PT2493843E - Ácido 2-amino-3-metil-hex-5-enoico e seu uso na produção de péptidos, tais como bacitracinas - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "ÁCIDO 2—AMINO—3—METIL—HEX—5—ENOICO E SEU USO NA PRODUÇÃO DE PÉPTIDOS, TAIS COMO BACITRACINAS"

Campo da Invenção A presente invenção refere-se a novos compostos de aminoácidos.

Antecedentes da Invenção A maioria das proteínas é composta por 20 diferentes a-aminoácidos: Alanina, Arginina, Asparagina, Ácido

Aspártico, Cisteína, Glutamina, Glutamato, Fenilalanina, Glicina, Histidina, Isoleucina, Lisina, Leucina, Metionina, Prolina, Serina, Treonina, Triptofano, Tirosina, e Valina.

No entanto, existem muitos péptidos biologicamente ativos compreendendo outros aminoácidos, tais como: Homocisteína, ornitina, 4-Hidroxiprolina, 5-Hidroxilisina,

Selenocisteína, Formilmetionina, Fosfosserina,

Acetilserina, Metilarginina, etc.

Os aminoácidos na configuração D são comuns em peptídeos bacterianos sintetizados de modo não-ribossómico e menos comuns em proteínas sintetizadas de modo ribossómico. Por exemplo, nas bacitracinas não sintetizadas ribossomicamente, os resíduos de aminoácidos na posição 4, 7, 9 e 11 estão geralmente em configuração D (Glu, Orn, Phe e Asp) . As bacitracinas são antibióticos peptídicos produzidos naturalmente pelo Bacillus satbtilis e Bacillus licheniformis. Várias bacitracinas foram identificadas, das quais a Bacitracina A é de importância primordial e é altamente ativa (Biochemistry, vol. 39 n° 14, de 2000, página 4037-45 de Epperson e Ming). A estrutura primária da Bacitracina A é NH2-L-Ilei-L-Tiazolina2-L-Leu3-D-Glu4-L-Ile5-L-Lys6-D-Orn7-LIle8-D-Phe9-L-Hisio-D-Aspn-L-Asni2-COOH a qual é ciclizada entre o grupo ε-amino de L-Lys6 e o grupo R-carboxilo de L-Asni2.

Estado da Técnica Vários péptidos sintetizados não ribossomicamente compreendem aminoácidos incomuns. Por exemplo, a ciclosporina A compreende ácido 2 (S)-amino-3(R)-hidroxi-4(R)-metil-6(E)-octenoico que é crucial para a ligação ao recetor intracelular de ciclofilina, e, portanto, para a sua atividade imunossupressora (Journal of Biological Chemistry, vol. 268 n° 35, 1993 de Offenzeller et al) . Vários aminoácidos incomuns assemelham-se à estrutura de isoleucina: O ácido 2-amino-5-metil-5-hexenóico, um novo análogo de metionina, foi isolado a partir de um caldo de fermentação de Streptomyces (Journal of Antibiotics, vol. 32, n°. 11, página 1118-1124, 1979 de Takeuchi et al) . • a 4 metileno-norleucina e o ácido 2-aminohept-6-enoico são compostos com a fórmula: C7H13NO2. • a 4 metil-norleucina é um derivado de isoleucina que pode ser incorporado numa proteína recombinante. (J Pharm Biomed Anal, vol 31, n° 5, 2003, página 979-987 de Muramatsu et al). • o ácido 2-amino-3-metil-4-pentanoico é um análogo isoleucina insaturado que pode ser incorporado em proteínas (Chembiochem, vol. 7, n° 1, 2006, página 83-87 de Mock et al). • as norleucinas insaturadas de Amanita solitaria. Estudos químicos e farmacológicos (Lloydia vol. 36 n° 2, 1973, página 69-73 de Chilton et al) . • Beta-metilnorleucina, urn antimetabolito produzido por Serratia marcescens (J Antibiot, vol. 34, n° 10, 1981 página 1278-82 de Sugiura et al) • US6168912 descreve vários derivados de alilo de aminoácidos para uso numa biblioteca de química combinatória multidimensional. • alilglicina e crotilglicina são descritas em

Journal of Bacteriology, vol. 148, n° 1, 1981 de

Kunz et al.

Sumário da invenção A invenção refere-se ao composto do ácido 2-amino-3-metil-hex-5-enoico.

Apesar de usarmos o nome ácido 2-amino-3-metil-hex-5-enoico, o termo abrange o mesmo composto como ácido 2-amino-3-metil-5-hexanóico. A estrutura deste composto de aminoácido na sua forma livre é representada pela Fórmula I:

A Fórmula I não é para ser interpretada como uma projeção de Fischer, mas sim como um composto sem especificação da estereoquímica. 0 aminoácido da Fórmula I compreende dois átomos de carbono quirais. A presente invenção abrange os quatro estereoisómeros do ácido 2-amino-3-metil-hex-5-enoico: (2S,3S)-2-amino-3-metil-hex-5-enoico, (2R,3S)-2-amino-3-metil-hex-5-enoico, (2S,3R)-2-amino-3-metil-hex-5-enoico, e (2R,3R)-2-amino-3-metil-hex-5-enoico.

Além disso, a presente invenção abrange os sais do ácido 2-amino-3-metil-hex-5-enoico.

Propomos e usamos o nome de 5-Metileno-Isoleucina para o ácido 2-amino-3-metil-hex-5-enoico. Consequentemente, a cadeia lateral 5-Metileno-Isoleucina tem a estrutura CH (CH3) CH2CH=CH2, que pode ser representada como

A invenção também diz respeito à utilização de 5-Metileno-Isoleucina para produzir Bacitracinas e um processo para a preparação da 5-Metileno-Isoleucina. A 5-Metileno-Isoleucina pode ser utilizada para a produção de Bacitracina Jl, Bacitracina J2, Bacitracina J3, Bacitracina Kl, Bacitracina K2, Bacitracina K3 e

Bacitracina L.

Os aspetos da invenção podem ser obtidos através das caracteristicas tal como estabelecidas na descrição que se segue da invenção e/ou das reivindicações de patente em anexo.

Descrição detalhada da invenção

Algumas Bacitracinas altamente ativas compreendem uma cadeia lateral de aminoácidos incomuns que tem a seguinte estrutura:

Propusemos e usamos os nomes Bacitracina J, K ou L para Bacitracinas compreendendo a estrutura acima. As estruturas destas bacitracinas estão representadas nas Figuras 1A-G.

Definições "Bacitracinas" são compostos peptídicos que compreendem a seguinte estrutura (com a numeração de resíduos de aminoácidos em sobrescrito):

em que X é

e, em que R é a cadeia lateral do resíduo de aminoácido de isoleucina, Valina ou 5-Metileno-Isoleucina; e em que Y e Z são, independentemente, o resíduo de aminoácido de

Isoleucina, Valina ou 5-Metileno-Isoleucina; e em que

Thz é um anel tiazolina

acoplado em 2' a X e acoplado em 4' ao α-carbono em Leu; e em que

Leu é um resíduo de aminoácido de Leucina

Glu é um resíduo de aminoácido de Glutamina

Lys é um resíduo de aminoácido de Lisina que forma ligações peptídicas com Y e Orn enquanto que a sua ε-amina é acoplada ao grupo α-carboxilo da Asparagina por uma ligação peptídica

Orn é um resíduo de aminoácido de Ornitina

Phe é um resíduo de aminoácido de Fenilalanina

His é um resíduo de aminoácido de histidina

Asp é um resíduo de aminoácido de ácido Aspártico

Asn é um resíduo de aminoácido de Asparagina que forma a ligação peptídica com Asp enquanto que o seu grupo a- carboxilo é acoplado à ε-amina de Lisina por uma ligação peptídica.

Quando usado neste pedido de patente; o termo "Bacitracinas" pretende abranger qualquer composto que possua a estrutura primária acima, independentemente do método de produção. Assim, o termo "Bacitracinas" inclui os compostos antibióticos produzidos naturalmente por Bacillus licheniformis, mas também os compostos produzidos in vitro (sintéticos) e os compostos semi-sintéticos que têm a estrutura primária acima. 0 termo "Bacitracinas" também pretende abranger qualquer composto que possua a estrutura primária acima, independentemente da carga que varia com o pH. "Bacitracinas" também pretende abranger qualquer composto que possua a estrutura primária acima, independentemente da estereoquimica. "Bacitracinas" também pretende abranger os sais e hidratos dos compostos que têm a estrutura primária acima. 0 termo "Bacitracinas compreendendo pelo menos um residuo de 5-Metileno-Isoleucina" pretende abranger qualquer Bacitracina compreendendo a estrutura que seria gerada se um resíduo (s) de Isoleucina ou Valina fosse(m) substituído por residuo(s) de 5-Metileno-Isoleucina na posição 1 e/ou 5 e/ou 8 .

Quando o grupo amino N-terminal e/ou o anel de tiazolina de Bacitracinas é oxidado, uma quantidade substancial da atividade antibacteriana é perdida. Por exemplo, o composto com atividade baixa de Bacitracina F, compreende uma porção de ceto-tiazol em vez da porção de amino-tiazolina (J. Org. Chem, vol. 22, 1957, página 1345-1353 de Craig et ai). 0 termo "aminoácido" é qualquer composto que compreende tanto um grupo amina como carboxilo. A maioria das proteínas é construída como um polímero linear de 20 a- aminoácidos padrão diferentes na configuração L: Alanina,

Arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteina, glutamina, glutamato, fenilalanina, glicina histidina, isoleucina, lisina, leucina, metionina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina e valina.

Um "resíduo de aminoácido" é a unidade num péptido que compreende -NH-CHR-COOH (C-terminal) ou NH2-CHR-CO- (N-terminal) ou -NH-CHR-CO- (interno) em que R é H em Glicina, CH3 em Alanina, OH em serina, CH2SH em Cisteina, CH (CH3) CH2CH3 em Isoleucina, CH2CH (CH3) 2 em Leucina CH (CH3) 2 em Valina etc.

Uma "cadeia lateral de aminoácidos" representa o grupo R de um "resíduo de aminoácidos". Por exemplo, o grupo R é CH (CH3) CH2CH3 em Isoleucina, CH2CH (CH3) 2 em Leucina CH (CH3) 2 em Valina. "Atividade antibacteriana" é qualquer atividade que inibe o crescimento, metabolismo ou reprodução de bactérias, ou aumente a mortalidade de bactérias, ou reduz a patogenicidade de bactérias.

As "posições" dos resíduos de aminoácidos nas Bacitracinas são numeradas a partir do N-terminal que pode ser Isoleucina, Valina ou 5-Metileno-Isoleucina na posição 1 (a extremidade esquerda em todas as figuras que mostram Bacitracinas neste pedido de patente). Assim, Lys está na posição número 6 e Asn está na posição número 12.

Nas Bacitracinas, a "posição 1" é especial, porque este resíduo de aminoácidos é parcialmente incorporado no anel tiazolina. Assim, o resíduo de aminoácido na posição 1 em Bacitracinas não compreende a unidade N-terminal habitual: mas compreende em vez disso: acoplado a Tiazolina.

Uma "composição" é qualquer mistura compreendendo mais do que dois compostos diferentes, por exemplo uma mistura de dois ingredientes farmacêuticos ativos, ou uma mistura de um ingrediente farmacêutico ativo e um ou mais excipientes farmacêuticos.

Uma "composição farmacêutica" é qualquer composição adequada para utilização in vivo. Tais composições podem, portanto, ser administradas cutaneamente, subcutaneamente, intravenosamente, parentericamente, etc. A 5-Metileno-Isoleucina compreende dois átomos de carbono quirais que poderiam ser independentemente na configuração R ou S.

As Bacitracinas compreendendo pelo menos um resíduo de 5-Metileno-Isoleucina na posição 1, 5 ou 8 podem ser utilizadas para inibir o crescimento de bactérias indesejáveis, tanto in vitro como in vivo. Estes compostos podem, assim, ter um efeito terapêutico se administradas a um animal ou um ser humano com uma infeção bacteriana. A invenção refere-se ao composto 5-Metileno-Isoleucina, que poderia ser utilizado para a produção das novas Bacitracinas; por exemplo, por síntese in vitro de Bacitracina Jl-3, Kl-3 ou L.

Por substituição da Isoleucina ou Valina por 5-Metileno-Isoleucina nos métodos descritos em J. Org Chem, vol. 61, n° 12, 1996, páginas 3983-3986 de Lee et ai ou W0199747313, as Bacitracinas com atividade antibacteriana podem ser produzidas.

Breve Descrição das Figuras A Figura IA mostra a estrutura de Bacitracina com um resíduo de 5-Metileno-Isoleucina na posição 5 (= Bacitracina Jl) A Figura 1B mostra a estrutura de Bacitracina com um resíduo de 5-Metileno-Isoleucina na posição 8 (= Bacitracina J2) A Figura 1C mostra a estrutura de Bacitracina com um resíduo de 5-Metileno-Isoleucina na posição 1 (= Bacitracina J3) A Figura ID mostra a estrutura de Bacitracina com resíduos de 5-Metileno-Isoleucina nas posições 5 e 8 (=

Bacitracina Kl) A Figura 1E mostra a estrutura de Bacitracina com resíduos de 5-Metileno-Isoleucina nas posições 1 e 5 (=

Bacitracina K2) A Figura 1F mostra a estrutura de Bacitracina com resíduos de 5-Metileno-Isoleucina nas posições 1 e 8 (=

Bacitracina K3) A Figura 1G mostra a estrutura de Bacitracina com resíduos de 5-Metileno-Isoleucina nas posições 1, 5 e 8 (= Bacitracina L) A Figura 2 mostra uma via para a produção de 5-Metileno-Isoleucina, tal como divulgado nos exemplos A invenção é definida pelas reivindicações e não pelos seguintes exemplos ilustrativos:

Exemplos

Exemplo 1: 0 éster metílico do ácido (2 S,3R)-2-(1,3-dioxo-l,3-di-hidro-isoindol-2-il)-3-metil-hex-5-enoico e o brometo Vinilmagnésio do éster metílico do ácido (2S,3S)-2-(1,3-dioxo-1,3-di-hidro-isoindol-2-il)-3-metil-hex-5-enoico em THF (1,0 M, 83, 64 mL, 83, 64 mmol) é adicionado a uma mistura pré-aquecida (-10 °C) de éster metílico de (2S,3S) e (2 S,3R)-4-iodo-N-ftaloilvalina (26, 96 g, 69, 68 mmol), CuCl2 (0,47 g, 3,5 mmol), LiCl seco (0,29 g, 7,0 mmol) em THF (100 mL). A mistura de reação é agitada durante a noite a esta temperatura. A mistura de reação é adicionada a solução saturada de cloreto de amónio (aq) (300 mL) . As fases são separadas e a fase aquosa é extraída com éter dietílico (3 x 100 mL) . As fases orgânicas combinadas são lavadas com solução salina saturada (100 mL), secas (MgSCh) e os solventes são removidos sob pressão reduzida. 10 g da mistura de produto são isolados e os produtos de (2S,3S) e (2S,3R) são separados por cromatografia em coluna.

Exemplo 2: Ácido (2S, 3R)-2-Amino-3-metil-hex-5-enoico Éster metilico do ácido (2S,3R)-2-(1,3-dioxo-l,3-di-hidro-isoindol-2-il)-3-metil-hex-5-enoico (2,01 g, 7,00 mmol) é dissolvido numa mistura 2:1 de ácido clorídrico 6 N e ácido acético glacial (62,5 mL), e a solução é aquecida a refluxo durante 4 h. A solução é arrefecida até à temperatura ambiente e concentrada sob pressão reduzida. O produto é retomado em água e a solução é filtrada. O filtrado é concentrado sob pressão reduzida e o resíduo é dissolvido em água, em seguida, a solução é aplicada a uma coluna de resina Amberlite IR 120 de permuta catiónica (forma NH4+) . A coluna é lavada com água (2,5 L), em seguida eluiu-se com solução aquosa de amoníaco (2,5 L). O eluato é fervido até que nenhum amoníaco seja detetado, em seguida, é concentrado sob pressão reduzida proporcionando o composto do título (0,5 g, 3,50 mmol).

Exemplo 3: Ácido (2 S,3S)-2-Amino-3-metil-hex-5-enoico Éster metilico do ácido (2S,3S)-2-(1,3-dioxo-l,3-di-hidro-isoindol-2-il)-3-metil-hex-5-enoico (2,01 g, 7,00 mmol) é dissolvido numa mistura 2:1 de ácido clorídrico 6 N e ácido acético glacial (62,5 mL), e a solução é aquecida a refluxo durante 4 h. A solução é arrefecida até à temperatura ambiente e concentrada sob pressão reduzida. 0 produto é retomado em água e a solução é filtrada. 0 filtrado é concentrado sob pressão reduzida e o resíduo é dissolvido em água, em seguida, a solução é aplicada a uma coluna de resina Amberlite IR 120 de permuta catiónica (forma NH4+) . A coluna é lavada com água (2,5 L), em seguida eluiu-se com solução aquosa de amoníaco (2,5 L). O eluato é fervido até que nenhum amoníaco seja detetado, em seguida, é concentrado sob pressão reduzida proporcionando o composto do título (0,5 g, 3,50 mmol).

Exemplo 4: Éster metílico do ácido (2R, 3R)-2-(1,3-Dioxo-l,3-di-hidro-isoindol-2-il)-3-metil-hex-5-enoico e éster metílico do ácido (2R,3S)-2-(1,3-dioxo-l,3-di-hidro-isoindol-2-il) -3-metil-hex-5-enoico

Brometo de Vinilmagnésio em THF (1,0 M, 83, 64 mL, 83,64 mmol) é adicionado a uma mistura pré-arrefecida (-10 °C) de éster metílico de (2S, 3S) e (2Sr 3R) -4-Iodo-JV-ftaloilvalina (26,96 g, 69,68 mmol), CuCÍ2 (0,47 g, 3,5 mmol), LiCl seco (0,29 g, 7,0 mmol) em THF (100 mL). A mistura de reação é agitada durante a noite a esta temperatura. A mistura de reação é adicionada a solução saturada de cloreto de amónio (aq) (300 mL) . As fases são separadas e a fase aquosa é extraída com éter dietílico (3 x 100 mL). As fases orgânicas combinadas são lavadas com solução salina saturada (100 mL), secas (MgSCh) e os solventes são removidos sob pressão reduzida. 10 g do produto da mistura são isolados. Os produtos de (2R,3S) e (2R,3R) são separados por cromatografia em coluna.

Exemplo 5: Ácido (2R,3R)-2-Amino-3-metil-hex-5-enoico Éster metílico do ácido (2R,3R)-2-(1,3-dioxo-l,3-di-hidro-isoindol-2-il)-3-metil-hex-5-enoico (2,01 g, 7,00 mmol) é dissolvido numa mistura 2:1 de ácido clorídrico 6 N e ácido acético glacial (62,5 mL), e a solução é aquecida a refluxo durante 4 h. A solução é arrefecida até à temperatura ambiente e concentrada sob pressão reduzida. O produto é retomado em água e a solução é filtrada. O filtrado é concentrado sob pressão reduzida e o resíduo é dissolvido em água, em seguida, a solução é aplicada a uma coluna de resina Amberlite IR 120 de permuta catiónica (forma NH4+) . A coluna é lavada com água (2,5 L), em seguida eluiu-se com solução aquosa de amoníaco (2,5 L). O eluato é fervido até que nenhum amoníaco seja detetado, em seguida, é concentrado sob pressão reduzida proporcionando o composto do título (0,5 g, 3,50 mmol).

Exemplo 6: Ácido (2R,3S)-2-Amino-3-metil-hex-5-enoico Éster metílico do ácido (2R,3S)-2-(1,3-dioxo-l,3-di-hidro-isoindol-2-il)-3-metil-hex-5-enoico (2,01 g, 7,00 mmol) é dissolvido numa mistura 2:1 de ácido clorídrico 6 N e ácido acético glacial (62,5 mL), e a solução é aquecida a refluxo durante 4 h. A solução é arrefecida até à temperatura ambiente e concentrada sob pressão reduzida. O produto é retomado em água e a solução é filtrada. O filtrado é concentrado sob pressão reduzida e o resíduo é dissolvido em água, em seguida, a solução é aplicada a uma coluna de resina Amberlite IR 120 de permuta catiónica (forma NH4+) . A coluna é lavada com água (2,5 L), em seguida eluiu-se com solução aquosa de amoníaco (2,5 L). 0 eluato é fervido até que nenhum amoníaco seja detetado, em seguida, é concentrado sob pressão reduzida proporcionando o composto do título (0,5 g, 3,50 mmol).

Lisboa,

Claims (11)

1. REIVINDICAÇÕES 1. 0 composto do ácido 2-amino-3-metil-hex-5-enoico e seus sais.
2. 2. Um composto de acordo com a reivindicação 1, tendo uma configuração (2S,3S).
3. 3. Um composto de acordo com a reivindicação 1, tendo uma configuração (2R,3S).
4. 4. Um composto de acordo com a reivindicação 1, tendo uma configuração (2S,3R).
5. 5. Um composto de acordo com a reivindicação 1, tendo uma configuração (2R,3R).
6. 6. Utilização do ácido 2-amino-3-metil-hex-5-enoico para a produção de um péptido.
7. 7. Utilização de acordo com a reivindicação 6, em que o péptido é uma Bacitracina.
8. 8. A composição compreendendo o ácido 2-amino-3-metil-hex-5-enoico.
9. 9. Método para a produção de ácido 2-amino-3-metil-hex-5-enoico compreendendo um acoplamento cruzado de um agente de vinilo de Grignard com um halogeneto de alquilo.
10. 10. Um método de acordo com a reivindicação 9, em que a reação é catalisada por LÍ2CUCI4.
11. 11. Um método de acordo com a reivindicação 10, em que o halogeneto de alquilo é éster metilico de 4-iodo-JV-ftaloilvalina. Lisboa,