PT2663564E - Composto de imidazo[4,5-c]quinolin-2-ona e a sua utilização como inibidor dual de quinase pi3/mtor - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "COMPOSTO DE IMIDAZO[4,5—C]QUINOLIN—2—ONA E A SUA UTILIZAÇÃO COMO INIBIDOR DUAL DE QUINASE PI3/MTOR"

As fosfoinositídeo 3-quinases (Pl3Ks) são uma família de quinases de lípidos que propagam as cascatas de sinalização intracelular que regulam uma larga variedade de processos celulares. Por exemplo, a activação de PI3K inicia uma cascata de transdução do sinal que promove o crescimento, sobrevivência e o metabolismo das células de cancro. 0 objectivo mamífero de rapamicina (mTOR) é um nódulo de sinalização chave que coordena o progresso do ciclo celular e crescimento celular em resposta a condições genéticas, epigenéticas e ambientais. As trajectórias envolvidas na sinalização do mTOR são desreguladas em tecidos humanos pré-cancerosos. Em vista dos papéis que a PI3K e mTOR mantêm nas trajectórias do ciclo celular, a inibição de tanto a PI3K como de mTOR pode ser útil no tratamento de determinadas doenças humanas, tais como cancro.

Os inibidores de PI3K e inibidores duplos Pl3K/mT0R são conhecidos na arte. 0 documento WO 2010/038165 descreve certos compostos de imidazo[1,5]naftiridina reconhecidos como moduladores ou inibidores da enzima de Pl3-Ka e/ou inibidores duais de Pl3-Ka/mTOR. Os documentos WO 2010/139731 e WO 2010/139747 descrevem certos compostos de imidazoquinolina reconhecidos pelo seu uso no tratamento de doenças dependentes de quinase de lípido ou proteína, particularmente doenças dependentes de PI3K.

Continua a haver uma necessidade para proporcionar inibidores de Pl3K/mTOR alternativos, particularmente inibidores potentes de Pl3K/mTOR com propriedades físicas benéficas, tais como solubilidade melhorada e/ou propriedades clínicas desejáveis, tais como a melhoria na potência in vivo e/ou desempenho farmacocinético, os quais podem ser usados no tratamento de desordens proliferativas celulares tais como o cancro. A presente invenção fornece potentes inibidores Pl3K/mTOR. Mais particularmente, a presente invenção fornece potentes inibidores Pl3K/mTOR com propriedades físicas benéficas e/ou desejáveis que são úteis como agentes anticancerígenos. A presente invenção fornece um composto 8— [5— (1 — hidroxi-l-metiletil)piridin-3-il]-1-[ (2S)-2-metoxipropil]-3-metil-l,3-dihidro-2H-imidazo[4,5-c]quinolin-2-ona, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.

Numa incorporação particular, a presente invenção fornece o composto 8-[5-(1-hidroxi-l-metiletil)piridin-3-il]-1- [ (2S)-2-metoxipropil]-3-metil-l,3-dihidro-2H-imidazo[4,5-c]quinolin-2-ona.

Numa outra incorporação, 8-[5-(1-hidroxi-l-metiletil)piridin-3-il]-1-[(2 S)-2-metoxipropil]-3-metil- 1.3- dihidro-2H-imidazo[4,5-c]quinolin-2-ona na forma cristalina. A presente invenção também fornece 8— [5— (1 — hidroxi-l-metiletil)piridin-3-il] -1-[ (2S)-2-metoxipropil]-3-metil-l,3-dihidro-2H-imidazo[4,5-c]quinolin-2-ona, na forma cristalina caracterizada por um padrão de difracção em pó de raios-X que tem picos caracteristicos em 2Θ10.2, ocorrendo a 8,57 e um ou mais de 9,06, 15,93, 18,29, e 18,87. A presente invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo 8-[5-(1-hidroxi-l- metiletil)piridin-3-il]-1- [ (2S) -2-metoxipropil]-3-metil- 1.3- dihidro-2H-imidazo[4,5-c]quinolin-2-ona, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, e um veiculo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. A presente invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo 8-[5-(1-hidroxi-l- metiletil)piridin-3-il]-1-[ (2 S)-2-metoxipropil]-3-metil- 1.3- dihidro-2H-imidazo[4,5-c]quinolin-2-ona, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, compreendendo adicionalmente um ou mais ingredientes terapêuticos. A presente invenção fornece um método para o tratamento do cancro, incluindo a administração a um paciente com necessidade do mesmo uma quantidade eficaz de 8—[5— (1 — hidroxi-l-metiletil)piridin-3-il]-1-[ (2 S)-2-metoxipropil]-3-metil-l,3-dihidro-2H-imidazo[4,5-c]quinolin-2-ona, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. A presente invenção fornece o uso de 8-[5-(1-hidroxi-l-metiletil)piridin-3-il]-1-[ (2S)-2-metoxipropil]-3-metil-l,3-dihidro-2H-imidazo[4,5-c]quinolin-2-ona, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para o fabrico de um medicamento para o tratamento de cancro. A presente invenção fornece 8-[5-(1-hidroxi-l-metiletil)piridin-3-il]-1-[ (2 S)-2-metoxipropil]-3-metil- 1.3- dihidro-2H-imidazo[4,5-c]quinolin-2-ona, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para o uso em terapia. A presente invenção fornece 8-[5-(1-hidroxi-l-metiletil)piridin-3-il]-1-[ (2 S)-2-metoxipropil]-3-metil- 1.3- dihidro-2H-imidazo[4,5-c]quinolin-2-ona, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, para o uso no tratamento do cancro.

Além disso, a presente invenção fornece incorporações preferidas dos métodos e usos aqui descritos, nos quais o cancro é seleccionado do grupo que consiste em cancro da bexiga, cancro do cólon, cancro gástrico, cancro da cabeça e pescoço, NSCLC, cancro da mama, melanoma, cancro do ovário, cancro do pâncreas, cancro da próstata, glioblastoma, cancro do pulmão, cancro renal, sarcoma, cancro de tecido linfóide e hematopoiético, cancro do sistema nervoso central, cancro cervical, cancro do endométrio, cancro do fígado, cancro da pele, cancro do estômago, cancro da tiróide, cancro do tracto aerodigestivo superior e cancro urinário.

Como usado acima, e ao longo da descrição da invenção, os termos seguintes, a menos que de outra forma indicado, devem ser entendidos com os seguintes significados: "Sal farmaceuticamente aceitável" ou "sais farmaceuticamente aceitáveis" refere-se a sais relativamente não-tóxicos, inorgânicos e orgânicos, de compostos da presente invenção.

Os termos "tratamento", "tratar", "tratando", e semelhantes, destinam-se a incluir a redução ou reversão do progresso da doença. Estes termos também incluem alivar, melhorar, atenuar, eliminar ou reduzir um ou mais sintomas de um distúrbio ou condição, mesmo que o distúrbio ou condição não seja realmente eliminado e mesmo se a progressão do distúrbio ou condição não for ela mesma reduzida ou invertida. "Quantidade terapeuticamente eficaz" ou "quantidade eficaz" significa que a quantidade de um composto, ou de um sal farmaceuticamente aceitável no mesmo, da presente invenção ou de uma composição farmacêutica contendo um composto ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, da presente invenção que provocará a resposta biológica ou médica ou o efeito terapêutico desejado num tecido, sistema, animal, mamífero ou humano que esteja a ser procurado pelo investigador, veterinário, médico ou outro especialista.

Os compostos da presente invenção são capazes de reacção, por exemplo, com um número de ácidos inorgânicos e orgânicos para formar sais farmaceuticamente aceitáveis. Tais sais farmaceuticamente aceitáveis e metodologia comum para a sua preparação são bem conhecidos na arte. Ver, por exemplo, P. Stahl, e outros, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, (VCHA/Wiley-VCH, 2002); S. M. Berge, e outros, "Pharmaceutical Salts", Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, No. 1 de Janeiro de 1977 .

Os compostos da presente invenção são preferencialmente formulados na forma de composições farmacêuticas utilizando um ou mais veículos, diluentes ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis e administrados por uma variedade de vias. De preferência, tais composições são para administração oral, subcutânea ou intravenosa. Tais composições farmacêuticas e processos para a sua preparação são bem conhecidos na arte. Ver, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (A. Gennaro, e outros, eds., 21a ed., Mack Publishing Co., 2005) . A quantidade de composto da presente invenção de facto administrada será determinada por um médico nas circunstâncias relevantes, incluindo a condição a ser tratada, a via de administração escolhida, o composto real da presente invenção administrado, a idade, peso, e resposta do paciente individual, e a gravidade dos sintomas do paciente. As dosagens por dia são normalmente dentro da gama de cerca de 1 mg a cerca de 2000 mg. Nalguns casos, os níveis de dosagem abaixo do limite mínimo da gama antes referida podem ser mais que adequados, enquanto que noutros casos, podem ser empregues doses ainda maiores.

Os compostos da presente invenção podem ser preparados por uma variedade de procedimentos conhecidos na arte, bem como os descritos nas Preparações e Exemplos abaixo. Os passos de síntese específicos para cada uma das vias descritas podem ser combinados em diferentes formas de preparar os compostos da presente invenção.

Os reagentes e materiais de partida estão geralmente prontamente disponíveis para um perito de habilidade comum na arte. Outros podem ser preparados por técnicas correntes de química orgânica e heterocíclica, técnicas que são análogas às sínteses de compostos conhecidos estruturalmente semelhantes, e os procedimentos descritos nas Preparações e Exemplos que se seguem, incluindo quaisquer procedimentos novos. As Preparações e Exemplos seguintes são fornecidos para ilustrar a invenção em maior detalhe e representam sínteses típicas dos compostos. Os nomes dos compostos da presente invenção são geralmente fornecidos por SymyxDraw 3.2.

Tal como aqui utilizado, os seguintes termos têm os significados indicados: "ATP" refere-se trifosfato de adenosina; "AUC" refere-se a área sob a curva; "CNS" refere-se ao sistema nervoso central; "DMEM" refere-se a meio de Eagle modificado por Dulbecco; "DMSO" refere-se a dimetil-sulfóxido; "DTT" refere-se a ditiotreitol; "4E-BP1" refere-se a uma proteína de ligação 4E; "FBS" refere-se soro fetal de bovino; "EDTA" refere-se a ácido etilenodiaminotetracético; "EGTA" refere-se a etilenglicol-bis (â-amino etiléter) - ácido N, N, Ν',Ν'-tetraacético; "GFP" refere-se a proteína fluorescente verde; "GST" refere-se a glutationa-S-transferase; "HEC" refere-se a hidroxietilcelulose; "HEPES" refere-se a ácido N-2- hidroxietilpiperazina-N'-2-etanossulfónico; "HPLC" refere-se a cromatografia líquida de alta pressão; "IC50" refere-se a metade da concentração inibidora máxima; "IMDM" refere-se a meio Dulbecco modificado de Iscove; "MEM" refere-se a meio essencial mínimo; "MS" refere-se a espectroscopia de massa; "NMR" refere-se a ressonância magnética nuclear; "NSCLC" refere-se ao cancro de pulmão de células não pequenas; "PBS" refere-se a solução salina tamponada com fosfato; "PGK" refere-se a fosfoglicerato-quinase; "PIP2" refere-se a fosfatidilinositol (4,5) bifosfato; "PO" refere-se a por via oral; "POPS" refere-se a palmitoil-oleoil fosfatidilserina; "PPI" refere-se a um inibidor da bomba de protões; "RPMI" refere-se a Roswell Park Memorial Institute; "RT" refere-se a temperatura ambiente; "TFA" refere-se ao ácido trifluoroacético; "TMED50" refere-se a dose mínima eficaz limiar; "TR-FRET" refere-se a transferência de energia fluorescente resolvida em tempo; "Tris" refere-se tris (hidroximetil)aminometano; "Triton-X" refere-se a 4-(1,1,3,3-tetrametilbutil)fenil-polietilenglicol t- octilfenoxipolietoxietanol polietilenglicol terc-octilfenil éter; e "Tween-20" refere-se a polissorbato 20; "XRD" refere-se a difracção em pó de Raios-X.

Preparação 1

Hidrocloreto de (2S)-2-metoxipropan-l-amina

Arrefecer uma solução de terc-butilo [ (2S)—2 — hidroxipropil]carbamato (870 g, 4,96 mol) em tetrahidrofurano (10 L) a 5°C. Adicionar hidreto de sódio (60% de dispersão, 248 g, 6,21 mol, 1,25 eq.) em porções, ao longo de 8 minutos. Agitar a reacção a 5°C durante 30 minutos. Adicionar iodeto de metilo (387 mL, 6,21 mol, 1,25 eq.) gota a gota, ao longo de 5 minutos e deixar a reacção prosseguir a 5-10°C durante 45 minutos. Extinguir a reacção com água (1 L) e extrair com acetato de etilo (4 L). Obter a camada orgânica e concentrá-la in vacuo para obter um resíduo. Co-evaporar o resíduo com tolueno (2 x 1 L) , diluir com diclorometano (2 L) e filtrar. Lavar o sólido restante com diclorometano adicional (500 mL). Concentrar o filtrado liquido de diclorometano combinado in vacuo para se obter um intermediário em bruto de terc-butilo N-[(2S)-2-metoxipropil]carbamato (880 g, 94%).

Suspender o intermediário bruto de terc-butilo N-[(2 S)-2-metoxipropil] carbamato (806 g, 4,26 mmol) em diclorometano (3,22 L) e adicionar HC1 4M em dioxano (2,66 L) gota a gota a 15°C durante 30 minutos. Agitar a mistura à temperatura ambiente durante 2 horas. Filtrar e lavar o residuo sólido com diclorometano adicional (2 x 250 mL) e remover os voláteis in vacuo para fornecer um precipitado sólido. Adicionar éter metil-terc-butilico (2 L) ao sólido e filtrar; lavar o sólido com éter metil-terc-butilico (2 x 500 mL) adicional, secar e lavar adicionalmente o sólido com acetona (4 χ 500 mL) para obter um sólido branco como o composto do titulo (171 g, 32%). 1H NMR (300,13 MHz, DMSO): 8,11 (s, 3H) , 3, 62-3,55 (m, 1H) , 3,26 (s, 3H) , 2,87 (dd, J=3,6, 13,2 Hz, 1H), 2,68 (dd, J=8,5, 13,2 Hz, 1H), 1,10 (d, J=6,3 Hz, 3H).

Preparação 2 6-bromo-4-cloro-quinolina-3-carboxilato de etilo

Suspender éster etílico do ácido 6-bromo-4-hidroxiquinolina-3-carboxílico (11 g, 37 mmol) em dimetilformamida anidra (148,6 mL) sob uma atmosfera de azoto. Juntar cloreto de fosforilo (20,7 mL, 222 mmol, 6 eq.) com uma seringa ao longo de 5 minutos e agitar vigorosamente à temperatura ambiente durante 3 horas. Extinguir a reacção vertendo a mistura em água gelada (1,5 L) e continuar a agitar até todo o gelo derreter. Obter o sólido formado por filtração, lavar com água e permitir a secagem completa, para se obter o composto do título (11,4 g, 94%). MS (ESI) m/z (M+H)+ 314,0, 316,0.

Em alternativa, preparar o éster etílico do ácido 6-bromo-4-hidroxiquinolina-3-carboxílico como segue e usar na preparação do composto do título. Dissolver 2-(((4-bromofenil)amino)metileno)malonato dietílico (25,6 g, 74,8 mmol) em 2-metiltetrahidrofurano (107 mL) e transferir para uma bomba. A bomba alimenta, em seguida, entre 19 e 21 ml desta solução para um reactor de 25 mL entre 240°C e 260°C, sob entre 575 a 700 psi de azoto para permanecer acima da pressão de vapor da solução reagente. Após entre 60 e 180 minutos a esta temperatura, a suspensão resultante sai do reactor através de uma válvula, através de um tubo de imersão para perto do fundo do reactor para uma zona de arrefecimento e de despressurização de 10 mL. Finalmente, uma segunda válvula em série envia a suspensão para um filtro de pressão em linha. Esta sequência para esvaziar o reactor é repetida mais 2 vezes antes de reencher o reactor, tal como descrito acima, para assegurar que a suspensão residual é removida para um volume mínimo e para proporcionar a pressão de azoto para o filtro de placa única. O ciclo automatizado continua repetidamente e os sólidos acumulam-se sobre o mesmo filtro de placa única ao longo do tempo. Se a campanha de produção for feita por vários dias, pelo menos dois filtros em paralelo poderiam ser usados, de modo que o filtro de linha apagada pode ser lavado e os sólidos removidos sem parar o reactor de fluxo intermitente. Após realizar 5 ciclos adicionais desta forma, 2-metiltetrahidrofurano (20 mL) é enviado para o reactor e transferido para o filtro. Este modo de operação pode ser chamado um lote automatizado de fluxo intermitente semi-contínuo ou de sequência. De qualquer maneira, os aspectos do presente modo de funcionamento que o tornam semelhante à reacção continua são que a temperatura e a pressão do reactor não se alteram com o tempo, mas permanecem sempre nas condições de reacção, os tempos de aquecimento e arrefecimento são muito rápidos para os reagentes que fluem para dentro do reactor e o produto que flui para fora do reactor, os tempos de aquecimento e arrefecimento são escaláveis, e tempo de residência dos reagentes e produtos no recipiente de reacção são os mesmos em todas as escalas, controlando os fluxos para dentro e para fora e a capacidade de aquecer/arrefecer externa do reactor. Após a secagem, o éster etílico do ácido 6-bromo-4-hidroxiquinolina-3-carboxílico é recolhido (4,66 g, 21%). Os filtrados ricos em 2- ( ( (4- bromofenil)amino)metileno)malonato dietilico resultantes são concentrados para remover o etanol obtendo-se 7,8 g e reconstituídos em 2-metiltetrahidrofurano. Uma porção deste material (4,8 g) é resubmetida às condições de reacção e éster etílico do ácido 6-bromo-4-hidroxiquinolina-3-carboxílico adicional (0,56 g) é recolhido para um rendimento global de 25%. 1H-NMR: (399,84 MHz, TFA-d) , δ (ppm): 1,52 (3H, t, J=7, 0 4 Hz), 4,67 (2H, q, J=7,03 Hz), 8,03 (1H, d, J= 8,7 9 Hz), 8,28 (1H, d, J=8,79 Hz), 8,80 (1H, s), 9,32 (1H, s); 13C NMR (100,54 MHz, TFA-d), δ (ppm): 11, 9, 64,7, 105,3, 121,0, 121,2, 124, 9, 126, 9, 137, 9, 141, 1, 145, 0, 167,2, 172,4 .

Preparação 3 2- (5-Bromo-3-pirid.il) propan-2-ol

Método 1

Adicionar uma solução de 5-bromopiridina-3-carboxilato de etilo (22,5 g, 98 mmol) em tetrahidrofurano (350 m L) a uma solução de brometo de metilmagnésio 3M em éter dietilico (98 mL, 293 mmol, 3 eq.) com temperatura interna inferior a 30°C. Após a conclusão da reacção, arrefecer a mistura num banho de gelo e extinguir com cloreto de amónio aquoso saturado e manter a agitação até que a maioria dos sólidos se dissolvam. Adicionar água (500 mL) e extrair com acetato de etilo (3 χ 500 mL) . Secar a camada orgânica sobre sulfato de sódio, filtrar e concentrar a camada orgânica até ficar um resíduo. Purificar o resíduo por cromatografia em coluna de gel de sílica, eluindo com um solvente de acetato de etilo:hexano (1:1), para se obter o produto do título como um óleo (19,4 g, 92%). MS(ESI) m/z (M+H) +214,9, 216,9. Método 2

Adicionar uma solução de 5-bromopiridin-3-carboxilato de metilo (173 g, 800 mmol) em tetrahidrofurano (2,6 L) gota a gota a uma solução 3M de brometo de metilmagnésio em éter dietilico (800 mL, 3,0 eq.) durante 30 minutos num banho de arrefecimento com uma temperatura interna abaixo de 18°C. Agitar a mistura à temperatura ambiente durante uma hora, em seguida, arrefecer para 0°C e extinguir com cloreto de amónio aquoso saturado (500 mL) . Adicionar uma solução aquosa saturada de bicarbonato de sódio (1 L) e permitir a separação das camadas. Obter a camada orgânica e concentrar com tolueno (1 L) a água residual azeotrópica para produzir o composto do titulo (168 g, 97%) como um óleo cor de laranja. 1H NMR (300,13 MHz, DMSO): 8,66 (d, J=1, 9 Hz, 1H) , 8,55 (d, J=2,2 Hz, 1H) , 8,06 (t, J=2,2 Hz, 1H), 5,38 (s, 1H), 1,45 (s, 6H).

Preparação 4 2-[5-(4,4,5,5-tetrametil-l,3,2-dioxaborolan-2-il)-3- piridil]propan-2-ol

Purgar com uma mistura de 2-(5-bromo-3-piridil)propan-2-ol (18,5 g, 85,7 mmol), bis (pinacolato)diboro (44 g, 171 mmol, 2 eq.) e acetato de potássio (25,2 g, 257 mmol, 3 eq.) em 1,4-dioxano (428 mL) em azoto completamente. Adicionar cloreto de (1,1'-bis(difenilfosfino)ferroceno)paládio(II) (3,5 g, 4,3 mmol) e evacuar e purgar a reacção duas vezes com azoto. Aquecer a mistura a 90°C durante a noite. Arrefecer e diluir com acetato de etilo (1 L) e aplicar ultra-sons durante 30 minutos. Filtrar através de uma almofada de Celite® e secar o filtrado liquido sobre sulfato de sódio. Após a filtração, concentrar o liquido orgânico e re-dissolver o resíduo em acetato de etilo (1 L) e filtrar outra vez através de uma almofada de Celite®. Concentrar o filtrado e suspender o resíduo em éter dietilico (100 mL) seguido de hexano (700 mL). Aplicar ultra-sons brevemente e filtrar para obter um resíduo sólido para proporcionar o composto do titulo como um sólido bruto (18,5 g) . MS (ESI) m/z (M+H)+ 264,0.

Preparação 5 6-bromo-4-[[(2S)-2-metoxipropil]amino]quinolina-3-carboxilato de etilo

r

Suspender etil-6-bromo-4-cloro-quinolina-3- carboxilato (389 g, 1,24 mol) e hidrocloreto de (2S)-2-metoxipropan-l-amina (171 g, 1,36 mol, 1,1 eg.) em etanol (5,84 L). Adicionar diisopropiletilamina (474 mL) e aguecer a mistura a 50°C durante a noite. Após 16 horas, arrefecer a reacção até à temperatura ambiente e concentrar in vacuo. Adicionar éter metil-terc-butilico (2 L) ao resíduo e agitar durante 20 min. Filtrar o precipitado e lavar com éter metil-terc-butílico (2 x 250 mL) . Concentrar o filtrado in vacuo para se obter o composto do título com um rendimento guase quantitativo. 0 composto será utilizado no próximo passo sem purificação adicional. MS(ESI) m/z (M+H)+ 367,0, 369,0.

Preparação 6 Ácido 6-Bromo-4-[[(2S)-2-metoxipropil]amino]quinolina-3- carboxílico

Adicionar uma solução de hidróxido de sódio (296,7 g, 7,42 mol, 6 eq.) em água (454 ml) a uma solução de 6-bromo-4-[[ (2 S)-2-metoxipropil]amino]quinolina-3-carboxilato de etilo (454 g, 1,24 mol) em tetrahidrofurano (4,54 L) à temperatura ambiente. Aquecer a mistura a 50°C durante a noite. Após 18 horas, arrefecer a reacção a 0°C, adicionar HC1 a 37% aquoso gota a gota durante 30 minutos até pH=6 (aproximadamente 450 ml), com a temperatura abaixo de 23°C. Filtrar o precipitado formado com papel de filtro e lavar com água (2 L), acetona (2 L) e éter metil-terc-butilico (2 L) subsequentemente. Secar o sólido branco para fornecer o composto do titulo (359 g, 86%). MS(ESI) m/z (M+H)+ 338,9, 340,9.

Preparação 7 8-Bromo-l-[(2S)-2-metoxipropil]-3H-imidazo[4,5-c]quinolin- 2-ona

Suspender ácido 6-bromo-4-[[(2 S)-2- metoxipropil]amino]quinolina-3-carboxílico (510 g, 1,5 mol) em dimetilformamida (7,65 L) e adicionar trietilamina (419 ml, 3 mol, 2 eq.) a 70°C. Adicionar azida difenilfosfónica (390 mL, 1,8 eq., 1,2 eq.) gota a gota durante 30 minutos. Aquecer a mistura a 70°C (temperatura interna) durante 1 hora. Arrefecer a 10°C e diluir com água (5 L) . Agitar a mistura durante 1 hora, filtrar o precipitado, lavar com água (2x1 L) e éter metil-terc-butilico (2x1 L) , e em seguida deixar secar para fornecer o composto do titulo como um sólido branco (445 g, 88%). MS (ESI) m/z (M+H)+ 335, 9, 337, 9.

Preparação 8 8-Bromo-l-[(2S)-2-metoxipropil]-3-metil-imidazo[4,5- c]quinolin-2-ona

Método 1

Suspender 8-bromo-l-[ (2 S)-2-metoxipropil]-3H- imidazo[4,5-c]quinolin-2-ona (10 g, 30 mmol) e brometo de tetra-N-butilamónio (3 g, 9,3 mmol) em diclorometano (150 mL) . Adicionar hidróxido de sódio aquoso 2M (75 mL, 150 mmol) à temperatura ambiente. Adicionar iodometano (7,5 mL, 120 mmol) e agitar vigorosamente a mistura durante a noite a 28°C. Permitir que a separação de fases ocorra. Concentrar os orgânicos in vacuo. Lavar o resíduo com acetona (50 mL) para remover o brometo de tetra-N-butilamónio. Filtrar a mistura para fornecer o composto do título como um pó sólido (5 g, 48%). MS(ESI) m/z (M+H)+ 350,0, 352,0. Método 2

Suspender 8-bromo-l-[ (2S)-2-metoxipropil]-3H- imidazo[4,5-c]quinolin-2-ona (285 g, 847,7 mmol) e brometo de tetra-N-butilamónio (82 g, 254 mmol) em diclorometano (2,85 L). Adicionar hidróxido de sódio aquoso 2 M (1,7 mL, 3,4 mmol) à temperatura ambiente. Adicionar sulfato de dimetilo (160,8 mL, 1,7 mol) e agitar a mistura vigorosamente durante 3 horas. Permitir a separação de fases e obter a camada orgânica. Concentrar a camada orgânica in vacuo e submeter a suspensão com água (2,4 L) durante 30 minutos. Filtrar o precipitado sólido formado e lavar com água (2 χ 500 ml), hexano (2 x 500 mL) e secar. O composto do titulo é obtido como um sólido branco (207 g, 70%) . MS (ESI) m/z (M+H)+ 350, 0, 352,0 . Método 3

Suspender 8-bromo-l-[ (2 S)-2-metoxipropil]-3H- imidazo[4,5-c]quinolin-2-ona (50 g, 149 mmol) e brometo de tetra-N-butilamónio (14,4 g, 44,7 mmol) em diclorometano (500 mL). Adicionar uma solução de hidróxido de sódio a 8% (600 mmol). Adicionar iodometano (23,2 g, 163,4 mmol) e agitar à temperatura ambiente durante 22 horas. A fase orgânica é separada e lavada com água (250 mL). Em seguida, a fase orgânica é concentrada e recristalizada a partir de diclorometano, em seguida, é seca abaixo de 65°C para fornecer o composto do titulo (42,7 g, 82%). 1H NMR (CDCI3, 400 MHz) δ 8,70 (s, 1H) , 8,50 (d, 1H, J=2,4 Hz), 7,97 (d, 1H, J=9,2 Hz), 7,65 (d, 1H, J=9,2, 2 Hz), 4,32 (m, 2H), 3,82 (m, 1 H) , 3,79 (s, 3H) , 3,28 (s, 3H) , 1,32 (d, 3H, J=6,4 Hz) .

Preparação 9 5-(4,4,5,5-tetrametil-l,3,2-dioxaborolan-2-il)piridina-3- carboxilato de etilo

Adicionar tris(dibenzilidenoacetona) dipaládio(O) (3,98 g, 4,35 mmol), triciclohexilfosfina (2,44 g, 8,7 mmol) e acetato de potássio (42,65 g, 435 mmol) a uma solução de bis(pinacolato)diboro (35,88 g, 141,3 mmol ) em dimetilformamida (175 mL) . Borbulhar N2 na mistura durante 15 minutos, em seguida aquecer a 80~85°C. Em seguida, adicionar lentamente 5-bromonicotinato de etilo (25,0 g, 108,8 mmol) em dimetilformamida (75 ml) à mistura a 80~85°C, e agitar a mistura formada a 80~85°C durante 4-5 horas. Arrefecer a mistura de reacção a 15-35°C e, em seguida, adicionar éter metil-terc-butilico (250 mL) e água (250 mL). Filtrar a mistura com. Extrair novamente a camada aquosa com éter metil-teuc-butílico (diatomite e separar as camadas orgânica e aquosa 250 mL). Lavar a camada orgânica combinada com salmoura (150 mL) e água (150 mL) . Concentrar a fase orgânica sob vácuo, re-cristalizar o produto em bruto com éter metil-temc-butílico/heptano (1:6), e em seguida secar abaixo de 55°C para dar o composto do titulo como um sólido cinzento (18,67 g, 62%) . 1H NMR (acetona-d6, 400 MHz) δ 1,40- 1,43 (m, 15H) , 4,44 (q, J=7,l Hz, 2H) , 8,57 (t, J=l,9 Hz, 1H), 9,02 (d, J=1,5 Hz, 1H), 9,225 (d, J=2,3 Hz, 1H).

Preparação 10 5-[1-[(2S)-2-metoxipropil]-3-metil-2-oxo-imidazo[4,5-c]quinolin-8-il]piridina-3-carboxilato de etilo

A um balão de três tubuladuras contendo 8-bromo-1-[ (2 S)-2-metoxipropil]-3-metil-imidazo[4,5-c]quinolin-2-ona (35 g, 100 mmol), 5-(4,4,5,5-tetrametil-l,3,2-dioxaborolan-2-il)piridina-3-carboxilato de etilo (29,1 g, 105 mmol), acetato de etilo sódico (28,7 g, 350 mmol), diclorometano de dicloreto de 1,1'- bis(difenilfosfino)ferroceno-paládio(II) (0,817 g, 1,0 mmol) adicionar 1,4-dioxano (200 mL) e água (200 mL) sob N2. Em seguida, aquecer a mistura de reacção a 85°C e continuar a agitar durante 10 horas. Arrefecer a mistura de reacção à temperatura ambiente. Filtrar a mistura com Kieselguhr® Silica-Thiol para remover o catalisador. Adicionar água (400 mL) gota a gota e os precipitados sólidos. Filtrar a mistura e lavar o sólido com água (400 mL) . Agitar o sólido em acetato de etilo (70 mL) à temperatura ambiente durante uma hora; filtrar, lavar com acetato de etilo (70 mL), e secar sob vácuo abaixo de 65°C para dar o composto do titulo (33,6 g, 80%). XH NMR (CDC13, 400 MHz) δ 9,25 (d, 1H, J=2 Hz), 9,15 (d, 1H, J=2,4 Hz), 8,75 (s, 1H) , 8,73 (d, 1H, J=l,6 Hz), 8,65 (t, 1H), 8,24 (d, 1H, J=8,8 Hz), 7,89 (dt, 1H, J=8,8, 1,6 Hz), 4,47 (q, 2H) , 4,38 (m, 2H) , 3,90 (m, 1H) , 3,64 (s, 3H), 3,26 (s, 3H), 1,45 (t, 3H), 1,37 (d, 3H, J=6 Hz). EXEMPLO 1 8-[5-(1-Hidroxi-l-metiletil)piridin-3-il]-1-[(2S)-2-metoxipropil]-3-metil-l,3-dihidro-2H-imidazo[4,5- c]quinolin-2-ona

Método 1

Dissolver 8-bromo-l-[ (2S)-2-metoxipropil]-3- metil-imidazo[4,5-c]quinolin-2-ona (0,600 g, 1,7 mmol) e 2-[5-(4,4,5,5-tetrametil-l,3,2-dioxaborolan-2-il) -3-piridil]propan-2-ol (0,9 g, 3,43 mmol) em tetrahidrofurano (75 mL) e água (7,5 mL) num tubo selado. Purgar a mistura com azoto. Adicionar fluoreto de potássio (400 mg, 6,89 mmol), tris(dibenzilidenoacetona)dipaládio(0) (200 mg, 0,22 mmol) e tetrafluoroborato de tri-terc-butilfosfónio (200 mg, 0,68 mmol) . Selar a reacção em azoto e aquecer a 65-70°C durante a noite. Arrefecer a mistura à temperatura ambiente, filtrar para remover o resíduo inorgânico. Concentrar o filtrado e diluir com diclorometano (120 mL) e água (30 mL). Separar a camada orgânica e secar sobre pó de sulfato de magnésio. Concentrar in vacuo até um óleo castanho. Purificar o resíduo por cromatografia em coluna de sílica gel com solvente de eluição de 30-65% de acetato de etilo em hexano, depois com 0-7% de metanol em diclorometano. Concentrar as fracções que contêm o produto e co-evaporar com éter dietílico (2 x 10 mL) , acetona (10 ml), acetona e éter dietílico (10 mL cada) subsequentemente. Seca-se o resíduo sólido para proporcionar o composto do título como um pó cor de laranja (0,30 g, 44%). MS (ESI) m/z (M+H)+ 407,0. Método 2

Purgar azoto através de uma suspensão de 2-(5-bromo-3-piridil)propan-2-ol (100 g, 464 mmol, 1,25 eq.), 4,4,5,5-tetrametil-2-(4,4,5,5-tetrametil-l, 3,2-dioxaborolan-2-il)-1,3,2-dioxaborolano (141,4 g, 557 mmol, 1,5 eq.), e acetato de potássio (127,5 g, 1,3 mol) em 1,4-dioxano (2,6 L) durante 30 minutos à temperatura ambiente. Adicionar aducto de diclorometano de dicloro-((bis-difenilfosfino)ferrocenil)-paládio(II) (9 g, 11,14 mmol) sob azoto e aquecer a mistura a 90°C. Agita-se a mistura durante 3 horas. Arrefecer a mistura de reacção a 80°C e, em seguida, adicionar 8-bromo-l-[(2 S)-2-metoxipropil]-3-metil- imidazo[4,5-c] quinolin-2-ona (130 g, 371 mmol), uma solução de carbonato de sódio (118 g, 1,1 mol) em água (910 mL), e aducto de diclorometano de dicloro-((bis- difenilfosfino)ferrocenil)-paládio(II) (9 g, 11,14 mmol). Agitar a mistura à mesma temperatura durante 1,5 horas. Permitir a separação de fases para obter a camada orgânica e arrefecer até 40°C antes de ser concentrada in vacuo. Purificar o resíduo (350 g) por cromatografia em coluna de gel de sílica com um gradiente de mistura de solvente de eluição de diclorometano/acetato de etilo/metanol de 1:1:1 a 1:1:20. Obtiveram-se fracções que contêm o produto. Concentrar e suspender o resíduo em acetato de etilo (10 L/kg) a 40°C durante 15 minutos, filtrar e lavar o sólido com acetato de etilo (2x1 L/kg) e éter metil-terc-butílico (2 x 2 L / kg) . Dissolver o sólido lavado em metanol (10 L/kg), tratar com Tiol SiliaBond® (0,4 g / g) para remover o metal residual. Agitar a suspensão a 23°C durante 4 h, e filtrar. Lavar o sólido com metanol (1 L/kg). Combinar todos os filtrados e lavagens de metanol e concentrar in vacuo. Reter o sólido em solvente (cerca de 100 mL) . O material cristaliza-se a partir do solvente. Filtrar o material sólido e secar a 1 mbar/40°C durante a noite para proporcionar o composto do título como um sólido branco (77 g, 51%) . MS (ESI) m/z (M+H)+ 407,1. 1H NMR (500,23 MHz, DMSO): 9,05 (s, 1H) , 8,95 (d, J=2,2 Hz, 1H) , 8,79 (d, J=2,0 Hz, 1H) , 8,69 (d, J=1,5 Hz, 1H) , 8,33 (t, J=2,l Hz, 1H) , 8,18 (d, J=8,8

Hz, 1H) , 8,12 (dd, J= 1,7, 8,8 Hz, 1H) , 5,41 (s, 1H) , 4,56 (dd, J= 8,3, 15,2 Hz, 1H) , 4,37 (dd, J=4,2, 15,2 Hz, 1H) , 3,85-3,80 (m, 1H), 3,57 (s, 3H), 3,12 (s, 3H), 1,56 (d, J=l,2 Hz, 6H), 1,26 (d, J=6,1 Hz, 3H). Método 3 A uma solução de 5-[ 1-[(2S)-2-metoxipropil]-3-metil-2-oxo-imidazo[4,5-c]quinolin-8-il]piridina-3-carboxilato de etilo (32,0 g, 76,1 mmol) em tetrahidrofurano (320 mL), adicionar lentamente MeMgBr (1,4M em tetrahidrofurano/tolueno, 221,4 g, solução 6,92χ) sob protecção de N2 com temperatura abaixo de 0°C. Agita-se a mistura à temperatura de -5~0°C durante uma hora sob protecção de N2. Adicionar uma solução de NH4C1 (15%, 320 ml) lentamente para extinguir a reacção, mantendo a temperatura abaixo de 25°C. Em seguida, adicionar acetato de etilo (320 mL). Aquecer a mistura a 25~30°C e agitar durante meia hora. Depois da separação das duas camadas, extrair novamente a camada aquosa com tetrahidrofurano (160 mL). Lavar a camada orgânica combinada com salmoura (192 mL). Adicionar carvão activado (1,6 g) à camada orgânica e agitar a 65~75°C durante 4-5 horas. Filtrar a mistura com Kieselguhr® Silica-Thiol (1,6 g) . Agitar a camada orgânica a 65~75°C durante 2-3 horas; a mistura é depois filtrada por Kieselguhr® Silica-Thiol. A camada orgânica é removida sob vácuo e re-cristalizada com acetato de etilo/tetrahidrofurano para fornecer 8-[5-(1-hidroxi-l-metiletil)piridin-3-il]-1-[(2S)-2-metoxipropil]-3-metil-l,3-dihidro-2H-imidazo[4,5- c]quinolin-2-ona como um sólido amarelo claro (22,34 g, 72,2%). A um balão de três tubuladuras adicionar 8— [5— (1 — hidroxi-l-metiletil)piridin-3-il]-1-[ (2 S)-2-metoxipropil]- 3-metil-l,3-dihidro-2H-imidazo[4,5-c]quinolin-2-ona preparada tal como acima neste Método 3 (50,0 g, 123 mmol) e tetrahidrofurano (1500 mL). Agitar a mistura e aquecê-la a 45~55°C para formar uma solução absoluta. Filtrar e concentrar o filtrado sob vácuo abaixo de 45°C a 2,0-3,0V e adicionar acetato de etilo (500 mL), em seguida, concentrar sob vácuo abaixo de 45°C a 7~8V. Agitar a suspensão a 70~80°C durante 6-10 horas, depois arrefecer a 20~25°C e filtrar. Adicionar acetato de etilo (135-140 g) e etanol (13,5-14,0 g) ao resíduo. Agitar a suspensão a 70~80°C durante 6-10 horas, depois arrefecer a 20~25°C e filtrar. Concentrar sob vácuo para fornecer o composto do título como um sólido amarelo claro (37,9 g, 75,8%). 1H NMR (CDCI3, 400 MHz) δ 8,86 (d, 1H, J=2 Hz), 8,76 (d, 1H, J=2,4 Hz), 8,71 (s, 1H), 8,64 (d, 1H, J=1, 6 Hz), 8,21 (t, 2H) , 7,85 (d, 1H, J=6, 8 Hz), 4,36 (q, 2H) , 3,88 (m, 1H) , 3,62 (s, 3H) , 3,23 (s, 3H) , 2,79 (s, 1H), 1,95 (s, 1H), 1,71 (d, 6H, J=0,8 Hz), 1,33 (d, 3H, J=6,4 Hz). EXEMPLO 2

8-[5-(1-Hidroxi-l-metiletil)piridin-3-il]-1-[(2S)-2-metoxipropil]-3-metil-l,3-dihidro-2H-imidazo[4,5-c]quinolin-2-ona, Forma I Método 1 A base livre impura (Exemplo 1) é submetida a suspensão em etilacetato, como um sólido branco que se começa a precipitar a partir de uma solução acastanhada. 0 sólido é filtrado numa "glove box" (caixa de luvas) colocada dentro do "ventilation hood" (exaustor) e é deixado secar no vácuo dentro da "glove box" durante a noite. 0 produto é deixado sob vácuo durante a noite (11 g, 63,18% de rendimento)

Os padrões de difracção em pó de raios X (XRD) dos sólidos cristalinos obtêm-se num difractrómetro em pó de raios-X Endeavor Bruker D4, equipado com uma fonte de CuKa (λ=1,54060 Ã) e um detector Vantec, que opera a 35 kV e 50 mA. A amostra é digitalizada entre 4 e 40° em 2Θ, com um tamanho de etapa de 0,0087° em 2Θ e uma taxa de digitalização de 0,5 segundos/etapa e com 0,6 mm de divergência, 5,28 mm antidispersão ajustado e 9,5 mm de detecto de aberturas. O pó seco é colocado num recipiente de amostra de quartzo e é obtida uma superfície lisa utilizando uma lâmina de vidro. É bem conhecido na técnica da cristalografia que por cada forma cristalina fornecida, as posições de pico angular podem variar ligeiramente. Por exemplo, as posições de pico podem- se alterar devido a uma variação na temperatura ou humidade na qual uma amostra é analisada, a deslocação da amostra ou na presença ou ausência de um standard interno. No presente caso, a variabilidade posição do pico de ± 0,2 em 2Θ terá em conta essas potenciais variações, sem prejudicar a identificação inequívoca da forma de cristal indicado. A confirmação de uma forma cristalina pode ser feita com base em qualquer combinação única de picos distinguíveis (em unidades de ° 2Θ) , tipicamente os picos mais proeminentes. Os padrões de difracção de forma cristalina, recolhidos à temperatura ambiente e humidade relativa do ar, são ajustados com base nos picos padrão NIST 675 a 8,85 e 26,77 graus 2-teta.

Assim, uma amostra do composto preparado é caracterizada por um padrão de XRD, utilizando radiação CuKa como tendo picos de difracção (valores 2-teta) como descrito na Tabela 1 abaixo. Especificamente, o padrão contém picos característicos que ocorrem em 8,57 e um ou mais de 9,06, 15,93, 18,29 e 18,87, com uma tolerância para os ângulos de difracção de 0,2 graus. TABELA 1

Picos de difracção em pó de raios-X do Exemplo 2, Método 1

Método 2

Dissolver uma quantidade razoável da base livre do Exemplo 1 em etanol ou tetrahidrofurano para se obter uma solução. Evaporar a solução para fornecer o composto do titulo.

Assim, uma amostra do composto preparado é caracterizada por um padrão de XRD, utilizando radiação CuKa como tendo picos de difracção (valores 2-teta) como descrito na Tabela 1 abaixo. Especificamente, o padrão contém picos caracteristicos que ocorrem em 8,60 e um ou mais de 9,08, 15,93, 18,25 e 18,83, com uma tolerância para os ângulos de difracção de 0,2 graus. TABELA 2

Picos de difracção em pó de raios-X do Exemplo 2, Método 2

EXEMPLO 3

Monohirato de 8-[5-(1-Hidroxi-l-metiletil)piridin-3-il]-1-[(2S)-2-metoxipropil]-3-metil-l,3-dihidro-2H-imidazo[4,5- c]quinolin-2-ona

0 Exemplo 3 pode ser preparado submetendo a suspensão uma mistura de uma forma de metanolato da base livre (metanolato é uma forma cristalina obtida a partir de uma solução de metanol de base livre), juntamente com a forma anidra da base livre (ver Exemplo 2) numa quantidade razoável de água durante 24 horas. Alternativamente, suspender a forma anidra de uma base livre (ver Exemplo 2) numa solução de acetona/água (proporção de 95:5, aw = 0,57) e semear com a forma mono-hidratada irá resultar numa conversão completa da forma anidra I no mono-hidrato desejado em 24 horas.

As condições para obter a difracção em pó de raio X (XRD) do Exemplo 3 são essencialmente as mesmas que as condições descritas no Exemplo 2.

Assim, uma amostra do composto preparado é caracterizada por um padrão de XRD, utilizando radiação CuKa como tendo picos de difracção (valores 2-teta) como descrito na Tabela 3 abaixo. Especificamente, o padrão contém um pico caracteristico a 13,57 em combinação com um ou mais dos picos seleccionados do grupo que consiste em 6,75, 9,71, 16,35, 16,98 e 19,54, com uma tolerância para os ângulos de difracção de 0,2 graus. TABELA 3

Picos de difracção em pó de raios-X do Exemplo 3

EXEMPLO 4

Malato de 8-[5-(1-Hidroxi-l-metiletil)piridin-3-il]-1-[(2S)-2-metoxipropil]-3-metil-l,3-dihidro-2H-imidazo[4,5- c]quinolin-2-ona

0 Exemplo 4 pode ser preparado por suspensão de uma base livre (53,5 mg) em acetona (2 mL) e em seguida incorporando o ácido L-málico (22 mg). Os sólidos dissolvem-se numa solução clara. Os sólidos cristalinos brancos precipitam-se a partir da solução. Filtrar os sólidos sob vácuo e secar ao ar. Secar o sal de malato num forno de vácuo (65°C) durante a noite para proporcionar o composto do título.

As condições para obter a difracção em pó de raio X (XRD) do Exemplo 4 são essencialmente as mesmas que as condições descritas no Exemplo 2.

Assim, uma amostra do composto do título é caracterizada por um padrão de XRD, utilizando radiação CuKa como tendo picos de difracção (valores 2-teta) como descrito na Tabela 4 abaixo. Especificamente, o padrão contém um pico característico a 5,39 em combinação com um ou mais dos picos seleccionados do grupo que consiste em 10,33, 12,16, 15,57 e 20,08, com uma tolerância para os ângulos de difracção de 0,2 graus.

EXEMPLO 5

Fumarato de 8-[5-(1-Hidroxi-l-metiletil)piridin-3-il]-1-[(2S)-2-metoxipropil]-3-metil-l,3-dihidro-2H-imidazo[4,5- c]quinolin-2-ona

0 Exemplo 5 pode ser preparado pela adição de uma base livre 8-[5-(1-hidroxi-l-metiletil)piridin-3-il]-1-[(2S)-2-metoxipropil]-3-metil-l,3-dihidro-2H-imidazo[4,5— c] quinolin-2-ona (60,2 mg) a 1-butanol (0,5 mL) e, em seguida, adicionar 21,9 mg de ácido fumárico. Adicionar heptano (5 x 0,5 mL) , gue produz uma suspensão branca espessa, e agitar a 90°C/500 rpm. Filtrar sob vácuo e secar sob azoto. Os sólidos são perdidos durante a recuperação da filtração, apesar de suficiente para XRD. Preparar o sal fumarato cristalino adicional adicionando base livre (101,0 mg) a 1-butanol (0,5 mL) e, em seguida, adicionar 34 mg de ácido fumárico. Adicionar heptano (6x0,5 mL) e sementes cristalinas do sal de fumarato da primeira preparação e agitar a mistura a 90°C/500 rpm durante 1 hora. Recuperar os sólidos por filtração sob vácuo e secar os sólidos sob azoto. Secar os sólidos adicionalmente num forno de vácuo (65°C) durante a noite para proporcionar o composto do titulo.

As condições para obter a difracção em pó de raio X (XRD) do Exemplo 5 são essencialmente as mesmas que as condições descritas no Exemplo 2.

Assim, uma amostra do composto do titulo é caracterizada por um padrão de XRD, utilizando radiação CuKa como tendo picos de difracção (valores 2-teta) como descrito na Tabela 5 abaixo. Especificamente, o padrão contém um pico caracteristico a 5,10 em combinação com um ou mais dos picos seleccionados do grupo que consiste em 8,55, 15,45, 15,78 e 22,50, com uma tolerância para os ângulos de difracção de 0,2 graus.

Ensaio Enzimático In Vitro de mTOR (FRAPl)

Usar o ensaio de Quinase mTOR LanthaScreen™ (Invitrogen) para determinar os valores IC50 do composto contra quinase mTOR. Este é um formato de ensaio de Transferência de Energia de Ressonância Fluorescente Resolvida por Tempo (TR-FRET) que utiliza anticorpo etiquetado com térbio de longa vida como das espécies dadoras e 4—BPl etiquetado com Proteína Fluorescente Verde (GFP) como as espécies aceitadoras. Usar a proporção TR-FRET para monitorizar a actividade mTOR onde um incremento na fosforilação da proteína resulta num incremento na proporção TR-FRET. Realizar a reacção de quinase utilizando um volume de reacção de 12,5 microlitros em Proxiplaca de 384-cavidades negras pouco profundas. Adicionar reagentes para obtenção de condições de reacção finais de ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanossulfónico (HEPES) a 50 milimolar, pH 7,5, ácido etileno glicol-bis(éter etílico β- amino etiléter)-N,N,Ν', Ν'-tetra-acético (EGTA) a 1 milimolar, 0,01% de Tween 20, cloreto de manganésio 10 mM, DL-ditiotreitol (DTT) 2 mM, GFP-4E-BP1 0,4 micromolar (um substrato fisiológico de mTOR, 4E-BP1 expresso e purificado como uma fusão com a proteína verde fluorescente, Invitrogen), 70 ng por mililitro de mTOR (mTOR humana recombinante, os resíduos 1360-2549, glutationa-S-transferase (GST)-etiquetado, expresso em células de insecto, Invitrogen), 4% de dimetilo sulfóxido e diluições em série do composto (diluído 1:3 a partir de 20.000 a 1 nM) . Adicionar a enzima e o substrato ao composto e, em seguida, adicionar o trifosfato de adenosina (ATP) a 10 μΜ para iniciar a reacção. Incubar à temperatura ambiente durante 60 min e, em seguida, adicionar 12,5 yL de tampão de diluição do anticorpo contendo anticorpo 4E-BP1 anti-fosfo-treonina-46 etiquetado com térbio 4 nM e ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 20 mM, hidrocloreto de tris(hidroximetil)aminoetano (Trizma®) 0,67 mM, pH 7,5, 0,02% de azida de sódio e 0,01% de nonilfenilpolietileno glicol (Nonidet® P40). Incubar à temperatura ambiente durante 60 min, e ler num leitor de placa Envision 340 nm com filtros de comprimento de onda de excitação e filtros de emissão de 495 nm e 520 nm de comprimento de onda. Usar o sinal medido com filtro de 520 nm (específico para GFP) sobre o sinal medido com filtro 495 (específico para térbio) para calcular a proporção de TR-FRET. Calcular o valor de IC5o para cada composto utilizando dados de percentagem de inibição, que são calculados a partir dos dados de reacção em relação aos controlos na placa (proporção TR-FRET de pontos de dados do ensaio relativos a controlos na placa sem ATP) . Usar ACTIVITYBASE 4.0 para ajustar a percentagem de inibição e dados de concentração do composto de dez pontos a uma equação logística de quatro parâmetros

Um composto dentro do âmbito da invenção é testado neste ensaio executado substancialmente como acima. Por exemplo, o composto do Exemplo 1 é testado e verificou-se ter um valor de IC5o de 0,165 μΜ absoluta (± 0,0925, n = 5). Estes resultados indicam que os compostos dentro do âmbito da presente invenção são potentes inibidores de mTOR.

Ensaio Enzimático In Vitro de Fosfoinositido 3-Quinase Alfa (Pl3Ka)

Usar o Ensaio de Proximidade de Cintilação Pl3Ka (Pl3Ka SPA) para determinar os valores de IC5o do composto contra quinase Pl3Ka. Este ensaio avalia a actividade de Pl3Ka na presença de inibidores dos compostos, medindo a incorporação de γ -P33-ATP em fosfatidilinositol (4,5) bifosfato (PIP2) · Executar as reacções de quinase em volumes de reacção de 40 μΐ em placas de poliestireno de fundo plano brancas de fundo claro de 96 cavidades em meia área. Adicionar Pl3Ka para iniciar a reacção. As condições de reacção final são 43,75 mM de 2,2-bis(hidroximetil) -2,2' , 2' ' -nitrilotrietanol (Bis-Tris) pH 7,0, cloreto de sódio (NaCl) 306 mM, éter polietileno glicol octilfenil (Triton™ X -100) 1,76 mM, trifosfato de adenosina (ATP) 10 M, cloreto de magnésio 2,9 mM (MgCl2) e 1 pCi por cavidade de trifosfato γ-Ρ33 adenosina (γ-Ρ33-ΑΤΡ) , enzima recombinante humana Pl3Ka 5,0 nM, palmitoil-oleoil fosfatidilserina (POPS) 0,2 mM, fosfatidilinositol (4,5) bifosfato (PIP2) 0,04 mM, 4% DMSO e diluições em série do composto (diluído 1:3 de 20.000 a 1 nM). Incubar à temperatura ambiente durante 90 minutos após a adição de Pl3Ka. Parar a reacção com a adição de 40 pL de um tampão de paragem contendo 2,5 mg/mL de grânulos ligados a neomicina (Amersham, Cat# RPNQ0506) e 21 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Centrifugar as placas durante 30 minutos a 1000 rotações por minuto (RPM) e contar a radioactividade com um Wallac Microbeta Trilux normalizada para P33. Derivar o valor IC50 para o Exemplo 1, utilizando dados de percentagem de inibição calculados usando os dados de reacção em relação aos controlos na placa (enzima activa versus controlos de enzima inibidos por EDTA 62,5 milimolares). Usar ACTIVITYBASE 4.0 para ajustar a percentagem de inibição e dados de concentração do composto de dez pontos a uma eguação logística de guatro parâmetros

Um composto dentro do âmbito da invenção é testado neste ensaio executado substancialmente como acima. Por exemplo, o composto do Exemplo 1 é testado e verificou-se ter um valor de IC50 de 0, 00607 μΜ (±0,00338, n=2) . Estes resultados indicam gue os compostos dentro do âmbito da presente invenção são potentes inibidores de Pl3Ka.

Ensaio Enzimático In Vitro de Fosfoinositido 3-Quinase Beta (Pl3Kb)

Usar o Ensaio de Proximidade de Cintilação Pl3Ka beta (Pl3Ka beta SPA) para determinar os valores de IC50 contra quinase Pl3Kb para um composto. Este ensaio avalia a actividade de Pl3Ka beta na presença de inibidores do composto, medindo a incorporação de γ-Ρ33-ΑΤΡ em fosfatidilinositol (4,5) bifosfato (PIP2). Executar as reacções de quinase em volumes de reacção de 40 μΐ em placas de poliestireno de fundo plano brancas de fundo claro de 96 cavidades em meia área. Adicionar PI3K beta para iniciar a reacção. As condições de reacção final são 43,75 mM de 2,2-bis(hidroximetil)-2,2',2''-nitrilotrietanol (Bis-Tris) pH 7,0, cloreto de sódio (NaCl) 87,5 mM, éter polietileno glicol octilfenil (Triton™ X -100) 1,76 mM, trifosfato de adenosina (ATP) 40 μΜ, cloreto de magnésio 1,0 mM (MgCÍ2) e 1 pCi por cavidade de trifosfato γ-Ρ33 adenosina (γ-Ρ33-ΑΤΡ) , enzima recombinante humana Pl3Ka beta 6, 0 nM, palmitoil-oleoil fosfatidilserina (POPS) 0,2 mM, fosfatidilinositol (4,5) bifosfato (PIP2) 0,04 mM, 4% DMSO e diluições em série do composto (diluído 1:3 de 20.000 a 1 nM). Incubar à temperatura ambiente durante 90 minutos após a adição de PI3K beta. Parar a reacção com a adição de 40 pL de um tampão de paragem contendo 2,5 mg/mL de grânulos ligados a neomicina (Amersham, Cat# RPNQ0506) e 21 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Centrifugar as placas durante 30 minutos a 1000 rotações por minuto (RPM) e quantificar a radioactividade com um Wallac Microbeta Trilux normalizado para P33. Derivar o valor IC5o para o composto, utilizando dados de percentagem de inibição calculados usando os dados de reacção em relação aos controlos na placa (enzima activa versus 62,5 milimolar controlos de enzima inibida EDTA). Usar ACTIVITYBASE 4.0 para ajustar a percentagem de inibição e dados de concentração do composto de dez pontos a uma equação logística de quatro parâmetros

Um composto dentro do âmbito da invenção é testado neste ensaio executado substancialmente como acima. Por exemplo, o composto do Exemplo 1 é testado e verificou-se ter um valor de IC50 absoluto de 0,0776 μΜ (±0,0401, n=2). Estes resultados indicam que os compostos dentro do âmbito da presente invenção são potentes inibidores de Pl3Kb.

Ensaio Enzimático In Vitro de Fosfoinositido 3-Quinase delta (Pl3Kd)e de Fosfoinositido 3-Quinase Gama (Pl3Kg)

Utilizar o ensaio de quinase Adapta® para a detecção de imunoensaio de base fluorescente de ADP. Este é um formato de ensaio Resolvido por Tempo-FRET (TR-FRET), que utiliza um anticorpo anti-ADP etiquetado com Európio e um indicador ADP etiquetado Alexa Fluor® 647 (AF647) para monitorizar a produção de ADP de quinase. Utilizar a proporção TR-FRET para monitorizar a actividade PI3K delta ou PI3K gama onde um aumento na fosforilação lípida e a correspondente produção de ADP aumentada resulta numa diminuição no TR-FRET.

Reacções Enzimáticas: Realizar a reacção da quinase para Pl3Kd usando um volume de reacção de 10 microlitros numa placa de 384 cavidades branca, de volume baixo, Corning® (Corning® #3674). Adicionar reagentes para obter as condições de reacção final de 0,47-2,6 nanogramas de PI3K delta (PI3K humano de longitude completa recombinante expresso em e purificada a partir de células de insecto, Invitrogen) e 50 micromolares de PIP2: PS em 32,5 milimolares de HEPES, pH 7,5, 50 milimolares de cloreto de sódio, 0,015% de CHAPS, 1,5 milimolares de cloreto de magnésio, 0,5 milimolares de EGTA, 25 micromolares de ATP, 1% de DMSO e composto diluido em série (diluído 1:3 a partir de 20.000 a 1 nanomolar). Adicionar o ATP ao composto e, em seguida, adicionar a mistura de substrato/quinase para iniciar a reacção. Agitar a placa durante 30 segundos e depois incubar à temperatura ambiente durante 60 minutos. Realizar a reacção da quinase para Pl3Kd usando um volume de reacção de 10 microlitros numa placa de 384 cavidades branca, de volume baixo, Corning® (Corning® #3674). Adicionar reagentes para obter as condições de reacção final de 3,5-26 nanogramas de PI3K gama (PI3K humano de longitude completa recombinante expresso em e purificada a partir de células de insecto, Invitrogen) e 50 micromolares de PIP2: PS em 32,5 milimolares de HEPES, pH 7,5, 0,5 milimolares de EGTA, 1,5 milimolares de cloreto de magnésio, 25 micromolares de ATP, 1% de DMSO e composto diluído em série (diluído 1:3 a partir de 20.000 a 1 nanomolar). Adicionar o ATP ao composto e, em seguida, adicionar a mistura de substrato/quinase para iniciar a reacção. Agitar a placa durante 30 segundos, centrifugar durante 2 minutos a l.OOOxg e depois incubar à temperatura ambiente durante 60 minutos.

Detecção ADP: Adicionar 5 microlitros da Mistura de Detecção (30 mM de EDTA, 30 nM de anticorpo Eu-anti ADP e a concentração de EC60 de marcador de ADP para reacções com 5-100 μΜ de ATP, Invitrogen) a reacções enzimáticas PI3K delta e gama. Agitar a placa durante 30 segundos, centrifugar durante 2 minutos a l.OOOxg e depois incubar à temperatura ambiente durante 60 minutos. Ler as placas num leitor de placas fluorescente, utilizando filtros de excitação de comprimento de onda 340 nm e filtros de emissão de comprimento de onda de 665 nm e 615 nm. Usar o sinal medido com filtro de 665 nm (especifico para emissão poli GT de AF647) sobre o sinal medido com filtro 615 (especifico para európio) para calcular a proporção de TR-FRET. Usar a relação TR-FRET para calcular a concentração de ADP por cálculo novamente para uma curva padrão de ADP/ATP que ajusta a uma resposta de dose sigmoidal número do modelo 205 (XLfit de IDBS0). Calcular o valor de IC50 para cada composto utilizando dados de percentagem de inibição, que são calculados a partir dos dados de reacção em relação aos controlos na placa (concentração de ADP de pontos de dados do ensaio relativos a controlos na placa sem ATP). Use XLfit (IDBS) para ajustar a percentagem de inibição e os dados de concentração de dez pontos do composto a uma resposta de dose sigmoidal modelo 205 {XLfit de IDBS) .

Um composto dentro do âmbito da invenção é testado neste ensaio executado substancialmente como acima. Por exemplo, o composto do Exemplo 1 é testado e verificou-se ter um valor de IC50 absoluto de 0,0380 μΜ para Pl3Kd e um valor de IC50 absoluto de 0,0238 μΜ para Pl3Kg. Estes resultados mostram que os compostos no âmbito da presente invenção são inibidores potentes da Pl3Kd e Pl3Kg.

Ensaio Enzimático In Vitro de Proteína Quinase Dependente de DNA (DNA-PK)

Usar o formato de ensaio de quinase Z'LYTE® (Invitrogen) para determinar valores IC50 contra DNA-PK para um composto. Esta é formato de ensaio enzimático acoplado, de base fluorescente, baseado na sensibilidade do substrato peptidico etiquetado dual fosforilado versus não fosforilado (Cumarina no término amino, fluoresceina no término carboxi) a proteólise. Utilizar a relação de Transferência de Energia de Ressonância de Fluorescência (FRET) para monitorizar a actividade de DNA-PK, em que a fosforilação do peptídeo protege o péptido de clivagem proteolítica e a FRET do substrato é mantida. Realizar a reacção da quinase usando volume de reacção de 10 microlitros numa placa de 384 cavidades preta, de baixo volume de NBS Corning® (Corning® #3676). Adicionar reagentes para obtenção de condições de reacção final de 50 milimolares de ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanossulfónico (HEPES), pH 7,5, 0,01% de surfactante não iónico BRIJ-35, 10 milimolares de cloreto de magnésio, 1 milimolar de etileno glicol-bis (β- amino éter etílico)-ácido N,N,Ν',Ν'-tetraacético (EGTA), 1 mM de DL-ditiotreitol (DTT), 2,5 microgramas/mililitro de DNA-Timo de vitelo (CT DNA), 3,88-27,3 nanogramas de DNA-PK, 2 micromolares do péptido etiquetado 26 Ser/Thr (Invitrogen), 1% de dimetilsulfóxido e diluições em série do composto (diluído 1:3 a partir de 20.000 a 1 nanomolar). Adicionar a enzima e o substrato ao composto e, em seguida, adicionar 25,0 microcolares do trifosfato de adenosina (ATP) para iniciar a reacção. Agitar a placa durante 30 segundos e depois incubar à temperatura ambiente durante 60 minutos. Adicionar 5 microlitros de uma diluição 1:16 de Solução B de Reagente de Desenvolvimento (Invitrogen), agitar a placa durante 30 segundos e em seguida incubar à temperatura ambiente durante 60 minutos. Ler as placas num leitor de placas fluorescente, utilizando filtros de excitação de comprimento de onda 400 nm e filtros de emissão de comprimento de onda de 445 nm e 520 nm. Usar o sinal medido com filtro de 445 nm (específico para Cumarina) sobre o sinal medido com filtro 520 (específico para fluoresceína) para calcular a proporção de TR-FRET. Usar XL fit (IDBS) para ajustar a percentagem de inibição e os dados de concentração de dez pontos do composto a uma resposta de dose sigmoidal modelo 205 (XLfit de IDBS).

Um composto dentro do âmbito da invenção é testado neste ensaio executado substancialmente como acima. Por exemplo, o composto do Exemplo 1 é testado e verificou-se ter um valor de IC5o absoluto de 0, 00424 μΜ. Estes resultados mostram que os compostos no âmbito da presente invenção são inibidores potentes da DNA-PK.

Detecção AlphaScreen SureFire de Quinase p70S6 fosforilada (Thr389), AKT (Thr308) , e AKT (Ser473) em células U87MG.

Usar o AlphaScreen SureFire® para quinase p-p70S6 (Thr389) (TGR Biosciences, TGRAS50K), p-AKT(Thr308) (TGR Biosciences, TGRA2S50K) , e p-AKT(Ser473) (TGR Biosciences, TGRAS50K) para determinar o efeito do Exemplo 1 na formação de quinase p70S6 fosforilada endógena (Thr389), AKT(Thr308) e AKT(Ser473) respectivamente. Este formato de ensaio homogéneo utiliza a captura imuno-intercalada do analito fosforilado e, em seguida, a detecção com esferas AlphaScreen revestidas de anticorpos para gerar um sinal amplificado.

Manter células U87MG em meio de crescimento U87MG consistindo em DMEM (GIBCO 11965-092) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS, Gibco, 10091-141), 1% de aminoácidos não essenciais (GIBCO, 11140-050) e 1% de piruvato de sódio (GIBCO, 11360-070). As células recolhem-se utilizando procedimentos de cultura de células standard e depois são contadas usando Vi-Cell. Colocar em placas 100 yL de células U87MG em meio de crescimento (50,000 células/cavidade) em placas de 96 cavidades Costar #3596 e incubar durante a noite a 37°C, 5% de CO2.

No dia do ensaio, tratar as células com o Exemplo 1 (20 yL/cavidade) diluído em meio contendo 6% DMSO. Incubar durante uma hora a 37 °C, em seguida, remover o meio e adicionar 50 yL de 1 x tampão de lise SureFire (componentes do Kit TGR Biosciences SureFire®) a cada cavidade e incubar à temperatura ambiente durante 10 min com agitação suave. Transferir 6 yL de lisado e 10 yL de mistura de reacção (60 partes de tampão de reacção/10 partes de tampão de activação/1 parte de cada um dos grânulos dadores e aceitantes, Perkin Elmer, 6760617R) a uma proxiplaca de 384 cavidades (Perkin Elmer, 6006280) para os ensaios de quinase p-p70S6 (Thr389) e p-AKT (Ser473). Selar a placa e incubar à RT durante 4 h. Transferir 4 yL de lisado e 5 yL de mistura de reacção (40 partes de tampão de reacção/10 partes de tampão de activação/1 parte grânulos aceitantes) a uma proxiplaca de 384 cavidades para o ensaio p-AKT (Thr308). Incubar 2 h à RT e, em seguida, adicionar 2 yL da mistura de diluição (20 partes de tampão de diluição/1 parte de grânulos aceitante) a cada cavidade. Selar a placa e incubar à RT durante mais 2 h. Ler as placas num Perkin Elmer Envision equipado com um TurboModule usando as configurações padrão AlphaScreen® (Ex680nm e Ern52o-620nm) · Calcular dados de percentagem de inibição a partir dos dados da reacção em relação ao controlo em placa. Em seguida, utilizar ACTIVITYBASE 4.0 para se ajustar a percentagem de inibição a partir dos dados de concentração de composto de dez pontos para uma equação logística de quatro parâmetros para calcular o valor de IC5q para o Exemplo 1.

Um composto dentro do âmbito da invenção é oeste ensaio executado substancialmente como acima. Por exemplo, 0 composto do Exemplo 1 é testado e verificou-se que os valores de IC50 absolutos como fornecidos na Tabela 6. Estes resultados demonstram que os compostos no âmbito da presente invenção inibem as enzimas na trajectória de PI3K e mTOR em células U87MG.

Ensaio de Proliferação Celular

Usar o Sistema de Ensaio de Viabilidade de Célula Luminescente CellTiter-Glo (comercialmente disponível em Promega) para medir a actividade antiproliferação do Exemplo 1 através da determinação do número de células viáveis em cultura com base na quantificação de ATP presente, que assinala a presença de células metabolicamente activas.

Colocar as células numa placa de 96 cavidades a 2000 células/cavidade em 100 μΐ de meio especifico de célula (para U87MG para utilizar DMEM, 10% de FBS, 25 mM de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinoetanossulfónico (HEPES), 1,0 mM de piruvato de sódio e 0,1 mM aminoácidos não essenciais (ATCC Cat.#30-2002); para HT1080 usar MEM de Eagle, 10% FBS (ATCC Cat.#30-2003); para H1975, A2780, SJSA-1 e 786-0 usar RPMI 1640, 10% de FBS (ATCC Cat.#30-2001); para A204 usar 5A de McCoy, 10% de FBS (ATCC Cat.#30-2007) , excepto na coluna 1 usar apenas meio como o controlo em branco. Incubar as placas durante a noite a 37°C e 5% de CO2. No dia seguinte, preparar reservas de composto a 1 mM em DMSO e diluir em série em DMSO numa placa de polipropileno de fundo redondo de 96 cavidades. Submeter a ensaio os compostos em 10 concentrações em duplicado, 4 compostos por placa.

Transferir 4 pL das diluições em série em DMSO para uma placa de 96 cavidades e adicionar 196 pL de meio de cultura para criar um stock 10χ para dosagem. Suavemente transferir 11 pi de cada unidade de dosagem para a correspondente cavidade da placa celular resultando numa concentração de DMSO de 0,2% e um volume final de 111 pL. Adicionar 11 pL de meio às colunas de controlo (coluna 12) e às colunas de fundo (coluna 1). Incubar as células com o composto para a 37°C, 5% de C02 durante 72 ou 96 h (Para Hl97 5, 786-0, HT1080, A2780, A204 e SJSA-1 usar 72 h e para U87MG usar 96 h.

Preparar o reagente CellTiter-Glo (Promega, Cat.: G7571) e adicionar 100 L a cada cavidade após a incubação estar completa, homogeneizar as células através da mistura num agitador orbital durante 2 min e, em seguida, incubar à RT durante 10 min para permitir que o sinal luminescente estabilize. Registar os dados brutos luminescentes com um leitor de placas Wallac Victor V. Calcular os valores de IC50 para o Exemplo 1, usando dados de percentagem de inibição. Uma curva logística de quatro parâmetros ajustada a cada resposta à dose.

Um composto dentro do âmbito da invenção é testado neste ensaio executado substancialmente como acima. Por exemplo, o composto do Exemplo 1 é testado e verificou-se que os valores de IC5o absolutos como fornecidos na Tabela 7. Estes resultados demonstram que os compostos no âmbito da presente invenção são úteis na inibição da proliferação de linhas de células U87MG, H1975, 786-0, A2780, HT-1080, A204, e SJSA-1.

Ensaio Clonogénico de Tumor Oncotest

Usar a recolha Oncotest (GmbH de Freiburg, Alemanha) de xenoenxertos de tumor humano que crescem subcutaneamente em ratos sem pelo imunodeficientes para medir a resposta do Exemplo 1 a uma variedade de tipos de tumor. Os xenoenxertos, transplantados directamente a partir de pacientes a e passados em ratos sem pelo, mantêm a maior parte das características dos tumores do paciente parental, incluindo histologia e sensibilidade a fármacos anticancerígenos que recapitulam a resposta do paciente dador a fármacos anticancerígenos padrão em elevada extensão. Preparar as células tumorais directamente a partir de xenoenxertos de tumores humanos em crescimento em ratos sem pelo. Medir a inibição da formação de colónias independentes de fixação das células tumorais em agar mole. 0 Exemplo de Teste 1 nos modelos de xenoenxerto de tumor humano derivado de paciente mostrados na Tabela 10, que compreende 2 a 10 modelos de 13 histotipos diferentes de tumores humanos, ou seja, cancro da bexiga, do cólon, gástrico, da cabeça e pescoço, pulmão de células não pequenas (adeno, de células escamosas e de células grandes), mama, ovário, pâncreas, próstata, e cancro renal, bem como o melanoma, mesotelioma pleural, e sarcoma, onde md é moderadamente diferenciado, pd é pouco diferenciado, ud é indiferenciado, e wd é bem diferenciado.

Preparação de Suspensões de Células Individuais de Xenotransplantes de Tumores Humanos

Fazer crescer xenoenxertos de tumores humanos sólidos subcutaneamente em passagens em série em ratos sem pelo aplásticos do timo (estirpe NMRI nu/nu) e remover tumores sob condições estéreis, desagregar mecanicamente e, subsequentemente, incubar com uma mistura de enzimas composta por colagenase tipo IV (41 U/ml) , DNase I (125 U/ml), hialuronidase (100 U/ml) e dispase II (1,0 U/mL) em meio RPMI 1640 a 37°C durante 45 minutos. Passar as células através de peneiras com tamanho de malha de 200 prn e 50 prn e lavar duas vezes com tampão PBS estéril. Determinar a percentagem de células viáveis num hemocitómetro Neubauer utilizando a exclusão de azul de tripano.

Procedimento de Ensaio Clonogénico com Células de Xenotransplantes de Tumores Humanos

Realizar o ensaio clonogénico num formato de 24 cavidades de acordo com um ensaio em agar mole de dupla camada modificado (Hamburger e outros, Science 197:461-643, 1997) . A camada inferior é composta por 0,2 ml/cavidade de IMDM (suplementado com 20% (v/v) de soro bovino fetal, 0,01% (w/v), gentamicina) e 0,75% (w/v) de agar. Adicionar 0,8·104 a 5·104 células a 0,2 mL do mesmo meio de cultura suplementado com 0,4% (w/v) de agar e a colocar em placas na camada inferior em placas de 24 cavidades. Aplicar o composto de ensaio por exposição continua (revestimento de fármaco) em 0,2 mL de meio de cultura. Adicionar o revestimento de fármaco 24 horas após semear as células, como solução concentrada 3 vezes. Incluir seis cavidades de controlo não tratadas e 6 concentrações de grupos tratados com o fármaco em triplicado, em cada placa. Incubar as culturas a 37°C e 7,5% de CO2 numa atmosfera humidificada, durante até 20 dias e acompanhar de perto para o crescimento das colónias utilizando um microscópio invertido. Durante este período, o crescimento do tumor in vitro conduz à formação de colónias com um diâmetro > 50 pm. No momento da formação máxima de colónias, contar as colónias com um sistema de análise automática de imagem (OMNICON 3600, Biosys GmbH). Tingir as colónias vitais 24 horas antes da avaliação, com uma solução aquosa estéril de cloreto de 2-(4-iodofenil)-3-(4-nitrofenil)-5-feniltetrazolio (1 mg/ml, 100 μΐ/poço).

Expressar os efeitos do fármaco em termos da percentagem de formação de colónias. Comparar o número médio de colónias nas cavidades tratadas com a contagem de colónias média dos controlos não tratados (expressar o número de colónias relativo pelo valor do teste-versus-grupo de controlo, T/C-valor [%]):

Traçar a concentração do composto contra a contagem relativa de colónias e determinar os valores absolutos de IC50 e IC70, ou as concentrações de fármaco necessárias para inibir a formação de colónias em 50% (T/C=50%) e 70% (T/C=30%), respectivamente, por um ajuste de curva de dois pontos.

Um composto dentro do âmbito da invenção é testado neste ensaio executado substancialmente como acima. Por exemplo, o composto do Exemplo 1 é testado e verificou-se que os valores de IC50 absolutos como fornecidos na Tabela 8. Estes resultados demonstram que os compostos no âmbito da presente invenção são úteis na inibição da proliferação destas linhas de células derivadas de paciente. TABELA 8

Xenoenxertos Humanos examinados no ensaio clonogénico

Modelo de Leucemia E545 KpllOa

Criação da linha de células de Leucemia:

Transduzir células hepáticas embrionárias derivadas de embriões transgénicos, B6.Cg-Tg[IghMyc]22Bri/J (Jackson

Laboratory, Bar Harbor, Me.), com um retrovirus que expressa uma mutação de activação clinicamente isolada de pllOa humano (E545K como uma mudança de aminoácido, G1633A no nível nucleótido) sob o controlo do virai 5' LTR (repetição terminal longa) e expressando GFP (proteína fluorescente verde), sob o controlo do promotor PGK (PGK/GFP G1633A FLAG-pllOa de MSCV6) para criar células de leucemia activadas pelo objectivo. Transferir as células transduzidas para um animal hospedeiro letalmente irradiado. As células transduzidas repovoam as células-tronco hematopoiéticas entre a medula óssea do receptor e resgatam o animal receptor da letalidade induzida por radiação devido à ablação da medula óssea original do receptor. Observar os animais primários resgatados para o desenvolvimento de leucemia através monitorização semanal das contagens de glóbulos brancos numa pequena quantidade de sangue (10 pL) , recolhida retro-orbitalmente. Recolher sangue de animais primários irradiados com leucemia confirmada e passar em série para animais hospedeiros secundários (não-irradiados) , a fim de estabelecer como uma linha de células leucémicas.

Animais Sujeito: Usar ratos fêmea C57BL/6 (Taconic, Cambridge City, Ind.), com 8 a 10 semanas de idade e 20 a 22 g de peso, como animais receptores da leucemia. Aclimatar os animais à dieta normal com baixo teor de gordura (4,5%) antes da inoculação e continuar nessa dieta ad libitum durante a duração do estudo. Identificar os ratos individuais de cada grupo por perfurações na orelha. Inocular os animais com células leucémicas de animais dadores (dia 0).

Modelo de leucemia singénica: A partir de um animal doador previamente inoculado com a linha de células leucémicas de interesse, recolher uma pequena quantidade de sangue retro-orbitalmente (10 pL) e medir o limite de células de leucemia por contagem de glóbulos brancos. A partir de animais com carga leucémica suficiente, recolher o sangue do dador, diluir com solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 500.000 glóbulos brancos por 200 pL e injectar 200 pl retro-orbitalmente por animal no dia 0 para iniciar a leucemia. Distribuir os ratos inoculados com ρΙΙΟα(E545K)/células myc em grupos de cinco para o tratamento com o Exemplo 1 e um grupo de dez para o grupo de controlo tratado com veiculo. No dia 5 até ao dia 11 pós-inoculação, administrar a cada grupo diariamente por sonda oral a dose apenas com veiculo; Exemplo 1 a 5, 10, 20 mg QD do artigo de teste por quilograma de peso corporal (mg/kg). Recolher pelo menos 10 pL de sangue retro-orbitalmente dos animais no dia 12 para avaliar a progressão da leucemia no ensaio de células de leucemia.

Ensaio de Células de Leucemia: Recolha de dez (10) pL de sangue completo de cada animal em estudo e processar num Coulter TQ-Prep de tal modo que os glóbulos vermelhos são lisados e fixar as restantes leucócitos nucleadas para análise. Analisar as células fixadas imediatamente ou armazená-las no escuro a 4°C para análise futura. Submeter a ensaio as células por Separação de Células Activada por Fluorescência (FACS), com um Cytomics FC 500 (Beckman Coulter). Contar as células leucémicas numa região específica da parcela de dispersão-dianteira/dispersão-lateral (FS/SS) em cada amostra (definida como uma região que mostra poucas/nenhumas células leucémicas em animais normais mas células leucémicas significativas nos animais de controlo leucémico). Normalizar estes dados como células leucémicas por unidade de volume de sangue através da utilização de um ponto de corte fixo de Fluorosferas Beckman Coulter Flow-Count por amostra (quantidade uniforme de Fluorosferas originalmente adicionada a cada amostra de sangue inicial onde contagens iguais por amostra seriam equivalentes a um volume igual contado por amostra) .

Artigo de Teste: Numa base semanal, misturar o Exemplo 1 com 1% de hidroxietilcelulose (HEC)/0,25% Polissorbato 80/0,05% de anti-espuma/água purificada e sonicar com um sonicador de sonda para suspender. Refrigerar o artigo de teste formulado a 4°C e armazenar no escuro até ser utilizado (re-suspender antes de cada administração).

Análises Estatísticas: Tabular os dados da citometria de fluxo com software CXP de Beckman Coulter. Determinar a significância estatística dos efeitos do Exemplo 1 com o método de Dunnett, ANOVA de uma via com o grupo de veículo como o grupo de controlo (Software Estatístico Descoberta JMP, SAS Institute).

Um composto dentro do âmbito da invenção é testado neste ensaio executado substancialmente como acima. Por exemplo, o composto do Exemplo 1 é testado e verificou-se que por ter % de valores TGI como apresentado na Tabela 9. Estes resultados indicam que os compostos dentro do âmbito da presente invenção inibem o crescimento de um tumor, cujo crescimento é impulsionado pelo E545K Pl3Ka mutante, uma das mutações de ponto de acesso encontradas em muitos cancros humanos. TABELA 9

Resultados do modelo de leucemia E545Kpll0a para o Exemplo 1

Modelos de Tumores de Xenoenxerto

Expandir células de glioblastoma humano U87MG e células de carcinoma renal humano 786-0, em cultura, recolher e injectar subcutaneamente sobre o flanco traseiro de ratos sem pelo atímicos. Expandir as células de cancro de pulmão de células não pequenas humanas NCI-H1975 em cultura, colher e injectar por via subcutânea η o flanco traseiro de ratos CD-I nu/nu. Preparar o composto de teste num veículo apropriado e administrar por sonda oral quando os tumores estão estabelecidos (7-21 dias após o implante). A resposta do tumor é determinada por medição do volume do tumor realizada duas vezes por semana durante o curso do tratamento. 0 peso corporal é tomado como uma medida geral da toxicidade.

Um composto dentro do âmbito da invenção é testado neste ensaio executado substancialmente como acima. Por exemplo, o composto do Exemplo 1 é testado e verificou-se que tem valores de % TGI como fornecidos na Tabela 10. Estes resultados demonstram que os compostos no âmbito da presente invenção são úteis na demonstração da actividade anti-tumoral dependente da dose nos modelos U87MG, 786-0 e NCI-H 1975.

Determinação de Inibição de Objectivo de Pl3Ka e mTOR In

Vivo

Implantar células de glioblastoma humano U87MG (5χ106) por via subcutânea no flanco de ratos sem pelo atímicos em 0,2 mL de matrigel. Dez dias após a implantação, administrar aos ratos por via oral uma dose de acordo com um curso de tempo, dose única/ponto de tempo único, ou um protocolo de dose de resposta para a determinação do TMED50 (limiar de dose mínima eficaz). Congelar instantaneamente os tumores na colheita e recolher sangue para a determinação da exposição de plasma ao composto de origem e o cálculo do TMEC50 (limiar de dose mínima eficaz) no caso de estudos de resposta à dose. Homogeneizar tumores em 500 pL de tampão de lise XY (10 pg/ml de leupeptina, 10 pg/ml de inibidor de tripsina-quimotripsina, 10 pg/mL de tosilo fenil-alanilo clorometilo cetona, 10 pg/mL de aprotinina, 60 mM de beta-glicerol fosfato, 1% de Triton X100, 25 mM de Tris pH 7,5, 2,5 mM de pirofosfato, 150 mM de NaCl, 2 mM de éster metílico p-tosil-L-arginina, 15 mM de fosfato de para-nitrofenilo, 5 mM de benzamidina, 1 mM de vanadato de sódio, 10 mM de fluoreto de sódio, 50 pg/mL de fluoreto de fenil-metano sulfonilo, 1 mM de 1,4-ditiotreitol (DTT), 15 mM de EDTA pH 8,0, 5 mM de EGTA pH 8,0, 1 pM de Microcistina, 1 pM de ácido ocadáico, e 1 mini-comprimido de inibidor de protease completa de Roche por 10 mL) utilizando um pilão Free Pellet de RNase (Kimble-Kontes). Alíquotar os lisados e ou submeter imediatamente a ensaio ou armazenar a -80°C para testar mais tarde. Usar o formato multiplex de Tecnologia ELISA de Meso Scale Discovery (Gaithersburg, Md.) e medir in vivo a inibição de objectivo de PI3K e mTOR para avaliar os efeitos sobre a fosforilação do local da treonina 308 de AKT, um efector a jusante de PI3K; fosforilação no local da treonina 389 de p70 S6K e no local da serina 240/244 de S6RP, efectores a jusante de mTORCl; a fosforilação do local da serina 473 de AKT, um efector a jusante de mTORC2. Adicionar 20 pg de lisado ao eléctrodo de carbono contendo placas de 96 cavidades pré-manchadas com os anticorpos de captura adequados. Sondar a proteína de interesse, utilizando um anticorpo de detecção etiquetado com ruténio. Passar corrente sobre o eléctrodo na presença de tampão de leitura contendo o co-reagente TPA, e quantificar e registrar a luz gerada por electro-quimiluminescência com o instrumento MSD Sector 6000. Calcular a percentagem de inibição em relação ao grupo de controlo de veículo e realizar a análise ANOVA utilizando o pacote de software JMP para a determinação de significância estatística.

Um composto dentro do âmbito da invenção é testado neste ensaio executado substancialmente como acima. Por exemplo, o composto do Exemplo 1 é testado e verificou-se que a actividade como apresentado na Tabela 11, onde os valores sublinhados indicam significância. Estes resultados indicam que os compostos dentro do âmbito da presente invenção demonstram a capacidade de inibir a PI3K e mTOR in vi vo.

Determinação da Solubilidade

Preparar uma solução de 2 mg/mL do Exemplo 2 em cada um dos meios necessários pesando aproximadamente 1 mg de composto num frasco e adicionar o volume desejado (isto é, 0,5 ml) dos meios correspondentes em cada frasco. Colocar o frasco tapado num misturador rotativo durante a noite (~16 horas) em condições ambientais, de seguida filtrar utilizando filtros de 0,22 pm Ultrafree-MC (Millipore™) e medir o pH do filtrado (medidor de pH Orion 720A). Preparar a amostra para análise por HPLC por transferência de 100 pL do filtrado para um frasco de HPLC e adicionar 900 pL de 50% de solução de acetonitrilo/água. Determinar a solubilidade usando o método de HPLC (fase móvel de HPLC de 15% acetonitrilo com 0,1% de TFA e 85% de água com 0,1% de TFA; coluna Bonus RP, 4,6 x 75 mm, 3,5 cm; detector a 264 nm UV; Coluna de Temperatura = 40°C; Taxa de fluxo 1,5 mL/min; volume de injecção = 1 pi).

Um composto dentro do âmbito da invenção é testado neste ensaio executado substancialmente como acima. Por exemplo, o composto do Exemplo 2 foi testado e verificou-se que os resultados de solubilidade como apresentados na Tabela 12. Estes resultados indicam que o Exemplo 2 demonstra a solubilidade desejável sobre o pH fisiológico do tracto gastrointestinal (GIT). Esta propriedade fisico-quimica vai ajudar a evitar a variabilidade da exposição em pacientes oncológicos, a quem provavelmente serão administrados vários medicamentos, como os inibidores da bomba de protões (PPI), que podem resultar em interacções medicamentosas com fármacos que têm solubilidade variável sobre o pH fisiológico do GIT. Isso ocorre porque as mudanças no pH do estômago (ou seja, os doentes a tomar ou não PPI ou efeitos do alimento) pode resultar em variabilidade da exposição devido a diferenças de solubilidade. A evitação de potenciais interacções fármaco-fármaco é especialmente importante na área da oncologia, por causa dos numerosos fármacos que os doentes com cancro geralmente recebem ao mesmo tempo, a estreita janela terapêutica de muitos fármacos anti-cancro e a maior variabilidade inter e intra indivíduo em pacientes. Um composto que tem a solubilidade desejável também evita a necessidade de formulações complexas e dispendiosas que podem ser utilizadas para aumentar a exposição sistémica necessária para a eficácia devido à baixa solubilidade ou reduzir a variabilidade de exposição devido a efeitos alimentares e PPI.

Propriedades Farmacocinéticas em Cães Cães da raça Beagle são rotineiramente utilizado para determinar de parâmetros de exposição e farmacocinéticos in vivo de produtos farmacêuticos.

Enquanto a fisiologia gastrointestinal canina difere em alguns aspectos daquela dos seres humanos, é útil para prever a absorção do fármaco e identificar potenciais problemas com a farmacocinética não linear.

Para determinar os parâmetros farmacocinéticos do Exemplo 1 em cães, a machos e fêmeas (até 4 animais por dose, em estudos separados) é administrado o Exemplo 1 por meio de sonda oral numa suspensão em água purificada a 1% hidroxietilcelulose, 0,25% polissorbato 80, 0,05% de anti-espuma ("suspensão HEC"). A gama de doses administradas está entre 1 e 12 mg/kg, numa suspensão de HEC.

As amostras de sangue são recolhidas em tubos contendo ácido etilenodiaminotetracético de potássio de cada cão a 0 (antes da dose), 0,5, 1, 2, 4, 8 e 24 horas após a dose. Alguns estudos também incluem amostras recolhidas nos pontos no tempo 0,25 h e 12 hr. Estas amostras são centrifugadas para obter plasma, o qual é subsequentemente congelado antes da análise. As amostras são submetidas a precipitação de proteína e os extractos são analisados para determinar a presença do Exemplo 1 por cromatografia líquida/espectrometria de massa em tandem, utilizando um espectrómetro de massa PE-Sciex API4000. As curvas padrão variam entre 1 a 5000 ng/mL. As concentrações de plasma acima do limite superior de quantificação são determinadas por diluição. As concentrações moderadas do Exemplo 1 são armazenadas em Watson v.7.4, um sistema validado de Gestão de Informação de Laboratórios utilizado para armazenar e gerir dados electrónicos, e os parâmetros farmacocinéticos são calculados pela análise não compartimentada usando o software WATSON.

Um composto dentro do âmbito da invenção é testado neste ensaio executado substancialmente como acima. Por exemplo, o composto do Exemplo 1 é testado e verificou-se a média AUC como apresentada na Tabela 13. Os valores da área sob a curva (AUC) do Exemplo 1 aumentam linearmente com a dose no intervalo de 1 a 12 mg/kg como mostrado na tabela abaixo. A análise de regressão linear dos valores de AUC individuais resulta numa correlação de determinação de R2 de 0,86 e uma equação linear de y=1474,3x+44,311. A análise de regressão linear dos valores médios de AUC para cada dose resulta numa correlação de determinação R2 0,96 e uma equação linear de y=1544,7x-735,34. Estes resultados indicam que os compostos dentro do âmbito da presente invenção têm propriedades farmacocinéticas lineares em cães com mais de uma gama de doses farmacologicamente relevantes, com nenhuma evidência de saturação da absorção. Esta é uma propriedade favorável para o desenvolvimento de medicamentos e administração clínica, permitindo aumentos previsíveis na exposição sistémica com a administração oral.

Lisboa, 13 de Fevereiro de 2015

Claims (7)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um composto que é 8-[5-(1-hidroxi-l-metiletil)piridin-3-il]-1-[ (2S)-2-metoxipropil]-3-metil- 1,3-dihidro-2H-imidazo[4,5-c]quinolin-2-ona, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
2. 2. 0 composto de acordo com a reivindicação 1, que é 8-[5-(1-hidroxi-l-metiletil)piridin-3-il]-1-[(2 S)-2- metoxipropil]-3-metil-l,3-dihidro-2H-imidazo[4,5— c]quinolin-2-ona.
3. 3. 0 composto de acordo com a reivindicação 2 que é 8-[5-(1-hidroxi-l-metiletil)piridin-3-il]-1-[(2 S)-2- metoxipropil]-3-metil-l,3-dihidro-2H-imidazo[4,5-c]quino-lin-2-ona na forma cristalina caracterizada por um padrão de difracção em pó de raios-X com picos característicos, em 2Θ±0,2, ocorrendo a 8,57 e um ou mais de 9,06, 15,93, 18,29, e 18,87 .
4. 4. Uma composição farmacêutica compreendendo o composto ou um sal de acordo com as reivindicações 1-3, e um veiculo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
5. 5. O composto ou sal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3 para utilização em terapia.
6. 6. O composto ou sal de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3 para utilização no tratamento do cancro.
7. 7. 0 composto ou sal para uso de acordo com a reivindicação 6, no qual o cancro é seleccionado do grupo que consiste em cancro da bexiga, cancro do cólon, cancro gástrico, cancro da cabeça e pescoço, NSCLC, cancro da mama, melanoma, cancro do ovário, cancro do pâncreas, cancro da próstata, glioblastoma, cancro do pulmão, cancro renal, sarcoma, cancro de tecido linfóide e hematopoiético, cancro do sistema nervoso central, cancro cervical, cancro do endométrio, cancro do fígado, cancro da pele, cancro do estômago, cancro da tiróide, cancro do tracto aerodigestivo superior e cancro urinário. Lisboa, 13 de Fevereiro de 2105 REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor, A mesma não faz parte do documento da patente Europeia, Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito, Documentos de patentes citadas na Descrição •WO 2010038165 A · WO 2010139747 A • WO 2010139731 A Literatura que não é de patentes citada na Descrição P<$TAM3u *t al. Haa&HXft Sa&s; “ HAMBURGER «f «í Síis-rss» vo? W «tw; ÍJk*í VCHAíVV^y-¥CH. 461-641 £M£ “ ABUÍÍOfò «1 «t)«; i u# Pti&mettmtm £508, vôi SJS, SÊROÊ 8í«{.R6arína<t,«^i>c,* jott*n&o( Mh 1IM5S J^sfy 1377, vsl 60 * QKgSSííAN 4 síst .00 a. lySO, v® ·0{ΐ), 11-21 Roro^fccsr ?>*§ SdOfKiO «Λ5 ^ísciíco OÍ Mísí* Co 2055