PT3008162T - Método para separação de células esporádicas de fluidos corporais e aparelho para levar a cabo o referido método - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "MÉTODO PARA SEPARAÇÃO DE CÉLULAS ESPORÁDICAS DE FLUIDOS CORPORAIS E APARELHO PARA LEVAR A CABO O REFERIDO MÉTODO"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção fornece um método delicado de células esporádicas viáveis (células raras) de fluidos corporais como sangue, derrames malignos (ascites, derrame pleural), fluido de lavagem broncoalveolar, fluido de lavagem peritoneal e fluido amniótico. Utilizando o presente método é possível isolar, por exemplo, células tumorais circulantes (CTCs, células tumorais circulantes) e células tumorais disseminadas (DTCs, células tumorais disseminadas), células endometriais e células trofoblásticas circulantes (CTFC, células trofoblásticas fetais circulantes), permitindo a deteção, quantificação, caracterização subsequentes, e especialmente cultura.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Lesões metastáticas são a causa de morte mais comum em pacientes com carcinomas (Birchmeier, 1996). Durante a metastização, células tumorais desprendem-se do tumor primário e entram no fluxo sanguíneo diretamente ou através do sistema linfático, migrando em órgãos secundários e desenvolvendo um depósito metastático. Deteção de CTCs em pacientes com carcinoma metastático é associada ao pior prognóstico (Zharo 2011, Zhang 2012, Wang 2011). Apesar do seu grande significado clinico, uma caracterização molecular de CTCs continua a não ser realizada. Isto pode ser atribuído à extremamente baixa frequência de CTCs comparadas com o número de células sanguíneas. CTCs são geradas pelo processo de transição epitélio-mesenquimal(EMT), que é caracterizado por reduzir a expressão de marcadores epiteliais e aumentar a expressão de marcadores mesenquimais. Estas alterações promovem motilidade avançada, invasão e resistência à terapia (Thiery 2002, Shook 2003, Christofori 2006, Jechlinger 2003) . CTCs/DTCs representam a população de células tumorais disseminadas para órgãos distantes carregando a potencial criação de focos metastáticos micro e macro. Algumas das células tumorais de tumores primários e/ou CTCs e DTCs têm propriedades de células-tronco (CSCs, células-tronco cancerosas). A população das células-troco cancerosas tem a capacidade de autorregeneração e é resistente ao tratamento, significando um pior prognóstico. CTCs/CSCs têm enorme potencial no diagnóstico, prognóstico determinante, monitorização do efeito e risco terapêutico da doença (Mani 2008) .

Disseminação precoce do tumor dos gânglios linfáticos e do sangue é realizada com a circulação de células tumorosas (CTCs), e células cancerosas disseminadas (DTCs). As CTCs têm sido descritas como também ocorrendo em pacientes devido à ressecção dos tumores simples primários por lidar com o tumor primário. A deteção de CTCs é inquestionavelmente um fator de prognóstico em cancro. A deteção de CTCs pode potencialmente ser usada para diagnóstico ou como alternativa a biópsias invasivas para deteção precoce do tumor metastático que se espalha, e para configurar e acompanhar a eficácia da terapia em pacientes individuais. A quantidade e caraterísticas dos CTCs podem ser um fator de prognóstico para fatores de sobrevivência ou predição da resposta à terapia. A caracterização a longo termo de CTCs pode fornecer uma oportunidade para melhorar o acesso à resposta psicológica dinâmica. Além disso, mudanças no número de CTCs em comparação com as mudanças previamente controladas observadas por imageamento sugerem que a análise de CTCs pode ser mais importante para avaliação da sobrevivência que métodos de imageamento.

Em geral, há uma evidência válida de valores de prognóstico adverso de CTCs detetadas em cancro metastático colorretal, cancro de próstata, cancro dos ovários, cancro de mama. Também há estudos sobre o significado de CTCs na formação de tromboembolia venosa. Em pacientes com cancro metastático da mama e com CTCs detetadas (n > 1) no sangue periférico, foi observado incidência de trombose quatro vezes maior em comparação com pacientes sem CTCs (Mego 2009) . CTCs estão possivelmente envolvidas na ativação da coagulação através da expressão e libertação de elementos de tecido (Davila 2008) . CTCs estão presentes no sangue numa quantidade muito pequena de aproximadamente uma para dez mil milhões de células sanguíneas (Pantel 2001, Ziegelschmidt 2005) .

Atualmente, as tecnologias disponíveis usam diferentes métodos para a deteção de CTCs: uma separação do gradiente de densidade, uma separação imunomagnética, uma separação de um gradiente imunomagnético. Estes métodos são específicos para células e mais tolerantes que métodos de filtração por pressão, mas mediante ligação os anticorpos interagem com recetores e antígenos na membrana da célula, e desta forma CTCs/DTCs autênticas e viáveis são difíceis de selecionar. A presença de células esporádicas pode ser detetada indiretamente por RT-PCR, mas esta abordagem é muitas vezes limitada por uma baixa expressão de marcadores tumorais específicos e a não especificidade dos antígenos típica para CTCs e DTCs (Andreopoulou 2012). Adicionalmente, um alto grau de discrepância na expressão da superfície de antígenos entre tumores primários e CTCs/DTCs foi provada, sugerindo grande falta de fiabilidade no uso destes marcadores para a separação das CTCs/DTCs.

Devido ao tamanho das células CTC esporádicas separadas na maioria dos tumores epiteliais ser muito maior do que o tamanho da célula sanguínea, uma das maneiras mais eficazes da separação das CTCs é baseada no processo de filtração através de uma membrana filtrante, em que as células separadas permanecem na membrana e outras células passam através da membrana (Paterlini-Brechot et al. 2007, Vona 2000) . A utilização de um método de separação baseado em tamanho de CTCs/DTCs permite a deteção e separação de CTCs/DTCs sem dependência de recetores e antígenos de superfície, cuja expressão varia durante a doença de cancro. Métodos de filtração utilizados recentemente incluem um processo de filtração acelerada por pressão ou por vácuo (Mikulova, 2011); o gradiente de filtração é desta forma criado mudando-se a pressão. A desvantagem mais comum dos métodos de filtração é que há uma acumulação de precipitado, e uma precipitação na membrana filtrante, causando o entupimento do filtro, o que leva a captura das células sanguíneas no precipitado. Consequentemente, o precipitado e as células sanguíneas deterioram consideravelmente a possibilidade de avaliação da presença de células esporádicas no filtro sob o microscópio. As células sanguíneas capturadas podem ser removidas parcialmente por lavagem, no entanto o precipitado permanece no filtro. Por esta razão, agentes anticoagulantes adicionais são adicionados no aparelho de filtração (não apenas no tubo durante a colheita de sangue). Uma desvantagem fundamental, como com a maioria dos outros métodos, prejudica a viabilidade das células, então as células não se dividem normalmente mais e o seu cultivo subsequente é impossível.

Os documentos WO 2006/116327 Al e US 2012/0178097 Al revelam filtros de membrana para separação de células tumorais circulantes viáveis (CTCs), que são filtros biocompatíveis feitos de parileno ou policarbonato do tamanho de poro de 5 para 40 micrómetros.

Os documentos US 2010/324449 Al e US 5114350 A revelam filtros de contacto com um material absorvente. Todos os métodos correntemente utilizados têm também outra desvantagem, por exemplo, requerem a análise de grandes volumes de sangue, uma grande proporção de trabalho de laboratório, avaliação morosa (processamento de amostras leva várias horas), ou equipamentos e reagentes caros utilizados, e/ou os métodos carecem de confiabilidade, sensibilidade, eficiência, especificidade e estandardização necessárias para métodos de deteção de CTCs e DTCs de rotina.

Deste modo, seria desejado um método de separação de células, especialmente de células esporádicas de fluidos corporais, sendo o referido método reproduzível, mostrando uma boa avaliação da presença de células esporádicas no filtro sob um microscópio, que não exige tempo de processamento, equipamento e pessoal de operação, que não é caro mesmo com números aixos de amostras testadas, e que não exige reagentes caros com vencimento limitado. No processo de separação não deve ocorrer nenhuma interação com recetores e antígenos. 0 processo deve ser delicado para as células, a fim de permitir a seleção de células viáveis e CTCs/DTCs autênticas e utilizar as referidas células em experiências subsequentes in vitro e in vivo, possivelmente .

Além disso, um dispositivo facilmente fabricado seria desejável para levar a cabo o processo de isolamento de modo reprodutível, sendo economicamente acessível para a maioria dos laboratórios, adequado para manuseamento estéril de material potencialmente patológico. 0 referido dispositivo deve fornecer a possibilidade de deteção subsequente e/ou quantificação e/ou cultura de células separadas numa membrana filtrante, e pode estar disponível como uma variante descartável ou reutilizável.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

As deficiências dos métodos anteriores foram removidas e os requisitos estabelecidos foram cumpridos por um método de separação de células esporádicas de fluidos corporais de organismos humanos e animais, de acordo com a presente invenção, com a utilização de uma membrana filtrante posicionada num contato íntimo com um material absorvente.

Verificou-se que em contrapartida à filtração por pressão/vácuo, durante a filtração com a utilização de coagulação de força capilar (capilaridade) de proteínas a partir de fluidos corporais, como sangue ou plasma sanguíneo, ocorre numa extensão mínima, portanto não há necessidade de um anticoagulante adicional ao anticoagulante (EDTA) adicionado ao tubo de amostra de sangue para uma coleta de sangue normal. Se já estiver presente um coágulo no fluido corporal, a diluição por pequenas quantidades de um tampão, como PBS, é suficiente para evitar a coagulação. Consequentemente, a membrana filtrante não está a ser entupida (particularmente no início da filtração, como acontece normalmente na filtração por pressão/vácuo), e a separação é mais suave, mais rápida e completa.

Uma quantidade mais baixa do precipitado provoca uma quantidade mais baixa de células sanguíneas tais como glóbulos vermelhos retidos no referido precipitado, em que em princípio tanto o precipitado como tal e as células sanguíneas destroem a deteção da presença das células esporádicas no filtro. Obviamente, a avaliação correta da presença de células esporádicas é crucial, o tempo de filtração pode ser facilmente ajustado pela área de filtração utilizada, ou seja, a área da membrana filtrante e do material absorvente.

Além disso, foi observado que as células esporádicas capturadas na membrana permanecem mecanicamente e quimicamente inalteradas e, portanto, viáveis, o que permite o seu cultivo eficaz subsequente, que não é praticável por outros métodos, a partir da perspetiva dos resultados atuais.

Além disso, foi observado que para a diluição do fluido corporal ou enxágue das células esporádicas no respetivo filtro, o meio de cultura tal como RPMI pode ser utilizado diretamente para aumentar a taxa de sucesso da separação (e também do cultivo, se a finalidade é também, adicionalmente, cultivar as células esporádicas), enquanto a velocidade de separação da membrana filtrante, assim como da viabilidade celular, é retida. 0 fluido corporal filtrado livre das células esporádicas passa através dos furos na membrana filtrante, em que os elementos maiores que os furos na membrana filtrante são capturados (tamanho típico das células sanguíneas é inferior a 6 ym e o das células esporádicas, superior a 10 ym) .

As células esporádicas separadas são alojadas, devido ao seu tamanho, na membrana filtrante, cuja membrana pode, então, ser separada do material absorvente, sendo que a membrana está ainda fixa no suporte. Em outra modalidade, a membrana pode ser subsequente e completamente removida do suporte. O fluxo dos fluidos corporais, livre das células esporádicas, é continuamente acelerado através da membrana em virtude da força capilar que suga o líquido para um material absorvente. Não existe sobrepressão antes do filtro nem subpressão (vácuo) atras do filtro aplicado ao fluido corporal filtrado durante a filtração. O fluido é apenas sugado por força capilar, sem a necessidade de qualquer regulação, a uma velocidade adequada através do filtro para o material absorvente. (Neste contexto, a pressão hidrostática exercida no filtro pela altura da coluna do fluido corporal é desconsiderada). A quantidade de força capilar provoca a filtração contínua do fluido, sem qualquer obstrução posterior ou na membrana filtrante, conforme observado frequentemente, por exemplo, em métodos que se utiliza o vácuo atrás do filtro ou uma sobrepressão antes do filtro. A vantagem da solução, de acordo com a invenção, é alta eficiência na captura mesmo de células esporádicas menos concentradas e aceleração do processo de separação, assim como também a velocidade de deteção e aumento da eficiência de cultivo. Quando é utilizado o método, de acordo com a invenção, não é observado interação de células esporádicas com recetores e antígenos e, deste modo, é impossível selecionar CTCs/DTCs autênticas e viáveis, que podem, então, ser utilizadas em experiências in vitro e in vivo. 0 método permite manter as células filtradas em condições vitais muito boas para futuras análises. Não é necessário equipamento laboratorial especial. 0 método permite o processo de volumes relativamente grandes de sangue ou outros fluidos corporais (por exemplo, 50 ml).

Em conformidade, a presente invenção fornece um método para separação de células esporádicas presentes no fluido corporal de um paciente através da sua captura numa membrana filtrante, que tem aberturas mais pequenas que o diâmetro das células, em que a partir das células esporádicas presentes no referido fluido corporal, presente no primeiro lado da membrana filtrante, o fluido corporal livre de células esporádicas é extraído através da membrana filtrante, em virtude da força capilar para um material absorvente posicionado num contacto íntimo com o segundo lado da referida membrana filtrante. Células esporádicas presentes no fluido corporal são, por exemplo, células tumorais circulantes, células tumorais disseminadas, células endometriais e células trofoblásticas fetais circulantes. 0 fluido corporal é qualquer fluido obtido diretamente (por colheita) ou indiretamente (com tratamentos subsequentes de qualquer tipo) de um corpo animal ou humano. Preferencialmente, é selecionado do grupo sanguíneo central ou periférico, medula óssea, fluido ascítico, derrame pleural, fluido de lavagem peritoneal e fluido amniótico. 0 objeto de teste pode ser, preferencialmente, um paciente com cancro primário ou doença metastática. A amostra de teste pode ser também coletada de modo bem sucedido a partir de um animal que foi aprovado como modelo metastático experimental.

Em outra modalidade, o sangue periférico é sangue periférico anticoagulado, tal como o sangue coletado para um tubo regular de colheita de sangue, que compreende um anticoagulante como EDTA.

Se o fluido corporal compreender precipitado antes da separação, o fluido corporal filtrado é, preferencialmente, diluído com um tampão adequado como PBS (solução salina isotónica com tampão de fosfato) e/ou TrypLE™ de modo a dissolver o precipitado e tornar a filtração/separação mais fácil. A invenção, contudo, não exclui a utilização de quaisquer métodos conhecidos para a prevenção de formação de coágulos de sangue durante a colheita de sangue. Um exemplo é uma dissolução opcionalmente enzimática de carregamento gradual (por exemplo, com a utilização de TrypLE™, Invitrogen), contudo é preferencial que a dissolução não seja utilizada.

Para melhorar a filtração, no caso da presença de precipitados sanguíneos, o sangue periférico pode ser adicionalmente diluído por uma solução PBS ou por meio de cultivo. De modo a remover os precipitados sanguíneos e outras impurezas compactas, sangue ou outros fluidos corporais podem também ser filtrados através de um coador com tamanho de poro de, por exemplo, 0,1 mm, que é depois lavado várias vezes com PBS. Depois disso, o volume do sangue residual é carregado. Finalmente, o tubo de colheita de sangue é enxaguado com PBS, cujo volume é filtrado através do coador.

As células esporádicas separadas podem, então, ser enxaguadas no filtro para melhor avaliação microscópica, por exemplo, pelo tampão tal como PBS ou por um meio tal como RPMI. Comparado com filtração a vácuo, o método de acordo com a invenção fornece benefícios substanciais em todos os aspetos.

As células separadas podem, então, ser analisadas adicionalmente, por exemplo, microscopicamente, de preferência após imuno-histoquímica ou outra coloração, quantificadas (por exemplo, microscopicamente de forma manual ou automática) ou cultivadas ou, de outro modo, processadas. Em outras modalidades, a deteção e/ou quantificação e/ou cultivo das células separadas é levado a cabo depois da separação, diretamente na membrana filtrante ou num vaso de cultura.

Os filtros com células esporádicas podem ser armazenados por períodos mais longos congelados, secos ou fixados por métodos convencionais em utilização para serem analisados posteriormente.

Como já foi constatado, principalmente no caso em que o cultivo subsequente das células esporádicas é planejado, o fluido corporal pode ser diluído diretamente pelo meio de cultura utilizado no subsequente cultivo de células separadas anterior à separação, tal como por meio RPMI, e assim aumentando mais a taxa de êxito de filtração e subsequente cultivo. 0 cultivo subsequente das células esporádicas pode ser levado a cabo de maneira convencional num incubador a 37 °C e 5% de CO2 numa placa de cultura convencional ou garrafa de vidro ou plástico após a lavagem do filtro das células. Para este propósito, por exemplo, o filtro é enxaguado com 2 x 1 ml de meio RPMI, e o meio com células é transferido para uma placa de 24 poços, onde as células podem ser cultivadas diretamente na superfície da placa de plástico ou na lamela inserida no microscópio. A cultura na lamela é preferencial se a análise imuno-histoquímica e imuno-fluorescente das células é requerida.

Preferencialmente, o cultivo é levado a cabo ao inserir o filtro que contém células capturadas no meio da cultura numa placa de cultura, ou ao verter o meio da cultura no filtro com as células capturadas inseridas na placa de cultura.

Em outra modalidade preferencial, o cultivo é levado a cabo ao transferir a membrana filtrante montada no suporte descrito abaixo, imediatamente após a separação, por exemplo, numa placa de cultura de 6 poços com um meio de crescimento adicionado em cada poço. As células podem então ser cultivadas como uma cultura de tecido padrão.

Em uma modalidade da invenção, um fluido corporal é o fluido corporal de pacientes com melanoma, cancro de mama, cancros do trato gastrointestinal tais como cancro gástrico, cancro de cólon, cancro de pâncreas e cancro de fígado; tumores urogenitais e tumores de tecidos moles, como tumores de cabeça e pescoço e outros tumores sólidos. 0 método e aparelho da presente invenção podem ser utilizados, por exemplo, para a separação de células tumorais circulantes (CTCs) de sangue periférico ou central, células tumorais do trato gastrointestinal (esófago, estômago, intestino grosso e pequeno, fígado, pâncreas, vesícula e vias biliares), tumores do sistema urogenital (ovário, endométrio, próstata, bexiga, testículo), tumores do sistema respiratório (pulmão, mediastino, trato respiratório superior), tumores do sistema neuroendócrino, tumores ósseos, tumores de cabeça e pescoço, tumores de mama, tumores metastáticos sem localização primária e outros tumores sólidos menos frequentes. 0 método e aparelho de acordo com a presente invenção também podem ser utilizados para doenças hematopoiéticas selecionadas, tumores neuroendócrinos, células tumorais disseminadas de ascite, de derrames pleurais, de expetoração, de lavagens (lavagens broncoalveolares, lavagens de peritoneu e cavidade torácica, lavagens de retroperitoneu, etc.), para células endometriais circulatórias e disseminadas (do sangue e das lavagens).

Uma utilização importante também se aplica à separação de células trofoblásticas fetais circulantes (CFTCs) do sangue ou fluido amniótico, porque CFTCs estão presentes no sangue materno periférico da 5a semana de gestação e não permanecem na circulação sanguínea após o final da gravidez (Bianchi et ai., 1996) . CFTC são, portanto, uma fonte muito atrativa de ADN/ ARN para examinação por um diagnóstico pré-natal não invasivo (PND-Nl). Ao comparar os testes com base em CFTC e coriocentese, tanto sensibilidade quanto especificidade diagnóstica de 100% foram confirmadas para testes com base no CFTC. A característica básica pela qual as células CFTC diferem das células sanguíneas no seu tamanho (células CFTC atingem um tamanho padrão 10 ym e mais). Relatórios atuais indicam que uma mulher grávida tem 99% de probabilidade de cada célula com tamanho superior a 15 ym, ser de origem embriónica, assim CFTC (Mouawia, 2012). Devido à nova metodologia, é agora possível separar reprodutivamente CFTC incólumes e utilizá-las para futuras análises. A deteção de CTCs e DTCs pode ser levada a cabo em modelos tumorais de animais e CTCs/ DTCs podem ser detetadas em indivíduos com mais do que um tipo de tumor.

Após a separação, as células podem ser processadas por ambos os métodos de imuno-histoquímica e métodos unicelulares para expressão do gene. A invenção fornece ainda um aparelho para executar a separação de uma mistura de células esporádicas presentes no fluido corporal de um paciente pelos métodos descritos acima, em que o aparelho compreende uma membrana filtrante posicionada em contacto intimo com o material absorvente. A geometria da membrana geralmente envolve o tamanho, forma e densidade dos poros da membrana. A eficácia do filtro da membrana pode assim ser otimizada ao ajustar o tamanho, forma e densidade dos poros da membrana. Tal construção da membrana é selecionada, na qual é preferencial a captura do tumor e células esporádicas em vez das células sanguíneas. A membrana filtrante é, de preferência, uma membrana que captura células esporádicas de dimensões acima de 10 ym e transmite elementos sanguíneos de tamanho até 6 ym, isto é, a membrana tem o tamanho de poro de 7 a 10 ym, por exemplo, 8 ym ou de valor semelhante, por exemplo, dentro da escala de ± 1 ym declarado pelo fabricante. A membrana filtrante é, de preferência, feita de material biocompatível, tal como policarbonato, que oferece as vantagens de flexibilidade e biocompatibilidade.

Minimizar os efeitos de coagulação e aumentar a velocidade da filtração pode ser ainda alcançado com a utilização de um filtro maior com a maior superfície de filtração disponível. Membranas de policarbonato com tamanho de poro de 8 ym com diâmetro de membrana de 25 mm podem ser usadas, por exemplo. O termo "um contacto íntimo" refere-se a um contacto tão próximo da membrana filtrante e do material absorvente que a ação capilar através da membrana para o material absorvente não é afetada, a saber, um acesso de ar à interface entre a membrana e o material absorvente, que está em contacto direto com o líquido filtrado apenas através dos poros na membrana, é impedido durante a operação. Isto pode ser conseguido, por exemplo, empurrando as bordas da membrana ou a membrana apertada num aparelho adequado, na superfície do material absorvente, ou empurrando as bordas da membrana montadas num suporte adequado sob leve pressão na superfície flexível do material absorvente. 0 material absorvente tem capacidade de absorção suficiente e tem a capacidade de absorver suavemente todos os elementos sanguíneos e outros elementos que estão presentes no fluido corporal de viscosidade variável, e o absorvente consiste principalmente em poupa, papel fino, fibras têxteis ou combinações dos mesmos em particular. 0 volume do fluido corporal filtrado é limitado pela capacidade de sucção do material absorvente e pelo seu volume. 0 tamanho e/ou o volume do aparelho e as características do material absorvente podem, portanto, ser adaptados à utilização pretendida. Vantajosamente, utilizando um único aparelho, um volume de 50 ml e mais pode ser filtrado. O método e o aparelho funcionam mesmo a partir de um volume mínimo de sangue, como menos de 1 ml, no entanto, com o aumento do volume de fluido corporal filtrado, aumenta a probabilidade de capturar as células esporádicas.

Preferencialmente, o aparelho de acordo com a invenção compreende ainda um recipiente oco aberto em cima e embaixo para receber uma mistura de células esporádicas presentes no fluido corporal, em que a periferia inferior do recipiente está em contacto estreito com pelo menos uma parte do primeiro lado superior da membrana e em que pelo menos uma parte do segundo lado inferior da membrana está em contacto intimo com o material absorvente, de modo a que a membrana separe o espaço interno do recipiente do referido material absorvente. A borda superior do recipiente pode, de preferência, ser ampliada para obter um funil e/ou a referida borda pode ser dotada de um coador para remover coágulos já presentes no sangue, etc.

Pelo motivo acima, para alcançar a área de filtração máxima pelo menos parte do primeiro lado da membrana e pelo menos parte do segundo lado da membrana são colocados um contra o outro na maior área que maximiza a área de contato entre o material absorvente e células esporádicas presentes no fluido corporal, separadas por uma membrana.

Em outra modalidade, o material absorvente está disposto num recipiente de base de colheita, dotado de uma tampa superior, em que a tampa do topo de um suporte de membrana circunferencial desbloqueia e engata e em que o referido suporte, por meio de um anel de pressão, desbloqueia firmemente e mantém a membrana ao longo da sua circunferência, e em que para o reservatório do topo o suporte é firmemente afixado ao longo da circunferência do referido suporte. Preferencialmente, o aparelho é designado para uma só utilização, mas nenhuma modalidade do aparelho para reutilização de todos os elementos, exceto a membrana e o material absorvente, é excluída.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 ilustra uma modalidade de um aparelho de filtro em duas vistas A Figura 2 mostra uma modalidade de um aparelho de filtro numa vista expandida (o material absorvente não é mostrado) A Figura 3 ilustra uma modalidade de fixação da membrana no suporte A Figura 4 mostra uma célula de cultura CTCs in vitro separada de sangue periférico do paciente com cancro de próstata, CTCs cultivadas numa membrana filtrante A Figura 5 mostra a cultura de CTCs in vitro na membrana filtrante, método de coloração May-Grunwald foi usado para análises hematológicas A Figura 6 ilustra o processamento de células separadas por imuno-histoquimica, (CTCs isoladas do sangue de um paciente com cancro de próstata metastático manchadas por anticorpo contra a pan-citoqueratina) A Figura 7 mostra um par de CTCs separadas, que no decorrer do cultivo penetraram o filtro no fundo dos poços de cultura (o método de coloração May-Grunwald foi usado para análises).

EXEMPLOS

Abreviações: CTCs: células tumorais circulantes DTCs: células tumorais disseminadas CFTC: células trofoblásticas fetais circulantes NI-PND: diagnóstico pré-natal não invasivo PBS: solução de tampão de fosfato com NaCl a 0,15 M, essencialmente solução salina tamponada FBS: soro fetal bovino EDTA: Quelação 2, ácido etilenodiaminotetracético Exemplo 1

Determinação de células tumorais circulantes no cancro de próstata do sangue periférico dos pacientes submetidos à cirurgia de remoção do tumor primário

5 a 10 ml de sangue periférico são coletados durante a cirurgia para um tubo de colheita com EDTA (por exemplo, Vacuette K3E (REF 456 036) , S-monovette K3E (REF 02,1066,001). O sangue é processado imediatamente ou armazenado a 4 °C por um período máximo de 24 horas. O sangue periférico é gradualmente aplicado pela pipeta no recipiente 3 do aparelho para executar a filtração. O sangue presente no primeiro lado da membrana 1 é filtrado através da membrana filtrante 1 de diâmetro de 2 5 mm, que consiste numa membrana de policarbonato (PCTE) com um tamanho de poro de 8 microns (GE, Policarbonato, 8,0 microns, 25 mm) , em que a membrana filtrante 1 está num contacto íntimo com o material absorvente 2, a pasta de papel (Pur-Zellin Hartmann). O processo de filtração demora cerca de 5 minutos, dependendo do volume de sangue filtrado e da viscosidade do sangue.

Adicionalmente, é possível proceder de várias maneiras: 1. Após filtração, a membrana filtrante 1, fixada num suporte 6 e que compreende CTCs isoladas, é transferida para um poço de uma placa de cultura de 6 poços à qual o crescimento médio do RPMI (4 ml), RPMI (Sigma R8758), enriquecido com FBS (F2442, Sigma) e antibióticos (Penicilina-Estreptomicina (P4458, Sigma), Anfotericina (A2942), Sigma) são adicionados. A células capturadas são depois cultivadas como cultura de tecido normal, por pelo menos 14 dias a 37 °C, 5% de CO2, com uma mudança de meio a cada 3 dias. A cultura de células cultivadas foi manchada de acordo com o protocolo padrão de May-Grunwald, coloração imuno-histoquímica e uma fotografia de um microscópio de luz invertida é mostrada na Figura 4. A Figura 5 mostra uma disposição semelhante de uma variação de coloração imuno-fluorescente de CTCs no cancro de próstata (pan-citoqueratina-FITC, Sigma), coberta com Prolong Gold™ com DAPI). 2. Após filtração, a membrana filtrante 1 que compreende CTCs isoladas é enxaguada com 1 ml de meio, e o referido meio com células lavadas do filtro é depois transferido para uma placa de 24 poços, onde é sobreposto numa lâmina de microscópio, colocado no fundo do poço (Assistent, N° 1.001, 12 mm de diâmetro). As células são depois cultivadas diretamente na lâmina do microscópio, que facilita mais o manuseamento durante a coloração imuno-histoquímica e a análise imuno-histoquímica subsequente, pelo menos 14 dias a 37 °C, numa atmosfera de 5% de CO2, com mudança de meio a cada 3 dias. 3. Após filtração, a membrana filtrante 1 que compreende CTCs isoladas é enxaguada com 1 ml do meio, o meio com as células da membrana é depois transferido por uma pipeta para câmaras de cultura (Nunc® Lab-Tek® ChamberSlide™ (4 câmaras) para microscopia confocal (o sistema para vídeo em tempo real que captura imagens de intervalo de tempo, Leica) e depois cultivado como cultura de tecido normal por pelo menos 14 dias a 37 °C, atmosfera de 5% de CO2, com mudança de meio a cada 3 dias.

Em todos os exemplos acima mencionados, o cultivo tanto das células esporádicas na membrana como das células esporádicas enxaguadas da membrana foi realizado sem quaisquer problemas. Do mesmo modo, o cultivo das células de outros tipos de tumores isolados pelo método da presente invenção foi realizado sem quaisquer problemas. Em contrapartida, o cultivo bem-sucedido de células esporádicas, separadas de fluidos corporais de pacientes por métodos conhecidos na técnica tanto numa membrana como sem a membrana, ainda não foi evidenciado. 4. Após a filtração e enxágue das células esporádicas capturadas no filtro 2 ml de RPMI, a membrana filtrante 1 montada num suporte que contem CTCs isoladas é manchada diretamente por padrão de protocolo de coloração May-Grunwald e a presença das células esporádicas é avaliada sob o microscópio.

Exemplo 2

Determinação de células tumorais disseminadas em cancro de ovário metastático do derrame pleural Células tumorais disseminadas do derrame pleural removidas de um paciente com cancro de ovário metastático foram separadas como se segue: o derrame foi aplicado por uma pipeta no recipiente 3 do aparelho de filtração. 0 derrame no primeiro lado da membrana 1 é filtrado através da membrana filtrante 1 de 25 mm de diâmetro, feita de membrana policarbonato (PCTE) com tamanho de poro de 8 pm conforme Exemplo 1, em que o material absorvente 2, pasta de papel (Pur-Zellin, Hartmann) é imediatamente adjacente à membrana filtrante 1. As células foram fixadas ao filtro e analisadas como manchas sanguíneas hematológicas, manchadas pelo protocolo de coloração padrão May-Grunwald e avaliadas sob o microscópio.

Exemplo 3

Aparelho para executar a filtração

Uma modalidade do aparelho para executar a filtração mostrada nas Figuras 1 a 3, compreende uma membrana filtrante de policarbonato 1, com tamanho de poro de 8 pm, com a qual o material absorvente 2 que consiste numa pasta de papel está em contacto íntimo, do lado inferior de referida membrana. 0 aparelho inclui ainda um recipiente oco de abertura superior e inferior 3 para receber uma mistura de células esporádicas presentes no fluido corporal. Para uma vertedura mais fácil dos líquidos, a borda superior do recipiente 3 é ampliada de modo a formar um funil. A periferia inferior do recipiente 3 está em contacto firme com o primeiro lado superior da membrana 1, e o segundo lado inferior da membrana 1 está num contacto intimo com o material absorvente 2, de modo a que a membrana 1 separe o espaço interno do recipiente 3 do referido material absorvente 2. 0 material absorvente 2 está disposto na base de um recipiente de colheitas 4 dotado de uma tampa superior 5, em que a tampa do suporte de membrana circunferencial 6 engata livremente a partir do topo. 0 suporte 6 é móvel verticalmente em relação à tampa 5 e, portanto, também em relação ao material absorvente 2, que permite o contacto intimo da membrana filtrante 1 ao material absorvente 2, ou o impulso do anel de pressão 7 para o material absorvente 2 respetivamente, para contacto perfeito da membrana 1 e do material absorvente 2. 0 suporte 6 suporta a membrana 1 ao longo da sua circunferência pelo anel de pressão 7 firmemente desbloqueado com a utilização de um fio, para que o conjunto do suporte 6, a membrana filtrante 1 e o anel de pressão 7 possam ser removidos do aparelho como um todo, e as células capturadas podem ser manchadas ou cultivadas diretamente na membrana 1. 0 recipiente 3 é fixado livremente por uma ligação de baioneta ao suporte 6 ao longo da sua circunferência.

Exemplo 4

Comparação de dois tipos tecnologia de filtro em relação à presença do precipitado 0 objetivo da experiência era comparar a filtração de células sanguíneas que contêm células esporádicas aceleradas por vácuo com a filtração, utilizando forças capilares, de acordo com a invenção, em relação a uma avaliação da presença de células esporádicas coletadas na membrana filtrante, que depende principalmente da presença de um precipitado e elementos residuais de células sanguíneas na membrana filtrante.

Ambos os processos utilizam uma membrana com tamanho declarado de um poro de 7 a 8 ym e um material absorvente conforme o Exemplo 1. De modo a alcançar aproximadamente tempos de filtração equivalentes, foram utilizados diferentes tamanhos de filtros - o filtro com diâmetro de 7 mm foi utilizado para filtração em vácuo e o filtro de diâmetro de 25 mm para filtração, utilizando forças capilares. 0 mesmo volume de 2 ml de sangue obtido conforme no Exemplo 1 de um paciente com cancro de próstata foi filtrado através de dois sistemas de membranas a temperatura ambiente, com os tempos de filtração 87 s para a filtração, utilizando o sistema vácuo e 97 s para a filtração, utilizando forças capilares, de acordo com a invenção.

Foi observada uma ocorrência frequente de precipitado de sangue em filtros, no caso de filtração a vácuo, que tornou impossível a aferição da presença de células esporádicas no filtro durante a microscopia. Quando é utilizado o método de filtração por forças capilares, de acordo com a invenção, nenhum precipitado está presente no filtro.

Exemplo 5

Comparação de dois tipos de tecnologia de filtro do ponto de vista de enxágue A mesma configuração foi utilizada conforme no Exemplo 4, exceto que a amostra de sangue foi tirada de um paciente com cancro de mama. Uma vez que foi encontrado frequentemente a formação de coágulos durante a filtração a vácuo neste tipo de amostras, o que levou a uma avaliação difícil principalmente devido a glóbulos vermelhos presos no precipitado, os filtros foram lavados com 2 ml adicionais de meio de cultura (RPMI), após filtração do sangue.

Como esperado, precipitado permaneceu no filtro após a filtração a vácuo, mas o enxágue ajudou a remover o resíduo dos glóbulos vermelhos, e assim a avaliação geral da presença de células esporádicas no filtro após o enxágue com RPMI é melhor do que no caso de sem enxágue. 0 tempo total de enxágue e filtração para o filtro com um RPMI médio foi 4 min 37 s.

Após utilizar forças capilares para filtração, o filtro mostrou uma avaliação melhor, mesmo sem enxágue, do que o filtro após a utilização do vácuo. A avaliação da presença de células esporádicas no filtro após enxágue com RPMI, melhorou e foi melhor que a avaliação do filtro enxaguado com a utilização de vácuo. 0 tempo total de enxágue e filtração para o filtro com RPMI médio foi apenas 39 s neste caso.

Em conformidade, a vantagem da utilização de forças capilares para a separação filtrante de células esporádicas, ambas da perspetiva da ocorrência de coágulos e também da perspetiva da avaliação da presença de células esporádicas, foi confirmada. Além disso, uma redução no tempo de filtração foi observada na etapa de enxágue com RPMI médio.

Lisboa,

Claims (14)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Utilização caracterizada por ser de um método para separação de células esporádicas, presentes nos fluidos corporais de um paciente, capturando-as numa membrana filtrante que tem aberturas mais pequenas que os diâmetros das células, no qual, das células esporádicas dos referidos fluidos corporais presentes no primeiro lado da membrana filtrante, o fluido corporal liberto de células esporádicas é extraído através da membrana filtrante em virtude da força capilar num material absorvente posicionado num contacto intimo com o segundo lado da referida membrana filtrante, para obter as referidas células esporádicas capturadas na membrana restante, mecanicamente e quimicamente inalteradas e, por isso, viáveis, permitindo o seu cultivo eficaz subsequente.
2. 2. Utilização, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por as células esporádicas presentes no fluido corporal serem células tumorais circulantes, células tumorais disseminadas, células endometriais e células trofoblásticas fetais circulantes.
3. 3. Utilização, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada por o fluido corporal que ser selecionado a partir do sangue periférico ou central, medula óssea, fluido ascitico, derrame pleural, fluido de lavagem peritoneal, fluido de lavagem broncoalveolar e fluido amniótico.
4. 4. Utilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações antecedentes, caracterizada por o referido fluido corporal ser um fluido corporal de pacientes com melanoma, cancro da mama, tumores do trato gastrointestinal, tais como carcinoma gástrico, carcinoma do cólon, carcinoma do pâncreas e carcinoma pulmonar; tumores urogenitais e tumores de tecidos moles, tais como tumores da cabeça e do pescoço e outros tumores sólidos.
5. 5. Utilização, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por o sangue periférico ser colhido como sangue periférico anticoagulado.
6. 6. Utilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações antecedentes, caracterizada por, previamente à separação, o precipitado que contém fluido corporal ser diluído com um tampão, em particular com PBS, a fim de dissolver o precipitado.
7. 7. Utilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações antecedentes, caracterizada por, subsequentemente à separação, deteção e/ou quantificação e/ou cultura de células separadas na membrana filtrante, ou células expulsas da membrana filtrante num vaso de cultura, ser levada a cabo.
8. 8. Utilização, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por, antes da separação, o fluido corporal ser diluído com uma cultura média, RPMI em particular, para aumentar o sucesso do cultivo subsequente.
9. 9. Aparelho para separação de células esporádicas, presentes no fluido corporal de um paciente, capturando-as numa membrana filtrante que tem aberturas mais pequenas que os diâmetros das células, no qual, das células esporádicas presentes nos referidos fluidos corporais presentes no primeiro lado da membrana filtrante, o fluido corporal libertado de células esporádicas é extraído através da membrana filtrante em virtude da força capilar num material absorvente posicionado num contacto intimo com o segundo lado da referida membrana filtrante, para obter as referidas células esporádicas capturadas na membrana restante, mecanicamente e quimicamente inalteradas e, por isso, viáveis, permitindo o seu cultivo eficaz subsequente, caracterizado por o referido aparelho compreender um recipiente oco de abertura superior e inferior (3) para receber uma mistura de células esporádicas presentes no fluido corporal, sendo que a periferia inferior do recipiente (3) está em contacto apertado com uma parte superior do primeiro lado da membrana (1), a referida membrana tem um tamanho de poro de 7 a 10 ym e é feita de um material biocompativel, e sendo que pelo menos uma parte inferior do segundo lado da membrana (1) está em contacto intimo com o material absorvente (2) para que a membrana (1) separe o espaço interno do recipiente (3) do referido material absorvente (2) .
10. 10. Aparelho, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o material absorvente (2) ser disposto num recipiente de base de colheitas (4) dotado de uma tampa superior (5), em que a tampa do suporte da membrana circunferencial (6) engata livremente a partir do topo, e em que o tal suporte (6), por meio de um anel de pressão (7), firmemente liberta o suporte da membrana (1) juntamente com a sua circunferência, e em que o reservatório (3) de cima do suporte (6) está firmemente apertado ao longo da circunferência do tal suporte (6).
11. 11. Aparelho, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado por a membrana filtrante (1) ter um tamanho de poro de 8 pm.
12. 12. Aparelho, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 11, caracterizado por a membrana filtrante (1) ser feita de policarbonato.
13. 13. Aparelho, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 12, caracterizado por o material absorvente (2) ser composto de celulose, papel fino, fibras têxteis, ou uma combinação dos mesmos.
14. 14. Utilização, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por levar a cabo a deteção e/ou quantificação e/ou cultivo, as células separadas são transferidas na membrana filtrante (1) fixas num suporte (6) da reivindicação 10. Lisboa,