PT726763E - Metodos de tratamento utilizando formulacoes lipossomicas unilamelares de metabolitos de acido araquidonico - Google Patents

Description

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DESCRICÃO "Métodos de tratamento utilizando formulações lipossómicas unilamelares de metaboiitos de ácido araquidónico"

Este pedido é uma continuação em parte de U.S. com o N°. de Série 08/152 852, apresentado em 16 de Novembro de 1993, o qual por sua vez é uma continuação em parte de U.S. com o N°. de Série 07/821 648, apresentado em 16 de Novembro de 1992, actualmente Patente dos E.U.A N°. 5 262 168, a qual por sua vez é uma continuação de U.S. com o N°. de Série 07/195 228, apresentado em 18 de Maio de 1988, actualmente Patente dos E.U.A. N°. 5 082 664, a qual por sua vez é uma continuação em parte de U.S. com o N°. de Série 053 305, apresentado em 2 de Maio de 1987, actualmente abandonado, e este pedido é também uma continuação em parte de U.S. com o N°. de Série 08/180 089, apresentado em 11 de Janeiro de 1994, o qual por sua vez é uma continuação em parte de U.S. com o N°. de Série 147 898, apresentado em 4 de Novembro, de 1993, agora abandonado. Este pedido é dirigido às utilizações terapêuticas de formulações lipossómicas unilamelares de metaboiitos de ácido araquidónico.

As várias prostaglandinas encontram-se agrupadas em diversas categorias (A-l), as quais são distinguidas por substituintes variáveis no anel de cinco carbonos introduzido no ácido gordo de vinte carbonos precursor durante a síntese da prostaglandina. Estes grupos podem ainda ser subdivididos com base no número, e na posição, das ligações duplas nas cadeias de carbono das prostaglandinas. Crê-se que as prostaglandinas actuam sobre as suas células alvo por meio de receptores na superfície celular; crê-se que estes receptores se encontram acoplados a sistemas de segundo mensageiro por meio dos quais é mediada a acção da prostaglandina. As prostaglandinas podem apresentar um largo espectro de actividades biológicas.

As enzimas no organismo podem desactivar rapidamente as prostaglandinas. Isto torna tipicamente indispensável administrações frequentes de doses elevadas dos compostos a fim de manter níveis séricos terapeuticamente eficazes, deste modo aumentando o custo do tratamento com 2 83 691 ΕΡ Ο 726 763/ΡΤ prostaglandinas e conduzindo à possibilidade de efeitos colaterais não desejados. Além disso, como a desactivação das prostaglandinas ocorre principalmente à medida que o sangue atravessa os pulmões, os compostos são geralmente administrados intra-arterialmente. As formulações lipossómicas podem prolongar as semividas circulatórias dos metabolitos de ácido araquidónico, por ex., das prostaglandinas, e podem ajudar a evitar a sua desactivação nos pulmões. Por conseguinte, as referidas formulações lipossómicas podem proporcionar alternativas terapêuticas úteis.

Mizishuma et a/. {J. Rheumatof. 14:97 (1987)) e Hoshi et al. (Drugs. Exptl. Clin. fíes. 1_2(8):681 (1986)) descrevem microesferas lipídicas contendo prostaglandina Et (PGEt). No entanto, tal como descrito em Mizishuma et al. (Patente dos E.U.A. N°. 4 493 847) e em Imagawa et al. (Patente dos E.U.A. N°. 4 684 633), estas "microesferas" são na realidade emulsões gordas contendo prostaglandina, que não são lipossomas, e não apresentam nem as mesmas propriedades, nem as mesmas vantagens, que as formulações lipossómicas de metabolitos de ácido araquidónico aqui proporcionadas. Shell e See (Patentes dos E.U.A. Nos. 4 820 732 e 4 955 878) descrevem tratamentos para redução da disfunção durante os procedimentos de angioplastia os quais envolvem a administração aos doentes de composições contendo prostaglandinas. Estas composições também contêm um transportador. No entanto, os transportadores líquidos descritos, por ex., álcoois desidratados e soluções salinas, não conseguem duma forma geral proporcionar uma libertação sustentada de um metabolito de ácido araquidónico. Os transportadores em microesferas carregadas de gordura descritos são referidos como sendo pelo menos tão volumosos como um glóbulo vermelho, isto é, com pelo menos 7 micra de diâmetro, e podem ser muito maiores. A administração de partículas de tão grandes dimensões a animais pode ocasionar dificuldades dado que as microesferas podem encalhar, e bloquear, pequenos vasos sanguíneos, por ex., os capilares pulmonares. Os lipossomas utilizados neste invento, em contraste, apresentam uma dimensão máxima de cerca de 5 micra ou menos, e apresentam preferencialmente cerca de 50 nm a cerca de 1 mícron de tamanho. Estes lipossomas podem, com segurança, ser administrados a animais para fins terapêuticos.

Em EP 0 416 527 descrevem-se preparações de lipossomas contendo 3 83 691 ΕΡ Ο 726 763/ΡΤ prostaglandinas, as quais são caracterizadas por um lípido ou lípidos carregados positivamente se encontrarem incorporados na membrana lipídica. No entanto, a necessidade de introdução de lípido carregado positivamente acarreta a desvantagem de os últimos não serem adequados para certas aplicações médicas. Aqui, é descrito um tampão fosfato o qual não é claramente um tampão inibitório da libertação.

As formulações lipossómicas de drogas podem apresentar um índice terapêutico melhorado por redução da toxicidade da droga, aumento da sua eficácia, ou ambos. As formulações lipossómicas de metabolitos de ácido araquidónico empregues na prática deste invento são úteis na melhoria ou prevenção de doenças, desordens ou condições tais como desordens toxémicas, desordens inflamatórias e desordens de activação e adesão celulares.

Este invento proporciona um método para o fabrico de uma composição farmacêutica para o tratamento de uma desordem caracterizada por activação e adesão celulares, inflamação ou toxemia, compreendendo a formulação de uma composição compreendendo um transportador farmaceuticamente aceitável e um lipossoma unilamelar compreendendo (i) um lípido, (ii) um tampão aquoso inibitório da libertação, e (iii) uma quantidade eficaz anti-desordem de um metabolito araquidónico, o qual é pelo menos cerca de 10~12 g do metabolito por kg de peso corporal do animal a ser tratado, em que o referido tampão inibitório da libertação aumenta a intensidade das interacções metabolito-lípido ou estabelece repulsões electrostáticas com o metabolito. A composição é adequada para administração a um animal. Preferencialmente, o animal é um humano e a administração compreende a administração endovenosa.

Adicionalmente, o invento proporciona a utilização de uma composição compreendendo um transportador farmaceuticamente aceitável e um lipossoma unilamelar compreendendo um metabolito de ácido araquidónico, um lípido e um tampão aquoso inibitório da libertação, em que o referido tampão inibitório da libertação aumenta a intensidade das interacções metabolito-lípido ou estabelece repulsões electrostáticas com o metabolito, para o fabrico de uma composição para o tratamento de um animal afectado com uma desordem caracterizada por activação e adesão celulares, inflamação ou toxemia.

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Preferencialmente, ο lipossoma unilamelar é um lipossoma unilamelar grande (LUV), mais preferencialmente, um LUV apresentando um diâmetro de cerca de 100 nm. Preferencialmente, o metabolito de ácido araquidónico administrado ao animal é uma prostaglandina, mais preferencialmente uma prostaglandina das séries E ou I, e o mais preferencialmente, a prostaglandina Preferencialmente, o lípido é um lípido de cadeia acilo saturada, mais preferencialmente, dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC). Preferencialmente, o tampão é um tampão de ácido cítrico, mais preferencialmente, um tampão de ácido cítrico apresentando um pH de cerca de 4,5. O método deste invento pode ser utilizado para tratar animais afectados com desordens caracterizadas por activação e adesão celulares, inflamação ou toxemia, entre outras indicações. As referidas desordens incluem, sem limitação: lesão de reperfusão, enfarte do miocárdio, doença vaso-oclusiva, síndrome de dificuldade respiratória do adulto {SDRA), síndrome de resposta inflamatória sistémica (SRIS), vasculite, choque pós-traumático, lesão por queimadura, desordens vaso-oclusivas, desordens artríticas, por exemplo, gota, artrite reumatóide e artrite por filária, e desordens auto-imunes, por exemplo, lúpus eritematoso sistémico, diabetes juvenil, esclerose múltipla ou tiroidite de Hashimoto. As indicações particularmente preferidas são a SDRA e a SRIS. 0 método compreende a administração ao animal de uma quantidade do lipossoma, a qual compreende uma quantidade eficaz anti-desordem do metabolito de ácido araquidónico. Duma forma geral, a quantidade eficaz anti-desordem do metabolito é, pelo menos, de cerca de 10'12 g do metabolito por kg de peso corporal do animal, e é tipicamente de cerca de 10'12 g por kg a cerca de 10’3 g por kg. Desejavelmente, a quantidade eficaz do metabolito é de cerca de 10'8 g por kg de peso corporal a cerca de 10'4 g por kg. Mais desejavelmente, a quantidade eficaz do metabolito de ácido araquidónico é de cerca de 10'6 g por kg de peso corporal. 0 lipossoma utilizado no método deste invento pode compreender um protector da secagem, e pode ser desidratado, armazenado e em seguida reconstituído antes da sua utilização. O protector da secagem é preferencialmente um sacárido tal como maltose, lactose, sacarose, dextrose, rafinose ou tre-halose. Preferencialmente, o sacárido protector da secagem é 83 691 ΕΡ Ο 726 763/ΡΤ maltose. Ο método deste invento pode compreender a administração ao animal de um agente bioactivo adicional, tal como um agente anti-inflamatório ou antimicrobiano.

BREVE DESCRICÃO DOS DESENHOS FIGURA 1. Efeito da LUV-PGE, sobre a Agregação Plaquetária. LUV-PGEt ("C-53"; preparada de acordo com os processos expostos no Exemplo 1, abaixo). Eixo dos X: controlo, 0,1 microgramas, 0,6 microgramas, 1,1 microgramas e 1,1 microgramas após administração da LUV-PGE1 por kg de peso corporal (Sombreado escuro: colagénio; sombreado claro: U46613). Eixo dos Y: percentagem do controlo. FIGURA 2. Frequência Cardíaca vs. Duração da Experiência em Cães tratados/de controlo. Quadrados a cheio: LUV-PGEt; triângulos a cheio: controlo; *: lipossomas vazios; losangos a cheio: PGE1 livre. FIGURA 3. Pressão Auricular Esquerda vs. Duração da Experiência. Quadrados a cheio: LUV-PGE,; triângulos a cheio: controlo; *: lipossomas vazios; losangos a cheio: PGE1 livre. FIGURA 4. Dimensão do Enfarte como Percentagem da Zona em Risco. Eixo dos X: LUV-PGE1( PGEt livre, lipossomas vazios, controlo. Eixo dos Y: dimensão do enfarte / zona em risco (%). FIGURA 5. Libertação de Mieloperoxidase a partir do Tecido Miocárdico. Eixo dos X: zona do enfarte, zona de fronteira, região em risco, zona de controlo (sombreado escuro: controlo; linhas oblíquas: lipossomas vazios; linhas rectas: PGEt livre; paralelas cruzadas: LUV-PGE!. FIGURA 6. Prevenção da Lesão Pulmonar após Lesão Cutânea Térmica com Tratamento com LUV-PGEt. Eixo dos X: controlo, queimadura, queimadura mais LUV-PGE-,. Eixo dos Y: percentagem da perda de albumina (cpm no pulmão direito/cpm no sangue). 6 83 691 ΕΡ Ο 726 763/ΡΤ FIGURA 7. Efeito de Lipossomas Vazios ou de PGEt Livre sobre a Perda Pulmonar em Ratos com Administração Intratraqueal de IL-1. Eixo dos X: solução salina de controlo, IL-1, IL-1 + LUV-PGE1f IL-1 + lipossomas vazios, IL-1 + PGEt livre. Eixo dos Y: perda pulmonar (cpm no pulmão / cpm no sangue). FIGURA 8. Modelo de Endotoxemia no Rato. Eixo dos X: tempo (dias) após administração do LPS. Eixo dos Y: percentagem de sobrevivência no grupo de tratamento. Quadrados a cheio: ratos aos quais foi administrada solução salina de controlo (0 pg/kg de LPS); quadrados a branco: ratos aos quais foi administrado 10 pg/kg de LPS; losangos a cheio: 15 ,ug/kg de LPS; losangos a branco: 25 pg/kg de LPS; triângulos a cheio: 50 pg/kg de LPS; triângulos a branco: 75 pg/kg de LPS; círculos a cheio: 100 pg/kg de LPS. FIGURA 9. Inibição da Secreção de TNFa e IL~ 1 β pelos Monócitos Humanos em Resposta ao Lipopolissacárido (LPS). Eixo dos X: PGEt livre, LUV-PGE, (lipossomas unilamelares contendo PGEt e preparados de acordo com os processos descritos neste Exemplo), LUV placebo (lipossomas unilamelares grandes não contendo PGE-,), LUV placebo mais PGE, livre. Eixo dos Y: percentagem de inibição da secreção de TNFa e IL-Ιβ; não sombreado: TNFa; sombreado: IL-1 β. FIGURA 10. Atenuação da Mortalidade Induzida por LPS. Eixo dos X: tempo (dias) após administração de LPS. Eixo dos Y: percentagem de sobrevivência no grupo de tratamento. Quadrados a cheio: solução salina de controlo (sem administração de LPS); losangos a cheio: LUV-PGEt; losangos a branco: LUV placebo mais PGEt livre; triângulos a cheio: LUV placebo; triângulos a branco: controlo de LPS (sem lipossomas ou PGE,); quadrados a branco: PGEt livre. FIGURA 11. Eliminação da Mortalidade Induzida pela PGEt livre. Eixo dos X: solução salina de controlo (sem LPS, PGEt ou lipossomas), controlo de LPS (LPS, mas sem lipossomas ou PGEt), LUV-PGE1( LUV placebo mais PGEt livre, microesferas de LÁTEX mais PGEt livre, LUV placebo, microesferas de LÁTEX. Eixo dos Y: percentagem de sobrevivência no grupo de tratamento. 7 83 691 - ΕΡ Ο 726 763/ΡΤ

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO O presente invento proporciona um método para o fabrico de uma composição farmacêutica compreendendo a formulação de um metabolito de ácido araquidónico de acordo com as reivindicações 1-23. A composição compreende um transportador farmaceuticamente aceitável e o metabolito de ácido araquidónico em associação com um lipossoma unilamelar. A composição é adequada para administração a um animal. Preferencialmente, o animal é um humano e a administração compreende a administração endovenosa. "Transportador farmaceuticamente aceitável" tal como aqui utilizado, significa qualquer um dos transportadores, diluentes, excipientes e similares padrão geralmente destinados à utilização em conexão com a administração de agentes bioactivos a animais, particularmente humanos. Os referidos transportadores são bem conhecidos na arte e são geralmente escolhidos tendo em conta um certo número de factores, tais como a droga particular a ser utilizada e a via de administração pretendida, os quais são bem compreendidos pelo perito na arte, ou a sua determinação encontra-se ao seu alcance sem excessiva experimentação. Transportadores adequados incluem, mas não se encontram limitados a soluções salinas como soro fisiológico (10 por cento em peso por volume de cloreto de sódio em água), soluções aquosas de dextrose, por ex., D5W (5 por cento em peso por volume de dextrose em água), e similares. A composição farmacêutica pode ainda compreender agentes auxiliares tais como conservantes, antioxidantes e similares em quantidades, e pelos motivos, bem conhecidos do perito na arte.

Os lipossomas são estruturas de automontagem compreendendo uma ou mais camadas duplas de moléculas lipídicas anfipáticas, circundando cada uma dessas camadas duplas um compartimento aquoso. Consequentemente, os lipossomas podem ser unilamelares, isto é, podem possuir uma única camada dupla lipídica, ou os lipossomas podem ser multilamelares, isto é, podem possuir duas ou mais camadas duplas lipídicas. O lipossoma deste invento é um lipossoma unilamelar. Preferencialmente, o lipossoma é um lipossoma unilamelar grande (LUV) e mais preferencialmente, é um LUV com um diâmetro de cerca de 100 nm. 8 83 691 ΕΡ Ο 726 763/ΡΤ

Os lipossomas podem ser preparados por uma diversidade de técnicas bem conhecidas dos peritos na arte. Por exemplo, ver Deamer e Uster, "Liposome Preparation: Methods and Mechanisms", em Liposomes (M. Ostro, ed.), Mareei Dekker, (Nova Iorque), pág. 27-51 (1983); Cullis et a!., em: Liposomes. From Biophvsics to Therapeutics (M. J. Ostro, ed.), Mareei Dekker, pág. 39-72 (1987). O processo de Bangham (J. Mol. BioL, 13:238 (1965)) produz vesículas multilamelares "ordinárias" (MLV), isto é, lipossomas com duas ou mais camadas duplas lipídicas, e envolve a dissolução de um ou mais lípidos anfifílicos num ou mais solventes orgânicos. Os lípidos são de seguida secos, e os lípidos secos são re-hidratados com uma solução aquosa de modo a formar as MLV. Lenk et al. (Patentes dos E.U.A. Nos. 4 522 803, 5 030 453 e 5 169 637), Fountain et al. (Patente dos E.U.A. N°. 4 588 578) e Cullis et al. (Patente dos E.U.A. N°. 4 975 282) descrevem métodos para a produção de lipossomas multilamelares que possuem um soluto encarcerado nos seus compartimentos aquosos, sendo a concentração do soluto em cada um dos compartimentos substancialmente igual. Os lipossomas unilamelares podem ser formados por injecção de éter ou etanol ou por métodos de infusão. Os lipossomas unilamelares podem ser produzidos a partir de lipossomas multilamelares por extrusão dos lipossomas multilamelares, sob pressão, através de filtros com tamanhos de poro definidos de acordo com as descrições de Cullis et al. (Patente dos E.U.A. N°. 4 975 282) e Loughrey et al. (Patente dos E.U.A. N°. 5 059 421). A extrusão, bem como outros processos tais como a homogeneização, a moagem por ultra-sons e a aplicação de Prensa Francesa, podem ser utilizados para reduzir o tamanho do lipossoma, o qual pode ser determinado por processos tais como a análise dos lipossomas em microscópio electrónico de fractura livre, bem como por difusão de luz quasi-eléctrica.

Os "metabolitos de ácido araquidónico" são prostaglandinas, ou compostos que podem ser convertidos em prostaglandinas, por ex., artificialmente ou no organismo de um animal. As prostaglandinas são um grupo de ácidos gordos de vinte carbonos contendo um anel de cinco carbonos, mais cadeias de sete ou oito carbonos, que são preparados a partir do ácido araquidónico e de outros ácidos gordos de vinte carbonos que possuem pelo menos três ligações duplas (por ex., os ácidos gordos "essenciais", ácido 8,11,14-eicosatrienóico, ácido 5,8,11,14-eicosatetraenóico ou ácido 5,8,11,14,17-eicosapentanóico; ver, por ex., Goodman and Gilman's The

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Pharmacological Basis of Therapeutics. supra). O ácido araquidónico é o mais abundante destes precursores das prostaglandinas de vinte carbonos nos humanos.

Os ácidos gordos essenciais de vinte carbonos precursores das prostaglandinas, intermediários formados durante a síntese das prostaglandinas, por ex., o ácido prostanóico, e os análogos estruturais que podem ser convertidos nestes compostos, são os "metabolitos de ácido araquidónico". Os "compostos relacionados com as prostaglandinas", por ex., leucotrienos, tromboxanos, lipoxinas e prostaciclinas, incluem aqueles compostos que se encontram funcionalmente relacionados com as prostaglandinas e os quais também podem ser derivados a partir dos ácidos gordos essenciais de vinte carbonos precursores das prostaglandinas. As prostaglandinas, os compostos relacionados com as prostaglandinas e os eicosanóides, bem como os análogos estruturais os quais podem ser convertidos nos referidos compostos, também são "metabolitos de ácido araquidónico". Preferencialmente, o metabolito de ácido araquidónico administrado a animais de acordo com a prática deste invento é uma prostaglandina, mais preferencialmente, uma prostaglandina das séries E ou I, e o mais preferencialmente, a prostaglandina E·,. A "associação" de um metabolito de ácido araquidónico com um lipossoma geralmente significa que o metabolito se encontra encarcerado no compartimento aquoso do lipossoma, ou que se encontra associado com a monocamada interior ou exterior da camada dupla do lipossoma, por exemplo por meio de interacções electrostáticas entre o metabolito e os grupos de cabeça dos lípidos anfipáticos componentes da monocamada. Um método preferido para a formação das formulações lipossómicas unilamelares deste invento é a associação do metabolito com o lípido em etanol de forma semelhante à técnica de Batzri et a!., Biochim. et Biophys. Acta., 298:1015 (1973) utilizando um gradiente de concentrações transmembranares tal como descrito em Baliy et ai (Patente dos E.U.A. N°. 5 077 056). Nesta técnica, o lípido e a prostaglandina são co-dissolvidos num solvente orgânico miscível com água tal como o etanol, sendo em seguida lentamente adicionados a uma primeira solução aquosa. Facultativamente, um conservante, tal como hidroxitolueno butilado (BHT), pode ser misturado com o lípido na solução.

83 691 ·“ ΕΡ Ο 726 763/ΡΤ 10 A dispersão de lipossomas resultante pode ser reduzida em dimensão para uma população mais homogénea, por exemplo, por extrusão através de um filtro, preferencialmente com um tamanho de poro de 100 nm, sendo o filtro do tipo de passagem rectilínea ou de passagem tortuosa. Um filtro preferido para utilização neste processo é uma película porosa de óxido de alumínio como os filtros Anopore™ fabricados por Anotec Separations. Uma tal população de lipossomas pode ser formada pelos processos de extrusão da Patente dos E.U.A. N°. 5 008 050. Os referidos processos de extrusão, em que os lipossomas são passados através de um filtro sob pressão, permitem a formação de populações homogéneas de lipossomas relativamente às dimensões. Quando os lipossomas são passados mais do que uma vez através do filtro, o número de passagens requerido será determinado por aquele que é necessário para obter a dimensão desejada do lipossoma.

Os tamanhos dos filtros utilizados no invento são escolhidos de acordo com a dimensão desejada do produto lipossómico final. No presente invento, são preferidos os lipossomas que apresentam um diâmetro médio inferior a 200 nm. O lipossoma individual utilizado neste invento tem preferencialmente menos de 500 nm de diâmetro. Mais preferencialmente, o lipossoma apresenta um diâmetro de cerca de 100 nm, dado que se sabe que, duma forma geral, os lipossomas com estas dimensões passam através do leito capilar do pulmão e consequentemente são capazes de passar através dos outros órgãos e tecidos. Por conseguinte, um filtro apresentando um tamanho de poro de cerca de 100 nm é preferencialmente escolhido para utilização no passo de extrusão. Os lipossomas de dimensão reduzida também podem ser filtrados de forma estéril, tal como por passagem através de um filtro Millipak de 220 nm (Millipore, Inc., Bedford, MA). O lipossoma unilamelar utilizado no método deste invento compreende o metabolito, um lípido e um tampão aquoso inibitório da libertação. O lípido preferencialmente aumenta a intensidade das interacções metabolito-lípido, e por conseguinte, inibe a libertação do metabolito a partir do lipossoma. Os referidos lípidos são "lípidos inibitórios da libertação". Os factores baseados em lípidos que tendem a aumentar a intensidade das interacções prostaglandina-lípido incluem, mas não se encontram limitados àqueles factores que tendem a tornar as camadas duplas lipídicas menos permeáveis à água e a outras

83 691 " ΕΡ Ο 726 763/ΡΤ 11 moléculas pequenas, por ex., aqueles factores que tendem a aumentar as interacções de Van der Waals, dipolo-dipolo e outras interacções entre cadeias acilo e, consequentemente, fazem com que as cadeias acilo se comprimam mais próximas umas das outras na camada dupla. Por exemplo, o número de ligações duplas nas cadeias acilo da camada dupla podem afectar o arranjo das cadeias umas em relação às outras na camada dupla. Quanto menor o número de ligações duplas, mais provável é que as cadeias acilo se comprimam mais próximas umas das outras, e por conseguinte, representem mais provavelmente uma barreira para uma prostaglandina transitando na camada dupla. Assim, os lípidos preferidos possuem cadeias acilo saturadas. O lípido preferido com cadeias acilo saturadas é a dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC). No entanto, também podem ser utilizados outros lípidos de cadeia saturada.

Os tampões aquosos nos lipossomas também podem inibir ou prevenir a libertação de um metabolito de ácido araquidónico associado a um lipossoma. Os referidos tampões aquosos são "tampões aquosos inibitórios da libertação". As características dos tampões inibitórios da libertação preferidos incluem, mas não se encontram limitadas à capacidade de estabelecer repulsões electrostáticas com os metabolitos ou de incrementar as interacções metabolito-lípido. Além disso, os tampões com uma capacidade tamponante mais elevada, e consequentemente uma maior capacidade para manter o pH desejado, serão melhores tampões inibitórios da libertação. Os tampões inibitórios da libertação preferidos são os tampões de ácido cítrico, particularmente aqueles tampões cítricos que apresentam um pH de cerca de 4,5. O método deste invento pode ser utilizado para administrar um metabolito de ácido araquidónico a um animal afectado com uma desordem caracterizada por activação e adesão celulares, inflamação e/ou toxemia, entre outras indicações. O método compreende a administração ao animal de uma quantidade do lipossoma compreendendo uma quantidade eficaz anti-desordem do metabolito. Desordens tratáveis de acordo com a prática deste invento incluem, sem limitação: lesão de reperfusão, síndrome de resposta inflamatória sistémica (SRIS), síndrome de dificuldade respiratória do adulto (SDRA), enfarte de miocárdio, vasculite, lesão por queimadura, choque após traumático, desordens vaso-oclusivas, desordens artríticas, tais como artrite reumatóide, gota e artrite por filária, e desordens auto-imunes, tais como lúpus eritematoso

83 691 ΕΡ Ο 726 763/ΡΤ 12 sistémico, diabetes juvenil, esclerose múltipla e tiroidite de Hashimoto.

Algumas desordens são caracterizadas pela activação anormal de células, por ex., de plaquetas e neutrófilos, no sangue, e pela subsequente adesão destas células umas às outras ou às células activadas no endotélio vascular circundante. As referidas desordens da activação e adesão celulares representam um problema significativo numa ampla variedade de patologias médicas. As células endoteliais, por exemplo as células endoteliais vasculares, pleurais, pericárdicas ou abdominais, podem ser activadas por citóquinas, por ex., interleucina-1 (IL-1), factor alfa de necrose tumoral (TNF-alfa) ou endotoxinas bacterianas. De forma semelhante, as células sanguíneas, particularmente os neutrófilos e as plaquetas, podem ser activadas por agentes tais como GM-CSF, endotoxinas bacterianas, agentes de quimio-atracção bacterianos, TNF-alfa e o componente C5a do complemento.

As células activadas possuem locais de adesão nas suas superfícies por meio dos quais podem aderir umas às outras. As células activadas e aderidas podem formar aglomerados, os quais podem bloquear pequenos vasos sanguíneos tais como aqueles encontrados nos pulmões e no coração, e desse modo reduzir o fluxo sanguíneo para o tecido circundante. As células activadas também podem aderir às células endoteliais vasculares activadas; a referida adesão pode conduzir à subsequente desgranulação do endotélio vascular, ou à libertação de mediadores de lesão celular, como o anião superóxido (02 ) e enzimas proteolíticas.

Entre as desordens de activação e adesão celulares para as quais o presente invento é dirigido encontram-se as desordens por reperfusão, tais como aquelas relacionadas com a reperfusão de vasos sanguíneos oclusos, ou subsequentes a cirurgia na qual o fluxo sanguíneo é temporariamente interrompido (ver, por ex., Seewaldt-Becker et al., "Effect of Anti-Adhesive Antibodies on Reperfusion Injury", (Springer et a/., ed.) em: Leukocvte Adhesion Molecules. Springer-Verlag, Nova Iorque (1990), pág. 138-148; e "Adhesion in Disease and Therapy" , (Springer et aí., ed.), em: Leukocvte Adhesion Molecules. Springer-Verlag, Nova Iorque (1990), pág. 85-156). Quando existe um bloqueio num vaso sanguíneo, as células endoteliais circundantes, bem como o tecido isquémico a jusante, podem ser lesados. Pode ainda ocorrer lesão 13 83 691 ΕΡ Ο 726 763/ΡΤ adicional das células endoteliais próximas quando a oclusão é removida. As referidas células lesadas podem por seu lado induzir activação em neutrófilos e plaquetas após o restabelecimento do fluxo sanguíneo para as áreas afectadas.

As mesmas células que se tornam activadas e subsequentemente são submetidas a adesão intracelular também podem possuir receptores de superfície para os metabolitos de ácido araquidónico. Sem pretender ser limitado pela teoria, acredita-se que o tratamento com metabolitos de ácido araquidónico, por ligação a estes receptores, pode reduzir a lesão associada à activação e à adesão celulares por desactivação dos receptores da superfície celular responsáveis pelos níveis elevados de adesão intercelular.

Verificou-se que a PGE-, e a PGI2 (ver, Jugdutt et a!., "Dissimilacts of Prostacycn, Prostaglandin E Prostaglandin Myocardial Infarct ze after Coronarusion in Conscious", Circulation CH, 49(3):685-700 981) apresentam efeito limitado na redução da dimensão do enfarte em cães, os quais foram reperfundidos após simulação de um enfarte do miocárdio por colocação de um laço oclusor em redor da artéria coronária. Nos testes relatados, a prostaglandina foi administrada por meio de infusão arterial contínua ao longo de um período de seis horas, resultando na administração de uma dose relativamente grande da droga. Acredita-se que a necessidade desta infusão contínua seja por as prostaglandinas livres, isto é, não lipossómicas, como a PGEt, apresentarem uma semivida extremamente curta in vivo, e terem de ser continuamente reabastecidas a fim de manter um nível eficaz no sangue. Além disso, crê-se que a prostaglandina é rapidamente inactivada quando o sangue passa através dos pulmões, o que implica a necessidade da infusão arterial em vez de uma administração endovenosa mais simples. Adicionalmente, sabe-se que a distribuição de níveis elevados de PGEt in vivo induz efeitos sistémicos tais como hipotensão, taquicardia e diarreia.

Quando os doentes são submetidos a insultos que podem conduzir a SDRA, tais como, traumatismo, queimaduras, sépsia, aspiração e hiperoxemia, podem ser afectados muitos órgãos no organismo para além dos pulmões. As causas e os desenvolvimentos clínicos desta condição podem variar amplamente. Por exemplo, no caso de um doente com uma infecção grave, a endotoxina é libertada a partir das paredes celulares bacterianas, a cascata

83 691 • ΕΡ Ο 726 763/ΡΤ 14 inflamatória é iniciada, conduzindo ao choque séptico. Novamente, como o síndrome de sépsia/traumatismo não se encontra limitada na causalidade às infecções, é possível que nenhuma endotoxina se encontre envolvida, mas não obstante, é despoletada a libertação de factores como TNF, IL-1, complemento e leucotrienos. A angioplastia é uma técnica pela qual um balão é inserido numa artéria oclusa e insuflado a fim de abrir os vasos sanguíneos bloqueados. Embora esta técnica se tenha tornado verdadeiramente rotineira na gestão da doença arterial coronária, no período de seis meses após o procedimento, mais de 33% dos doentes tratados sofrem estenose recidiva, ou reoclusão do vaso sanguíneo anteriormente desobstruído. Pensa-se que esta condição se inicia com a lesão do endotélio vascular a qual, muitas vezes, resulta do procedimento com o balão. A matriz extracelular exposta ligar-se-á rapidamente a diversas camadas de plaquetas activadas. Uma vez as plaquetas ligadas, elas libertarão uma diversidade de factores de crescimento os quais terão como consequência a proliferação de células do músculo liso subjacente ao vaso no ponto onde o vaso sofre de reoclusão. Ao impedir que as plaquetas se liguem à matriz extracelular, pode quebrar-se a cascata de acontecimentos que resulta na estenose recidiva. Assim, a administração aguda no momento do procedimento de angioplastia de uma droga que impeça a adesão de plaquetas pode prevenir a estenose recidiva.

Recentemente, De Servi et a/., European Heart Journal, "Prostaglandin E administration in unstable angina patients undergoing PTCA; preliminary results", Agosto de 1990, publicaram os resultados de um ensaio clínico em doentes com angina instável aos quais foi administrada uma infusão intracoronária de PGEt antes e após a angioplastia. A droga foi infundida durante um período de 24 horas. Os resultados deste estudo mostraram que a taxa de estenose recidiva seis meses após a angioplastia no grupo tratado com PGEi foi reduzida em quase 50% em comparação com o grupo de controlo não tratado, embora o tratamento com a PGEt apenas tenha durado 24 horas. O enfarte agudo de miocárdio (mais comummente designado como ataque cardíaco) refere-se a um bloqueio do fornecimento sanguíneo para os músculos do coração, habitualmente causado por um coágulo sanguíneo. Se o sangue é impedido de alcançar o coração durante um período de tempo 1«, 1«,

83 691 ΕΡ Ο 726 763/ΡΤ 1 5 demasiado longo, ο doente morrerá. Quando ocorre uma oclusão da artéria coronária, o doente ou é tratado com um agente fibrinolítico, tal como activador do plasminogénio tissular (tPA) ou estreptoquinase, a fim de dissolver o coágulo, ou o bloqueio pode resolver-se por si só. Em ambos os casos, o fluxo sanguíneo é retomado para a região isquémica (privada de oxigénio) do coração. Esta recirculação de sangue para o coração é chamada reperfusão. Embora a reperfusão seja necessária para salvar a vida do doente, ela ocasiona lesão adicional do músculo cardíaco denominada lesão por reperfusão. A lesão de reperfusão é reconhecida como sendo o resultado final da cascata inflamatória.

Para além do problema da lesão por reperfusão no seguimento da remoção do coágulo, os doentes que sofrem de um enfarte de miocárdio podem sofrer de outros problemas secundários. Por exemplo, depois do fluxo sanguíneo normal para o coração ter sido restabelecido, quer os neutrófilos quer as plaquetas são activados. As plaquetas activadas frequentemente aderem umas às outras e começam a reocluir a artéria coronária, originando uma situação em que a taxa de sangue que flui para o coração diminui ao longo do tempo. Em alguns casos, ocorrerá a reoclusão completa. A PGEt, para além de prevenir a ligação dos neutrófilos às células endoteliais, previne a agregação plaquetária e reduz, se não mesmo elimina, o fenómeno de não recirculação.

Sharma et a/., The American Journal of Cardiology, "Intracoronary Prostaglandin Et Plus Streptokinase in Acute Myocardial Infarction", página 1161, Dezembro 1986, vol. 58, verificou, num cenário clínico de enfarte agudo do miocárdio, que a administração de PGEt livre por infusão intracoronária lenta em conjunto com estreptoquinase intracoronária proporciona resultados clínicos positivos quando comparados com um grupo de controlo ao qual apenas é administrada estreptoquinase intracoronária. Os resultados mostravam um tempo até reperfusão diminuído, dose de estreptoquinase necessária reduzida, percentagem de vasos patentes após 10 dias aumentada, e fracções de ejecção mais elevadas. As desvantagens deste estudo são que a droga deve ser administrada por infusão intracoronária lenta a qual é incómoda e requer instalações especializadas e pessoal altamente treinado. Esta abordagem também exige uma titulação cuidadosa da dose de PGEt de modo a poderem ser observadas descidas significativas na pressão sanguínea.

83 691 • ΕΡ Ο 726 763/ΡΤ 16 A inflamação é um processo de reacções citológicas e histológicas que ocorrem nos vasos sanguíneos afectados, e nos tecidos circundantes, em resposta a uma lesão (ver, por ex., Stedman's Medicai Dictionarv (lllustrated) (24a. edição, J. V. Basmajian et a!., ed.), Williams e Wilkins, Baltimore, MD (1982), pág. 707-708). As respostas inflamatórias aos referidos estímulos incluem as reacções locais e as modificações morfológicas resultantes, a destruição ou remoção de materiais prejudiciais e a activação dos mecanismos de reparação. Assim, a inflamação pode ser um componente do processo pelo qual os animais se curam a si próprios.

No entanto, a inflamação também pode ocorrer em resposta a estímulos fisiológicos anormais e pode ocasionar problemas no organismo. As articulações, por exemplo, ficam inflamadas em condições artríticas tais como a gota, a artrite por filária, a artrite reumatóide e a doença de Lyme (ver, por ex., Stedman's Medicai Dictionarv (lllustrated). supra às páginas 123-124). Estes estados podem ser caracterizados pela extravasão de células, isto é, a saída de células a partir da circulação para a área inflamada. Agentes, tais como as prostaglandinas, os quais podem inibir a referida extravasão, ou os quais podem doutro modo inibir as respostas inflamatórias a estímulos fisiológicos anormais, podem ser utilizados para melhorar a inflamação. A toxemia é a manifestação clínica observada no decorrer de infecções por agentes infecciosos, por ex., micróbios os quais contêm toxinas e outras substâncias venenosas para os animais hospedeiros. Por exemplo, durante infecções por certas bactérias gram-negativas tais como E. Coli. um lipopolissacárido (LPS) é libertado a partir da parede celular à medida que ela é quebrada. O LPS pode então induzir a morte de células no animal hospedeiro. As condições toxémicas ocorrem em animais nos quais toxinas tais como o LPS são tornadas disponíveis, isto é, em condições sépticas, ou em condições de doença sistémica causada pela multiplicação de microorganismos na circulação (ver, por ex., Stedman's Medicai Dictionarv (lllustrated). supra nas páginas 1274-1275 e 1464). A toxemia também pode resultar da exposição do animal a estímulos traumáticos, por ex., a traumatismo físico ou químico.

As "desordens auto-imunes" tais como o lúpus eritematoso sistémico, a diabetes juvenil, a esclerose múltipla e a tiroidite de Hashimoto, são

83 691 ΕΡ Ο 726 763/ΡΤ 17 caracterizadas por um sistema imunitário de um animal que ataca os seus próprios tecidos.

Quantidades "eficazes anti-desordem" de um metabolito de ácido araquidónico são quaisquer quantidades eficazes para melhorar, inibir ou prevenir a activação e adesão celulares, a inflamação, a toxemia, ou outra indicação associada com a desordem a ser tratada de acordo com o método deste invento. Tipicamente, a quantidade eficaz do metabolito compreende pelo menos cerca de 10' g do metabolito por kg de peso corporal do animal, e desejavelmente, de cerca de 10'12 g por kg a cerca de 10'3 g/kg. Mais desejavelmente, a quantidade eficaz do metabolito compreende de cerca de 10'8 g por kg de peso corporal a cerca de 10'4 g por kg. O mais desejavelmente, a quantidade eficaz compreende cerca de 10'6 g do metabolito de ácido araquidónico por kg de peso corporal do animal.

De uma forma geral, é necessária uma dosagem significativamente mais baixa do metabolito lipossómico, em comparação com uma dosagem do metabolito livre, a fim de obter o efeito desejado. Tal como anteriormente discutido, devido ao rápido metabolismo das prostaglandinas livres in vivo, infusões contínuas longas de doses relativamente elevadas destas drogas têm sido necessárias para manter um nível sanguíneo eficaz no doente em tratamento. No entanto, a hipotensão, a taquicardia e a diarreia causadas pelos níveis sanguíneos elevados de prostaglandinas limitam as quantidades de prostaglandinas livres que podem ser administradas. Além disso, o elevado custo das prostaglandinas torna proibitivamente dispendiosa a administração de tão elevadas dosagens. O método do presente invento proporciona a administração eficaz dos metabolitos de ácido araquidónico a custo reduzido e com efeitos colaterais reduzidos. O tratamento com metabolito de ácido araquidónico, por ex., prostaglandina, pode reduzir o dano exibido nos animais afectados com desordens caracterizadas por activação e adesão celulares, toxemia, inflamação e outras indicações. As mesmas células que possuem receptores para os agentes activadores celulares também podem possuir receptores de superfície para os metabolitos. Crê-se que, quando os metabolitos se ligam aos seus receptores, eles podem desactivar os receptores de superfície responsáveis 18 83 691 ΕΡ Ο 726 763/ΡΤ pelos níveis elevados de adesão intercelular. Acredita-se que o mecanismo para esta desactivação seja um aumento nos níveis de AMPc intracelular mediado pela proteína-quinase A instigada pela interacção metabolito/receptor. Sem a ligação célula-célula, cofactores tais como 02 e diversas enzimas degradativas não podem ser libertadas, e a lesão tissular é eliminada.

Demonstrou-se que a PGE, é um potente inibidor da agregação quer de neutrófilos quer de plaquetas, bem como da ligação destas células às células endoteliais activadas. Também se acredita que os metabolitos de ácido araquidónico tais como a PGEt possuem a capacidade quer de prevenir a inflamação quer de a "desligar" uma vez iniciada. Verificou-se que a libertação extracelular pelos neutrófilos de mediadores da inflamação pode ser modulada pela elevação ou deplecção de reservas intracelulares de adenosina-monofosfato cíclico (AMPc).

Verificou-se que a libertação extracelular de mediadores da inflamação pelos neutrófilos pode ser modulada pela elevação ou deplecção de reservas intracelulares de adenosina-monofosfato cíclico (AMPc) e de guanosina-monofosfato cíclico (GMPc). A elevação de AMPc reduz a libertação de mediadores da inflamação enquanto que aumentos nos níveis de GMPc incrementam a excreção daqueles mediadores. O AMPc é por vezes designado como o "interruptor universal" dado que o aumento dos níveis intracelulares de AMPc pode "desligar" a inflamação, independentemente do factor que inicialmente a "ligou". Notavelmente, algumas prostaglandinas tais como a PGEt elevam o AMPc, proporcionando desse modo o fundamento lógico para a utilização da PGE, como um agente anti-inflamatório. A PGEt pode ser considerada como um agente que pode activar o "interruptor universal". Foi agora demonstrado in vitro que a PGE, inibe a ligação dos neutrófilos e das plaquetas a si próprios, bem como às células endoteliais, por impedir a activação dos receptores necessários à mediação da adesão célula-célula. Esta inibição é coincidente com a elevação do AMPc intracelular. Sem a ligação célula-célula, cofactores tais como 02 e diversas enzimas degradativas não podem ser libertadas, e a lesão tissular é eliminada. Por conseguinte, a PGE! actua na realidade como um potente agente anti-inflamatório. Pode impedir a inflamação ou "desligá-la", independentemente de o factor mediador ser IL-1, TNF, complemento, leucotrienos ou outros. 19 83 691 ΕΡ Ο 726 763/ΡΤ

Os lipossomas podem ser veículos particularmente vantajosos na distribuição das prostaglandinas nos seus locais de acção pretendidos. Sem estar cingido a uma teoria ou mecanismo particulares, acredita-se que os lipossomas são atraídos para as células activadas e aderem às superfícies activadas. A prostaglandina encontra-se então prontamente disponível no local da lesão para distribuir a sua acção anti-adesão celular. Uma teoria para a atracção dos lipossomas para a adesão às células activadas é que os lipossomas são opsonizados por fibronectina e vitronectina no sangue. A opsonização é o processo pelo qual as bactérias são alteradas de modo que sejam mais prontamente e eficientemente englobadas pelos fagócitos. Assim, os lipossomas opsonizados seriam mais prontamente atraídos para os neutrófilos activados os quais expressam receptores para a fibronectina e a vitronectina, desse modo distribuindo a prostaglandina associada pelos locais afectados.

As formulações lipossómicas de metabolitos de ácido araquidónico, nas quais o metabolito se encontra associado com o lipossoma por meio de um gradiente de pH através da camada dupla lipídica do lipossoma, podem ser terapeuticamente úteis. As formulações lipossómicas que possuem um tampão aquoso ácido interno, tal como um tampão de ácido cítrico, particularmente um tampão de ácido cítrico com pH de 4,5, são preferidas para o estabelecimento de gradientes de pH através da camada dupla. Os metabolitos de ácido araquidónico associados aos lipossomas pelos referidos gradientes tendem a permanecer associados ao lipossoma contando que o gradiente de pH seja mantido. No entanto, quando o gradiente decai nos organismos dos animais aos quais o lipossoma foi administrado, e o pH interno consequentemente aumenta, os metabolitos de ácido araquidónico geralmente ficam não associados ao lipossoma. O metabolito é então mais provavelmente, do que quando se encontrava associado ao lipossoma, capaz de interagir com os receptores de superfície correspondentes sobre células, tais como neutrófilos, que ficam activadas e que subsequentemente são submetidas a adesão intercelular.

Os lipossomas unilamelares utilizados em acordo com a prática deste invento podem compreender um protector da secagem, o qual é em geral um composto hidrófilo, tal como um sacárido, ureia, dextrano, albumina ou poli(álcool vinílico), capaz de impedir o rearranjo dos lípidos nos lipossomas, de

83 691 ' ΕΡ Ο 726 763/ΡΤ 20 modo que, quando os lipossomas são reconstituídos depois da desidratação, uma porção substancial do conteúdo originalmente encarcerado nos lipossomas permanece nesse lugar. Os protectores da secagem são geralmente fortes aceitadores de ligação de hidrogénio, e tipicamente possuem características estereoquímicas favoráveis para a conservação do espaçamento intramolecular dos constituintes da camada dupla. Os sacáridos, tais como manose, galactose, tre-halose, rafinose, maltose, sacarose, lactose ou dextrose, são os protectores da secagem preferidos. A maltose é particularmente preferida.

Os sacáridos são tipicamente utilizados como protectores da secagem numa concentração de cerca de 5 a cerca de 20 por cento, preferencialmente a cerca de 10 por cento em peso da fase aquosa utilizada na preparação dos lipossomas. O manitol pode ser utilizado em conjunto com qualquer um dos sacáridos, mas verificou-se surpreendentemente que quando é utilizado sozinho, o manitol não é bem sucedido na manutenção do tamanho do lipossoma. O manitol pode ser utilizado em combinação com os sacáridos numa concentração a cerca de 0-2%, preferencialmente numa concentração a 1%. A concentração total de sacárido utilizado varia de cerca de 5% a cerca de 20%, preferencialmente 10% a 12%, o mais preferencialmente a cerca de 10%. Também podem ser incluídos conservantes adicionais nas formulações, tais como BHT ou EDTA a, por exemplo, 5 mg de BHT por ml de etanol e, por exemplo, EDTA a 0,01 % em dextrose a 10%. A desidratação lipossómica permite que os lipossomas sejam armazenados durante períodos de tempo prolongados; eles podem em seguida ser reconstituídos com base na necessidade da sua administração a indivíduos. A desidratação é preferencialmente levada a cabo utilizando um protector da secagem em conexão com os lipossomas, de acordo com os procedimentos de Schneider et a/. (Patente dos E.U.A. N°. 4 229 360) e Janoff et al. (Patente dos E.U.A. N°. 4 880 635); cujos conteúdos são aqui incorporados por referência. Alternativamente, o protector da secagem pode ser omitido se a desidratação for conduzida sem prévia congelação e se for deixada ficar água suficiente na preparação lipossómica para manter a integridade de uma porção substancial das camadas duplas lipossómicas ao longo do processo de desidratação/re-hidratação.

83 691 ΕΡ Ο 726 763/ΡΤ 21

As formulações lipossómicas de prostaglandina liofilizadas podem ser estáveis durante pelo menos um ano, quando armazenadas a 6°C ou 25°C. Acredita-se que a inserção do metabolito de ácido araquidónico na membrana do lipossoma, seguida pela liofilização, escude o metabolito da água, e desse modo iniba a hidrólise. Os estudos de estabilidade da formulação utilizando a análise por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) mostraram que após armazenamento a 6°C durante um ano, não se encontravam presentes quaisquer produtos de degradação da PGE,. Quando se pretendem utilizar os lipossomas liofilizados, a re-hidratação é levada a cabo pela adição aos lipossomas de uma solução aquosa, por ex., água destilada, água para injecção (WFI), ou uma solução tamponada ou aquosa de pH apropriado, tal como anteriormente descrito. Os lipossomas podem ser ressuspensos na solução aquosa por mistura suave. A re-hidratação pode ser executada a cerca de 25 graus C. O método deste invento pode compreender a administração de um agente bioactivo adicional ao animal, isto é, um agente bioactivo para além do metabolito de ácido araquidónico ao qual o lipossoma se encontra associado. "Agente bioactivo" tal como aqui utilizado designa qualquer composto ou composição de matéria que possa ser administrado a animais. Estes incluem agentes que apresentem actividade biológica nos animais, bem como aqueles que são úteis para imageologia ou para outras formas de diagnóstico. Os agentes bioactivos incluem, mas não se encontram limitados a: compostos antivirais, antibacterianos, antifúngicos, antiparasíticos, antimetabólicos, antiglaucomatosos, anti-inflamatórios ou antineoplásicos, esteróis, hidratos de carbono, aminoácidos, péptidos, proteínas, imunoglobulinas, imunomoduladores, corantes, toxinas, enzimas, hormonas, neurotransmissores, glicoproteínas, radiomarcadores, compostos radio-opacos, compostos fluorescentes, proteínas de receptores celulares, ligandos de receptores celulares, compostos midriáticos, broncodilatadores, anestésicos locais, agentes promotores do crescimento, agentes regenerativos e similares. Os agentes bioactivos adicionais são seleccionados para indicações particulares de acordo com critérios, por exemplo, a necessidade de tratamento de outras condições que afectem o animal, bem conhecidas dos peritos na arte aos quais se destinam os ensinamentos deste invento. O agente bioactivo adicional pode ser um metabolito de ácido araquidónico adicional. 22 83 691 ΕΡ Ο 726 763/ΡΤ

Este invento encontra-se nriais completamente descrito nos Exemplos seguintes. No entanto, os peritos na arte compreenderão prontamente que estes exemplos são meramente ilustrativos do invento tal como está descrito nas reivindicações que se seguem posteriormente.

EXEMPLOS EXEMPLO 1

Preparação lipossómica

Um lote de 1500 ml de PGEt lipossómica foi preparado a partir dos seguintes componentes:

Ingrediente: Por 1 500 ml Por ml Fosfatidilcolina de ovo (EPC) 7,06 g 4,4 mg Mono-hidrato de maltose 1 50,0 g 100 mg Etanol (anidro) 8,38 ml 0,00558 ml Hidroxitolueno butilado (BHT) 45 mg 0,03 mg PGEt 1 5 mg 0,01 mg Água para injecção, USP qs 1 500ml

Preparação: 1350 ml de água para injecção foram adicionados a um copo e foi montada uma aspersão de azoto que e manteve durante pelo menos 30 minutos. Os 150 g de maltose (J.T. Baker, Phillipsburg NJ) foram adicionados à água e misturados até à sua dissolução, com continuação da aspersão de azoto. Isto produziu 1440 ml de mistura a um pH de 4,81.

Num outro copo, os 7,06 g de fosfatidilcolina de ovo (EPC) (Nippon Oil and Fats, Hyogo, Japão) foram combinados com 6 ml de etanol (anidro) e misturados até à sua dissolução, e os 45 mg de BHT foram adicionados e misturados até à sua dissolução. A esta mistura, foram adicionados os 15 mg de PGEt e misturados até à sua dissolução, sendo os restantes 2,37 ml de etanol utilizados para lavar para a mistura qualquer PGEt que tivesse permanecido no recipiente utilizado para a pesagem. A solução em etanol foi retirada para uma seringa de vidro com

83 691 ' ΕΡ Ο 726 763/ΡΤ 23 capacidade de 10 ml e injectada através de uma cânula de calibre 14, lentamente, ao longo de um período de 11 minutos, para uma solução de maltose com mistura rápida e aspersão de azoto continuada. Depois da adição da mistura de etanol/lípido, a solução tornou-se turva, indicativo da formação de lipossomas. A suspensão foi de seguida diluída até um volume final de 1500 ml com a água para injecção restante. A dispersão lipossómica foi de seguida extrudida 3 vezes através de um filtro do tipo passagem linear de policarbonato Nucleopore® com tamanho de poro de 0,2 pm (Nuclepore, Pleasanton CA), seguida por 5 extrusões através de um filtro de 0,1 μιτι correspondente. O tamanho de partícula dos lipossomas resultantes foi determinado como sendo de 0,169 μιτι (S. D. 0,041 μηι), utilizando difusão de luz quasi-eléctrica (QELS) (Nicomp Particle Sizer). A dispersão lipossómica dimensionada foi de seguida passada através de um filtro de esterilização Millipak de 0,22 μιτι. Finalmente, alíquotas de 10,5 ml da dispersão foram colocadas dentro de frascos e liofilizadas de acordo com os processos expostos no Exemplo 2 a fim de formar um produto liofilizado, o qual pode ser imediatamente utilizado ou armazenado para utilização futura. O produto liofilizado foi re-hidratado com 10 ml de tampão acetato 0,01 M (pH 4,3), com a suspensão resultante apresentando pH de cerca de 4,3. O encarceramento da PGEt nos lipossomas foi determinado por HPLC, e verificou-se que pelo menos 98 por cento da PGEt disponível se encontrava encarcerada nos lipossomas, numa concentração de cerca de 9,0 microgramas de PGEt por ml de suspensão re-hidratada.

Processo de liofilizacão

Frascos de liofilizacão Flint com capacidade de 50 ml, com rolha de borracha butilada, e topo fendido, foram cheios com 10,5 ml de lipossomas suspensos em solução aquosa contendo PGEt. Estes frascos foram colocados sobre prateleiras no liofilizador (PV-24 Stokes Lyophilizer). Os frascos foram mantidos a 0°C durante 1,5 horas. A temperatura em prateleira foi de seguida diminuída até -45°C a um ritmo de 0,8°C por minuto, e mantida durante 1 hora, após o que foi aplicado um vácuo de 100 μιτι de Hg. A temperatura em prateleira foi de seguida aumentada até -28°C a um ritmo de 0,5°C por minuto, enquanto era mantido o vácuo a 100 micrómetros de Hg. 24 83 691 ΕΡ Ο 726 763/ΡΤ

Os frascos foram mantidos a -28°C durante 50 horas sob vácuo de 100 μηη de Hg. A temperatura em prateleira foi de seguida aumentada até +25°C a um ritmo de 0,5°C/min e mantida durante 22 horas. Os frascos foram de seguida rolhados sob vácuo parcial.

Enfarte Aaudo de Miocárdio / Teste in vivo da PGE^ lipossómica

Os lipossomas re-hidratados do Exemplo 1 foram testados in vivo como um meio de redução da lesão de reperfusão subsequente ao tratamento do enfarte do miocárdio resultante de vasos sanguíneos oclusos. Um total de 53 cães de 25-35 kg condicionados foram estudados nos ensaios de selecção da dose e no estudo do enfarte. Foram excluídos cães da análise pelas seguintes razões: colateralização extensa em relação à zona do enfarte (4), vermes cardíacos na necropsia (1) e paragem cardíaca durante a oclusão (1). Sobreviveram quarenta cães dos quais 27 foram considerados adequados para a análise; 7 cães em cada um dos grupos de controlo, da PGEt lipossómica (LUV-PGEt) e de controlo dos lipossomas (lipossomas vazios ou "simples"), e 6 cães no grupo de controlo da PGEt (PGEt livre).

Primeiro, foram conduzidos ensaios de selecção da dose a fim de determinar uma dosagem adequada para utilização nos estudos de enfarte de miocárdio. Foram administradas doses crescentes de PGEt lipossómica enquanto eram medidos a frequência cardíaca, a tensão arterial média, o débito cardíaco e a pressão capilar pulmonar em cunha. Também foram recolhidas amostras de sangue a intervalos para estudos da agregação plaquetária (Figura 1). Doses superiores a 2,0 pg/kg administradas como um bólus ao longo de 10 a 20 minutos produziram uma taquicardia marcada e hipotensão transitória com um aumento significativo (duplo) do débito cardíaco. A agregação plaquetária foi parcialmente inibida a 0,1 pg/kg e totalmente inibida a 0,6 pg/kg. Uma dose de 0,5 pg/kg administrada ao longo de 10 minutos pareceu aumentar a frequência cardíaca e o débito cardíaco apenas de forma ligeira. A fim de optimizar os resultados potenciais, foi decidido fornecer duas doses de PGE-| lipossómica de 0,5 pg/kg cada. Uma injecção foi administrada imediatamente após a oclusão da artéria relacionada com o enfarte e a outra imediatamente antes da reperfusão. O regime deverá assegurar um efeito ao longo de todo o período de isquemia e no período inicial de reperfusão. O efeito da PGE, lipossómica pareceu persistir 25 83 691 ΕΡ Ο 726 763/ΡΤ durante algum tempo depois da administração. Esta observação é significativa para a reoclusão após reperfusão e para a estenose recidiva no seguimento de angioplastia os quais se encontram directamente relacionados com a agregação plaquetária e aderência às células endoteliais e à matriz extracelular.

Foram estudados os efeitos da PGEt lipossómica, da PGEt livre, de lipossomas vazios e um grupo de controlo sobre a frequência cardíaca. Os cães testados foram anestesiados com pentobarbital sódico e mantidos com pentobarbital e Inovar ® (droperidol/fentanil) endovenosos. A oclusão arterial foi simulada por ligação da artéria aorta descendente esquerda. Dez minutos depois da oclusão, foram administrados por via endovenosa 0,5 pg/kg de PGEt ligada a lipossomas ao longo de dez minutos a um primeiro grupo de cães, com um segundo grupo de animais de controlo mantidos sem tratamento. A infusão lipossómica mostrou tendência para causar um aumento na frequência cardíaca o qual foi neutralizado, em parte, pela administração de pequenas quantidades de Inovar adicional. Os testes não mostraram diferenças importantes na frequência cardíaca ao longo de toda a experiência entre os animais de controlo e os animais tratados. Cem minutos após a oclusão, foi administrada uma segunda dose de 0,5 μg/kg ao longo de dez minutos. Após 2 horas, a ligadura foi removida, ocasionando uma reperfusão aguda do vaso sanguíneo. Duas horas depois, o cão foi submetido a eutanásia, e o coração foi examinado quanto a lesão por enfarte do miocárdio. Os resultados encontram-se resumidos na Figura 2. O grupo que recebeu a PGEt livre exibiu uma subida significativa na frequência cardíaca depois da dosagem inicial e que persistiu até à reperfusão. Esta subida não foi notada em nenhum dos 3 restantes grupos de animais.. Esta subida foi atribuída a taquicardia compensatória devida a vasodilatação.

Um total de sete cães foram incluídos no grupo de controlo, e sete cães foram tratados com ΡΰΕ, lipossómica. Durante o período de teste, a pressão aórtica média permaneceu relativamente constante, e não existiu diferença significativa entre os grupos de controlo e tratado. A pressão arterial esquerda média aumentou em cada grupo depois da oclusão, mas não surgiram diferenças significativas entre os grupos. Os resultados encontram-se resumidos na Figura 3.

Tal como previsto, o fluxo sanguíneo miocárdico, tal como medido por

83 691 * ΕΡ Ο 726 763/ΡΤ 26 microesferas radioactivas de 1 5 μηη, demonstrou uma redução significativa em todos os grupos de animais depois da oclusão. Não existiu melhoria significativa no fluxo sanguíneo colateral após a infusão de PGEt lipossómica nos animais testados, sugerindo que os efeitos vasodilatadores microvasculares da PGEt lipossómica foram mínimos.

Com a reperfusão o fluxo sanguíneo aumentou de forma significativamente mais elevada nos cães tratados em comparação com os animais de controlo. O exame dos corações mostrou que a dimensão do enfarte do miocárdio, expressa como uma percentagem da região em risco (isto é, a área de baixo fluxo durante a isquemia), pareceu reduzida em cerca de 50% nos cães tratados com a PGEt lipossómica, quando comparados com os cães de controlo não tratados. Além disso, a administração da PGEt lipossómica resultou na inibição quase total da agregação plaquetária no sangue. A Figura 4 resume os resultados nos quatro grupos de cães que receberam a PGEt lipossómica, a PGE-, livre, lipossomas vazios, ou solução salina de controlo. A PGEt lipossómica foi administrada em duas infusões de 0,5 pg/kg ao longo de 10 minutos cada uma para uma dosagem total de 1,0 pg/kg. A PGE, livre foi infundida continuamente ao longo de 90 minutos a 0,1 pg/kg/minuto ou numa dosagem total de 9 pg/kg.

Também foram conduzidos testes a fim de medir a infiltração de glóbulos brancos sanguíneos no tecido isquémico do coração. Imediatamente a seguir à extracção do coração aos animais, foram obtidas amostras a partir da 1) zona do enfarte, 2) zona fronteira da zona de enfarte dentro da região em risco, 3) zona em risco (isquémica), e 4) zona de controlo fora da região em risco. (A região em risco era a porção do coração alimentada pelo vaso sanguíneo ocluso). O tecido foi congelado instantaneamente utilizando azoto líquido, e foi mantido a -70°C até ser analisado. A actividade de mieloperoxidase (uma enzima encontrada apenas nos neutrófilos) foi subsequentemente analisada para cada uma das quatro zonas em cada coração de animal. Inicialmente, seis animais de controlo foram testados desta maneira, embora um destes (CONT 4 na tabela) tenha sido considerado aberrante ao longo de todo o teste, mas foi incluído na tabela para a completar. Apenas quatro dos animais tratados com a PGE, lipossómica (LIPO 1-4) foram incluídos nesta porção do estudo. Os 27 83 691 ΕΡ Ο 726 763/ΡΤ resultados encontram-se representados na Tabela 1, com o nível de mieloperoxidase expresso em unidades arbitrárias de enzima para fins comparativos: TABELA 1

MIELOPEROXIDASE LIBERTADA A PARTIR DE TECIDOS MIOCÁRDICOS

ZONA

CÃO 1 2 3 4 CONT 1 22,8 17,8 1,1 1,3 CONT 2 18,2 0 6 0 CONT 3 23,3 29,0 17,9 0,7 CONT 4 0 0 0 0 CONT 5 23,5 24,4 19,6 3,9 CONT 6 2,7 3,0 1,2 1,7 MÉDIA 15,1 12,4 7,6 1,3 DP 10,9 13,0 8,9 1,5 LI PO 1 1,7 0 0 0,6 LIPO 2 1,3 - 0 0,5 LI PO 3 - 0 0 0 LIPO 4 2,7 0,5 0 0,2 MÉDIA 1,9 0,2 0 0,3 DP 0,7 0,3 0 0,3

Em cada grupo foram testados cães adicionais. A Figura 5 resume os resultados da totalidade de cães adequados para análise em cada um dos quatro grupos testados.

Na tabela acima, um travessão indica que não foram realizadas quaisquer medições para aquele valor particular.

83 691 * ΕΡ Ο 726 763/ΡΤ 28 EXEMPLO 3

Testes in vivo para profilaxia da SDRA O síndrome de dificuldade respiratória do adulto (SDRA) é uma condição secundária a uma variedade de insultos incluindo, mas não se encontrando limitados a traumatismo, queimadura, aspiração e hiperoxemia. A condição é caracterizada por edema intersticial devido a lesão capilar. Uma vez os pulmões encharcados com fluído, a respiração torna-se difícil e 5-60% dos doentes morrem. A sequência de acontecimentos que conduzem a esta conclusão catastrófica pode variar dependendo da natureza do insulto inicial. Factores tais como C3a, C5a, IL-1 e TNF activam os neutrófilos. O modo de acção da PGEt é independente dos mecanismos de activação celular. Na presença de PGE1( os neutrófilos não podem ser activados, e se eles já se encontram activados serão desligados, desse modo prevenindo a doença.

Foram conduzidos estudos em modelos de roedores para a SDRA onde a lesão pulmonar foi induzida quer por lesão térmica quer por injecção intratraqueal directa de IL-1. Tal como mencionado nos exemplos seguintes, doses de PGE·, lipossómica impedem o derrame de fluido para o pulmão e reduzem significativamente o influxo de neutrófilos para o pulmão. A PGEt lipossómica re-hidratada do Exemplo 1 foi testada in vivo como um profilático para o início do síndrome de dificuldade respiratória do adulto (SDRA). Os ratos testados foram divididos em três grupos contendo sete ou oito animais cada, e foram tratados com 8 pg/kg de PGEt lipossómica ou com solução salina, em simultâneo com, e uma imediatamente após a lesão térmica (por imersão em água a 70°C durante 45 segundos). O primeiro grupo foi tratado com PGE, lipossómica, o segundo grupo não foi tratado com PGE, lipossómica, mas foi submetido ao mesmo traumatismo, e o terceiro grupo não foi nem tratado nem traumatizado. Uma hora antes do sacrifício dos ratos, foi injectada por via endovenosa 125 l-albumina como um marcador para o derrame de fluído para o pulmão. Quatro horas após a lesão térmica os animais foram sacrificados. Os resultados do estudo encontram-se resumidos na Figura 6.

Um efeito da referida traumatização é conhecido como sendo o início da SDRA, tal como colocado em evidência por um nível aumentado de albumina nos pulmões dos animais afectados. Os animais traumatizados não tratados

83 691 ' ΕΡ Ο 726 763/ΡΤ 29 exibem todos níveis elevados de albumina nos pulmões. Além disso, seis destes sete animais de teste morreram. O nível de albumina nos animais tratados com PGEt lipossómica foi verificado como sendo quase tão baixo, ou mesmo mais baixo, do que os níveis no grupo de controlo não traumatizado. Adicionalmente, nenhum dos sete animais tratados com PGEt morreu em resultado do traumatismo. Estes resultados mostram a eficácia da PGEt lipossómica como um profilático para o início da SDRA.

Testes in vivo para o tratamento da SDRA induzida pela inieccão intratraaueal de IL-1: A instilação intratraqueal de IL-1 recombinante induz um influxo de neutrófilos e lesão pulmonar em ratos (Figura 7). O tratamento com PGEt lipossómica reduzirá a lesão pulmonar e o influxo de neutrófilos induzidos pela IL-1. 50 ng de interleucina 1 (IL-1) disponível comercialmente ou solução salina (no grupo de controlo) foram instilados na traqueia de ratos induzindo a infiltração de neutrófilos para os pulmões e o derrame de fluído para os alvéolos. O tratamento endovenoso, 6 pg/kg, com PGE, lipossómica re-hidratada do Exemplo 1, ou com ΡΰΕΊ livre ou com lipossomas vazios, foi administrado 2,5 horas após a instilação de IL-1 nos ratos que tinham recebido a IL-1. Dos ratos analisados, 40 receberam apenas solução salina, 54 receberam IL-1 e não foram tratados, 6 receberam IL-1 e foram tratados com PGEt lipossómica, 6 receberam IL-1 e foram tratados com lipossomas vazios , e 6 receberam IL-1 e foram tratados com PGEt livre.

Quatro horas e meia após a IL-1 ter sido administrada, depois de muitos neutrófilos se terem já infiltrado no tecido, os ratos foram injectados com 125 l-albumina como um marcador na corrente sanguínea. Meia hora depois da albumina ter sido injectada, os animais foram sacrificados, os pulmões foram removidos e o derrame de fluido para o pulmão foi quantificado pela determinação da quantidade de isótopo no tecido. Foi calculado um índice do derrame pulmonar com base na contagem por minuto (cpm) de 125 l-albumina marcada no pulmão dividida pela quantidade de l-albumina marcada na corrente sanguínea. O derrame pulmonar é expresso sobre o eixo dos Y da Figura 7. Tal como assinalado na Figura 7, a instilação de IL-1 sem tratamento ocasionou um aumento do derrame pulmonar de 2,5 vezes acima do simulado ou animais aos quais foi administrada solução salina. No entanto, quando o 30 83 691 ΕΡ Ο 726 763/ΡΤ tratamento com PGE, lipossómica foi administrado após a instilação de IL-1, o índice do derrame pulmonar foi igual ao observado no controlo simulado. Notavelmente, o tratamento quer com a PGE, livre quer com os lipossomas livres não apresentou qualquer efeito sobre o derrame pulmonar.

Esta sequência de acontecimentos representa aquela que poderia ocorrer num cenário clínico. A lesão foi induzida, e o tratamento foi iniciado num tempo posterior após o diagnóstico apropriado ter sido feito. EXEMPLO 4

Estudos de endotoxemia no rato Preparação de MLV de PGE^ contendo EPC

Uma solução-mãe concentrada de fosfatidilcolina de ovo (EPC) (20 mg/ml em etanol) foi preparada como se segue: 1 g de EPC seca foi dissolvido em 50 ml de etanol absoluto, sob turbilhonamento suave, num frasco castanho de 50 ml com uma tampa revestida de Teflon. A solução resultante foi armazenada a 20 graus Celsius negativos. A solução-mãe concentrada de PGEt (1 mg/ml em etanol) foi preparada como se segue: 20 mg de PGE, seca foram transferidos para um frasco de 20 ml, ao qual foram adicionados 20 ml de etanol absoluto. A PGEt foi dissolvida no etanol sob turbilhonamento suave; a solução resultante foi armazenada a 20 graus Celsius negativos.

Uma alíquota da solução-mãe de EPC (9,75 ml), e uma alíquota da solução-mãe de PGEt (0,5 ml), foram combinadas num balão de fundo redondo de 500 ml; o etanol foi removido por rotoevaporação a cerca de 30 graus C durante pelo menos duas horas. A EPC/PGEt seca foi ressuspensa num tampão de pH 4,5 (por ex., 50 mM de acetato, 150 mM de NaCI, pH levado até 4,5 com NaOH 10N; contas de vidro auxiliaram na ressuspensão da EPC/PGEt seca) de modo a formar uma suspensão lipossómica. Esta suspensão foi armazenada a 4 graus C.

Preparação de MLV de PGEi_contendo DPPC

Uma solução-mãe de DPPC foi preparada tal como descrito acima, utilizando 1,035 g de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC) dissolvidos em cloreto de metileno. A re-hidratação da mistura DPPC/PGEt seca necessitou de aquecimento em banho-maria, sob turbilhonamento, a cerca de 52 graus C

83 691 ΕΡ Ο 726 763/ΡΤ 31 durante cerca de 3-5 minutos.

Modelo de endotoxemia no rato

Febre, hipotensão, alterações nas contagens de leucócitos e diarreia, são * sintomas de infecções por bactérias gram-negativas. Estas infecções podem conduzir a coagulação intravascular disseminada e a choque irreversível. Uma grande volume da literatura aponta para o envolvimento de IL-1, IL-6 e TNFa derivados de leucócitos na mediação da progressão do choque endotóxico. Dado que os nossos dados in vitro indicam uma inibição destas citóquinas a partir de monócitos cultivados, foi desenvolvido um modelo in vivo de endotoxemia no rato, utilizando a mortalidade como um ponto final, para avaliar a eficácia da PGE! e das formulações particuladas na atenuação da morte induzida pelo LPS.

As experiências foram concebidos a fim de estabelecer uma DL50 para o LPS de E. coli (lipopolissacárido; serotipo 055:B5) em ratos Sprague-Dawley. Os dados destas experiências encontram-se representados na Figura 8, e indicam que a DL50 é de 50 pg/kg. Esta dosagem de LPS foi utilizada nas experiências subsequentes, excepto se de outro modo indicado.

Ratos Sprague-Dawley macho, pesando 126-150 g cada, foram aclimatados durante dois dias num alojamento para animais com comida e água ad iibitum. No tempo 0, grupos de ratos (η = 16) foram injectados i.v. com lipopolissacárido de E. coli como um bólus único, ou com um controlo de solução salina (sem LPS). A mortalidade foi avaliada a tempos (dias) variados após a administração do LPS.

Inibição da Síntese de Factor Alfa de Necrose Tumoral (TNFa) e de Interleucina-1 Beta (IL-1B) em Resposta ao Lipopolissacárido (LPS) e à PGE·^ 0

Monócitos humanos aderentes foram estimulados com LPS (1pg/ml/10 células) no tempo 0. PGE, livre (não encarcerada em lipossomas), LUV-PGE! (lipossomas unilamelares grandes (LUV) preparados de acordo com os processos descritos neste Exemplo), lipossomas LUV-PGE, "placebo" (LUV não contendo PGE-,), lipossomas LUV placebo mais PGEt livre, lipossomas placebo ou um controlo de solução salina (sem PGE^ foram injectados simultaneamente (10 μΜ de PGEt). O TNFa e a IL-1 β segregados foram analisados às três horas. Os 32 83 691 ΕΡ Ο 726 763/ΡΤ resultados destas experiências encontram-se representados na Figura 9.

Atenuação da Mortalidade Induzida pelo LPS

Ratos Sprague-Dawley macho foram injectados i.v. com 50 μg de LPS/kg de peso corporal no tempo 0. ΡΰΕτ livre, LUV-PGE! (40 pg/kg de PGEt), LUV placebo (LUV não contendo PGE,; número de partículas equivalente ao número de lipossomas administrados com a dose de LUV-PGEt de 40 pg/kg de PGEt) ou LUV placebo (equivalência em lípido a 40 pg/kg) mais PGE, livre (40 pg/kg). Existiam 12 ratos em cada grupo de tratamento. A sobrevivência foi determinada em cada grupo aos dias 6, 12, 18 e 24 pós a administração do LPS. Os resultados encontram-se representados na Figura 10.

Eliminação da Mortalidade Induzida pela PGE^ Livre

Ratos Sprague-Dawley macho foram injectados i.v. com 50 pg /kg de LPS no tempo 0. PGEt livre (40 pg/kg), LUV-PGEt (40 pg/kg de PGE-,), LUV placebo (equivalência em lípido a 40 pg/kg, isto é, o número de LUV placebo era igual ao número de LUV presente em conexão com uma dose de 40 microgramas de prostaglandina Et por kg de peso corporal), microesferas de látex (o número equivalente ao número de LUV placebo) ou microesferas de látex mais PGEt livre injectados simultaneamente i.v.. A sobrevivência no grupo de tratamento (16 ratos) foi determinada às 24 horas: Os resultados encontram-se representados na Figura 11.

Lisboa, 26. JUM. 2000

Por THE LIPOSOME COMPANY, INC. - O AGENTE OFICIAL -

Claims (23)

1. 83 691 ΕΡ Ο 726 763/ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Método para ο fabrico de uma composição farmacêutica para o tratamento de uma desordem caracterizada por activação e adesão celulares, inflamação ou toxemia, compreendendo a formulação de: (a) um transportador farmaceuticamente aceitável; e, (b) um lipossoma unilamelar compreendendo: (i) um lípido, (ii) um tampão aquoso inibitório da libertação; (iii) uma quantidade eficaz anti-desordem de um metabolito de ácido araquidónico, o qual é pelo menos cerca de 10'12 g do metabolito por kg de peso corporal do animal a ser tratado, em que o referido tampão inibitório da libertação aumenta a intensidade das interacções metabolito-lípido ou estabelece repulsões electrostáticas com o metabolito.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, o qual é adequado para administração endovenosa.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o lipossoma unilamelar é um lipossoma unilamelar grande possuindo um diâmetro de cerca de 100 nm.
4. 4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o metabolito de ácido araquidónico é uma prostaglandina.
5. 5. Método de acordo com a reivindicação 4, em que a prostaglandina é a prostaglandina E·,.
6. 6. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o lípido é um lípido de cadeia acilo saturada.
7. 7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que o lípido de cadeia acilo saturada é dipalmitoilfosfatidilcolina.
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o tampão é um 83 691 ΕΡ Ο 726 763/ΡΤ 2/3 tampão de ácido cítrico.
9. 9. Método de acordo com a reivindicação 8, em que o tampão de ácido cítrico apresenta um pH de cerca de 4,5.
10. 10. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a desordem compreende lesão por reperfusão, síndrome de resposta inflamatória sistémica, enfarte do miocárdio, síndrome de dificuldade respiratória do adulto, vasculite, lesão por queimadura, choque pós-traumático, uma desordem vaso-oclusiva, uma desordem artrítica ou uma desordem auto-imune.
11. 11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que a desordem artrítica é a artrite reumatóide, a gota ou a artrite por filária.
12. 12. Método de acordo com a reivindicação 10, em que a desordem auto-imune é o lúpus eritematoso sistémico, a diabetes juvenil, a esclerose múltipla ou a tiroidite de Hashimoto.
13. 13. Método de acordo com a reivindicação 10, em que a desordem compreende a síndrome de resposta inflamatória sistémica ou a síndrome de dificuldade respiratória do adulto.
14. 14. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a quantidade eficaz do metabolito é de cerca de 10'12 g do metabolito por kg de peso corporal do animal a cerca de 10 3 g por kg.
15. 15. Método de acordo com a reivindicação 14, em que a quantidade eficaz do metabolito é de cerca de 10'8 g do metabolito por kg de peso corporal do animal a cerca de 10'4 g por kg.
16. 16. Método de acordo com a reivindicação 15, em que a quantidade eficaz do metabolito é de cerca de 10'6 g do metabolito por kg do peso corporal do animal.
17. 17. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o lipossoma compreende um protector da secagem. 83 691 ΕΡ Ο 726 763/ΡΤ 3/3
18. 18. Método de acordo com a reivindicação 17, em que o protector da secagem é um sacárido.
19. 19. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o sacárido é maltose, lactose, dextrose, tre-halose, rafinose ou sacarose.
20. 20. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o sacárido é maltose.
21. 21. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendo um agente bioactivo adicional.
22. 22. Utilização de uma composição compreendendo um transportador farmaceuticamente aceitável e um lipossoma unilamelar compreendendo um metabolito de ácido araquidónico, um lípido e um tampão aquoso inibitório da libertação, em que o referido tampão inibitório da libertação aumenta a intensidade das interacções metabolito-lípido ou estabelece repulsões electrostáticas com o metabolito, para o fabrico de uma composição para o tratamento de um animal afectado com uma desordem caracterizada por activação e adesão celulares, inflamação ou toxemia.
23. 23. Utilização de acordo com a reivindicação 22, em que o animal é um ser humano. Lisboa, Jíl ?O0U Por THE LIPOSOME COMPANY, INC. _ η ancMTC r\cmiAi

    ENG." ANTÓNIO J0À0 DA CUNHA FERREIRA Ag. Of. Pr. Ind. Ruo dos Flores, 74-4«· ie@Q LISBOA