PT2101760E - Formulações de dose unitária e métodos de tratamento da trombose com um inibidor oral do fator xa - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "FORMULAÇÕES DE DOSE UNITÁRIA E MÉTODOS DE TRATAMENTO DA TROMBOSE COM UM INIBIDOR ORAL DO FATOR XA"

Referência cruzada a aplicações relacionadas

Esta aplicação reivindica o beneficio sob 35 C.E.U.A. § 119(e) das Aplicações de Patente Provisional dos Estados Unidos Nos. 60/873,792 depositada em 8 dezembro, 2006 e 60/947,629 depositada em 2 julho, 2007, ambas as quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade.

Antecedentes da invenção Área da invenção

Esta invenção é direcionada a métodos de inibição da coagulação usando uma dose particular de um inibidor do fator Xa. A invenção é também direcionada a um ensaio que mede a geração de trombina no sangue para avaliar a atividade antitrombótica de um composto de teste.

Estado da Técnica A hemostasia, o controlo da hemorragia, ocorre por meio cirúrgico, ou pelas propriedades fisiológicas da vasoconstrição e da coagulação. Embora as plaquetas e a coagulação do sangue estejam ambos envolvidos na restauração da hemostasia e em doenças trombóticas, certos componentes da cascata de coagulação são principalmente responsáveis pela amplificação e aceleração dos processos envolvidos na agregação das plaquetas e na deposição da fibrina as quais são grandes eventos na trombose e na hemostasia. A formação de coágulos envolve a conversão do fibrinogénio na fibrina a qual polimeriza numa rede para restaurar a 2 hemostasia após a lesão. Um processo similar resulta em vasos sanguíneos obstruídos em doenças trombóticas. A conversão do fibrinogénio na fibrina é catalisada pela trombina, o produto final de uma série de reações na cascata de coagulação do sangue. A trombina é também um jogador-chave na ativação das plaquetas, contribuindo desse modo para a trombose sob condições de fluxo sanguíneo quer arterial, quer venoso. Por estas razões, tem sido postulado que a regulação eficaz da trombina pode levar à regulação eficaz da trombose. Várias classes de anticoagulantes correntemente usados afetam diretamente ou indiretamente a trombina (i.e. heparinas não fracionadas, heparinas de baixo peso molecular, compostos tipo heparinas, pentassacarídeo e varfarina). A inibição direta ou indireta da atividade da trombina tem sido também o foco de uma variedade de anticoagulantes no desenvolvimento clínico (revista por Eriksson e Quinlan, Drugs, 11: 1411-1429, 2006) . A protrombina, o precursor da trombina, é convertida na enzima ativa pelo fator Xa (fXa). A geração do fator Xa mediada pela ativação localizada do fator de tecido/fator Vila é amplificada pelo complexo fator IXa/VIIIa e leva à montagem da protrombinase em plaquetas ativadas. O fator Xa, como uma parte do complexo de protrombinase, é a única enzima responsável pela formação sustentada da trombina na vasculatura. O fator Xa é uma protease de serina, a forma ativada do seu precursor Fator X, e um membro dos fatores de ligação ao ião de cálcio, contendo ácido carboxiglutâmico alfa (ALG), dependentes da vitamina K, e da coagulação do sangue. Ao contrário da trombina, que atua numa variedade de substratos de proteína incluindo fibrinogénio e os recetores RAP (recetores ativados por protease, Coughlin, J. Thrombosis Haemostasis 3: 1800-1814, 2005), o fator Xa parece ter um único substrato 3 fisiológico, nomeadamente a protrombina. Uma vez que uma molécula do fator Xa pode ser capaz de gerar mais do que 1000 moléculas de trombina (Mann, et al.r J. Thrombosis. Haemostasis 1: 1504-1514, 2003), a inibição direta do fator Xa como uma maneira de indiretamente inibir a formação da trombina pode ser uma estratégia anticoagulante eficaz. Esta afirmação é baseada no papel-chave da protrombinase na sintese da trombina e no facto de que a inibição da protrombinase terá um efeito pronunciado na agregação de plaquetas e nas vias de coagulação globais.

As proteases ativadas tais como fator Vila, fator IXa ou fator Xa têm atividade proteolitica pobre por conta própria. No entanto, a sua montagem nos complexos dependentes de cofator, ligados à membrana intensifica significativamente as suas eficácias catalíticas. Este efeito é mais pronunciado para o fator Xa, onde a eficácia é aumentada por um fator de 105 (Mann, et al., Blood 76(1): 1-16, 1990) . Devido à concentração mais alta dos zimogéneos presentes no sangue (1,4 μΜ de protrombina versus 150 nM de fator Xa) e à cinética de ativação, uma quantidade mais pequena do fator Xa do que da trombina necessita de ser inibida para alcançar um efeito anticoagulante. Prova indireta da hipótese da superioridade do fator Xa como um alvo terapêutico em comparação com a trombina pode ser também encontrada em ensaios clínicos para a prevenção da trombose venosa profunda. Provou-se que o fondaparinux, um inibidor do fator Xa dependente da antitrombina III, era superior à enoxaparina (uma heparina de baixo peso molecular que inibe ambos a trombina e o fator Xa). Portanto, tem sido sugerido que compostos que seletivamente inibem o fator Xa podem ser úteis como agentes de diagnóstico in vitro, ou para administração terapêutica em certas desordens trombóticas, ver e.g., WO 94/13693. 4

Sumário da invenção A modelação comparativa da extensão das mudanças na atividade da protrombinase até níveis de eficácia antitrombótica tem levado à descoberta da atividade terapêutica em humanos de inibidores do fator Xa. Esta invenção é direcionada a um método de inibição da coagulação num paciente humano usando uma quantidade inibidora da coagulação de um inibidor do fator Xa. Especificamente, um inibidor direto oralmente disponível do fator Xa é eficaz na inibição da coagulação num paciente humano quando administrado ao paciente numa quantidade diária agregada de entre 0,2 e 2,0 miligramas por quilograma com base no peso total do paciente ("mg/kg"). É contemplado que esta dose irá ser particularmente eficaz para o inibidor do fator Xa da Fórmula II descrita abaixo.

Conformemente, a invenção proporciona um composto para uso num método de inibição da coagulação num paciente humano com necessidade dele, em que o composto é da Fórmula II:

II ou um seu sal f armaceuticamente aceitável, e em que o método compreende a administração ao paciente de uma quantidade inibidora da coagulação do referido composto em 5 que a quantidade inibidora da coagulação é uma dose diária agregada de entre 0,2 e 2,0 mg/kg. Tipicamente, a dose diária agregada é entre 0,2 e 1,5 mg/kg ou entre 0,4 e 1,2 mg/kg. Em algumas formas de realização, o sal é um sal de maleato. Numa forma de realização, o sal é o sal de maleato tendo a estrutura da fórmula III: 5

IH

Esta invenção é também direcionada para uma formulação de dose unitária compreendendo uma composição farmacêutica compreendendo um transportador farmaceuticamente aceitável e uma quantidade inibidora da coagulação do composto inibidor do fator Xa da Fórmula II como definida acima ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, por exemplo o sal da Fórmula III. A quantidade inibidora da coagulação é de entre 0,2 e 2,0 mg/kg. Noutras formas de realização, a dose é entre 0,2 e cerca de 1,5 mg/kg ou entre cerca de 0,4 e cerca de 1,2 mg/kg.

Breve descrição das figuras A FIG. IA mostra a correlação da geração de trombina com a razão normalizada internacional (RNI) em pacientes anticoagulados tratados com varfarina. A geração de trombina foi medida a 10 minutos em amostras do plasma de pacientes recebendo terapia de varfarina estável (n = 137). 6

Os dados de pacientes recebendo terapia de varfarina são apresentados como quintis dos resultados da RNI. As barras de erro mostram os erros padrão. A FIG. 1B mostra a correlação da geração de trombina com o tempo da tromboplastina parcial ativada (TTPa) em pacientes anticoagulados tratados com enoxaparina. A geração de trombina no plasma foi medida em 16 pacientes tratados com enoxaparina. As unidades anti-fXa foram medidas por ensaio de BPM COATEST de acordo com as instruções do fabricante. Os grupos foram comparados por teste-t de Student. A FIG. 1C mostra a correlação da geração de trombina com o TTPa em pacientes anticoagulados tratados com heparina não fracionada (HNF). A geração de trombina no plasma foi medida em 15 pacientes. As inidades anti-fXa foram medidas por ensaio de BPM COATEST de acordo com as instruções do fabricante. Os grupos foram comparados por teste-t de Student. A FIG. 2 mostra a inibição responsiva à dose da trombose in vivo no modelo babuino e proporciona evidência de que o ensaio in vitro é preditivo da atividade antitrombótica in vivo. 0 número de plaquetas marcadas na câmara foi normalizado para a contagem de plaquetas pré-infusão para animais individuais. Os dados representam a média ± desvio padrão. A deposição das plaquetas a 140 minutos foi analisada por ANOVA seguida de pós-teste de Dunnett. A dose 3 (26-38 ng/mL) teve uma diminuição significativa em comparação com o controlo (P < 0,05) e a dose 4 (54-88 ng/mL) teve uma diminuição significativa em comparação com o controlo (P < 0,01). 7 A FIG. 3 mostra a inibição responsiva à dose da geração de trombina no sangue total de voluntários humanos saudáveis. 0 sangue total foi tratado com a concentração indicada (em nM) de betrixaban antes da iniciação do teste. São mostradas as unidades de fluorescência relativa resultando da clivagem do substrato de trombina marcado.

As FIGS. 4A e 4B mostram a inibição responsiva à dose da geração de trombina no sangue total de voluntários humanos saudáveis. 0 sangue total foi tratado com a concentração indicada (em nM) de fondaparinux antes da iniciação do teste. A gama de concentração de fondaparinux representada na FIG. 4B corresponde a niveis de anticoagulação terapêutica usados em cirurgia ortopédica e em pacientes com síndroma coronária aguda. São mostradas as unidades de fluorescência relativa resultando da clivagem do substrato de trombina marcado. A FIG. 5 mostra dados de ensaios in vitro realizados com plasma de voluntários humanos saudáveis oralmente doseados com betrixaban. Isto é discutido mais minuciosamente no Exemplo 8. A FIG. 6 mostra a percentagem de pacientes com tromboembolismo venoso (TEV) e intervalos de confiança de 95% para o betrixaban e a enoxaparina como determinado pelo estudo no Exemplo 9 com venografia unilateral entre os Dias 10 e 14 e para os controlos históricos de enoxaparina (B e C) de estudos usando venografia unilateral realizada entre os Dias 10 e 14 após cirurgia ortopédica (substituição total do joelho). Isto é discutido mais completamente no Exemplo 9. Os detalhes do estudo correspondendo a Enox B são relatados em Blood 102 (11); 2003. Os detalhes do estudo correspondendo a Enox C são relatados na referência por Lassen et al. (J Thromb Haemostasis 2007, 15 setembro). A FIG. 7 mostra a redução da geração de trombina de linha de base mediante tratamento com doses variáveis de betrixaban e de enoxaparina ao dia 2, aquando da alta e aquando do venograma. É mostrada a mudança média a partir das unidades de fluorescência relativa da linha de base (± erro padrão da média) na geração de trombina no plasma, por visita e tratamento. Os pacientes com alta no Dia 2 estão também representados no valor médio para esse dia de estudo. A FIG. 8 mostra as mudanças na atividade anti-fXa das doses variáveis de betrixaban e enoxaparina ao dia 2, aquando da alta e aquando do venograma. É mostrada a atividade anti-fXa (U/mL) média (± erro padrão da média), como medida por ensaio de heparina de BMP COATEST, por visita e tratamento. 0 limite detetável para o anti-fXa foi de 0,05 U/mL; os valores abaixo do limite detetável foram definidos para 0,025. Os pacientes com alta no Dia 2 estão também representados no valor médio para esse dia de estudo. A FIG. 9 mostra a concentração de betrixaban no plasma (ng/mL) das doses variáveis de betrixaban ao dia 2, aquando da alta e aquando do venograma.

Descrição detalhada da invenção

Antes das composições e dos métodos serem descritos, é para ser entendido que a invenção não está limitada às metodologias, protocolos, linhas de células, ensaios, e reagentes particulares descritos, pois estes podem variar. É também para ser entendido que a terminologia usada aqui destina-se a descrever formas de realização particulares da presente invenção, e não se destina de modo nenhum a limitar o âmbito da presente invenção como estabelecido nas reivindicações anexadas. 9 A não ser que seja definido de outro modo, todos os termos técnicos e cientificos usados aqui têm os mesmos significados como comummente entendidos por um perito ordinário na técnica à qual esta invenção pertence. Embora possam ser usados quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui na prática ou teste da presente invenção, os métodos, dispositivos, e materiais preferenciais são agora descritos. Todas as publicações técnicas e de patentes citadas aqui são incorporadas aqui por referência na sua totalidade. Nada aqui é para ser interpretado como uma admissão de que a invenção não tem direito a anteceder tal divulgação em virtude de invenção anterior. A prática da presente invenção irá empregar, a não ser que seja indicado de outro modo, técnicas convencionais de cultura de tecido, de imunologia, de biologia molecular, de microbiologia, de biologia celular e de ADN recombinante, as quais estão dentro da perícia da técnica. Ver, e.g., Sambrook e Russell eds. (2001) Molecular Clonlng: A Laboratory Manual, 3a edição; a série Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology; a série Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.I.); MacPherson et al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press na Oxford University Press); MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach; Harlow e Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techigue, 5a edição; Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; Patente dos E.U.A. No. 4,683,195; Hames e Higgins eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization; Hames e Higgins eds. (1984) Transcription and Translation; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986)); Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning; Miller e 10

Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer e Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, Londres); Herzenberg et al. eds (1996) Weir's Handbook of Experimental Immunology; Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3a edição (Cold Spring Harbor Laboratory Press (2002)).

Todas as designações numéricas, e.g., pH, temperatura, tempo, concentração, e peso molecular, incluindo gamas, são aproximações que são variadas (+) ou (-) por incrementos de 0. 1. É para ser entendido, embora nem sempre explicitamente afirmado, que todas as designações numéricas são precedidas pelo termo "cerca de". É também para ser entendido, embora nem sempre explicitamente afirmado, que os reagentes descritos qui são meramente exemplares e que equivalentes de tais são conhecidos na técnica. 1. Definições

De acordo com a presente invenção e como usados aqui, os termos seguintes são definidos com os significados seguintes, a não ser que seja explicitamente afirmado de outro modo.

Como usada na especificação e nas reivindicações, a forma singular "um" e "o" inclui referências plurais a não ser que o contexto dite claramente de outro modo. Por exemplo, o termo "uma célula" inclui uma pluralidade de células, incluindo suas misturas.

Como usado aqui, o termo "compreendendo" ou "compreende" destina-se a significar que as composições e métodos incluem os elementos recitados, mas não excluindo outros. 11 "Consistindo essencialmente em" quando usado para definir composições e métodos deverá significar a exclusão de outros elementos de qualquer significado essencial da combinação para o propósito indicado. Assim sendo, uma composição consistindo essencialmente nos elementos como definido aqui não excluiria contaminantes vestigiais do método de isolamento e purificação e transportadores farmaceuticamente aceitáveis, tais como tampão fosfato salino, conservantes e similares. "Consistindo em" deve significar a exclusão de mais do que contaminantes vestigiais de outros ingredientes e passos do método substanciais para administração das composições desta invenção ou passos de processo para produzir uma composição ou alcançar um resultado pretendido. Formas de realização definidas por cada um destes termos de transição estão dentro do âmbito desta invenção. 0 termo "dose diária agregada" refere-se à quantidade de fármaco ou composto administrada num período de 24 horas. 0 termo "amostra de teste" ou "solução de ensaio" compreende sangue total ou plasma sanguíneo (quer anticoagulado, quer não anticoagulado), fator de tecido ("FT"), um substrato de trombina detetavelmente marcado, e um composto de teste. A solução pode também conter um número de solventes adequados, tal como dimetilosulfóxido (DMSO). Numa forma de realização, o sangue ou plasma na amostra de teste ou na solução de ensaio não é tratado ou titulado com enzimas, incluindo enzimas de veneno de réptil, tal como Reptilase®. Noutra forma de realização, o sangue ou plasma não é rico em plaquetas. 0 termo "fator de tecido" ou FT está presente em tecido subendotelial, plaquetas, e leucócitos e é necessário para o início da formação de trombina a partir da protrombina 12 zimogénea. 0 FT é também referido como tromboplastina, fator III, ou CD142. 0 FT usado nos métodos desta invenção é preferencialmente TF recombinante humano o qual está comercialmente disponível da Dade Behring Pharmaceuticals ou da American Diagnostica, Inc. 0 FT usado nos ensaios pode também ser endógeno ou uma combinação de endógeno e exógeno. 0 termo "composto de teste" como usado aqui refere-se a um composto não peptidico tendo um peso molecular de menos do que 1500 Daltons. Este termo também se refere a pequenas frações de heparinoide e sacarideo tendo um peso molecular de menos do que 5000 Daltons. O termo "amostra de controlo" refere-se à amostra de teste ou solução de ensaio onde o composto de teste está ausente. O termo "sangue total não anticoagulado" refere-se a sangue recolhido de um paciente que não recebeu terapia de anticoagulação por um agente antitrombótico. Isto também se refere a sangue de um paciente que possa ter recebido terapia de anticoagulação mas qualquer beneficio ou efeito não é mais alcançado. 0 termo "sangue total anticoagulado" ou "plasma anticoagulado" refere-se a sangue ou plasma retirado de pacientes que recentemente foram ou correntemente estão submetidos a terapia anticoagulante. Isto também se refere a sangue de dadores humanos que é obtido por venipunctura e recolhido num meio contendo anticoagulante exogenamente adicionado tal como citrato, AEDT, ou heparina. O termo "substrato de trombina detetavelmente marcado" refere-se a um substrato de trombina que está marcado por qualquer número de marcadores detetáveis. Estes marcadores 13 incluem, mas não estão limitados a, marcadores fluorescentes, marcadores fosforescentes, marcadores quimioluminescentes, marcadores eletroquimioluminescentes, e marcadores radioativos. Numa forma de realização da invenção o substrato marcado é Z-Gly-Gly-Arg-AMC, comercialmente disponível da Bachem. 0 termo "atividade antitrombótica" refere-se à capacidade dos compostos em inibirem a formação de trombos com efeitos aceitáveis em medições clássicas de parâmetros de coagulação, plaquetas, e função das plaquetas. As condições caracterizadas por trombose indesejada incluem aquelas envolvendo a vasculatura arterial e venosa. No que diz respeito à vasculatura arterial coronária, a formação de trombos anormais caracteriza a rutura de uma placa aterosclerótica estabelecida que é a principal causa do enfarte agudo do miocárdio e angina instável, bem como caracterizando também a formação de trombos coronários oclusivos resultando em ou terapia trombolítica ou angioplastia coronária transluminal percutânea (ACTP).

No que diz respeito à vasculatura venosa, a formação de trombos anormais caracteriza a condição observada em pacientes submetidos a grande cirurgia nas extremidades inferiores ou a área abdominal que frequentemente sofrem de formação de trombos na vasculatura venosa resultando em fluxo sanguíneo reduzido à extremidade afetada e uma predisposição para embolismo pulmonar. A formação de trombos anormais caracteriza adicionalmente a coagulopatia intravascular disseminada a qual comummente ocorre em ambos os sistemas vasculares durante o choque sético, certas infeções virais e cancro, uma condição em que existe um rápido consumo de fatores de coagulação e coagulação sistémica que resulta na formação de trombos com risco de 14 vida ocorrendo em toda a microvasculatura levando à falência de órgãos generalizada.

Evidência de atividade antitrombótica prestar-se-á a utilidade na terapia anticoagulante para prevenção da coagulação de sangue total armazenado e para prevenção da coagulação noutras amostras biológicas para teste ou armazenamento. 0 termo "sais farmaceuticamente aceitáveis" inclui sais de compostos derivados da combinação de um composto e um ácido orgânico ou inorgânico. Estes compostos são úteis em ambas as formas de base livre e de sal. Na prática, o uso da forma de sal equivale ao uso da forma de base; ambos os sais de adição ácida e básica estão dentro do âmbito da presente invenção. "Sais de adição ácida farmaceuticamente aceitáveis" referem-se a sais retendo a eficácia e propriedades biológicas das bases livres e que não são biologicamente ou de outro modo indesejáveis, formados com ácidos inorgânicos tais como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico e similares, e ácidos orgânicos tais como ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido maleico, ácido malónico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido p-toluenosulfónico, ácido salicíclico e similares. "Sais de adição básica farmaceuticamente aceitáveis" incluem aqueles derivados de bases inorgânicas tais como sais de sódio, de potássio, de lítio, de amónio, de cálcio, de magnésio, de ferro, de zinco, de cobre, de manganésio, 15 de alumínio e similares. Particularmente preferenciais são os sais de amónio, de potássio, de sódio, de cálcio e de magnésio. Sais derivados de bases não tóxicas orgânicas farmaceuticamente aceitáveis incluem sais de aminas primárias, secundárias, e terciárias, aminas substituídas incluindo aminas substituídas que ocorrem naturalmente, aminas cíclicas e resinas de permuta iónica básicas, tais como isopropiloamina, trimetiloamina, dietiloamina, trietiloamina, tripropiloamina, etanolamina, 2-dietiloaminoetanol, trimetamina, diciclohexiloamina, lisina, arginina, histidina, cafeína, procaína, hidrabamina, colina, betaína, etilenodiamina, glucosamina, metiloglucamina, teobromina, purinas, piperazina, piperidina, N-etilopiperidina, resinas de poliamina e similares. Bases não tóxicas orgânicas particularmente preferenciais são isopropiloamina, dietiloamina, etanolamina, trimetamina, diciclohexiloamina, colina, e cafeína. "Propriedade biológica" para os propósitos aqui significa um efetor ou função antigénica ou atividade in vivo que é diretamente ou indiretamente realizado por um composto desta invenção que é frequentemente mostrado por ensaios in vitro. Funções efetoras incluem ligação ao recetor ou ao ligando, qualquer atividade de enzima ou atividade moduladora de enzima, qualquer atividade de ligação ao transportador, qualquer atividade hormonal, qualquer atividade na promoção ou inibição da adesão das células a uma matriz extracelular ou a moléculas da superfície da célula, ou qualquer papel estrutural. Funções antigénicas incluem posse de um epítopo ou local antigénico que é capaz de reagir com anticorpos produzidos contra ele.

Nos compostos desta invenção, os átomos de carbono ligados a quatro substituintes não idênticos são assimétricos. 16

Conformemente, os compostos podem existir como diastereoisómeros, enantiómeros ou suas misturas. As sínteses descritas aqui podem empregar racematos, enantiómeros ou diastereómeros por métodos cromatográficos ou de cristalização, ou por outros métodos conhecidos na técnica. Do mesmo modo, as misturas de produto enantioméricas podem ser separadas usando as mesmas técnicas ou por outros métodos conhecidos na técnica. Cada um dos átomos de carbono assimétricos, quando presentes nos compostos desta invenção, pode estar num de duas configurações (R ou S) e ambos estão dentro do âmbito da presente invenção. 2. Métodos de Inibição da Coagulação do Sangue e Formulações de Dose Unitária

Um aspeto da invenção proporciona métodos de inibição da coagulação do sangue num paciente humano pela administração ao paciente de uma quantidade inibidora da coagulação de um composto inibidor do fator Xa. Este aspeto relaciona-se com a surpreendente descoberta de que a dose unitária dos compostos inibidores do fator Xa divulgada aqui requerida para inibir a coagulação num primata é menor do que a dose unitária requerida para obter níveis similares de inibição da coagulação noutros modelos animais, tais como roedores. Como descrito adicionalmente nos Exemplos e nas Figuras, esta especificidade quanto à espécie foi demonstrada em ensaios in vivo e por extensões in vitro do tempo de protrombina (TP) em plasma de rato, de coelho, de babuíno e de humano. Uma razão de expressão de dois do TP foi atingida a concentrações de 8,9 μΜ no rato e de 1,6 μΜ no coelho em comparação com os primatas onde a razão de expressão de dois no TP foi observada a 1 μΜ no babuíno e a 0,4 μΜ em humanos. 17

Os compostos inibidores do fator Xa são úteis no tratamento de estados de doença em mamíferos que têm desordens de coagulação tais como no tratamento ou prevenção da angina instável, da angina refratária, do enfarte do miocárdio, dos ataques isquémicos transientes, do acidente vascular cerebral trombótico, do acidente vascular cerebral embólico, da coagulação intravascular disseminada incluindo o tratamento de choque sético, da trombose venosa profunda na prevenção de embolismo pulmonar ou o tratamento de reoclusão ou restenose de artérias coronárias reperfundidas. Adicionalmente, estes compostos são úteis para o tratamento ou profilaxia daquelas doenças que envolvem a produção e/ou ação do complexo de fator Xa/protrombinase. Isto inclui um número de estados trombóticos e protrombóticos nos quais a cascata de coagulação é ativada o qual inclui mas não está limitado a trombose venosa profunda, embolismo pulmonar, enfarte do miocárdio, acidente vascular cerebral, complicações tromboembólicas de cirurgia e oclusão arterial periférica. Outras doenças tratáveis ou preveníveis pela administração de compostos desta invenção incluem, sem limitação, formação de trombos coronários oclusivos resultando em ou terapia trombolítica ou angioplastia coronária transluminal percutânea, formação de trombos na vasculatura venosa, coagulopatia intravascular disseminada, uma condição em que existe um rápido consumo de fatores de coagulação e coagulação sistémica que resulta na formação de trombos com risco de vida ocorrendo em toda a microvasculatura levando à falência de órgãos generalizada, acidente vascular cerebral hemorrágico, diálise renal, oxigenação do sangue, e cateterização cardíaca.

Conformemente, um aspeto da invenção proporciona um composto para uso num método de inibição da coagulação num paciente humano com necessidade dele, compreendendo a 18 administração a um paciente de uma quantidade inibidora da coagulação de um composto inibidor do fator Xa da fórmula II como definido acima ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em que a quantidade inibidora da coagulação do composto inibidor do fator Xa é uma dose diária agregada de entre 0,2 e 2,0 mg/kg. O composto inibidor do fator Xa é mostrado na Fórmula II, e seus sais (tal como a Fórmula III) como estabelecido abaixo. Em algumas formas de realização, a quantidade inibidora da coagulação de um composto inibidor do fator Xa é uma dose diária agregada de entre 0,2 e 1,5 mg/kg; ou alternativamente, a quantidade inibidora da coagulação de um composto inibidor do fator Xa é uma dose diária agregada de entre 0,4 e 1,2 mg/kg; ou alternativamente, a quantidade inibidora da coagulação de um composto inibidor do fator Xa é uma dose diária agregada de entre 0,43 e 1,15 mg/kg; ou alternativamente, a quantidade inibidora da coagulação de um composto inibidor do fator Xa é uma dose diária agregada de entre 0,45 e 0,55 mg/kg. Noutra ainda forma de realização da invenção, a quantidade do composto inibidor do fator Xa administrada a um humano é tal que o nivel de soro é cerca de 1 μΜ ou menos.

Outro aspeto da invenção proporciona as formulações de dose unitária compreendendo uma composição farmacêutica compreendendo um transportador farmaceuticamente aceitável e uma quantidade inibidora da coagulação do composto inibidor do fator Xa da Fórmula II como definido acima, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em que a quantidade inibidora da coagulação do composto inibidor do fator Xa é uma dose diária agregada de entre 0,2 e 2,0 mg/kg; alternativamente, a quantidade inibidora da coagulação do composto inibidor do fator Xa é uma dose diária agregada de entre 0,2 e 1,5 mg/kg; ou alternativamente, a quantidade inibidora da coagulação do composto inibidor do fator Xa é 19 uma dose diária agregada de entre 0,4 e 1,2 mg/kg; ou alternativamente, a quantidade inibidora da coagulação do composto inibidor do fator Xa é uma dose diária agregada de entre 0,43 e 1,15 mg/kg; ou alternativamente, a quantidade inibidora da coagulação do composto inibidor do fator Xa é uma dose diária agregada de entre cerca de 0,45 e cerca de 0,55 mg/kg.

As formulações são adicionalmente descritas na secção intitulada "formulações". 3. Ensaio de Geração de Trombina

Medições correntes para a monitorização do estado de coagulação (tempo da tromboplastina parcial ativada (TTPa), tempo da protrombina (TP), razão normalizada internacional (RNI), tempo de coagulação ativada (TCA), unidades anti-fXa) têm sido desenvolvidas para anticoagulantes existentes (i.e., heparinas e varfarina). Os testes disponiveis não são suficientemente sensíveis para avaliar concentrações terapêuticas de inibidores diretos do fXa.

Uma vez que o verdadeiro alvo dos inibidores do fXa é o complexo de protrombinase associado à membrana, um ensaio medindo a geração da trombina seria uma medida melhor do nível de anticoagulação alcançado em pacientes doseados com inibidores diretos do fXa. O betrixaban, um inibidor do fXa oralmente biodisponível em estágios avançados de desenvolvimento clínico (Fase II), foi usado para validar esta hipótese. O betrixaban é um inibidor competitivo, sítio-dirigido ativo do fXa humano (Ki = 117 pM) e exibe uma especificidade maior do que 86.000 vezes contra proteases relacionadas tais como trombina, fator Vila, fator Ixa, proteína C ativada, ativador do plasminogéneo do tecido, plasmina e tripsina. O betrixaban é um potente inibidor do complexo de protrombinase (Ki = 801 pM). 20

Ensaios conhecidos na técnica, tais como aqueles descritos em Sinha et al., ATVB 2003, 23: 1098-1104, incorporado por referência na sua totalidade aqui, são distinguíveis daqueles descritos aqui na medida em que são requeridos passos extra, tais como o tratamento do sangue com veneno de cobra ou materiais ou estão a ser tomadas diferentes medições. Por exemplo, os ensaios descritos em Sinha et al. requeriam que o plasma do sangue fosse tratado com Reptilase® para remover o fibrinogénio ou que fosse usado plasma rico em plaquetas ou que a trombina fosse medida indiretamente com marcadores tais como complexos de trombina/antitrombina III.

Um aspeto descrito aqui proporciona ensaios in vitro que são preditivos de se um composto tem atividade antitrombótica in vivo. A atividade antitrombótica pode ser determinada usando sangue total medindo a atividade da trombina. A quantidade de trombina está correlacionada com a atividade de anticoagulação nas FIGS. ΙΑ, 1B, e 1C. Este ensaio está adicionalmente correlacionado com a atividade de anticoagulação in vivo e discutido mais completamente na FIG. 2 e nos Exemplos.

Os ensaios envolvem a determinação da atividade da trombina na presença e ausência de um composto de teste. Numa forma de realização, é preparada uma solução de ensaio. A solução de ensaio é compreendida por sangue total não anticoagulado, fator de tecido (FT) , e um substrato de trombina detetavelmente marcado, tal como Z-Gly-Gly-Arg AMC. Um composto de teste de interesse é adicionado à solução de ensaio e a clivagem do substrato de trombina detetavelmente marcado é medida como uma função do tempo. A 21 ordem de introdução dos componentes na solução de ensaio pode ser variada.

Um ensaio de controlo é também realizado com a solução de ensaio na ausência de um composto de teste. Uma redução da atividade da trombina, como indicado por uma diminuição na clivagem do substrato de trombina, no ensaio com o composto de teste relativamente ao ensaio de controlo indica que o composto de teste tem atividade antitrombótica in vivo.

Alternativamente, o ensaio não inclui FT exogenamente adicionado. Em vez disso, a solução de ensaio é agitada para ativar o FT endogenamente presente nas células no sangue total.

Alternativamente, a solução de ensaio é compreendida por sangue total anticoagulado ou plasma anticoagulado em vez de sangue total não anticoagulado.

Conformemente, descrito aqui é um ensaio in vitro para determinar se um composto tem atividade antitrombótica in vivo compreendendo: a) introdução de um composto de teste numa amostra in vitro de sangue total não anticoagulado compreendendo fator de tecido (FT) e um substrato de trombina detetavelmente marcado para formar uma amostra de teste; b) determinação do nivel de atividade da trombina na amostra de teste pela monitorização da clivagem do substrato de trombina detetavelmente marcado na amostra de teste como uma função do tempo; c) determinação do nivel de atividade da trombina numa amostra de controlo pela monitorização da clivagem do substrato de trombina detetavelmente marcado na amostra 22 de controlo como uma função do tempo, em que a amostra de controlo compreende sangue total não anticoagulado compreendendo fator de tecido (FT) e um substrato de trombina detetavelmente marcado; d) comparação do nivel de atividade da trombina na amostra de teste e na amostra de controlo, em que um nível menor de atividade da trombina na amostra de teste é uma indicação de que o composto de teste tem atividade antitrombótica in vivo. 0 sangue total anticoagulado de a) pode ser substituído por sangue total não anticoagulado, plasma anticoagulado, ou plasma não anticoagulado. 2. Compostos Inibidores do Fator Xa Vários inibidores do fator Xa têm sido relatados como polipéptidos derivados de organismos hematófagos, bem como compostos que não são inibidores do tipo polipéptidos grandes. Inibidores do fator Xa adicionais incluem pequenas moléculas de compostos orgânicos, tais como compostos heterocíclicos contendo nitrogénio que têm grupos substituintes amidino, em que dois grupos funcionais dos compostos se podem ligar ao fator Xa em dois dos seus locais ativos. Por exemplo, a WO 98/28269 descreve compostos de pirazol tendo um grupo terminal amidino (-C(=NH)-NH2); a WO 97/21437 descreve compostos de benzimidazol substituídos por um radical básico que estão conetados com um grupo naftilo através de um grupo de ligação de alquileno de cadeia linear ou ramificada, C(=0)- ou -S(=0)2-; a WO 99/10316 descreve compostos tendo um grupo 4-fenilo-N-alquilamidino-piperidina e 4-fenoxi-N-alquilamidino-piperidina conetado com um grupo 3-amidinofenilo através de uma ponte de carboxamida- alquilenoamino; e a EP 798295 descreve compostos tendo um grupo 4-fenoxi-N-alquilamidino-piperidina conetado com um 23 grupo amidinonaftilo através de um grupo de ligação de sulfonamida ou carboxamida substituido ou não substituido. Inibidores do fator Xa relatados adicionais incluem aqueles tendo uma estrutura compreendendo um fenilo-amidino, fenilo, e halofenilo conetado através de ligações amida (Patentes dos E.U.A Nos. 6,376,515 e 6,844,367). Outros inibidores do fator Xa têm o halo-fenilo substituido com um halo-piridilo (ver Patentes dos E.U.A. Nos. 6,376,515 B2 e 6, 835,739) .

Na invenção, o inibidor do fator Xa é um composto da Fórmula II:

ou um seu sal farmaceuticamente aceitável. Os compostos da Fórmula II são divulgados como o Exemplo 206 nas Patentes dos E.U.A. Nos. 6,376,515 e 6,385,739, ambas as quais são incorporadas por referência na sua totalidade aqui. 0 composto da fórmula II tem o nome genérico de betrixaban e é algumas vezes referido como este ao longo da invenção.

Numa forma de realização especifica, o sal de um composto da Fórmula II é um sal de maleato. O sal de maleato é formado pela protonação de um ou mais átomos de nitrogénio do composto da Fórmula II. Numa forma de realização, o 24 nitrogénio de amidino (=NH) da Fórmula li é protonado (=NH2+) para formar o sal.

Numa forma de realização, o sal de maleato do composto da Fórmula II é representado pela Fórmula III:

Isto é também referido aqui como maleato de betrixaban.

Noutra forma de realização, o sal da Fórmula II tem uma forma polimorfa cristalina. Em formas de realização preferenciais, a forma polimorfa cristalina exibe um padrão de difração de raios-X por pó tendo pelo menos quatro e mais preferencialmente oito das seguintes localizações de pico caracteristicas aproximadas: 4,9, 9,7, 13,8, 14,1, 15,2, 17, 6, 18,5, 20,8, 21, 6, 22,7, 24,1, 26, 3, 26, 8 graus 2Θ. Noutra ainda forma de realização, o padrão de difração de raios-X por pó tem localizações de pico caracteristicas aproximadas de: 4,9, 9,7, 11,8, 13,8, 14,1, 15,2, 17,6, 18,5, 19, 9, 20,8, 21, 6, 22,7, 24,1, 25, 0, 26, 3, 26.8 graus 2Θ. A invenção contempla que os picos caracteristicos aproximados terão um desvio de até cerca de ± 0,5 graus 2Θ. Ver PCT/EUA2006/43635, depositada a 7 novembro, 2006, incorporada por referência na sua totalidade aqui, para 25 divulgação adicional de sais e polimorfos de sais do composto da Fórmula II. 4. Formulações

Uma forma de realização desta invenção é direcionada a uma formulação de dose unitária. A formulação de dose unitária compreende uma composição farmacêutica compreendendo um inibidor do fator Xa da Fórmula II como descrito acima e um transportador farmaceuticamente aceitável. 0 inibidor do fator Xa está presente numa quantidade de inibição da coagulação eficaz que é de entre 0,2 mg/kg e 2,0 mg/kg. Em certas formas de realização, a dose é formulada para ser administrada uma ou duas vezes diariamente, tal que a quantidade total por dia seja a quantidade eficaz quanto à coagulação. Em algumas formas de realização, a formulação de dose unitária é para distribuição oral.

Na gestão de desordens trombóticas, os compostos e/ou sais desta invenção podem ser utilizados em composições tais como comprimidos, cápsulas, pastilhas ou elixires para administração oral, supositórios, soluções ou suspensões estéreis ou administração injetável, e similares, ou incorporados em artigos moldados. O método de administração irá variar de sujeito para sujeito e depender de tais fatores como o tipo de mamífero a ser tratado, o seu sexo, peso, dieta, medição concomitante, condição clínica global, os compostos e/sais particulares empregues, o uso específico para o qual estes compostos e/ou sais são empregues, e outros fatores que aquelas peritos nas técnicas médicas reconhecerão. Cápsulas úteis na presente invenção podem ser preparadas usando técnicas de encapsulação convencionais e conhecidas, tais como as descritas em Stroud et al., Patente dos E.U.A. 26

No. 5,735,105. A cápsula é tipicamente uma concha oca de forma geralmente cilíndrica tendo um diâmetro e comprimento suficientes tal que as composições de solução farmacêutica contendo a dose apropriada do agente ativo se encaixem no interior da cápsula. O exterior das cápsulas pode incluir plastificante, água, gelatina, amidos modificados, gomas, carragenanos, e suas misturas. Aqueles peritos na técnica irão apreciar quais as composições que são adequadas.

Adicionalmente ao agente ativo, os comprimidos úteis na presente invenção podem compreender enchimentos, ligantes, agentes de compressão, lubrificantes, desintegrantes, corantes, água, talco e outros elementos reconhecidos por um perito na técnica. Os comprimidos podem ser homogéneos com uma única camada no núcleo, ou ter múltiplas camadas de modo a alcançar perfis de libertação preferenciais. Em alguns casos, os comprimidos da invenção instantânea podem ser revestidos, tal como com um revestimento entérico. Um perito na técnica irá apreciar que outros excipientes são úteis nos comprimidos na presente invenção.

Pastilhas úteis na presente invenção incluem uma quantidade apropriada do agente ativo bem como quaisquer enchimentos, ligantes, desintegrantes, solventes, agentes solubilizantes, adoçantes, agentes corantes e quaisquer outros ingredientes que um perito na técnica apreciaria se necessário. As pastilhas da presente invenção são desenhadas para dissolver e libertar o agente ativo em contacto com a boca do paciente. Um perito na técnica irá apreciar que outros métodos de distribuição são úteis na presente invenção.

As formulações dos compostos e/ou sais desta invenção são preparados para armazenamento ou administração pela mistura do sal tendo um grau desejado de pureza com 27 transportadores, excipientes, estabilizantes fisiologicamente aceitáveis, etc., e podem ser proporcionados em libertação sustentada ou formulações de libertação temporizada. Transportadores ou diluentes aceitáveis para uso terapêutico são bem conhecidos na área farmacêutica, e são descritos, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., (A.R. Gennaro Ed. 1985) . Tais materiais são não tóxicos em relação aos recipientes nas dosagens e concentrações empregues, e incluem tampões tais como fosfato, citrato, acetato e outros compostos e/ou sais ácidos orgânicos, antioxidantes tais como ácido ascórbico, péptidos de baixo peso molecular (menos do que cerca de dez resíduos) tais como poliarginina, proteínas, tais como albumina do soro, gelatina, ou imunoglobulinas, polímeros hidrofílicos tais como polivinilopirrolidinona, aminoácidos tais como glicina, ácido glutâmico, ácido aspártico, ou arginina, monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo celulose ou seus derivados, glucose, manose ou dextrinas, agentes quelantes tais como AEDT, álcoois de açúcar tais como manitol ou sorbitol, contraiões tais como sódio, e/ou surfatantes não iónicos tais como Tween, Pluronics ou polietilenoglicol.

As formulações de dosagem dos compostos e/ou dos sais desta invenção a serem usadas para administração terapêutica têm de ser estéreis. A esterilidade é prontamente alcançada por filtração através de membranas estéreis tais como membranas de 2 mícrons, ou por outros métodos convencionais. As formulações irão ser tipicamente armazenadas na forma liofilizada ou como uma solução aquosa. 0 pH das preparações desta invenção irá tipicamente estar entre 3 e 11, mais preferencialmente de 5 a 9 e o mais preferencialmente de 7 a 8. Será entendido que o uso de alguns dos excipientes, transportadores, ou estabilizadores 28 precedentes irá resultar na formação de compostos e/ou sais de polipéptidos ciclicos. Enquanto a rota preferencial de administração é por injeção, outros métodos de administração são também antecipados tais como intravenosamente (pílula grande e/ou infusão), subcutaneamente, intramuscularmente, através do cólon, retalmente, nasalmente ou intraperitonealmente, empregando uma variedade de formas de dosagem tal como supositórios, pastilhas ou pequenos cilindros implantados, aerossóis, formulações de dosagem oral (tais como comprimidos, cápsulas e pastilhas) e formulações tópicas tais como pomadas, gotas e pensos dérmicos. As membranas estéreis desta invenção são desejavelmente incorporadas em artigos moldados tais como implantes que podem empregar materiais inertes tais como polímeros biodegradáveis ou silicones sintéticos, por exemplo, Silastic, borracha de silicone ou outros polímeros comercialmente disponíveis.

Os compostos e/ou sais da invenção podem ser também administrados na forma de sistemas de distribuição de lipossomas, tais como pequenas vesículas unilamelares, grandes vesículas unilamelares e vesículos multilamelares. Os lipossomas podem ser formados de uma variedade de lípidos, tal como colesterol, estearilamina ou fosfatidilcolinas.

Os compostos e/ou sais desta invenção podem ser também distribuídos pelo uso de anticorpos, fragmentos de anticorpo, fatores de crescimento, hormonas, ou outras frações alvo, aos quais as moléculas de sal estão acopladas. Os compostos e/ou sais desta invenção podem estar também acoplados com polímeros adequados como transportadores de fármaco alvo. Tais polímeros podem incluir polivinilopirrolidinona, copolímero de pirano, polihidroxi-propilo-metacrilamida-fenol, polihidroxietilo- 29 aspartamida-fenol, ou polietilenoóxido-polilisina substituída com resíduos de palmitoílo. Além disso, os compostos e/ou sais da invenção podem estar acoplados a uma classe de polímeros biodegradáveis úteis no alcance da libertação controlada de um fármaco, por exemplo ácido poliláctico, ácido poliglicólico, copolímeros de ácido poliláctico e poliglicólico, poliépsilon caprolactona, ácido butírico de polihidroxi, poliortoésteres, poliacetais, poliidropiranos, policianoacrilatos e copolímeros de hidrogéis em bloco reticulados ou amfipáticos. Os polímeros e matrizes de polímero semipermeáveis podem ser formados em artigos moldados, tais como válvulas, endopróteses, tubos, próteses e similares. 5. Preparação do Composto

a. Sais do Composto da Fórmula II 0 composto da Fórmula II pode ser convertido em sais de vários ácidos inorgânicos e orgânicos incluindo, mas não se limitando a, sal de HC1, lactato, maleato, fenoxiacetato, propionato, succinato, adipato, ascorbato, camforato, gluconato, fosfato, tartrato, citrato, mesilato, fumarato, glicolato, naftaleno-1,5-disulfonato, gentisato e sulfonato de benzeno. Um perito na técnica irá reconhecer que podem ser usados outros ácidos para fazer sais compreendendo o composto da Fórmula I que são úteis na presente invenção. É também contemplado que os sais da invenção podem ser prontamente convertidos em outros sais da invenção.

Um número de métodos é útil para a preparação dos sais descritos acima e é conhecido daqueles peritos na técnica. Por exemplo, a reação do composto da Fórmula II com ou mais equivalentes molares do ácido desejado num solvente ou mistura de solventes no qual o sal é insolúvel, ou num 30 solvente como a água após a qual o solvente é removido por evaporação, destilação ou liofilização. Alternativamente, o composto da Fórmula II pode ser passado sobre uma resina de permuta iónica para formar o sal desejado ou uma forma de sal do produto pode ser convertida noutra usando o mesmo processo geral. O composto da Fórmula II foi preparado de acordo com o procedimento estabelecido abaixo. O sal de maleato do composto da Fórmula II foi escolhido pelas suas excelentes cristalinidades, estabilidade térmica e hidrolitica, e alta pureza. b. Betrixaban O composto da Fórmula II ou betrixaban pode ser preparado de acordo com qualquer uma de várias metodologias diferentes, quer numa escala de grama (< 1 kg) , quer numa escala de quilograma (> 1 kg). Um método à escala do grama é estabelecido abaixo no Exemplo 2. Outro método à escala do grama é estabelecido na Patente dos E.U.A. No. 6,844,367B1, ver Exemplo 266, a qual é aqui incorporada por referência na sua totalidade.

Alternativamente, o composto da Fórmula II pode ser preparado numa escala de quilograma usando o procedimento estabelecido no Exemplo 2. A formação da amidina de dimetilo da Fórmula II envolve um ataque nucleofilico num grupo ciano por uma amina desprotonada, com a amida desprotonada formada de uma amina secundária e um litio de alquilo. Como usado aqui, o termo "alquilo" refere-se a um radical de hidrocarbilo de 1 a 8 átomos de carbono. Um perito na técnica irá reconhecer que a amina desprotonada pode ser formada através de outros métodos, e a formação da funcionalidade de amidina da Fórmula II pode ser preparada por uma variedade de outros métodos. 31

Um solvente útil para o método da presente invenção como descrito acima é um solvente aprótico tal como tetrahidrofurano (THF), éter de dietilo, dimetoximetano, dioxano, hexano, éter de metilo e tert-butilo, heptano, e ciclohexano. Adicionalmente, a formação da amina desprotonada pode ser levada a cabo a temperaturas abaixo de 10°C. A adição nucleofílica da amina para formar o composto da Fórmula I pode ser também levada a cabo a temperaturas abaixo de 10°C. Um perito na técnica irá reconhecer que os métodos da presente invenção podem ser praticados usando vários outros solventes, reagentes, e temperaturas de reação.

Adicionalmente, enquanto o método da presente invenção para preparação do composto da Fórmula II numa escala de grama é similar ao procedimento usado na escala de quilograma, existe um aumento na escala da reação de mais do que 3400%. Além disso, em vários passos, são obtidos rendimentos aumentados usando quantidades reduzidas dos reagentes em excesso. Um perito na técnica irá reconhecer que o composto da Fórmula I pode ser preparado através de outras metodologias quimicas em tanto numa escala de grama, tanto numa de quilograma.

Exemplos A não ser que se afirme de outro modo, as abreviações usadas ao longo da especificação têm os significados seguintes: Â = Angstrom A% = área percentual total aq. = aquoso cm = centímetro 32 d = dupleto CDV = calorimetria diferencial de varrimento AEDT = ácido etilenodiaminotetraacético eq. = equivalente EtOH = etanol g = grama CLAR = cromatografia líquida de alta resolução hr = hora Hz = Hertz IV = infravermelho J = constante de acoplamento kg = quilograma kV = quilivolts L = litro LDD = limite de deteção M = molar m = multipleto mA = miliampere Me = metilo MeO = metoxi MeOH = metanol mg = miligrama min. = minuto mL = mililitro mm = milímetro EMTB = éter de metilo e tert-butilo N = normal nM = nanomolar RMN = ressonância magnética nuclear s = singuleto SDT = sólidos dissolvidos totais ATG = análise térmica gravimétrica THF = tetrahidrofurano μΜ = micromolar BID = duas vezes ao dia 33

Exemplo 1

Preparação de vim sal polimorfo cristalino da Fórmula II a. Preparação à escala do grama

Num frasco com 3 tubuladuras com fundo redondo de 1500 mL equipado com um condensador, foi carregado o composto de base livre da Fórmula I (25 g; 1 eq.) e foi adicionado EtOH/Água 9:1 (500 mL) enquanto se agitava. A suspensão resultante foi aquecida até 70°C. Foi adicionado ácido maleico (12,77 g; 2 eq.) gota a gota como uma solução (100 mL de EtOH/Água 9:1) e após terem sido adicionados 50 mL, a solução tornou-se notavelmente mais límpida. Aquando da adição completa da solução de ácido maleico, a temperatura foi mantida a 80°C durante 5 minutos. Permitiu-se que o vaso arrefecesse até 45°C e 400 mL de EMTB foram depois adicionados. A solução foi agitada durante outras 12 hr. O precipitado resultante foi filtrado e seco sob vácuo. O sal de maleato do composto da Fórmula I foi recuperado com um rendimento de 45% (14,2 g). b. Preparação à escala do quilograma O composto da Fórmula I (24,6 kg) foi carregado num reator GLMS de 760 mL (Reator A). Foram adicionados ácido maleico (12,7 kg, 2,0 eq), etanol (445 kg, 18,1 partes), e água com alta pureza (140 kg, 5,7 partes). A mistura reacional foi ajustada até 22°C (19-25°C) e agitada àquela temperatura durante ca. de 1 hr, depois transferida através de um filtro de polimento para um reator Hastelloy condicionado de 780 L (Reator B). A bomba e as linhas do Reator A foram enxaguadas na direção do Reator B com etanol adicional (ca. de 45 kg) através de filtro de polimento. 0 filtrado foi concentrado sob vácuo com uma temperatura máxima de banho quente de glicol (para aquecer a camisa do reator) de 45°C, 34 até permanecerem ca. de 140 L (volume de 5,7 partes) . Os conteúdos do Reator B foram amostrados para a RMN em processo, a qual mostrou que a razão molar de etanol:sal de maleato do composto da Fórmula I era de 26. Água de alta pureza (49 kg, 2,0 partes) foi carregada no Reator B e a concentração sob vácuo retomou até se ter alcançado um volume de vaso de ca. de 140 L (volume de 5,7 partes) . A RMN em processo indicou que a razão molar de etanol:sal de maleato do composto da Fórmula I era de 14. Água de alta pureza (49 kg, 2,0 partes) foi novamente carregada e a concentração sob vácuo retomou até se obter um volume de vaso de ca. de 140 L. A RMN em processo mostrou que a razão molar de etanol:sal de maleato do composto da Fórmula I era de 5. A temperatura dos conteúdos do Reator B foi ajustada até 22°C (19-25°C) e a formação de uma suspensão foi visualmente confirmada. A mistura reacional foi agitada a 22°C (19-25°C) durante ca. de 2 hrs, e depois filtrada numa centrífuga de 30"" equipada com um pano de filtro. A bomba e as linhas do Reator B foram enxaguadas na direção da centrífuga de 30"" através de filtro de polimento com duas porções de água de alta pureza (ca. de 40 kg cada) . O bolo de filtração foi amostrado para a CLAR em processo, a qual mostrou que a pureza do produto era de 99,1 A%, a impureza maior era de 0,26 A%, e portanto a recristalização foi desnecessária. O bolo de filtração (33,1 kg) foi seco sob vácuo com uma temperatura máxima de banho quente de glicol (para aquecer a camisa do reator) de 40°C. Após ca. de 30,5 hrs, a análise do LDD em processo indicou um conteúdo de solvente de 0%. O produto seco foi descarregado (26,4 kg) e armazenado a 2-8°C. O rendimento do produto final foi ligeiramente mais alto do que o esperado a 85% (esperado 50-80%) . A pureza do sal de maleato foi medida pela presença de conteúdo de amidina hidrolisada como medida por CLAR, e descobriu-se que a pureza era > 99%. 35 RMN (DMSO-d6) : δ 3,0 (s, 3 Η), 3,2 (s, 3 Η), 3,82 (s, 3 Η), 7,2 (d, 1 H, J = 9,0 Hz), 7,42 (s, 1 H) , 7,68 (d, 1 H, J = 8,0 Hz), 7,95 - 8,15 (m, 2 H) , 8,12 (m) , 8,18 (m, 1 H) , 8,42 (s, 1 H) , 9,0 (s, 1 H) , 11,0 (s, 1 H) , 11,2 (s, 1 H) ; IV (KBr, cm-1) : 3300, 1685, 1600, 1515, 1380, 1270, 1200, 1100, 1050, 880, 800, 710.

Exemplo 2

Preparação do composto da Fórmula II

a. Preparação à escala do grama

Uma suspensão do composto da Fórmula F (455 g, 1,0 eq.) em THF (4,67 kg, 10,3 partes) foi preparada e ajustada até < 10°C. Foi preparada amida de dimetilo de lítio como se segue: foi adicionado litio de hexilo (2,3 N/hexano, 2,45 L, 5,5 eq.) a uma solução de dimetiloamina (2 N/THF, 2,8 L, 5,5 eq.) mantendo-se < 10°C. A solução de amida de dimetilo de litio foi carregada na suspensão contendo o composto da Fórmula F mantendo a temperatura do vaso < 10°C. O progresso da reação foi monitorizado por CLAR em processo a qual confirmou que a quantidade da Fórmula F era < 10 A%. Uma solução tampão de NaHCCu (490 g, 1,1 partes, 5,7 eq.) e Na2C03 (490 g, 1,1 partes, 4,5 eq.) em água desionizada (6,6 kg, 14,51 partes) foi preparada, e a mistura reacional acima foi transferida para esta solução aquosa mantendo < 36 5°C. 0 produto precipitou e a suspensão resultante foi ajustada até 20°C ao longo de um periodo de 12 hr. 0 sólido foi filtrado, e o bolo húmido resultante foi lavado com 3,5 kg (7,7 partes) de água desionizada. 0 sólido foi filtrado usando um filtro de bancada com frita de vidro grosseira, e enxaguado e encaminhado com etanol absoluto (628 g, 1,4 partes) frio (0-5°C). 0 produto foi seco a 30-3°C. o produto seco foi obtido em 458 g (rendimento de 73%). b. Preparação à escala do quilograma

Uma suspensão do composto da Fórmula F (31,5 kg, 1,0 eq.) em THF (251 kg, 8,0 partes) foi preparada num reator Hastelloy de 780 L (Reator A) e ajustada até 0°C (-3 a 3°C). Dimetiloamina a 2 M em THF (161,0 kg, 5,0 eq.) e THF (63 kg, 2 partes) foram carregados num reator GLMS de 1900 L (Reator B) e ajustados até 0°C (-3 a 3°C) com agitação máxima. Litio de hexilo (2,3 M, 97,2 kg, 4,5 eq.) foi lentamente carregado no Reator B enquanto se mantinha uma temperatura máx de 10°C. A bomba e as linhas foram enxaguadas na direção do Reator B com THF (3,2 kg) . Os conteúdos do Reator B foram ajustados até 0°C (-3 a 3°C) , depois transferidos para o Reator A enquanto se mantinha a temperatura do Reator A < 10°C. A bomba e as linhas do

reator B foram enxaguadas e encaminhadas com THF (31,4 kg, 1,0 parte). Os conteúdos do Reator A foram ajustados até 0°C (-3 a 3°C), e agitados a esta temperatura até a reação estar completa como verificado por CLAR (1-2 hrs) . Após cerca de 1 hr de agitação, a análise de CLAR em processo indicou que 0 A% do material de partida permaneceu (critério em processo: máx 1 A%). Os conteúdos do Reator A foram ajustados até -5°C (-8 a -3°C). A limpeza em processo do Reator B com água foi realizada. Duas soluções aquosas previamente preparadas (NaHC03 (35,0 kg, 1,1 partes) em água (236 kg, 7,5 partes), e Na2C03 (35,0 kg, 1,1 partes) em água (236 kg, 7,5 partes)) foram carregadas no Reator B 37

e ajustadas até -3°C (0 a 6°C) . Os conteúdos do Reator A foram transferidos para o Reator B através de uma linha isolada, mantendo a temperatura do Reator B a -8°C até um máximo de 5°C. A bomba e as linhas do Reator A foram enxaguadas e encaminhadas com THF (31,4 kg, 1,0 parte) frio [-5°C (-8 a -3°C)]. Os conteúdos do Reator B foram ajustados a 22°C (19-25°C) e agitados durante ca. de 3 hrs. A formação de suspensão foi visualmente confirmada, e os conteúdos do Reator B foram filtrados para uma centrífuga de 30"" equipada com pano de filtro. A bomba e as linhas do Reator B foram enxaguadas na direção da centrífuga de 30"" equipada com um pano de filtro com água potável (63 kg, 2 partes) . O bolo de filtração húmido (66,5 kg) foi transferido de volta para o Reator B e submetido a uma lavagem de suspensão em água potável (1005 kg, 32 partes) a 22°C (19-25°C) durante ca. de 1 hr. O produto foi filtrado para a centrífuga de 30"" (após lavagem em processo e equipamento com um pano de filtro) , e a bomba e as linhas do Reator B foram enxaguadas e encaminhadas com água potável (63 kg, 2 partes) . A água de enxaguamento foi amostrada para teste por SDT, os quais se descobriu serem 0,46%. A bomba, as linhas e o bolo de filtração húmido do Reator B foram adicionalmente enxaguados com etanol (44 kg, 1,93 partes) frio [0°C (-3 a 3°C) ] . O bolo de filtração húmido foi seco sob vácuo com uma temperatura máxima de banho de água (para aquecer a camisa de secagem) de 35°C. O LDD em processo foi de 0% após ca. de 24 hrs de secagem, e o produto foi descarregado (24,8 kg) com rendimento de 76,7%. A CLAR mostrou 98% de pureza, com impureza desclorada a 1,14%. 38

Exemplo 3

Preparação do composto da Fórmula F

Passo 1. Sintese da 2-nitro-N-(5-cloro-piridin-2-ilo)-5-metoxl-benzamida (C)

A B C

Cl Ácido 5-metoxi-2-nitrobenzoico (A) (25,0 kg, 1,0 eq.), 2- amino-5-cloropiridina (B) (16,3 kg, 1,0 eq.), e acetonitrilo (87,5 kg, 3,5 partes) foram carregados num reator GLMS de 380 L. A mistura reacional foi ajustada até 22°C (19-25°C) e foi adicionada piridina anidra (30,0 kg,

3,0 eq.). A bomba e as linhas foram enxaguadas e encaminhadas com acetonitrilo (22,5 kg, 0,9 partes), e os conteúdos do reator foram ajustados até uma temperatura de 19-22°C. Foi carregado oxicloreto de fósforo (23,3 kg, 1,20 eq.) nos conteúdos do reator através de uma bomba doseadora, enquanto se mantinha uma temperatura de 25°C (22-28°C). A bomba doseadora e as linhas foram enxaguadas e encaminhadas com acetonitrilo (12,5 kg, 0,5 partes), enquanto se mantinha a temperatura a 25°C (22-28°C). A mistura reacional tornou-se normalmente de uma suspensão numa solução limpida após a adição de cerca de 1/3 do POCI3. No final da adição, ela tornou-se túrbida. Após adição completa, a mistura reacional foi agitada a 25°C (22-28°C) durante ca. de 1 hr, altura em que a análise de CLAR confirmou a completação da reação. A solução foi 39 arrefecida até 15°C (12-18°C) e foi lentamente carregada água potável (156,3 kg, 6,5 partes) enquanto se mantinha a temperatura reacional entre 12 e 30°C. A mistura reacional foi depois ajustada até 22°C (19-25°C) e agitada durante ca. de 5 hrs até a exotermia cessar. A formação de uma suspensão foi visualmente confirmada e os conteúdos do reator foram filtrados num Nutsche de pressão equipado com um pano de vidro. 0 reator, a bomba, e as linhas foram lavadas na direção do Nutsche de pressão com duas porções de água potável (62,5 kg, 2,5 partes cada). 0 filtrado tinha um valor de pH de 7. 0 produto (41,8 kg) foi seco sob vácuo com uma temperatura máxima de banho de água (para aquecer a camisa de secagem) de 50°C. Após ca. de 12 hrs, a análise de LDD em processo indicou um conteúdo de solvente de 0,72%. O produto seco (C) foi descarregado (34,4 kg) com rendimento de 88,2% e 99,1% de pureza por CLAR.

Passo 2. Síntese da 2-amino-N-(5-cloro-piridin-2-ilo)-5-metoxi-benzamida (D)

A um reator Hastelloy de 780 L, foram carregados o composto C (33 kg, 1,0 eq.), carbono de platina a 5% (sulfatado, 0,33 kg, 0,010 partes) e diclorometano (578 kg, 17,5 partes). A agitação foi iniciada e os conteúdos do reator foram ajustados até 22°C (19-25°C). O reator foi

pressurizado com ca. de 30 psi de hidrogénio e a mistura reacional suavemente aquecida até 28°C (25-31°C). A hidrogenação dos conteúdos do reator foi realizada sob ca. 40 de 30 psi a 28°C (25 a 31°C; máximo 31°C) até a reação estar completa por CLAR. Após 16,5 hrs, a reação foi considerada completa após confirmação do desaparecimento do material de partida (0,472 A%) . Os conteúdos do reator foram circulados através de um bloco de Celite condicionada (0,2-0,5 kg de Celite condicionada com 20-55 kg de diclorometano) preparado num filtro Sparkler de 8'' para remover ao catalisador de platina. O reator e a cama de

Celite foram enxaguados e encaminhados com duas porções de

diclorometano (83 kg, 2,5 partes cada). O filtrado foi transferido para um e concentrado num reator GLMS de 570 L sob uma pressão atmosférica até ca. de 132 L (4 partes de volume). Foi carregado etanol (69 kg, 2,1 partes) e a concentração continuou sob pressão atmosférica até ca. de 99 L (3 partes de volume). A RMN em processo indicou que o conteúdo de diclorometano era de 39%. Foi novamente carregado etanol (69 kg, 2,1 partes) e a concentração continuou novamente até ca. de 99 L (3 partes de volume). A RMN em processo indicou que o conteúdo de diclorometano era de 5%. A mistura reacional foi depois ajustada até 3°C (0 a 6°C), agitada durante ca. de 1 hr, e a suspensão resultante filtrada para um Nutsche de pressão encamisado equipado com um pano de vidro. O reator, a bomba, e as linhas foram enxaguadas e encaminhadas com etanol (26 kg, 0,8 partes) frio [3°C (0-6°C) ] . O bolo de filtração húmido (36,6 kg) foi seco sob vácuo a 40-50°C com uma temperatura máxima de banho de água (para aquecer a camisa de secagem) de 50°C. A análise de LDD após 12,5 hrs indicou que o conteúdo de solvente estava em 0,1%. O produto seco (D) foi descarregado (26,4 kg) com rendimento de 89,5%. A CLAR mostrou pureza de 98,4 A%, com impureza desclorada a 0,083%. 41

Passo 3. Síntese do hidrocloreto da N-(5-cloro-piridin-2-ilo)-2-(4-ciano-benzoílo-amino)-5-metoxi-benzamida (F)

A um reator Hastelloy de 780 L, foram carregados cloreto de 4-cianobenzoí lo (E) (17,2 kg, 1,1 eq.) e THF (92 kg, 3,5 partes). Os conteúdos do reator foram agitados a 22°C (19— 25°C) até todos os sólidos se dissolverem. A solução resultante foi transferida para o recetor inferior e o reator foi enxaguado e encaminhado com THF (26 kg, 1 parte). O composto D (26,4 kg, 1 eq.), THF (396 kg, 15 partes) e piridina (2,90 kg, 0,4 eq.) foram carregados num reator limpo. A bomba e as linhas foram enxaguadas e encaminhadas com THF (34 kg, 1,3 partes). Através de uma bomba doseadora, a solução de cloreto de 4-cianobenzoílo/THF foi carregada no reator, mantendo a temperatura a ^ 30°C e enxaguando para a frente com THF (ca. de 10 kg) . A suspensão de cor amarela resultante foi agitada a 22°C (19-25°C) durante ca. de 2 horas. A CLAR em processo tomada após 2 hrs mostrou um conteúdo de composto da Fórmula D de 0%, indicando a completação da reação. A suspensão foi filtrada num Nutsche de pressão equipado com um pano de vidro. O reator, a bomba, as linhas e o bolo húmido foram enxaguados com três porções de etanol (ca. de 15 kg cada) . O bolo de filtração húmido foi descarregado (65,4 kg) e transferido de volta para o reator para lavagem de suspensão em etanol (317 kg, 12 partes) a 22°C (19-25°C) durante ca. de 1 hora. A suspensão foi filtrada para o 42

Nutsche de pressão e o reator, a bomba, as linhas e o bolo húmido foram enxaguados com duas porções de etanol (ca. de 15 kg cada) e duas porções de THF (ca. de 15 kg cada) . 0 bolo de filtração húmido foi seco sob vácuo com uma temperatura máxima de banho de glicol quente (para aquecer a camisa de secagem) de 40°C. Após 14,5 hrs de secagem, o LDD era de 0,75%. O material seco foi moido (grelha de 0,125") para dar 31,8 kg de produto, o qual foi seco sob vácuo durante outras 10,5 hrs. O LDD após secagem foi de 1,8%, e o produto foi descarregado (31,5 kg) com rendimento de 74,8% (esperado 60-90%). A CLAR mostrou 100% de pureza.

Exemplo 4

Bioensaio para Determinar Atividade Antitrombótica

Este exemplo descreve um ensaio in vitro para determinar a atividade antitrombótica in vivo. O valor preditivo do ensaio foi verificado usando um modelo babuíno in vivo estabelecido descrito abaixo. O composto usado no ensaio corresponde a um composto da Fórmula II, ou a um seu sal.

Materiais e Métodos

Para os estudos in vitro, foi gerado um conjunto de plasma a partir de sangue recolhido através de venipunctura em citrato de trisódio a 3,2% (1:9 v/v) de um mínimo de dez dadores. O substrato de trombina específico usado foi Z-GGR-AMC (Bachem). O fator de tecido (Innovin, "FT") foi adquirido da Dade Behring. A IgG de FT anti-humana de coelho e o FT humano recombinante purificado eram da American Diagnostica. Os Conjuntos de Heparina/Heparina de BPM COATEST eram da Chomogenix. As fontes dos anticoagulantes testados foram como se segue: sódio de enoxaparina (Aventis Pharmaceuticals), sódio de fondaparinux (Glaxo Smith Kline), bivalirudina (The 43

Medicines Company) , inibidor do fXa C921-78 (Betz, A. et al. Biochem., 1999; 38-14582-14591); rivaroxaban e razaxaban. A geração da trombina no conjunto de plasma na ausência e presença de vários anticoagulantes e em pacientes tratados com varfarina foi iniciada pela adição de Innovin e cálcio. A geração da trombina foi medida pelo sinal continuo gerado pela clivagem do substrato de trombina ao longo de um periodo de 10 min num leitor de fluorescência FlexStation (Molecular Probes). O sinal de fluorescência (unidades de fluorescência relativa Máx-Min) é apresentado como unidades (UFR) ou unidades arbitrárias (UA) da geração da trombina e as unidades de anti-fXa foram medidas por COATEST. A quantificação da concentração do FT em Innovin foi levada a cabo por imunotransferência com IgG de FT anti-humana de coelho, seguida de densitometria e comparação com FT humano purificado (resíduos 1-263, expressos em baculovírus).

Para a validação ex vivo do ensaio, foi recolhido plasma de 168 pacientes recebendo terapia de anticoagulação. Os sujeitos compreenderam pacientes internados medicamente estáveis ou aqueles atendendo um clínica de ambulatório e que estavam a receber varfarina (nenhuma mudança na dose de varfarina durante aproximadamente 7 dias). O sangue foi somente colhido se a venissecção e a medição rotineira de testes de anticoagulação tradicionais (RNI, TTPa, etc.) já fossem pretendidas e nenhumas picadas de agulha adicionais foram realizadas para este estudo. 5 mL adicionais de sangue foram colhidos e colocados em tubos anticoagulados por citrato de sódio. As amostras foram depois centrifugadas duas vezes para colher a fração de plasma, e este plasma foi depois prontamente armazenado a -80°C. 44

Resultados 0 ensaio foi sensível aos anticoagulantes com mecanismos de ação variáveis. A adição de heparina não fracionada (HNF) ou de heparina de baixo peso molecular (HBPM) ao plasma de dadores saudáveis produz uma inibição dependente da dose no ensaio. Similarmente, os inibidores da trombina diretos ou do fXa também elicitam uma atividade inibitória proporcional à dose. 0 efeito dos inibidores específicos da trombina ou do fator Xa na geração da trombina no plasma induzida por FT é mostrado na Tabela 1.

Tabela 1

Fármaco CI50 Fondaparinux 160 nM Inibidor da Trombina Bivalirudina 2,4 yg/mL Inibidor do fXa C921-78 17 nM Inibidor do fXa Rivaroxaban 180 nM Inibidor do fXa Razaxaban 125 nM

Este ensaio é também útil para medição da anticoagulação em pacientes quer agudamente, quer cronicamente anticoagulados. As medições do TTPa de pacientes tratados com HNF ou HBPM correlacionaram-se com a inibição da geração da trombina. Relativamente aos marcadores tradicionais da geração da trombina (TAT e F1.2 como medido por ELISA), este bioensaio proporcionou uma correlação superior às medições de RNI, os resultados da qual são mostrados nas FIGS. ΙΑ, 1B e 1C. A extensão da geração da trombina (UA) a 10 minutos foi medida em amostras de plasma de (a) pacientes tratados com varfarina e traçadas contra valores de RNI de 137 pacientes (FIG. IA) , (b) pacientes tratados com enoxaparina traçadas contra valores de TTPa de 16 pacientes (FIG. 1B) e (c) pacientes tratados com 45 heparina não fracionada (HNF) traçadas contra valores de TTPa de 15 pacientes (FIG. 1C).

Exemplo 5

Comparação do Betrixaban com o Fondaparinux

Uma avaliação num ensaio de protrombinase de sangue total foi levada a cabo para comparar o betrixaban com o fondaparinux, um inibidor indireto do fXa. Tal como o fondaparinux, o betrixaban inibiu independentemente da dose a atividade da protrombinase mediada pelas plaquetas neste sistema de teste.

Materiais e Métodos

Os ensaios amidoliticos para inibição do fXa humano purificado e de proteases relacionadas foram levados a cabo como relatado previamente (Sinha, U et ai. Eur. J. Pharmacol. 2000; 114:2313-6). Para a determinação da atividade inibitória da protrombinase, a pré-trombina-2 do plasma humano foi adquirida da Haemetologic Technologies e o substrato de trombina Boc-Asp(OBzl)-Pro-Arg-AMC.HC1 foi obtido da Bachem. As análises dos dados para a derivação de parâmetros cinéticos foram levadas a cabo usando o software Dynafit (Biokin). O betrixaban exibiu um Ki de 0,117 (nM) e a protrombinase um Ki de 0,801 (nM) . O ensaio descrito no Exemplo 4 foi empregue. O betrixaban foi testado num modelo de incorporação de dispositivo trombogénico num shunt arteriovenoso em babuinos (Hanson SR et al. J. Clin. Invest. 1993; 92:2003-12). O dipositivo com trombogénico com dois componentes mede o crescimento de trombos num enxerto de dacron e numa câmara de expansão usando plaquetas marcadas com ιηΙη e fibrinogénio marcado 125I. Este modelo tem sido previamente usado para 46 estudar uma ampla variedade de anticoagulantes (heparinas não fracionadas e de baixo peso molecular, inibidores da trombina e do fXa).

Resultados A inibição dependente da dose da trombose venosa foi observada a quatro doses (0,05, 0,12, 0,21 e 0,49 mg/kg) de betrixaban. Medições ex vivo da geração da trombina no plasma, do TTPa, do TP, do tempo de coagulação ativada ("TCA"), e das unidades anti-fXa foram realizadas durante o curso do tempo. Em contraste com a atividade antitrombótica observada (30 a 89% de inibição da deposição das plaquetas, 0 a 87% da inibição da deposição das fibrinas) , houve extensão minima dos parâmetros de coagulação após tratamento com betrixaban. Os resultados disto são apresentados na Tabela 2 abaixo.

Tabela 2

Razão de Expressão em relação ao Controlo Média ± DP Agente TCA TP TTPa Controlo 0,87 ± 0,09 1,00 ± 0,04 1,02 ± 0,03 betrixaban 0,05 mg/kg 1,14 ± 0,06 1,02 ± 0,03 1,07 ± 0,03 betrixaban 0,12 mg/kg 1,14 ± 0,15 1,05 ± 0,06 1,07 ± 0,03 betrixaban 0,21 mg/kg 1,11 ± 0,04 1,07 ± 0,03 1,09 ± 0,08 betrixaban 0,49 mg/kg 1,28 ± 0,06 1,17 ± 0,11 1,29 ± 0,21

As unidades anti-fXa estavam abaixo do limite de quantificação para as três doses mais baixas e 0,31 Unidades/mL à dose mais alta. Os tempos de hemorragia modelo não foram perturbados em qualquer um dos animais 47 tratados com betrixaban. 0 parâmetro ex vivo que se correlacionou com a atividade antitrombótica foi a inibição proporcional à dose (coeficiente de correlação R2 = 0,99) da geração da trombina no plasma, a qual variou de 13% de inibição na dose mais baixa a 72% na dose mais alta. Assim sendo, este novo bioensaio de protrombinase prediz a atividade antitrombótica in vivo. A Tabela 3 abaixo proporciona a inibição responsiva à dose da trombose in vivo no modelo babuino. A Tabela 3 proporciona também a atividade anti-fXa em amostras de plasma de babuino durante a infusão do controlo ou do composto de teste.

Tabela 3

Grupo Doseado Gama de Concentração no Plasma do Betrixaban (ng/mL) % Inibição da Deposição das Plaquetas % Inibição da Formação da Fibrina Controlo 0 0,00 0, 00 1 7-10 29, 71 -0,38 2 13-21 44,20 37,50 3 26-38 65,22 71,97 4 54-88 88,77 87,12 A FIG. 2 proporciona evidência adicional de que o ensaio in vitro é preditivo da atividade antitrombótica in vivo. Especificamente, a FIG. 2 mostra a inibição responsiva à dose da trombose in vitro no modelo babuino. A deposição das plaquetas marcadas com inIn ao longo do tempo na câmara venosa durante a infusão do betrixaban (n = 3 em cada dose). Animais de controlo foram infundidos com veiculo (n = 4) .

As FIGS. 3, 4A e 4B mostram a inibição da geração da trombina iniciada pelo fator de tecido em sangue total 48 humano pelo betrixaban comparada com o fondaparinux. A atividade da trombina foi quantificada pela clivagem do substrato fluorogénico. A resposta à dose da inibição da geração da trombina foi medida pela adição de quantidades variáveis de betrixaban e de fondaparinux a sangue total de onze dadores saudáveis. As medições das unidades de fluorescência relativa (UFR) do dador representativo são mostradas.

Este estudo mostrou as caracteristicas in vitro e in vivo do betrixaban como um inibidor potente do fXa humano purificado e o complexo de protrombinase. Especificamente, houve uma especificidade maior do que 86.000 vezes contra proteases humanas relacionadas tais como trombina e Proteína C ativada. Houve também uma inibição dependente da dose da geração da trombina iniciada pelo fator de tecido em sangue total humano e uma inibição dependente da dose da trombose em curso num modelo primata da trombose arteriovenosa sem estender os parâmetros de coagulação ou o tempo de hemorragia. Assim sendo, comparado com medidas padrão de coagulação, este ensaio foi mais preditivo da eficácia in vivo no modelo animal.

Exemplo 6 A Inibição da Protrombinase e do Fator Xa Não Solúvel Prediz a Eficácia dos Inibidores do fXa num Modelo in vivo de Trombose Venosa Profunda (TVP)

Este exemplo foi desenhado para testar a hipótese de que a potência dos inibidores do fXa contra o fXa incorporado no complexo de protrombinase prediria a eficácia antitrombótica in vivo. Oito inibidores do fXa de quatro séries químicas estruturalmente distintas com uma gama de atividades contra o fXa foram testados quanto à sua 49 capacidade para inibir o complexo da enzima protrombinase no plasma humano. A geração da trombina e subsequente clivagem de um substrato de trombina especifico foram usadas como uma medida da atividade da protrombinase, a atividade inibitória sendo definida pela concentração do inibidor requerida para produzir uma extensão de duas vezes no tempo até a produção máxima de trombina (2x lag) . Os tempos TP in vitro no coelho foram também determinados. Os tempos de protrombina (TP) in vitro no coelho foram determinados pela adição da tromboplastina ao plasma do coelho. A inibição no modelo de TVP no coelho foi avaliada como previamente descrito (Hollenbach et al., Thromb. Haemost. 1994; 71:357) e relacionada com as concentrações no plasma do fármaco.

Materiais e Métodos

Os compostos foram sintetizados (Zhu et al.; Curr. Top. Med. Chem. 2001; 2:101-119; Betz et al. Biochem., 1999; 36: 14582-91). A concentração do composto requerida para inibir a atividade amidolitica do fXa humano solúvel purificado (Haematologic Technologies) em 50% (CI50) foi medida pelo seguimento da formação de p-nitroanilina a partir do substrato de péptido Z-D-Arg-Gly-Arg pNA (Diapharma) a 405 nm num leitor de placa Spectramax (Molecular Devices) (Sinha et al., Eur. J. Pharmacol. 2000; 395: 51-59). A formação da trombina pela protrombinase foi avaliada em plasma pobre em plaquetas humano agrupado tratado com Reptilase® pela medição da p-nitroanilina a 405 nm depois da clivagem do substrato do péptido trombina Pefachrome TG (Pentapharma) (Sinha et al., ATVB; 2003; 23: 1098-1104). A concentração do composto que elicitou um aumento de duas vezes no tempo da geração de trombina máxima foi registada como a concentração 2x lag. A eficácia antitrombótica contra a trombose venosa profunda no coelho foi determinada 50 pela medição da acreção dos trombos num fio de algodão colocado na veia cava por meio de um cateter inserido na veia femoral esquerda. A diminuição no peso dos trombos depois de uma infusão de duas horas do composto foi expressa relativamente ao controlo do veículo (Hollenbach et ai., Thromb. Haemost. 1994; 71: 357).

As concentrações do fármaco no plasma de coelho foram medidas por CL-EM/EM. Os tempos de protrombina no coelho foram medidos usando Tromboplastina C Plus (Dade) num temporizador de coagulação automatizado (ACL 3000,

Instrumentation Laboratory) (Sinha, et ai., Eur. J. Pharmacol., 2000; 395: 51-59).

Resultados

Todos os compostos inibiram o fXa solúvel em 50% a concentrações menores do que 10 nM. No entanto, a ordem de classificação das potências de inibição do fXa solúvel diferiu daquela requerida para inibir o complexo de protrombinase. Os resultados são mostrados na Tabela 4.

Tabela 4

No. Classe do Cmpt Ciso do fXa (nM) 2x lag da protrombinase (μΜ) Concentração no Plasma na TVP (μΜ) Inibição da Trombose (%) Razão de Ex+ressão 2x do TP em coelho (μΜ) 1 Cetotiazol 0,5 0,18 0,06 94 7 2 Antranilamida 1,3 0,22 1,14 37 2,7 3 Antranilamida 0,7 0,24 1,65 47 1,7 4 Antranilamida 0,4 0,25 1,04 47 1,0 5 Antranilamida 0,8 0,34 3,39 47 1,5 6 Naftalenopirazol 4,4 0,92 5,2 11 4,7 7 1,2- Benzenodiamina 3, 5 1,35 4,6 19 8,8 8 Isoxazol 8,2 1,66 9,2 0 64

Existiu também uma correlação pobre entre o valor de 2x lag da inibição da protrombinase e a concentração requerida 51 para alcançar uma mudança 2x no TP no coelho (R2 = 0,57) . Nem as atividades da inibição do fXa nem a mudança no TP no coelho predisseram a atividade no modelo da trombose venosa profunda (TVP) in vivo. Por contraste, os compostos poderam ser largamente divididos em 3 niveis de eficácia para a inibição do crescimento de trombos in vivo dependendo da sua potência no ensaio de protrombinase in vitro. O composto 1 teve o valor de 2x lag mais baixo de 0,18 μΜ e foi o inibidor mais potente da trombose in vivo com 94% de inibição a uma concentração no plasma de 65 nM. O segundo grupos de compostos, com valores de 2x lag no ensaio de protrombinase variando de 0,22 a 0,34 μΜ, inibiu a formação de trombos in vivo em 37 a 47% a concentrações no plama variando de 1,04 a 3,39 μΜ. Os compostos na terceira categoria foram os inibidores da protrombinase menos potentes (valores de 2x lag maiores do que 0,92 μΜ) e foram incapazes de inibir significativamente a trombose in vivo mesmo a concentrações no plasma de 9,2 μΜ. Estes dados mostram que o valor de 2x lag obtido no ensaio de protrombinase, e a não inibição do fXa solúvel ou a extensão do tempo TP no coelho, é o mais preditivo da eficácia inibidora do fXa no modelo de TVP in vivo em coelho.

Dadas as limitações dos anticoagulantes correntes, a posição do fator Xa (fXa) na convergência de ambas as vias extrínseca e intrínseca da coagulação do sangue tornou-o um alvo atrativo para o desenvolvimento de novas terapias. No que diz respeito à investigação da relação de atividade estrutural (RAE) de potenciais inibidores do fXa, ensaios medindo a inibição da atividade da protease fXa em fase de solução são um ponto de partida óbvio. No entanto, a capacidade dos compostos para inibir o fXa solúvel, purificado não é um reflexo verdadeiro da interação entre o 52 inibidor e a enzima in vivo. Isto é porque a maior contribuição do fXa para o processo de coagulação ocorre quando ele é combinado com o fator Va como parte do complexo de protrombinase no qual a atividade da protease é aumentada 300.000 vezes em relação ao fXa em fase de solução. Esta atividade do fXa aumentada no complexo de protrombinase é muito mais difícil de inibir, logo qualquer avaliação da potência anti-fXa do composto deve incluir uma avaliação da inibição da protrombinase. A atividade da protrombinase pode ser medida em plasma pobre em plaquetas (PPP) e, sob estas condições, também tem em conta o efeito da ligação da proteína no plasma na potência do composto. Outra forma mais direta de avaliar o efeito dos compostos no processo de anticoagulação é através do uso de ensaios de coagulação in vitro tais como o tempo de protrombina (TP) e o tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPa).

Exemplo 7

Avaliação do Bioensaio em Estudo de Doses Múltiplas Ascendente A FIG. 5 mostra dados de ensaios in vitro realizados com plasma de voluntários humanos saudáveis oralmente doseados com betrixaban. Nove sujeitos receberam cada um cápsulas de 40, de 80 ou de 120 mg a cada 12 horas durante dez dias consecutivos. Os sujeitos de controlo (12) foram tratados com placebo ou controlo de fármaco não anticoagulante. As amostras de plasma obtidas dos sujeitos foram avaliadas no ensaio biológico in vitro da geração da trombina iniciada pelo fator de tecido. As amostras de plasma foram também analisadas quanto à concentração do fármaco usando cromatografia líquida de alta resolução com espetroscopia de massa tandem. Os resultados mostram uma correlação responsiva à dose entre a concentração do fármaco no plasma 53 do betrixaban e a inibição da geração da trombina no ensaio biológico.

Exemplo 8

Concentrações Terapêuticas Humanas de Betrixaban

Foram realizados ensaios de geração da trombina como descrito no Exemplo 4, com os compostos adicionados ex vivo ao sangue total humano. Os valores de TP e TTPa nas várias espécies foram determinados a partir dos compostos adicionados ao plasma pobre em plaquetas. As amostras foram analisadas num ACL3000 plus (Coulter), o TP determinado usando Tromboplastina C plus Dade® e o TTPa determinado usando o reagente de TTP ativada FS Dade® Actin®.

Ambos o betrixaban e o fondaparinux, um inibidor indireto do fXa, inibiram significativamente a geração de TAT e de F1.2 no sangue total humano. Comparado com um nivel terapêutico de fondaparinux (200 nM), o betrixaban (200 nM) foi mais potente na supressão de ambos os marcadores da geração de trombina.

Materials e Métodos

Doses múltiplas de betrixaban foram avaliadas em três modelos animais. O primeiro modelo, que mediu a acreção dos coágulos em fios de algodão colocados na veia cava abdominal do coelho, comparou a inibição da massa dos trombos pelo betrixaban com aquela de doses supraterapêuticas de enoxaparina (uma heparina BPM). O segundo modelo comparou a capacidade do betrixaban em manter a patência dos vasos sob condições de fluxo arterial em trombose induzida por FeCl3 na artéria carótida de rato 54 com aquela alcançada pela enoxaparina ou clopidogrel (um agente antiplaquetário). 0 terceiro modelo investigou a inibição da deposição de plaquetas marcadas com i:L1In em enxertos de dracon e câmaras de expansão em shunts arteriovenosos femorais em babuínos. Em todos os modelos testados, o betrixaban e o fondaparinux foram administrados como infusões IV e o clopidogrel foi oralmente doseado durante três dias. Os TP e TTPa ex vivo foram medidos em todos os modelos. Os modelos englobam critérios estringentes de trombose arterial e venosa e o betrixaban produziu atividade antitrombótica responsiva à dose em cada um dos três modelos. A eficácia do betrixaban comparou-se favoravelmente com os níveis supraterapêuticos da enoxaparina e do clopidogrel. A eficácia na trombose venosa no coelho foi determinada pela medição da acreção dos trombos em fios de algodão colocados na veia cava por meio de um cateter inserido na veia femoral esquerda, como descrito por Hollenbach et al., Thromb. Haemost. 1994; 71: 357-362, incorporado por referência na sua totalidade aqui. A diminuição do peso dos trombos depois de uma infusão de duas horas do composto foi expressa em relação ao veículo de controlo. Ver também Sinha, et al., Eur. J. Pharmacology. 395: 51-59 (2000), incorporado por referência na sua totalidade aqui. O modelo de FeCl3 de rato foi adaptado de Kurz, K.D. et al. Thromb. Res. 1990; 60(4): 269-280, incorporado por referência na sua totalidade aqui, utilizando a artéria carótida esquerda. Uma estenose da artéria foi aplicada com um ligamento de seda reduzindo o fluxo de sangue em 50% com um ligeira lesão por esmagamento pela aplicação de FeCl3 a 50% durante a duração da experiência. O fluxo de sangue foi 55 monitorizado através de uma sonda de fluxo de Doppler pulsado e registado durante 90 minutos após a aplicação de FeCl3. A enoxaparina e o betrixaban foram administrados por IV. O clopidogrel foi administrado oralmente q.d. durante 3 dias. O modelo babuino foi realizado na Universidade de Saúde & Ciência do Oregon seguindo os procedimentos descritos por Hanson, S.R. et al. J. Clin. Invest. 1993; 92: 2003-2012, incorporado por referência na sua totalidade aqui. Brevemente, a trombose é induzida por dois dispositivos trombogénicos diferentes incorporados num shunt de arterial-venoso (A-V) femoral. O modelo arterial utiliza um ambiente de alto stress de cisalhamento para promover a formação de trombos num enxerto de dracon. O modelo venoso utiliza um ambiente de baixo stress de cisalhamento para promover a formação de trombos numa câmara de expansão. As plaquetas e a fibrina são pré-marcadas com fibrinogénio niIn e 125I para medir a deposição das plaquetas e a acumulação da fibrina, respetivamente.

Resultados

Surpreendentemente, ao contrário dos modelos de roedor, a eficácia nos primatas foi atingida a uma dose muito menor com prolongação minima do TP. A especificidade quanto à espécie foi também demonstrada por extensões in vitro do TP e do TTPa em plasma de rato, de coelho, de babuino e de humano. Uma razão de expressão de 2x do TP foi atingida a concentrações de 8,9, 1,6, 1 e 0,4 μΜ respetivamente. Os dados indicam que as doses de betrixaban que inibem a geração de trombina em sangue humano e que proporcionam anticoagulação similar em babuínos doseados a 0,05-0,49 mg/kg podem ser suficientes para prevenir a trombose venosa em humanos. A modelação comparativa de extensões de mudança 56 no TP a níveis de eficácia antitrombótica também nos leva a prever que a atividade terapêutica humana pode ser atingida sem mudanças concomitantes nos parâmetros de coagulação ex vivo. Os dados são apresentados na Tabela 5.

Tabela 5

Modelo de Trombose Agente, Dose Atividade Antitrombótica Razão de Expressão do TTPa Razão de Expressão do TP Veia Cava de Coelho betrixaban, 3 mg/kg 7 6% de inibição 2,22 2,34 Enoxaparina, 2,2 mg/kg 96% de inibição 2,06 1,01 Carótida de Rato betrixaban, 19,1 mg/kg 90% de patência 1,69 2,20 Enoxaparina, 7,6 mg/kg 7 0% de patência 3,49 1,19 Clopidogrel, 3 mg/kg/dia 80% de patência 1,03 1,01 Arteriovenosa de Babuíno betrixaban, 0,49 mg/kg 90% de inibição (venoso), 32% de inibição (arterial) 1,29 1,17

Exemplo 9

Comparação do Betrixaban com a Enoxaparina num Ensaio

Randomizado para a Prevenção de Eventos Tromboembólicos

Venosos após Substituições Totais do Joelho

Este estudo incluiu 215 pacientes submetidos a substituição total do joelho (STJ) que foram randomizados numa razão de 2:2:1 em relação a ou 15 mg ou de 40 mg de betrixaban doseados oralmente duas vezes ao dia ou 30 mg de enoxaparina (Enox) doseados subcutaneamente duas vezes ao 57 dia durante 10 a 14 dias. O estudo foi cego para a dose de 15 mg versus a dose de 40 mg, mas não para o betrixaban vs. Enox. O ponto final de eficácia principal foi a incidência de tromboembolismo venoso ("TEV") (trombose venosa profunda sintomática ou assintomática num venograma unilateral obrigatório ou embolismo pulmonar sintomático) ao longo do Dia 10 a 14. Os pontos finais de segurança incluíram a incidência de hemorragias grandes e não grandes clinicamente significativas ao longo do dia após venografia. Todos os pontos finais de eficácia e de hemorragia foram adjudicados por um comité de adjudicação central independente, cego.

Materiais e Métodos O betrixaban neste estudo foi administrado em cápsulas de gelatina. As cápsulas continham maleato de betrixaban, monoidrato de dextrose e estearato de magnésio. A dose inicial de betrixaban foi tomada 6 a 8 horas após cirurgia e duas vezes ao dia (BID) posteriormente. A enoxaparina foi administrada subcutaneamente 12 a 24 horas após cirurgia e a cada 12 horas (q 12 h) posteriormente. O tratamento continuou durante 10 a 14 dias a não ser que se encontrasse um critério de paragem especificado no protocolo. A última dose da medicação do estudo foi administrada na manhã da venografia obrigatória programada da perna operada (Dia 10 a 14).

As amostras de sangue para avaliação das concentrações do fármaco no plasma e das medições farmacodinâmicas foram obtidas no rastreio, 1 a 4 horas após administração da dose matinal da medicação do estudo no Dia 2, no dia de alta e antes do venograma obrigatório no Dia 10 a 14. As amostras de plasma foram analisadas quanto ao betrixaban usando 58 cromatografia líquida de alta resolução com espetroscopia de massa tandem. 0 método foi validado para uma gama de 0,100-50,0 ng/mL, com base na análise de 0,2 mL de plasma. A quantificação foi realizada usando uma curva de calibração padrão gerada por análise de regressão dos mínimos quadrados ponderados. A anticoagulação foi medida por um ensaio de inibição da geração de trombina como discutido no Exemplo 4 e a atividade anti-fXa adicionalmente ao tempo de tromboplastina parcial ativada (PPTa), ao tempo de

protrombina (TP) e à razão normalizada internacional (RNI). O ensaio de unidade de fXa foi adaptado do conjunto de heparina de BPM Coatest (Diapharma) e modificado para um formato de placa com 96 poços. Neste ensaio, os padrões e as amostras do paciente foram ensaiados em duplicado e o limite de quantificação foi de 0,05 U de anti-Xa/mL. A geração de trombina foi iniciada pela adição de fator de tecido (Innovin, Dade Behring) e de cálcio ao plasma do paciente anticoagulado por citrato (0,1 mL). A formação de trombina foi medida pela clivagem de um substrato de trombina específico (Z-GGR-AMC, Bachem) ao longo de um período de 10 minutos. As unidades de fluorescência relativa foram medidas num leitor de fluorescência

FlexStation (Molecular Devices) e usadas para quantificação da geração de trombina. Todas as amostras de plasma dos pacientes foram ensaiadas em triplicado e a inibição da geração de trombina registada como mudança nas unidades fluorescentes em relação à linha de fundo para cada indivíduo.

Resultados

Um efeito dependente da dose e da concentração do betrixaban na inibição da geração de trombina e dos níveis anti-fXa foi observado. 175 pacientes (81,4%) tiveram uma 59 avaliação da eficácia e da segurança como mostrado na Tabela 6.

Tabela 6

Resultados de eficácia e segurança primários 15 mg de betrixaban BID 40 mg de betrixaban BID 30 mg de Enox BID % TEV (Cl a 95%) 20 (12-32) 15 (8-27) 10 (3-23) % Grandes Hemorragias (Cl a 95%) 0 (0-4) 0 (0-4) 2 (0-12) Hemorragias não grandes clinicamente signif. 0 (0-4) 2 (0-8) 5 (1-16) A FIG. 6 mostra as taxas de TEV e intervalos de confiança de 95% para o betrixaban e a enoxaparina como determinados neste estudo com venografia unilateral entre os Dias 8 e 10 e para controlos históricos de enoxaparina de estudos usando venografia vilateral realizada entre os Dias 10 e 14 pós-STJ. A FIG. 9 representa as concentrações de betrixaban no plasma após a segunda dose (Dia 2), aquando da alta e no momento da venografia. Como expetável dado a longa meia-vida do betrixaban, as concentrações de fármaco médias aumentaram após as primeiras doses e pareceram atingir o estado de equilibrio aquando da alta (Dia mediano 4) para ambos os grupos com dose de betrixaban. O betrixaban exibiu um efeito dependente da dose e dependente da concentração na inibição da geração de trombina e niveis de anti-Xa (FIG. 7 e 8) . 0 efeito de 15 mg de betrixaban na inibição da geração de trombina foi similar àquele observado com a enoxaparina enquanto o efeito visto com 40 mg de betrixaban foi mais pronunciado. Reciprocamente, o efeito visto na atividade anti-Xa foi similar para 40 mg de betrixaban e enoxaparina e menos com 15 mg de betrixaban. O tratamento 60 com betrixaban não afetou significativamente outros parâmetros de coagulação (i.e. PPTa, PT e RNI). O betrixaban foi eficaz na prevenção de TEV após STJ e foi seguro e bem tolerado. É para ser entendido que enquanto a invenção tenha sido descrita em conjunto com as formas de realização acima, a descrição e exemplos precedentes destinam-se a ilustrar e não limitar a âmbito da invenção. Outros aspetos, vantagens e modificações dentro do âmbito da invenção serão aparentes para aqueles peritos na técnica à qual a invenção pertence.

Lisboa, 29 de abril de 2013

Claims (13)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma formulação de dose unitária compreendendo uma composição farmacêutica compreendendo um transportador farmaceuticamente aceitável e uma quantidade inibidora da coagulação do composto da Fórmula II:

II ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em que a quantidade inibidora da coagulação do composto é uma dose diária agregada de entre 0,2 e 2,0 mg/kg.

2. A formulação de dose unitária da reivindicação 1, em que o sal farmaceuticamente aceitável do composto é um sal de maleato.

3. Um composto para uso num método de inibição da coagulação num paciente humano com necessidade dele, em que o composto é da Fórmula II: 2

ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, e em que o método compreende a administração ao paciente de uma quantidade inibidora da coagulação do referido composto, em que a quantidade inibidora da coagulação do composto é uma dose diária agregada de entre 0,2 e 2,0 mg/kg.

4. 0 composto da reivindicação 3, em que o sal farmaceuticamente aceitável do composto é um sal de maleato.

5. O composto da reivindicação 3 ou reivindicação 4, em que o composto é administrado ao paciente uma vez por dia.

6. 0 composto da reivindicação 3 ou reivindicação 4, em que o composto é administrado ao paciente duas vezes por dia.

7. O composto da reivindicação 3 ou reivindicação 4, em que o composto é administrado ao paciente três vezes por dia.

8. A formulação de dose unitária da reivindicação 1 ou 2, ou o composto de qualquer uma das reivindicações 3-7, 3 em que a quantidade inibidora da coagulação do composto é uma dose diária agregada de entre 0,2 e 1,5 mg/kg.

9. A formulação de dose unitária da reivindicação 1 ou 2, ou o composto de qualquer uma das reivindicações 3-7, em que a quantidade inibidora da coagulação do composto é uma dose diária agregada de entre 0,4 e 1,5 mg/kg.

10. A f ormulação de dose unitária da reivindicação 1 ou 2, ou o composto de qualquer uma das reivindicações 3-7, em que a quantidade inibidora da coagulação do composto é uma dose diária agregada de entre 0,4 e 1,2 mg/kg.

11. A formulação de dose unitária da reivindicação 1 ou 2, ou o composto de qualquer uma das reivindicações 3-7, em que a quantidade inibidora da coagulação do composto é uma dose diária agregada de entre 0,43 e 1,15 mg/kg.

12. A formulação de dose unitária da reivindicação 1 ou 2, ou o composto de qualquer uma das reivindicações 3-7, em que a quantidade inibidora da coagulação do composto é uma dose diária agregada de entre 0,45 e 0,55 mg/kg.

13. A formulação de dose unitária da reivindicação 1 ou 2, ou o composto de qualquer uma das reivindicações 3-7, em que a quantidade inibidora da coagulação do composto produz um nivel de soro do composto de 1 μΜ ou menos quando administrada a um humano. Lisboa, 29 de abril de 2013