidos, tendo a zidovudina, ou AZT, sido o primeiro antiretroviral disponível. Em seguida, o surgimento de mutantes resistentes conduziu à pesquisa de novos tratamentos.

Os trabalhos realizados pelo requerente sobre uma mistura de ácido e de produtos de origem natural, conduziram à produção de composições de grande eficácia para inactivar o poder infeccioso do HIV. A invenção tem, assim, por objectivo, proporcionar novas composições antivirais capazes. 1

Tem igualmente como objectivo, um processo para a preparação destas composições.

As composições de acordo com a invenção caracterizam-se por serem preparadas a partir de ácido acético e extractos de pó de noz de coco, de solução de sais minerais, de extractos de cactáceas, liliáceas, anacardiáceas e euforbiáceas. A noz de coco é o fruto do coqueiro. De acordo com a invenção, utiliza-se com vantagem a polpa branca, ralada.

As cactáceas adequadas particularmente para a realização da invenção compreendem a opúncia. Recorde-se que a opúncia é o nome genérico da Figueira da índia, da nopálea, da figueira da barbaria ("figuler de barberie") e outras espécies originárias da América tropical.

Utilizam-se mais especialmente os frutos da figueira da índia verde.

As liliáceas adequadas no âmbito da invenção compreendem a salsaparrilha. Utiliza-se com vantagem a raiz de salsaparrilha.

Como anacardiáceas os requerentes recorreram mais particularmente a mombina e mais particularmente à casca de mombina.

Uma euforbiácea particularmente preferida é o rícino. Os seus grãos, particularmente no estado torrado e na forma de pó, são especialmente utilizados de acordo com a invenção.

As composições preferidas são preparadas a partir de ácido acético, de noz de coco ralada, de água do mar, de frutos de figueira da índia verde, de raiz de salsaparrilha, de casca de mombina, de pó de grãos de rícino torrados.

Utiliza-se com vantagem estes diferentes ingredientes, de acordo com a seguintes proporções: - ácido acético: de 5 a 10 litros, em particular de 7 a 8 litros - pó de noz de coco (de preferência polpa branca, ralada): equivalente a cerca de 10 nozes de coco; solução de sais minerais (especialmente sódio, potássio, magnésio, cálcio, fosfatos, cloretos, sulfatos, carbonatos e bicarbonatos), por exemplo água do mar: 3 a 5 litros, em particular 4 litros; - figueira da índia, particularmente frutos de figueira da índia verde, ralados: de 10 a 20 frutos, correspondendo a 1 a 2 kg , especialmente cerca de 15 frutos, correspondendo a cerca de 1,5 kg; - raiz de salsaparrilha: 500 g a 1 kg, especialmente cerca de 750 g; - casca de mombina: de 500 g a 1,5 kg, especialmente cerca de 1 kg. grãos de rícino torrados e moídos: de 500 g a 1,5 kg, especialmente cerca de 1 kg

De acordo com um outro aspecto, as composições da invenção obtêm-se deixando macerar a noz de coco em pó com o ácido acético, durante cerca de 24 horas e adicionando ao filtrado da mistura de maceração os vários ingredientes enumerados acima, vantajosamente de acordo com as proporções indicadas, e levando 3

U a mistura resultante à ebulição, durante pelo menos 1 hora, e recuperando o filtrado. A invenção refere-se igualmente a um processo para a obtenção das composições acima definidas, caracterizado pelas etapas anteriormente descritas. O estudo das propriedades das composições da invenção revelou um efeito inibidor da actividade da transcriptase inversa de HIV-1, podendo exceder os 90% em relação à actividade medida nos controlos. Constata-se igualmente uma diminuição do efeito citopatogénico do HIV-1 nas células infectadas por este virus, tratadas por composições da invenção. A ausência de toxicidade destas composições foi verificada no rato, por injecção intraperitoneal a pH fisiológico. A invenção tem, assim, por objectivo tirar partido das propriedades destas composições para a preparação de composições farmacêuticas.

As composições farmacêuticas da invenção caracterizam-se por conter uma quantidade eficaz de pelo menos uma composição tal como definida acima, em associação com um veiculo farmacêutico inerte.

Estas composições são particularmente adequadas para a prevenção e tratamento do SIDA, caso necessário em combinação com outros medicamentos. 4

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Estas composições são administradas de preferência por via injectável, na forma de soluções ou de suspensões injectáveis, isotónicas em relação ao plasma sanguíneo. A quantidade de princípio activo varia de acordo com a idade do paciente, sendo mais usualmente a posologia no homem de 1 a 500 mg de princípio activo (extracto seco), por dia. A invenção será ilustrada em seguida por meio de um exemplo de preparação de uma composição de grande eficácia em relação ao vírus HIV-1 e pelos resultados de testes in vitro e in vivo.

Exemplo 1; Preparação de uma composição de acordo com a invenção

Maceram-se durante pelo menos 24 horas, polpa branca, seca, ralada de 10 nozes de coco, com 7 a 8 litros de vinagre branco ou ácido acético. A mistura é em seguida filtrada.

Adiciona-se ao filtrado recuperado os seguintes ingredientes: - solução rica em minerais, como água do mar; 4 litros; - figueira da índia verde, ralada (cerca de 15 frutos): 1,5 kg - raiz de salsaparrilha: 750 g - casca de mombina: 1 kg - pó de grãos de rícino torrados: 1 kg A mistura assim obtida é levada à ebulição durante cerca de lh e em seguida filtrada.

Exemplo 2: Estudo de inactivação de HIV-1 pela composição do exemplo 1 5 \

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PROTOCOLO EXPERIMENTAL Inactivação do vírus A suspensão de partículas virais A no meio de cultura RPMI 1640 (HIV-1 III B, actividade de transcriptase inversa 3,8 x 106 cpm/ml) é incubada com a composição do exemplo 1, designada daqui para a frente "a composição” (V/V), durante 20 min a 4 °C, em seguida 1 hora à temperatura ambiente, e por fim 2 horas a 37 °C. No final da incubação, a mistura é diluída a 1/10, 1/20, 1/40, 1/100, 1/200 no meio de cultura RPMI 1640, mais soro fetal de vitela (SFV) a 10%, previamente aquecido durante 30 min a 56 °C.

Infecçâo 5 x 105 células MT4 (células humanas de origem linfóide, transformadas por HTLV-1) são recolocadas em suspensão em 250 μΐ das diferentes diluições da mistura vírus-composição.

Após uma hora de adsorção à temperatura ambiente, com recolocação das células em suspensão a cada 15 minutos, os vírus não adsorvidos são eliminados por centrifugação das células. Estas são lavadas duas vezes com RPMI, em seguida colocadas em suspensão no meio RPMI 10% SFV, na concentração de 2 x 105/ml. As células infectadas são postas em cultura em placas de microtítulo (Costar 96 cadinhos) numa proporção de 200 μΐ/cadinho.

Todas as culturas são feitas pelo menos em duplicado. As culturas são diluídas com um volume idêntico de meio após 5 dias e 8 dias de infecçâo. 6

Uma série de culturas controlo são infectadas em paralelo com a suspensão de vírus A misturada (V/V) com meio RPMI. As incubações e diluições são realizadas estritamente nas mesmas condições que para o vírus tratado com a composição.

Realiza-se um controlo suplementar com o vírus pré-incubado com uma solução de NaCl 0,15M. A produção de vírus foi medida por um doseamento da actividade de transcriptase inversa, associada às partículas virais libertadas pelas células no meio de cultura. A transcriptase inversa é igualmente designada por transcriptase reversa ou RT, como abreviatura. 0 teste RT é realizado em 65 μΐ de meio, de acordo com o protocolo descrito por Moog et col. em Antiviral Research, 24_ (1994), 275-288. Os resultados são expressos em cpm/teste (quadro, parte inferior). A viabilidade celular é medida pelo teste MTT descrito por Moog et col., na referência acima indicada (quadro, parte superior). A intensidade de coloração é expressa em mili DO. EXPERIÊNCIA A:

Avalia-se a produção de HIV após a infecção das células MT4 com o vírus pré-incubado com a composição. Após 5 ou 7 dias de infecção, os valores de RT estão compreendidos entre 699 e 1538 cpm/teste, sendo para os sobrenadantes de culturas não infectadas de 1400-2100 cpm/teste. Todas as culturas infectadas com o vírus não tratado produzem o vírus de D5 a Dll. 7 u Γ

Experiência B

Avalia-se a produção de HIV após infecção de células CEM-SS por HIV-1 Lai.

Incuba· -se (V/V) uma suspensão de vírus B (HIV-1 LAi, actividade de transcriptase reversa 3 x 108 cpm/ml) com a composição. Todas as outras etapas são as descritas para a experiência realizada com as células MT4.

Nestas condições, as culturas infectadas com o virus controlo (não incubado com a composição) produzem o vírus, medido por RT, 11 dias após a infecção.

No caso das células infectadas com o vírus pré-incubado com a composição, os RT são semelhantes aos medidos nos sobrenadantes de culturas não infectadas (1707-2564 cpm/teste), após 11 dias de infecção.

EXPERIÊNCIA C 0 protocolo experimental seguido é idêntico ao da experiência A. As medidas feitas em D5 e D7 após infecção mostram que não se detecta, ou muito pouco, a replicação do vírus quando este foi pré-incubado com a composição (RT das células controlo não infectadas 972-12192 cpm/teste).

EXPERIÊNCIA D A fim de poder medir a produção de vírus a tempos mais precoces que na experiência B, utilizou-se uma concentração de vírus 10 vezes superior. 8

A produção de vírus após 5 e 8 dias é fortemente inibida pela pré-incubação do vírus com a composição. A ausência de efeito observado utilizando a solução NaCl 0,15 M indica que a inibição do vírus é específica da composição.

Estes resultados mostram assim que a pré-incubação do vírus HIV-1 com a composição da invenção resulta numa inactivação do poder infeccioso das partículas virais.

Exemplo 3: Estudo do efeito da composição do exemplo 1 sobre a actividade de transcriptase reversa do HIV-1

Misturou-se (V/V) uma suspensão de vírus HIV-1 com diferentes diluições da composição. A determinação da actividade de transcriptase reversa (RT) associada às partículas virais foi efectuada como descrito por Moog et al., na referência acima indicada.

As medições foram efectuadas em pelo menos duas amostras.

Os resultados obtidos são apresentados na tabela 1.

Constata-se que a utilização da composição, em concentrações mais elevadas, inibe a actividade RT em mais de 90%.

Uma outra série de experiências, cujos resultados são apresentados na tabela 2, confirma os dados anteriores. 9

Estas experiências mostram, portanto, que as composições de acordo com a invenção são capazes de inibir a actividade da transcriptase reversa medida in vitro.

Quadro 1 - Actividade de RT (cpm/teste)

Diluição final das soluções Composição / Virus Meio 1/2 1.164 783 973 (93%)* 1/6 759 688 724 (94%) 1/8 2.453 2.875 2664 (80%) 1/54 6.875 5.949 6.412 (50%) 1/162 10.035 8.220 9.128 (29%) 1/486 11.747 12.981 12.364 14.318 Meio 10.743 11.764 Virus controlo 12.687 12.794 12.218 15.036 10 * Os números entre parêntesis indicam a % de inibição da actividade de RT.

Quadro 2 - Actividade de RT (cpm/teste)

Diluição final das soluções Composição / Virus Meio 1/2 550 783 666 (100%)* 1/4 925 524 724 (100%) 1/8 572 442 507 (100%) 1/16 910 797 854 (100%) 1/32 27.045 30.535 28.790 (82%) 55.180 1/64 71.351 63.265 (60%) 108.652 1/128 103.673 106.163 (32%) 129.555 1/256 107.540 118.548 (24%) 81.234 1/512 149.698 115.466 (26%) 167.936 1/1024 144.598 156.267 157.233 Meio Virus controlo 155.059 156.146 11 de inibição da

Os números entre parêntisis indicam a

actividade de RT

Lisboa, 24 de Agosto de 2001 O AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Composições que possuem especialmente propriedades antivirais e, em particular, antiretrovirais, caracterizadas por serem produzidas a partir de ácido acético e extractos de pó de noz de coco, solução de sais minerais, extracto de cactácea, de liliácea, de anacardiácea e de euforbiácea.
2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por se utilizar a polpa branca ralada da noz de coco.
3. Composição de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada por se utilizar uma opúncia como cactácea, em particular a figueira da índia e mais especialmente os frutos da figueira da índia verde.
4 . Composição de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por se utilizar como liliácea t a salsaparrilha, em particular a raiz de salsaparrihla
• 5. Composição de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada por se utilizar, como anacardiácea, a mobina, em particular a casca de mombina.
6. Composição de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada por se utilizar, como ' euforbiácea, grãos de rícino, em particular pó de grãos de rícino torrados
• 7. Composição de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada por ser preparar a partir de ácido acético, de noz de coco ralada, de água do mar, de frutos de figueira 1

da índia, de raiz de salsaparrilha, de casca de mobina, de pó de grãos de rícino torrados.
8· Composição de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por se utilizar os diferentes ingredientes de acordo com as proporções seguintes - ácido acético: de 5 a 10 litros, particularmente 7 a 8 litros; - pó de noz de coco (de preferência polpa branca ralada) : equivalente a cerca de 10 nozes de coco; - solução de sais minerais (especialmente sódio, potássio, magnésio, cálcio, fosfatos, cloretos, sulfatos, carbonatos e bicarbonatos) , por exemplo água do mar: 3 a 5 litros, em particular 4 litros; - figueira da índia, particularmente frutos de figueira da índia verde ralados; de 10 a 20 frutos, correspondendo ala 2 kg , especialmente cerca de 15 frutos, correspondendo a cerca de 1,5 kg; - raiz de salsaparrilha: 500 g a 1 kg, especialmente cerca de 750 g; - casca de mombina: de 500 g a 1,5 kg, especialmente cerca de 1 kg. - grãos de rícino torrados e moídos: de 500 g a 1,5 kg, em especial cerca de 1 kg.
9. Composições com propriedades antiretrovirais, caracterizadas por serem obtidas deixando macerar a noz de coco em pó com ácido acético, durante cerca de 24 horas, adicionando ao filtrado da mistura de maceração os ingredientes de acordo com uma das reivindicações 1 a 8, com vantagem segundo as 2 proporções indicadas, levando a mistura resultante à ebulição durante pelo menos 1 hora e recuperando o filtrado.
10. Processo para a obtenção de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por se macerar a noz de coco em pó com o ácido acético, durante cerca de 24 horas, adicionar ao filtrado da mistura de maceração os ingredientes de acordo com uma das reivindicações la 8, levar a mistura à ebulição durante pelo menos 1 hora e recuperar o filtrado.
11. Medicamentos que possuem especialmente propriedades antiretrovirais, caracterizados por conterem uma quantidade eficaz de uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em associação com um veiculo inerte. Lisboa, 24 de Agosto de 2001 0 AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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