PT689439E

PT689439E - Utilizacao de compostos de triazina no fabrico de um medicamento para o tratamento de patologias da memoria e da aprendizagem

Info

Publication number: PT689439E
Application number: PT94909263T
Authority: PT
Inventors: Martin George Baxter
Original assignee: Wellcome Found
Priority date: 1993-03-19
Filing date: 1994-03-18
Publication date: 2001-05-31
Also published as: DE69426622T2; AU6217694A; AP9400627A0; GR3035528T3; AP478A; WO1994021260A1; ES2153854T3; EP0689439A1; TW256773B; ATE198831T1; JPH08507782A; DE69426622D1; DK0689439T3; IL109034A; IL109034A0; GB9305693D0; EP0689439B1; ZA941938B

Description

6¾¾^ 3£> L-Cj ^^

DESCRIÇÃO

"UTILIZAÇÃO DE COMPOSTOS DE TRIAZINA NO FABRICO DE UM MEDICAMENTO PARA O TRATAMENTO DE PATOLOGIAS DA MEMÓRIA E DA APRENDIZAGEM" A presente invenção relaciona-se com a utilização em terapêutica de 3,5-diamino-6-(2,3-diclorofenil)-1,2,4-triazina e os seus sais de adição de ácido farmaceuticamente e veterinariamente aceitáveis. O EP-A-0 021 121 descreve um grupo de triazinas, incluindo a 3,5-diamino-6-(2,3-diclorofenil)-1,2,4-triazina, que são activas no tratamento de patologias do sistema nervoso central, por exemplo patologias psiquiátricas e neurológicas, e que são particularmente úteis como anticonvulsivos, por exemplo no tratamento da epilepsia. Estas triazinas são não-depressivas e são portanto vantajosas em comparação com anti-epilépticos depressivos tais como a fenobarbitona. O EP-A-0 247 892 descreve o isetionato de 3,5-diamino-6-(2,3-diclorofenil)-1,2,4-triazina, um sal particularmente preferido devido à sua boa solubilidade. 0 EP-A-0 519 602 descreve formulações farmacêuticas capazes de inibir a libertação maciça de glutamato cerebral que compreendem (4S)-4,7-dihidro-3-isobutil-6-metil-4-(3-nitro-fenil)tieno[2,3-b]piridino-5-carboxilato de metilo e um método para o tratamento de doenças provocadas pela libertação maciça de glutamato cerebral tal como a epilepsia, a doença de Alzheimer ou a coreia de Huntington.

Em estudos mecanísticos, demonstrou-se que a 3,5-diamino-6-(2,3-diclorofenil)-1, 2,4-triazina produz um bloqueamento dependente de utilização de canais de sódio sensíveis a voltagem (Lang et al. , 1993, J. Pharm. Exp. Therap., 266, 829; Lees, G. e 1

Leach, M. J., 1993, Brain Res , 612, 190) e a concentrações cerebrais anticonvulsivas para inibir a libertação de amino ácidos excitatórios, principalmente glutamato (Leach, M. J. et al., 1986, Epilepsia, 27, 490-497; Zhu, S. G. e McGee, E. G. , 1990, Neurosci. Lett., 112, 348-351). O glutamato actua como um importante neurotransmissor no sistema nervoso central de mamíferos e também foi identificado como exercendo acções específicas sobre o sistema nervoso periférico. O conhecido efeito anticonvulsivo deste composto foi portanto atribuído à sua capacidade para actuar sobre os canais de sódio sensíveis a voltagem como um inibidor da libertação de glutamato. A perda de memória e a deterioração da capacidade de aprendizagem são características da uma gama de patologias clínicas. Por exemplo, a perda de memória é o sintoma mais comum de estados de demência incluindo a doença de Alzheimer e a demência senil do tipo Alzheimer (os dois termos diferentes distinguem aqui entre casos instalados em jovens e idosos). A doença de Alzheimer é de facto a entidade clínica mais importante responsável pela demência progressiva em populações em envelhecimento. O EP-A-0 275 668 descreve que o antagonista de receptores de 5HT3 ondansetron, 1,2,3,9-tetrahidro-9-metil-3-t (2-metil-líf-imidazol-l-il)metil]-47í-carbazol~4-ona, é útil no tratamento do défice de memória e estados de demência incluindo a demência senil do tipo Alzheimer.

Embora a área da deterioração da memória e da aprendizagem seja rica em modelos animais que são capazes de demonstrar diferentes características dos processos da memória e da aprendizagem, não há actualmente concordância quanto a qual o modelo que proporciona a melhor validade previsional para utilização clínica (Hollictcr, L. E., 1990, Pharmacopsychiat., 23 (Supll. II) , 33-36) . Há provas de que, em demências, existe uma perda acentuada de neurónios colinérgicos que medeiam a transmissão para o 2

•'W \l neocortéx e hipocampo. Esta perda correlaciona-se com deficiências da memória (Bartus et al., 1982, Science, 217, 408-417). Em experiências com animais, os antagonistas colinérgicos tais como a escopolamina administrados antes ou imediatamente após um teste de aprendizagem podem abolir a memória, tal como evidenciado pela ausência de resposta numa segunda ocasião (Spencer & Lai, 1983, Drug Dev. Res., 3, 489-502). A inversão do efeito da escopolamina foi portanto utilizado para rasteio de compostos nootrópicos (também conhecidos como intensificadores da cognição) . Neste modelo os agonistas colinérgicos e os intensificadores de sistemas colinérgicos dão resultados positivos, tal como o dão o piracetam e compostos relacionados que não interactuam com os sistemas colinérgicos de modo evidente (Pepeu & Spignoli, 1989, Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiat., 13 (Suppl.) 577-588). Uma variedade de outros compostos também deram resultados positivos, incluindo compostos vaso-activos, TRH e análogos, antagonistas de 5-HT3 (e.g. ondansetron, referido acima), estimulantes centrais, inibidores de ACE, antagonistas de opiato e dopamina, antagonistas de receptores de benzodiazepinas, análogos de AC TH e alfa agonistas. A validação de qualquer modelo animal particular está, contudo, impedida pela inexistência no presente de um fármaco nootrópico padrão para comparação. As novas formas de tratamento de perda de memória e de dificuldades da aprendizagem presentemente disponíveis não são consideradas suficientemente eficazes para fazer uma diferença significativa para um doente (Hollister, L. E., ibid.) . Existe portanto uma necessidade de novos fármacos que sejam clinicamente eficazes no tratamento de deficiências da memória e de dificuldades da aprendizagem.

Surpreendentemente verificou-se agora que a 3,5-diamino-6-( 2,3-diclorofeni1)-1,2,4-triazina e os seus sais podem influenciar uma parte essencial dos processos da memória e da aprendizagem. Em conformidade, a presente invenção proporciona a 3 r\j L-Cj t utilização, para a preparação de um medicamento para o tratamento de deficiência da memória e de uma patologia da aprendizagem, de 3,5-diamino-6-(2,3-diclorofenil)-1,2,4-triazina ou um seu sal de adição de ácido f armaceuticamente ou veterinariamente aceitável.

Daqui em diante a 3,5-diamino-6-(2,3-diclorofenil)-1,2,4-triazina será aqui referida como o composto A. 0 composto A e os seus sais serão conjuntamente designados como os presentes compostos. Os presentes compostos são não-tóxicos em doses profilaticamente e terapeuticamente eficazes.

Sais de adição de ácido adequados do composto A incluem os formados quer com ácidos orgânicos quer inorgânicos. Esses sais de adição de ácido serão normalmente farmaceuticamente e veterinariamente aceitáveis. Exemplos desses sais incluem os formados com os ácidos clorídrico, sulfúrico, cítrico, tartárico, fosfórico, láctico, pirúvico, acético, succínico, fumárico, maleico, metanossulfónico, etanossulfónico, oxaloacético e isetiónico. É preferido o sal com ácido isetiónico uma vez que possui uma solubilidade particularmente boa.

Os presentes compostos podem ser preparados por um processo que compreende a ciclização do composto de fórmula (II) :

NH

II e, se desejado, a conversão do composto A assim obtido num sal de adição de acido farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável. 4

A ciclização é tipicamente realizada por aquecimento do composto de fórmula II a refluxo num alcanol, preferencialmente um Ci-4alcanol, por exemplo metanol ou etanol, na presença de uma base forte, por exemplo hidróxido de potássio. 0 processo pode, por exemplo, ser realizado tal como descrito no Exemplo 1 do EP-A-0 021 121. O passo subsequente opcional de conversão do composto A num sal de adição de ácido é realizado por um método convencional, por exemplo por tratamento com o ácido apropriado à temperatura ambiente. O sal do ácido isetiónico pode ser preparado, por exemplo, tal como descrito no EP-A-0 247 892, em particular no Exemplo 3. O composto de partida de fórmula II pode ser preparado pelo método descrito na patente US 3,637,688.

Os estados clínicos em que as deficiências de memória e as dificuldades de aprendizagem são proeminentes incluem, tal como referido acima, a doença de Alzheimer (AD) e a demência senil do tipo Alzheimer (SDAT) . AD refere-se a demência com uma instalação antes dos 65 anos enquanto que a SDAT se refere a instalação depois dos 65 anos. Contudo, as alterações neuropatológicas encontradas em doentes com AD e SDAT são virtualmente idênticas. Existe uma necessidade crítica de um fármaco para aliviar as deficiências cognitivas, especialmente a memória, que ocorre nos estádios precoces da AD e da SDAT.

As deficiências da memória também ocorrem noutros tipos de demência tais como a demência multi-enfarte (MID), a demência senil provocada por deficiência cerebrovascular, e a variante de Lewy-body da doença de Alzheimer com ou sem associação à doença de Parkinson. A doença de Cruetzfeld-Jakob é uma demência rara à qual estão associadas perturbações da memória. E uma encefalopatia espongiforme que é devida à proteína de priões; pode ser transmitida por outros doentes ou pode resultar de mutações genéticas. 5

Γ~

I \ι A perda de memória é uma característica comum em doentes com lesões cerebrais. As lesões cerebrais podem ocorrer, por exemplo, após uma apoplexia clássica ou como resultado de um acidente durante a anestesia, trauma craniano, hipoglicémia, envenenamento com monóxido de carbono, intoxicação com lítio, deficiência vitamínica (Bl, tiamina e B12), ou utilização excessiva de álcool. As lesões cerebrais selectivas em áreas associadas à memória, por exemplo no hipocampo, também estão associadas a derrames cerebrais e epilepsia. A doença de Korsakow é uma doença rara da memória que é caracterizada por perda profunda de memória e confabulação, através da qual o doente inventa histórias para esconder a sua perda de memória. Está frequentemente associada à ingestão excessiva de álcool.

As deficiências da memória podem além disso estar associadas ao envelhecimento; a capacidade para recordar informação tal como nomes, locais e palavras parece diminuir com o aumento da idade. Também pode ocorrer perda transitória de memória em doentes, que sofrem de doença depressiva grave, após terapêutica electro-convulsiva (ECT).

Os modelos animais disponíveis para a perda de memória e patologias da aprendizagem envolvem a medição da capacidade de animais para recordarem um evento discreto. 0 procedimento de exclusão passiva é o mais largamente utilizado. Aqui, o animal recorda-se do ambiente característico em que é administrado um choque eléctrico suave e evita-o numa segunda ocasião. Contudo, este ensaio tem várias desvantagens. Uma variante do procedimento de exclusão passiva utiliza portanto a preferência do um roedor por ambientes fechados c escuro3 cm relação a ambientes abertos e iluminados, mas não utiliza o choque. Foi utilizado o movimento de uma caixa iluminada para uma caixa escura como um ensaio para fármacos ansiolíticos em murganhos: Crawley, J. N., 1981, Pharmacol. Bíochem. Behav. , 15, 695-699; 6 f

J

Costall, B. et al., 1987, Neuropharmacol., 26, 195-200; Costall, B. et al., 1989, Pharmacol. Biochem. Behav., 32, 777-785. Crê-se que o ensaio capitaliza no conflito entre o impulso exploratório e o medo de ambientes desconhecidos.

Por medição da latência para se deslocar de um compartimento para o outro, e realização do ensaio em diversas ocasiões, a situação de ensaio acima descrita foi modificada para proporcionar um ensaio de aprendizagem e memória em murganhos: Barnes, J. M. et al. , 1989, Br. J. Pharmacol., 98 (Suppl.) 693P; Barnes, J. M. et al., 1990, Pharmacol. Biochem. Behav., 35, 955-962. Neste ensaio, a caixa escura é recordada numa segunda ocasião como um local "seguro" e há menos hesitação em entrar.

Os presentes compostos são activos no modelo modificado de ambiente dia-noite descrito acima, tendo um défice de memória sido induzido por escopolamina nos animais testados. Tal como descrito nos Exemplos que se seguem, o efeito do composto A sobre o défice de memória induzido por escopolamina foi determinado por comparação com outros compostos descritos como sendo activos neste ou em ensaios semelhantes. A presente invenção proporciona portanto um método para o tratamento de uma deficiência da memória ou de uma patologia da aprendizagem num mamífero, compreendendo o método a administração a este de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um dos presentes compostos. Os presentes compostos podem pois ser utilizados no tratamento terapêutico de estados clínicos em que ocorrem deficiências da memória ou dificuldades de aprendizagem. Desta forma podem ser melhoradas a memória e a aprendizagem. Pode assim ser melhorado o estado de um ser humano ou animal.

Os presentes compostos têm utilidade no tratamento de estados clínicos e doenças em que ocorrem deficiências da memória ou patologias da aprendizagem, quer como característica central quer como sintoma associado. Exemplos dessas doenças que 7 os presentes compostos podem ser utilizados para tratar incluem a doença de Alzheimer, a demência senil do tipo Alzheimer, a demência multi-enfarte e a variante de Lewy-body da doença de Alzheimer com ou sem associação com a doença de Parkinson; a doença de Creutzfeld-Jakob; e a doença de Korsakow.

Os presentes compostos também podem ser utilizados para tratar patologias da memória ou da aprendizagem que estão associadas ao envelhecimento, que são resultado da terapêutica electro-convulsiva ou que são resultado de lesões cerebrais provocadas, por exemplo, por apoplexia, um acidente durante a anestesia, trauma craniano, hipoglicémia, envenenamento com monóxido de carbono, intoxicação com lítio ou deficiência vitamínica.

Os presentes compostos são não-tóxicos em doses profilaticamente e terapeuticamente eficazes. A toxicidade oral aguda (LD50) orientadora para o composto A em murganhos é de 250 mg/kg e em ratos é de 640 mg/kg. Estes são os níveis de dosagem aos quais 50% dos animais sobrevivem 10 dias após a administração do composto A.

Os presentes compostos podem ser administrados por uma variedade de vias e numa variedade de formas de dosagem incluindo as para administração oral, rectal, parentérica (tal como subcutânea, intramuscular e intravenosa), epidural, intratecal, intra-articular, tópica e bucal.

Os presentes compostos podem ser administrados em qualquer das formas de dosagem acima referidas a uma dosagem desde 1 mg/kg até 40 mg/kg por dia, por exemplo 5 mg/kg até 40 mg/kg, adequadamente 10 mg/kg ate 30 mg/kg. Para administração oral é particularmente adequada uma dose de 40 mg/kg. A gama de dosagem para seres humanos adultos dependerá de diversos factores incluindo a idade, peso e estado do doente e da via de administração. Um regime de dosagem típico é desde 20 mg até 3200 mg por dia, tipicamente desde 350 mg até 1400 mg por dia, preferencialmente desde 600 mg até 107 0 mg por dia. Nalgumas situações pode ser vantajoso, uma vez que os presentes compostos são de actuação prolongada, administrar uma dose inicial de 70 mg até 3200 mg no primeiro dia de tratamento e depois uma dose inferior de 20 mg até 1600 mg em dias subsequentes (todas as doses estão expressas como a base). A presente invenção proporciona adicionalmente uma composição compreendendo um veículo ou diluente farmaceuticamente ou veterinariamente adequado e, como princípio activo, um dos presentes compostos. A composição pode ser preparada utilizando métodos convencionais e administrada numa forma farmaceuticamente aceitável.

Para administração oral, os pós finos ou grânulos contendo agentes diluentes, dispersantes e/ou tensoactivos podem ser apresentados como uma poção, em água ou num xarope, em cápsulas ou em saquetas no estado seco, numa suspensão não-aquosa em que podem estar incluídos agentes de suspensão, ou numa suspensão em água ou num xarope. Quando desejável ou necessário, podem ser incluídos agentes aromatizantes, conservantes, de suspensão, espessantes ou emulsionantes. Quando é preparada uma suspensão em água de acordo com a presente invenção estará presente pelo menos um desses agentes.

Outros compostos que podem ser incluídos por mistura são, por exemplo, componentes medicamente inertes, e.g. diluentes sólidos e líquidos, tais como lactose, dextrose, sacarose, celulose, amido ou fosfato de cálcio para comprimidos ou cápsulas, azeite ou oleato de etilo para cápsulas moles e água ou óleo vegetal para suspensões ou emulsões; agentes lubrificantes tais como sílica, talco, ácido esteárico, estearato de magnésio ou de cálcio e/ou polietileno glicóis; agentes gelificantes tais como argilas coloidais; agentes espessantes tais como goma tragacanta ou alginato de sódio; 9

t agentes ligantes tais como amidos, gomas arábicas, gelatina, metilcelulose, carboximetilcelulose ou polivinilpirrolidona; agentes desintegrantes tais como amido, ácido algínico, alginatos ou amido glicolato de sódio; misturas efervescentes; corantes; edulcorantes; agentes molhantes tais como lecitina, polissorbatos ou laurilsulfatos; e outros componentes adjuvantes terapeuticamente aceitáveis, tais como humectantes, conservantes, tampões e antioxidantes, que são adjuvantes conhecidos para essas formulações.

As dispersões líquidas para administração oral podem ser xaropes, emulsões ou suspensões. Os xaropes podem conter como veículo, por exemplo, sacarose ou sacarose com glicerol e/ou manitol e/ou sorbitol. Em particular um xarope para doentes diabéticos pode conter como veículos apenas produtos, como por exemplo o sorbitol, que não metabolizam a glucose ou que só metabolizam a uma quantidade muito pequena de glucose. As suspensões e as emulsões podem conter um veículo, por exemplo uma goma natural, agar, alginato de sódio, pectina, metilcelulose, carboximetilcelulose ou álcool polivinílico.

As suspensões ou soluções para injecção intramuscular podem conter, conjuntamente com o composto activo, um veículo farmaceuticamente aceitável tal como água estéril, azeite, oleato de etilo, glicóis tais como propileno glicol e, se desejado, uma quantidade adequada de cloridrato de lidocaína. As soluções para injecção intravenosa ou infusão podem conter um veículo, por exemplo, água estéril que é geralmente Água para Injecção. Preferencialmente, contudo, podem tomar a forma de uma solução salina isotónica, aquosa, estéril. Alternativamente, os presentes compostos podem ser encapsulados em lipossomas.

Os presentes compostos também podem ser administrados na forma pura não-associados a outros adjuvantes, caso em que uma cápsula, saqueta ou comprimido é a forma de dosagem preferida. 10 Γ

t

Os comprimidos e outras formas de dosagem proporcionados em unidades discretas convenientemente contêm uma dose diária, ou uma sua fracção apropriada, de um dos presentes compostos. Por exemplo, as unidades podem conter desde 5 mg até 500 mg, mas mais usualmente desde 10 mg até 250 mg, de um dos presentes compostos (expresso como a base). A invenção é adicionalmente ilustrada pelos Exemplos seguintes. EXEMPLO 1: Ensaio comparativo do composto A num modelo de murganho de défice de memória Métodos e Materiais (a) Animais & Administração

Administração aguda

Utilizou-se murganhos albinos CD-I obtidos de Charles River. Foram alojados em condições controladas (temperatura 21±2°C, humidade de aproximadamente 50%, ciclo de dia/noite de 12 horas, comida e água ad lib) durante uma semana antes da utilização. Um dia antes do ensaio, os murganhos foram alojados em grupos de seis em caixas de polietileno no laboratório e marcados para identificação. Forneceu-se comida e água ad lib. No dia do ensaio, os animais foram pesados e depois tratados ou 30 minutos antes do ensaio (piracetam, ondansetron), uma hora antes do ensaio (composto A) ou imediatamente depois do ensaio.

Todo3 os fármacos foram dis3olvidoa ou 3uspenso3 em celacol aquoso a 0,25% (p/v), e administrados oralmente (por cânula), i.p. ou s.c. 0 volume da dose foi de 10 mL/kg para todas as vias. 11

t (b) Fármacos

Utilizou-se os fármacos seguintes. Todas as doses estão expressas como mg/kg de base:

composto A cloridrato de ondansetron piracetam bromidrato de escopolamina (c) Equipamento 0 equipamento consistiu em duas caixas com uma abertura de 90 mm x 60 mm ao nível do chão entre elas. Utilizou-se uma porta de plástico para fechar a abertura quando necessário. A caixa mais pequena (290 mm x 120 mm x 120 mm de altura) era feita de plástico opaco, aberta no topo para permitir a iluminação pela luz normal do laboratório. A caixa maior (350 mm quadrados x 280 mm de altura) era fechada com excepção de uma única abertura. (d) Procedimento

Este consistiu em treino, com descanso 24 horas mais tarde. Durante o treino, os animais foram colocados individualmente na caixa aberta de costas para a extremidade com a abertura. Após um período de exploração, geralmente entraram na caixa escura e registou-se a latência de entrada em segundos. A porta para a caixa escura foi fechada, e após terem decorrido 30 segundos, o animal foi suavemente retirado e recolocado na sua gaiola. Vinte e quatro horas mais tarde, utilizou-se um procedimento idêntico, excepto que a sessão terminou logo que o animal entrou na caixa escura. Registou-se novamente a latência. Durante o intervalo, oo animaia não foram manuseados, e foram perturbados o menos possível. Cada animal foi utilizado apenas uma vez. 12

Γ

Administração aguda

Os fármacos de teste ou os fluidos de controlo foram administrados antes ou imediatamente após a sessão de treino. O soro fisiológico e a escopolamina foram administrados 15 minutos antes da sessão de treino. A dose de escopolamina, suficiente para impedir a aquisição de memória durante a sessão de treino, baseou-se em trabalho publicado, i.e. 1 mg/kg em murganhos (Barzaghi, F. & Galliani, G., 1985, Br. J. Pharmacol., 86, 661P). (e) Análise estatística

Foram realizadas comparações entre grupos quanto às latências para entrar no compartimento escuro na primeira e segunda ocasiões. Para ambas as ocasiões de treino e de repetição do ensaio, as comparações foram realizadas entre os grupos com veículo e de tratamento. As distribuições das latências eram assimétricas tanto nos ensaios de aprendizagem como de repetição do ensaio (resultados não ilustrados), por isso utilizou-se o teste U de Mann-Whitney não-paramétrico. Contudo, para conveniência de ilustração, apresenta-se nas Tabelas as médias dos grupos ± SEM. A diferença entre latências nas duas ocasiões é apresentada como % de decréscimo no Dia 2 em comparação com o Dia 1. Os valores de significância entre 0,06 e 0,1 estão apresentados entre parêntesis rectos; * indica que embora a diferença entre latências nos dois dias de ensaio fosse não-significativa, havia uma diferença significativa (p < 0,05) entre os grupos de controlo e tratado com fármaco nos mesmos dias.

Os resultados estão apreaentadoe nas Tabelas 1 e 2 a seguir e são discutidos adiante. 13 TABELA 1

Efeito do composto A (A, p.o.), piracetam (Pirac, i.p.) ou ondansetron (Ondan, i.p.) administrados pré-treino como uma dose única em murganhos com défice induzido por escopolamina

Tratamento no Dia 1 Latência média (seg) ± SEM Diferença entre dias mg/kg s. c. mg/kg p.o. ou i.p.# Dia 1 Dia 2 % de decréscimo P Soro Celacol 17,3±1,7 9,910,9 43 <0,001 Soro A.40 23,313,4 12,811,2 45 <0,01 Escop. 1 Celacol 18,811,8 20,712,3 -10 NS Escop. 1 A.10 19,611,7 17,112,2 13 NS Escop. 1 A.20 18,612,4 13,311,5 28 <0,05 Escop. 1 A.40 22,113,2 9,711,2 56 <0,001 Soro Soro 18,911,4 11,510,8 39 <0,001 Soro Pirac. 2000 21,412,7 12,111,2 44 <0,01 Escop. 1 Soro 18,911,4 24,012,5 -27 NS Escop. 1 Pirac. 2000 19,112,4 13,911,8 27 NS* Escop. 1 Soro 16,511,3 16,811,8 -2 NS Escop. 1 Ondan. 0,01 15,611,8 20,011,9 -28 NS Escop. 1 Ondan. 1,0 14,311,4 14,911,2 -5 NS Escop. 1 Ondan. 100 16,311,9 11,811,5 28 <0,05 # Doses de ondansetron em μρ/kg * p < 0,05 comparado com o controlo no mesmo dia A latência média para entrar na caixa escura ± erro padrão da média foi calculada a partir de um grupo de 12 animais. Para um dado tratamento, os valores nas colunas assinaladas com "Dia 1" e com "Dia 2" mostram as latências médias tomadas a partir do 14

V u t mesmo grupo de animais. A diferença entre os resultados obtidos nos dois dias é ilustrada evidenciando a % de decréscimo, e os resultados comparados utilizando o teste-U de Mann-Whitney; NS indica um valor de p > 0,1.

Discussão da Tabela 1

Composto A: Os murganhos tratados com veículo ou com uma dose única de composto A (40 mg/kg p.o.), na ausência de escopolamina uma hora antes do treino, apresentaram o decréscimo de latência esperado (43%, p < 0,001 e 45%, p < 0,01, respectivamente) ao serem novamente ensaiados. A escopolamina (1 mg/kg) eliminou este efeito em animais tratados com veículo. O composto A a 10 mg/kg p.o não teve efeito significativo sobre o défice induzido por escopolamina (13% de decréscimo de latência), enquanto que a 20 mg/kg apresentou uma inversão significativa (28% de decréscimo de latência, p < 0,05) e a 40 mg/kg eliminou o défice (56% de decréscimo de latência, p < 0,001) .

Piracetam: O piracetam (2000 mg/kg i.p.) não inverteu o défice induzido por escopolamina tal como avaliado pela diferença de latências entre o Dia 1 e o Dia 2 (27% de decréscimo, p > 0,05). Contudo, no Dia 2 a latência nos animais tratados com piracetam/escopolamina era significativamente diferente (p < 0,05) dos animais de controlo tratados com escopolamina testados no mesmo dia.

Ondansetron: O ondansetron (100 μg/kg, mas não 1,0 ou 0,1 Hg/kg) administrado i.p. 30 minutos antes do treino inverteu significativamente o défice induzido por escopolamina (28% de dccrcscimo dc latcncia, p < 0,05) . Nesta ocasião utilizou se controlos sem veículo/veículo. 15 TABELA 2

Efeito do composto A (A, p.o. ou i.v.) ou piracetam (i.p.) administrados imediatamente pós-treino em murganhos com défice induzido por escopolamina

Tratamento no Dia 1 Latência média (seg) ± SEM Diferença entre dias mg/kg s. c. mg/kg Dia 1 Dia 2 % de decréscimo P Soro Soro 20,0+2,3 13,9+1,5 30 <0,05 Soro Comp.A.40 p.o. 20,2+3,0 14,2+2,3 30 <0,05 Soro Comp.A.2 0 i.v. 19,9+2,7 14,8+2,1 26 (0,09) Soro Piracetam 2000 i.p. 18,8±2,0 13,5+1,7 28 <0, 05 Escop. 1 Soro 19,5±2,3 26,5+2,7 -36 (0,07*) Escop. 1 Comp.A.4 0 p.o. 18,5±1,8 22,7+2,6 -23 NS Escop. 1 Comp.A.40 i.v. 20,0+2,3 20,3+2,5 -1 NS Escop. 1 Piracetam 2000 i.p. 19,2+1,8 18,0+1,8 6 NS* * p < 0,05 comparado com o controlo do mesmo dia Para a legenda ver Tabela 1

Valores de probabilidade entre parêntesis na gama desde 0,05 até 0,1

Discussão da Tabela 2 A Tabela 2 mostra os resultados de uma experiência em que os fármacos foram administrados imediatamente após a remoção dos murganhos da caixa escura, em contraste com os resultados f L· descritos na Tabela 1 que foram obtidos com fármaco administrado antes do ensaio. 0 composto A (40 mg/kg p.o. ou 20 mg/kg i.v., o último numa tentativa de reduzir ao mínimo o atraso na instalação dos efeitos do fármaco) não apresentou inversão do défice induzido por escopolamina. 0 piracetam (2000 mg/kg i.p.) não inverteu o défice induzido por escopolamina tal como avaliado pela diferença de latências no Dia 1 e no Dia 2 (6% de decréscimo, p > 0,05). Contudo, no Dia 2 a latência nos animais tratados com piracetam/escopolamina era significativamente diferente (p < 0,05) dos animais de controlo tratados com escopolamina testados no mesmo dia. EXEMPLO 2: Ensaio comparativo do composto A num modelo de rato de défice de memória Métodos e Materiais (a) Animais & Administração

Administração aguda

Utilizou-se ratos machos Wistar obtidos de Charles River. Foram alojados em condições controladas (temperatura 21±2°C, humidade de aproximadamente 50%, ciclo de dia/noite de 12 horas, comida e água ad lib) durante uma semana antes da utilização. Um dia antes do ensaio os ratos foram alojados permanentemente em grupos de seis. Forneceu-se comida e água ad lib. No dia do ensaio, os animais foram pesados e depois tratados ou 30 minutos antes do ensaio (midazolam), uma hora antes do ensaio (composto A) ou imediatamente depois do ensaio.

Administração sub-aguda

No regime de administração sub-aguda (ver "Procedimento") os ratos, alojados tal como descrito acima, receberam seis doses 17 de fármaco ou de veículo por via oral, cada uma espaçada de 24 horas.

Todos os fármacos foram dissolvidos ou suspensos em celacol aquoso a 0,25% (p/v), e administrados oralmente (por cânula), i.p. ou s.c. 0 volume da dose foi de 5 mL/kg para todas as vias. (b) Fármacos

Utilizou-se os fármacos seguintes. Todas as doses estão expressas como mg/kg de base: composto A cloridrato de midazolam bromidrato de escopolamina (c) Equipamento

Utilizou-se um equipamento idêntico ao descrito no Exemplo 1, excepto que a caixa mais pequena media 370 mm x 260 mm x 190 mm. (d) Procedimento

Este consisitu em treino tal como descrito para murganhos na secção (d) do Exemplo 1.

Administração aguda

Os fármacos de teste ou os fluidos de controlo foram administrados antes ou imediatamente após a sessão de treino. O soro fisiológico ou α cocopolamina foram administrados 15 minutos antes da sessão de treino. A dose de escopolamina, suficiente para impedir a aquisição de memória durante a sessão de treino, baseou-se em observações internas não publicadas e era de 0,1 mg/kg. L-Zj y

Administração sub-aguda O procedimento foi idêntico ao descrito acima, excepto que sete grupos de ratos receberam o composto A ou o pré-tratamento de controlo como 6 doses orais, cada uma delas espaçada de 24 horas, como se segue Grupo N2 de Dose de composto A mg/kg p • o. ratos Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 1 24 0 0 0 0 0 0 2 12 0 0 0 0 10 0 3 12 0 0 0 0 40 0 4 12 0 0 0 0 10 10 5 12 0 0 0 0 40 40 6 12 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 7 12 10 10 10 10 10 10 0 treino teve lugar 1 hora após a quinta dose, i.e. ao 5. Para cada um dos regimes de tratamento referidos acima, números iguais de ratos receberam soro fisiológico ou escopolamina a 0,1 mg/kg 15 minutos antes do treino, i.e. utilizou-se um total de 192 ratos. A repetição usual do ensaio foi realizada 24 horas mais tarde (ao dia 6), uma hora após o sexto tratamento oral. (e) Análise estatística

Esta foi tal como descrito na secção (e) do Exemplo 1.

Os resultados estão apresentados nas Tabelas 3 a 5 a seguir c oão diocutidoo adiante. 19 TABELA 3

Efeito do composto A administrado pré-treino como uma dose oral única em ratos com défice induzido por escopolamina

Tratamento no Dia 1 Latência média (seg) ± SEM Diferença entre dias mg/kg mg/kg Dia 1 Dia 2 % de P s. c. p.o. decréscimo Soro Celacol 33,4±3,4 14,5+2,8 56 <0,001 Soro Comp. A.40 38,3±3,8 19,3+3,0 50 <0,001 Escop. 0,1 Celacol 44,4±4,3 44,5+3,7 0 NS Escop. 0,1 Comp. A. 10 40,8+4,8 40,8+4,6 0 NS Escop. 0,1 Comp. A.2 0 37,7±4,4 31,7+3,9 16 NS* Escop. 0,1 Comp. A. 40 38,4+4,1 21,1+3,6 45 <0,01 * p < 0,05 comparado com o controlo no mesmo dia Para a legenda ver a Tabela 1 no Exemplo 1

Discussão da Tabela 3

Os ratos tratados p.o. com composto A ou veículo 1 hora antes do treino mostraram um resultado muito semelhante ao obtido com murganhos (Tabela 1 no Exemplo 1). Os ratos tratados com veículo mostraram o decréscimo de latência esperado na repetição do ensaio (56%, p < 0,001). As escopolamina inverteu este efeito. O composto A (40 mg/kg) inverteu o défice induzido por escopolamina (45% de decréscimo de latência, p < 0,01).

Um efeito ansiolítico, ao deixar-se que os ratos permanecessem durante mais tempo na caixa iluminada na primeira ocasião, podia representar um falso positivo por parte do composto de teste. Foi portanto testado o midazolam, uma 20

para examinar esta benzodiazepina ansiolítica típica, possibilidade. TABELA 4

Efeito do midazolam administrado pré-treino como uma dose i.p. única em ratos com défice induzido por escopolamina

Tratamento no Latência média Diferença entre dias Dia 1 (seq) ± SEM mg/kg mg/kg Dia 1 Dia 2 % de P s. c. i.p. decréscimo Soro Soro 31,3±4,3 15,512,3 50 <0,01 Soro Midazol.0,5 39,9+4,9 28,212,7 29 (0,09) Escop. 0,1 Soro 34,4±5,2 39,814,5 -16 NS Escop. 0,1 Midazol.0,5 37,014,0 33,613,4 9 NS

Para a legenda ver a Tabela 1 no Exemplo 1

Os valores de probabilidade estão na gama desde 0,05 até 0,1 Discussão da Tabela 4

Os ratos tratados com veículo apresentaram o decréscimo esperado na latência média por repetição do ensaio (50% de decréscimo de latência, p < 0,01). A escopolamina impediu este efeito. Na presença só de midazolam (0,5 mg/kg i.p.), observou-se uma redução da latência por repetição do ensaio (29% de decréscimo de latência) que não chegou a ser significativo (p = 0,09). Esta dose de midazolam não inverteu o défice induzido por escopolamina, indicando que qualquer acção ansiolítica é insuficiente para justificar os resultados obtidos neste modelo com o composto A. 21

ιο

Ο Ό Ο ιφ ο- r4 4J Φ Οι φ ο <ο Ό ια φ μ α φ φ Φ Ό V) η. Η

Ο α Η φ μ μ 'Φ Ο Οι Λ Ο α •Η φ Μ μ ι >Φ ο Οι ο Ό Φ μ μ ο Η £ Ό Φ ο μ <0 ο & ο υ ο Ό Ο μ •Η φ μ Η ο Η φ η> Ο Φ Ο Ό Ο ίφ Ο- Η μ Φ Οι φ Ο Ο α Η φ μ μ ο Ό μ Φ μ α φ ο μ Ο Φ £ Φ μ Φ μ μ ι 'Φ μ Ο μ μ φ ο σ Ο £ ο υ

22 f— U, ^

M A latência média para entrar na caixa escura = erro padrão da média foi calculada a partir de um grupo de 24 animais (controlos no primeiro bloco) ou 12 animais (todos os outros tratamentos). Para um dado tratamento, os valores nas colunas assinaladas "Dia 5” e "Dia 6" mostram as latências médias obtidas para o mesmo grupo de animais. A diferença entre os resultados obtidos nos dois dias é ilustrada apresentado a % de decréscimo, e os resultados são comparados utilizando o teste-U de Mann-Whitney. NS indica um valor de p > 0,1 Discussão da Tabela 5

Os ratos tratados com veículo apresentaram o decréscimo de latência média esperado (50%, p < 0,01), que foi invertido pela escopolamina. A Tabela 5 (segundo bloco) mostra que uma dose única de composto A de 10 mg/kg administrada antes do teste de aprendizagem não alterou o défice induzido por escopolamina. Contudo, 40 mg/kg do composto A produziram uma inversão completa e altamente significativa (46% de decréscimo de latência média; p < 0,001) . Este resultado efectivamente reproduz resultados descritos acima mas com doses adicionais de veículo. A Tabela 5 (terceiro bloco) mostra que quando é administrada uma segunda dose de composto A antes da repetição do ensaio, 10 mg/kg apresentaram uma tendêndia para inverter o défice induzido por escopolamina (28% de decréscimo de latência média; p = 0,1), não observada após a dose única, e 40 mg/kg tinham eficácia máxima (48% de decréscimo de latência média; p < 0,01) . A Tabela 5 (quarto bloco) mostra o efeito de quatro pré-tratamentos adicionais com composto A, 2,5 ou 10 mg/kg diários (i.e. seis doses no total). Não foram observados efeitos significativos no grupo tratado com 2,5 mg/kg diários (16% de 23

-t redução da latência). Em contraste, 10 mg/kg diários produziram uma inversão altamente significativa e maximizada do défice induzido por escopolamina (i.e. 41% de decréscimo de latência média; p < 0,01), semelhante à produzida por uma dose única de 40 mg/kg. EXEMPLO 3; Teste do composto A num ensaio de salivação e medição da pupila em ratos

Ratos machos Wistar (tal como utilizados no Exemplo 2) foram tratados uma vez só com composto A (10 ou 40 mg/kg p.o.) ou controlo de celacol, uma hora antes da observação e com bromidrato de escopolamina (0,1 mg/kg s.c., calculado como a base) em controlo de soro fisiológico, 15 minutos antes da observação. Nestas condições, que eram idênticas às utilizadas nas experiências de aprendizagem descritas no Exemplo 2, mediu-se as alterações de salivação e diâmetro da pupila. A salivação foi medida colocando um pedaço de papel de filtro dobrado na boca do rato e medindo o diâmetro da mancha em mm após 1 minuto. 0 diâmetro da pupila foi medido utilizando uma lente e uma quadrícula em condições normais de iluminação. Para ambas as medições, foram feitas comparações entre grupos de controlo e tratados com fármaco utilizando um teste-T de Student em amostras independentes.

Os resultados estão apresentados na Tabela 6 a seguir. Utilizou-se grupos de 6 animais. 24 TABELA 6

Ausência de efeito do composto A sobre a boca seca e a dilatação da pupila induzidas por escopolamina em ratos

Tratamento mg/kg p.o. Tratamento mg/kg s.c. Diâmetro médio da pupila (mm x 10) ± SEM Salivação média (diâmetro da mancha, mm) ± SEM Celacol Soro 6,29±0,47 8,79+0,38 Composto A 10 Soro 7,00±0,58 8,75+1,11 Composto A 40 Soro 7,75±0,85 8,25+0,63 Celacol Escopolamina 0,1 22,8±1,65 2,88+0,38 Composto A 40 Escopolamina 0,1 23,0+1,78 2,13+0,63

Discussão da Tabela 6

Em ratos pré-tratados com veículo, a escopolamina aumentou significativamente o diâmetro da pupila e reduziu a salivação (p < 0,01 para todas as comparações). O pré-tratamento com composto A não teve influência sobre as alterações induzidas por escopolamina (todas as comparações entre grupos tratados com veículo e composto A p > 0,05). EXEMPLO 4; Composições farmacêuticas São formulados comprimidos para administração oral com os seguintes componentes:

Composto A.............................. 150 mg

Lactose................................. 200 mg

Amido de milho.......................... 50 mg

Polivinilpirrolidona.................... 4 mg

Estearato de magnésio................... 4 mg

Misturar o composto activo com a lactose e o amido e granular com uma solução da polivinilpirrolidona em água. Secar os grânulos resultantes, misturar com o estearato de magnésio e comprimir para obter comprimidos com um peso médio de 408 mg.

Lisboa, 6 de Março de 2001

O AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

26

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de 3,5-diamino-6-(2,3-diclorofenil)-1,2,4-triazina ou de um seu sal de adição de ácido farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável na preparação de um medicamento para o tratamento de deficiência da memória ou de uma patologia da aprendi zagem.
2. Utilização de acordo com a reivindicação 1 de isetionato de 3,5-diamino-6-(2,3-diclorofenil)-1,2,4-triazina.
3. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2 em que a deficiência da memória ou a patologia da aprendizagem está associada a demência.
4. Utilização de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3 em que a deficiência da memória ou a patologia da aprendizagem está associada à doença de Alzheimer ou à demência senil do tipo Alzheimer.
5. Utilização de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3 em que a deficiência da memória ou a patologia da aprendizagem está associada à demência multi-enfarte ou à doença de Creutzfeld-Jakob.
6. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2 em que a deficiência da memória ou a patologia da aprendizagem é o resultado de lesão cerebral.
7. Utilização de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 6 cm que a deficiência da memória ou a patologia da aprendizagem é o resultado de uma apoplexia, acidente durante a anestesia, trauma craniano, hipoglicémia, envenenamento 1 com monóxido de carbono, intoxicação com lítio, deficiência vitamínica ou utilização excessiva de álcool.
8. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2 em que a deficiência da memória ou a patologia da aprendizagem está associada ao envelhecimento, está associada à doença de Korsakow ou é o resultado de terapêutica electro-convulsiva.
9. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8 em que são administrados 5 mg/kg até 40 mg/kg de 3,5-diamino-6-(2,3-diclorofenil)-1,2,4-triazina.
10. Utilização de acordo com a reivindicação 9 em que são administrados oralmente substancialmente 40 mg/kg de 3,5-diamino-6-(2,3-diclorofenil)-1,2,4-triazina. Lisboa, 6 de Março de 2001 0 AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL tVv 2