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PT2666016T - Utilização de bubr1 como um biomarcador da resposta farmacológica a furazanobenzimidazolos - Google Patents

Utilização de bubr1 como um biomarcador da resposta farmacológica a furazanobenzimidazolos Download PDF

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PT2666016T
PT2666016T PT127013415T PT12701341T PT2666016T PT 2666016 T PT2666016 T PT 2666016T PT 127013415 T PT127013415 T PT 127013415T PT 12701341 T PT12701341 T PT 12701341T PT 2666016 T PT2666016 T PT 2666016T
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PT
Portugal
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compound
cancer
bubr1
pharmaceutically acceptable
cells
Prior art date
Application number
PT127013415T
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English (en)
Inventor
Alexandra Lane Heidi
Bachmann Felix
Breuleux Madlaina
Boutros Michael
Gilbert Daniel
Zhang Xian
Original Assignee
Basilea Pharmaceutica Ag
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Publication date
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Description

DESCRIÇÃO "UTILIZAÇÃO DE BUBR1 COMO UM BIOMARCADOR DA RESPOSTA FARMACOLÓGICA A FURAZANOBENZIMIDAZOLOS" A presente invenção refere-se à utilização de BUBR1 como um biomarcador para prever a resposta de uma doença, como uma doença neoplásica ou autoimune, preferencialmente cancro, a um composto da fórmula geral I, tal como 3— (4 — {1— [2 — (4 — amino-fenil)-2-oxo-etil]-lH-benzoimidazol-2-il}-furazano-3-ilamino)-propionitrilo (BAL27862). Noutros aspetos relaciona-se com métodos e kits, bem como métodos de tratamento envolvendo a utilização do biomarcador.
Os microtúbulos são um dos componentes do citoesqueleto celular e são compostos por heterodímeros de alfa e beta tubulina. Os agentes que se direcionam a microtúbulos estão entre os agentes quimioterápicos citotóxicos mais eficazes, possuindo um amplo espectro de atividade. Agentes desestabilizadores dos microtúbulos (por exemplo, os vinca alcaloides como vincristina, vimblastina e vinorelbina) são utilizados por exemplo no tratamento de vários tipos de neoplasias hematológicas, tais como a leucemia linfoblástica e linfoma, bem como tumores sólidos, como o cancro do pulmão. Agentes estabilizadores dos microtúbulos (por exemplo, os taxanos como paclitaxel, docetaxel) são utilizados por exemplo no tratamento de tumores sólidos, incluindo cancro da mama, pulmão e próstata.
Contudo pode ocorrer resistência a estes agentes conhecidos que se direcionam a microtúbulos. A resistência pode ser quer inerente ou pode ser adquirida após a exposição a tais agentes. Tal resistência tem então impacto nas taxas de sobrevivência dos pacientes, bem como nas escolhas dos regimes de tratamento. Vários mecanismos potenciais de resistência têm sido identificados, e incluem defeitos dos alvos dos microtúbulos, tais como níveis elevados de beta-tubulina de subtipo III e mutações adquiridas na beta-tubulina de subtipo I que são conhecidas por reduzir a ligação a taxanos. Em acréscimo, defeitos noutras proteínas celulares têm sido sugeridos como estando associados à resistência a certos agentes que se direcionam a microtúbulos, tais como a sobreexpressão da glicoproteína-p (P-gp, também conhecida como proteína de resistência a multi-fármacos 1 ou MDR1). Tais fatores podem ser utilizados como biomarcadores da resistência a estes agentes convencionais que se direcionam a microtúbulos.
Uma classe descoberta relativamente recentemente de agentes desestabilizadores dos microtúbulos são os englobados pela fórmula dada abaixo:
m em que R representa fenil, tienil ou piridinil em que fenil é opcionalmente substituído por um ou dois substituintes independentemente selecionados a partir de alquil, haloalquil inferior, hidroxialquil inferior, alcoxi inferior alquil inferior, aciloxialquil inferior, fenil, hidroxi, alcoxi inferior, hidroxialcoxi inferior, alcoxi inferior alcoxi inferior, fenilalcoxi inferior, alquilcarboniloxi inferior, amino, monoalquilamino, dialquilamino, alcoxicarbonilamino inferior, alquilcarbonilamino inferior, amino substituído em que dois substituintes no nitrogénio formam em conjunto com ο nitrogénio heterocíclico, alquilcarbonil inferior, carboxi, alcoxicarbonil inferior, ciano, halogénio, e nitro; e em que dois substituintes adjacentes são metilenodioxi; e em que piridinil é opcionalmente substituído por alcoxi inferior, amino ou halogénio; X representa um grupo C=Y, em que Y representa oxigénio ou nitrogénio substituído por hidroxi ou alcoxi inferior; R1 representa hidrogénio, alquilcarbonil inferior, hidroxialquil inferior ou cianoalquil inferior; R2, R3 e R6 representam hidrogénio; R4 e R5, independentemente um do outro, representam hidrogénio, alquil inferior ou alcoxi inferior; ou R4 e R5 em conjunto representam metilenodioxi; e sais farmaceuticamente aceitáveis resultantes dos mesmos; ou em que R representa fenil ou piridinil em que fenil é opcionalmente substituído por um ou dois substituintes independentemente selecionados a partir de alquil, haloalquil inferior, hidroxialquil inferior, alcoxi inferior alquil inferior, aciloxialquil inferior, fenil, hidroxi, alcoxi inferior, hidroxialcoxi inferior, alcoxi inferior alcoxi inferior, fenilalcoxi inferior, alquilcarboniloxi inferior, amino, monoalquilamino, dialquilamino, alcoxicarbonilamino inferior, alquilcarbonilamino inferior, amino substituído em que dois substituintes no nitrogénio formam em conjunto com o nitrogénio heterocíclico, alquilcarbonil inferior, carboxi, alcoxicarbonil inferior, formil, ciano, halogénio, e nitro; e em que dois substituintes adjacentes são metilenodioxi; e em que piridinil é opcionalmente substituído por alcoxi inferior, amino ou halogénio; X representa oxigénio; R1 representa hidrogénio, alquilcarbonil inferior, hidroxialquil inferior ou cianoalquil inferior; R2, R3 e R6 representam hidrogénio; R4 e R5, independentemente um do outro, representam hidrogénio, alquil inferior ou alcoxi inferior; ou R4 e R5 em conjunto representam metilenodioxi; e sais farmaceuticamente aceitáveis resultantes dos mesmos; e em que o sufixo inferior denota um radical possuindo até e incluindo um máximo de 7, especialmente até e incluindo um máximo de 4, átomos de carbono.
Estes compostos são divulgados em W02004/103994 AI. Estes compostos têm demonstrado reter a proliferação de células tumorais e induzir apoptose. A síntese dos compostos da fórmula I é descrita em W02004/103994 Al, em geral nas páginas 29-35, e especificamente nas páginas 39-55. Estes podem ser preparados conforme divulgado ou por um método análogo aos processos aí descritos.
Um composto que recai sobre esta classe, conhecido como BAL27862, e mostrado em W02004/103994 Al como o exemplo 58, possui a estrutura e nome químico dados abaixo;
Nome químico: 3-(4 —{1—[2-(4-Amino-fenil)-2-oxo-etil]-lH-benzoimidazol-2-il}-furazano-3-ilamino)-propionitrilo.
Ou aqui como Composto A
Outros compostos exemplificados em W02004/103994 AI como os exemplos 50 e 79 respetivamente, possuem as estruturas e nomes químicos abaixo:
Nome químico: 2-[2-(4-Amino-furazano-3-il)-benzoimidazol-1-il]-1-(4-amino-fenil)-etanona
ou aqui como Composto B e
Nome químico: 3-(4-{1-[2-(6-Amino-piridina-3-il)-2-oxo- etil]-lH-benzoimidazol-2-il}-furazano-3-ilamino)-propionitrilo ou aqui como Composto C. BAL27862 tem demonstrado atividade através de um amplo painel de modelos experimentais de xenoenxertos de tumores sólidos. Em acréscimo, a atividade é mantida mesmo em modelos tumorais os quais foram selecionados quanto à resistência a agentes convencionais que se direcionam a microtúbulos (incluindo os agentes desestabilizadores de microtúbulos vinca alcaloides e agentes estabilizadores de microtúbulos paclitaxel e epitilona B) . A atividade de BAL27862 não é afetada pela sobreexpressão da bomba P-gp em quaisquer modelos testados in vitro, nem em xenoenxertos tumorais mamários humanos. Adicionalmente, BAL27862 manteve a sua atividade apesar dos níveis elevados de beta-tubulina de subtipo III e mutações na tubulina de subtipo I (ver o poster "In vitro activity of the novel tubulin active agent BAL27862 in MDR1 (+) and MDR1 (-) human breast and ovarian cancer variants selected for resistance to taxanes", apresentado no 101° Encontro Anual de 2010).
Portanto, a atividade de BAL27862 não é afetada por um número de fatores que conferem resistência aos agentes convencionais que se direcionam a microtúbulos.
Em acréscimo, é conhecido que os compostos da fórmula geral I possuem um efeito diferente sobre o fenótipo das células em comparação com outros agentes que se direcionam a microtúbulos, incluindo outros agentes desestabilizadores de microtúbulos (ver o poster "BAL27862: A Novel Anticancer Agent that Dissociates Microtubules and Creates a Distinct Cellular Phenotype", apresentado no Simpósio EORT-NCI-AACR de 2009). A presente aplicação também demonstra que ο tratamento com um composto da fórmula geral I induz um fenótipo de microtúbulos consistente em linhas celulares tumorais derivadas a partir de uma variedade de órgãos, por exemplo, pulmão, colo do útero e da mama, como visto na Figura 1. A marcação dos microtúbulos nestas células com um anticorpo anti-alfa-tubulina mostra que, em vez das fibras do fuso mitótico das células não tratadas, apenas estruturas semelhantes a pontos são visíveis nas células tratadas. Este mesmo efeito é também mostrado utilizando os Compostos C e B nas Figuras 2A e 2B respetivamente à linha celular de cancro do pulmão A549. No entanto de forma muito distinta face àquela observada com os agentes convencionais que se direcionam a microtúbulos vinblastina, colchicina, paclitaxel e nocodazolo, como pode ser visto nas Figuras 3B, 3C, 3D e 4 respetivamente. Os microtúbulos foram marcados com um anticorpo anti-alfa-tubulina e as células foram visualizadas numa ampliação de lOOOx (Figuras 3, 4) . Para as células tratadas com BAL27862, são visíveis múltiplas estruturas semelhantes a pontos, enquanto, de forma contrastante, os outros fármacos convencionais produzem estruturas de microtúbulos filamentosas, ou estruturas agregadas de microtúbulos densas. Estas diferenças a nivel fenotipico, às doses de composto consideradas ideais em termos de efeito antiproliferativo, indicam uma diferença no modo de ação a nivel molecular.
Em acréscimo, é sabido que o BAL27862 provoca um fenótipo de microtúbulos dominante na presença de outros agentes que se direcionam a microtúbulos (ver também o poster "BAL27862: A Novel Anticancer Agent that Dissociates Microtubules and Creates a Distinct Cellular Phenotype"). A presente aplicação também demonstra que o tratamento com apenas vimblastina, colchicina, paclitaxel ou nocodazolo induziu os fenótipos de microtúbulos caracteristicos destes agentes (Figura 5A, 5D, 5G, 6C-6F respetivamente). No entanto, o tratamento de combinação com BAL27862 durante as últimas 4 horas resultou na rutura destes fenótipos; apesar da continua presença de vimblastina, colchicina, paclitaxel ou nocodazolo (Figura 5B, 5E, 5H, 6g-6J respetivamente). Em contraste, tratando em primeiro com BAL27862 e subsequentemente durante 4 horas em combinação com vimblastina, colchicina, paclitaxel ou nocodazolo, não houve nenhum impacto na geração do fenótipo consistente com o tratamento com BAL27862 (Figura 5C, 5F, 51, 6K-6N respetivamente). WO 2005/020794 estuda a determinação da quimiossensibilidade de células cancerígenas a taxanos, ao avaliar o efeito do taxano no nível de expressão ou atividade de, entre muitos outros, BUBR1. WO 98/56910 divulga a preparação de anticorpos que se ligam especificamente a uma proteína huBUBl. 0 poster "BAL27862: A unique microtubule-targeted drug that suppresses microtubule dynamics, severs microtubules, and overcomes Bcl-2 and tubulin subtype-related drug resistance", apresentado no 101° Encontro Anual da Associação Americana para a Investigação Oncológica, divulga que BAL27862 produz um único fenótipo de microtúbulos distinto daquele observado com vinca alcaloides.
Todos estes dados demonstram que BAL27862 afeta a biologia dos microtúbulos numa forma diferente que aquela referente a agentes convencionais que se direcionam a microtúbulos.
Assim, a partir da informação sobre agentes convencionais que se direcionam a microtúbulos, não podem ser feitas previsões sobre se, ou como, genes em particular estão envolvidos na ação dos compostos da fórmula I.
Um objeto da presente invenção é identificar os fatores que estão associados à resposta dos compostos da fórmula I ou compostos derivados farmaceuticamente aceitáveis resultantes dos mesmos, por exemplo para identificar fatores associados com a resistência aos compostos da fórmula geral I, em particular BAL27862 ou compostos derivados farmaceuticamente aceitáveis resultantes do mesmo, conforme definido abaixo.
Foi verificado surpreendentemente que a BUBR1 pode ser utilizada como um biomarcador da resposta ao tratamento com um composto da fórmula geral I ou compostos derivados farmaceuticamente aceitáveis resultantes do mesmo, conforme definido abaixo.
Numa forma de realização preferencial da invenção, níveis relativamente baixos de BUBRl numa amostra tumoral estão associados com resistência inerente e adquirida ao BAL27862, conforme descrito abaixo.
Foi atribuído a BUBRl o número de Identificação referente ao Comité para a Nomenclatura do Genoma Humano HGNC ID:1149 e Entrez Gene ID 701. Uma sequência correspondente a BUBRl humana está disponível através do número de referência do Centro Nacional para Informação Biotecnológica (NCBI) NP_0012 02 (Figura 18, SEQ ID No. 1, NP_001202.4) . A BUBRl é também conhecida como hBUBRl e BubRl; Budding não inibida por benzimidazolos 1, S. cerevisiae, homóloga, beta; gene de checkpoint mitótico BUB1B; BUB1B; beta BUB1; quinase de checkpoint mitótico Mad3L; MAD3L; proteína quinase de tipo MAD3; e SSK1. O nome BUB1B é frequentemente associado à sequência de ácidos nucleicos, enquanto publicações que se focam na proteína têm frequentemente usado o termo BUBR1. Por simplicidade, o termo BUBR1 deve ser usado aqui para englobar todos os sinónimos acima mencionados e deverá referir-se a esta entidade quer aos níveis dos ácidos nucleicos e da proteína conforme apropriado. O nome budding não inibida por benzimidazolos foi designado para o homólogo de levedura por Hoyt et al. após experiências conduzidas com benomil. (Hoyt MA. et al., "S. Cerevisiae Genes Required for Cell Cycle Arrest in Response to Loss of Microtubule Function." Cell, Vol. 66, 507-517, Aug. 9, 1991) Esta publicação descreve as mutações no homólogo de levedura bub que resultaram em hipersensibilidade ao benomil. 0 homólogo humano está localizado no cromossoma 15ql5. A sequência do gene BUBR1 humano foi publicada em US 6,593,098 Bl, e está identificada nesta como BUB1A humana. O exemplo VI desta patente descreve uma experiência realizada em células HeLa, em que a atividade de BUB1A endógeno (BUBR1) foi inibida por microinjeção de anticorpos anti-huBUBlA. As células injetadas foram então testadas quanto à sua capacidade para permanecer retidas na mitose quando expostas a nocadozolo, um desestabilizador de microtúbulos. A patente afirma que as células injetadas com anticorpos huBUBla falharam a retenção na mitose na presença de nocodazolo, e continuaram a sofrer apoptose como resultado da saida prematura da mitose.
Semelhantemente à publicação de Hoyt, isto sugere que a perda da função de BUBR1 em células que são então tratadas com nocodazolo, resulta numa taxa de apoptose elevada.
Contudo, em contraste, os presentes inventores descobriram que a perda da expressão de BUBR1 está associada a níveis de morte celular baixos em resposta a compostos da fórmula geral I, ou seja, a resistência a estes compostos. É para ser novamente enfatizado que os compostos da fórmula I possuem um efeito diferente no fenótipo das células, em comparação a outros agentes de microtúbulos, incluindo outros desestabilizadores de microtúbulos, como observado nas Figuras 3, 4, 5 e 6. A discrepância entre as conclusões, de um lado em US 6, 593, 098 Bl e Hoyt, e do outro lado, os presentes inventores, confirma que as previsões a partir de informações relativas a agentes convencionais de microtúbulos não podem ser feitas no que diz respeito se, ou como, genes em especifico estão envolvidos na atividade dos compostos da fórmula geral I.
Um aspeto da presente invenção refere-se à utilização ex vivo de BUBR1 como um biomarcador para prever a resposta a um composto, em que o composto é um composto da fórmula geral I
(I) em que R representa fenil, tienil ou piridinil em que fenil é opcionalmente substituído por um ou dois substituintes independentemente selecionados a partir de alquil, haloalquil inferior, hidroxialquil inferior, alcoxi inferior alquil inferior, aciloxialquil inferior, fenil, hidroxi, alcoxi inferior, hidroxialcoxi inferior, alcoxi inferior alcoxi inferior, fenilalcoxi inferior, alquilcarboniloxi inferior, amino, monoalquilamino, dialquilamino, alcoxicarbonilamino inferior, alquilcarbonilamino inferior, amino substituído em que dois substituintes no nitrogénio formam em conjunto com o nitrogénio heterocíclico, alquilcarbonil inferior, carboxi, alcoxicarbonil inferior, ciano, halogénio, e nitro; e em que dois substituintes adjacentes são metilenodioxi; e em que piridinil é opcionalmente substituído por alcoxi inferior, amino ou halogénio; X representa um grupo C=Y, em que Y representa oxigénio ou nitrogénio, substituído por hidroxi ou alcoxi inferior; R1 representa hidrogénio, alquilcarbonil inferior, hidroxialquil inferior ou cianoalquil inferior; R2, R3 e R6 representam hidrogénio; R4 e R5, independentemente um do outro, representam hidrogénio, alquil inferior ou alcoxi inferior; ou R4 e R5 em conjunto representam metilenodioxi; e compostos derivados farmaceuticamente aceitáveis resultante do mesmo, em que o composto derivado farmaceuticamente aceitável é selecionado a partir do grupo consistindo de um sal, solvato, éster ou amida hidrolisável in vivo do composto referido, sal de tal éster ou amida hidrolisável in vivo, e forma polimórfica do composto referido; ou em que R representa fenil ou piridinil em que fenil é opcionalmente substituído por um ou dois substituintes independentemente selecionados a partir de alquil, haloalquil inferior, hidroxialquil inferior, alcoxi inferior alquil inferior, aciloxialquil inferior, fenil, hidroxi, alcoxi inferior, hidroxialcoxi inferior, alcoxi inferior alcoxi inferior, fenilalcoxi inferior, alquilcarboniloxi inferior, amino, monoalquilamino, dialquilamino, alcoxicarbonilamino inferior, alquilcarbonilamino inferior, amino substituído em que dois substituintes no nitrogénio formam em conjunto com o nitrogénio heterocíclico, alquilcarbonil inferior, carboxi, alcoxicarbonil inferior, formil, ciano, halogénio, e nitro; e em que dois substituintes adjacentes são metilenodioxi; e em que piridinil é opcionalmente substituído por alcoxi inferior, amino ou halogénio; X representa oxigénio; R1 representa hidrogénio, alquilcarbonil inferior, hidroxialquil inferior ou cianoalquil inferior; R2, R3 e R6 representam hidrogénio; R4 e R5, independentemente um do outro, representam hidrogénio, alquil inferior ou alcoxi inferior; ou R4 e R5 em conjunto representam metilenodioxi; e compostos derivados farmaceuticamente aceitáveis resultante do mesmo, em que o composto derivado farmaceuticamente aceitável é selecionado a partir do grupo consistindo de um sal, solvato, éster ou amida hidrolisável in vivo do composto referido, sal de tal éster ou amida hidrolisável in vivo, e forma polimórfica do composto referido; e em que o sufixo inferior denota um radical possuindo até e incluindo um máximo de 7, especialmente até e incluindo um máximo de 4, átomos de carbono. A resposta é de uma doença num indivíduo. Também preferencialmente a resposta pode ser para um tratamento, ou seja, um tratamento com o composto da fórmula geral I ou compostos derivados farmaceuticamente aceitáveis resultantes do mesmo. 0 biomarcador BUBR1 é medido ex vivo numa amostra ou amostras retiradas do corpo humano ou animal, preferencialmente retirado a partir do corpo humano.
Numa forma de realização preferencial, a invenção refere-se à utilização de BUBR1 como um biomarcador para prever a resistência de uma doença num indivíduo, a um composto da fórmula geral I ou compostos derivados farmaceuticamente aceitáveis resultantes do mesmo, conforme definido acima. 0 composto derivado farmaceuticamente aceitável é selecionado a partir do grupo consistindo num sal, solvato, pró-fármaco, sal de um pró-fármaco e forma polimórfica de um composto da fórmula geral I como definido acima. Os pró-fármacos são ésteres e amidas hidrolisáveis in vivo do composto da fórmula geral (I), preferencialmente éster e amidas de aminoácidos, pequenos peptídeos ou ácidos hidroxilicos peguilados de ocorrência natural. Mais preferencialmente, o pró-fármaco é uma amida formada por um grupo amino presente num grupo R do composto da fórmula geral I, e o grupo carboxilico de glicina, alanina ou lisina.
Particularmente e preferencialmente o composto é
ou um sal farmaceuticamente aceitável resultante do mesmo, preferencialmente um sal hidrocloreto, mais preferencialmente um sal dihidrocloreto resultante do mesmo.
Outro aspeto da presente invenção refere-se a um método para prever a resposta de uma doença num indivíduo, a um composto da fórmula geral I ou compostos derivados farmaceuticamente aceitáveis resultantes do mesmo conforme definido acima, compreendendo as etapas de: a) medir um nível de BUBR1 numa amostra previamente obtida a partir do indivíduo, para obter um valor ou valores que representam este nível; e b) comparar o valor ou valores da etapa a) com um valor de referência ou a um conjunto de valores de referência. A resposta que é previsível é resistência. A medição de um nível ou níveis de BUBR1 é realizada ex-vivo numa amostra ou amostras previamente obtidas a partir do indivíduo. Pré-obtido refere-se ao facto de que a amostra é obtida antes que seja submetida a qualquer método envolvendo a medição do nível do biomarcador, e pré-obtido não é para ser entendido como em relação ao tratamento.
Um menor nível de BUBR1 na amostra do sujeito em relação ao valor de referência ou um conjunto de valores de referência prevê resistência. A doença é uma doença neoplásica ou autoimune. Mais preferencialmente a doença é cancro. Especialmente preferencial, o cancro é selecionado a partir do grupo consistindo em cancro da mama, cancro da próstata, cancro do colo do útero, cancro do ovário, cancro gástrico, cancro colorretal (ou seja, incluindo cancro do cólon e cancro retal), cancro pancreático, cancro do fígado, cancro cerebral, cancro neuroendócrino, cancro do pulmão, cancro renal, malignidades hematológicas, melanoma e sarcomas. Mais especialmente preferencial, o cancro é selecionado a partir do grupo consistindo em cancro da mama, cancro do colo do útero, cancro do ovário, cancro gástrico, cancro pancreático, cancro do cólon e cancro do pulmão. Mais particularmente preferencial o cancro é selecionado a partir do grupo consistindo em cancro do colo do útero, cancro do ovário, cancro gástrico, cancro pancreático, cancro do cólon e cancro do pulmão. Ainda noutra forma de realização particularmente preferencial, em que a resistência adquirida é determinada, o cancro é cancro do pulmão ou cancro do ovário. Ainda noutra forma de realização particularmente preferencial, na qual a resistência inerente é determinada, o cancro é selecionado a partir do grupo consistindo em cancro do colo do útero, cancro da mama, cancro do ovário, cancro gástrico, cancro pancreático, cancro do cólon e cancro do pulmão, mais preferencialmente cancro do pulmão ou gástrico.
Está aqui também descrito um método de tratamento de uma doença neoplásica ou doença autoimune, preferencialmente cancro, num indivíduo em necessidade para o mesmo, compreendendo medir um nível de BUBR1 numa amostra do indivíduo para obter um valor ou valores que representem este nível, e tratar o indivíduo com um composto da fórmula geral I ou um composto derivado farmaceuticamente aceitável resultante do mesmo como definido acima, caso o nível de BUBR1 na amostra referida não seja inferior a um valor de referência ou a um conjunto de valores de referência. BUBR1 pode ser utilizada no tratamento de uma doença neoplásica ou doença autoimune, preferencialmente cancro, compreendendo medir um nível de BUBR1 numa amostra do indivíduo para obter um valor ou valores que representem este nível, e tratar o indivíduo com um composto da fórmula geral I ou um composto derivado farmaceuticamente aceitável resultante do mesmo como definido acima, caso o nível de BUBR1 não seja inferior a um valor de referência ou a um conjunto de valores de referência. A medição do nível de BUBR1 é realizada ex-vivo numa amostra previamente obtida a partir do indivíduo.
Está aqui também descrito um método de tratamento de uma doença neoplásica ou doença autoimune, preferencialmente cancro, aumentando em primeiro lugar o nível de BUBR1 num indivíduo que possui uma amostra com um nível de BUBR1 menor em comparação a um nível de referência ou a um conjunto de níveis de referência, tratando de seguida o indivíduo com um composto da fórmula geral I ou um composto derivado farmaceuticamente aceitável resultante do mesmo como definido acima.
Ainda noutro aspeto, a invenção refere-se a um kit para prever a resposta a um composto da fórmula geral I ou um composto derivado farmaceuticamente aceitável resultante do mesmo, como definido acima, compreendendo os reagentes necessários para medir o nível de BUBR1 numa amostra. Mias preferencialmente, o kit também inclui um módulo de comparação que compreende um valor de referência ou um conjunto de valores de referência para os quais o nível de BUBR1 na amostra é comparado. 0 kit compreende um composto da fórmula geral I ou compostos derivados farmaceuticamente aceitáveis resultante do mesmo como definido acima, ou um composto da seguinte fórmula ou um sal farmaceuticamente aceitável resultante da mesma:
Nome químico: Ácido S-2,6-Diamino-hexanoico [4 — (2—{2 — [4 — (2 — ciano-etilamino)-furazano-3-il]-benzoimidazol-l-il}-acetil)-fenil]-amida
Numa forma de realização particularmente preferencial, o sal farmaceuticamente aceitável é um sal dihidrocloreto.
Numa forma de realização preferencial, os reagentes do kit compreendem um reagente de captura compreendendo um composto de deteção da BUBRl, e um reagente de deteção. Especialmente preferencial, o reagente de captura é um anticorpo. Também preferencialmente, a doença é predita ser resistente ao tratamento com o composto referido quando a BUBRl é inferior em relação a um valor de referência ou a um conjunto de valores de referência. Numa forma de realização preferencial, o módulo de comparação está incluído nas instruções de utilização do kit. Noutra forma de realização preferencial, o módulo de comparação está sob a forma de um dispositivo de exibição.
Formas de realização da presente invenção serão agora descritas a título de exemplo com referência às figuras que as acompanham. A invenção não deve, no entanto, ser entendida como limitada por estas formas de realização.
Breve Descrição das Figuras
Figura 1: Mostra o tratamento de linhas celulares tumorais humanas a partir de diferentes histotipos com 50 nM de BAL27862. Os microtúbulos de células mitóticas ou retiradas em G2/M foram marcados após tratamento durante 24 horas com 50 nM de BAL27862 ou veiculo de controlo.
Fig. IA e 1B: Células A549 NSCLC;
Fig. 1C e 1D: Células cancerígenas do colo do útero HeLa;
Fig. IE e 1F: Células cancerígenas da mama SKBR3 Tratamento com veículo de controlo: Figuras IA, 1C & 1E,
Tratamento com BAL27862: Figuras IB, ID & 1F.
Figura 2: Mostra o tratamento de células A549 NSCLC com os Compostos B e C. Os microtúbulos de células A549 NSCLC mitóticas ou retiradas em G2/M foram marcados após tratamento durante 24 horas com 80 nM e 20 nM dos Compostos B e C, respetivamente. A barra de escala branca representa 10 micrómetros.
Fig. 2A: Tratamento com 20 nM do Composto C Fig. 2B: Tratamento com 80 nM do Composto B
Figura 3: Mostra uma comparação do tratamento de células com BAL27862 em comparação com os agentes convencionais que se direcionam a microtúbulos. Os microtúbulos de células A549 NSCLC mitóticas ou retiradas em G2/M foram marcados após tratamento durante 24 horas com tratamento com 50 nM de A: BAL27862; B: vimblastina; C: colchicina; D: paclitaxel. Pilhas de imagens tiradas a cada 1 ym foram processadas utilizando o software ImageJ.
Figura 4: Mostra uma comparação do tratamento de células A549 NSCLC com BAL27862 em comparação com nocodazolo. Os microtúbulos de células mitóticas ou retiradas em G2/M foram marcados após tratamento durante 24 horas com diferentes concentrações de nocodazolo (B, C & D) e BAL27862 (E, F & G). A: controlo, B: Nocodazolo a 50 nM, C: Nocodazolo a 100 nM, D: Nocodazolo a 200 nM, E: BAL27862 a 20 nM; F: BAL27862 a 30 nM e G: BAL27862 a 50 nM. A barra de escala branca representa 10 micrómetros. São mostradas imagens representativas dos fenótipos de microtúbulos observados.
Figura 5: Mostra uma combinação do tratamento com BAL27862 e agentes convencionais que se direcionam a microtúbulos. Os microtúbulos de células A549 NSCLC mitóticas ou retiradas em G2/M foram marcados após tratamento segundo os períodos indicados abaixo. Foram utilizados 50 nM de BAL27862, 50 nM de vimblastina, 50 nM de colchicina e 25 nM de paclitaxel. A barra de escala branca representa 10 micrómetros.
Fig. 5A: tratamento com vimblastina durante 24 horas; Fig. 5B: tratamento com vimblastina durante 24 horas com as últimas 4 horas incluindo BAL27862;
Fig. 5C: tratamento com BAL27862 durante 24 horas com as últimas 4 horas incluindo vimblastina.
Fig. 5D: tratamento com colchicina durante 24 horas; Fig. 5E: tratamento com colchicina durante 24 horas com as últimas 4 horas incluindo BAL27862;
Fig. 5F: tratamento com BAL27862 durante 24 horas com as últimas 4 horas incluindo colchicina.
Fig. 5G: tratamento com paclitaxel durante 24 horas;
Fig. 5H: tratamento com paclitaxel durante 24 horas com as últimas 4 horas incluindo BAL27862;
Fig. 51: tratamento com BAL27862 durante 24 horas com as últimas 4 horas incluindo paclitaxel.
Figura 6: Mostra uma combinação do tratamento com BAL27862 e nocodazolo. Os microtúbulos de células A549 NSCLC mitóticas ou retiradas em G2/M foram marcados após tratamento segundo os períodos indicados abaixo. Foram utilizados 25 nM de BAL27862 e nocodazolo às concentrações indicadas a seguir. A barra de escala branca representa 10 micrómetros.
Fig. 6A: tratamento de controlo durante 24 horas;
Fig. 6B: tratamento com 25 nM de BAL278 62 durante 24 horas;
Fig. 6C: tratamento com 50 nM de nocodazolo durante 24 horas;
Fig. 6D: tratamento com 100 nM de nocodazolo durante 24 horas;
Fig. 6E: tratamento com 150 nM de nocodazolo durante 24 horas;
Fig. 6F: tratamento com 200 nM de nocodazolo durante 24 horas;
Fig. 6G: tratamento com 50 nM de nocodazolo durante 24 horas com as últimas 4 horas incluindo 25 nM de BAL27 8 62;
Fig. 6H: tratamento com 100 nM de nocodazolo durante 24 horas com as últimas 4 horas incluindo 25 nM de BAL27 8 62;
Fig. 61: tratamento com 150 nM de nocodazolo durante 24 horas com as últimas 4 horas incluindo 25 nM de BAL27862;
Fig. 6J: tratamento com 200 nM de nocodazolo durante 24 horas com as últimas 4 horas incluindo 25 nM de BAL27862;
Fig. 6K: tratamento com 25 nM de BAL27862 durante 24 horas com as últimas 4 horas incluindo 50 nM de nocodazolo;
Fig. 6L: tratamento com 25 nM de BAL27 8 62 durante 24 horas com as últimas 4 horas incluindo 100 nM de nocodazolo;
Fig. 6M: tratamento com 25 nM de BAL27862 durante 24 horas com as últimas 4 horas incluindo 150 nM de nocodazolo;
Fig. 6N: tratamento com 25 nM de BAL27862 durante 24 horas com as últimas 4 horas incluindo 200 nM de nocodazolo.
Figura 7: Mostra análise por immunoblot da expressão de BUBRl depois da transfecção com uma pool de siRNA BUBR1. Controlo: células não transfectadas tratadas apenas com meio; Lipofectamina: células tratadas apenas com reagente de transfecção; NTC: células tratadas com siRNA não direcionado de controlo; BUBRl: células tratadas com uma pool de siRNA especifica para BUBRl. Os níveis de alfa-tubulina atuam como um controlo de carga. Os anticorpos de BUBRl de Cell Signalling (CS) ou BR Transduction Laboratorires (BD) foram utilizados como indicado. Fig. 7A: Células de cancro do colo do útero HeLa, Fig. 7B: Células de cancro do pulmão H460
Figura 8: Efeito de uma pool de siRNA BUBRl em resposta a BAL27862 em células HeLa. Células HeLa foram semeadas e tratadas com siRNA. Após 48 horas de incubação, as células foram tratadas apenas com DMSO ou 50 nM de BAL27862 durante 24 horas anteriormente à análise. Painel superior:
Histograma da fração de células por poço (em %) exibindo o fenótipo não tratado. Painel inferior: Histograma do número de células por poço. Barras de erros: Desvio-padrão. Controlo negativo: siRNA não direcionado de controlo. BubRl: Células tratadas com pool de siRNA especifico para BUBR1.
Figura 9: Mostra o efeito de uma pool de siRNA BUBR1 na resposta de células HeLa a BAL27862. Células HeLa em
crescimento exponencial foram tratadas apenas com meio (controlo), ou transfectadas com lipofectamina, siRNA não direcionado de controlo (NTC) ou uma pool de siRNA especifico para BUBR1. Após 24 horas, foi adicionado BAL27862 às concentrações indicadas, com veículo de transporte DMSO usado como um controlo. Após tratamento durante 48 horas, os efeitos sobre a proliferação (Fig. 9A) e viabilidade (Fig. 9B) das células HeLa foram avaliados usando o ensaio de proliferação YO-PRO. a. u. = dados são expressos em unidades arbitrárias.
Figura 10: Mostra o efeito de uma pool de siRNA BUBR1 na resposta de células H460 a BAL27862. Células H460 em
crescimento exponencial foram transfectadas com siRNA não direcionado de controlo (NTC) ou uma pool de siRNA específico para BUBR1. Após 24 horas, foi adicionado BAL27862 às concentrações indicadas, com veículo de transporte DMSO usado como um controlo. Após tratamento durante 48 horas, os efeitos sobre a proliferação (Fig. 10A) e viabilidade (Fig. 10B) das células H460 foram avaliados usando o ensaio de proliferação YO-PRO. a. u. = dados são expressos em unidades arbitrárias.
Figura 11: Mostra o efeito de uma pool de siRNA BUBRl na resposta de células MCF-7 a BAL27862. Células MCF-7 em crescimento exponencial foram transfectadas com siRNA não direcionado de controlo (NTC) ou uma pool de siRNA especifico para BUBR1. Após 24 horas, foi adicionado BAL27862 às concentrações indicadas, com veículo de transporte DMSO usado como um controlo. Após tratamento durante 48 horas, os efeitos sobre a proliferação (Fig. 11A) e viabilidade (Fig. 11B) das células MCF-7 foram avaliados usando o ensaio de proliferação YO-PRO. a. u. = dados são expressos em unidades arbitrárias.
Figura 12: Mostra o efeito de uma pool de siRNA BUBR1 na resposta de células HeLa, Panel e HCT116 a BAL27862. Células em crescimento exponencial foram transfectadas com siRNA não direcionado de controlo (NTC) ou uma pool de siRNA específico para BUBR1. Após 24 horas, foi adicionado 50 nM (HeLa, HCT116) ou 30 nM (Panel) de BAL27862, com veículo de transporte DMSO usado como um controlo. Após tratamento durante 48 horas, efeitos sobre a proliferação em células HeLa (Fig. 12A), Panel (Fig. 12B) e HCT116 (Fig. 12C) foram avaliados usando o ensaio de Violeta de Cristal, a. u. = dados são expressos em unidades arbitrárias.
Figura 13: Mostra o efeito de siRNAs BUBR1 individuais na resposta de células HeLa a BAL27862. Células em crescimento exponencial foram transfectadas com siRNA não direcionado de controlo (NTC) ou uma pool de siRNAs específicos para BUBR1 (siRNA #1, 2, 3 e 4, como definido na seção de metodologia experimental abaixo). Após 24 horas, foi adicionado 50 nM de BAL27862, com veículo de transporte DMSO usado como um controlo. Após tratamento durante 48 horas, efeitos sobre a proliferação em células HeLa (Fig. 13A) foram avaliados usando o ensaio de Violeta de Cristal, e efeitos na expressão proteica de BUBR1 foram avaliados por immunoblotting (Fig. 13B) . a. u. = dados são expressos em unidades arbitrárias.
Figura 14: Mostra que níveis proteicos de BUBR1 diminuem em linhas tumorais com resistência adquirida para BAL27862. Linhas celulares tumorais foram selecionadas quanto à resistência a BAL27862 através de cultura in vitro na presença de BAL27862. Com base nas determinações de IC50, os fatores de resistência a BAL27862 versus linhas parentais foram: A549 (3,0 vezes); SKOV3 (7,6 vezes - linha resistente 1); H460 (5,3 vezes) (ver Tabela 1). Extratos proteicos de toda a célula foram preparados a partir de linhas parentais e resistentes, e foram analisados por immunoblot para a expressão de BUBR1. Níveis de actina atuam como um controlo de carga.
Figura 15: Mostra que níveis proteicos de BUBRl diminuídos são mantidos na linha tumoral SKOV3 durante o desenvolvimento da resistência. As células tumorais SKOV3 foram selecionadas quanto à resistência a BAL27862 através de cultura in vitro na presença de BAL27862 para períodos de tempo crescentes. Com base nas determinações de IC50, os fatores de resistência a BAL27862 versus linhas parentais foram: SKOV3 resistente 1 (7,6 vezes), SKOV3 resistente 2 (11,6 vezes) (ver Tabela 1). Extratos proteicos de toda a célula foram preparados a partir de linhas parentais e resistentes, e foram analisados por immunoblot para a expressão de BUBRl, usando os anticorpos para BUBRl de BD Transduction Laboratories (BD) . Níveis de alfa-tubulina atuam como um controlo de carga.
Figura 16: Mostra que os níveis de BUBRl em células tumorais estão diminuídos em xenoenxertos de tumores derivados de pacientes definidos como resistente a BAL27862, pela análise de crescimento ex vivo em colónia. Os xenoenxertos tumorais derivados de pacientes (mantidos em ratinhos sem pelo) foram preparados, fixos e marcados para a expressão proteica de BUBR1 usando imunohistoquimica. A resistência e sensibilidade a BAL27862, paclitaxel e vimblastina são como definidas na Tabela 2.
Figura 17: Mostra que para BUBR1, os niveis proteicos em células tumorais são refletidos pelos seus niveis de expressão de RNA. Figura 17A: Foram preparadas amostras a partir de linhas celulares HeLa e H460, e RT-PCR foi realizada nestas para medir os niveis de RNA. Os resultados de HeLa foram fixados a 100%, e o gráfico mostra os niveis de expressão de RNA na amostra H460 em relação aos valores de HeLa. Figura 17B: Extratos proteicos de toda a célula foram preparados a partir das mesmas passagens das linhas celulares HeLa e H460, e analisados então por immunoblotting quanto à expressão proteica de BUBR1, usando os anticorpos para BUBR1 de BD Transduction Laboratories (BD) . Niveis de alfa-tubulina atuam como um controlo de carga.
Figura 18: Mostra a sequência proteica preferencial de BUBR1 (SEQ. ID No. 1)
Figura 19: Mostra a sequência de ácidos nucleicos preferencial de BUBR1 (SEQ. ID No. 2)
Descrição Detalhada
Compostos da fórmula geral I
Os compostos são representados pela fórmula geral I:
(I) em que R representa fenil, tienil ou piridinil em que fenil é opcionalmente substituído por um ou dois substituintes independentemente selecionados a partir de alquil, haloalquil inferior, hidroxialquil inferior, alcoxi inferior alquil inferior, aciloxialquil inferior, fenil, hidroxi, alcoxi inferior, hidroxialcoxi inferior, alcoxi inferior alcoxi inferior, fenilalcoxi inferior, alquilcarboniloxi inferior, amino, monoalquilamino, dialquilamino, alcoxicarbonilamino inferior, alquilcarbonilamino inferior, amino substituído em que dois substituintes no nitrogénio formam em conjunto com o nitrogénio heterocíclico, alquilcarbonil inferior, carboxi, alcoxicarbonil inferior, ciano, halogénio, e nitro; e em que dois substituintes adjacentes são metilenodioxi; e em que piridinil é opcionalmente substituído por alcoxi inferior, amino ou halogénio; X representa um grupo C=Y, em que Y representa oxigénio ou nitrogénio, substituído por hidroxi ou alcoxi inferior; R1 representa hidrogénio, alquilcarbonil inferior, hidroxialquil inferior ou cianoalquil inferior; R2, R3 e R6 representam hidrogénio; R4 e R5, independentemente um do outro, representam hidrogénio, alquil inferior ou alcoxi inferior; ou R4 e R5 em conjunto representam metilenodioxi; e compostos derivados farmaceuticamente aceitáveis resultante do mesmo, em que o composto derivado farmaceuticamente aceitável é selecionado a partir do grupo consistindo de um sal, solvato, éster ou amida hidrolisável in vivo do composto referido, sal de tal éster ou amida hidrolisável in vivo, e forma polimórfica do composto referido, ou em que R representa fenil ou piridinil em que fenil é opcionalmente substituído por um ou dois substituintes independentemente selecionados a partir de alquil, haloalquil inferior, hidroxialquil inferior, alcoxi inferior alquil inferior, aciloxialquil inferior, fenil, hidroxi, alcoxi inferior, hidroxialcoxi inferior, alcoxi inferior alcoxi inferior, fenilalcoxi inferior, alquilcarboniloxi inferior, amino, monoalquilamino, dialquilamino, alcoxicarbonilamino inferior, alquilcarbonilamino inferior, amino substituído em que dois substituintes no nitrogénio formam em conjunto com o nitrogénio heterocíclico, alquilcarbonil inferior, carboxi, alcoxicarbonil inferior, formil, ciano, halogénio, e nitro; e em que dois substituintes adjacentes são metilenodioxi; e em que piridinil é opcionalmente substituído por alcoxi inferior, amino ou halogénio; X representa o oxigénio; R1 representa hidrogénio, alquilcarbonil inferior, hidroxialquil inferior ou cianoalquil inferior; R2, R3 e R6 representam hidrogénio; R4 e R5, independentemente um do outro, representam hidrogénio, alquil inferior ou alcoxi inferior; ou R4 e R5 em conjunto representam metilenodioxi; e compostos derivados farmaceuticamente aceitáveis resultante do mesmo, em que o composto derivado farmaceuticamente aceitável é selecionado a partir do grupo consistindo de um sal, solvato, éster ou amida hidrolisável in vivo do composto referido, sal de tal éster ou amida hidrolisável in vivo, e forma polimórfica do composto referido, e em que o sufixo inferior denota um radical possuindo até e incluindo um máximo de 7, especialmente até e incluindo um máximo de 4, átomos de carbono.
Heterociclico designa preferencialmente um anel saturado, parcialmente saturado ou insaturado, mono- ou biciclico contendo 4-10 átomos compreendendo um, dois ou três heteroátomos selecionados a partir de nitrogénio, oxigénio e enxofre, os quais podem, a menos que especificado em contrário, estar ligados a carbono ou nitrogénio, em que um átomo de nitrogénio do anel pode ser opcionalmente substituído por um grupo selecionado a partir de alquil inferior, alquilamino inferior, aril, alquilaril inferior e acil, e um átomo de carbono do anel pode ser substituído por alquil inferior, alquilamino inferior, aril, alquilaril inferior, heteroaril, alcoxi inferior, hidroxi ou oxo. São exemplos de heterocíclicos pirrolidinil, oxazolidinil, tiazolidinil, piperidinil, morfolinil, piperazinil, dioxolanil e tetrahidropiranil.
Acil designa, por exemplo, alquilcarbonil, ciclohexilcarbonil, arilcarbonil, alquilcarbonil de aril inferior, ou heteroarilcarbonil. Acil inferior é preferencialmente alquilcarbonil inferior, em particular propionil ou acetil.
Preferencialmente, o composto da fórmula geral I é definido em que R1 é selecionado a partir do grupo consistindo em hidrogénio, acetil, CH2CH2CN e CH2CH2CH2OH.
Numa forma de realização preferencial, o composto da fórmula geral I é selecionado a partir do grupo consistindo em: 4-(l-Fenacil-lH-benzimidazol-2-il)-furazano-3-ilamina, 4-[1-(4-Bromofenacil)-lH-benzimidazol-2-il]-furazano- 3- ilamina oxima, N-{4-[1-(4-Clorofenacil)-lH-benzimidazol-2-il]-furazano-3-il}-acetamida, 4- [1- (4-Clorofenacil)-lH-benzimidazol-2-il]-furazano- 3- il-N-(2-cianoetil)-amina 4- [1- (4-Clorofenacil)-lH-benzimidazol-2-il]-furazano- 3- il-N-(3-hidroxipropil)-amina 4- [1-(3-Amino-4-clorofenacil)-lH-benzimidazol-2-il]-furazano-3-ilamina 4-[1-(3-Metoxi-4-metoximetoxi-fenacil)-1H-benzimidazol-2-il]-furazano-3-ilamina e compostos derivados farmaceuticamente aceitáveis resultantes dos mesmos.
Noutra forma de realização preferencial, o composto da fórmula geral I é:
em que R, Y e R1 são definidos como se segue:
ou compostos derivados farmaceuticamente aceitáveis resultantes dos mesmos como definido acima.
Ainda noutra forma de realização preferencial, o composto da fórmula geral I é selecionado a partir do grupo consistindo em: 4-(l-Fenoximetil-lH-benzimidazol-2-il)-furazano-3-ilamina, 4-[1-(4-Fluorofenoximetil)-lH-benzimidazol-2-il]-furazano-3-ilamina, 4-[1-(3,4-Dimetilfenoximetil)-lH-benzimidazol-2-il]-furazano-3-il-N-(2-cianoetil)-amina e compostos representados pela formula:
em que R e R1 são definidos como abaixo
ou compostos derivados farmaceuticamente aceitáveis resultantes dos mesmos como definido acima.
Ainda noutra forma de realização preferencial o composto da fórmula geral I é:
em que R, R4 e R5 são definidos como abaixo
ou compostos derivados farmaceuticamente aceitáveis resultantes dos mesmos como definido acima.
Mais preferencialmente, o composto é um composto da fórmula geral I (I)
em que R representa fenil ou piridinil em que o fenil é opcionalmente substituído por um ou dois substituintes independentemente selecionados a partir de alquil inferior, alcoxi inferior, amino, acetilamino, halogénio e nitro; e em que piridinil é opcionalmente substituído por amino ou halogénio; X representa um grupo C=0; R1 representa hidrogénio ou cianoalquil inferior; R2, R3, R4, R5 e R6 representam hidrogénio; e compostos derivados farmaceuticamente aceitáveis resultantes do mesmo como definido acima, e em que o sufixo inferior denota um radical possuindo até e incluindo um máximo de 7, especialmente até e incluindo um máximo de 4 átomos de carbono.
Especialmente preferencial, o composto é representado pela seguinte fórmula
em que R, Y e R1 são definidos como segue:
ou compostos derivados farmaceuticamente aceitáveis resultantes dos mesmos como definido acima.
Mais especialmente preferencial, o composto é representado pela seguinte fórmula
em que R, Y e R1 são definidos como se segue:
ou compostos derivados farmaceuticamente aceitáveis resultantes dos mesmos como definido acima.
Particularmente preferencial, o composto é
ou compostos derivados farmaceuticamente aceitáveis resultantes dos mesmos como definido acima. 0 termo derivado ou derivados na frase "composto derivado farmaceuticamente aceitável" ou "compostos derivados farmaceuticamente aceitáveis" de compostos da fórmula geral I, refere-se a sais, solvatos e complexos resultantes dos mesmos e a solvatos e complexos de sais resultantes dos mesmos, bem como a pró-fármacos como definidos aqui e formas polimórficas resultantes dos mesmos, e também sais de pró-fármacos resultantes dos mesmos como definido aqui. Numa forma de realização mais preferencial, refere-se a sais e pró-fármacos, bem como a sais de pró-fármacos resultantes dos mesmos conforme definido aqui.
Sais são preferencialmente sais de adição ácidos. Sais são formados, preferencialmente com ácidos orgânicos ou inorgânicos, a partir de compostos da fórmula (I) com um átomo de nitrogénio básico, especialmente os sais farmaceuticamente aceitáveis. Ácidos inorgânicos adequados são, por exemplo, ácidos halogenados, tais como ácido clorídrico, ácido sulfúrico ou ácido fosfórico. Ácidos orgânicos adequados são, por exemplo, ácidos carboxilicos, fosfónicos, sulfónicos ou sulfâmicos, por exemplo ácido etanoico, ácido propanoico, ácido octanoico, ácido decanoico, ácido dodecanoico, ácido glicólico, ácido láctico, ácido fumárico, ácido sucínico, ácido adípico, ácido pimélico, ácido subérico, ácido azeláico, ácido málico, ácido tartárico, ácido cítrico, aminoácidos, tais como ácido glutamico ou ácido aspártico, ácido maleico, ácido hidroximaleico, ácido metilmaleico, ácido ciclohexanocarboxílico, ácido adamantanocarboxílico, ácido benzoico, ácido salicílico, ácido 4-aminossalicílico, ácido ftálico, ácido fenilacético, ácido mandélico, ácido cinâmico, ácido metano- ou etanossulfónico, ácido 2-hidroxietanossulfónico, ácido etano-1,2-dissulfónico, ácido benzenossulfónico, ácido 2-naftalenossulfónico, ácido 1,5-naftaleno-dissulfónico, 2-, 3- ou ácido 4-metilbenzenossulfónico, ácido metilsulfúrico, ácido etilsulfúrico, ácido dodecilsulfúrico, ácido N-ciclohexilsulfâmico, ácido N-metil-, N-etil- ou N-propil-sulfâmico, ou outros ácidos orgânicos protonados, tais como ácido ascórbico. O composto pode ser administrado sob a forma de um pró-fármaco que é degradado no corpo humano ou animal para formar o composto da fórmula I. Os pró-fármacos são ésteres e amidas hidrolisáveis in vivo de um composto da fórmula I. Pró-fármacos considerados em particular são ésteres e amidas de aminoácidos de ocorrência natural e ésteres ou amidas de pequenos peptídeos, em particular pequenos peptídeos consistindo até cinco, preferencialmente dois ou três aminoácidos, bem como ésteres e amidas de ácidos hidroxílicos peguilados, preferencialmente ácido hidroxiacético e ácido láctico. Os pró-fármacos de ésteres são formados a partir da função ácido do aminoácido ou da posição C-terminal do peptídeo e grupo (s) hidroxi apropriado(s) no composto da fórmula I. Os pró-fármacos de amidas são formados a partir da função amino de aminoácidos ou da posição N-terminal do peptídeo e grupo (s) carboxílico (s) apropriados (s) no composto da fórmula I, ou a partir da função ácido do aminoácido ou da posição C-terminal do peptídeo e grupo (s) amino apropriado(s) no composto da fórmula I. Particularmente preferencial, os pró-fármacos de amidas são formados a partir de grupo(s) amino presente (s) no grupo R da fórmula I.
Mais preferencialmente, o pró-fármaco é uma amida formada a partir de um grupo amino presente no grupo R de um composto da fórmula geral I como definido acima e o grupo carboxílico de glicina, alanina ou lisina.
Ainda mais preferencialmente, o composto da fórmula geral I está sob a forma de um pró-fármaco selecionado a partir dos compostos de fórmulas:
Numa forma de realização especialmente preferencial, o composto da fórmula geral I está sob a forma de um pró-fármaco que possui a seguinte fórmula
Numa forma de realização mais especialmente preferencial, o composto é
ou um sal farmaceuticamente aceitável resultante do mesmo, preferencialmente um sal hidrocloreto, mais preferencialmente um sal dihidrocloreto. 0 metabólito farmaceuticamente ativo in vivo é neste caso BAL27862.
Estes pró-fármacos podem ser preparados por processos que são conhecidos de per se, em particular, um processo, em que um composto da fórmula (II)
em que R1 é definido como para fórmula (I) e Z é CH ou N, ou um composto derivado de tal composto compreendendo grupos funcionais sob forma protetora, ou um sal resultante do mesmo é (1) acilado com um aminoácido da fórmula (III)
(III) em que R10 é selecionado a partir de hidrogénio (Gly); metil (Ala) e aminobutil (Lys) protegido e R11 é um grupo amino protetor adequado, e (2) quaisquer grupos protetores num composto derivado protegido do composto resultante são removidos para gerar um pró-fármaco como mostrado acima e, se assim desej ado, (3) o pró-fármaco referido é convertido num sal por tratamento com ácido, ou um sal de um composto da fórmula (II) é convertido no composto da fórmula (II) livre correspondente ou noutro sal, e/ou uma mistura de compostos de produtos isoméricos é separada nos isómeros individuais. A acilação de um composto da fórmula (II) com um aminoácido da fórmula (III) é realizada numa forma conhecida de per se, geralmente na presença de um solvente aprótico polar ou dipolar adequado, com arrefecimento ou aquecimento como necessário, por exemplo, num intervalo de temperatura de aproximadamente menos 80 °C a aproximadamente mais 150 °C, mais preferencialmente de menos 30 °C a mais 120 °C, especialmente num intervalo de aproximadamente de cerca de 0 °C até à temperatura de refluxo do solvente utilizado. Opcionalmente uma base adequada é adicionada, em particular uma base aromática como piridina ou colidina ou uma base amina terciária como trietilamina ou diisopropiletilamina, ou um sal inorgânico básico, por exemplo, carbonato de potássio ou de sódio. A acilação pode ser realizada sob condições utilizadas para formação de amidas conhecidas de per se na química de peptídeos, por exemplo, com agentes de ativação para o grupo carboxílico, tal como carbodiimidas como N,N'-dietil-, N,Ν'-dipropil-, N,Ν'-diisopropil-, N,N'- diciclohexilcarbodiimida e hidrocloreto de N- (3-dimetilaminoisopropil)-N'-etilcarbodiimida (EDC), ou com agentes tais como 1-hidroxibenzotriazolo (HOBt), hexafluorofosfato de benzotriazolo-1- iloxitris(dimetilamino)fosfónio (BOP), hexafluorofosfato de O- (7-aza-benzotriazol-l-il)-Ν,Ν,Ν',N'-tetrametilurónio (HATU), tetrafluoroborato de 2-(2-oxo-l-(2H)-piridil)-1, 1,3,3-tetrametilurónio (TPTU), opcionalmente na presença de bases, catalisadores ou co-reagentes adequados. 0 grupo carboxílico pode também ser ativado como acilo halogenados, preferencialmente como cloreto de acilo, por exemplo, por reação com tionilcloreto ou oxalilcloreto, ou como anidrido simétrico ou assimétrico, por exemplo, por reação com formiatos halogenados como cloroformiato de etilo, opcionalmente na presença de bases, catalisadores ou co-reagentes adequados.
Se um ou mais outros grupos funcionais, por exemplo carboxilicos, hidroxi ou amino, são ou precisam de ser protegidos num composto da fórmula (II) ou (III), porque estes não devem tomar parte na reação, estes são tais grupos protetores como aqueles normalmente aplicados na síntese de amidas como, em particular de compostos peptídicos, cefalosporinas, penicilinas, compostos derivados de ácidos nucleicos e açúcares, os quais são conhecidos por peritos na especialidade. Grupos protetores adequados para grupos amino são, por exemplo, carbamato de t-butil, carbamato de benzil ou carbamato de 9-fluorenilmetil.
Os grupos protetores podem já estar presentes em precursores e devem proteger os grupos funcionais em causa contra reações secundárias indesejáveis, tais como alquilações, acilações, eterificações, esterificações, oxidações, solvólise e reações semelhantes. É uma característica dos grupos protetores que estes se disponibilizem prontamente, ou seja, sem reações secundárias indesejáveis, para remoção, normalmente por solvólise, redução, fotólise ou também por atividade enzimática, por exemplo, em condições análogas às condições fisiológicas, e que estes não estão presentes nos produtos finais. 0 perito na especialidade sabe, ou pode facilmente estabelecer, quais grupos protetores são adequados com as reações acima mencionadas aqui e doravante. A proteção de tais grupos funcionais por tais grupos protetores, os próprios grupos protetores e as suas reações de remoção, são descritos por exemplo em livros de referência para a síntese de peptídeos e em livros especiais sobre grupos de proteção, tais como J. F. W. McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, Londres E nova Iorque 1973, em "Methoden der organischen Chemie" (Métodos da química orgânica), Houben-Weyl, 4a edição, Volume 15/1, Georg Thieme Verlag, Stuttgart 1974, e em T. W. Greene, G. M. Wuts "Protective Groups in Organic Synthesis", Wiley, Nova Iorque, 2006.
Doença
Os compostos da fórmula geral I têm demonstrado reter a proliferação celular e induzir por apoptose. A desregulação da proliferação celular, ou falta de morte celular adequada, possui um intervalo amplo de implicações clínicas. Um número de doenças associadas com tal desregulação envolve hiperproliferação, inflamação, remodelação e reparação de tecidos. Indicações familiares nesta categoria incluem cancros, reestenose, hiperplasia neointimal, angiogénese, endometriose, distúrbios linfoproliferativos, patologias relacionadas com transplantes (rejeição de enxerto), poliose, perda da função neural no caso de remodelação de tecidos e semelhantes. O cancro está associado com a proliferação de células anormais e taxas de morte celular. Como apoptose é inibida ou retardada na maioria dos tipos de doenças proliferativas, neoplásicas, a indução da apoptose é uma opção para o tratamento oncológico, especialmente em tipos de cancros que mostram resistência à quimioterapia, radiação e imunoterapia clássica ("Apoptosis and Cancer Chemotherapy", Hickman e Dive, Eds., Blackwell Publishing, 1999) . Também em doenças e patologias relacionadas com a autoimunidade e transplantação, podem ser utilizados compostos indutores da apoptose para restaurar os processos normais de morte celular, e portanto podem erradicar os sintomas e podem curar as doenças. Outras aplicações de compostos indutores da apoptose podem estar na reestenose, ou seja, acumulação de células vasculares do músculo liso nas paredes das artérias, e em infeções persistentes causadas por uma falha em erradicar as células infetadas por bactérias e vírus. Em acréscimo, a apoptose pode ser induzida ou restabelecida em células epiteliais, em células endoteliais, em células musculares e noutras que perderam contato com a matriz extracelular.
Um composto de acordo com a fórmula geral I pode ser utilizado para o tratamento profilático ou especialmente terapêutico do corpo humano ou animal, em particular para o tratamento de uma doença neoplásica, doença autoimune, patologia relacionada com transplante e/ou doença degenerativa. Exemplos de tais doenças neoplásicas incluem, mas não estão limitadas a, neoplasmas epiteliais, neoplasmas de células escamosas, neoplasmas de células basais, papilomas e carcinomas de células transicionais, adenocarcinomas e adenomas, neoplasmas do tipo apêndice cutâneo e anexais, neoplasmas mucoepidermóides, neoplasmas císticos, neoplasmas séricos e mucinosos, neoplasmas ducais-, lobulares e medulares, neoplasmas de células acinares, neoplasmas epiteliais complexos, neoplasmas gonadais especializados, paragangliomas e tumores glómicos, melanomas e nevos, tumores e sarcomas de tecidos moles, neoplasmas fibromatosos, neoplasmas mixomatosos, neoplasmas lipomatosos, neoplasmas miomatosos, neoplasmas do estroma e mistos complexos, neoplasmas fibroepiteliais, neoplasmas do tipo sinovial, neoplasmas mesoteliais, neoplasmas de células germinativas, neoplasmas trofoblásticos, mesonefromas, tumores dos vasos sanguíneos, tumores dos vasos linfáticos, neoplasmas ósseos e condromatosos, tumores de células gigantes, tumores ósseos diversos, tumores odontogénicos, gliomas, neoplasmas neuroepiteliomatosos, meningiomas, tumores das bainha nervosas, tumores de células granulares e sarcomas alveolares das partes moles, linfomas de Hodgkin e de não Hodgkin, outros neoplasmas linforeticulares, tumores de células do plasma, tumores de mastócitos, doenças imunoproliferativas, leucemias, diversos distúrbios mieloproliferativos, distúrbios linfoproliferativos e síndromes mielodisplásicas.
Os compostos da fórmula geral I ou compostos derivados farmaceuticamente aceitáveis resultantes dos mesmos podem ser utilizados para tratar doenças autoimunes. Exemplos de tais doenças autoimunes incluem, mas não estão limitados a, lúpus eritematoso cutâneo sistémico, discoide ou subagudo, artrite reumatoide, síndrome antifosfolípidos, CREST, esclerose sistémica progressiva, doença mista do tecido conectivo (síndrome de Sharp), síndrome de Reiter, artrite juvenil, doença por aglutininas frias, crioglobulinemia mista essencial, febre reumática, espondilite anquilosante, poliartrite crónica, miastenia severa, esclerose múltipla, polineuropatia desmielinizante inflamatória crónica, síndrome de Guillan-Barré, dermatomiosite/polimiosite, anemia hemolítica autoimune, trombocitopenia púrpura, neutropenia, diabetes mellitus tipo I, tireoidite (incluindo doença de Hashimoto e Grave), doença de Addison, síndrome poliglandular, pênfigo (vulgar, foliáceo, sebáceo e vegetante) , penfigoide bolhoso e cicatricial, penfigoide gestacional, epidermólise bolhosa adquirida, doença de IgA linear, líquen escleroso e atrófico, doença de Duhring, psoríase vulgar, gutata, psoríase pustulosa pustolosa generalizada e localizada, vitiligo, alopécia areata, cirrose biliar primária, hepatite autoimune, todas as formas de glomerulonefrite, hemorragia pulmonar (síndrome de goodpasture) , nefropatia por IgA, anemia perniciosa e gastrite autoimune, doenças inflamatórias intestinais (incluindo colite ulcerosa e doença de Crohn), doença de Behçet, doença de Celic-Sprue, uveíte autoimune, miocardite autoimune, orquite granulomatosa, aspermatogénese sem orquite, fibrose pulmonar idiopática e secundária, doenças inflamatórias, com possibilidade de patogéneses autoimunes, tais como pioderma gangrensoso, líquen rubro, sarcoidose (incluindo Lofgren e tipo cutâneo/subcutâneo), granuloma anular, reação imunolófica alérgica tipo I e tipo IV, asma bronquial, polinose, dermatite atópica, de contato e por via aérea, vasculite de vasos grandes (células gigantes e arterite de Takayasu) , vasculite de vasos de tamanho médio (poliarterite nodosa, doença de Kawasaki), vasculite de vasos pequenos (granulomatose de Wegener, síndrome de Churg Strauss, poliangiite microscópica, púrpura de Henoch-Schõnlein, vasculite crioglobulinémica essencial, angiite leucoclástica cutânea), síndromes de hipersensibilidade, necrólise epidérmica tóxica (síndrome de Stevens-Johnson, eritema multiforme), doenças devido a efeitos secundários de fármacos, todas as formas de efeitos cutâneos, específicos de órgãos e sistémicos devido ao tipo I-vu (classificação de Coombs) formas imunológicas reacionais, patologias relacioanadas com a transplantação, tais como doença aguda e crónica de enxerto contra hospedeiro e hospedeiro contra enxerto, envolvendo todos os órgãos (pele, coração, rim, medula óssea, olho, fígado, baço, pulmão, músculo, sistema nervoso central e periférico, tecido conjuntivo, ossos, sangue e vasos linfáticos, sistema genito-urinário, orelha, cartilhagem, sistema linfático primário e secundário incluindo medula óssea, linfonodos, timo, trato gastrointestinal, incluindo oro-faringe, esofágico, estômago, intestino delgado, cólon e reto, incluindo partes dos órgãos acima mencionados até ao nivel da célula individual e subestruturas, por exemplo, células estaminais).
Particularmente preferencial, a doença é uma doença neoplásica ou autoimune. Numa forma de realização especialmente preferencial, a doença é cancro.
Exemplos de cancros em termos de órgãos e partes do corpo afetadas incluem, mas não estão limitado a, mama, colo do útero, ovários, cólon, reto, (incluindo o cólon e reto, ou seja, o cancro colorectal), pulmão, (incluindo o cancro do pulmão de pequenas células, cancro do pulmão de células não pequenas, cancro do pulmão de células grandes e mesotelioma), sistema endócrino, ossos, glândula adrenal, timo, figado, estômago, intestino, (incluindo cancro gástrico), pâncreas, medula óssea, malignidades hematológicas, (por exemplo, linfoma, leucemia, mieloma ou malignidades linfoides), bexiga, aparelho urinário, rins, pele, tireoide, cérebro, cabeça, pescoço, próstata e testículo. Preferencialmente o cancro é selecionado a partir do grupo consistindo em cancro da mama, cancro da próstata, cancro do colo do útero, cancro do ovário, cancro gástrico, cancro colorretal, cancro pancreático, cancro do fígado, cancro cerebral, cancro neuroendócrino, cancro do pulmão, cancro renal, malignidades hematológicas, melanoma e sarcomas. Especialmente preferencial, o cancro é selecionado a partir do grupo consistindo em cancro da mama, cancro do colo do útero, cancro do ovário, cancro gástrico, cancro pancreático, cando do cólon e cancro do pulmão. Mais especialmente preferencial, o cancro é selecionado a partir do grupo consistindo em cancro do colo do útero, cancro gástrico, cancro do ovário, cancro pancreático, cancro do cólon e cancro do pulmão.
Amostras A medição do nivel de BUBR1 pode ser realizada in vitro, numa amostra de tecido biológico derivado a partir do indivíduo. A amostra pode ser qualquer material biológico removido do corpo como, por exemplo, tecido normal, tecido tumoral, linhas celulares, plasma, soro, sangue completo, líquido cefalorraquidiano, fluido linfático, células tumorais circulantes, lisado celular, tecido lisado, urina e aspirados. Preferencialmente, a amostra é derivada a partir de tecido normal, tecido tumoral, linhas celulares, células tumorais circulantes ou sangue. Mais preferencialmente, a amostra é derivada a partir de tecido tumoral ou células tumorais circulantes. Numa forma de realização particularmente preferencial, a amostra é derivada a partir de tecido tumoral. Por exemplo, o nível de BUBR1 pode ser medido numa amostra de tecido tumoral fresca, congelada ou fixada em formol/embebida em parafina. A amostra é pré-obtida a partir do indivíduo antes que a amostra seja submetida às etapas do método que envolvam a medição do nível do biomarcador. Os métodos para a remoção da amostra são bem conhecidos na especialidade, e esta pode ser, por exemplo, removida a partir do indivíduo por biópsia, por exemplo, por biópsia de punção, biopsia nuclear ou biópsia de aspiração por agulha fina, biopsia endoscópica ou biópsia superficial. Uma amostra de sangue pode ser colhida por punção venosa e processado posteriormente de acordo com as técnicas convencionais. Células tumorais circulantes também podem ser obtidas a partir do sangue com base, por exemplo, no tamanho (por exemplo, ICTET- Isolamento de células Tumorais Epiteliais por Tamanho) ou enriquecimento celular imunomagnético. (por exemplo, CellSearch®, Veridex, Raritan, NJ)
Comparação de amostras 0 indivíduo pode ser humano ou animal. Preferencialmente, o indivíduo é humano. 0 biomarcador de BUBRl é medido ex vivo numa amostra ou amostras retiradas a partir do corpo humano ou animal, preferencialmente retiradas a partir do corpo humano. A amostra ou amostras são previamente pré-obtidas a partir do corpo humano ou animal, preferencialmente pré-obtidas a partir do corpo humano, antes de submeter a amostra às etapas do método que envolvem a medição do nível do biomarcador.
Um biomarcador é em geral uma substância que é utilizada como um indicador de uma resposta biológica, preferencialmente como um indicador da suscetibilidade a um determinado tratamento, no qual no presente pedido é um tratamento com um composto da fórmula geral I ou um composto derivado farmaceuticamente aceitável resultante do mesmo.
Numa forma de realização particularmente preferencial, níveis de BUBRl menores na amostra em relação a um valor de referência ou a um conjunto de valores de referência, preveem resistência. Tal como utilizado aqui, uma diminuição ou níveis relativamente baixos ou baixos ou menores em relação a um nível de referência ou a um conjunto de níveis de referência, significa que a quantidade ou concentração do biomarcador numa amostra é detectavelmente inferior na amostra em relação ao nivel de referência ou a um conjunto de niveis de referência. Isto engloba pelo menos uma diminuição de, ou nivel inferior a, cerca de 1% em relação à referência, preferencialmente pelo menos uma diminuição de cerca de 5% em relação à referência. Mais preferencialmente, é uma diminuição de, ou nivel inferior a, pelo menos cerca de 10% em relação à referência. Mais particularmente preferencial, é uma diminuição de, ou nivel inferior a, pelo menos cerca de 20% em relação à referência. Por exemplo, uma tal diminuição de, ou nível inferior a, podem incluir, mas não estão limitados a, pelo menos cerca de 1%, cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 50%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90 ou cerca de 100% ou mais de diminuição, em relação à referência. Assim uma diminuição também inclui a ausência de BUBR1 detetável na amostra.
Preferencialmente, niveis baixos de BUBR1 numa amostra ou amostras i) em relação a um valor de referência ou a um conjunto de valores de referência a partir de indivíduos com o mesmo histotipo tumoral; ou ii) retirados após iniciação do tratamento e comparados com uma amostra ou amostras retiradas a partir do mesmo indivíduo antes do início do tratamento; ou iii) em relação a um valor de referência ou a um conjunto de valores de referência a partir de células, tecidos ou fluidos corporais normais; são preditivos de resistência. A medição de um nível de BUBR1 é realizada ex vivo numa amostra previamente obtida a partir do indivíduo. Ainda mais preferencialmente, a resposta que deve ser predita é resistência.
Mais preferencialmente, níveis baixos de BUBR1 numa amostra ou amostras i) em relação a um valor de referência ou a um conjunto de valores de referência a partir de indivíduos com o mesmo histotipo tumoral; ou ii) retirados após iniciação do tratamento e em comparação com uma amostra ou amostras retiradas a partir do mesmo indivíduo antes do início do tratamento; são preditivos de resistência.
Especialmente preferencial, níveis baixos de BUBR1 numa amostra ou amostras em relação a um valor de referência ou a um conjunto de valores de referência a partir de indivíduos com o mesmo histotipo tumoral, são preditivos de resistência.
Numa forma de realização preferencial, para o caso i) em que a medição é comparada numa amostra ou amostras em relação a um valor de referência ou a um conjunto de valores de referência de amostras a partir de indivíduos com o mesmo histotipo tumoral, como aquele referente à amostra a que está a ser comparado, o valor de referência ou um conjunto de valores de referência são estabelecidos a partir de amostras de uma população de indivíduos com esse tipo de cancro. As amostras destes indivíduos de referência podem por exemplo ser derivadas a partir de tecido tumoral ou a partir de células tumorais circulantes, sempre que a origem da amostra seja consistente entre a referência e a amostra a ser comparada.
Noutra forma de realização preferencial, para o caso ii) em que a medição é comparada numa amostra ou amostras colhidas após iniciação do tratamento e em comparação com uma amostra ou amostras retiradas a partir do mesmo indivíduo antes do início do tratamento, esta é medida preferencialmente para prever resistência adquirida. As amostras são comparadas com as células ou tecidos da mesma origem biológica. A previsão da resistência adquirida seria então indicativa que o tratamento com o composto deve ser descontinuado. 0 biomarcador é então utilizado para monitorar caso o tratamento subsequente com o composto é suscetível de proporcionar a resposta necessária (por exemplo, redução de células anormais), ou se as células se tornaram não responsivas ou resistentes ao tratamento.
Ainda noutra forma de realização preferencial, para o caso iii) onde a medição é comparada numa amostra ou amostras em relação a um valor de referência ou a um conjunto de valores de referência de células, tecido ou fluido corporal normais, o valor de referência ou um conjunto de valores de referência poderá ser estabelecido a partir de uma amostra de células, tecidos ou fluido corporal normais (por exemplo, não tumorais). Tais dados podem ser recolhidos a partir de uma população de indivíduos a fim de estabelecer o valor de referência ou um conjunto de valores de referência. 0 valor de referência ou um conjunto de valores de referência são estabelecidos ex vivo a partir de amostras pré-obtidas que podem ser de linhas celulares, ou preferencialmente de materiais biológicos de pelo menos um indivíduo, e mais preferencialmente de uma média de indivíduos (por exemplo, n = 2 a 1000 ou mais). 0 valor de referência ou um conjunto de valores de referência podem então ser correlacionados com os dados da resposta das mesmas linhas celulares, ou dos mesmos indivíduos, do tratamento com um composto da fórmula geral 1 ou um composto derivado farmaceuticamente aceitável resultante do mesmo. A partir desta correlação um módulo de comparação, por exemplo sob a forma de uma escala relativa ou sistema de pontuação, opcionalmente incluindo valores de corte ou limite, pode ser estabelecido, o qual indica os níveis de biomarcador associados com um espectro de níveis de resposta para o composto da fórmula I ou um composto derivado farmaceuticamente aceitável resultante do mesmo. O espectro dos níveis de resposta pode compreender sensibilidade relativa à atividade terapêutica do composto, (por exemplo, alta sensibilidade a baixa sensibilidade), bem como a resistência à atividade terapêutica. Numa forma de realização preferencial, este módulo de comparação compreende um valor ou um conjunto de valores de corte que predizem a resistência ao tratamento.
Por exemplo, se um método de imunohistoquímica é utilizado para medir o nível de BUBR1 numa amostra, os valores de referência podem estar sob a forma de um sistema de pontuação. Tal sistema pode levar em consideração a percentagem de células nas quais a marcação de BUBR1 está presente. O sistema pode também levar em consideração a intensidade relativa da marcação nas células individuais. Os valores de referência ou o conjunto de valores de referência do nível de BUBR1 podem então ser correlacionados com dados indicando a resposta, especialmente resistência, do indivíduo ou tecido ou linha celular para a atividade terapêutica de um composto da fórmula I ou um composto derivado farmaceuticamente aceitável resultante do mesmo. Tais dados podem fazer parte de um módulo de comparação. A resposta é a reação das linhas celulares, ou preferencialmente do sujeito, ou mais preferencialmente da doença num indivíduo, à atividade, preferencialmente atividade terapêutica, de um composto da fórmula geral I ou de um composto derivado farmaceuticamente aceitável resultante do mesmo. 0 espectro dos níveis de resposta pode compreender sensibilidade relativa à atividade, preferencialmente atividade terapêutica, do composto (por exemplo, alta sensibilidade a baixa sensibilidade), bem como a resistência à atividade, preferencialmente atividade terapêutica. Os dados da resposta podem ser monitorizados, por exemplo, em termos de: taxas de resposta objetiva, tempo para progressão da doença, sobrevivência de progressão livre, e sobrevida global. A resposta de uma doença oncológica pode ser avaliada ao utilizar critérios bem conhecidos por um perito na área do tratamento oncológico, por exemplo, mas não limitado a,
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Critérios Rustin CA-125 para Resposta do Cancro do ovário, Fonte: Rustin GJ, Quinn M, Thigpen T, du Bois A, Pujade-Lauraine E, Jakobsen A, Eisenhauer E, Sagae S, Greven K, Vergote I, Cervantes A, Vermorken J. "Re; New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors (ovarian cancer)". J Natl Cancer Inst. 2004; 96 (6) :487-8; e
Critérios do Grupo de Trabalho 2 PSA para Resposta do Cancro da Próstata,
Fonte: Scher HI, Halabi S, Tannock I, Morris M, Sternberg CN, Carducci MA, Eisenberger MA, Higano C, Bubley GJ, Dreicer R, Petrylak D, Kantoff P, Basch E, Kelly WK, Figg WD, Small EJ, Beer TM, Wilding G, Martin A, Hussain M; "Prostate Cancer Clinical Trials Working Group. Design and end points of clinical trials for patients with progressive prostate cancer and castrate levels of testosterone: recommendations of the Prostate Cancer Clinical Trials Working Group". J Clin Oncol. 2008;26 (7) :1148-59. A resistência está associada à não existência de uma redução observável e/ou mensurável em, ou ausência de, um ou mais dos seguintes: redução do número de células anormais, preferencialmente células cancerígenas; ou ausência de células anormais, preferencialmente células cancerígenas; para doenças oncológicas: redução do tamanho do tumor; inibição (ou seja, diminuída em certa medida e interrompida preferencialmente) do crescimento tumoral adicional; redução dos níveis de marcadores tumorais como PSA e CA-125, inibição (ou seja, diminuída em certa medida e interrompida preferencialmente) da infiltração de células cancerígenas noutros órgãos (incluindo a propagação do cancro em tecido mole e osso); inibição (ou seja, diminuída em certa medida e interrompida preferencialmente) de metástases rumorais; alívio de um ou mais dos sintomas associados com o cancro específico; e morbidade e mortalidade reduzidas.
Numa forma de realização preferencial, resistência significa que não há uma redução observável e/ou mensurável em, ou ausência de, um ou mais dos seguintes critérios; diminuição do tamanho do tumor; inibição do crescimento tumoral adicional, inibição da infiltração de células cancerígenas noutros órgãos; e inibição de metástases tumorais.
Numa forma de realização mais preferencial, resistência refere-se a um ou mais dos seguintes critérios; nenhuma redução no tamanho do tumor; nenhuma inibição do crescimento tumoral adicional, nenhuma inibição da infiltração de células cancerígenas noutros órgãos; e nenhuma inibição de metástases tumorais. A medição dos critérios de resistência acima mencionados está de acordo com as diretrizes clínicas bem conhecidas por um perito na área do tratamento oncológico, tais como aquelas listadas acima para medir a resposta de uma doença oncológica. A resposta também pode ser estabelecida in vitro ao avaliar a proliferação celular e/ou morte celular. Por exemplo, efeitos na morte ou proliferação celular poderão ser avaliados in vitro por um ou mais dos seguintes ensaios bem estabelecidos: A) marcação nuclear com corante Hoechst 33342, fornecendo informações sobre a morfologia nuclear e fragmentação de DNA, os quais são indicativos da apoptose. B) Ensaio de ligação de Anexina V que reflete o conteúdo de fosfatidilserina do exterior da bicamada lipidica da membrana plasmática. Este evento é considerado uma indicação precoce da apoptose. C) Ensaio TUNEL (Ensaio de marcação das extremidades cortadas com transferase terminal de desoxinucleotídeoa mediada por desoxiuridina trifosfato), um método de fluorescência para avaliar células em fase de apoptose ou necrose, ao medir a fragmentação de DNA através da marcação terminal final de ácidos nucleicos. D) Ensaio de proliferação MTS medindo a atividade metabólica das células. Células viáveis são metabolicamente ativas, enquanto células com uma cadeia respiratória comprometida apresentam uma atividade reduzida neste teste. E) Ensaio de marcação com violeta de cristal, em que efeitos no número de células são monitorizados através da marcação direta de componentes celulares. F) Ensaio de proliferação por monitorização de síntese de DNA através da incorporação de bromodeoxiuridina (BrdU). Efeitos inibitórios de crescimento/proliferação podem ser determinados diretamente. G) Ensaio YO-PRO, cujo uma cianina monomérica, impermeável à membrana, fluorescente, passível de marcação de ácidos nucleicos, permite a análise de células a morrer (por exemplo, apoptose) sem interferir com a viabilidade celular. Efeitos gerais no número de células também podem ser analisados após a permeabilização celular. H) Marcação com iodeto de propídio para distribuição do ciclo celular, a qual mostra alterações na distribuição entre as diferentes fases do ciclo celular. Podem ser determinados os pontos de interrupção do ciclo celular. I) Ensaios de crescimento independente de ancoragem, tais como ensaios de crescimento em colónia que avaliam a capacidade de suspensões de células individuais para crescer em colónias de ágar macio.
Numa forma de realização preferencial referente à determinação da resistência in vitro, resistência significa que não há nenhuma diminuição na taxa de proliferação de células anormais e/ou redução do número de células anormais. Mais preferencialmente, resistência significa que não há nenhuma diminuição na taxa de proliferação de células cancerígenas e/ou nenhuma redução do número de células cancerígenas. A redução do número de células anormais, preferencialmente cancerígenas, pode ocorrer através de uma variedade de mecanismos de morte celular programada e não programada. Apoptose, morte celular programada de independente de caspases e morte celular autofágica, são exemplos de morte celular programada. No entanto, os critérios de morte celular envolvidos nas formas de realização da invenção não devem ser tomados como limitativos de qualquer mecanismo de morte celular. BUBR1
Conforme descrito acima, o termo BUBR1 é usado aqui para englobar todos os sinónimos mencionados anteriormente e refere-se a esta entidade quer aos níveis de ácidos nucleicos ou de proteína como apropriado. Os níveis de ácidos nucleicos referem-se por exemplo a mRNA, cDNA ou DNA, e o termo de proteína inclui polipeptídeos ou sequências proteicas transcritas e as suas formas pós-translacionamente modificadas.
Um exemplo preferencial da sequência proteica da BUBR1 (BUBR1 humana) está listado em SEQ. ID No. 1, Figura 18. Contudo o termo BUBR1 engloba também homólogos, formas mutantes, variantes alélicas, isotipos, variantes de splicing e equivalentes desta sequência. Preferencialmente também engloba homólogos, formas mutantes, variantes alélicas, isotipos, variantes de splicing e equivalentes humanos desta sequência. Mais preferencialmente engloba sequências possuindo pelo menos cerca de 75% de identidade, especialmente preferencial pelo menos cerca de 85% identidade, particularmente preferencial pelo menos cerca de 95% de identidade e mais particularmente preferencial cerca de 99% de identidade face à sequência referida.
Numa forma de realização especialmente preferida, BUBR1 é a entidade nos níveis de ácidos nucleicos ou de proteína, a qual é representada no nível de proteína por SEQ ID NO. 1 ou sequências possuindo pelo menos 95% de identidade com esta sequência, preferencialmente pelo menos 99% de identidade. Numa forma de realização particularmente preferencial, BUBR1 é representada por SEQ. ID. No. 1.
Um exemplo preferencial da sequência de ácidos nucleicos de BUBRl (BUBRl humana) está acessível através da Referência de Sequência NCBI NM_001211, e está listada na SEQ. ID. No. 2 (NM_001211.5), Figura 19. O termo BUBRl também engloba modificações, variantes mais degeneradas da sequência referida, complementos da sequência referida, e oligonucleótidos que hibridizam para uma das sequências referidas. Tais modificações incluem, mas não estão limitadas a, mutações, inserções, eliminações e substituições de um ou mais nucleotídeos. Mais preferencialmente, engloba ainda sequências possuindo pelo menos cerca de 75% de identidade face à sequência referida, especialmente preferencial pelo menos cerca de 85% de identidade, particularmente preferencial pelo menos cerca de 95% de identidade e mais particularmente preferencial cerca de 99% de identidade.
Noutra forma de realização preferencial, BUBRl é a entidade nos níveis de ácidos nucleicos ou de proteína, a qual é representada no nível de ácidos nucleicos pela SEQ ID NO. 2 ou sequências possuindo pelo menos 95% de identidade face a esta sequência, preferencialmente pelo menos 99% de identidade. Numa forma de realização particularmente preferencial, BUBR1 é representada por SEQ. ID. No. 2.
Nivel de BUBRl 0 nivel de BUBRl pode ser analisado na amostra por meios técnicos bem conhecidas por um perito da especialidade. Pode ser analisado ao nivel da transcrição e translação.
Numa forma de realização preferencial, o nivel de ácidos nucleicos de BUBRl, preferencialmente mRNA BUBRl, é medido numa amostra. Exemplos de métodos de análise da expressão génica conhecidos na especialidade que são apropriados para medir o nivel de BUBRl ao nivel de ácidos nucleicos incluem, mas não estão limitados a, i) utilizar uma sonda marcada que é capaz de hibridizar mRNA; ii) usar PCR envolvendo um ou mais primers com base na sequência do gene BUBRl, por exemplo usar métodos quantitativos de PCR utilizando sondas marcadas, por exemplo, sondas fluorogénicas, tais como PCR quantitativa em tempo real; iii) micro-arrays; IV) northern blotting V) análise expressão génica em série (SAGE), READS (amplificação da enzima de restrição de cDNAs digeridos), indicação diferencial e medição de microRNA.
Numa forma de realização preferencial é medido o nivel de BUBRl ao nivel de proteína. Exemplos de métodos de análise da expressão proteica conhecido na especialidade que são apropriados para medir o nível de BUBRl ao nível proteico incluem, mas não limitados a, i) análise por imunohistoquímica (IHC), ii) western botting iii) imunoprecipitação iv) ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) v) ensaio imunorradiométrico vi) separação de células ativadas por fluorescência (FACS) vii) espectrometria de massa, incluindo ionização e dessorção a laser assistida por matriz (MALDI, por exemplo, MALDI-TOF) e ionização e dessorção a laser melhorada por superfície (SELDI, por exemplo SELDI-TOF).
Os anticorpos envolvidos em alguns dos métodos anteriores podem ser anticorpos monoclonais ou policlonais, fragmentos de anticorpos e/ou vários tipos de anticorpos sintéticos, incluindo anticorpos quiméricos. O anticorpo pode ser marcado para permitir ser detetado ou passível de deteção após reação com uma ou mais das seguintes espécies, por exemplo utilizando um anticorpo secundário que é marcado ou capaz de produzir um resultado detetável. Anticorpos específicos para BUBR1 estão disponíveis comercialmente a partir da BD Transduction Laboratories e Cell Signaling Technology, Inc. ou podem ser preparados através de métodos de geração de anticorpos convencionais bem conhecidos por um perito qualificado. Métodos preferenciais de análise de proteínas são ELISA, técnicas de espectrometria de massa, imunohistoquímica e western blotting, mais preferencialmente western blotting e imunohistoquímica. No western blotting, também conhecido como imunoblotting, anticorpos marcados podem ser utilizados para avaliar os níveis de proteínas, em que a intensidade do sinal a partir de um marcador detetável corresponde à quantidade de proteína, e pode ser quantificado por exemplo por densitometria. A imunohistoquímica usa novamente anticorpos marcados para detetar a presença e quantidade relativa do biomarcador. Este pode ser utilizado para avaliar a percentagem de células para as quais o biomarcador está presente. Este também pode ser utilizado para avaliar a localização ou quantidade relativa do biomarcador em células individuais; sendo este último visto como uma função da intensidade da marcação. ELISA significa ensaio de imunoabsorção enzimática, dado que este usa uma enzima ligada a um anticorpo ou antigénio para a deteção de uma proteína específica. ELISA é tipicamente realizada como se segue (embora existam outras variações na metodologia): um substrato sólido, como uma placa de 96 poços, é revestido com um anticorpo primário, o qual reconhece o biomarcador. 0 biomarcador de ligação é então reconhecido por um anticorpo secundário específico para o biomarcador. Este pode estar diretamente ligado a uma enzima ou um terceiro anticorpo anti-imunoglobulina pode ser utilizado, o qual está ligado a uma enzima. É adicionado um substrato e a enzima catalisa uma reação, produzindo uma cor específica. Ao medir a densidade ótica desta cor, podem ser determinadas a presença e quantidade do biomarcador.
Usos do biomarcador
Numa forma de realização preferencial, o biomarcador é utilizado para prever a resistência inerente da doença num indivíduo para o composto da fórmula geral I ou um composto derivado farmaceuticamente aceitável resultante do mesmo como definido acima.
Numa forma de realização preferencial, o biomarcador é utilizado para prever a resistência adquirida da doença num indivíduo para o composto da fórmula geral I ou um composto derivado farmaceuticamente aceitável resultante do mesmo como definido acima. 0 biomarcador pode ser utilizado para selecionar indivíduos que sofrem ou são predispostos a sofrer de uma doença, preferencialmente cancro, para tratamento com um composto da fórmula geral I ou um composto derivado farmaceuticamente aceitável resultante do mesmo conforme definido acima. Os níveis de tal biomarcador podem ser utilizados para identificar indivíduos suscetíveis de responderem ou de não responderem, ao tratamento com tais agentes. A estratificação de indivíduos pode ser feita a fim de evitar regimes de tratamento desnecessários. Em particular o biomarcador pode ser utilizado para identificar indivíduos a partir dos quais uma amostra ou amostras não exibem um nível de BUBR1 baixo, em relação a um nível de referência ou um conjunto de níveis de referência, quando então tais indivíduos podem depois ser selecionados para tratamento com o composto da fórmula I ou um composto derivado farmaceuticamente aceitável resultante do mesmo como definido acima. 0 biomarcador pode também ser utilizado para auxiliar na determinação dos regimes de tratamento, em relação às quantidades e esquemas de dosagem. Adicionalmente, o biomarcador pode ser utilizado para ajudar na seleção de uma combinação de fármacos a serem administrados a um indivíduo, incluindo um composto ou compostos da fórmula geral I ou um composto derivado farmaceuticamente aceitável resultante dos mesmos, e outro agente (citotóxico) quimioterápico ou agentes. Em acréscimo, o biomarcador pode ser utilizado para auxiliar na determinação de estratégias terapêuticas num indivíduo incluindo se um composto da fórmula geral I ou um composto derivado farmaceuticamente aceitável resultante do mesmo, deve ser administrado em combinação com terapia direcionada, terapia endócrina, radioterapia, imunoterapia ou intervenção cirúrgica, ou uma combinação destas. A BUBR1 pode também ser utilizada em combinação com outros biomarcadores para prever a resposta a um composto da fórmula geral I ou um composto derivado farmaceuticamente aceitável resultante do mesmo, e para determinar os regimes de tratamento. Pode ainda ser utilizada em combinação com ensaios de quimiossensibilidade para prever a resistência e determinar os regimes de tratamento. 0 ensaio de quimiossensibilidade envolve aplicar diretamente um composto da fórmula geral I às células colhidas a partir do indivíduo, por exemplo a partir de um indivíduo com malignidades hematológicas ou tumores sólidos acessíveis, por exemplo cancro da mama, cabeça e garganta ou melanomas, para determinar a resposta das células ao composto. Método de tratamento
Num método de tratamento e em BUBR1 para utilização num método de tratamento, o nível de BUBR1 é primeiramente estabelecido em relação a um nível de referência ou a um conjunto de níveis de referência ou a níveis iniciais de pré-tratamento, e depois um composto da fórmula geral I ou um composto derivado farmaceuticamente aceitável resultante do mesmo como definido acima, é administrado caso o nível de BUBR1 na amostra referida não seja inferior a um valor de referência ou a um conjunto de valores de referência ou não tenha diminuído em relação aos níveis iniciais de pré-tratamento respetivamente. 0 composto da fórmula I ou um composto derivado farmaceuticamente aceitável resultante do mesmo pode ser administrado numa composição farmacêutica, como é bem conhecido por um perito na especialidade. Dosagens e composições adequadas são por exemplo divulgadas em WO 2004/103994 AI nas páginas 35-39. Composições para administração por via entérica, tais como administração nasal, bucal, retal ou, especialmente, oral, e para administração por via parentérica, tais como administração endovenosa, intramuscular ou subcutânea, a animais de sangue quente, especialmente seres humanos, são especialmente preferenciais. Mais particularmente, são preferenciais composições para administração intravenosa.
As composições compreendem o principio ativo e um veiculo de transporte farmaceuticamente aceitável. Um exemplo de uma composição inclui os, mas não está limitada aos, seguintes: cápsulas de gelatina mole 5000, cada uma compreendendo como principio ativo 0,05 g de um dos compostos da fórmula geral (I), são preparadas como se segue: 250 g de principio ativo pulverizado são suspensas em 2 litros de Lauroglykol® (laurato de propilenoglicol, Gattefossé S.A., Saint Priest, França) e processadas num pulverizador molhado para produzir um tamanho de partícula de cerca de 1 a 3 pm. Porções de 0,419 g da mistura são então introduzidas em cápsulas de gelatina mole utilizando uma máquina de preenchimento de cápsulas. É aqui também drescrito um método de tratamento de uma doença neoplásica ou doença autoimune, preferencialmente cancro, aumentando primeiramente o nível de BUBR1 num indivíduo que tem uma amostra com um nível baixo de BUBR1 em relação a um nível de referência ou um conjunto de níveis de referência, ou níveis iniciais de pré-tratamento, tratando posteriormente o indivíduo com um composto da fórmula geral I ou um composto derivado farmaceuticamente aceitável resultante do mesmo como definido acima. O nível de BUBR1 pode ser aumentado por meios químicos ou genéticos diretos ou indiretos. São exemplos de tais métodos de tratamento com um fármaco que resulte na expressão aumentada de BUBR1, e libertação direcionada de artifícios virais, plasmídeos ou peptídicos, ou anticorpo ou siRNA ou antisense para sobrerregulação do nível de BUBR1. Por exemplo, artifícios virais ou de plasmídeos podem ser utilizados para aumentar a expressão de BUBR1 na célula. 0 indivíduo pode então ser tratado com um composto da fórmula geral I ou um composto derivado farmaceuticamente aceitável resultante do mesmo.
Um composto da fórmula geral I ou um composto derivado farmaceuticamente aceitável resultante do mesmo, pode ser administrado sozinho ou em combinação com um ou mais agentes terapêuticos diferentes. Terapia de possível combinação pode assumir a forma de combinações fixas, ou a administração de um composto da invenção e de um ou mais agentes terapêuticos diferentes que são escalonados ou administrados independentemente uns dos outros, ou a administração combinada de combinações fixas e um ou mais agentes terapêuticos diferentes.
Um composto da fórmula geral I ou um composto derivado farmaceuticamente aceitável resultante do mesmo pode, para além de ou em acréscimo, ser especialmente administrado para terapia tumoral em combinação com quimioterapia (terapia citotóxica), terapia direcionada, terapia endócrina, radioterapia, imunoterapia, intervenção cirúrgica, ou uma combinação destas. Terapia a longo prazo é igualmente possível como terapia adjuvante no contexto de outras estratégias de tratamento, como descrito acima. Outros tratamentos possíveis são terapias para manter o estado do paciente após regressão tumoral, ou até terapia quimiopreventiva, por exemplo em pacientes sob risco.
Kit
Num aspeto a invenção refere-se a um kit para prever a resposta, preferencialmente de uma doença num indivíduo, a um composto da fórmula geral I ou um composto derivado farmaceuticamente aceitável resultante do mesmo como definido acima, compreendendo os reagentes necessários para medir o nível de BUBR1 numa amostra. Preferencialmente, os reagentes compreendem um reagente da captura compreendendo um detetor da BUBR1 e um reagente de deteção. 0 kit podem também compreender preferencialmente um módulo de comparação que compreende um valor de referência ou um conjunto de valores de referência para os quais o nível de BUBRl na amostra é comparado. Numa forma de realização preferencial, o módulo de comparação está incluído nas instruções de uso do kit. Noutra forma de realização preferencial, o módulo de comparação está sob a forma de um dispositivo de exibição, por exemplo uma faixa de cor ou material codificado numericamente, o qual é projetado para ser colocado ao lado da leitura da medição da amostra, de modo a indicar os níveis de resistência. 0 valor de referência ou um conjunto de valores de referência pode ser determinado conforme descrito acima.
Os reagentes são preferencialmente anticorpos ou fragmentos de anticorpos que se ligam seletivamente à BUBRl. Estes podem estar por exemplo sob a forma de um anticorpo primário específico que se liga à BUBRl e um anticorpo secundário que se liga ao anticorpo primário, e o qual ele próprio está marcado para deteção. 0 anticorpo primário pode também ser marcado para deteção direta. Os kits podem também conter opcionalmente uma(várias) solução (ões) de lavagem que seletivamente permite(m) a retenção do biomarcador ligado ao reagente de captura em comparação com outros biomarcadores após lavagem. Tais kits podem então ser utilizados em ELISA, western blotting, citometria de fluxo, imunohistoquímica ou outros métodos imunoquímicos para detetar o nível do biomarcador.
Os reagentes podem também noutra forma de realização preferencial, serem aqueles que são capazes de medir o nível de ácidos nucleicos de BUBR1 numa amostra. Amostras adequadas são amostras de tecidos ou de tecidos tumorais, secções de espécimes de tecidos ou de tecidos tumorais fixos ou embebidos em parafina ou congelados, células tumorais circulantes e sangue e amostras de liquidos derivados a partir do corpo. Preferencialmente, os reagentes compreendem uma sonda marcada ou primers para hibridização de ácidos nucleicos de BUBR1 na amostra. Sistemas de deteção apropriados, quer com base em técnicas de amplificação de PCR ou de deteção de sondas marcadas, permitem a quantificação de ácidos nucleicos de BUBR1 na amostra. Isto pode ser feito i) in situ na própria amostra, preferencialmente nas seções de espécimes embebidos em parafina ou congelados, ii) em extratos de espécimenes tumorais, de tecidos ou hemoderivados, em que reagentes apropriados seletivamente enriquecem para ácidos nucleicos. Os kits permitem a medição e quantificação i) da quantidade de sondas hibridizadas marcadas para os espécimes in situ ou ii) a quantidade de produtos de amplificação com base em primers por métodos com base em propriedades físico-químicas específicas das próprias sondas ou dos reporters ligados aos primers. 0 kit de acordo com a invenção pode ser utilizado no método de tratamento, como definido acima. Este compreende um composto da seguinte fórmula ou um sal farmaceuticamente aceitável resultante do mesmo
Numa forma de realização particularmente preferencial do kit, o sal é um sal de dihidrocloreto. Noutro aspeto a invenção refere-se ao uso de tal kit como descrito acima.
Na especificação presente as palavras "compreendem" ou "compreende" ou "compreendendo" devem ser entendidas como sugerindo a inclusão de um determinado item ou grupo de itens, mas não a exclusão de qualquer outro item ou grupo de itens.
Metodologia experimental
Marcação imunofluorescente de células cultivadas Células A549 humanas de cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC, número de referência ATCC CCL-185), células HeLa de cancro do colo do útero (número de referência ATCC CCL-2) e células SKBR3 de carcinoma da mama (número de referência ATCC HTB-30) foram semeadas a densidades de 50% em lamelas de microscópio redondas e cultivadas durante 24 horas em RPMI-1640 contendo 10% de FCS (também referido como FBS) a 37 °C, 5% de C02. Os compostos a serem testados foram dissolvidos em DMSO. 0 meio de cultura celular foi substituído com meio contendo o(s) composto(s) diluído(s) (paclitaxel, vimblastina, colchicina e nocodazolo foram comprados a partir da Sigma-Aldrich) ou veículo de transporte. Após o tratamento, as lamelas foram lavadas e as células foram fixas em metanol/acetona (1:1) durante 5 minutos à temperatura ambiente e incubadas subsequentemente em solução tampão de bloqueio (0,5% de BSA e 0,1% de TX-100 em PBS) durante 30 minutos à temperatura ambiente. Espécimes foram então incubados com anticorpo anti-alfa-tubulina (Sigma, 1:2000) durante 1 hora à temperatura ambiente em solução tampão de bloqueio. Após várias etapas de lavagem, as células foram incubadas com IgG de cabra anti-rato AlexaFluor-488 (Molecular Probes, 1:3000) durante 1 hora à temperatura ambiente, seguindo-se de várias etapas de lavagem com solução tampão de bloqueio. Espécimes foram então dispostos com antifade ProLong Gold (Molecular Probes), seladas com verniz para as unhas e examinadas com um microscópio Leica de imunofluorescência. As imagens foram capturadas com uma câmara CCD arrefecida e processadas pelo programa computacional ImageJ.
Transfeção como siRNA
De modo a mostrar que BUBR1 é um biomarcador para a resistência, foram realizadas experiências com siRNA. Para as experiências como siRNA avaliarem os efeitos sobre o fenótipo e número de células tumorais (Figura 8), foram cultivadas células de cancro do colo do útero HeLa (referência ATCC CCL-2) a 37 °C e 5% de C02 em DMEM com 10% de FCS (Invitrogen) . Foram semeadas 1000 células HeLa por poço em placas pretas multititer 384 (BD Falcon) . As células foram reversamente transfectadas com 20 nM de siRNA não direcionado de controlo (pool não direcionada ON- target-plus D001810, Dharmacon) ou com uma mistura de quatro siRNAs BUBR1 (Smartpool ON-target-plus L-004101, Dharmacon, ver informações de sequência abaixo), usando reagente de transfecção Dharmafectl (Dharmacon, Thermo). 48 horas após semear as células e tranfectar com siRNA, um par replicado de clones de siRNA foi tratado com BAL27862 (50 nM, 0,1% de DMSO) e outro par replicado com solução de controlo (0,1% de DMSO) durante 24 horas. A experiência foi terminada por fixação à base de metanol (-20 °C, 5 min) e subsequente imunomarcação (1 hora, temperatura ambiente) usando anticorpos de alfa-tubulina (marcado com FITC, 1:500, F2168, Sigma) e de actina (TRITC-faloidina, 1:3000, P1951, Sigma), bem como o marcador de DNA Hoe33342 (1:8000, Sigma). Com base na imunocoloração, a morfologia das células tratadas foi analisada usando uma abordagem multiparamétrica (microscópio de fluorescência BD Pathway 855; objetiva 20x) com programa computacional adequado. O número de células por poço também foi calculado com base na marcação de núcleos com Hoe33342. Isto permitiu o cálculo da fração de células exibindo um fenótipo (normal) não tratado (em %).
Para as experiências com siRNA avaliarem efeitos nos níveis de expressão de BUBR1 por immunoblotting e efeitos sobre a proliferação e viabilidade de células tumorais usando o ensaio YO-PRO (Figuras 7, 9, 10 e 11) , e ensaio de Violeta de Cristal (Figuras 12 e 13), foram semeadas células em 6 poços de placas a uma densidade adequada: células HeLa (células de cancro do colo do útero; referência ATCC CCL-2) 2,5E+04 (para YO-PRO) ou 4,0E+04 (para Violeta de Cristal) por poço, células H460 (células NSCLC; referência ATCC HTB-177) 5,0E+04 por poço, células MCF-7 (células de carcinoma da mama; referência ATCC HTB-22) 2,4E+05 por poço, células Panei (células de cancro pancreático, referência ATCC CRL-1469) e células HCT116 (células de cancro do cólon, referência ATCC CC1-247) 8E+04 células por poço, e foram cultivadas a 37 °C e 5% de C02 em RPMI-1640 ou DMEM contendo 10% de FCS (meio completo) . As células foram transfectadas no dia seguinte com uma mistura de quatro siRNAs BUBR1 (Smartpool ON-Target-plus L-004101, Dharmacon, ver informação de sequência abaixo), os quatro siRNAs BUBR1 individuais (Conjunto ON-Target-plus de quatro LU-004101 atualizados) ou siRNAs não direcionados de controlo (pool ON-Target-plus não direcionada D001810, Dharmacon), usando Hiperfect (Qiagen) para H460, Panel e HCT116 ou Lipofectamine2000 (Invitrogen) para HeLa e MCF-7, de acordo com as instruções do fabricante. A concentração final de siRNA foi de 10 nM (H460) ou de 20-30 nM (HeLa) ou de 20 nM (MCF-7, Panel, HCT116). As células foram mantidas a 37 °C e 5% de C02 durante 24 horas antes do tratamento com composto durante 48 horas, seguido por análise YO-PRO, ensaio de Violeta de Cristal ou extração para ensaio immunoblot. Os siRNAs ON-Target-plus são siRNAs de cadeia dupla, quimicamente modificados para melhorar a especificidade para o alvo desejado.
As sequências dos quatro siRNAs BUBR1 usados foram:
ON-TARGETplus siRNA BUBR1 #1 SEQ ID. No. 3 5' GAUGGU GAAUU GUGGAAUA
ON-TARGETplus siRNA BUBRl #2 SEQ ID. No. 4 5' GAAACGGGCAUUUGAAUAU
ON-TARGETplus siRNA BUBRl #3 SEQ ID. No. 5 5' GCAAUGAGCCUUUGGAUAU
ON-TARGETplus siRNA BUBRl #4 SEQ ID. No. 6 5' CAAUACAGCUUCACUGAUA
Ensaio YO-PRO de células tratadas com siRNA BAL27862, dissolvido em DMSO, foi diluído em meio completo antes da adição às células às concentrações indicadas (concentração final de DMSO de 0,5%) . As células foram incubadas durante 48 horas, seguindo-se análise YO-PRO.
Iodeto de YO-PRO® é uma cianina monomérica, impermeável à membrana, fluorescente, passível de marcação de ácidos nucleicos, o qual permite análise de células na fase de morte (por exemplo, apoptóticas) sem interferir com a viabilidade celular.
Foram adicionados 12,5 pL de iodeto de Y0-PR0®-1 (491/509) (Invitrogen/Molecular Probes, # Y-3603; 1 mM em DMSO) a 1 mL 5 vezes mais concentrado de solução tampão YO-PRO (100 mM de Na-citrato, pH 4,0; 134 mM de NaCl) para produzir a mistura YO-PRO. Para a determinação da citotoxicidade/apoptose, 500 pL de mistura YO-PRO foram adicionados por poço em 6 placas de poços (diluição 1:5), e incubados durante 10 minutos à temperatura ambiente no escuro. A absorção do corante YO-PRO pelas células foi avaliada por meio de um leitor de placas SpectraMax M2e (Molecular Devices) usando excitação a 485 nm e emissão a 538 nm a um cutoff de 530 nm. Para a determinação dos efeitos globais no crescimento celular/número total de células, foram adicionados por poço 500 pL de solução tampão de lise (30mM de EDTA; 30mM de EGTA; 0,6% de NP-40; em 0,33 vezes da solução tampão YO-PRO), e foram incubados durante 30 min à temperatura ambiente no escuro. A leitura da fluorescência foi realizada num leitor de placas SpectraMax M2e (Molecular Devices) usando excitação a 485 nm e emissão a 538 nm num cutoff de 530 nm. A% de células mortas foi calculada como uma percentagem do número total de células restantes.
Ensaio de Violeta de Cristal das células tratadas com siRNA Células foram incubadas durante 48 horas com DMSO ou BAL27862 diluído em meio completo (concentração final de DMSO de 0,5%) . Após o meio ter sido removido, as células foram fixas e marcadas ao adicionar 1 mL de Marcador Violeta de Cristal (0,2% de Violeta de Cristal em 50% de Metanol) por poço. As placas foram incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente. Subsequentemente o marcador foi decantado e as placas foram lavadas 4 vezes com água destilada duplamente. As placas foram secas ao ar durante várias horas. O marcador foi dissolvido ao adicionar 2 mL de solução tampão (0,1 M de Tris pH 7,5, 0,2% de SDS, 20% de Etanol) por poço e agitando as placas. A absorvância a 590 nm foi medida usando um leitor de placas SpectraMax M2e (Molecular Devices). A fim de subtrair os números de células iniciais, uma placa de controlo foi fixa e marcada no mesmo dia em que o composto foi adicionado. Os resultados finais foram calculados subtraindo a absorvância celular inicial a partir daquela do controlo (DMSO) ou das células tratadas com composto. Valores inferiores a zero indicam morte celular.
Ensaio de Crescimento em Colónia:
Foram preparadas suspensões de células individuais de xenoenxertos tumorais derivados a partir de pacientes (mantidos em ratinhos sem pelo). Para ensaios de crescimento em colónia, foram plaqueadas células em ágar macio em placas de 24 poços de acordo com o ensaio introduzido por Hamburger & Salmon ("Primary bioassay of human tumour stem cells", Science, 1977,197:461-463). 2,0E + 04 - 6, 0E + 04 células em 0,2 mL de meio contendo 0,4% de ágar foram plaqueadas para uma camada inferior de 0,75% de ágar. Os compostos em teste foram aplicados a 0,2 mL de meio de cultura. Cada placa de 24 poços possuía controlos não tratados e amostras em triplicado. As culturas foram incubadas a 37 °C e 7,5% de CO2 durante 5-28 dias. 24 horas anteriormente à análise, as colónias vitais foram marcadas com uma solução de sal de tetrazólio metabolizável (Alley MC et al, Life Sei. 1982, 31:3071-3078) e foram contadas com um sistema de análise de imagem automático (Omnicon 3600, Biosys GmbH).
Os efeitos farmacológicos relativos foram expressos segundo o rácio entre o número médio de colónias em poços tratados e em poços de controlo. Os valores de IC70 foram determinados ao representar graficamente as concentrações de compostos versus as contagens de colónias referentes. PCR quantitativa em tempo real Células de cancro do colo do útero HeLa e células NSCLC H460 (referência número ATCC HTB-177) foram cultivadas em pratos de 10 cm até que atingissem 80% de confluência, seguido por tripsinisação, formação de pellets e ressuspensão em 1 mL de reagente Trizol (Invitrogen). O RNA total foi isolado de acordo com as instruções do fabricante. PCR em tempo real foi realizada utilizando o kit de 1 passo TaqMan RNA-to-Ct (Applied Biosystems, número de referência 4392938) e ensaios de expressão génica (Applied Biosystems) com 100 ng de RNA por reação usando o Sistema de Deteção de Sequência ABI Prism 7000. Foram usados os seguintes ensaios de expressão génica: Ensaio ID Hs01084828_ml para quantificação de BUBR1 ou Ensaio ID HS99999901_sl para quantificação de RNA 18S. Todas as amostras foram analisadas em triplicado. A análise dos dados foi realizada utilizando o programa computacional SDS (Applied Biosystems). Os níveis de expressão de BUBR1 foram normalizados quanto a RNA 18S.
Fabrico e Ensaio Violeta de Cristal das Linhas Celulares Resistentes a BAL27862
Sublinhas resistentes a BAL27862 de linhas celulares humanas de cancro do pulmão de células não pequenas (H460 referência ATCC HTB-177; A549 referência ATCC CCL-185), linhas celulares de cancro do ovário (SKOV3 referência ATCC HTB-77) foram geradas por seleção a longo prazo em meio de cultura celular completo (RPMI-1640 contendo 10% de FCS; Sigma-Aldrich) segundo aumento gradual das concentrações de BAL27862. Dependendo da linha celular, o processo de seleção foi realizado durante 8-12 meses de modo a atingir fatores de resistência (rácio de IC50 da linha celular resistente e linha celular não mutante apropriada) entre 3 e 11,6. As sublinhas resistentes foram expandidas à maior concentração de BAL27862 tolerada e posteriormente congeladas e armazenadas em nitrogénio liquido.
As células foram semeadas em placas de 96 poços às seguintes densidades: A549: 2000, H460: 1000, SKOV3: 2000 e, após incubação durante 24 horas, foram incubadas durante 72 horas com DMSO, BAL27862, colchicina, nocodazolo, paclitaxel ou vinblastina, diluídos em meio completo (concentração final em DMSO max. 0,5%) . Após o meio ter sido removido, as células foram fixas e marcadas ao adicionar 50 mL de Marcador Violeta de Cristal (0,2% de Violeta de Cristal em 50% de Metanol) por poço. As placas foram incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente. Subsequentemente o marcador foi decantado e as placas foram lavadas 4 vezes com água que foi destilada por duas vezes. As placas foram secas ao ar durante várias horas. O marcador foi dissolvido segundo a adição de 100 yL de solução tampão (0,1 M Tris pH 7,5, 0,2% de SDS, 20% de Etanol) por poço e agintando as placas. A absorvância a 590 nm foi medida utilizando um leitor de placa SpectraMax M2e (Molecular Devices). Os valores de IC50 antiproliferativos foram calculados a partir das curvas de resposta à concentração utilizando o programa computacional GraphPad Prism. Os fatores de resistência foram calculados como um rácio do IC50 de BAL27862 na variante de linha resistente versus o IC50 na linha parental.
Extração Proteica
Extração de células tumorais: Células foram lavadas com uma solução gelada de PBS contendo 1 mM de fluoreto de fenilmetilsufonil (PMSF) e solução tampão gelada para lise contendo 50 mM de HEPES (pH 7,5), 150 mM de NaCl, 25 mM de β-glicerofosfato, 25 mM de NaF, 5 mM de EGTA, 1 mM de EDTA, 15 mM de pirofosfato, 2 mM de ortovanadato de sódio, 10 mM de molibdato de sódio, leupeptina (10 mg/mL) , aprotinina (10 mg/mL) e 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF). As células foram extraídas na mesma solução tampão contendo 1% de NP-40. Após homogeneização, os lisados foram clarificados por centrifugação e congelados a -80 °C.
Immunoblottinq/Western Bloting O ensaio de immunoblotting foi realizado utilizando 20 mg de proteína total por faixa. A concentração de proteína total foi determinada com o Ensaio Proteico por BCA (Pierce). A proteína foi separada num SDS-gel a 7,5% e transferida para uma membrana de PVDF utilizando Semidry Blotting (90 min, 50 mA/gel). Os anticorpos primários utilizados para immunoblotting foram os seguintes: BUBR1 Ab. No. 1: BUBRlCs (disponível a partir de Cell Signaling Technology, Inc, número de referência 4116) origem: coelho, policlonal, diluição 1:1000, condições de tampão: 5% de leite em PBS/0,1% de Tween BUBR1 Ab. No. 2: BUBR1Bd (disponível a partir BD Transduction Laboratories, número de referência 612502) origem: rato, monoclonal, diluição 1:5000, condições de tampão: 3% de BSA em PBS/0,1% de Tween
Alfa-tubulina: (disponível a partir de Sigma, número de referência T5168) origem: rato, monoclonal, diluição 1:10000, condições de tampão: 5% de leite ou 3% de BSA em PBS/0,1% de Tween
Actina: (disponível a partir de Chemicon, número de referência MAB1501) origem: rato, monoclonal, diluição 1:5000, condições de tampão: 5% de leite ou 3% de BSA em PBS/0,1% de Tween
Os anticorpos secundários utilizados para immunoblotting foram peroxidase conjugada com anti-coelho de cabra ou anti-rato de cabra (disponível a partir de Jackson ImmunoResearch Laboratories INC: número de referência 111-035-144 JIR e 115-035-146 JIR), diluição a 1:5000, as condições de tampão: 0,5% de leite em PBS/0,1% de Tween. As bandas marcadas foram reveladas utilizando um Sistema de Imagiologia de Alta Performance Raytest Stella 3200.
Imunohistoquímica A fixação de xenoenxertos de tumores derivados de pacientes (mantidos em ratinhos sem pelo) foi realizada em formol neutro-tamponado a 10% contendo 4% de formaldeído durante 20 - 28 horas à temperatura ambiente. Os espécimes fixos foram mantidos numa solução de etanol a 70% por um período máximo de uma semana anteriormente à desidratação e embebimento em parafina de acordo com um procedimento padrão, utilizando as condições listadas abaixo:
Seções de parafina de aproximadamente 2 ym foram cortadas e processadas utilizando o equipamento de imunomarcação automático Benchmark XT® (Roche) executando as etapas de processamento padrão. A visualização da marcação do anticorpo especifico foi realizada com DAB (3,3- diaminobenzidina) como substrato cromogénico a uma concentração de 5 mg/mL. 0 seguinte anticorpo primário e condições de processamento foram usadas para a marcação:
Exemplos detalhados
Exemplo 1: Um Fenótipo Mitótico Distinto Induzido pelos compostos da fórmula geral I
Tratamento com o composto A (BAL27862) ou com composto B ou composto C, induziu um fenótipo de microtúbulos distinto e altamente reprodutível em todas as linhas celulares tumorais testadas (apresentado para o composto A em células A54 9, HeLa e SKBR3 na Figura 1 e para o composto B e composto C em células A54 9 na Figura 2) . Em células em divisão ocorreu uma fragmentação aparente do fuso mitótico, resultando na formação de estruturas semelhantes a pontos (Figura 1) . Este fenótipo foi mostrado como sendo distinto daquele observado com agentes convencionais que se direcionam a microtúbulos, tais como o estabilizador de microtúbulos paclitaxel e os desestabilizadores de microtúbulos vimblastina e colchicina (Figura 3) e nocodazolo (Figura 4).
Exemplo 2: BAL27862 Supera Fenótipo de Microtúbulos Induzido por Fármacos Convencionais que se Direcionam a Microtúbulos numa Forma Dominante A fim de mostrar a singularidade da sua atividade em microtúbulos, BAL27862 foi testado em combinação com vimblastina, colchicina e paclitaxel (Figura 5) e nocodazolo (Figura 6) utilizando células A549. 0 tratamento somente com vimblastina, colchicina, paclitaxel ou nocodazolo, induziu os fenótipos de microtúbulos mitóticos característicos destes agentes. No entanto, o tratamento em combinação com BAL27862 durante 4 horas resultou na disrupção das estruturas de microtúbulos; criando um fenótipo consistente com o tratamento com apenas BAL27862, apesar da presença continuada de vimblastina, colchicina, paclitaxel ou nocodazolo. Em contraste, tratando inicialmente com BAL27862 e subsequentemente durante 4 horas em combinação com vimblastina, colchicina, paclitaxel ou nocodazolo, não teve nenhum impacto sobre o fenótipo de microtúbulos observado, o qual era consistente com o tratamento com BAL27862.
Estes dados demonstram que os compostos da fórmula I afetam consistentemente a bioloqia dos microtúbulos, mas numa forma diferente àquela referente a agentes convencionais que se direcionam a microtúbulos.
Exemplos Detalhados de acordo com a invenção
Exemplo 3: Subregulação da Expressão de BUBR1 mediada por siRNA Suprime o Efeito Antiproliferativo e Morte de Células Tumorais Induzido pelo tratamento com BAL27862
Através de análise por immunoblot (utilizando ambos BUBR1 Ab. No. 1 e 2) a subregulação da expressão de BUBR1 usando uma pool de quatro siRNAs BUBR1, mostrou ser muito eficiente em ambas as linhas celulares de cancro do colo do útero HeLa e NSCLC H460 (Figura 7).
Surpreendentemente, a análise dos efeitos do tratamento como uma pool de siRNA BUBR1 no número de células HeLa e a fração das células HeLa com um fenótipo normal na presença de BAL27862, indicou que BUBR1 foi necessário para efeitos ideais (Figura 8) . Uma análise adicional dos efeitos da reduzida expressão de BUBR1 na proliferação e viabilidade de células HeLa usando o ensaio YO-PRO, indicou que, embora a perda de expressão de BUBR1 por si só tenha causado uma ligeira redução na taxa de proliferação, o efeito antiproliferativo de BAL27862 foi drasticamente reduzido (Figura 9, painel superior). Ainda, não houve nenhum aumento observado na morte de células tumorais, em comparação com um número de controlos tratados com BAL27862 (Figura 9, painel inferior).
Este efeito foi mostrado como sendo não especifico da linha celular ou tipo tumor, assim como a mesma observação foi feita após tratamento de células H460 (Figura 10) e de cancro da mama MCF7 (Figura 11) . Ainda, usando um método alternativo para analisar a proliferação celular (ensaio de Violeta de Cristal), os mesmos efeitos foram novamente observados em HeLa, bem como em células de cancro pancreático (Panei) e cancro do cólon (HCT116) (Figura 12). A fim de controlar a especificidade da pool de siRNA BUBR1 utilizada nas experiências apresentadas nas Fig. 7 - 12, também foram avaliados os siRNAs individuais contidos dentro da pool. O tratamento com todos os siRNAs individuais diminuiu o efeito da BAL27862 na proliferação celular (avaliada pelo ensaio de Violeta de Cristal)(Figura 13A). De forma importante, o grau de redução correlacionou-se com a eficiência da subregulação da proteina BUBR1 causada por cada siRNA individual (comparar Figura 13A com 13B) .
Exemplo 4: A Subregulação da Expressão de BUBR1 é Observada em Linhas Tumorais Selecionadas quanto à Resistência a BAL27862 A seleção in vitro quanto à resistência a BAL27862 resultou na geração de 3 linhas de células tumorais relativamente resistentes, com os seguintes fatores de resistência versus linhas parentais (com base nas determinações de IC50 usando o ensaio de Violeta de Cristal): A549 (3,0 vezes); SKOV3 resistente 1 (7,6 vezes), SKOV3 resistente 2 (11,6 vezes); H460 (5,3 vezes) (Tabela 1) .
Tabela 1
Em geral, estas células resistentes a BAL27862 exibiram um nível diferente de resposta a outros agentes desestabilizadores de microtúbulos, tais como a colchicina, nocodazolo e vimblastina, em comparação com BAL27862; e foi observado em todas as linhas de facto um aumento da sensibilidade ao estabilizador de microtúbulos paclitaxel (Tabela 1). A extração e análise por immunoblot destas linhas (com BUBR1 Ab. No. 2, monoclonal, rato) indicaram expressão reduzida de proteína BUBR1 em comparação com a linha parental (Figura 14). Isto foi mantido ao longo do desenvolvimento de resistência em células SK0V3 (Figura 15) . Estes dados demonstram a associação da redução dos níveis de expressão de BUBR1 com a resistência adquirida a BAL278 62.
Exemplo 5: Associação dos níveis baixos de expressão de BUBR1 com células tumorais resistentes ao tratamento com BAL27862 derivadas de pacientes
Com base nos ensaios de crescimento em colónias, utilizando células tumorais derivadas a partir de tumores mantidos como xenoenxertos em ratinhos derivados de pacientes, foram identificadas células tumorais sensíveis ou relativamente resistentes a BAL27862 a partir de cancro gástrico e do pulmão (ver Tabela 2). As concentrações às quais foi observado 70% de inibição de crescimento versus controlos (IC70), são apresentadas na Tabela 2. Nesta tabela, as células tumorais sensíveis a BAL27862 possuem valores de IC70 no intervalo inferior a nanomolar, enquanto as células tumorais resistentes a BAL27862 são definidas por valores de IC70 > 500 nanomolar. Os dados de paclitaxel e vimblastina, utilizando o mesmo ensaio ex vivo, também estavam disponíveis para todos modelos tumorais. Todos foram resistentes ao tratamento com paclitaxel, enquanto todos os tumores foram sensíveis ao tratamento com vimblastina.
Tabela 2
A análise por imunohistoquímica foi realizada para medir a expressão de proteína BUBR1 em células tumorais nos mesmos tumores mantidos como xenoenxertos. A análise dos níveis tumorais globais de BUBR1 indicou que os níveis de BUBRl variam drasticamente entre os diferentes tumores (Figura 16).
Com base no ensaio de crescimento em colónia e os mesmo critérios de IC70, não houve nenhuma associação entre a resistência ao paclitaxel ou à vinblastina e os níveis baixos de expressão de BUBRl. Isto é evidente dado que, para o tipo de tumor gástrico, ambos os modelos eram resistentes ao paclitaxel e ainda para GXF 97 os níveis de BUBR1 eram muito inferiores face a GXF 251. A mesma falta de associação foi verdade para o vinca alcaloide, vimblastina no modelo gástrico, dado que ambos tumores eram sensíveis à vimblastina. Esta falta de associação foi repetida nos modelos de cancro do pulmão. Assim, os níveis de BUBR1 foram demonstrados como sendo inadequados como um biomarcador confiável para a resistência aos agentes convencionais que se direcionam a microtúbulos paclitaxel e vimblastina, em modelos de tumores derivados a partir de pacientes.
Surpreendentemente, em contraste, quando os dados de resistência a BAL27862, como definido pelo ensaio de crescimento em colónia, são comparados com o nível de BUBR1, a expressão de BUBR1 foi demonstrada como sendo inferior somente em tumores resistentes e não em tumores sensíveis derivados do mesmo histotipo tumoral (comparar Figura 16 com Tabela 2) . Níveis baixos de BUBR1 foram, portanto, consistentemente indicativos de resistência a BAL27862. Assim, os níveis de BUBR1 foram demonstrados como sendo um biomarcador da resistência ao composto BAL27862.
Exemplo 6: RNA BUBR1 versus níveis de expressão de proteína A fim de mostrar que os níveis de expressão de RNA BUBR1 refletem níveis de expressão de proteína, e, portanto, que os níveis de expressão de RNA podem ser usados na previsão de resistência a BAL27862, os níveis de expressão foram medidos quer aos níveis de RNA e de proteína como se segue. Extratos proteicos de toda a célula foram preparados a partir de linhas de células HeLa e H460 e analisados por immunoblot para a expressão de proteína BUBR1 (Figura 17B). Amostras de RNA foram preparadas a partir da mesma passagem celular, e RT-PCR quantitativa foi realizada (Figura 17A) .
Comparação dos dados de immunoblot (Figura 17B) e os dados de RT-PCR (Figura 17A), indicam que houve uma boa correlação entre os níveis de expressão de proteína e de RNA para BUBR1 nestas linhas.
Lista de abreviaturas A549 linha celular de cancro do pulmão de células não pequenas humano BCA ácido bicinconínico
Bcl-2 proteína 2 de linfoma de células B BRCA1 proteína de susceptibilidade ao tipo 1 do cancro da mama
BrdU bromodeoxiuridina BSA albumina de soro bovino CCD dispositivo de carga acoplada cDNA ácido desoxirribonucleico complementar CA-125 antigénio 125 oncológico CREST síndrome de esclerodermia limitada DAB 3,3-diaminobenzidina DMSO dimetilsulfóxido DMEM meio essencial modificado Dulbecos DNA ácido desoxirribonucleico dUTP 2'-desoxiuridina-5'-trifosfato EDTA/EGTA Ácido etilenodiamino tetraacético/ etilenoglicol-bis(β-aminoetil)-N,N,N’,N'-tetraacetato ELISA ensaio de imunoabsorção enzimática
ErbB-2 recetor do fator de crescimento epidérmico 2 humano
EtOH álcool etílico FACS separação/rastreio de células ativadas por fluorescência FCS/FBS soro de bovino fetal / bezerro fetal G2/M transição de G2 para a fase mitótica no ciclo celular GXF 251 cancro gástrico derivado de paciente GXF 97 cancro gástrico derivado de paciente HCT116 linha celular de carcinoma colorretal humano
HeLa linha celular de células cancerígenas escamosas humanas HEPES ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1- etanossulfónico
Hoe33342 trihidrocloreto de 2'-(4'-etoxifenil)-5-(4- metilpiperazina-l-il)-2,5'-bis-lH-benzimidazolo trihidratado H460 linha celular de cancro do pulmão de células
não pequenas humano IgA imunoglobulina A
IgG imunoglobulina G IHC Imunohistoquímica LXFA 629 células de carcinoma de pulmão derivado de paciente LXFA 529 células de carcinoma de pulmão derivado de paciente MALDI espectrometria de massa por ionização/dessorção a laser assistida por matriz MALDI-TOF espectrometria de massa por ionização/dessorção a laser assistida por matriz com tempo de vôo MCF-7 linha celular de carcinoma da mama humano mRNA ácido ribonucleico mensageiro MTS 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3- carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazólio
NaCl Cloreto de sódio
Nap Fluoreto de sódio NCBI Centro Nacional para Informação
Biotecnológica NSCLC cancro do pulmão de células não pequenas NP40 Nonidet P40 PBS Solução tampão salina de fosfato PCR reação em cadeia da polimerase P-gp P-glicoproteina PMSF Fluoreto de fenilmetilsulfonil PSA antigénio prostático especifico PVDF fluoreto de polivinilideno RANO avaliação da resposta para gliomas de elevada classificação RECIST critérios de avaliação da resposta em tumores sólidos READS amplificação da enzima de restrição de cDNAs digeridos RPMI-1640 meio de cultura celular utilizado para cultivo de células e linhas celulares eucarióticas transformadas e não transformadas RT-PCR reação em cadeia da polimerase em tempo real SAGE análise expressão génica em série SDS dodecil sulfato de sódio SELDI espectroscopia de massa por ionização e dessorção a laser melhorada por superfície SELDI-TOF espectroscopia de massa por ionização e dessorção a laser melhorada por superfície com tempo de vôo SEQ. ID No. número de identificação de sequência siRNA pequeno fragmento inibitório do ácido ribonucleico SKBR3 linhagem celular de carcinoma mamário humano SK0V3 linhagem celular de carcinoma ovariano humano TUNEL marcação das extremidades cortadas com transferase terminal de desoxinucleotideos
dUTP TX-100 Triton-Xl0 0 YO-PRO cianina monomérica, fluorescente, marcador de ácido nucleico

Claims (22)

REIVINDICAÇÕES
1. Utilização ex vivo de BUBR1 como um biomarcador para prever a resposta a um composto, em que o composto é um composto da fórmula geral I (I) em que
R representa fenil, tienil ou piridinil em que fenil é opcionalmente substituído por um ou dois substituintes independentemente selecionados a partir de alquil, haloalquil inferior, hidroxialquil inferior, alcoxi inferior alquil inferior, aciloxialquil inferior, fenil, hidroxi, alcoxi inferior, hidroxialcoxi inferior, alcoxi inferior alcoxi inferior, fenilalcoxi inferior, alquilcarboniloxi inferior, amino, monoalquilamino, dialquilamino, alcoxicarbonilamino inferior, alquilcarbonilamino inferior, amino substituído em que dois substituintes no nitrogénio formam em conjunto com o nitrogénio heterociclico, alquilcarbonil inferior, carboxi, alcoxicarbonil inferior, ciano, halogénio, e nitro; e em que dois substituintes adjacentes são metilenodioxi; e em que piridinil é opcionalmente substituído por alcoxi inferior, amino ou halogénio; X representa um grupo C=Y, em que Y representa oxigénio ou nitrogénio substituído por hidroxi ou alcoxi inferior; R1 representa hidrogénio, alquilcarbonil inferior, hidroxialquil inferior ou cianoalquil inferior; R2, R3 e R6 representam hidrogénio; R4 e R5, independentemente um do outro, representam hidrogénio, alquil inferior ou alcoxi inferior; ou R4 e R5 em conjunto representam metilenodioxi; e compostos derivados farmaceuticamente aceitáveis resultante do mesmo, em que o composto derivado farmaceuticamente aceitável é selecionado a partir do grupo consistindo de um sal, solvato, éster ou amida hidrolisável in vivo do composto referido, sal de tal éster ou amida hidrolisável in vivo, e forma polimórfica do composto referido; ou em que R representa fenil ou piridinil em que fenil é opcionalmente substituído por um ou dois substituintes independentemente selecionados a partir de alquil, haloalquil inferior, hidroxialquil inferior, alcoxi inferior alquil inferior, aciloxialquil inferior, fenil, hidroxi, alcoxi inferior, hidroxialcoxi inferior, alcoxi inferior alcoxi inferior, fenilalcoxi inferior, alquilcarboniloxi inferior, amino, monoalquilamino, dialquilamino, alcoxicarbonilamino inferior, alquilcarbonilamino inferior, amino substituído em que dois substituintes no nitrogénio formam em conjunto com o nitrogénio heterociclico, alquilcarbonil inferior, carboxi, alcoxicarbonil inferior, formil, ciano, halogénio, e nitro; e em que dois substituintes adjacentes são metilenodioxi; X representa oxigénio; R1 representa hidrogénio, alquilcarbonil inferior, hidroxialquil inferior ou cianoalquil inferior; R2, R3 e R6 representam hidrogénio; R4 e R5, independentemente um do outro, representam hidrogénio, alquil inferior ou alcoxi inferior; ou R4 e R5 em conjunto representam metilenodioxi; e compostos derivados farmaceuticamente aceitáveis resultante do mesmo, em que o composto derivado farmaceuticamente aceitável é selecionado a partir do grupo consistindo de um sal, solvato, éster ou amida hidrolisável in vivo do composto referido, sal de tal éster ou amida hidrolisável in vivo, e forma polimórfica do composto referido; e em que o sufixo inferior denota um radical possuindo até e incluindo um máximo de 7, especialmente até e incluindo um máximo de 4, átomos de carbono; e em que a resposta é de uma doença num indivíduo e o biomarcador BUBR1 é medido ex vivo numa amostra ou amostras colhidas a partir do corpo humano ou animal, preferencialmente colhidas a partir do corpo humano.
2. Uso de acordo com a reivindicação 1, em que o composto é um composto da fórmula geral I R representa fenil ou piridinil; em que fenil é opcionalmente substituído por um ou dois substituintes independentemente selecionados a partir de alquil inferior, alcoxi inferior, amino, acetilamino, halogénio e nitro; e em que piridinil é opcionalmente substituído por amino ou halogénio; X representa um grupo C=0; R1 representa hidrogénio ou cianoalquil inferior; R2, R3, R4, R5 e R6 representam hidrogénio; e compostos derivados farmaceuticamente aceitáveis resultante do mesmo como definido na reivindicação 1, e em que o sufixo inferior denota um radical possuindo até e incluindo um máximo de 7, especialmente até e incluindo um máximo de 4, átomos de carbono.
3. Uso de acordo com reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que o composto é representado pela seguinte fórmula
em que R, Y e R1 são definidos como se segue:
ou compostos derivados farmaceuticamente aceitáveis resultantes do mesmo como definido na reivindicação 1.
4. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, em que o composto é
ou compostos derivados farmaceuticamente aceitáveis resultantes do mesmo como definido na reivindicação 1.
5. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, em que o composto derivado farmaceuticamente aceitável é uma amida formada a partir de um grupo amino presente no grupo R do composto da fórmula geral I como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 4 e o grupo carboxílico de glicina, alanina ou lisina.
6. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, em que o composto é
ou um sal farmaceuticamente aceitável resultante do mesmo, preferencialmente um sal hidrocloreto, mais preferencialmente um sal dihidrocloreto resultante do mesmo.
7. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, para prever a resistência de uma doença num indivíduo ao composto referido.
8. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, em que a doença é uma doença neoplásica ou doença autoimune.
9. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, em que a doença é um cancro.
10. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, em que a doença é selecionada a partir do grupo consistindo em cancro da mama, cancro da próstata, cancro colo do útero, cancro do ovário, cancro gástrico, cancro colorretal, cancro pancreático, cancro do fígado, cancro do cérebro, cancro neuroendócrino, cancro do pulmão, cancro renal, malignidades hematológicas, melanoma e sarcomas.
11. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, em que o cancro é selecionado a partir do grupo consistindo em cancro do ovário, cancro da mama, cancro gástrico, cancro pancreático, cancro do cólon, cancro do pulmão e melanoma.
12. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, em que a doença é selecionada a partir do grupo consistindo em cancro do pulmão e cancro gástrico.
13. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, em que um nivel baixo de BUBR1 na amostra do indivíduo em relação a um valor de referência ou a um conjunto de valores de referência prevê resistência.
14. Uso de acordo com a reivindicação 13, em que níveis baixos de BUBR1 numa amostra ou amostras i) em relação a um valor de referência ou a um conjunto de valores de referência a partir de indivíduos com o mesmo histotipo tumoral; ou ii) retirados após iniciação do tratamento e comparados a uma amostra ou amostras retiradas a partir do mesmo indivíduo antes da iniciação do tratamento; ou iii) em relação a um valor de referência ou a um conjunto de valores de referência a partir de células, tecido ou fluido corporal normais; são preditivos de resistência.
15. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 14, em que o biomarcador é utilizado para selecionar indivíduos sofrendo ou predispostos a sofrer a partir de uma doença, preferencialmente cancro, para tratamento com um composto da fórmula geral I ou compostos derivados farmaceuticamente aceitáveis resultantes do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 6.
16. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 15, em que a amostra é derivada a partir de tecido tumoral, tecido normal, linhas celulares ou células tumorais circulantes, preferencialmente em que esta é derivada a partir de tecido tumoral.
17. Um método para prever num indivíduo sofrendo de um cancro a resposta desse cancro a um composto da fórmula geral I ou a um composto derivado farmaceuticamente aceitável resultante do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, compreendendo as etapas de: a) medir ex vivo um nível de BUBR1 numa amostra pré-obtida a partir de tecido tumoral ou células tumorais circulantes do indivíduo, para obter um valor ou valores que representem este nível; e b) comparar o valor ou valores da etapa a) a um valor de referência ou a um conjunto de valores de referência de indivíduos com o mesmo tipo de cancro, em que um nível baixo de BUBR1 na amostra em relação ao valor de referência ou ao conjunto de valores de referência é preditivo da resistência do cancro do indivíduo ao composto da fórmula (I) , e preferencialmente em que o cancro é um cancro como definido em qualquer uma das reivindicações 10, 11 ou 12.
18. Um composto da fórmula geral I ou um composto derivado farmaceuticamente aceitável resultante do mesmo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, para uso no tratamento de uma doença neoplásica ou doença autoimune num sujeito humano sofrendo de tal doença, caracterizado em que o ser humano tem um nível de BUBR1, medido ex vivo numa amostra do indivíduo humano, que não é inferior a um valor de referência ou a um conjunto de valores de referência, em que um nível de BUBR1 baixo numa amostra obtida do sujeito em relação ao valor de referência ou ao conjunto de valores de referência é preditivo da resistência para o composto da fórmula (I) .
19. O composto da fórmula geral I ou um composto derivado farmaceuticamente aceitável resultante do mesmo de acordo com a reivindicação 18, para uso no tratamento de cancro, preferencialmente um cancro como definido em qualquer uma das reivindicações 10, 11 e 12 .
20. Um kit para prever a resposta a um composto da fórmula geral I ou a um composto derivado farmaceuticamente aceitável resultante do mesmo, como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, compreendendo os reagentes necessários para medir um nivel de BUBR1 numa amostra recolhida a partir de um indivíduo com um cancro, compreendendo um composto da fórmula (I) ou um composto derivado farmaceuticamente aceitável resultante do mesmo, em que o composto derivado farmaceuticamente aceitável é selecionado a partir do grupo consistindo num sal, solvato, éster ou amida hidrolisável in vivo do composto referido, sal de tal éster ou amida hidrolisável in vivo e forma polimórfica do composto referido, e compreendendo ainda um módulo de comparação que compreende um valor de referência ou um conjunto de valores de referência de um nível de BUBR1 retirado a partir de amostras de tecido tumoral ou células tumorais circulantes de indivíduos com um cancro do mesmo histotipo para o qual o nível de BUBR1 é comparado, em que um nível baixo de BUBR1 na amostra obtida a partir do sujeito em relação ao valor de referência ou ao conjunto de valores de referência é preditivo da resistência para o composto da fórmula (I) .
21. O kit de acordo com a reivindicação 20, em que os reagentes compreendem um reagente de captura compreendendo um detetor para BUBR1 e um reagente de deteção, preferencialmente em que o reagente de captura é um anticorpo.
22. 0 kit de acordo com a reivindicação 20 ou reivindicação 21, em que o composto é um composto da seguinte fórmula
ou sal farmaceuticamente aceitável resultante do mesmo, em particular o sal dihidrocloreto resultante do mesmo.
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