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PT1992635E - Oligonucleótidos de sequência imunoestimuladora e métodos de utilização dos mesmos - Google Patents

Oligonucleótidos de sequência imunoestimuladora e métodos de utilização dos mesmos Download PDF

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PT1992635E
PT1992635E PT08013086T PT08013086T PT1992635E PT 1992635 E PT1992635 E PT 1992635E PT 08013086 T PT08013086 T PT 08013086T PT 08013086 T PT08013086 T PT 08013086T PT 1992635 E PT1992635 E PT 1992635E
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PT
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PT08013086T
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Dino Dina
Karen L Fearon
Jason Marshall
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Dynavax Tech Corp
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Description

ΕΡ 1 992 635/ΡΤ
DESCRIÇÃO "Oligonucleótidos de sequência imunoestimuladora e métodos de utilização dos mesmos"
CAMPO TÉCNICO 0 presente invento refere-se a polinucleótidos imunomoduladores. Refere-se também à administração dos polinucleótidos para modular uma resposta imunitária.
ANTECEDENTES DO INVENTO 0 tipo de resposta imunitária gerada à infecção ou outra provocação antigénica pode geralmente ser distinguido através do subconjunto de células T auxiliares (Th) envolvido na resposta. 0 subconjunto Thl é responsável por funções clássicas mediadas por células tais como hipersensibilidade de tipo retardado e activação de linfócitos T citotóxicos (CTL), enquanto o subconjunto Th2 funciona mais eficazmente como auxiliar da activação de células B. 0 tipo de resposta imunitária a um antigénio é geralmente influenciado pelas citocinas produzidas pelas células que respondem ao antigénio. Crê-se que as diferenças nas citocinas segregadas por células Thl e Th2 reflectem diferentes funções biológicas destes dois subconjuntos. Ver, por exemplo, Romagnani, Ann. Allergy Asthma Immunol. 85: 9-18, 2000. O subconjunto Thl pode ser particularmente adequado para responder a infecções virais, patogénios intracelulares e células tumorais porque segrega IL-2 e IFN-γ, que activam CTL. O subconjunto Th2 pode ser mais adequado para responder a bactérias de vida livre e parasitas helmínticos e pode mediar reacções alérgicas, uma vez que se sabe que IL-4 e IL-5 induzem a produção de IgE e a activação de eosinófilos, respectivamente. Em geral, as células Thl e Th2 segregam padrões distintos de citocinas e assim um tipo de resposta pode moderar a actividade do outro tipo de resposta. Uma mudança no equilíbrio Thl/Th2 pode resultar numa resposta alérgica, por exemplo, ou alternativamente, numa maior resposta de CTL. 2 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ
Para muitas doenças infecciosas, tais como tuberculose e malária, as respostas de tipo Th2 são de pouco valor protector contra a infecção. As vacinas propostas utilizando pequenos péptidos derivados do antigénio alvo e outros agentes antigénicos actualmente utilizados que evitam a utilização de partículas virais intactas potencialmente infecciosas, nem sempre desencadeiam a resposta imunitária necessária para alcançar um efeito terapêutico. As vacinas baseadas em proteínas induzem tipicamente respostas imunitárias de tipo Th2, caracterizadas por elevados títulos de anticorpos neutralizadores mas sem significativa imunidade mediada por células.
Para além disso, alguns tipos de respostas de anticorpos são inapropriados em certas indicações, mais nitidamente em alergia onde uma resposta de anticorpos IgE pode resultar em choque anafiláctico. Geralmente, as respostas alérgicas envolvem também respostas imunitárias de tipo Th2. As respostas alérgicas, incluindo as da asma alérgica, são caracterizadas por uma resposta de fase inicial, que ocorre dentro de segundos a minutos desde a exposição ao alergénio e se caracteriza por desgranulação celular, e uma resposta de fase tardia, que ocorre 4 a 24 horas depois e se caracteriza por infiltração de eosinófilos no local de exposição ao alergénio. Especificamente, durante a fase inicial da resposta alérgica, o alergénio liga-se de forma cruzada a anticorpos IgE em basófilos e mastócitos, que por sua vez desencadeiam desgranulação e a subsequente libertação de histamina e outros mediadores de inflamação de mastócitos e basófilos. Durante a resposta de fase tardia, os eosinófilos infiltram-se no local de exposição ao alergénio (onde resulta danos nos tecidos e disfunção). A imunoterapia de antigénios para distúrbios alérgicos envolve a injecção subcutânea de pequenas quantidades, mas gradualmente crescentes, de antigénio. Tais tratamentos de imunização apresentam o risco de indução de anafilaxia mediada por IgE e não se dirigem eficientemente a eventos mediados por citocinas da resposta alérgica de fase tardia. Até agora, esta abordagem produziu apenas um sucesso limitado. 3
ΕΡ 1 992 635/PT A administração de certas sequências de ADN, geralmente conhecidas como sequências imunoestimuladoras, induz uma resposta imunitária com uma tendência para o tipo Thl tal como indicado pela segregação de citocinas associadas a Thl. A administração de um polinucleótido imunoestimulador com um antigénio resulta numa resposta imunitária de tipo Thl ao antigénio administrado. Roman et al. , Nature Med. 3: 849-854, 1997. Por exemplo, ratinhos injectados intradermicamente com β-galactosidase (β-Gal) de Escherichia coli (E. coli) em solução salina ou no adjuvante alúmen responderam produzindo anticorpos IgGl e IgE específicos, e células CD4+ que segregavam IL-4 e IL-5, mas não IFN-γ, demonstrando que as células T eram predominantemente do subconjunto Th2. No entanto, os ratinhos injectados intradermicamente (ou com um aplicador de raspagem da pele) com ADN plasmídico (em solução salina) codificando β-Gal e contendo uma sequência imunoestimuladora responderam produzindo anticorpos IgG2a e células CD4+ que segregavam IFN-γ, mas não IL-4 e IL-5, demonstrando que as células T eram predominantemente do subconjunto Thl. Para além disso, a produção de IgE específica pelos ratinhos injectados com ADN plasmídico foi reduzida em 66-75%. Raz et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93: 5141-5145, 1996. Em geral, a resposta a imunização com ADN nu caracteriza-se pela produção de IL-2, TNF-α e IFN-γ por células T CD4+ estimuladas com antigénio, o que é indicativo de uma resposta de tipo Thl. Isto é particularmente importante no tratamento de alergia e asma tal como mostrado pela menor produção de IgE. A capacidade dos polinucleótidos imunoestimuladores para estimularem uma resposta imunitária de tipo Thl foi demonstrada com antigénios bacterianos, antigénios virais e com alergénios (ver, por exemplo, WO 98/55495).
As referências que descrevem actividade imunoestimuladora de polinucleótidos incluem: Krug et al. (2001) Eur. J. Immunol. 31:3026; Bauer et al. (2001) J. Immunol. 166:5000; Klinman et al. (1999) Vaccine 17:19; Jahn-Schmid et al. (1999) J. Allergy Clin. Immunol. 104:1015; Tighe et al. (2000) Eur. J. Immunol. 30:1939; Shirota et al. (2000) J. Immunol. 164:5575; Klinman et al. (1999) Infect. Immun. 67:5658; Sur et al. (1999) J. Immunol. 162:6284; Magone et al. (2000) Eur. J. Immunol. 30:1841; Kawarada et al. (2001) J. Immunol. 167:5247; 4 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ
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Os polinucleótidos imunomoduladores incluem geralmente uma sequência CG. Os nucleótidos flanqueando o CG de um PIM parecem também ter um papel na actividade imunomoduladora do polinucleótido. Permanece a necessidade de identificação continuada de polinucleótidos imunomoduladores.
DIVULGAÇÃO DO INVENTO O presente invento refere-se a polinucleótidos imunomoduladores (PIM) e à modulação de respostas imunitárias em indivíduos utilizando estes polinucleótidos, particularmente humanos.
Num aspecto, o presente invento proporciona polinucleótidos imunomoduladores. Em certas concretizações, o presente invento inclui composições imunomoduladoras que compreendem qualquer um dos polinucleótidos imunomoduladores do presente invento. As composições podem também incluir, por exemplo, um excipiente farmaceuticamente aceitável ou qualquer um de uma variedade de outros componentes, tais como um antigénio. 7 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ
Em particular, ο presente invento proporciona um polinucleótido imunomodulador compreendendo a sequência apresentada em SEQ ID NO:171, em que a sequência apresentada em SEQ ID NO: 171 está na extremidade 5' do polinucleótido. É também descrito aqui um polinucleótido imunomodulador que compreende (a) uma sequência palindrómica compreendendo pelo menos dois dinucleótidos CG, em que os dinucleótidos CG estão separados por 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 bases e em que a sequência palindrómica tem pelo menos 8 bases de comprimento; e (b) uma (TCG)y, em que y é 1 ou 2, em que o T 5' da (TCG)y está posicionado a 0, 1, 2 ou 3 bases da extremidade 5' do polinucleótido e em que a (TCG)y está separada da extremidade 5' da sequência palindrómica por 0, 1 ou 2 bases. Nalguns polinucleótidos imunomoduladores, descritos neste parágrafo ou noutro local neste pedido, a sequência palindrómica tem uma composição de bases de menos de dois terços de G e C. Nalguns casos, a sequência palindrómica tem uma composição em bases de mais de um terço de A e T. É também aqui descrito um polinucleótido imunomodulador que compreende (a) uma sequência palindrómica compreendendo pelo menos dois dinucleótidos CG, em que os dinucleótidos CG estão separados por 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 bases e em que a sequência palindrómica tem pelo menos 8 bases de comprimento; e (b) uma sequência (TCG)y, em que y tem 1 ou 2, em que o T 5' da sequência (TCG)y está posicionado a 0, 1, 2 ou 3 bases da extremidade 5' do polipéptido, e ainda em que a sequência palindrómica de (a) inclui toda ou parte da sequência (TCG)y e em que um CG da sequência (TCG)y pode ser um dos dinucleótidos CG da sequência palindrómica de (a). É também aqui descrito um polinucleótido imunomodulador que compreende (a) 5 ' -Nx (TCG (Nq) ) yNw (XiX2CGX2 'Xi' (CG) p) z (SEQ ID NO: 156) em que N são nucleósidos, x=0-3, y=l-4, w=-2, -1, 0, 1 ou 2, p=0 ou 1, q=0, 1 ou 2, e z=l-20, Xy e Xi' são nucleósidos auto-complementares, X2 e X2' são nucleósidos auto-complementares, e em que o T 5' da sequência (TCG(Nq))y está a 0-3 bases da extremidade 5' do polinucleótido; e (b) uma sequência palindrómica de pelo menos 8 bases de comprimento em que a sequência palindrómica compreende a primeira (XiX2CGX2 'Xi' ) das sequências (XiX2CGX2 ' Xi' (CG) p) z. 8 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ
Nalguns casos, Χι e Χ2 são cada um A ou T. Num PIM com w=-l, a base 3' da sequência (TCG(Nq) ) y é o Xi 5' da primeira sequência (XiX2CGX2'Xx' (CG) p) .
Também aqui descrito está um polinucleótido imunomodulador que compreende (a) 5 ' -Nx (TCG (Nq) ) yNw (XiX2CGX3X3 ' CGX2 'Xi' (CG) p) z (SEQ ID NO: 159) em que N são nucleósidos, x=0-3, y=l-4, w=-2, -1, 0, 1 ou 2, p=0 ou 1, q=0, 1 ou 2, e z=l-20, Xi e Χχ' são nucleósidos auto-complementares, X2 e X2' são nucleósidos auto-complementares, X3 e X3' são nucleósidos auto-complementares e em que o T 5' da sequência (TCG(Nq))y está a 0-3 bases da extremidade 5' do polinucleótido; e (b) uma sequência palindrómica de pelo menos 10 bases de comprimento em que a sequência palindrómica compreende a primeira (XxX2CGX3X3'CGX2'Xx') (SEQ IDNO:216) das sequências (XiX2CGX3X3,CGX2TXi' (CG)P) z (SEQ IDNO:217). Nalguns casos, quando p=l, Χχ, X2, e X3 são cada um A ou T. Nalguns casos, quando p=0, pelo menos dois de X3, X2 e X3 são A ou T.
É também aqui descrito um polinucleótido imunomodulador que compreende (a) 5 ' -Nx (TCG (Nq) ) yNw (XiX2X3X4X5CGX5' X4 ' X3' X2 ' Xi' (CG)P)Z (SEQ ID NO:160) em que N são nucleósidos, x=0-3, y=l-4, w=-3, -2, -1, 0, 1 ou 2, p=0 ou 1, q=0, 1 ou 2, e z=l-20, Χχ e Χχ' são nucleósidos auto-complementares, X2 e X2' são nucleósidos auto-complementares, X3 e X3' são nucleósidos auto-complementares, X4 e X4' são nucleósidos auto-complementares, X5 e X5' são nucleósidos auto-complementares, e em que o T 5' da sequência (TCG(Nq))y está a 0-3 bases da extremidade 5' do polinucleótido; e (b) uma sequência palindrómica de pelo menos 12 bases de comprimento em que a sequência palindrómica compreende a primeira (XiX2X3X4X5CGX5 ' X4' X3 ' X2 ' Χχ' ) (SEQ ID NO:218) das sequências (XxX2X3X4X5CGX5 'X4'X3 'X2 ' Xi' (CG) p) z (SEQ ID NO: 219) . Nalguns casos, pelo menos três de Χχ, X2, X3, X4, e X5 são A ou T. É também aqui descrito um polinucleótido imunomodulador que compreende (a) 5 ' -Nx (TCG (Nq) ) yNw (CGXxXx' CG (CG) p) z (SEQ ID NO: 161) em que N são nucleósidos, x=0-3, y=l-4, w=-2, 0, 1 ou 2, p=0 ou 1, q=0, 1 ou 2, e z=l-20, em que Χχ e Χχ' são nucleósidos auto-complementares e em que o T 5' da sequência (TCG(Nq))y está a 0-3 bases da extremidade 5' do polinucleótido; e (b) uma sequência palindrómica com pelo 8 9
ΕΡ 1 992 635/PT bases de comprimento em que a sequência palindrómica compreende a primeira (CGXiXi'CG) das sequências (CGXiXi' CG (CG) p) z. É também aqui descrito um polinucleótido imunomodulador que compreende (a) 5 ' -Nx (TCG (Nq) ) yNw (XiCGCGXi' (CG) p) (SEQ ID NO: 162) em que N são nucleósidos, x=0-3, y=l-4, w=-l, 0, 1 ou 2, p=0 ou 1, q=0, 1 ou 2, e z=l-20, Xi e Xi' são nucleósidos auto-complementares e em que o T 5' da sequência (TCG (Nq) ) y está a 0-3 bases da extremidade 5' do polinucleótido; e (b) uma sequência palindrómica de pelo 8 bases de comprimento em que a sequência palindrómica compreende a primeira (XiCGCGXi') das sequências (XiCGCGXi' (CG)p) z. É também aqui descrito um polinucleótido imunomodulador que compreende (a) 5 1 -Nx (TCG (Nq) ) yNw (XiX2CGCGX2 1 Xi1 (CG) p) z (SEQ ID NO: 163) em que N são nucleósidos, x=0-3, y=l-4, w=-2, -1, 0, 1 ou 2, p=0 ou 1, q=0, 1 ou 2, e z=l-20, Xi e Xi' são nucleósidos auto-complementares, X2 e X2' são nucleósidos auto-complementares, e em que o T 5' da sequência (TCG(Nq))y está a 0-3 bases da extremidade 5' do polinucleótido; e (b) uma sequência palindrómica de pelo menos 8 bases de comprimento em que a sequência palindrómica compreende a primeira (XiX2CGCGX2 ’ Xi ’ ) das sequências (XiX2CGCGX2 ' Xi ' (CG) p) z (SEQ ID NO:220). Nalguns casos, X2 e X2 são cada um A ou T. É aqui também descrito um polinucleótido imunomodulador que compreende (a) 5 '-Nx (TCG (Nq) ) yNw (X^XsCGCGXs'X2'Xi' (CG) p) z (SEQ ID NO: 164) em que N são nucleósidos, x=0-3, y=l-4, w=-3, -2, -1, 0, 1 ou 2, p=0 ou 1, q=0, 1 ou 2, e z=l-20, X2 e Χχ' são nucleósidos auto-complementares, X2 e X2' são nucleósidos auto-complementares, X3 e X3' são nucleósidos auto-complementares, e em que o T 5' da sequência (TCG(Nq))y está a 0-3 bases da extremidade 5' do polinucleótido; e (b) uma sequência palindrómica de pelo menos 10 bases de comprimento em que a sequência palindrómica compreende a primeira (X1X2X3CGCGX3'X2 ’Xi' ) (SEQ ID NO: 221) das sequências (X1X2X3CGCGX3'X2 ’Xi' (CG)P)Z (SEQ ID NO: 222) . Nalguns casos, quando p=l, Xi, X2, e X3 são cada um A ou T. Nalguns casos, quando p=0, pelo menos dois de Xi, X2, e X3 são A ou T. 10 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ É também aqui descrito um polinucleótido imunomodulador que compreende (a) 5 ' -Nx (TCG (Nq) ) yNw (CGXiX2X2 'Xi' CG (CG) p) z (SEQ ID NO: 165) em que N são nucleósidos, x=0-3, y=l-4, w=-2, 0, 1 ou 2, p=0 ou 1, q=0, 1 ou 2, e z=l-20, Xi e Xi' são nucleósidos auto-complementares, X2 e X2' são nucleósidos auto-complementares, e em que o T 5' da sequência (TCG(Nq))y está a 0-3 bases da extremidade 5' do polinucleótido; e (b) uma sequência palindrómica de pelo menos 8 bases de comprimento em que a sequência palindrómica compreende a primeira (CGX1X2X2 ' Xi' CG) das sequências (CGX1X2X2 ' Xi' CG (CG) p) z (SEQ ID NO:223). Nalguns casos, Xi e X2 são cada um A ou T.
Noutro aspecto, o presente invento proporciona um polinucleótido imunomodulador do presente invento para utilizar em modulação de uma resposta imunitária num indivíduo. Um polinucleótido imunomodulador do presente invento é administrado a um indivíduo numa quantidade suficiente para modular uma resposta imunitária no referido indivíduo. A imunomodulação de acordo com o presente invento pode ser praticada em indivíduos incluindo os que sofrem de um distúrbio associado a uma resposta imunitária de tipo Th2 (p.ex., alergias, asma induzida por alergia ou dermatite atópica), indivíduos que recebem vacinas tais como vacinas terapêuticas (p.ex., vacinas compreendendo um epítopo de alergia, um epítopo micobacteriano ou um epítopo associado a um tumor) ou vacinas profiláticas, indivíduos com cancro e indivíduos possuindo uma doença infecciosa.
Noutro aspecto, o presente invento proporciona um polinucleótido imunomodulador do presente invento para utilizar no aumento de interferão gama (IFN-γ) num indivíduo. É administrada ao referido indivíduo uma quantidade eficaz de um polinucleótido imunomodulador do presente invento. A administração de um polinucleótido imunomodulador de acordo com o presente invento aumenta o IFN-γ no indivíduo.
Noutro aspecto, o presente invento proporciona um polinucleótido imunomodulador do presente invento para utilizar no aumento de interferão alfa (IFN-α) num indivíduo. É administrada ao referido indivíduo uma quantidade eficaz de um polinucleótido imunomodulador do presente invento. A 11 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ administração de um polinucleótido imunomodulador de acordo com o presente invento aumenta o IFN-α no indivíduo.
Noutro aspecto, o presente invento proporciona um polinucleótido imunomodulador do presente invento para utilizar no melhoramento de um ou mais sintomas de uma doença infecciosa. É administrada uma quantidade eficaz de um polinucleótido imunomodulador do presente invento a um indivíduo possuindo uma doença infecciosa. A administração de um polinucleótido imunomodulador de acordo com o presente invento melhora um ou mais sintomas da doença infecciosa.
Noutro aspecto, o presente invento proporciona um polinucleótido imunomodulador do presente invento para utilizar no melhoramento de um ou mais sintomas de um distúrbio relacionado com IgE. É administrada uma quantidade eficaz de um polinucleótido imunomodulador do presente invento a um indivíduo possuindo um distúrbio relacionado com IgE. A administração de um polinucleótido imunomodulador de acordo com o presente invento melhora um ou mais sintomas do distúrbio relacionado com IgE. 0 presente invento proporciona também a utilização de um polinucleótido imunomodulador do presente invento para o fabrico de um medicamento para tratamento de asma e um polinucleótido imunomodulador de acordo com o presente invento para utilizar no tratamento de asma. São também aqui descritos estojos, de preferência para realizar o presente invento. Os estojos compreendem geralmente um polinucleótido imunomodulador do presente invento (geralmente num recipiente adequado) , e podem ainda conter instruções para a utilização do polinucleótido imunomodulador em imunomodulação de um indivíduo.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Fig. 1 é um gráfico representando a quantidade de IFN-a produzida (pg/ml) a partir de PBMC humanas em resposta a doses variáveis de quatro PIM diferentes: SEQ ID N0:1, 27, 113 e 172. 12 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ A Fig. 2 contém gráficos representando a actividade lítica de células NK estimulada por PIM.
MODOS DE REALIZAÇÃO DO INVENTO
Determinámos polinucleótidos imunomoduladores e métodos para modulação de respostas imunitárias em indivíduos, particularmente seres humanos, utilizando estes polinucleótidos imunomoduladores. As composições do presente invento compreendem um polinucleótido imunomodulador do presente invento. Os polinucleótidos imunomoduladores do invento compreendendo a sequência apresentada em SEQ ID NO:171 em que a sequência apresentada em SEQ ID NO: 171 está na extremidade 5' do polinucleótido.
Verificámos que os polinucleótidos imunomoduladores do presente invento modulam eficientemente células imunitárias, incluindo células humanas, numa variedade de modos. Observámos que os polinucleótidos imunomoduladores do presente invento podem estimular eficazmente a produção de citocinas, incluindo interferões de tipo I, tais como IFN-oí e IFN-ω, e IFN-γ, a partir de células humanas. Observámos também que os polinucleótidos imunomoduladores do presente invento podem estimular eficazmente células B a proliferar. Observámos que alguns dos polinucleótidos imunomoduladores do presente invento activam células dendriticas plasmacitóides a sofrer maturação. Observámos também que a presença de alguns dos polinucleótidos imunomoduladores do presente invento pode resultar no retardamento da apoptose de células dendriticas plasmacitóides em cultura. 0 presente invento proporciona também um polinucleótido imunomodulador do presente invento para utilização na modulação de uma resposta imunitária num indivíduo. É administrado ao indivíduo um polinucleótido imunomodulador do presente invento. São ainda descritos estojos compreendendo os PIM do presente invento. Os estojos podem ainda compreender instruções para administração de um polinucleótido imunomodulador do presente invento para imunomodulação num sujeito e polinucleótidos imunomoduladores. 13
ΕΡ 1 992 635/PT Técnicas Gerais A prática do presente invento empregará, a menos que indicado em contrário, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindo técnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, bioquímica e imunologia, que estão dentro da perícia na especialidade. Tais técnicas são completamente explicadas na literatura, tal como em, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edição (Sambrook et al. , 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney, ed., 1987); "Handbook of
Experimental Immunology", (D.M. Weir & C.C. Blackwell, eds.); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al. , eds., 1994); "Current Protocols in Immunology" (J.E. Coligan et al., eds., 1991); "The Immunoassay Handbook" (D. Wild, ed., Stockton
Press NY, 1994); "Bioconjugate Techniques" (Greg T. Hermanson, ed., Academic Press, 1996); e "Methods of Immunological Analysis" (R. Masseyeff, W.H. Albert, e N.A. Staines, eds., Weinheim: VCH Verlags gesellschaft mbH, 1993).
Definições
Tal como aqui se utiliza, a forma singular "um", "uma" e "o" e "a" incluem referências plurais a menos que indicado em contrário. Por exemplo, "um" PIM inclui um ou mais PIM.
Tal como aqui se utilizam indiferentemente, os termos "polinucleótido" e "oligonucleótido" incluem ADN de cadeia simples (ADNcs) , ADN de cadeia dupla (ADNcd), ARN de cadeia simples (ARNcs) e ARN de cadeia dupla (ARNcd), oligonucleótidos modificados e oligonucleósidos ou combinações destes. 0 oligonucleótido pode estar configurado linearmente ou circularmente ou o oligonucleótido pode conter segmentos tanto lineares como circulares. Os oligonucleótidos são polímeros de nucleósidos unidos, geralmente, através de ligações fosfodiéster, embora ligações alternativas, tais como ésteres de fosforotioato possam também ser utilizadas nos oligonucleótidos. Um nucleósido consiste numa base purina (adenina (A) ou guanina (G) ou derivado desta) ou pirimidina 14 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ (timidina (Τ), citosina (C) ou uracilo (U), ou derivado desta) ligada a um açúcar. As quatro unidades nucleosidicas (ou bases) no ADN são designadas desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxitimidina, e desoxicitidina. Um nucleótido é um éster de fosfato de um nucleósido. 0 termo "polinucleótido imunomodulador" ou "PIM" tal como aqui se utiliza refere-se a um polinucleótido que efectua e/ou contribui para uma resposta imunitária mensurável medida in vitro, in vivo e/ou ex vivo. Exemplos de respostas imunitárias mensuráveis incluem, mas não se limitam à produção de anticorpos específicos do antigénio, secreção de citocinas, activação ou expansão de populações de linfócitos tais como células NK, linfócitos T CD4+, linfócitos T CD8+, linfócitos B e semelhantes. De preferência, as sequências de PIM activam preferencialmente uma resposta de tipo Thl. 0 termo "imunomodulador" ou "modulador de uma resposta imunitária" tal como aqui se utiliza inclui efeitos imunoestimuladores bem como imunossupressores. A imunomodulação é primariamente uma alteração qualitativa numa resposta imunitária global, embora possam também ocorrer alterações quantitativas em conjunto com a imunomodulação. Uma resposta imunitária que seja imunomodulada de acordo com o presente invento é uma que é mudada para uma resposta imunitária "de tipo Thl", em oposição a uma resposta imunitária de "tipo Th2". As respostas de tipo Thl são tipicamente consideradas respostas do sistema imunitário celular (p.ex., linfócitos citotóxicos), enquanto as respostas de tipo Th2 são geralmente "humorais", ou baseadas em anticorpos. As respostas imunitárias de tipo Thl são normalmente caracterizadas por reacções de "hipersensibilidade de tipo retardado" a um antigénio e podem ser detectadas ao nível bioquímico através de níveis aumentados de citocinas associadas a Thl tais como IFN-γ, IFN-α, IL-2, IL-12, e TNF-β, bem como IL-6, embora IL-6 possa também estar associada a respostas de tipo Th2. As respostas imunitárias de tipo Thl estão geralmente associadas à produção de linfócitos citotóxicos (CTL) e baixos níveis de produção transiente de anticorpo. As respostas imunitárias de tipo Th2 estão geralmente associadas a níveis mais elevados de produção de anticorpos, incluindo produção de IgE, uma ausência ou 15 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ produção mínima de CTL, bem como expressão de citocinas associadas a Th2 tais como IL-4. Assim, a imunomodulação de acordo com o presente invento pode ser reconhecida através, por exemplo, de um aumento em IFN-γ e/ou IFN-α e/ou uma diminuição na produção de IgE num indivíduo tratado de acordo com os métodos do invento em comparação com a ausência de tratamento. 0 termo "3'" refere-se genericamente a uma região ou posição num polinucleótido ou oligonucleótido a 3' (jusante) de outra região ou posição no mesmo polinucleótido ou oligonucleótido. 0 termo "extremidade 3'" refere-se ao terminal 3' do polinucleótido. 0 termo "5'" refere-se genericamente a uma região ou posição num polinucleótido ou oligonucleótido a 5' (montante) de outra região ou posição no mesmo polinucleótido ou oligonucleótido. 0 termo "extremidade 5'" refere-se ao terminal 5' do polinucleótido.
Uma região, porção ou sequência que está "adjacente" a outra sequência une-se directamente a essa região, porção ou sequência. Por exemplo, uma sequência polinucleotídica adicional (p.ex., um trinucleótido TCG) que está adjacente a uma determinada porção de um polinucleótido imunomodulador une-se directamente a essa região. 0 termo "sequência palindrómica" ou "palíndroma" refere-se a uma sequência de ácido nucleico que é uma repetição invertida, p.ex., ABCDD'C'B'A', onde as bases, p.ex., A e A', B e B', C e C', D e D', são capazes de formar os pares de bases de Watson-Crick. Tais sequências podem ser de cadeia simples ou podem formar estruturas de cadeia dupla ou podem formar estruturas em "gancho de cabelo" sob certas condições. Por exemplo, tal como aqui se utiliza, "um palíndroma de 8 bases" refere-se a uma sequência de ácido nucleico na qual a sequência palindrómica tem 8 bases de comprimento, tal como ABCDD'C'B'A'. Uma sequência palindrómica pode fazer parte de um polinucleótido que contenha também sequências não palindrómicas. Um polinucleótido pode conter uma ou mais porções com sequência palindrómica e uma ou mais porções com sequência não palindrómica. Alternativamente, uma sequência 16 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ polinucleotídica pode ser inteiramente palindrómica. Num polinucleótido com mais de uma porção com sequência palindrómica, as porções com sequência palindrómica podem sobrepor-se umas às outras ou as porções com sequência palindrómica podem não se sobrepor umas às outras. 0 termo "conjugado" refere-se a um complexo no qual estão ligados um PIM e um antigénio. Tais ligações de conjugado incluem ligações covalentes e/ou não covalentes. 0 termo "antigénio" significa uma substância que é reconhecida e à qual se liga especificamente um anticorpo ou um receptor de antigénio de células T. Os antigénios podem incluir péptidos, proteínas, glicoproteínas, polissacáridos, hidratos de carbono complexos, açúcares, gangliósidos, lípidos e fosfolípidos; porções destes e combinações destes. Os antigénios podem ser os verificados na natureza ou podem ser sintéticos. Antigénios adequados para administração com PIM incluem qualquer molécula capaz de desencadear uma resposta de células B ou células T especifica do antigénio. De preferência, os antigénios desencadeiam uma resposta de anticorpos específica para o antigénio. Os haptenos estão incluídos dentro do âmbito de "antigénio". Um hapteno é um composto de baixo peso molecular que não é imunogénico por si próprio mas que se torna imunogénico quando conjugado com uma molécula imunogénica contendo determinantes antigénicos. Moléculas pequenas podem necessitar de ser haptenizadas para serem tornadas antigénicas. De preferência, os antigénios do presente invento incluem péptidos, lípidos (p.ex., esteróides, ácidos gordos e fosfolípidos), polissacáridos tais como os utilizados em vacinas de Hemophilus influenza, gangliósidos e glicoproteínas. "Adjuvante" refere-se a uma substância que, quando adicionada a um agente imunogénico tal como um antigénio, aumenta de modo não específico ou potência uma resposta imunitária ao agente no hospedeiro receptor após exposição à mistura. 0 termo "péptido" designa polipéptidos que têm comprimento suficiente e composição para efectuar uma resposta biológica, p.ex., produção de anticorpos ou actividade de 17
ΕΡ 1 992 635/PT citocinas seja o péptido um hapteno ou não. Tipicamente, os péptidos têm pelo menos seis resíduos de aminoácidos de comprimento. O termo "péptido" inclui ainda aminoácidos modificados (de ocorrência natural ou não natural), incluindo tais modificações, mas não se limitando a, fosforilação, glicosilação, "peguilação", lipidação e metilação.
Os "péptidos antigénicos" podem incluir péptidos nativos purificados, péptidos sintéticos, proteínas recombinantes, extractos proteicos brutos, vírus atenuados ou inactivados, células, microrganismos ou fragmentos de tais péptidos. Um "péptido antigénico" ou "polipéptido antigénico" significa assim a totalidade ou uma porção de um polipéptido que exibe uma ou mais propriedades antigénicas. Assim, por exemplo, um "polipéptido antigénico Amb a 1" ou "antigénio polipeptídico Amb a 1" é uma sequência de aminoácidos de Amb a 1, seja a sequência inteira, uma porção da sequência, e/ou uma modificação da sequência, que exibe uma propriedade antigénica (i.e., liga-se especificamente a um anticorpo ou a um receptor de células T).
Uma "molécula de entrega" ou "veículo de entrega" é uma porção química que facilita, permite, e/ou aumenta a entrega de um polinucleótido imunomodulador a um determinado local e/ou em relação a um determinado momento. Um veiculo de entrega pode ou não estimular adicionalmente uma resposta imunitária.
Uma "resposta alérgica ao antigénio" significa uma resposta imunitária geralmente caracterizada pela criação de eosinófilos e/ou IgE específica do antigénio e seus efeitos resultantes. Tal como é bem conhecido na especialidade, a IgE liga-se a receptores de IgE nos mastócitos e basófilos. Após posterior exposição ao antigénio reconhecido pela IgE, o antigénio liga-se de forma cruzada à IgE nos mastócitos e basófilos causando desgranulação destas células, incluindo, mas não se limitando a, libertação de histamina. Entende-se e pretende-se que os termos "resposta alérgica ao antigénio", "alergia" e "condição alérgica" sejam igualmente apropriados para a aplicação do presente invento. Mais, entende-se e pretende-se que as utilizações do presente invento incluam as que são igualmente apropriadas para prevenção de uma resposta 18 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ alérgica bem como tratamento preexistente. de uma condição alérgica
Tal como aqui se utiliza, o termo "alergénio" significa um antigénio ou porção antigénica de uma molécula, habitualmente uma proteína, que desencadeia uma resposta alérgica após exposição a um sujeito. Tipicamente o sujeito é alérgico ao alergénio tal como indicado, por exemplo, pelo teste de pápulas e vermelhidão ou qualquer outro método conhecido na especialidade. Uma molécula é referida como sendo um alergénio mesmo se apenas um pequeno subconjunto de sujeitos exibir uma resposta imunitária alérgica (p.ex., IgB) após exposição à molécula. São conhecidos na especialidade vários alergénios isolados. Estes incluem, mas não se limitam aos proporcionados na Tabela 1 aqui. 0 termo "dessensibilização" refere-se ao processo de administração de doses crescentes de um alergénio ao qual o sujeito demonstrou sensibilidade. Exemplos de doses de alergénio utilizadas para dessensibilização são conhecidos na especialidade, ver, por exemplo, Fornadley, Otolaryngol. Clin. North Am. 31: 111-127, 1998. "Imunoterapia específica do antigénio" refere-se a qualquer forma de imunoterapia que envolva o antigénio e gere uma modulação da resposta imunitária específica do antigénio. No contexto de alergia, a imunoterapia específica do antigénio inclui, mas não se limita a, terapia de dessensibilização. 0 termo "microtransportador" refere-se uma composição particulada que é insolúvel em água e que tem um tamanho de menos de cerca de 150, 120 ou 100 μπι, de preferência menos de cerca de 50-60 μπι, de preferência menos de cerca de 10 μπι, de preferência menos de cerca de 5, 2,5, 2 ou 1,5 μπι. Os microtransportadores incluem "nanotransportadores", que são microtransportadores possuindo um tamanho de menos de cerca de 1 μπι, de preferência menos de cerca de 500 nm. Os microtransportadores incluem partículas de fase sólida tais como partículas formadas a partir de polímeros biocompatíveis de ocorrência natural, polímeros sintéticos ou copolímeros sintéticos, embora microtransportadores formados a partir de agarose ou agarose reticulada possam estar incluídos ou 19 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ excluídos da definição de microtransportadores daqui bem como outros materiais biodegradáveis conhecidos na especialidade. Os microtransportadores para utilizar no presente invento podem ser microtransportadores biodegradáveis ou não biodegradáveis. Os microtransportadores não biodegradáveis de fase sólida são formados por polímeros ou outros materiais que não são erodíveis e/ou não degradáveis sob condições fisiológicas de mamífero, tais como poliestireno, polipropileno, sílica, cerâmica, poliacrilamida, ouro, látex, hidroxiapatite, dextrano e materiais ferromagnéticos e paramagnéticos. Os microtransportadores biodegradáveis de fase sólida podem ser formados a partir de polímeros que são degradáveis (p.ex., poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico) e copolímeros destes) ou erodíveis (p.ex., poli(orto-ésteres tais como 3,9-dietilideno-2,4,8,10-tetraoxaespiro[5.5]undecano (DETOSU) ou poli(anidridos), tais como poli(anidridos) de ácido sebácico) sob condições fisiológicas de mamífero. Os microtransportadores podem também estar em fase líquida (p.ex., baseados em óleos ou lipidos), tais lipossomas, ISCOM (complexos imunoestimuladores, que são complexos estáveis de colesterol, fosfolípidos e saponina com adjuvante activo) sem antigénio, ou gotículas ou micelas verificadas em emulsões de óleo em água ou de água em óleo. Os microtransportadores biodegradáveis de fase liquida incorporam tipicamente um óleo biodegradável, vários dos quais são conhecidos na especialidade, incluindo esqualeno e óleos vegetais. Os microtransportadores são tipicamente de forma esférica, mas microtransportadores que se desviem da forma esférica são também aceitáveis (p.ex., elipsoidais, bastonetes, etc.). Devido à sua natureza insolúvel (em relação à água), os microtransportadores são filtráveis da água e de soluções baseadas em água (aquosas). 0 termo "não biodegradáveis", tal como aqui se utiliza, refere-se a um microtransportador que não é degradado ou erodido sob composições fisiológicas normais de mamífero. Geralmente, um microtransportador é considerado não biodegradável se não for degradado (i.e., perder menos de 5% da sua massa ou comprimento médio do polímero) após uma incubação de 72 horas a 37°C em soro humano normal. 20 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ
Um microtransportador é considerado "biodegradável" se for degradável ou erodivel sob condições fisiológicas normais de mamífero. Geralmente, um microtransportador é considerado biodegradável se for degradado (i.e., perder pelo menos 5% da sua massa ou comprimento médio do polímero) após uma incubação de 72 horas a 37°C em soro humano normal. 0 "tamanho" de um microtransportador é geralmente o "tamanho de desenho" ou tamanho pretendido das partículas indicado pelo fabricante. 0 tamanho pode ser uma dimensão medida directamente, tal como o diâmetro médio ou máximo, ou pode ser determinado através de um ensaio indirecto tal como um ensaio de pesquisa por filtração. A medição directa do tamanho do microtransportador é tipicamente realizada através de microscopia, geralmente microscopia óptica ou microscopia electrónica de varrimento (MEV), em comparação com partículas de tamanho conhecido ou através de referência a um micrómetro. Uma vez que surgem variações menores no tamanho durante o processo de fabrico, os microtransportadores são considerados como sendo de um tamanho indicado se as medições mostrarem que os microtransportadores têm ± cerca de 5-10% da medida indicada. As características do tamanho podem também ser determinadas através de técnicas de dispersão dinâmica de luz ou de obscuridade. Alternativamente, o tamanho do microtransportador pode ser determinado através de ensaios de pesquisa por filtração. Um microtransportador tem menos que o tamanho afirmado se pelo menos 97% das partículas passam através de um filtro "de tipo ecrã" (i.e., um filtro no qual as partículas retidas estão à superfície do filtro, tais como filtros de policarbonato ou poliéter-sulfona, em oposição a um "filtro de profundidade" no qual as partículas retidas se alojam dentro do filtro) com o tamanho indicado. Um microtransportador tem mais que o tamanho indicado se pelo menos cerca de 97% das partículas do microtransportador ficarem retidas por um filtro de tipo ecrã do tamanho indicado. Assim, pelo menos cerca de 97% dos microtransportadores com cerca de 10 pm a cerca de 10 nm de tamanho passam através de um filtro de ecrã com poro de 10 pm e são retidos por um filtro de ecrã de 10 nm.
Tal como a discussão acima indica, a referência a um tamanho ou intervalo de tamanhos para um microtransportador 21 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ inclui implicitamente variações aproximadas e aproximações do tamanho e/ou intervalo de tamanhos indicado. Isto é reflectido através da utilização do termo "cerca" quando se refere a um tamanho e/ou intervalo de tamanhos e a referência a um tamanho ou intervalo de tamanhos sem referência a "cerca" não significa que o tamanho e/ou intervalo de tamanhos seja exacto. 0 termo "complexo polinucleótido imunomodulador/ microtransportador" ou "complexo PIM/MT" refere-se a um complexo de um polinucleótido imunomodulador e um microtransportador. Os componentes do complexo podem ser ligados covalentemente ou não covalentemente. As ligações não covalentes podem ser mediadas por qualquer força de ligação não covalente, incluindo através de interacção hidrófoba, ligação iónica (electrostática), pontes de hidrogénio e/ou atracções de van der Waals. No caso das ligações hidrófobas, a ligação é geralmente através de uma porção hidrófoba (p.ex., colesterol) ligada covalentemente ao PIM.
Um "indivíduo" é um vertebrado, tal como uma ave, e é de preferência um mamífero, de maior preferência um humano. Os mamíferos incluem, mas não se limitam a, humanos, primatas, animais de quinta, animais de desporto, roedores e animais de estimação.
Uma "quantidade eficaz" ou uma "quantidade suficiente" de uma substância é a quantidade suficiente para ter resultados benéficos ou desejados, incluindo resultados clínicos e, como tal, uma "quantidade eficaz" depende do contexto em que está a ser aplicada. No contexto de administração de uma composição que modula uma resposta imunitária a um antigénio co-administrado, uma quantidade eficaz de um polinucleótido imunomodulador e um antigénio é uma quantidade suficiente para alcançar uma tal modulação em comparação com a resposta imunitária obtida quando o antigénio é administrado sozinho. Uma quantidade eficaz pode ser administrada numa ou mais administrações. 0 termo "co-administração" tal como aqui se utiliza refere-se à administração de pelo menos duas substâncias diferentes suficientemente próximas no tempo para modular uma 22
ΕΡ 1 992 635/PT resposta imunitária. De preferência, a co-administração refere-se à administração simultânea de pelo menos duas substâncias diferentes. "Estimulação" de uma resposta ou parâmetro inclui o desencadeamento e/ou a estimulação dessa resposta ou parâmetro. Por exemplo, a "estimulação" de uma resposta imunitária, tal como a resposta Thl, significa um aumento na resposta, que pode surgir do desencadeamento e/ou reforço de uma resposta. Semelhantemente, "estimulação" de uma citocina ou tipo celular (tal como CTL) significa um aumento na quantidade ou nivel de citocina ou tipo celular. A "estimulação" de células B inclui, por exemplo, maior proliferação de células B, activação de células B induzidas e/ou maior produção de citocinas, tais como IL-6 e/ou TNF-α, a partir das células B estimuladas.
Um "distúrbio associado a IgE" é uma condição fisiológica que é caracterizada, em parte, por níveis elevados de IgE, que podem ou não ser persistentes. Distúrbios associados a IgE incluem, mas não se limitam a, alergia e reacções alérgicas, alergias alimentares, distúrbios relacionados com alergia (descritos abaixo), asma, rinite, dermatite atópica, conjuntivite, urticária, choque, alergias a picada de Hymenoptera, e alergias a fármacos, e infecções parasitárias. 0 termo inclui também manifestações relacionadas destes distúrbios. Geralmente, a IgE em tais distúrbios é específica do antigénio.
Um "distúrbio relacionado com alergia" significa um distúrbio resultante dos efeitos de uma resposta imunitária de IgE específica do antigénio. Tais efeitos podem incluir, mas não se limitam a, hipotensão e choque. A anafilaxia é um exemplo de um distúrbio relacionado com alergia durante o qual a histamina libertada para a circulação causa vasodilatação bem como maior permeabilidade dos capilares com resultante perda marcada de plasma da circulação. A anafilaxia pode ocorrer sistemicamente, com os efeitos associados experimentados ao longo de todo o corpo, e pode ocorrer localmente, com a reacção limitada a um tecido ou órgão alvo específico. 23
ΕΡ 1 992 635/PT Ο termo "doença virai", tal como aqui se utiliza, refere-se a uma doença que tem um vírus como seu agente etiológico. Exemplos de doenças virais incluem hepatite B, hepatite C, influenza, síndroma de imunodeficiência adquirida (SIDA) , e herpes zóster.
Tal como aqui se utiliza e tal como é bem entendido na especialidade, "tratamento" é uma abordagem para obter resultados benéficos ou desejados, incluindo resultados clínicos. Para os fins deste invento, resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, mas não se limitam a, alívio ou melhoria de um ou mais sintomas, diminuição da extensão da doença, estado estabilizado (i.e., sem se agravar) da doença, prevenção da disseminação da doença, retardamento ou abrandamento da progressão da doença, melhoria ou paliação do estado de doença, e remissão (parcial ou total), detectável ou indetectável. "Tratamento" pode também significar prolongamento da sobrevivência em comparação com a esperança de vida sem receber tratamento. "Paliação" de uma doença ou distúrbio significa que a extensão e/ou manifestações clínicas indesejáveis de um distúrbio ou um estado de doença são reduzidos e/ou é atrasado ou prolongado o curso de tempo da progressão da doença, em comparação com o não tratamento do distúrbio. Especialmente no contexto de alergia, tal como é bem entendido pelos peritos na especialidade, a paliação pode ocorrer após modulação da resposta imunitária contra um ou mais alergénios. Mais, a paliação não ocorre necessariamente através de administração de uma dose, mas ocorre frequentemente após administração de uma série de doses. Assim, uma quantidade suficiente para paliar uma resposta ou distúrbio pode ser administrada numa ou mais administrações.
Um "título de anticorpo", ou "quantidade de anticorpo", que é "desencadeada" por um polinucleótido imunomodulador e um antigénio refere-se à quantidade de um dado anticorpo medida num momento após a administração do polinucleótido imunomodulador e o antigénio.
Um "anticorpo associado a Thl" é um anticorpo cuja produção e/ou aumento está associado a uma resposta imunitária 24 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ
Thl. Por exemplo, IgG2a é um anticorpo associado a Thl em ratinho. Para os fins deste invento, a medição de um anticorpo associado a Thl pode ser a medição de um ou mais desses anticorpos. Por exemplo, em humano, a medição de um anticorpo associado a Thl pode implicar a medição de IgGl e/ou IgG3.
Um "anticorpo associado a Th2" é um anticorpo cuja produção e/ou aumento está associado a uma resposta imunitária Th2. Por exemplo, IgGl é um anticorpo associado a Th2 em ratinho. Para os fins deste invento, a medição de um anticorpo associado a Th2 pode ser a medição de um ou mais desses anticorpos. Por exemplo, em humano, a medição de um anticorpo associado a Th2 pode implicar a medição de IgG2 e/ou IgG4. "Suprimir" ou "inibir" uma função ou actividade, tal como a produção de citocinas, a produção de anticorpos ou a libertação de histamina, é reduzir a função ou actividade quando comparada com as mesmas condições excepto quanto a um parâmetro de interesse ou, alternativamente, em comparação com outra condição. Por exemplo, uma composição compreendendo um polinucleótido imunomodulador e um antigénio que suprima a libertação de histamina reduz a libertação de histamina em comparação, por exemplo, com a libertação de histamina induzida pelo antigénio sozinho. Como outro exemplo, uma composição compreendendo um polinucleótido imunomodulador e um antigénio que suprima a produção de anticorpos reduz a extensão e/ou os níveis de anticorpos em comparação, por exemplo, com a extensão e/ou níveis de anticorpos produzidos pelo antigénio sozinho.
Uma "proteína sérica" é uma proteína que é normalmente verificada no soro de mamíferos sem doenças, particularmente bovinos sem doenças. A proteína sérica mais prevalecente é a albumina do soro.
Tal como aqui se utiliza, o ter termo "compreendendo" e seus cognatos são utilizados no seu sentido inclusivo; isto é, equivalente ao termo "incluindo" e seus correspondentes cognatos. 25
ΕΡ 1 992 635/PT
Composições do invento 0 presente invento proporciona polinucleótidos imunomoduladores (PIM) para modulação de respostas imunitárias em indivíduos. As composições do presente invento compreendem um polinucleótido imunomodulador sozinho (ou uma combinação de dois ou mais polinucleótidos imunomoduladores) ou em conjunto com outro agente imunomodulador, tal como um péptido, um antigénio (descrito abaixo) e/ou um adjuvante adicional. As composições do presente invento podem compreender um polinucleótido imunomodulador e um excipiente farmaceuticamente aceitável. Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis, incluindo tampões, são bem conhecidos na especialidade. "Remington; The Science and Practice of Pharmacy”, 20a edição, Mack Publishing (2000).
Após administração, as composições compreendendo um antigénio, um polinucleótido imunomodulador do presente invento, e opcionalmente um adjuvante podem conduzir a uma potenciação de uma resposta imunitária ao antigénio e podem assim resultar numa maior resposta imunitária em comparação com a que resulta de uma composição compreendendo o PIM e o antigénio sozinhos. Os adjuvantes são conhecidos na especialidade e incluem, mas não se limitam a, emulsões de óleo em água, emulsões de água em óleo, alúmen (sais de alumínio), lipossomas e micropartícuias, incluindo mas não se limitam a, poliestireno, amido, polifosfazeno e polilactida/ poliglicósidos. Outros adjuvantes adequados incluem também, mas não se limitam a, MF59, DETOX™ (Ribi) , misturas de esqualeno (SAF-1), péptido de muramilo, derivados de saponina, preparações de parede celular de micobactérias, monofosforil-lípido A, derivados de ácido micólico, tensioactivos de copolímeros de blocos não iónicos, Quil A, subunidade B da toxina da cólera, polifosfazeno e derivados, e complexos imunoestimuladores (ISCOM) tais como os descritos por Takahashi et al., Nature 344: 873-875, 1990, bem como adjuvantes à base de lípidos e outros aqui descritos. Para utilização veterinária e para produção de anticorpos em animais, podem ser utilizados os componentes mitogénicos do adjuvante de Freund (completo e incompleto). 26 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ
Os ΡΙΜ do presente invento podem ser combinados com outras terapias para determinadas indicações. Por exemplo, para além de um PIM, as composições do presente invento podem compreender também fármacos anti-malária tais como cloroquina para pacientes de malária, fármacos leishmanicidas tais como pentamidina e/ou alopurinol para pacientes de leishmaniose, fármacos antimicobacterianos tais como isoniazida, rifampina e/ou etambutol para pacientes de tuberculose, ou reagentes de dessensibilização a alergénios para pacientes (de alergia) atópicos.
Tal como aqui descrito, as composições do presente invento podem incluir PIM e podem ainda compreender um ou mais agentes imunoterapêuticos (i.e., um agente que actue através do sistema imunitário e/ou seja derivado do sistema imunitário) incluindo, mas não se limitando a, citocina, adjuvantes e anticorpos. Exemplos de anticorpos terapêuticos incluem os utilizados no contexto de cancro (p.ex., anticorpos antitumorais), tais como os descritos abaixo.
Polinucleótidos imunomoduladores
Nos parágrafos seguintes, apenas SEQ ID NO:171 cai dentro do âmbito do invento. É aqui descrito um polinucleótido imunomodulador que contém pelo menos uma sequência palindrómica (i.e., palíndroma) de pelo menos 8 bases de comprimento contendo pelo menos um dinucleótido CG. 0 PIM contém também pelo menos uma sequência trinucleotidica TCG na extremidade 5' do polinucleótido ou próximo desta (i.e., 5'-TCG) . Nalguns casos, a sequência palindrómica e a 5'-TCG são separadas por 0, 1 ou 2 bases no PIM. Nalguns casos, a sequência palindrómica inclui toda ou parte da 5'-TCG.
Os PIM foram descritos na especialidade e a sua actividade pode ser facilmente identificada utilizando ensaios padrão que indicam vários aspectos da resposta imunitária, tal como secreção de citocinas, produção de anticorpos, activação de células NK, proliferação de células B, proliferação de células T. Ver, p.ex., WO 97/28259; WO 98/16247; WO 99/11275; Krieg et al. , Nature 374: 546-549, 1995; Yamamoto et al. , 1992a; Bailas et al., 1996; Klinman et al., 1997; Sato et al., 1996; Pisetsky, 1996a; Shimada et al., Jpn. J. Câncer Res. 77: 27
ΕΡ 1 992 635/PT 808-816, 1986; Cowdery et al., J. Immunol. 156: 4570-4575, 1996; Roman et al., 1997; Lipford et al., 1997a; WO 98/55495 e WO 00/61151. Assim, estes e outros métodos podem ser utilizados para identificar, testar e/ou confirmar PIM imunomoduladores. O PIM pode ser de qualquer comprimento superior a 10 bases ou pares de bases, de preferência superior a 15 bases ou pares de bases, de maior preferência superior a 20 bases ou pares de bases de comprimento.
Tal como é claramente aqui comunicado, entende-se que, em relação às fórmulas aqui descritas, qualquer um e todos os parâmetros são seleccionados independentemente. Por exemplo, se x=0-2, y pode ser seleccionado de forma independente independentemente dos valores de x (ou qualquer outro parâmetro seleccionável num fórmula).
Nalguns casos, um PIM compreende (a) uma sequência palindrómica de pelo menos 8 bases de comprimento que contém pelo menos dois dinucleótidos CG, onde os dinucleótidos CG são separados um do outro por 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 bases e (b) uma sequência (TCG)y posicionada a 0, 1, 2, ou 3 bases da extremidade 5' do polinucleótido, onde y é 1 ou 2, e onde a extremidade 3' da sequência (TCG)y é separada da extremidade 5' da sequência palindrómica por 0, 1 ou 2 bases. Nalguns casos, um dinucleótido CG da sequência (TCG)y de (b) pode contar para um dos pelo menos dois dinucleótidos CG na sequência palindrómica de (a). Nalguns casos, os dinucleótidos CG da sequência palindrómica são separados um do outro por 1, 3 ou 4 bases. Nalguns PIM, descritos neste parágrafo ou noutro local no pedido, a sequência palindrómica tem uma composição de bases de menos de dois terços de G e C. Nalguns casos, a sequência palindrómica tem uma composição de bases de mais de um terço de A e T. É aqui descrito um PIM que compreende (a) uma sequência palindrómica de pelo menos 8 bases de comprimento que contém pelo menos dois dinucleótidos CG, onde os dinucleótidos CG são separados um do outro por 0, 1, 2, 3, 4 ou 5 bases, e (b) uma sequência (TCG)y posicionada a 0, 1, 2, ou 3 bases da extremidade 5' do polinucleótido, onde y é 1 ou 2, onde a 28 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ sequência palindrómica inclui toda ou parte da sequência (TCG)y e onde um dinucleótido CG da sequência (TCG)y de (b) pode contar para um dos dinucleótidos CG da sequência palindrómica de (a) . De preferência, os dinucleótidos CG da sequência palindrómica são separados uns dos outros por 1, 3 ou 4 bases.
Assim, um PIM pode compreender uma sequência de fórmula: 5 ' -Nx (TCG (Nq) ) yNw (XiCGXi' (CG) p) z (SEQ IDNO:155) em que N são nucleósidos com x=0-3, y=l-4, w=-l, 0, 1 ou 2, p=0 ou 1, q=0, 1 ou 2, e z=l-20, em que Xi e Xi' são auto-complementares e em que o T 5' da sequência (TCG(Nq))y está a 0-3 bases da extremidade 5' do polinucleótido. O PIM compreende ainda uma sequência palindrómica de 8 bases de comprimento ou mais em que a sequência palindrómica compreende pelo menos uma das sequências (XiCGXi' (CG)P) . Num PIM com w=-l, a base 3' da sequência (TCG(Nq))y é o Xi 5' da primeira sequência (XiCGXi' (CG) p) . Nalguns casos, a sequência (TCG(Nq))y é separada da sequência palindrómica por 0, 1 ou 2 bases.
Noutros casos, a sequência palindrómica inclui toda ou parte da sequência (TCG(Nq))y. Nalguns casos, quando p=0, Χχ é A ou T.
As seguintes sequências são mostradas apenas para fins ilustrativos. 5'-TCGTCGACGTCGAGATGATAT (SEQ ID NO:35); 5'-TCGTCGACGTCGACGAGATAT (SEQ ID NO:60); 5'-TCGACGTCGACGTCGACGTAT (SEQ ID NO:61); 5'-TCGGTCGACGTCGACCGATT (SEQ ID NO:82); 5'-TCGGACGTCGACGTCCGATT (SEQ ID NO:83); 5'-TCGACGTCGA (SEQ ID NO:105); 5'-TCGGACGTCGACGTGCGATT (SEQ ID NO:114); 5'-TCGACGTCGACGTCGACGTCGA (SEQ ID NO:119); 5'-ACGTCGACGTCGACGTCGACGT (SEQ ID NO:120); 5'-TCGTCGACGTCGACGTCGACGT (SEQ ID NO:121); 5'-TCGTCGGCGCCGGCGCCGGCGC (SEQ ID NO:122); 5'-TCGTCGCCGGCGCCGGCGCCGG (SEQ ID NO:123); 5'-TCGATACGTCGACGTCGACGT (SEQ ID NO:124). 29 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ
Um ΡΙΜ pode compreender uma sequência com a fórmula: 5'-Nx(TCG(Nq) )yNw(X1X2X3CGX3,X2,Xi' (CG) p) z (SEQ ID NO: 157 ) em que N são nucleósidos com x=0-3, y=l-4, w=-3, -2, -1, 0, 1 ou 2, p=0 ou 1, q=0, 1 ou 2, e z=l-20, em que Xi e Xi', X2 e X2' , e X3 e X3' são auto-complementares e em que o T 5' da sequência (TCG (Nq) ) y está a 0-3 bases da extremidade 5' do polinucleótido. O PIM compreende ainda uma sequência palindrómica de 8 bases de comprimento ou mais em que a sequência palindrómica compreende a primeira (XiX2X3CGX3 ' X2 ' Xi' ) da pelo menos uma sequência (X1X2X3CGX3' X2' Xi' (CG) p) (SEQ ID NO: 224) . Num PIM com w=-l, a base 3' da sequência (TCG (Nq) ) y é ο XI 5' da primeira sequência (X1X2X3CGX3'X2 'Xi' (CG) p) (SEQ ID NO:224). Num PIM com w=-2, a penúltima (i.e., antes da final) e a última (i.e. , a final) base 3' da sequência (TCG (Nq) )y são 0 Xi e X2 5', respectivamente, da primeira sequência (XiX2X3CGX3' 'X2'Xi (CG) p) (SEQ ID NO: 224) . Num PIM com w=-3, a antepenúltima (i.e., em terceiro antes da última), a penúltima (i.e., a segunda antes da final) e a última (i.e., a final) base 3' da sequência (TCG(Nq))y são o Xi, X2 e X3 5', respectivamente, da primeira sequência (XiX2X3CGX3'X2 'Xi' (CG) p) (SEQ ID NO:224). Nalguns casos, a sequência (TCG(Nq))y é separada da sequência palindrómica por 0, 1 ou 2 bases.
Noutros casos, a sequência palindrómica inclui toda ou parte da sequência (TCG(Nq))y. Nalguns casos, quando p=l, Χχ, X2, e X3 são cada um A ou T. Nalguns casos, quando p=0, pelo menos dois de Xi, X2, e X3 são A ou T.
As seguintes sequências (sequências palindrómicas sublinhadas) são mostradas apenas para fins ilustrativos: (SEQ ID NO:62); (SEQ ID NO:63); (SEQ ID NO:125); (SEQ ID NO:126); (SEQ ID NO:127); (SEQ ID NO:128); (SEQ ID NO:129); (SEQ ID NO:130).
5’-TCGTCGAAACGTTTCGACAGT 5'-TCGTCGAGACGTCTCGAC AGT 5’-TCGTCGAAGCGCTTCGACAGT 5’-TCGTCGAATCGATTCGACAGT 5’-TCGTCGAGTCGACTCGACAGT 5’-TCGTCGCAACGTTGCGACAGT 5’-TCGTCGCCGCGCGGCGACAGT 5’-TCGAAACGTTTCGACAGTGAT 30 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ
Um ΡΙΜ pode compreender uma sequência de fórmula: 5'-Nx(TCG(Nq) )yNw(XiX2X3X4CGX4'X3'X2'Xi' (CG)P)Z (SEQ IDNO:158) em que N são nucleósidos com x=0-3, y=l-4, w=-3, -2, -1, 0, 1 ou 2, p=0 ou 1, q=0, 1 ou 2, e z=l-20, em que Xx e Xx', X2 e X2' , X3 e X3', e X4 e X4' são auto-complementares e em que o T 5' da sequência (TCG(Nq))y está a 0-3 bases da extremidade 5' do polinucleótido. O PIM compreende ainda uma sequência palindrómica com 10 bases de comprimento ou mais em que a sequência palindrómica compreende a primeira (XiX2X3X4CGX4'X3’X2’Xi') (SEQ IDNO:225) da pelo menos uma sequência (X, X2X3X4CGX4 ' X3 ' X2 ' X, ' (CG)P) (SEQ IDNO:226). Num PIM com w=-l, a base 3' de uma sequência (TCG(Nq))y é o Xx 5' da primeira sequência (XxX2X3X4CGX4' X3 ' X2 ' Xx' (CG)P) (SEQ IDNO:226). Num PIM com w=-2, a penúltima (i.e., a segunda antes da final) e a última (i.e., a final) bases 3' de uma sequência (TCG(Nq))y são Xi e X2 5', respectivamente, da primeira sequência (XxX2X3X4CGX4' X3 ' X2 ' Xx' (CG)P) (SEQ IDNO:226). Num PIM com w=-3, a antepenúltima (i.e., a terceira antes da final), a penúltima (i.e., a segunda antes da final) e a última (i.e., a final) bases 3' da sequência (TCG(Nq))y são Xx, X2, e X3 5', respectivamente, da primeira sequência (XiX2X3X4CGX4’X3’X2’Xi’ (CG)p) (SEQ ID NO: 226) . Nalguns casos, a sequência (TCG(Nq))y é separada da sequência palindrómica por 0, 1 ou 2 bases. Noutros casos, a sequência palindrómica inclui toda ou parte da sequência (TCG(Nq))y. Nalguns casos, quando p=l, pelo menos três de Xx, X2, X3, e X4 são A ou T. Nalguns casos, quando p=0, pelo menos dois de Xx, X2, X3, e X4 são A ou T.
As seguintes sequências (sequências palindrómicas sublinhadas) são apenas para fins ilustrativos: 5'-TCGTCGAAAACGTTTTCGAGAT (SEQ ID NO:64); 5'-TCGAAAACGTTTTCGAGATGAT (SEQ ID NO:65); 5'-TCGAGGACGTCCTCGAGATGAT (SEQ ID NO:66); 5'-TCGAGGTCGACCTCGAGATGAT (SEQ ID NO:131)/ 5'-ATCGATGTCGACATCGATATGAT (SEQ ID NO:132); 5'-TCGTCGTCGACGACGAGATGAT (SEQ ID NO:133).
Um PIM pode compreender uma sequência de fórmula: 5’-Nx(TCG(Nq) )yNw(XxCGCGXx' (CG)P)Z (SEQ IDNO:162) em que N são 31 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ nucleósidos com χ=0-3, y=l-4, w=-l, 0, 1 ou 2, p=0 ou 1, q=0, 1 ou 2, e z=l-20, em que Xi e Xi' são auto-complementares e em que o T 5' da sequência (TCG(Nq))y está a 0-3 bases da extremidade 5' do polinucleótido. O PIM compreende ainda uma sequência palindrómica de 8 bases de comprimento ou mais em que a sequência palindrómica compreende a primeira (XiCGCGXi') de pelo menos uma sequência (XiCGCGXi' (CG)P) . Num PIM com w=-l, a base 3' da sequência (TCG(Nq))y é o Xi 5' da primeira sequência (XiCGCGXi' (CG)p) . Nalguns casos, a sequência (TCG(Nq) ) y é separada da sequência palindrómica por 0, 1 ou 2 bases. Noutros casos, a sequência palindrómica inclui toda ou parte da sequência (TCG(Nq))y. As seguintes sequências (sequências palindrómicas sublinhadas) são mostradas apenas para fins ilustrativos: 5'-TCGTCGTCGCGACGAGATGAT (SEQ ID NO:50); 5'-TCGTCGACGCGTCGAGATGAT (SEQ ID NO:142); 5'-TCGTCGGCGCGCCGAGATGAT (SEQ ID NO:143).
Um PIM pode compreender uma sequência de fórmula: 5 ' -Nx (TCG (Nq) ) yNw (CGXiXi' CG (CG) p) z (SEQ IDNO:161) em que N são nucleósidos com x=0-3, y=l-4, w=-2, 0, 1 ou 2, p=0 ou 1, q=0, 1 ou 2, e z=l-20, em que Xi e Xi' são auto-complementares e em que o T 5' da sequência (TCG(Nq))y está a 0-3 bases da extremidade 5' do polinucleótido. O PIM compreende ainda uma sequência palindrómica de 8 bases de comprimento ou mais em que a sequência palindrómica compreende a primeira (CGXiXi'CG) de pelo menos uma sequência (CGXiXi'CG(CG)p) . Num PIM com w=-2, a penúltima (i.e., a segunda antes da final) e a última (i.e., a final) bases 3' da sequência (TCG(Nq))y são CG e são o CG 5' da primeira sequência (CGXiXi'CG(CG)p) y. Nalguns casos, a sequência (TCG(Nq))y é separada da sequência palindrómica por 0, 1 ou 2 bases. Noutros casos, a sequência palindrómica inclui toda ou parte da sequência (TCG(Nq))y. As seguintes sequências (sequências palindrómicas sublinhadas) são mostradas apenas para fins ilustrativos: 5'-TCGTCGCGATCGCGAGATGAT (SEQ ID NO:49); 5'-TCGTCGCGTACGCGAGATGAT (SEQ ID NO:139); 5'-TCGTCGCGGCCGCGAGATGAT (SEQ ID NO:140); 5'-TCGCGATCGCGCGATCGCGA (SEQ ID NO:141). 32 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ
Um ΡΙΜ pode compreender uma sequência de fórmula: 5 ’ -Nx (TCG (Nq) ) yNw (XiX2CGX3X3 ' CGX2 ' Xi' (CG) p) z (SEQ ID NO: 159) em que N são nucleósidos com x=0-3, y=l-4, w=-2, -1, 0, 1 ou 2, p=0 ou 1, q=0, 1 ou 2, e z=l-20, em que Xi e Xi', X2 e X2', e X3 e X31 são auto-complementares e em que o T 5' da sequência (TCG (Nq) ) y está a 0-3 bases da extremidade 5' do polinucleótido. O PIM compreende ainda uma sequência palindrómica de 10 bases de comprimento ou mais em que a sequência palindrómica compreende a primeira (XiX2CGX3X3,CGX2IXi’) (SEQ IDNO:216) de pelo menos uma sequência (XiX2CGX3X3 ' CGX2 ’Χχ ' (CG) p) (SEQ IDNO:217). Num PIM com w=-l, a base 3' de uma sequência (TCG(Nq))y é o Xi 5' da primeira sequência (XiX2CGX3X3' CGX2 'Xi' (CG) p) (SEQ ID NO:217). Num PIM com w=-2, a penúltima (i.e., a segunda antes da final) e a última (i.e., a final) bases 3' da sequência (TCG(Nq))y são o Xi e X2 5', respectivamente, da primeira sequência (XiX2CGX3X3 ' CGX2 1 Xi' (CG)P) (SEQ ID NO: 217) . Nalguns casos, a sequência (TCG(Nq))y é separada da sequência palindrómica por 0, 1 ou 2 bases. Noutros casos, a sequência palindrómica inclui toda ou parte da sequência (TCG(Nq))y. Nalguns casos, quando p=l, X2, X2, e X3 são cada um A ou T. Nalguns casos, quando p=0, pelo menos dois de X2, X2, e X3 são A ou T. As seguintes sequências (sequências palindrómicas sublinhadas) são mostradas apenas para fins ilustrativos: 5'-TCGGACGATCGTCGACGATCGTC (SEQ ID NO:86); 5'-TCGTCGGACGATCGTCACGACG (SEQ ID NO:87); 5'-TCGGTCGATCGACGTCGATCGAC (SEQ ID NO:134); 5'-TCGGACGGCCGTCGACGGCCGTC (SEQ ID NO:135); 5'-TCGGACGTACGTCGACGTACGTC (SEQ ID NO:136); 5'-TCGATCGTACGATATCGTACGAT (SEQ ID NO:137); 5'-TCGTCGGACGATCGTCCGACGA (SEQ ID NO:138). É aqui descrito um PIM que compreende uma sequência de fórmula: 5 ' -Nx (TCG (Nq) ) yNw (XiX2CGX2 ' Xi' (CG) p) z (SEQ IDO NO:156) em que N são nucleósidos com x=0-3, y=l-4, w= -2, -1, 0, 1 ou 2, p=0 ou 1, q=0, 1 ou 2, e z=l-20, em que Xi e Xi', X2 e X2' são auto-complementares, e em que o T 5' da sequência (TCG (Nq) ) y está a 0-3 bases da extremidade 5' do polinucleótido. O PIM compreende ainda uma sequência palindrómica de 8 bases de comprimento ou mais em que a 33
ΕΡ 1 992 635/PT sequência palindrómica compreende a primeira (XxX2CGX2'Χχ') de pelo menos uma sequência (XxX2CGX2' Χχ' (CG)P)Z. Num PIM com w = -2, as penúltimas (i.e., anteriores à final) e as últimas (i.e., as finais) bases a 3' da sequência (TCG(Nq) ) y são a Χχ e a X2 a 5', respectivamente, da primeira sequência (XiX2CGX2 'Xi ' (CG) p) . Em alguns casos, a sequência (TCG(Nq))y é separada da sequência palindrómica por 0, 1 ou 2 bases.
Noutros casos, a sequência palindrómica inclui toda ou parte da sequência (TCG(Nq))y. Nalgumas concretizações, Χχ e X2 são cada uma A ou T. 0 PIM do invento compreende a seguinte sequência (sequência palindrómica sublinhada) marcada com um asterisco (*). 0 resto é apenas para fins ilustrativos: 5'-TCGAACGTTCGTTCGAACGAACGTT (SEQ ID NO:147); 5'-TCGAACGTTTTCGAAAACGTT (SEQ ID NO:148); 5'-TCGTCGAACGTTCCTTAACGTTCG (SEQ ID NO:7); 5'-TCGAACGTTAACGTTCGATT (SEQ ID NO:80); 5'-TCGTCGAACGTTCGAGATGAT (SEQ ID NO:27); 5'-GGTCGAACGTTCGAGGGGGG (SEQ ID NO:30); 5'-TCGTCGAACGTTCGAGGGGGG (SEQ ID NO:32); 5'-TTCGAACGTTCGAACGTTCGAAT (SEQ ID NO:38); 5'-TCGAACGTTCGAACGTTCGAAT (SEQ ID NO:39); 5'-TCGTCGAACGTTCGACGA (SEQ ID NO:52); 5'-TTTCGAACGTTCGAACGTTCGAAAT (SEQ ID NO:57); 5.-TTTTCGAACGTTCGAACGTTCGAAAAT (SEQ ID NO:58); 5.-TTTTCGAACGTTCGAACGTTCGAAT (SEQ ID NO:59); 5'-TCGAACGTTCGAACGTTCGA (SEQ ID NO:97); 5'-TTCGAACGTTCGAA (SEQ ID NO:98); 5'-TCGTCGAACGTTCGAGAT (SEQ ID NO:99); 5'-TCGTCGAACGTTCGAG (SEQ ID NO:100); 5'-TCGTCGAACGTTCGA (SEQ ID NO:101); 5'-TCGAACGTTCGAG (SEQ ID NO:102)/ 51-TCGAACGTTCGA (SEQ ID NO:103); 51-TCGAACGTTCG (SEQ ID NO:104); 34
ΕΡ 1 992 635/PT 5'-TCGTCGTCGAACGTTCGAGAT (SEQ ID NO:106); 5'-TCGTCGTCGTCGAACGTTCGA (SEQ ID NO:107); 5'-TCGTCGTCGAACGTTCGACGAGAT (SEQ ID NO:108); 5'-TCGAACGTTCGAACGTTCGAACGTT (SEQ ID NO:113); 5'-CTTCGAACGTTCGAAGTG (SEQ ID NO:115); 5'-TGATCGTCGAACGTTCGACGATCA (SEQ ID NO:116); 5'-TCGAACGTTCGAACGTTCGAATTTT (SEQ ID NO:117); 5 ' -TCGCGAACGTTCGAACGTTCG (SEQ ID NO:150); 5 ' -TCGCGAACGTTCGAACGTTTC (SEQ ID NO:151); 5'-TCGATAACGTTCGAACGTTAT (SEQ ID NO:152); 5 ' -TCGATAACGTTCGAACGTTTC (SEQ ID NO:153); 5 ' -TCGTCGAACGTTCGAGATG (SEQ ID NO:166); 5'-TCGTCGAACGTTCG (SEQ ID NO:167); 5'-TCGAACGTTCGA TCGAACGTTCGA (SEQ ID NO:168); 5'-TCGACCGGTCGACCGGTCGA (SEQ ID NO:169); 5'-TCGAACGTTCGAACGTTGATGT (SEQ ID NO:170); 5'-TCGAACGTTCGAAGATGATGAT (SEQ ID NO:171)*; 5'-TCGAACGTTCGAACGTTCGAACG (SEQ ID NO:175); 5'-TCGAACGTTCGAACGTTCGAACGTTCGAAT (SEQ ID NO:172); 5'-TCGATAACGTTCGAACGTTCGAACGTTAT (SEQ ID NO:173); 5'-TCGTAACGTTCGAACGTTCGAACGTTA (SEQ ID NO:174).
Nalguns casos, num PIM, X1X2 não é AA. Nalguns casos, num PIM, Xi não é A. As seguintes sequências (sequências palindrómicas sublinhadas) são apenas para fins ilustrativos. 5'-TCGAGCGCTAGCGCTCGATT (SEQ ID NO:81); 5'-TCGGTCGACGTCGACCGATT (SEQ ID NO:82); 5'-TCGGACGTCGACGTCCGATT (SEQ ID NO:83); 5'-TCGTTCGAATTCGAACGATT (SEQ ID NO:84); 5'-TCGTCGGCCGGCCGAGATGAT (SEQ ID NO:112); 5'-TCGGACGTCCGGACGTCCGA (SEQ ID NO:79); 5'-TCGTCGCACGTGCGAGATGAT (SEQ ID NO:48); 35
ΕΡ 1 992 635/PT 35 ΕΡ 1 992 635/PT 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5' 5’ 5' 5' 5' 5' 5’ 5' 5' 5' 5' 5 5' 5' 5' 5' 5' -TCGTCGTACGTACGAGATGAT (SEQ ID N0:51); -TCGTCGGGCGCCCGAGATGAT (SEQ ID NO:70); -TCGTCGCGCGCGCGAGATGAT (SEQ ID N0:71); -TCGTCGCTCGAGCGAGATGAT (SEQ ID NO:72); -TCGTCGCCCGGGCGAGATGAT (SEQ ID NO:73); -TCGTCGTGCGCACGAGATGAT (SEQ ID NO:74); -TCGTCGTCCGGACGAGATGAT (SEQ ID NO:76); -TCGAGCGCTCGAGCGCTCGA (SEQ ID NO:77); -TCGTCGGTCGACCGAGATGAT (SEQ ID NO:46); -TCGTCGGACGTCCGAGATGAT (SEQ ID NO:47); -TCGTCGAGCGCTCGAGATGAT (SEQ ID NO:44); -TCGATTCGAACGTTCGAACGTTCG (SEQ ID NO:40); -TCGTTCGAACGTTCGAAGTGAT (SEQ ID N0:41); -TCGTTCGAACGTTCGAACGA (SEQ ID NO:42); -TCGTTCGAACGTTCGAACGTTCG (SEQ ID NO:53); -TCGTTCGAACGTTCGAA (SEQ ID NO:54); -TCGTTCGAACGTTCGAACGTTCGAA (SEQ ID NO:55); -TCGTTCGAACGTTCGAACGATTTTTCGTTCGAACGTTCGAACGA (SEQ ID NO:56); -TCGATCGATCGATCGATCGATT (SEQ ID NO:43); -TCGTCGATCGATCGAGATGAT (SEQ ID NO:45); -TCGTCGACCGGTCGAGATGAT (SEQ ID NO:69); -TCGTCGTTCGAACGAGATGAT (SEQ ID NO:75); -TCGGTCGACCGGTCGACCGA (SEQ ID NO:78); '-TCGTTCGAACGTTCGAACGTTCGAACG (SEQ ID NO:109); -TCGTTCGAACGTTCGAACGAATGAT (SEQ ID NO:118); -TCGACCGGTCGACCGGTCGACCGGT (SEQ ID NO:176); -TCGCGCGCGCGCGCGCGCGA (SEQ ID NO:177); -TCGCCCGGGCGCCCGGGCGA (SEQ ID NO:178); -TCGGCCGGACGTCCGGACGA (SEQ ID NO:179); 5'-TCGGCCGGCCGGCCGGCCGA (SEQ ID NO:180). 36
ΕΡ 1 992 635/PT
Um PIM pode compreender uma sequência de fórmula: 5'-Nx(TCG(Nq)yNw(X1X2X3X4X5CGX5'X4'X3'X2'Xi' (CG) p) z (SEQ ID NO:160) em que N são nucleósidos com x=0-3, y=l-4, w=-3, -2, -1, 0, 1 ou 2, p=0 ou 1, q=0, 1 ou 2, e z=l-20, em que Xi e Χ2', X2 e X2', X3 e X3', X4 e X4' , e X5 e X5' são auto-complementares, e em que o T 5' da sequência (TCG(Nq))y está a 0-3 bases da extremidade 5' do polinucleótido. O PIM compreende ainda uma sequência palindrómica de 12 bases de comprimento ou mais em que a sequência palindrómica compreende a primeira (X1X2X3X4X5CGX5 ) (SEQ ID NO: 218) de pelo menos uma sequência ( (X1X2X3X4X5CGX5 ' X4' X3 ' X2 ' Xi) ' (CG)P) (SEQ IDNO:219). Num PIM com w=-l, a base 3' da sequência (TCG(Nq))y é o X2 5' da primeira sequência (XiX2X3X4X5CGX5 ' X4' X3 ' X2 ' X±' (CG) P) (SEQ ID NO:219). Num PIM com w=-2, a penúltima (i.e., a segunda antes da final) e a última (i.e., a final) bases 3' da sequência (TCG(Nq))y são o X2 e X2 5', respectivamente, da primeira sequência (XiX2X3X4X5CGX5' X4 ' X3' X2 ' Xi' (CG) p) (SEQ ID NO: 219) . Num PIM com w=-3, a antepenúltima (i.e., a terceira antes da final), a penúltima (i.e., a segunda antes da final) e a última (i.e., a final) bases 3' da sequência (TCG (Nq) ) y são o Xi, X2, e X3 5', respectivamente, da primeira sequência (XiX2X3X4XsCGX5 ' X41 2X3'X2'Xi' (CG) p) (SEQ ID NO: 219) .
Nalguns casos, a sequência (TCG(Nq))y é separada da sequência palindrómica por 0, 1 ou 2 bases. Noutros casos, a sequência palindrómica inclui toda ou parte da sequência (TCG(Nq))y. Nalguns casos, pelo menos três de X2, X2, X3, X4, e X5 são A ou T. As seguintes sequências (sequências palindrómicas sublinhadas) são mostradas apenas para fins ilustrativos: 5'-TCGTGCATCGATGCAACG (SEQ ID NO:93); 5'-TCGTGCATCGATGCAGATGAT (SEQ ID NO:110); 5'-TCGTGCATCGATGCATGCATCGATGCA (SEQ ID NO:111); 5'-TCGTGCATCGATGCACGA (SEQ ID NO:149). 1
Um PIM pode compreender uma sequência de fórmula: 5 ' -Nx (TCG (Nq) ) yNw (XiX2CGCGX2 'Xi' (CG) p) z (SEQ IDNO:163) em que N são nucleósidos com x=0-3, y=l-4, w=-2, -1, 0, 1 ou 2, p=0 ou 2 q=0, 1 ou 2, e z=l-20, em que Xi e Xi', e X2 e X2' são auto-complementares, e em que o T 5' da sequência (TCG(Nq))y está a 0-3 bases da extremidade 5' do polinucleótido. O PIM compreende ainda uma sequência palindrómica de 8 bases de comprimento ou mais em que a sequência palindrómica compreende 37 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ a primeira (XiX2CGCGX2'Xi') de pelo menos uma sequência (XiX2CGCGX2 ' Xi' (CG)P) (SEQ ID NO:220). Num PIM com w=-l, a base 3' da sequência (TCG(Nq))y é o Xx 5' da primeira sequência (XiX2CGCGX2,Xi' (CG)P) (SEQ IDNO:220). Num PIM com w=-2, a penúltima (i.e., a segunda antes da final) e a última (i.e., a final) bases 3' da sequência (TCG(Nq))y são o Xi e X2 5', respectivamente, da primeira sequência (XiX2CGCGX2' Xi' (CG)P) (SEQ IDNO:220). Nalguns casos, a sequência (TCG(Nq))y é separada de uma sequência palindrómica por 0, 1 ou 2 bases. Noutros casos, a sequência palindrómica inclui toda ou parte da sequência (TCG(Nq))y. Nalguns casos, X2 e X2 são cada um A ou T. A seguinte sequência (sequência palindrómica sublinhada) é mostrada apenas para fins ilustrativos: 5'-TCGTCGATCGCGATCGACGA (SEQ ID NO:144).
Um PIM pode compreender uma sequência de fórmula: 5’-Nx(TCG(Nq) )yNw(XiX2X3CGCGX3’X2’Xi' (CG)P) z (SEQ ID NO: 164) em que N são nucleósidos com x=0-3, y=l-4, w=-3, -2, -1, 0, 1 ou 2, p=0 ou 1, q=0, 1 ou 2, e z=l-20, em que Xi e Χχ', X2 e X2', e X3 e X3' são auto-complementares, e em que o T 5' da sequência (TCG(Nq))y está a 0-3 bases da extremidade 5' do polinucleótido. O PIM compreende ainda uma sequência palindrómica de 10 bases de comprimento ou mais em que a sequência palindrómica compreende a primeira (XiX2X3CGCGX3'X2 'Χχ ’ ) (SEQ ID NO: 221) de pelo menos uma sequência (XiX2X3CGCGX3 ’X2 ’Χχ' (CG) p) (SEQ IDNO:222). Num PIM com w=-l, a base 3' de uma sequência (TCG(Nq))y é ο Χχ 5' da primeira sequência (XiX2X3CGCGX3 ’X2 'Χχ' (CG) p) (SEQ ID NO:222). Num PIM com w=-2, a penúltima (i.e., a segunda antes da final) e a última (i.e., a final) bases 3' da sequência (TCG(Nq))y são o Xi e X2 5', respectivamente, da primeira sequência (XiX2X3CGCGX3 ' X2 ' Χχ' (CG)P) (SEQ ID NO:222). Num PIM com w=-3, a antepenúltima (i.e., a terceira antes da final), a penúltima (i.e., a segunda antes da final) e a última (i.e., a final) bases 3' da sequência (TCG(Nq))y são o Χχ, X2, e X3 5', respectivamente, da primeira sequência (XiX2X3CGCGX3 ' X2 ' Χχ' (CG)P) (SEQ IDNO:222). Nalguns casos, a sequência (TCG(Nq) ) y é separada da sequência palindrómica por 0, 1 ou 2 bases. Noutros casos, a sequência palindrómica inclui toda ou parte da sequência (TCG(Nq))y. Nalguns casos, quando p=l, Xi, X2, e X3 são cada um A ou T. Nalguns casos, 38 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ quando ρ=0, pelo menos dois de Xi, X2, e X3 são A ou T. A seguinte sequência (sequência palindrómica sublinhada) é apenas para fins ilustrativos: 5'-TCGTCGAATCGCGATTCGACGA (SEQ ID NO:145).
Um PIM pode compreender uma sequência de fórmula: 5,-Nx(TCG(Nq)yNw(CGXiX2X2,Xi,CG(CG)p)z (SEQ IDNO:165) em que N são nucleósidos com x=0-3, y=l-4, w=-2, 0, 1 ou 2, p=0 ou 1, q=0, 1 ou 2, e z=l-20, em que Xi e Xi', e X2 e X2' são auto-complementares, e em que o T 5' da sequência (TCG(Nq))y está a 0-3 bases da extremidade 5' do polinucleótido. O PIM compreende ainda uma sequência palindrómica de 8 bases de comprimento ou mais em que a sequência palindrómica compreende a primeira (CGX1X2X2' Xi' CG) de pelo menos uma sequência (CGXiX2X2,Xi,CG(CG)p) (SEQ IDNO:223). Num PIM com w=-2, a penúltima (i.e., a segunda antes da final) e a última (i.e., a final) bases 3' da sequência (TCG(Nq))y são CG e são o CG 5' da primeira sequência (CGXiX2X2'Xi'CG(CG)p) (SEQ IDNO:223). Nalguns casos, a sequência (TCG(Nq))y é separada da sequência palindrómica por 0, 1 ou 2 bases. Noutros casos, a sequência palindrómica inclui toda ou parte da sequência (TCG(Nq))y. Nalguns casos, Xi e X2 são cada um A ou T. A seguinte sequência (sequência palindrómica sublinhada) é mostrada apenas para fins ilustrativos: 5'-TCGTCGCGATATCGCGACGA (SEQ ID NO:146).
Para PIM compreendendo qualquer um dos motivos aqui descritos (i.e., SEQ ID NO: 155-165) onde y=2 ou mais, o (Nq) em cada uma das repetições de y de (TCG(Nq)) é seleccionado independentemente. Por exemplo, num PIM com y=2, a primeira TCG(Nq) pode ter N=A e q=l e a segunda TCG (Nq) pode ter q=0 caso em que esta porção do PIM será . . . TCGATCG. . . Nalguns casos de PIM compreendendo qualquer um dos motivos aqui descritos (i.e., SEQ ID NO: 155-165), x é de preferência 0 ou 1. Nalguns casos de PIM compreendendo qualquer um dos motivos aqui descritos (i.e., SEQ ID NO:155-165), y é de preferência 1 ou 2. Nalguns casos de PIM compreendendo qualquer um dos motivos aqui descritos (i.e., SEQ ID NO:155-165), w é de preferência 0. Nalguns casos de PIM compreendendo qualquer um dos motivos aqui descritos (i.e., SEQ ID NO: 155-165), z é de preferência 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8. 39 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ
Tal como observado acima, os PIM contêm pelo menos uma sequência palindrómica de pelo menos 8 bases de comprimento. Nalgumas concretizações, um PIM contém pelo menos uma sequência palindrómica com pelo menos os seguintes comprimentos (em bases) : 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30. Nalgumas concretizações, a sequência palindrómica é repetida pelo menos uma vez num PIM. Nalgumas concretizações, a sequência palindrómica inclui também bases 5' da sequência (TCG (Nq) ) y, se houver.
Um polinucleótido imunomodulador pode conter modificações. As modificações de PIM incluem qualquer uma conhecida na especialidade, mas não se limitam a modificações do grupo 3 ΌΗ ou 5'OH, modificações da base nucleotidica, modificações do componente açúcar e modificações do grupo fosfato. Várias dessas modificações estão descritas abaixo. As bases modificadas podem estar incluídas na sequência palindrómica de um PIM desde que a base ou bases modificadas mantenham a mesma especificidade para o seu complemento natural através de emparelhamento de bases de Watson-Crick (p.ex., a porção palindrómica do PIM é ainda auto-complementar).
Um PIM pode ser linear, pode ser circular ou incluir porções circulares e/ou pode incluir uma volta em "gancho de cabelo". Nalgumas concretizações, o PIM compreende a seguinte sequência cíclica (sequências palindrómicas sublinhadas): --V-TCGAACGTTCGA ACGTTCG AAT - (SEQ ID NO: 181)
Um PIM pode ser ADN de cadeia simples ou cadeia dupla, bem como ARN de cadeia simples ou dupla ou outros polinucleótidos modificados. As seguintes sequências de cadeia dupla são apenas para fins ilustrativos: 5'-TCGTCGAACGTTCGAGATGAT / 5'-ATCATCTCGAACGTTCGACGA (SEQ ID NO:27 / SEQ ID NO:29) (o dúplex é SEQ ID NO:182); 5'-TCG*TCG*AACG*TTCG*AG*ATG*AT / 5’-ATCATCTCGAACGTTCGACGA (G* = 7-desaza-8-aza-dG, SEQ ID NO:187/SEQ ID NO:29) (o dúplex é SEQ ID NO:183); 40 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ 5'-TCGTCGA*A*CGTTCGA*GA*TGA*T/5'-ATCATCTCGAACGTTCGACGA (Α*= 2-amino-dA, SEQ ID NO: 188 / SEQ ID NO: 29) (o dúplex é SEQ ID NO:18 4); 5' -TCGTCGAA*CGT*TCGAGATGAT/ 5' -ATCATCTCGAACGTTCGACGA (A* = 2-amino-dA; T* = 2-tio-dT, SEQ ID NO:189/SEQ ID NO:29) (o dúplex é SEQ ID NO:185); 5 ' -TCGTCGA*A*CGT*T*CGAGATGAT/5' -ATCATCTCGAACGTTCGACGA (A*=2-amino-dA; T* = 2-tio-dT, (SEQ ID NO:190/SEQ ID NO:29) (o dúplex é SEQ ID NO:186).
Um PIM pode conter bases de ocorrência natural ou modificadas de ocorrência não natural, e pode conter açúcar, fosfato, e/ou terminais modificados. Por exemplo, para além das ligações fosfodiéster, as modificações do fosfato incluem, mas não se limitam a, metilfosfonato, fosforotioato, fosforamidato (em ponte ou não), fosfotriéster e fosforoditioato e podem ser utilizadas em qualquer combinação. Podem também ser utilizadas outras ligações não fosfato. Nalgumas concretizações, os polinucleótidos do presente invento compreendem apenas estruturas de fosforotioato. Nalgumas concretizações, os polinucleótidos do presente invento compreendem apenas estruturas de fosfodiéster. Nalgumas concretizações, um PIM pode compreender uma combinação de ligações fosfato na estrutura de fosfato tais como uma combinação de ligações fosfodiéster fosforotioato. As seguintes sequências ("s" indica ligações fosforotioato) são apenas para fins ilustrativos. ligações ligações quimera quimera quimera quimera 5'-TCGTCGAAACGTTTCGACAGT (SEQ IDNO:62), todas fosforotioato; 5'-TCGTTCGAACGTTCGAACGA (SEQ ID NO:88), todas fosfodiéster; 5'-TsCsGsTTCGAACGTTCGsAsAsCsGsA (SEQ ID NO:89), fosforotioato/fosfodiéster; 5'-GsGsTCGAACGTTCGAGsGsGsGsGsG (SEQ ID NO:26), fosforotioato/fosfodiéster; 5'-TsCsGsTCGAACGTTCGAGsGsGsGsGsG (SEQ ID NO:33), fosforotioato/fosfodiéster; 5'-TsCsGsTGCATCGATGCAGGsGsGsGsG (SEQ ID NO:34), fosforotioato/fosfodiéster. 41 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ
Modificações de açúcar conhecidas no campo, tais como análogos 2'-alcoxi-ARN, análogos 2'-amino-ARN, 2'-fluoro-ADN e quimeras 2'-alcoxi- ou 2'-amino-ARN/ADN e outras aqui descritas, podem também ser feitas e combinadas com qualquer modificação de fosfato. Exemplos de modificações de bases (discutidas mais abaixo) incluem, mas não se limitam à adição de uma porção de retirada de electrões ao C-5 e/ou C-6 de uma citosina do PIM (p.ex., 5-bromocitosina, 5-clorocitosina, 5-fluorocitosina, 5-iodocitosina) e C-5 e/ou C-6 de um uracilo do PIM (p.ex., 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-fluorouracilo, 5-iodouracilo). Ver, por exemplo, Pedido
Internacional de Patente WO 99/62923. Tal como observado acima, a utilização de uma modificação de uma base numa sequência palindrómica de um PIM não deve interferir com a capacidade de auto-complementaridade das bases envolvidas para emparelhamento de bases de Watson-Crick. No entanto, fora de uma sequência palindrómica, as bases modificadas podem ser utilizadas sem esta restrição. As seguintes sequências são apenas para fins ilustrativos: 5'-uCGuCGAACGTTCGAGATG (SEQ IDN0:21), u=2'-O-metil-uridina; 5'-TcGTCGAACGTTCGAGATG (SEQ IDNO:22), c=2'-O-metil-citidina; 5'-TCGTcGAACGTTCGAGATG (SEQ IDNO:23), c=2'-O-metil-citidina; 5'-TBGTBGAABGTTBGAGATGAT (SEQ IDNO:28), B=5-bromo-2'- desoxicitidina. 0 PIM pode ser sintetizado utilizando técnicas e equipamento de síntese de ácidos nucleicos que são bem conhecidos na especialidade incluindo, mas não se limitando a, métodos enzimáticos, métodos químicos e a degradação de sequências oligonucleotídicas maiores. Ver, por exemplo, Ausubel et al., 1987; e Sambrook et al., 1989. Quando montadas enzimaticamente, as unidades individuais podem ser ligadas, por exemplo, com uma ligase tal como ADN-ligase ou ARN-ligase de T4. Patente U.S. 5124246. A degradação de oligonucleótidos pode ser alcançada através da exposição de um oligonucleótido a uma nuclease, tal como exemplificado na Patente U.S. 4650675. O PIM pode também ser isolado utilizando procedimentos convencionais de isolamento de polinucleótidos. Tais 42 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ procedimentos incluem, mas não se limitam a, hibridação de sondas com bibliotecas de ADN genómico ou ADNc para detectar sequências nucleotidicas partilhadas, pesquisa de bibliotecas de expressão com anticorpos para detectar caracteristicas estruturais partilhadas e síntese de determinadas sequências nativas através de reacção em cadeia da polimerase. 0 polinucleótido circular imunomodulador pode ser isolado, sintetizado através de métodos recombinantes ou quimicamente sintetizado. Quando o PIM circular é obtido através de isolamento ou através de métodos recombinantes, o PIM será de preferência um plasmídeo. A síntese química de oligonucleotídicos circulares menores pode ser efectuada utilizando qualquer método descrito na literatura. Ver, por exemplo, Gao et al., Nucleic Acids Res. 23: 2025-2029, 1995; e Wang et al., Nucleic Acids Res. 22: 2326-2333, 1994.
As formas em dúplex (i.e., de cadeia dupla) e em "gancho de cabelo" da maioria dos PIM estão em equilíbrio dinâmico, com a forma em "gancho de cabelo" geralmente favorecida a baixa concentração de polinucleótido e temperaturas mais elevadas. As ligações cruzadas covalentes intercadeias ou intracadeias aumentam a estabilidade do dúplex ou do "gancho de cabelo", respectivamente, para alterações conformacionais induzidas pela temperatura, força iónica, pH e concentração. As ligações cruzadas químicas podem ser utilizadas para prender o polinucleótido na forma de dúplex ou de "gancho de cabelo" para caracterização físico-química e biológica. Os PIM com ligações cruzadas que sejam conformacionalmente homogéneos e estejam "presos" na sua forma mais activa (forma em dúplex ou "gancho de cabelo") podem ser potencialmente mais activos que as suas contrapartidas sem ligações cruzadas. Assim, alguns PIM do presente invento contêm ligações cruzadas covalentes intercadeias e/ou intracadeias. É conhecida na especialidade uma variedade de modos para ligar quimicamente de forma cruzada ADN dúplex. Pode ser utilizado qualquer método de ligação cruzada desde que o produto polinucleótido com ligações cruzadas possua a actividade imunomoduladora desejada. 43
ΕΡ 1 992 635/PT
Um método, por exemplo, resulta numa ponte dissulfureto entre duas timidinas opostas no terminal do dúplex ou "gancho de cabelo". Para este método de ligação cruzada, o oligonucleótido ou oligonucleótidos de interesse são sintetizados com uma 5'-DMT-N3-(tBu-SS-etil)timidina-3'-fosforamidito ("T*"). Para formar a ponte dissulfureto, as ligações dissulfureto mistas são reduzidas, o oligonucleótido é purificado, as cadeias hibridadas e o composto oxidado ao ar para formar a ligação cruzada intracadeia no caso de uma forma em "gancho de cabelo" ou a ligação cruzada intercadeias no caso de uma forma dúplex. Alternativamente, os oligonucleótidos podem ser primeiro hibridados e depois reduzidos, purificados e oxidados ao ar. Tais métodos e outros estão descritos, por exemplo, em Glick et al., J. Org. Chest. 56: 6746-6747, 1991; Glick et al., J. Am. Chem. Soc. 114: 5447-5448, 1992; Goodwin et al., Tetrahedron Letters 35: 1647-1650, 1994; Wang et al., J. Am. Chem. Soc. 117: 2981-2991, 1995; Osborne et al., Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 6: 2339-2342, 1996; e Osborne et al. , J. Am. Chem. Soc. 18: 11993-12003, 1996.
Exemplos de sequências polinucleotidicas nas quais uma 5'-DMT-A/3-(tBu-SS-etil)timidina-3'-fosforamidito ("τ *") pode ser incorporada para fins de ligação cruzada incluem as seguintes. A incorporação da T* na extremidade 3' de um análogo de SEQ ID NO:27 (5'-TCGTCGAACGTTCGAGATGAT*-3', SEQ ID NO: 27ANALOG1) e na extremidade 5' de um análogo de SEQ ID NO: 29 (5 ' -T*TCATCTCGAACGTTCGACGA-3 ' , SEQ ID NO: 29ANAL0G1) permitirá uma ligação cruzada num dúplex das duas cadeias na extremidade 3' do análogo da SEQ ID NO: 27. A incorporação da T* em dois locais num análogo de SEQ ID NO:113 permitirá duas ligações cruzadas para formar um dúplex ou uma única ligação cruzada para manter uma forma em "gancho de cabelo".
Por exemplo, a dobragem da sequência 5’-TCGT*AACGTTCGAACGTTCGAACGTTT*-3 (SEQ ID NO:113ANALOG1) numa estrutura em "gancho de cabelo" e a formação de uma ligação cruzada nos resíduos T substituídos resultarão num polinucleótido com ligações cruzadas com a seguinte estrutura secundária.
A
5 ’-TCGT* AACGTTCGA C 3’-T*TTGCAAGCT G T 44
ΕΡ 1 992 635/PT
Uma tal estrutura em "gancho de cabelo" ou estrutura dúplex da mesma sequência terá uma 5'-TCG livre embora constrangida em duas posições (a extremidade 3' e 4 bases internas desde a extremidade 5').
Outro método de ligação cruzada forma uma ponte dissulfureto entre resíduos de deslocamento na estrutura dúplex ou em "gancho de cabelo". Para este método de ligação cruzada, o oligonucleótido ou oligonucleótidos de interesse são sintetizados com nucleósidos convertíveis (comercialmente disponíveis, por exemplo, em Glen Research). Este método utiliza, por exemplo, uma ponte dissulfureto A-A ou uma ponte dissulfureto C-A e são também possíveis ligações através de outras bases. Para formar o polinucleótido modificado por dissulfuretos, faz-se reagir o polinucleótido contendo o nucleósido convertível com cistamina (ou outra amina contendo dissulfureto). Para formar a ponte dissulfureto, as ligações mistas de dissulfureto são reduzidas, o oligonucleótido é purificado, as cadeias hibridadas e o composto é oxidado ao ar para formar a ligação cruzada intracadeia no caso de uma forma em "gancho de cabelo" ou a ligação cruzada intercadeias no caso de uma forma dúplex. Alternativamente, os oligonucleótidos podem ser primeiro hibridados e depois reduzidos, purificados e oxidados ao ar. Tais métodos estão descritos, por exemplo, em Ferentz et al. , J. Am. Chem. Soc. 113: 4000-4002, 1991 e Ferentz et al. , J. Am. Chem. Soc. 115: 9006-9014, 1993.
Exemplos de sequências polinucleotídicas nas quais resíduos N6-cistamina-2'-dA (A*) de deslocamento são utilizados para ligar de forma cruzada um dúplex incluem as seguintes. A incorporação da A* na extremidade 3' da sequência 5' -TCGTCGAACGTTCGAGA*TGAT-3 ' , SEQ ID NO: 191 e na extremidade 5' do seu complemento 5' -ATCA*TCTCGAACGTTCGACGA-3 ' , SEQ IDNO:192 permitirá uma ligação cruzada num dúplex das duas cadeias na extremidade 3' da SEQ ID NO:191. Tais modificações podem também ser utilizadas para ligação cruzada de estruturas em "gancho de cabelo".
As técnicas para produzir polinucleótidos e polinucleótidos modificados são conhecidas na especialidade. O ADN ou ARN de ocorrência natural, contendo ligações 45
ΕΡ 1 992 635/PT fosfodiéster, é geralmente sintetizado através da ligação sequencial do nucleósido-fosforamidito apropriado ao grupo 5'-hidroxilo do oligonucleótido em crescimento ligado a um suporte sólido na extremidade 3', seguido de oxidação do triéster de fosfito intermediário num triéster de fosfato. Uma vez sintetizada a sequência polinucleotidica desejada, o polinucleótido é removido do suporte, os grupos triéster de fosfato são desprotegidos em diésteres de fosfato e as bases nucleosidicas são desprotegidas utilizando amónia aquosa ou outras bases. Ver, por exemplo, Beaucage (1993) "Oligodeoxyribonucleotide Synthesis" em Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties (Agrawal, ed.) Humana Press, Totowa, NJ; Warner et al., DNA 3: 401, 1984; e Patente U.S. 4458066. O PIM pode também conter polinucleótidos com modificação do fosfato, alguns dos quais sabe-se que estabilizam o polinucleótido. Assim, algumas concretizações incluem polinucleótidos imunomoduladores estabilizados. A síntese de polinucleótidos contendo ligações fosfato ou ligações não fosfato modificadas é também conhecida na especialidade. Para uma revisão, ver Matteucci (1997) "Oligonucleotide Analogs: an OverView" em Oligonucleotides as Therapeutic Agents, (D.J. Chadwick e G. Cardew, ed.) John Wiley and Sons, New York, NY. O derivado fosforoso (ou grupo fosfato modificado) que pode ser unido à porção açúcar ou análogo de açúcar nos polinucleótidos do presente invento pode ser um monofosfato, difosfato, trifosfato, alquilfosfonato, fosforotioato, fosforoditioato, fosforamidato ou semelhante. A preparação dos análogos fosfato acima observados, e sua incorporação em nucleótidos, nucleótidos modificados e oligonucleótidos, per se, é também conhecida e não necessita de ser aqui descrita em detalhe. Peyrottes et al. , Nucleic Acids Res. 24: 1841-1848, 1996; Chaturvedi et al., Nucleic Acids Res. 24: 2318-2323, 1996; e Schultz et al. , Nucleic Acids Res. 24: 2966-2973, 1996. Por exemplo, a síntese de oligonucleótidos fosforotioato é semelhante à descrita para oligonucleótidos de ocorrência natural excepto que o passo de oxidação é substituído por um passo de sulfurização (Zon (1993) "Oligonucleoside Phosphorothioates" em Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties (Agrawal, ed.) Humana Press, págs. 165-190). Semelhantemente foi também descrita a síntese 46
ΕΡ 1 992 635/PT de outros análogos de fosfato, tais como fosfotriéster (Miller et al. , JACS 93: 6657-6665, 1971), fosforamidatos sem formar pontes (Jager et al., Biochem. 27: 7247-7246, 1988), fosforamidiatos N3' a P5' (Nelson et al. , JOC 62: 7278-7287, 1997) e fosforoditioatos (Patente U.S. 5453496). Outros oligonucleótidos modificados de bases não fosforosas podem também ser utilizados (Stirchak et al., Nuclelc Acids Res. 17: 6129-6141, 1989). Os polinucleótidos com estruturas de fosforotioato podem ser mais imunogénicos que aqueles com estruturas fosfodiéster e parecem ser mais resistentes à degradação após injecção no hospedeiro. Braun et al., J. Immunol. 141: 2084-2089, 1988/ e Latimer et al., Mol. Immunol. 32: 1057-1064, 1995.
Os PIM utilizados no presente invento podem compreender um ou mais ribonucleótidos (contendo ribose como o único ou o principal componente açúcar), desoxirribonucleótidos (contendo desoxirribose como o principal componente açúcar), ou, tal como é conhecido na especialidade, podem também ser incorporados no PIM açúcares modificados ou análogos de açúcares. Assim, para além da ribose e da desoxirribose, a porção açúcar pode ser pentose, desoxipentose, hexose, desoxi-hexose, glicose, arabinose, xilose, lixose, e um grupo ciclo-pentilo "análogo" de açúcar. O açúcar pode estar numa forma de piranosilo ou de furanosilo. No PIM, a porção açúcar é de preferência o furanósido da ribose, desoxirribose, arabinose ou 2'-O-alquilribose, e o açúcar pode ser unido às respectivas bases heterociclicas na configuração α ou β anomérica. As modificações do açúcar incluem, mas não se limitam a, análogos 2'-alcoxi-ARN, análogos 2'-amino-ARN, análogos 2'-fluoro-ADN e quimeras 2'-alcoxi- ou 2'-amino-ARN/ADN. Por exemplo, uma modificação do açúcar no PIM inclui, mas não se limita a, 2'-O-metil-uridina e 2'-O-metil-citidina. A preparação destes açúcares ou análogos de açúcar e respectivos "nucleósidos" em que tais açúcares ou análogos estão ligados a uma base heterocíclica (base de ácido nucleico) é conhecida per se, e não necessita de ser aqui descrita, excepto até ao ponto em que tal preparação pode pertencer a qualquer exemplo especifico. Modificações de açúcares podem também ser feitas e combinadas com qualquer modificação do fosfato na preparação de um PIM. 47
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As bases heterociclicas, ou bases de ácidos nucleicos, que são incorporadas no PIM podem ser as bases purina e pirimidina principais de ocorrência natural, (nomeadamente uracilo, timina, citosina, adenina e guanina, tal como mencionado acima), bem como modificações de ocorrência natural e sintéticas das referidas bases principais. Assim, um PIM pode incluir 2'-desoxiuridina e/ou 2-amino-2'-desoxiadenosina.
Os peritos na especialidade reconhecerão que um grande número de nucleósidos não naturais "sintéticos" compreendendo vários bases heterociclicas e várias porções açúcar (e análogos de açúcar) estão disponíveis na especialidade, e que desde que outros critérios do presente invento sejam satisfeitos, o PIM pode incluir uma ou várias bases heterociclicas para além das cinco bases principais componentes dos ácidos nucleicos de ocorrência natural. De preferência, no entanto, a base heterocíclica no PIM inclui, mas não se limita aos grupos uracil-5-ilo, citosin-5-ilo, adenin-7-ilo, adenin-8-ilo, guanin-7-ilo, guanin-8-ilo, 4- aminopirrolo[2,3-d]pirimidin-5-ilo, 2-amino-4-oxopirolo-[2,3-d]pirimidin-5-ilo, 2-amino-4-oxopirrolo[2,3-d]pirimidin-3-ilo, onde as purinas estão ligadas à porção açúcar do PIM através da posição 9, as pirimidinas através da posição 1, as pirrolopirimidinas através da posição 7 e as pirazolopirimidinas através da posição 1. 0 PIM pode compreender pelo menos uma base modificada. Tal como aqui se utiliza, o termo "base modificada" é sinónimo de "análogo de base", por exemplo, "citosina modificada" é sinónimo de "análogo de citosina". Semelhantemente, nucleósidos ou nucleótidos "modificados" são aqui definidos como sendo sinónimos de "análogos" de nucleósidos ou nucleótidos. Exemplos de modificações de bases incluem, mas não se limitam à adição de uma porção de retirada de electrões ao C-5 e/ou C-6 de uma citosina do PIM. De preferência, a porção de retirada de electrões é um halogéneo. Tais citosinas modificadas podem incluir, mas não se limitam a, azacitosina, 5- bromocitosina, bromouracilo, 5-clorocitosina, citosina clorada, ciclocitosina, arabinósido de citosina, 5-fluorocitosina, fluoropirimidina, fluorouracilo, 5,6-di-hidrocitosina, 5-iodocitosina, hidroxiureia, iodouracilo, 5-nitrocitosina, uracilo e qualquer outro análogo de pirimidina 48 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ ou pirimidina modificada. Outros exemplos de modificações de bases incluem, mas não se limitam à adição de uma porção de retirada de electrões ao C-5 e/ou C-6 de um uracilo do polinucleótido imunomodulador. De preferência, a porção de retirada de electrões é um halogéneo. Tais uracilos modificados podem incluir, mas não se limitam a, 5- bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-fluorouracilo, 5-iodouracilo.
Outros exemplos de modificações de bases incluem a adição de um ou mais grupos tiol à base incluindo, mas não se limitando a, 2-amino-adenina, 6-tio-guanina, 2-tio-timina, 4-tio-timina, 5-propinil-uracilo e 4-tio-uracilo. Outros exemplos de modificações de bases incluem, mas não se limitam a, N4-etilcitosina, 7-desazaguanina, 7-desaza-8-azaguanina e 5-hidroxicitosina. Ver, por exemplo, Kandimalla et ai., Bioorg. Med. Chem. 9: 807-813, 2001. As seguintes sequências com bases modificadas (sequência palindrómica sublinhada) são apenas para fins ilustrativos. 5'-TCXTCXAACXTTCXAGATGAT (X = 7-desaza-dG) (SEQ ID NO:193); 5'-TCGTCGAA*CGT*TCGAGATGAT (A* = 2-amino-dA; T* = 2-tio-dT) (SEQ ID NO:189); 5'-TCGTCGA*A*CGT*T*CGAGATGAT (A* = 2-amino-dA; T* = 2-tio-dT) (SEQ ID NO:190); 5'-TCG*TCG*AACG*TTCG*AG*ATG*AT (G* = 7-desaza-8-aza-dG) (SEQ ID NO:187); 5'-TCG*AACG*TTCG*AACG*TTCG*AACG*TT (G* = 7-desaza-8-aza-dG) (SEQ ID NO:194); 5'-TCGT*CGAACGT*T*CGAGAT*GAT* (T* = 5-propinil-dU) (SEQ ID NO:195); 5,-TCGAACGT*T*CGAACGT*T*CGAACGT*T* (T* = 5-propinil-dU) (SEQ ID NO:196); 5 ' -TCGTCGA*A*CGTTCGA*GA*TGA*T (A* = 2-amino-dA) (SEQ ID NO:188); 5 ' -TCGA*A*CGTTCGA*A*CGTTCGA*A*CGTT (A* = 2-amino-dA) (SEQ ID NO:197).
Tal como exemplificado no Exemplo 1, os PIM que mantêm uma forma de dúplex a baixa concentração tendem a ser capazes de estimular a produção de IFN-α a partir de PBMC humanas. A 49 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ estabilização das formas dúplex do polinucleótido através de ligações cruzadas foi descrita acima. Quando na forma dúplex com a sua sequência complementar, certas bases modificadas podem também aumentar a estabilidade dos dúplices. Por exemplo, 2-amino-dA (comercialmente disponível, por exemplo, em Glen Research) forma 3 ligações de hidrogénio com T em vez de duas ligações de hidrogénio, tal como formadas entre dA e T. SEQ ID NO: 188, um análogo de SEQ ID NO: 27, contém cinco bases 2-amino-dA em vez das cinco bases dA de SEQ ID NO: 27 e forma um dúplex mais forte consigo próprio que SEQ ID NO: 27 (dados de cromatografia de exclusão de tamanho). A incorporação destas bases modificadas aumenta a Tf cerca de 3°C por modificação. Tal como demonstrado aqui no Exemplo 1, SEQ ID NO:188 também induziu a produção de mais IFN-α que SEQ ID NO:27 quando as PBMC humanas foram tratadas com 0,8 pg/ml de PIM. A SEQ ID NO: 884 de cadeia dupla induziu cerca de três vezes a produção de IFN-α como SEQ ID NO:188 de cadeia simples. A preparação de nucleósidos de bases modificadas, e a síntese de oligonucleótidos modificados utilizando os referidos nucleósidos de bases modificadas como precursores, foi descrita, por exemplo, nas Patentes U.S. 4910300, 4948882 e 5093232. Estes nucleósidos de bases modificadas foram desenhados para poderem ser incorporados através de síntese química em posições terminais ou internas de um oligonucleótido. Tais nucleósidos de bases modificadas, presentes em posições terminais ou internas de um oligonucleótido, podem servir como locais para união de um péptido ou outro antigénio. Foram também descritos nucleósidos modificados na sua porção açúcar (incluindo, mas não se limitando a, p.ex., Patentes U.S. 4849513, 5015733, 5118800, 5118802) e podem ser utilizados semelhantemente.
Nalgumas concretizações, um polinucleótido imunomodulador tem menos de cerca de qualquer um dos seguintes comprimentos (em bases ou pares de bases): 10000; 5000; 2500; 2000; 1500; 1250; 1000; 750; 500; 300; 250; 2 00; 175; 150; 125; 100; 75; 60; 50; 40; 30; 25; 20; 15; 14; 13; 12; 11; 10. Nalgumas concretizações, um polinucleótido imunomodulador é maior que cerca de qualquer um dos seguintes comprimentos (em bases ou pares de bases) : 10; 11; 12; 13; 14; 15; 20; 25; 30; 40; 50; 50 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ 60; 75; 100; 125; 150; 175; 200; 250; 300; 350; 400; 500; 750; 1000; 2000; 5000; 7500; 10000; 20000; 50000. Alternativamente, ο polinucleótido imunomodulador pode ser qualquer um de um intervalo de tamanhos possuindo um limite superior de 10000; 5000; 2500; 2000; 1500; 1250; 1000; 750; 500; 300; 250; 200; 17 5; 150; 125; 100; 75; 60; 50; 40; 30; 25; 20; 15; 14; 13; 12; 11; 10 e um limite inferior seleccionado independentemente a partir de 10; 11; 12; 13; 14; 15; 20; 25; 30; 40; 50; 60; 75; 100; 12 5; 150; 175; 2 00; 250; 300; 350; 4 00; 50 0; 7 50; 1000; 2000; 5000; 7500, em que o limite inferior é menor que o limite superior. Nalgumas concretizações, um PIM tem de preferência cerca de 200 ou menos bases de comprimento. São também aqui descritos métodos de produção dos polinucleótidos imunomoduladores aqui descritos. Os métodos podem ser qualquer um dos aqui descritos. Por exemplo, o método pode ser sintese do PIM (por exemplo, utilizando síntese em estado sólido) e pode ainda compreender qualquer passo ou passos de purificação. Os métodos de purificação são conhecidos na especialidade. Outros métodos de preparação incluem a combinação de um polinucleótido imunomodulador com um antigénio.
Antigénio
Qualquer antigénio pode ser co-administrado com um polinucleótido imunomodulador e/ou utilizado em composições compreendendo um polinucleótido imunomodulador e um antigénio (e preparações destas composições).
Nalgumas concretizações, o antigénio é um alergénio. Exemplos de alergénios recombinantes são proporcionados na Tabela 1. A preparação de muitos alergénios é bem conhecida na especialidade, incluindo, mas não se limitando a, preparação do alergénio Antigénio E do pólen da ambrósia (Amb a I) (Rafnar et al., J. Biol. Chem. 266: 1229-1236, 1991), alergénio Lol p 1 da erva (Tamborini et al., Eur. J. Biochem. 249: 886-894, 1997), principais alergénios dos ácaros do pó
Der pi e Der PII (Chua et al. , J. Exp. Med. 167: 175-182, 1988; Chua et al., Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 91: 124-129, 1990) , alergénio do gato doméstico Fel d I (Rogers et al., Mol. Immunol. 30: 559-568, 1993), pólen de bétula 51 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ americana Bet vl (Breiteneder et ai., EMBO J. 8: 1935-1938, 1989) , alergénios da criptoméria do Japão Cry j 1 e Cry j 2 (Kingetsu et ai., Immunology 99: 625-629, 2000), e antigénios proteicos do pólen de outras árvores (Elsayed et ai., Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 204: 17-31, 1991). Tal como indicado, são conhecidos alergénios de árvores, incluindo alergénios do vidoeiro, zimbro e criptoméria do Japão. A preparação de antigénios proteicos a partir do pólen de erva para administração in vivo foi relatada.
Nalgumas concretizações, o alergénio é um alergénio alimentar, incluindo, mas não se limitando a, alergénio do amendoim, por exemplo Ara h I (Stanley et al. , Adv. Exp. Med. Biol. 409: 213-216, 1996); alergénio da noz, por exemplo,
Jug r I (Tueber et al., J. Allergy Clin. Immunol. 101: 807- 814, 1998); alergénio da castanha-do-pará, por exemplo,
albumina (Pastorello et al. , J. Allergy Clin. Immunol. 102: 1021-1027, 1998; alergénio do camarão, por exemplo, Pen a I (Reese et al., Int. Arch. Allergy Immunol. 113: 240-242, 1997); alergénio do ovo, por exemplo, ovomucóide (Crooke et al. , J. Immunol. 159: 2026-2032, 1997); alergénio do leite, por exemplo, β-lactoglobina bovina (Sei et ai., Clin. Exp. Allergy 29: 1055-1063, 1999); alergénio do peixe, por exemplo, parvalbuminas (Van Do et ai., Scand. J. Immunol. 50: 619-625, 1999; Galland et ai., J. Chromatogr. B. Biomed. Sei. Appl. 706: 63-71, 1998). Nalgumas concretizações, o alergénio é um alergénio do látex, incluindo mas não se limitando a, Hev b 7 (Sowka et ai., Eur. J. Biochem. 255: 213-219, 1998). A Tabela 1 mostra uma lista de exemplos de alergénios que podem ser utilizados. 52 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ TABELA 1
ALERGÉNIOS RECOMBINANTES
Grupo Alergénio Referência ANIMAIS: CRUSTÁCEOS Camarão/Lagosta tropomiosina Leung et al. (1996) J. Allergy Clin. Immunol. 98:954-961 Pan s I Leung et al. (1998) Mol. Mar. Biol. Biotechnol. 7:12-20 INSECTOS Formiga Sol i 2 (veneno) Schmidt et al. J Allergy Clin Immunol., 1996, 98:82-8 Abelha Fosfolipase A2 Muller et al. J Allergy Clin Immunol, 1995, 96:395-402 (PLA) Forster et al. J Allergy Clin Immunol, 1995, 95:1229-35 Muller et al. Clin Exp Allergy, 1997, 27:915-20 Hialuronidase Soldatova et al. J Allergy Clin Immunol, 1998, 101:691-8 (Hya) Barata Bla g Bd90K Helm et al. J Allergy Clin Immunol, 1996, 98:172-180 Bla g 4 (uma calicina) Vailes et al. J Allergy Clin Immunol, 1998, 101:274-280 Glutationa-S- Arruda et al. J Biol Chem, 1997, 272:20907-12 transferase Per a 3 Wu et al. Mol Immunol, 1997, 34:1-8 Ácaro do pó Der p 2 (alergénio Lynch et al. J Allergy Clin Immunol, 1998, 101:562-4 principal) Hakkaart et al. Clin Exp Allergy, 1998, 28:169-74 Hakkaart et al. Clin Exp Allergy, 1998, 28:45-52 Hakkaart et al. Int Arch Allergy Immunol, 1998, 115 (2) : 150-6 Mueller et al. J Biol Chem, 1997, 272:26893-8 variante de Der p2 Smith et al. J Allergy Clin Immunol, 1998, 101:423-5 Der f2 Yasue et al. Clin Exp Immunol, 1998, 113:1-9 Yasue et al. Cell Immunol, 1997, 181:30-7 Der plO Asturias et al. Biochim Biophys Acta, 1998, 1397:27-30 Tyr p 2 Eriksson et al. Eur J Biochem, 1998 Vespão Antigénio 5 aka Tomalski et al. Arch Insect Biochem Physiol, 1993, Dol m V (veneno) 22:303-13 Mosquito Aed a I (apirase salivar) Xu et al. Int Arch Allergy Immunol, 1998, 115:245-51 Vespa antigénio 5, hialuronidase e King et al. J Allergy Clin Immunol, 1996, 98:588-600 fos folipase (veneno) MAMÍFEROS Gato Fel d I Slunt et al. J Allergy Clin Immunol, 1995, 95:1221-8 Hoffmann et al. (1997) J Allergy Clin Immunol 99:227-32 Hedlin Curr Opin Pediatr, 1995, 7:676-82 Vaca Bos d 2 (pêlo; uma Zeiler et al. J Allergy Clin Immunol, 1997, 100:721-7 lipocalina) Rautiainen et al. Biochem Bioph. Res Comm., 1998, 247:746-50 β-lactoglobulina Chatel et al. Mol Immunol, 1996, 33:1113-8 (BLG, principal alergénio do leite de vaca) Lehrer et al. Crit Rev Food Sei Nutr, 1996, 36:553-64 Cão Can fie Can f 2, Konieczny et al. Immunology, 1997, 92:577-86 lipocalinas Spitzauer et al. J Allergy Clin Immunol, 1994, 93:614-27 salivares Vrtala et al. J Immunol, 1998, 160:6137-44 Cavalo Equ cl (principal alergénio, uma lipocalina) Gregoire et al. J Biol Chem, 1996, 271:32951-9 Ratinho proteina urinária de ratinho (MUP) Konieczny et al. Immunology, 1997, 92:577-86 OUTROS ALERGÉNIOS DE MAMÍFERO Insulina Ganz et al. J Allergy Clin Immunol , 1990, 86:45-51 Grammer et al. J Lab Clin Med, 1987,109:141-6 Gonzalo et al. Allergy, 1998, 53:106-7 Interferões interferão alfa 2c Detmar et al. Contact Dermatis, 1989, 20:149-50 MOLUSCOS topomiosina Leung et al. J Allergy Clin Immunol, 1996, 98:954-61 ALERGÉNIOS VEGETAIS: Cevada Hor v 9 Astwood et al. Adv Exp Med Biol, 1996, 409:269-77 Bétula alergénio do pólen, Bet v 4 Twardosz et al. Biochem Bioph. Res Comm., 1997, 23 9:197 rBet v 1 Bet v 2: Pauli et al. J Allergy Clin Immunol, 1996, 97:1100-9 (profilina) van Neerven et al. Clin Exp Allergy, 1998, 28:423-33 Jahn-Schmid et al. Immunotechnology, 1996, 2:103-13 53 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ
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Nalgumas concretizações, ο antigénio é de um agente infeccioso, incluindo protozoários, bacterianos, fúngicos (incluindo unicelulares e multicelulares), e virais. Exemplos de antigénios virais adequados são aqui descritos e são conhecidos na especialidade. As bactérias incluem Hemophilus influenza, Mycobacterium tuberculosis e Bordetella pertussis. Agentes infecciosos protozoários incluem o plasmódio da malária, espécies de Leishmania, espécies de Trypanosoma e espécies de Schistosoma. Os fungos incluem Candida albicans. 54 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ
Nalgumas concretizações, ο antigénio é um antigénio virai. Antigénios polipeptídicos virais incluem, mas não se limitam a, proteínas de VIH tais como proteínas gag de VIH (incluindo, mas não se limitando a, proteína de ancoramento na membrana (MA), proteína da cápside nuclear (CA) e proteína da nucleocápside (NC)), polimerase de VIH, proteína da matriz do vírus ínfluenza (M) e proteína da nucleocápside do vírus influenza (NP), antigénio de superfície da hepatite B (HBsAg), proteína nuclear da hepatite B (HBcAg), proteína da hepatite e (HBeAg), ADN-polimerase da hepatite B, antigénios da hepatite C e semelhantes. Referências discutindo a vacinação de influenza incluem Scherle e Gerhard, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 4446-4450, 1998; Scherle e Gerhard, J. Exp. Med. 164: 1114-1128, 1986; Granoff et al., Vaccine 11: 546-51, 1993; Kodihalli et al. , J. Virol. 71: 3391-3396, 1997; Ahmeida et al. , Vaccine 11: 1302-1309, 1993; Chen et al. , Vaccine 17: 653-659, 1999; Govorkova e Smimov, Acta Virol. 41: 251-257, 1997; Koide et al. , Vaccine 13: 3-5, 1995; Mbawuike et al. , Vaccine 12: 1340-1348, 1994; Tamura et al. , Vaccine 12: 310-316, 1994; Tamura et al., Eur. J. Immunol. 22: 477-481, 1992; Hirabayashi et al., Vaccine 8: 595-599, 1990. Outros exemplos de polipéptidos antigénios são os antigénios específicos do grupo ou subgrupo, que são conhecidos para vários agentes infecciosos, incluindo, mas não se limitando a, adenovírus, vírus de herpes simplex, vírus do papiloma, vírus sincicial respiratório e poxvírus.
Muitos péptidos e proteínas antigénicos são conhecidos e estão disponíveis na especialidade; outros podem ser identificados utilizando técnicas convencionais. Para imunização contra formação de tumores ou tratamento de tumores existentes, os péptidos imunomoduladores podem incluir células tumorais (vivas ou irradiadas), extractos de células tumorais ou subunidades proteicas de antigénios tumorais tais como Her-2/neu, Marti, antigénio carcinoembrionário (CEA) , gangliósidos, glóbulo de gordura do leite humano (HMFG), mucina (MUC1), antigénios MAGE, antigénios BAGE, antigénios GAGE, gplOO, antigénio específico da próstata (PSA) e tirosinase. Podem ser formadas vacinas para contracepção com base imunológica incluindo proteínas de esperma administradas com PIM. Lea et al., Biochim. Biophys. Acta 1307: 263, 1996. 55
ΕΡ 1 992 635/PT Vírus atenuados e inactivados são adequados para utilizar aqui como antigénio. A preparação destes vírus é bem conhecida na especialidade e muitos estão comercialmente disponíveis (ver, p.ex., "Physicians' Desk Reference" (1998) 52a edição, Medicai Economics Company, Inc.). Por exemplo, o poliovírus está disponível como IPOL® (Pasteur Merieux Connaught) e ORIMUNE® (Lederle Laboratories), o vírus da hepatite A como VAQTA® (Merck), o vírus do sarampo como ATTENUVAX® (Merck), o vírus da papeira como MUMPSVAX® (Merck) e vírus da rubéola como MERUVAX®II (Merck). Adicionalmente, vírus atenuados e inactivados tais como VIH-1, VIH-2, vírus de herpes simplex, vírus da hepatite B, rotavírus, papilomavírus humano e não humano e vírus lentos do cérebro podem proporcionar antigénios peptídicos.
Nalgumas concretizações, o antigénio compreende um vector virai, tal como vacínia, adenovírus e varíola canarina.
Os antigénios podem ser isolados a partir da sua fonte utilizando técnicas de purificação conhecidas na especialidade ou, mais convenientemente, podem ser produzidos utilizando métodos recombinantes.
Os péptidos antigénicos podem incluir péptidos nativos purificados, péptidos sintéticos ou proteínas recombinantes, extractos proteicos brutos, vírus atenuados ou inactivados, células, microrganismos ou fragmentos de tais péptidos. Os péptidos imunomoduladores podem ser nativos ou sintetizados quimicamente ou enzimaticamente. Qualquer método de síntese química conhecido na especialidade é adequado. A síntese peptídica em fase de solução pode ser utilizada para construir péptidos de tamanho moderado ou, para a construção química de péptidos, pode ser empregue síntese de fase sólida. Atherton et al., Hoppe Seylers Z. Physiol. Chem. 362: 833-839, 1981. Podem também ser utilizadas enzimas proteolíticas para unir aminoácidos para produzir péptidos. Kullmann (1987) "Enzymatic Peptide Synthesis", CRC Press, Inc. Alternativamente, o péptido pode ser obtido através da utilização da maquinaria bioquímica de uma célula ou através de isolamento a partir de uma fonte biológica. Para a produção de péptidos podem ser empregues técnicas de ARN recombinante. Hames et al., 1987, 56 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ "Transcription and Translation: A Practical Approach", IRL Press. Os péptidos podem também ser isolados utilizando técnicas padrão tais como cromatografia de afinidade.
De preferência os antigénios são péptidos, lipidos (p.ex., esteróis excluindo colesterol, ácidos gordos e fosfolipidos), polissacáridos tais como os utilizados em vacinas de H. influenza, gangliósidos e glicoproteinas. Estes podem ser obtidos através de vários métodos conhecidos na especialidade, incluindo isolamento e síntese utilizando métodos químicos e enzimáticos. Em certos casos, tais como para muitos esteróis, ácidos gordos e fosfolipidos, as porções antigénicas das moléculas estão comercialmente disponíveis.
Exemplos de antigénios virais úteis nas composições e métodos sujeitos utilizando as composições incluem, mas não se limitam a, antigénios de VIH. Tais antigénios incluem, mas não se limitam aos antigénios derivados das glicoproteinas do envelope de VIH incluindo, mas não se limitam a, gpl60, gpl20 e gp41. São conhecidas numerosas sequências para genes e antigénios de VIH. Por exemplo, a base de dados Los Alamos National Laboratory HIV Sequence Database recolhe, trata e anota sequências nucleotídicas e de aminoácidos de VIH. Esta base de dados está acessível através da internet e numa publicação anual, ver "Human Retrovírus and AIDS Compendium" (por exemplo, edição de 2000).
Os antigénios derivados de agentes infecciosos podem ser obtidos utilizando métodos conhecidos na especialidade, por exemplo, a partir de extractos virais ou bacterianos, a partir de células infectadas com o agente infeccioso, a partir de polipéptidos purificados, a partir de polipéptidos produzidos de forma recombinante e/ou como péptidos sintéticos. PIM-Antigénio
Quando utilizado com antigénio, o PIM pode ser administrado com o antigénio de vários modos. Nalgumas concretizações, um PIM e um antigénio podem ser administrados espacialmente próximos em relação um ao outro, ou como uma mistura (i.e., em solução). Tal como descrito abaixo, a aproximação espacial pode ser alcançada de vários modos, incluindo conjugação (ligação), encapsidação, através de 57 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ afixação numa plataforma ou adsorção numa superfície. Geralmente, e de maior preferência, um PIM e um antigénio estão associados em proximidade a uma distância eficaz para aumentar a resposta imunitária gerada em comparação com a administração do PIM e do antigénio como uma mistura.
Nalgumas concretizações, o PIM é conjugado com o antigénio. A porção PIM pode ser ligada à porção antigénio de um conjugado numa variedade de modos, incluindo interacções covalentes e/ou não covalentes. A ligação entre as porções pode ser feita na extremidade 3' ou 5' do PIM, ou numa base adequadamente modificada numa posição interna no PIM. Se o antigénio for um péptido e contiver um grupo reactivo adequado (p.ex., um éster de N-hidroxissuccinimida), pode reagir directamente com o grupo amino N4 dos resíduos de citosina. Dependendo do número e da localização dos resíduos de citosina no PIM, pode ser alcançada a ligação específica num ou mais resíduos.
Alternativamente, oligonucleósidos modificados, tais como são conhecidos na especialidade, podem ser incorporados em posições terminais ou internas no PIM. Estes podem conter grupos funcionais bloqueados que, quando desbloqueados, são reactivos com uma variedade de grupos funcionais que podem estar presentes ou ser unidos ao antigénio de interesse.
Quando o antigénio é um péptido ou polipéptido, esta porção do conjugado pode ser unida à extremidade 3' do PIM através de química de suporte sólido. Por exemplo, a porção PIM pode ser adicionada a uma porção polipéptido que tenha sido pré-sintetizada num suporte. Haralambidis et al., Nucleic Acids Res. 18: 493-499, 1990a; e Haralambidis et al., Nucleic
Acids Res. 18: 501-505, 1990b. Alternativamente, o PIM pode ser sintetizado de modo a que fique ligado a um suporte sólido através de um ligante clivável que se prolongue desde a extremidade 3'. Após clivagem química do PIM do suporte, é deixado um grupo tio terminal na extremidade 3' do oligonucleótido (Zuckermann et al. , Nucleic Acids Res. 15: 5305-5321, 1987; e Corey et al., Science 238: 1401-1403, 1987) ou é deixado um grupo amino terminal na extremidade 3' do oligonucleótido (Nelson et al. , Nucleic Acids Res. 17: 1781- 58
ΕΡ 1 992 635/PT 1794, 1989) . A conjugação do PIM modificado em amino com grupos amino do péptido pode ser efectuada tal como descrito em Benoit et al., Neuromethods 6: 43-72, 1987. A conjugação do PIM modificado em tiol com grupos carboxilo do péptido pode ser efectuada tal como descrito em Sinah et al., 1991, "Oligonucleótido Analogues: A Practical Approach", IRL Press. Foi também descrita a ligação de um oligonucleótido possuindo uma maleimida anexa à cadeia lateral tiol de um resíduo de cisteína de um péptido. Tung et al., Bloconjug. Chem. 2: 464- 465, 1991. A porção péptido ou polipéptido do conjugado pode ser unida à extremidade 5' do PIM através de um grupo amina, tiol ou carboxilo que tenha sido incorporado no oligonucleótido durante a sua síntese. De preferência, enquanto o oligonucleótido é fixado no suporte sólido, um grupo de ligação compreendendo uma amina, um tiol ou um carboxilo protegido numa extremidade e um fosforamidito na outra, é ligado covalentemente ao hidroxilo 5'. Agrawal et al., Nucleic Acids Res. 14: 6227-6245, 1986; Connolly, Nucleic Acids Res. 13: 4485-4502, 1985; Kremsky et al., Nucleic Acids Res. 15: 2891-2909, 1987; Connolly, Nucleic Acids Res. 15: 3131-3139, 1987; Bischoff et al., Anal. Biochem. 164: 336-344, 1987;
Blanks et al., Nucleic Acids Res. 16: 10283-10299, 1988; e
Patentes U.S. 4849513, 5015733, 5118800 e 5118802.
Subsequentemente à desprotecção podem ser utilizadas as funcionalidades de amina, tiol e carboxilo para ligar covalentemente o oligonucleótido a um péptido. Benoit et al., 1987; e Sinah et al., 1991.
Um conjugado PIM-antigénio pode também ser formado através de interacções não covalentes, tais como ligações iónicas, interacções hidrófobas, pontes de hidrogénio e/ou atracções de van der Waals.
Os conjugados ligados não covalentemente podem incluir uma interacção não covalente tal como um complexo biotina- estreptavidina. Um grupo biotinilo pode ser ligado, por exemplo, a uma base modificada de um PIM. Roget et al., Nucleic Acids Res. 17: 7643-7651, 1989. A incorporação de uma porção estreptavidina na porção péptido permite a formação de 59
ΕΡ 1 992 635/PT um complexo ligado não covalentemente do péptido conjugado com estreptavidina com o oligonucleótido biotinilado.
Podem também ocorrer associações não covalentes através de interacções iónicas envolvendo um PIM e resíduos dentro do antigénio, tais como aminoácidos com carga ou através da utilização de uma porção ligante compreendendo resíduos com carga que possam interagir tanto como o oligonucleótido como com o antigénio. Por exemplo, pode ocorrer conjugação não covalente entre um PIM com carga geralmente negativa e resíduos de aminoácidos com carga positiva de um péptido, p.ex., resíduos de polilisina, poliarginina e poli-histidina. A conjugação não covalente entre PIM e antigénios podem ocorrer através de motivos de ligação ao ADN de moléculas que interajam com ADN como seus ligandos naturais. Por exemplo, tais motivos de ligação ao ADN podem ser verificados em factores de transcrição e anticorpos anti-ADN. A ligação do PIM a um lípido pode ser formada utilizando métodos padrão. Estes métodos incluem, mas não se limitam à síntese de conjugados oligonucleótido-fosfolípido (Yanagawa et al. , Nucleic Acids Symp. Ser. 19: 189-192, 1988), conjugados oligonucleótido-ácido gordo (Grabarek et al., Anal. Bíochem. 185: 131-135, 1990; e Staros et al. , Anal. Bíochem. 156: 220-222, 1986), e conjugados oligonucleótido-esterol. Boujrad et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 5728-5731, 1993. A ligação do oligonucleótido a um oligossacárido pode ser formada utilizando métodos padrão conhecidos. Estes métodos incluem, mas não se limitam à síntese de conjugados oligonucleótido-oligossacárido, em que o oligossacárido é uma porção de uma imunoglobulina. 0'Shannessy et al. , J. Applied Bíochem. 7: 347-355, 1985. A ligação de um PIM circular a um péptido ou antigénio pode ser formada de vários modos. Quando o PIM circular é sintetizado utilizando métodos recombinantes ou químicos, é adequado um nucleósido modificado. Ruth (1991) em "Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach", IRL Press. Tecnologia de ligação padrão pode então ser utilizada para ligar o PIM circular ao antigénio ou outro péptido. 60
ΕΡ 1 992 635/PT
Goodchild, Bioconjug. Chem. 1: 165, 1990. Quando o PIM circular é isolado, ou sintetizado utilizando métodos recombinantes ou químicos, a ligação pode ser formada através de activação química, ou fotoactivação, de um grupo reactivo (p.ex., carbeno, radical) que tenha sido incorporado no antigénio ou outro péptido. Métodos adicionais para a ligação de péptidos e outras moléculas a oligonucleótidos podem ser verificados na Patente U.S. 5391723; Kessler (1992) "Nonradioactive labeling methods for nucleic acids" em Kricka (ed.) "Nonisotopic DNA Probe Techniques", Academic Press; e Geoghegan et al., Bioconjug. Chem. 3: 138-146, 1992.
Um PIM pode estar associado em proximidade com um ou mais antigénios de outros modos. Nalgumas concretizações, um PIM e um antigénio estão associados em proximidade através de encapsulamento. Noutras concretizações, um PIM e um antigénio estão associados em proximidade através de ligação a uma molécula plataforma. Uma "molécula plataforma" (também chamada "plataforma") é uma molécula contendo locais que permitem a ligação do PIM e do antigénio ou antigénios. Noutras concretizações, um PIM e um antigénio estão associados em proximidade através de adsorção numa superfície, de preferência uma partícula transportadora.
Nalgumas concretizações, o presente invento emprega um agente de encapsulamento que pode manter a associação próxima do PIM com o primeiro antigénio até o complexo estar disponível para o alvo (ou composições compreendendo tais agentes de encapsulamento). De preferência, a composição compreendendo PIM, antigénio e agente de encapsulamento está na forma de emulsões adjuvantes de óleo em água, micropartículas e/ou lipossomas. De maior preferência, as emulsões adjuvantes de óleo em água, micropartículas e/ou lipossomas que encapsulam uma molécula imunomoduladora PIM estão na forma de partículas com cerca de 0,04 pm a cerca de 100 pm de tamanho, de preferência qualquer um dos seguintes intervalos: de cerca de 0,1 pm a cerca de 2 0 pm; de cerca de 0,15 pm a cerca de 10 pm; de cerca de 0,05 pm a cerca de 1,00 pm; de cerca de 0,05 pm a cerca de 0,5 pm. 61 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ
Sistemas de dispersão coloidais, tais como microesferas, contas, complexos macromoleculares, nanocápsulas e sistemas baseados em lipidos, tais como emulsões de óleo em água, micelas, micelas mistas e lipossomas podem proporcionar um encapsulamento eficaz de composições contendo PIM. A composição de encapsulamento compreende ainda qualquer um de uma variedade de componentes. Estes incluem, mas não se limitam a, alúmen, lipidos, fosfolipidos, estruturas membranares lipidicas (LMS), polietilenoglicol (PEG) e outros polímeros, tais como polipéptidos, glicopéptidos e polissacáridos.
Polipéptidos adequados para encapsular componentes incluem qualquer um conhecido na especialidade e incluem, mas não se limitam a, proteínas de ligação a ácidos gordos. Os polipéptidos modificados contêm qualquer uma de uma variedade de modificações, incluindo, mas não se limitando a, glicosilação, fosforilação, miristilação, sulfatação e hidroxilação. Tal como aqui se utiliza, um polipéptido adequado é um que protegerá uma composição contendo PIM para conservar a actividade imunomoduladora deste. Exemplos de proteínas de ligação incluem, mas não se limitam a, albuminas tais como albumina de soro bovino (BSA) e albumina de ervilha.
Outros polímeros adequados podem ser qualquer um conhecido na especialidade farmacêutica e incluem, mas não se limitam a, polímeros de ocorrência natural tais como dextranos, hidroxietil-amido e polissacáridos, e polímeros sintéticos. Exemplos de polímeros de ocorrência natural incluem proteínas, glicopéptidos, polissacáridos, dextrano e lipidos. 0 polimero adicional pode ser um polímero sintético. Exemplos de polímeros sintéticos que são adequados para utilizar no presente invento incluem, mas não se limitam a, polialquilglicóis (PAG) tais como PEG, polióis polioxietilados (POP), tais como glicerol polioxietilado (POG), politrimetilenoglicol (PTG), polipropilenoglicol (PPG), poli-hidroxietilmetacrilato, poli(álcool vinílico) (PVA), poli(ácido acrílico), polietiloxazolina, poliacrilamida, polivinilpirrolidona (PVP), poliaminoácidos, poliuretano e polifosfazeno. Os polímeros sintéticos podem também ser lineares ou ramificados, substituídos ou não substituídos, 62 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ homopoliméricos, copolímeros, ou copolimeros de blocos de dois ou mais monómeros sintéticos diferentes.
Os PEG para utilizar no encapsulamento das composições do presente invento são adquiridos em fornecedores de produtos químicos ou sintetizados utilizando técnicas conhecidas dos peritos na especialidade. 0 termo "LMS", tal como aqui se utiliza, significa partículas lipídicas lamelares em que grupos de cabeça polar de um lípido polar são dispostos para fazerem face a uma fase aquosa de uma interface para formar estruturas membranares. Exemplos das LMS incluem lipossomas, micelas, cocleatos (i.e., lipossomas geralmente cilíndricos), microemulsões, vesículas unilamelares, vesículas multilamelares e semelhantes.
Um sistema de dispersão coloidal preferido deste invento é um lipossoma. Em ratinhos imunizados com um antigénio encapsulado em lipossomas, os lipossomas pareceram aumentar uma resposta imunitária de tipo Thl ao antigénio. Aramaki et al., Vaccine 13: 1809-1814, 1995. Tal como aqui se utiliza um "lipossoma" ou "vesícula lipídica" é uma pequena vesícula ligada através de pelo menos uma e possivelmente mais de uma membrana de bicamada lipídica. Os lipossomas são produzidos artificialmente a partir de fosfolípidos, glicolípidos, lípidos, esteróides tais como colesterol, moléculas aparentadas ou uma combinação destes através de qualquer técnica conhecida na especialidade, incluindo mas não se limitando a ultra-sons, extrusão ou remoção de detergente a partir de complexos lipido-detergente. Um lipossoma pode também compreender opcionalmente componentes adicionais, tais como um componente de direccionamento para o tecido. Entende-se que uma "membrana lipídica" ou "bicamada lipídica" não consiste exclusivamente em lípidos, mas pode adicionalmente conter quaisquer outros componentes adequados, incluindo, mas não se limitando a, colesterol e outros esteróides, químicos solúveis em lípidos, proteínas de qualquer comprimento e outras moléculas anfipáticas, desde que a estrutura geral da membrana seja um folha de duas superfícies hidrófilas ensanduichando um núcleo central hidrófobo. Para uma discussão geral da estrutura membranar, ver "The Encyclopedia of Molecular Biology" de J. Kendrew (1994). Para lípidos 63 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ adequados ver p.ex., Lasic (1993) "Lipossomas: from Physics to Applications" Elsevier, Amsterdão.
Os processos para preparação de composições contendo PIM contendo lipossomas são conhecidos na especialidade. As vesículas lipídicas podem ser preparadas através de qualquer técnica conhecida na especialidade. Os métodos incluem, mas não se limitam a, microencapsulamento, microfluidificação, método LLC, injecção de etanol, injecção de fréon, o método da "bolha", diálise de detergente, hidratação, ultra-sons, e evaporação de fase inversa. Revisto em Watwe et al., Curr. Sei. 68: 715-724, 1995. As técnicas podem ser combinadas para proporcionar vesículas com os atributos mais desejáveis. 0 presente invento engloba a utilização de LMS contendo componentes de direccionamento para tecidos ou células. Tais componentes de direccionamento são componentes de uma LMS que aumentam a sua acumulação preferencialmente em certos locais tecidulares ou celulares em relação a outros locais tecidulares ou celulares quando administrados a um animal intacto, órgão ou cultura celular. Um componente de direccionamento é geralmente acessível de fora do lipossoma e está portanto de preferência ligado à superfície externa ou inserido na bicamada lipídica externa. Um componente de direccionamento pode ser inter alia um péptido, uma região de um péptido maior, um anticorpo específico para uma molécula ou marcador da superfície celular, ou um fragmento de ligação ao antigénio deste, um ácido nucleico, um hidrato de carbono, uma região de um hidrato de carbono complexo, um lípido especial, ou uma molécula pequena tal como um fármaco, uma hormona ou um hapteno, ligada a qualquer uma das moléculas acima mencionadas. Anticorpos com especificidade para marcadores da superfície celular específicos do tipo celular são conhecidos na especialidade e são facilmente preparados através de métodos conhecidos na especialidade.
As LMS podem ser direccionadas a qualquer tipo celular contra o qual se pretende dirigir um tratamento terapêutico, p.ex., um tipo celular que possa modular e/ou participar numa resposta imunitária. Tais células e órgãos alvo incluem, mas não se limitam a, APC, tais como macrófagos, células dendríticas e linfócitos , estruturas linfáticas, tais como 64
ΕΡ 1 992 635/PT nódulos linfáticos e o baço, e estruturas não linfáticas, particularmente aquelas nas quais se verificam células dendríticas.
As composições de LMS do presente invento podem compreender adicionalmente tensioactivos. Os tensioactivos podem ser catiónicos, aniónicos, anfifilicos, ou não iónicos. Uma classe preferida de tensioactivos é a dos tensioactivos não iónicos; particularmente preferidos são os que são solúveis em água.
Em concretizações nas quais um PIM e um antigénio estão associados em proximidade através de ligação a uma molécula plataforma, a plataforma pode ser proteinácea ou não proteinácea (i.e., orgânica). Exemplos de plataformas proteináceas incluem, mas não se limitam a, albumina, gamaglobulina, imunoglobulina (IgG) e ovalbumina. Borel et al., Immunol. Methods 126: 159-168, 1990; Dumas et al., Arch. Dematol. Res. 287: 123-128, 1995; Borel et al., Int. Arch. Allergy Immunol. 107: 264-267, 1995; Borel et al. , Ann. N.Y. Acad. Sei. 778: 80-87, 1996. Uma plataforma é multivalente {i.e., contém mais de um local de ligação ou união) para acomodar a ligação a um PIM e um antigénio. Assim, uma plataforma pode conter 2 ou mais, 3 ou mais, 4 ou mais, 5 ou mais, 6 ou mais, 7 ou mais, 8 ou mais, 9 ou mais, 10 ou mais locais de ligação ou união. Outros exemplos de plataformas poliméricas são dextrano, poliacrilamida, Ficoll, carboximetilcelulose, poli (álcool vinilico) e poli-ácido D-glutâmico/D-lisina.
Os princípios de utilização de moléculas plataforma são bem compreendidos na especialidade. Geralmente, uma plataforma contém, ou é derivada para conter, locais de ligação apropriados para o PIM e o antigénio. Adicionalmente, ou alternativamente, o PIM e/ou o antigénio é derivado para proporcionar grupos de ligação apropriados. Por exemplo, uma simples plataforma é um ligante bifuncional (i.e., tem dois locais de ligação), tal como um péptido. Mais exemplos são discutidos abaixo.
As moléculas plataforma podem ser biologicamente estabilizadas, i.e., exibem frequentemente uma semivida de 65 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ excreção in vivo de horas a dias a meses para conferir eficácia terapêutica e são de preferência compostas de uma cadeia simples sintética de composição definida. Têm geralmente um peso molecular no intervalo de cerca de 200 a cerca de 1 000 000, de preferência qualquer um dos seguintes intervalos: de cerca de 200 a cerca de 500 000; de cerca de 200 a cerca de 200 000; de cerca de 200 a cerca de 50 000 (ou menos, tal como 30 000) . Exemplos de moléculas plataforma de valência são polímeros (ou são constituídas por polímeros) tais como polietilenoglicol (PEG; de preferência possuindo um peso molecular de cerca de 200 a cerca de 8000), poli-D-lisina, poli(álcool vinílico), polivinilpirrolidona, ácido D-glutâmico e D-lisina (numa proporção de 3:2) . Outras moléculas que podem ser utilizadas são albumina e IgG.
Outras moléculas plataforma adequadas para utilizar dentro do presente invento são as moléculas plataforma de valência quimicamente definidas, não poliméricas divulgadas na Patente U.S. 5552391. Outras moléculas plataforma de valência quimicamente definidas homogéneas adequadas para utilizar no presente invento são derivadas de 2,2'-etilenodioxidietilamina (EDDA) e trietilenoglicol (TEG).
Moléculas plataforma de valência adequadas adicionais incluem, mas não se limitam a, tetra-aminobenzeno, hepta-aminobetaciclodextrina, tetra-aminopentaeritritol, 1,4,8,11-tetra-azaciclotetradecano (Cyclam) e 1,4,7,10-tetra-azaciclododecano (Cyclen).
Em geral, estas plataformas são feitas através de técnicas de síntese química padrão. O PEG tem de ser derivado e tornado multivalente, o que é conseguido utilizando técnicas padrão. Algumas substâncias adequadas para síntese conjugada, tais como PEG, albumina, e IgG estão comercialmente disponíveis. A conjugação de um PIM e um antigénio com uma molécula plataforma pode ser efectuada de muitos modos, tipicamente envolvendo um ou mais agentes de reticulação e grupos funcionais na plataforma de antigénio e PIM e na molécula plataforma. As plataformas e o PIM e o antigénio têm de ter grupos de ligação apropriados. Os grupos de ligação são 66
ΕΡ 1 992 635/PT adicionados a plataformas utilizando técnicas de síntese química padrão. Os grupos de ligação podem ser adicionados a antigénios polipeptídicos e a PIM utilizando técnicas sintéticas de fase sólida padrão ou técnicas recombinantes. As abordagens recombinantes podem requerer modificação pós-tradução para unir um ligante, e tais métodos são conhecidos na especialidade.
Como exemplo, os polipéptidos contêm porções da cadeia lateral dos aminoácidos contendo grupos funcionais tais como grupos amino, carboxilo ou sulfidrilo que servem como locais para ligação do polipéptido à plataforma. Os resíduos que têm tais grupos funcionais podem ser adicionados ao polipéptido se o polipéptido não contiver já esses grupos. Tais resíduos podem ser incorporados através de técnicas de síntese de fase sólida ou técnicas recombinantes, ambas as quais são bem conhecidas nas artes de síntese peptídica. Quando o polipéptido tem uma ou mais cadeias laterais de hidrato de carbono (ou se o antigénio for um hidrato de carbono), grupos funcionais amino, sulfidrilo e/ou aldeído podem ser incorporados aí através de química convencional. Por exemplo, grupos amino primários podem ser incorporados através de reacção do açúcar oxidado com etilenodiamina na presença de cianoboro-hidreto de sódio, podem ser introduzidos sulfidrilos através de reacção de dicloridrato de cisteamina seguida de redução com um agente redutor de dissulfureto padrão, enquanto grupos aldeído podem ser gerados após oxidação de periodato. De um modo semelhante, a molécula plataforma pode também ser derivada para conter grupos funcionais se não possuir já grupos funcionais apropriados.
Ligantes hidrófilos de comprimentos variáveis são úteis para ligar o PIM e o antigénio a moléculas plataforma. Ligantes adequados incluem oligómeros lineares ou polímeros de etilenoglicol. Tais ligantes incluem ligantes com a fórmula R1S (CH2CH20) nCH2CH20 (CH2) mC02R2 em que n=0-200, m=l ou 2, R1=H ou um grupo protector tal como tritilo, R2=H ou alquilo ou arilo, p.ex., éster de 4-nitrofenilo. Estes ligantes são úteis na ligação de uma molécula contendo um grupo tiol reactivo tal como haloaceílo, maleiamida, etc., através de um tioéter a uma segunda molécula que contenha um grupo amino através de uma ligação amida. Estes ligantes são flexíveis em relação à ordem 67 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ de ligação, i.e., o tioéter pode ser formado primeiro ou no fim.
Em concretizações nas quais um PIM e um antigénio estão associados em proximidade através de adsorção numa superfície, a superfície pode estar na forma de uma partícula transportadora (por exemplo, uma nanopartícula) feita com um núcleo inorgânico ou orgânico. Exemplos de tais nanopartículas incluem, mas não se limitam a, partículas nanocristalinas, nanopartículas feitas através de polimerização de alquilcianoacrilatos e nanopartículas feitas através de polimerização de metilidenomalonato. Superfícies adicionais às quais um PIM e um antigénio podem ser adsorvidos incluem, mas não se limitam a, partículas de carbono activado e nanoplacas cerâmicas de proteínas. Outros exemplos de partículas transportadoras são aqui proporcionados. A adsorção de polinucleótidos e polipéptidos a uma superfície para o fim de entrega das moléculas adsorvidas a células é bem conhecida na especialidade. Ver, por exemplo, Douglas et al., Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier Syst. 3: 233-261, 1987; Hagiwara et al., In Vivo 1: 241-252, 1987; Bousquet et al., Pharm. Res. 16: 141-147, 1999; e Kossovsky et al., Patente U.S. 5460831. De preferência, o material compreendendo a superfície adsorvente é biodegradável. A adsorção de um PIM e/ou um antigénio a uma superfície pode ocorrer através de interacções não covalentes, incluindo interacções iónicas e/ou hidrófobas.
Em geral, as características de transportadores como nanopartículas, tais como carga superficial, tamanho da partícula e peso molecular, dependem das condições de polimerização, concentração do monómero e presença de estabilizantes durante o processo de polimerização (Douglas et al., 1987). A superfície das partículas transportadores pode ser modificada, por exemplo, com um revestimento de superfície, para permitir ou aumentar a adsorção do PIM e/ou do antigénio. As partículas de transportador com PIM e/ou antigénio adsorvidos podem ainda ser revestidas com outras substâncias. A adição de tais outras substâncias pode, por exemplo, prolongar a semivida das partículas uma vez administradas ao sujeito e/ou pode direccionar as partículas 68
ΕΡ 1 992 635/PT para um tipo celular ou tecido especifico, tal como aqui descrito.
Foram descritas superfícies nanocristalinas às quais um PIM e um antigénio podem ser adsorvidos (ver, por exemplo, Patente U.S. 5460831). Partículas centrais nanocristalinas (com diâmetros de 1 μιη ou menos) são revestidas com uma camada de alteração da energia superficial que promove a adsorção de polipéptidos, polinucleótidos e/ou outros agentes farmacêuticos. Tal como descrito na Patente U.S. 5460831, por exemplo, uma partícula central é revestida com uma superfície que promova a adsorção de um oligonucleótido e é subsequentemente revestida com uma preparação de antigénio, por exemplo, na forma de uma mistura lípido-antigénio. Tais nanopartículas são complexos que se montam por si de partículas com um tamanho em nanómetros, tipicamente na ordem de 0,1 pm, que possuem uma camada interna de PIM e uma camada externa de antigénio.
Outra superfície adsorvente são nanopartículas feitas através de polimerização de alquilcianoacrilatos. Os alquilcianoacrilatos podem ser polimerizados em meios aquosos acidificados através de um processo de polimerização aniónica. Dependendo das condições de polimerização, as partículas pequenas tendem a ter tamanhos no intervalo de 20 a 3000 nm, e é possível fazer nanopartículas com características superficiais específicas e com cargas superficiais específicas (Douglas et al., 1987). Por exemplo, oligonucleótidos podem ser adsorvidos a nanopartículas de poli-isobutilcianoacrilato e poli-iso-hexilcianoacrilato na presença de catiões hidrófobos tais como cloreto de tetrafenilfosfónio ou sais de amónia quaternários, tais como brometo de cetiltrimetilamónio. A adsorção de oligonucleótidos nestas nanopartículas parece ser mediada pela formação de pares iónicos entre grupos fosfato com carga negativa da cadeia do ácido nucleico e os catiões hidrófobos. Ver, por exemplo, Lambert et al., Bíochimle 80: 969-976, 1998, Chavany et al. , Pharm. Res. 11: 1370-1378, 1994; Chavany et al., Pharm. Res. 9: 441-449, 1992. Polipéptidos podem também ser adsorvidos a nanopartículas de polialquilcianoacrilato. Ver, por exemplo, Douglas et al. , 1987; Schroeder et al., Peptides 19: 777-780, 1998. 69 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ
Outra superfície adsorvente são nanopartículas feitas através da polimerização de metilideno-malonato. Por exemplo, tal como descrito em Bousquet et al. , 1999, polipéptidos adsorvidos a nanopartículas de poli(metilideno-malonato 2.1.2) parecem fazê-lo inicialmente através de forças electrostáticas seguido de estabilização através de forças hidrófobas.
Complexos PIM/MT
Os PIM podem ser administrados na forma de complexos polinucleótido imunomodulador/microtransportador (PIM/MT). Assim, o presente invento proporciona composições compreendendo complexos PIM/MT.
Os microtransportadores úteis no presente invento têm menos de cerca de 150, 120 ou 100 pm de tamanho, mais vulgarmente menos de cerca de 50-60 pm de tamanho, de preferência menos de cerca de 10 pm de tamanho, e são insolúveis em água pura. Os microtransportadores utilizados no presente invento são de preferência biodegradáveis, embora sejam aceitáveis microtransportadores não biodegradáveis. Os microtransportadores estão vulgarmente em fase sólida, tais como "contas" ou outras partículas, embora microtransportadores de fase líquida tais como emulsões de óleo em água compreendendo polímeros biodegradáveis ou óleos estejam também contemplados. Uma ampla variedade de materiais biodegradáveis e não biodegradáveis aceitáveis para utilizar como microtransportadores é conhecida na especialidade.
Os microtransportadores para utilizar nas composições ou métodos do presente invento têm geralmente menos de cerca de 10 pm de tamanho (p.ex., têm um diâmetro médio de menos de cerca de 10 pm, ou pelo menos cerca 97% das partículas passam através de um filtro de ecrã de 10 pm) , e incluem nanotransportadores (i.e., transportadores com menos de cerca de 1 pm de tamanho) . De preferência, são seleccionados microtransportadores possuindo tamanhos dentro de um limite superior de cerca de 9, 7, 5, 2, ou 1 pm ou 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 250, 200, ou 100 nm e um limite inferior seleccionado independentemente de cerca de 4, 2, ou 1 pm ou cerca de 800, 600, 500, 400, 300, 250, 200, 150, 100, 50, 25, ou 10 nm, onde o limite inferior é menor que o limite 70
ΕΡ 1 992 635/PT superior. Nalgumas concretizações, os microtransportadores têm um tamanho de cerca de 1,0-1,5 pm, cerca de 1,0-2,0 pm ou cerca de 0,9-1,6 pm. Em certas concretizações preferidas, os microtransportadores têm um tamanho de cerca de 10 nm a cerca de 5 pm ou de cerca de 25 nm a cerca de 4,5 pm, de cerca de 1 pm, cerca de 1,2 pm, cerca de 1,4 pm, cerca de 1,5 pm, cerca de 1,6 pm, cerca de 1,8 pm, cerca de 2,0 pm, cerca de 2,5 pm ou cerca de 4,5 pm. Quando os microtransportadores são nanotransportadores, concretizações preferidas incluem nanotransportadores de cerca de 25 a cerca de 300 nm, 50 a cerca de 200 nm, cerca de 50 nm ou cerca de 200 nm.
Microtransportadores biodegradáveis de fase sólida podem ser fabricados a partir de polímeros biodegradáveis incluindo, mas não se limitando a: poliésteres biodegradáveis, tais como poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), e copolímeros (incluindo seus copolímeros de blocos), bem como copolímeros de blocos de poli(ácido láctico) e poli(etilenoglicol); poliortoésteres tais como polímeros baseados em 3,9-dietilideno-2,4,8,10-tetraoxaspiro[5.5]undecano (DETOSU); polianidridos tais como polímeros de poli(anidrido) baseados em monómeros relativamente hidrófilos tais como ácido sebácico; imidas de polianidrido, tais como polímeros de polianidrido baseados em monómeros derivados de ácido sebácico incorporando aminoácidos (i.e., ligados a ácido sebácico por ligações imida através do azoto amino-terminal) tais como glicina ou alanina; ésteres de polianidrido; polifosfazenos, especialmente poli(fosfazenos) que contenham grupos éster sensíveis a hidrólise que possam catalisar a degradação da estrutura polimérica através da criação de grupos ácido carboxílico (Schacht et al., Biotechnol. Bioeng. 1996: 102, 1996); e poliamidas tais como poli(ácido láctico-co-lisina). É também conhecida uma ampla variedade de materiais não biodegradáveis adequados para fabrico de microtransportadores, incluindo, mas não se limitando a poliestireno, polipropileno, polietileno, sílica, cerâmica, poliacrilamida, dextrano, hidroxiapatite, látex, ouro e materiais ferromagnéticos ou paramagnéticos. Certas concretizações excluem ouro, látex e/ou contas magnéticas. Em certas concretizações, os microtransportadores podem ser feitos de um primeiro material 71 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ (p.ex., um material magnético) encapsulado com um segundo material (p.ex., poliestireno).
Microesferas de fase sólida são preparadas utilizando técnicas conhecidas na especialidade. Por exemplo, podem ser preparadas através da técnica de extracção/evaporação de solvente de emulsão. Geralmente, nesta técnica, polímeros biodegradáveis tais como polianidratos, poli(alquil-a-cianoacrilatos) e poli(ésteres de α-hidroxilo), por exemplo, poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), poli(ácido D,L-láctico-co-glicólico) e poli(caprolactona), são dissolvidos num solvente orgânico adequado, tal como cloreto de metileno, para constituir a fase dispersa (FD) da emulsão. A FD é emulsionada através de homogeneização a elevada velocidade num excesso de volume de fase contínua aquosa (FC) que contém um tensioactivo dissolvido, por exemplo, poli(álcool vinílico) (PVA) ou polivinilpirrolidona (PVP) . 0 tensioactivo na FC é para assegurar a formação de gotículas de emulsão discretas e de tamanho adequado. 0 solvente orgânico é então extraído na FC e subsequentemente evaporado subindo a temperatura do sistema. As micropartícuias sólidas são então separadas através de centrifugação ou filtração, e secas, por exemplo, através de liofilização ou aplicação de vácuo, antes de armazenamento a 4°C.
Características físico-químicas tais como o tamanho médio, a distribuição de tamanhos e a carga superficial das microesferas secas podem ser determinadas. As características de tamanho são determinadas, por exemplo, através da técnica de dispersão dinâmica da luz e a carga superficial foi determinada através da medição do potencial zeta.
Microtransportadores de fase líquida incluem lipossomas, micelas, gotículas de óleo e outras partículas baseadas em lípidos ou óleos que incorporem polímeros ou óleos biodegradáveis. Em certas concretizações, o polímero biodegradável é um tensioactivo. Noutras concretizações, os microtransportadores de fase líquida são biodegradáveis devido à inclusão de um óleo biodegradável tal como esqualeno ou um óleo vegetal. Um microtransportador de fase líquida preferido é gotículas de óleo dentro de uma emulsão de óleo em água. De preferência, as emulsões de óleo em água utilizadas como 72 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ microtransportadores compreendem substituintes biodegradáveis tais como esqualeno.
Os complexos PIM/MT compreendem um PIM ligado à superfície de um microtransportador (i.e., o PIM não está encapsulado no MT) , e compreendem de preferência múltiplas moléculas de PIM ligadas a cada microtransportador. Em certas concretizações, uma mistura de diferentes PIM pode ser complexada com um microtransportador, de modo a que o microtransportador fique ligado a mais de uma espécie de PIM. A ligação entre o PIM e o MT pode ser covalente ou não covalente. Tal como será entendido por um perito na especialidade, o PIM pode ser modificado ou derivado e a composição do microtransportador pode ser seleccionada e/ou modificada para acomodar o tipo de ligação desejado para a formação do complexo PIM/MT.
Os complexos PIM/MT ligados covalentemente podem ser ligados utilizando qualquer tecnologia de ligação cruzada conhecida na especialidade. Tipicamente, a porção PIM será modificada, para incorporar uma porção adicional (p.ex., um grupo amina, carboxilo ou sulfidrilo livre) ou incorporar bases nucleotídicas modificadas (p.ex., fosforotioato) para proporcionar um local no qual a porção PIM possa ser ligada ao microtransportador. A ligação entre as porções PIM e MT do complexo pode ser feita na extremidade 3' ou 5' do PIM, ou numa base adequadamente modificada numa posição interna no PIM. 0 microtransportador é também geralmente modificado para incorporar porções através das quais possa ser formada uma ligação covalente, embora possam também ser utilizados grupos funcionais normalmente presentes no microtransportador. 0 PIM/MT é formado através de incubação do PIM com um microtransportador sob condições que permitam a formação de um complexo covalente (p.ex., na presença de um agente de reticulação ou através da utilização de um microtransportador activado compreendendo uma porção activada que formará uma ligação covalente com o PIM). É conhecida na especialidade uma ampla variedade de tecnologias de reticulação que inclui agentes de reticulação reactivos com grupos amino, carboxilo e sulfidrilo. Tal como será aparente a um perito na especialidade, a selecção de um 73 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ agente de reticulação e do protocolo de reticulação dependerá da configuração do PIM e do microtransportador bem como da configuração final desejada do complexo PIM/MT. 0 agente de reticulação pode ser homobifuncional ou heterobifuncional. Quando é utilizado um agente de reticulação homobifuncional, o agente de reticulação explora a mesma porção no PIM e no MT (p.ex., um agente de reticulação de aldeídos pode ser utilizado para ligar covalentemente um PIM e um MT quando ambos compreendem uma ou mais aminas livres) . Os agentes de reticulação heterobifuncionais utilizam diferentes porções no PIM e no MT, (p.ex., um éster de maleimido-N-hidroxissuccinimida pode ser utilizado para ligar covalentemente um sulfidrilo livre no PIM e uma amina livre no MT) , e são preferidos para minimizar a formação de ligações inter-microtransportador. Na maioria dos casos, é preferível reticular através de uma primeira porção de reticulação no microtransportador e uma segunda porção de reticulação no PIM, quando a segunda porção de reticulação não está presente no microtransportador. Um método preferido de produção do complexo PIM/MT é através de "activação" do microtransportador através de incubação com um agente de reticulação heterobifuncional, formando então o complexo PIM/MT através de incubação do PIM e do MT activado sob condições apropriadas para reacção. 0 agente de reticulação pode incorporar um braço "espaçador" entre as porções reactivas ou as duas porções reactivas no agente de reticulação podem ser ligadas directamente.
Numa concretização preferida, a porção PIM compreende pelo menos um sulfidrilo livre (p.ex., proporcionado por uma base ou ligante 5'-tiol modificado) para reticulação com o microtransportador, enquanto o microtransportador compreende grupos amina livres. Um agente de reticulação heterobifuncional reactivo com estes dois grupos (p.ex., um agente de reticulação compreendendo um grupo maleimida e um éster de NHS), tal como succinimidil-4-(N-maleimidometil)ciclo-hexano-l-carboxilato é utilizado para activar o MT, depois ligar covalentemente de forma cruzada o PIM para formar o complexo PIM/MT.
Complexos PIM/MT não covalentes podem ser ligados através de qualquer ligação não covalente ou interacção, incluindo 74 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ ligações iónicas (electrostáticas), interacções hidrófobas, pontes de hidrogénio, atracções de van der Waals ou uma combinação de duas ou mais interacções diferentes, tal como é normalmente o caso quando é utilizado um par de ligação para ligar o PIM e o MC.
Os complexos PIM/MT não covalentes preferidos são tipicamente complexados através de interacções hidrófobas ou electrostáticas (iónicas), ou uma combinação destas, (p.ex., através de emparelhamento de bases entre um PIM e um polinucleótido ligado a um MT utilizando um par de ligação). Devido à natureza hidrófila da estrutura dos polinucleótidos, os complexos PIM/MT que assentam em interacções hidrófobas para formar o complexo requerem geralmente a modificação da porção PIM do complexo para incorporar uma porção altamente hidrófoba. De preferência, a porção hidrófoba é biocompativel, não imunogénica e de ocorrência natural no indivíduo para quem se pretende a composição (p.ex., é verificada em mamíferos, particularmente humanos). Exemplos de porções hidrófobas preferidas incluem lípidos, esteróides, esteróis tais como colesterol e terpenos. 0 método de ligação da porção hidrófoba ao PIM dependerá, claro, da configuração do PIM e da identidade da porção hidrófoba. A porção hidrófoba pode ser adicionada em qualquer local conveniente no PIM, de preferência na extremidade 5' ou 3'; no caso de adição de uma porção colesterol a um PIM, a porção colesterol é de preferência adicionada à extremidade 5' do PIM, utilizando reacções químicas convencionais (ver, por exemplo, Godard et al., Eur. J. Biochem. 232: 404-410, 1995). De preferência, os microtransportadores para utilizar em complexos PIM/MT ligados através de ligação hidrófoba são feitos a partir de materiais hidrófobos, tais como gotículas de óleo ou polímeros hidrófobos, embora possam igualmente ser utilizados materiais hidrófilos modificados para incorporar porções hidrófobas. Quando o microtransportador é um lipossoma ou outro microtransportador de fase líquida compreendendo um lúmen, o complexo PIM/MT é formado através da mistura do PIM com o MT após preparação do MT, para evitar encapsulamento do PIM durante o processo de preparação do MT.
Os complexos PIM/MT não covalentes ligados através de ligação electrostática exploram tipicamente a carga altamente 75
ΕΡ 1 992 635/PT negativa da estrutura do polinucleótido. Assim, os microtransportadores para utilizar em complexos PIM/MT ligados não covalentemente têm geralmente carga positiva (catiónicos) a pH fisiológico (p.ex., pH cerca de 6,8-7,4). 0 microtransportador pode possuir intrinsecamente uma carga positiva, mas os microtransportadores feitos a partir compostos que normalmente não possuem uma carga positiva podem ser derivados ou de outro modo modificados para ficarem com carga positiva (catiónicos). Por exemplo, o polímero utilizado para fazer o microtransportador pode ser derivado para adicionar grupos com carga positiva, tais como aminas primárias. Alternativamente, podem ser incorporados compostos com carga positiva na formulação do microtransportador durante o fabrico (p.ex., podem ser utilizados tensioactivos com carga positiva durante o fabrico de copolímeros de poli(ácido láctico)/poli(ácido glicólico) para conferir uma carga positiva às partículas de microtransportador resultantes).
Tal como aqui descrito, para preparar microesferas catiónicas, são adicionados lípidos ou polímeros catiónicos, por exemplo, 1,2-dioleoil-l,2,3-trimetilamóniopropano (DOTAP), brometo de cetiltrimetilamónio (CTAB) ou polilisina, à FD ou à FC, consoante a sua solubilidade nestas fases.
Tal como aqui descrito, os complexos PIM/MT podem ser formados através de adsorção em microesferas catiónicas através da incubação do polinucleótido e das partículas, de preferência numa mistura aquosa. Tal incubação pode ser realizada sob quaisquer condições desejadas, incluindo temperatura ambiente (p.ex., aproximadamente 20°C) ou sob refrigeração (p.ex., 4°C) . Como as microesferas catiónicas e os polinucleótidos se associam de forma relativamente rápida, a incubação pode ser durante qualquer período de tempo conveniente, tal como 5, 10, 15 minutos ou mais, incluindo incubações de um dia para o outro e mais longas. Por exemplo, os PIM podem ser adsorvidos nas microesferas catiónicas através de incubação aquosa de um dia para o outro do polinucleótido e das partículas a 4°C. No entanto, como as microesferas catiónicas e os polinucleótidos se associam espontaneamente, o complexo PIM/MT pode ser formado através de simples co-administração do polinucleótido com o MT. As microesferas podem ser caracterizadas pelo tamanho e pela 76 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ carga da superfície antes e após associação ao polinucleótido. Lotes seleccionados podem então ser avaliados quanto à actividade contra controlos adequados, por exemplo, em células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC) estabelecidas, tal como aqui descrito, e ensaios de esplenócitos de ratinho. As formulações podem também ser avaliadas em modelos animais adequados.
Complexos PIM/MT não covalentes ligados através de emparelhamento de bases nucleotídicas podem ser produzidos utilizando metodologias convencionais. Geralmente, os complexos PIM/MT com bases emparelhadas são produzidos utilizando um microtransportador compreendendo um polinucleótido ligado, de preferência ligado covalentemente, (o "polinucleótido de captura") que é pelo menos parcialmente complementar ao PIM. 0 segmento de complementaridade entre o PIM e o nucleótido de captura é de preferência de pelo menos 6, 8, 10 ou 15 pares de bases contíguos, de maior preferência pelo menos 20 pares de bases contíguos. O nucleótido de captura pode ser ligado ao MT através de qualquer método conhecido na especialidade e é de preferência ligado covalentemente ao PIM na extremidade 5' ou 3'.
Noutras concretizações, pode ser utilizado um par de ligação para ligar o PIM e o MT num complexo PIM/MT. O par de ligação pode ser um receptor e um ligando, um anticorpo e um antigénio (ou epítopo) ou qualquer outro par de ligação que se ligue com elevada afinidade (p.ex., Kd menor que cerca de 10-8). Um tipo de par de ligação preferido é biotina e estreptavidina ou biotina e avidina, que formam complexos muito apertados. Quando se utiliza um par de ligação para mediar a ligação do complexo PIM/MT, o PIM é derivado, tipicamente através de uma ligação covalente, com um membro do par de ligação e o MT é derivado com o outro membro do par de ligação. A mistura dos dois compostos derivados resulta na formação do complexo PIM/MT.
Muitas concretizações de complexos PIM/MT não incluem um antigénio, e certas concretizações excluem o antigénio ou antigénios associados à doença ou ao distúrbio que é o objecto da terapia com o complexo PIM/MT. Noutras concretizações, o PIM é também ligado a uma ou mais moléculas de antigénio. O 77 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ antigénio pode ser ligado à porção PIM de um complexo PIM/MT numa variedade de modos, incluindo interacções covalentes e/ou não covalentes, tal como descrito, por exemplo, em WO 98/16247. Alternativamente, o antigénio pode ser ligado ao microtransportador. A ligação entre o antigénio e o PIM em complexos PIM/MT compreendendo um antigénio ligado ao PIM pode ser feita através de técnicas aqui descritas e conhecidas na especialidade, incluindo, mas não se limitando a ligação covalente directa, conjugação covalente através de uma porção de reticulação (que pode incluir um braço espaçador), conjugação não covalente através de um par de ligação especifico (p.ex., biotina e avidina) e conjugação não covalente através de interacção electrostática ou hidrófoba.
Complexos de PIM com um agente de condensação catiónico e um agente estabilizante
Os PIM podem ser administrados como uma composição compreendendo um agente de condensação catiónico, um PIM, e um agente estabilizante (i.e., composição CIS) para modulação de uma resposta imunitária no receptor. Ver, Pedido de Patente U.S. 60/402968. Nalgumas concretizações, a composição CIS pode também compreender um antigénio e/ou um ácido gordo.
As composições CIS do presente invento estão tipicamente na forma particulada. Tal como será aparente aos peritos na especialidade, as composições CIS particuladas do presente invento consistirão numa população de partículas de diferentes tamanhos. Devido à sua variabilidade que surge naturalmente, o "tamanho" das partículas nas composições do presente invento pode ser descrito em intervalos ou como um diâmetro máximo ou mínimo. As partículas são consideradas terem um determinado tamanho se pelo menos 95% das partículas (em massa) verificarem a dimensão especificada (p.ex., se pelo menos 97% das partículas tiverem menos de 20 pm de diâmetro, então a composição é considerada como consistindo em partículas de menos de 20 pm de diâmetro). O tamanho das partículas pode ser medido através de qualquer método conveniente conhecido na especialidade, incluindo filtração (p.ex., a utilização de um filtro de "profundidade" para capturar partículas maiores que as do tamanho limite), dispersão dinâmica de luz, microscopia 78 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ electrónica, incluindo ΜΕΤ (particularmente em combinação com processamento de criofractura) e MEV, e semelhantes.
De preferência, as composições CIS do presente invento compreendem partículas que têm menos de cerca de 50 pm de diâmetro, de preferência menos de cerca de 20 pm de diâmetro, embora nalgumas concretizações as partículas terão menos de cerca de 3, 2 ou 1 pm de diâmetro. O intervalo preferido do tamanho de partículas inclui cerca de 0,01 pm a 50 pm, 0,02 a 20 pm, 0,05 a 5 pm, e 0,05 a 3 pm de diâmetro.
Os componentes das composições CIS podem estar presentes em várias quantidades/proporções nas composições, embora esteja contemplado que as quantidades do agente ou agentes estabilizantes e componentes opcionais tais como ácidos gordos e antigénio permanecerão relativamente invariantes, com os agentes estabilizantes a variarem geralmente de cerca de 0,1% a 0,5% (v/v), os ácidos gordos variando de cerca de 0 a 0,5%, e as concentrações de antigénio variando de cerca de 0,1 a cerca de 100 pg/ml, de preferência de cerca de 1 a cerca de 100 pg/ml, de maior preferência de cerca de 10 a 50 pg/ml. As quantidades e proporções do PIM e do agente de condensação catiónico são sujeitas a um maior intervalo de variação nas composições do presente invento. A quantidade do PIM variará até certo ponto em função do peso molecular do PIM e varia geralmente de cerca de 50 pg/ml a cerca de 2 mg/ml, de preferência de cerca de 100 pg/ml a 1 mg/ml. O agente de condensação catiónico está geralmente presente em excesso (em termos de massa) em relação ao PIM, geralmente nas proporções de cerca de 1:2 (PIM:agente de condensação catiónico) a cerca de 1:6, de preferência de cerca de 2:5 a 1:5. O tamanho da partícula nas composições CIS é uma função de várias variáveis. A distribuição de tamanhos das partículas nas composições pode ser modulada através da alteração da proporção de agente de condensação catiónico para PIM. Por exemplo, a alteração da proporção de agente de condensação catiónico para PIM nas composições exemplares de +ISS/Tween 85 a 0,4%/oleato a 0,4%/polimixina B pode alterar o tamanho médio das partículas de cerca de 1,5 pm a agente de condensação catiónico:PIM=1 a cerca de 45 pm a agente de condensação catiónico:PIM=10. 79 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ
Em certas concretizações, as composições CIS compreendem um agente de condensação catiónico, um PIM e um agente estabilizante que é um detergente não iónico. Noutras concretizações, as composições compreendem um lipopéptido catiónico destruidor de membranas (de preferência uma polimixina, de maior preferência polimixina B) , um PIM e um agente estabilizante. Nalgumas concretizações o agente estabilizante não é uma proteína sérica (particularmente não uma proteína sérica bovina). Uma composição exemplar desta classe de concretizações utiliza um detergente de éter de polioxietileno tal como Tween 80 ou Tween 85 como agente estabilizante, com oleato como um agente estabilizante adicional opcional.
Nalgumas concretizações, as composições CIS compreendem partículas imunomoduladoras, em que as partículas são feitas através do processo de combinação de um agente de condensação catiónico, um PIM e um agente de estabilização que é um detergente não iónico. Noutras concretizações, as composições do presente invento compreendem partículas imunomoduladoras, em que as partículas são feitas através do processo de combinação de um lipopéptido catiónico destruidor de membranas (de preferência uma polimixina, de preferência polimixina B), um PIM e um agente estabilizante. Nalgumas concretizações o agente estabilizante não é uma proteína sérica (particularmente não uma proteína sérica bovina).
Nalgumas concretizações, as composições CIS compreendem partículas imunomoduladoras, em que as partículas são formadas através do processo de combinação de um PIM e um agente estabilizante que é um detergente não iónico, formando deste modo uma mistura PIM/agente estabilizante, e combinando um agente de condensação catiónico com a mistura PIM/agente estabilizante. Noutras concretizações, as composições do presente invento compreendem partículas imunomoduladoras, em que as partículas são formadas através do processo de combinação de um PIM com um agente estabilizante, formando deste modo uma mistura PIM/agente estabilizante, e combinando um lipopéptido catiónico destruidor de membranas (de preferência uma polimixina, de maior preferência polimixina B) com a mistura PIM/agente estabilizante. Nalgumas 80 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ concretizações ο agente estabilizante não é uma proteína sérica (particularmente não uma proteína sérica bovina).
Nalgumas concretizações, composições CIS compreendem partículas imunomoduladoras em que as partículas compreendem um agente de condensação catiónico, um PIM e um agente estabilizante que é um detergente não iónico. Noutras concretizações, as composições do presente invento compreendem partículas imunomoduladoras, em que as partículas compreendem um lipopéptido catiónico destruidor de membranas (de preferência uma polimixina, de maior preferência polimixina B) , um PIM e um agente estabilizante. Nalgumas concretizações o agente estabilizante não é uma proteína sérica (particularmente não uma proteína sérica bovina).
Os agentes de condensação catiónicos úteis nas composições CIS e métodos de utilização das composições CIS são moléculas que têm carga positiva a pH fisiológico (i.e., pH de cerca de 7,0 a cerca de 7,5). De preferência, os agentes de condensação catiónicos utilizados no presente invento não são zwiteriónicos e são policatiónicos, isto é, possuindo mais de uma carga positiva por molécula. Agentes de condensação catiónicos úteis no presente invento incluem policatiões hidrófilos ou anfipáticos.
Agentes de condensação catiónicos preferidos incluem: (a) lipopéptidos catiónicos destruidores de membranas incluindo, mas não se limitando a polimixinas incluindo polimixina A, polimixina B (incluindo polimixina Bi e polimixina B2) , polimixina C, polimixina D, polimixina E (também conhecida como colistina), polimixina K, polimixina M, polimixina P, polimixina S e polimixina T, circulinas incluindo circulina A, circulina B, circulina C, circulina D, circulina E e circulina F, octapeptina, anfotericinas incluindo anfotericina B, e péptidos acilados incluindo octanoí1-KFFKFFKFF e acil-KALA (octanoíl - WEAKL AKALAKALAKHLAKALAKALEACEA; (b) péptidos catiónicos destruidores de membranas incluindo, mas não se limitando a nonapéptido polimixina B, cecropinas incluindo cecropina A, cecropina B e cecropina Pl, KFFKFFKFF e KALA (WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA) ; (c) tensioactivos catiónicos de cadeia simples incluindo, mas não se limitando a brometo de cetiltrimetilamónio (CTAB), brometo de benzildimetilamónio 81
ΕΡ 1 992 635/PT (BDAB), CpyrB (brometo de cetilpiridinio), CimB (brometo de cetilimidazólio), e polímeros policatiónicos, incluindo, mas não se limitando a, poli-L-lisina (PLL) e polietilenoimina (PEI) . Em certas concretizações, o agente de condensação catiónico é um lipopéptido catiónico destruidor de membranas, de preferência uma polimixina, de maior preferência polimixina B. Nalgumas concretizações, os agentes de condensação catiónicos podem excluir ésteres de ácidos gordos (i.e., lípidos) e tensioactivos catiónicos de cadeia dupla.
Os agentes estabilizantes úteis nas composições CIS e os métodos de utilização das composições CIS incluem os que podem ser suspensos em água e reduzem a tensão superficial da água, embora sejam preferíveis agentes estabilizantes que sejam solúveis em água e/ou completamente miscíveis em água. Várias classes de agentes estabilizantes são úteis nas composições e métodos do presente invento, incluindo proteínas (de preferência proteínas hidrófilas), detergentes não iónicos, tensioactivos poliméricos (p.ex., poli(álcool vinílico) e polivinilpirrolidona), detergentes catiónicos, detergentes aniónicos e ácidos gordos, embora em certas concretizações proteínas séricas (particularmente proteínas séricas bovinas), ácidos gordos e/ou detergentes iónicos possam ser excluídos da definição de agentes estabilizantes.
Qualquer proteína pode ser utilizada como agente estabilizante de acordo com o presente invento. Nalgumas concretizações, o agente estabilizante é uma proteína que não é pretendida como antigénio (ver discussão abaixo); nestas concretizações, é preferido que a proteína seja derivada da mesma espécie do receptor pretendido da composição (p.ex., se a composição for pretendida para utilização em humanos, é então preferível que a proteína utilizada como agente estabilizante seja uma proteína humana). A albumina sérica é uma proteína exemplar útil como agente estabilizante em tais concretizações. Noutras concretizações, é utilizado um antigénio como agente estabilizante, caso em que o antigénio não necessita de ser, e em general de preferência não é, da mesma espécie que o receptor pretendido. Os antigénios úteis nas composições e métodos do presente invento são aqui divulgados. 82 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ
Detergentes não iónicos úteis nas composições CIS e métodos de utilização das composições CIS incluem glucamidas tais como óxido de decildimetilfosf ina (APO-IO) e óxido de dimetildodecilfosfina (APO-12), octanoí1-N-metilglucamida (MEGA-8), nonanoíl-N-metilglucamida (MEGA-9) e decanoil-N-metilglucamida (MEGA-10) , detergentes de éter de polioxietileno incluindo polioxietileno(10)-dodeciléter (Genapol C100), polioxietileno(4)-lauriléter (BRIJ® 30), polioxietileno(9)-lauriléter (LUBROL® PX) polioxietileno(23)-lauriléter (BRIJ® 35), polioxietileno(2)-cetiléter (BRIJ® 52), polioxietileno(10)-cetiléter (BRIJ® 56), polioxietileno(20)-cetiléter (BRIJ® 58), polioxietileno(2)-esteariléter (BRIJ® 72), polioxietileno(10)-esteariléter (BRIJ® 76), polioxietileno(20)-esteariléter (BRIJ® 78), polioxietileno(100)-esteariléter (BRIJ® 700), polioxietileno(2)-oleiléter (BRIJ® 92), polioxietileno(10)-oleiléter (BRIJ® 97), polioxietileno(20)-oleiléter (BRIJ® 98), isotridecilpoli(etilenoglicoléter)8 (Genapol 80), PLURONIC® F-68, PLURONIC® F-127, dodecilpoli-(etilenoglicoléter)9 (Thesit) polioxietileno(10)-isooctilfenil-éter (TRITON® X-100), polioxietileno(8)-isooctilfeniléter (TRITON® X-114), monolaurato de polietilenoglicol-sorbitano (TWEEN® 20), monopalmitato de polioxietileno-sorbitano (TWEEN® 40), monostearato de polietilenoglicol-sorbitano (TWEEN® 60), triestearato de polioxietileno-sorbitano (TWEEN® 65), monooleato de polietilenoglicol-sorbitano (TWEEN® 80), trioleato de polioxietileno(20)-sorbitano (TWEEN® 85), poloxâmero 188 e polietilenoglicol-p-isooctilfeniléter (Nonidet NP40), detergentes de alquilmaltósido incluindo ciclo-hexil-n-etil-p-D-maltósido, ciclo-hexil-n-hexil-p-D-maltósido e ciclo-hexil-n-metil-p-D-maltósido, n-decanoilsacarose, glucopiranósidos incluindo metil-6-Ο-(N-heptilcarbamoí1)-a-D-glucopiranósido (HECAMEG) e alquilglucopiranósidos tais como n-decil-p-D-glucopiranósido, n-heptil-p-D-glucopiranósido, n-dodecil-p-D-glucopiranósido, η-ηοηίΙ-β-D-glucopiranósido, n-octil-a-D-glucopiranósido, e n-octil-p-D-glucopiranósido, alquiltioglucopiranósidos incluindo n-heptil^-D-tioglucopiranósido, alquilmaltopiranósidos incluindo n-decil^-D-maltopiranósido e n-octil-p-D-maltopiranósido, n-decil-β-D-tiomaltósido, digitonina, n-dodecanoilsacarose, n-dodecil^-D-maltósido, heptano-1,2,3-triol, n-octanoil-β-Ό-glucosilamina (NOGA), n-octanoilsacarose, poloxâmeros (copolimeros de blocos de polioxietileno/polioxipropileno) 83 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ tais como poloxâmero 188 e poloxâmero 407, e sulfobetaínas incluindo SB-10, SB-12, e SB-14 e n-undecil^-D-maltósido.
Agentes estabilizantes preferidos incluem detergentes de éter de polioxietileno, particularmente monooleato de polietilenoglicol sorbitano e trioleato de polioxietileno(20) -sorbitano.
Detergentes aniónicos úteis nas composições CIS e métodos de utilização das composições CIS incluem ácido caprilico e sais deste, ácido quenodesoxicólico e sais deste, ácido eólico e sais deste, ácido decanossulfónico e sais deste, ácido desoxicólico e sais deste, ácido glicodesoxicólico e sais deste, lauroilsarcosina e sais deste, n-dodecilsulfato e sais deste (incluindo sais de sódio e litio) , ácido tauroquenodesoxicólico e sais deste, ácido taurocólico e sais deste, ácido taurodesidrocólico e sais deste, ácido taurodesoxicólico e sais deste, ácido taurolitocólico e sais deste, e ácido tauroursodesoxicólico e sais deste.
Detergentes catiónicos incluem cetilpiridinio e seus sais, cetiltrimetilamónia e seus sais incluindo brometo de cetiltrimetilamónio (CTAB), dodeciltrimetilamónia e seus sais incluindo brometo de dedeciltrimetilamónio, alquilamónio imidazolinas, imidazolinas quaternárias, e tetradeciltrimetilamónia e sais deste incluindo brometo tetradeciltrimetilamónio.
Os detergentes seleccionados para utilizar como agentes estabilizantes são de preferência os que são considerados detergentes emulsionantes de óleo/água. Os detergentes emulsionantes de óleo/água são conhecidos na especialidade e são geralmente caracterizados por um valor de equilíbrio hidrófobo/lipóf ilo (HLB) de cerca de 8 a cerca de 18. De preferência, os detergentes incorporados nas composições particuladas têm valores HLB de cerca de 10 a cerca de 16, de preferência de cerca de 11 a cerca de 15 (p.ex., monooleato de polietilenoglicol sorbitano, HLB=15,4; polioxietileno(10) isooctilfeniléter, HLB=13,5; trioleato de polioxietileno(20) sorbitano HLB=11).
Em certas concretizações, as composições CIS podem também incluir um ou mais ácidos gordos, ou um sal destes, como 84 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ componente adicional. Nessas concretizações empregando um ácido gordo como componente agente estabilizante e um ácido gordo como componente adicional da composição, o ácido gordo utilizado como agente estabilizante será diferente do ácido gordo utilizado como componente "adicional". Os ácidos gordos úteis nas composições CIS do presente invento podem variar no tamanho de guatro a 30 átomos de carbono e podem ser insaturados (p.ex., ácido esteárico), mono-insaturados (p.ex., ácido oleico) ou polinsaturados (p.ex., ácido linoleico), embora sejam geralmente preferidos ácidos gordos mono-insaturados e polinsaturados.
Nalgumas concretizações, as composições CIS incorporarão um ácido gordo possuindo um comprimento da cadeia de carbono de pelo menos cerca de 4, 5, 6, 8, 10, 15, 18, ou 20 átomos de carbono e menos de cerca de 30, 25, 20, 19, 15 ou 10 átomos de carbono. Assim, nalgumas concretizações os ácidos gordos utilizados no presente invento podem ter cadeias de carbono com um comprimento no intervalo de cerca de 4 a 30, 5 a 25, 10 a 20, ou 15 a 20 átomos de carbono.
Os ácidos gordos úteis nas composições CIS incluem, mas não se limitam a, ácido araquidónico, ácido decanóico, ácido docosanóico, ácido docosa-hexanóico, ácido eicosanóico, ácido heneicosanóico, ácido heptadecanóico, ácido heptanóico, ácido hexanóico, ácido láurico, ácido linoleico, ácido linolénico, ácido mirístico, ácido nonadecanóico, ácido nonanóico, ácido octanóico, ácido oleico, ácido palmitico, ácido pentadecanóico, ácido esteárico, ácido tetracosanóico, ácido tricosanóico, ácido tridecanóico e ácido undecanóico. Ácidos gordos preferidos para utilizar nas composições CIS incluem ácido oleico, ácido palmitoleico e ácido linoleico.
Em certas concretizações do presente invento, um antigénio é incorporado na composição CIS ou administrado em combinação com uma composição CIS. As composições CIS que incorporam um antigénio podem incorporar o antigénio na própria composição particulada, ou serem dissolvidas ou suspensas na solução na qual a composição particulada é suspensa. Qualquer antigénio pode ser incorporado ou co-administrado com uma composição CIS do presente invento. 85
ΕΡ 1 992 635/PT Métodos do Invento
Tal como aqui descrito, os PIM do presente invento podem estimular particularmente a produção de IL-6, TNF-a, IFN-γ e de interferões de tipo I, incluindo IFN-a e IFN-ω, estimular a proliferação de células B e/ou activar células dendriticas plasmacitóides para se diferenciarem. Os PIM do presente invento podem também estimular a produção de outras citocinas, quimiocinas e proteínas associadas a activação incluindo, mas não se limitando a, IP-10 (proteína de 10 kDa induzida por interferão), MCP-1 (proteína 1 quimioatraente de monócitos), MCP-2, MCP-3, MIG, MIP-3b, CD80, CD86, CD40, CD54 e MHC de classe II. Os PIM do presente invento podem também estimular a expressão de genes indutíveis por IFN-a incluindo, mas não se limitando a 2,5-oligoadenilato-sintetase (2,5-OAS), gene-54K de estimulação por interferão (ISG-54K) e proteína 1 de ligação a guanilato (GBP-1). Os polinucleótidos imunomoduladores do presente invento podem também proporcionar um sinal que retarde a apoptose de células dendriticas plasmacitóides. Os polinucleótidos imunomoduladores do presente invento podem também estimular a actividade lítica de células assassinas naturais (NK) . Assim, os PIM do presente invento são particularmente eficazes na modulação de uma resposta imunitária num indivíduo. O presente invento refere-se à modulação de uma resposta imunitária num indivíduo, de preferência um mamífero, de maior preferência um humano, através da administração ao indivíduo de um PIM do presente invento. A imunomodulação pode incluir estimulação de uma resposta imunitária de tipo Thl e/ou inibição ou redução de uma resposta imunitária de tipo Th2. O PIM é administrado numa quantidade suficiente para modular uma resposta imunitária. Tal como aqui descrito, a modulação de uma resposta imunitária pode ser humoral e/ou celular, e é medida utilizando técnicas padrão na especialidade e tal como aqui descrito.
Por exemplo, a modulação de uma resposta imunitária de um animal ou população de células, p.ex., de mamífero, opcionalmente células sanguíneas humanas (p.ex., PBMC, linfócitos, células dendriticas), células de lavagem broncoalveolar ou outras células ou populações celulares 86 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ contendo células que respondem a ISS, é alcançada através do contacto das células com um PIM ou composição contendo PIM aqui descrita (p.ex., uma composição contendo um PIM, um PIM e um antigénio, um conjugado PIM-antigénio, um complexo PIM/microtransportador, etc.)· A modulação pode ser alcançada através de qualquer forma de contacto, incluindo sem limitação, co-incubação de células com o PIM in vitro, aplicação do PIM na pele de um mamífero (p.ex., de um animal experimental), e administração parentérica.
Uma resposta imunitária em animais ou populações celulares pode ser detectada através de vários modos, incluindo maior expressão de um ou mais de IFN-γ, IFN-α, IL-2, IL-12, TNF-a, IL-6, IL-4, IL-5, IP-10, ISG-54K, MCP-1, ou uma alteração nas caracteristicas do perfil de expressão génica da estimulação imunitária bem como respostas tais como proliferação de células B e maturação de células dendriticas. A capacidade para estimular uma resposta imunitária numa população celular tem várias utilizações, p.ex., num sistema de ensaio para agentes imunossupressores. Vários indivíduos são adequados para receber o polinucleótido ou polinucleótidos imunomoduladores aqui descritos. De preferência, mas não necessariamente, o indivíduo é humano.
Em certas concretizações, o indivíduo sofre de um distúrbio associado a uma resposta imunitária de tipo Th2, tal como alergias ou asma induzida por alergia. A administração de um PIM resulta em imunomodulação, maiores níveis de uma ou mais citocinas associadas a respostas de tipo Thl, que podem resultar numa redução das caracteristicas da resposta de tipo Th2 associadas à resposta do indivíduo ao alergénio. A imunomodulação de indivíduos com distúrbios associados a respostas de tipo Th2 resulta numa redução ou melhoria de um ou mais dos sintomas do distúrbio. Quando o distúrbio é alergia ou asma induzida por alergia, a melhoria de um ou mais dos sintomas inclui uma redução de um ou mais dos seguintes: rinite, conjuntivite alérgica, níveis de IgE em circulação, níveis de histamina em circulação e/ou necessidade de terapia "SOS" por inalador (p.ex., albuterol inalado administrado através de inalador ou nebulizador de dose calibrada). 87 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ
Noutras concretizações, ο indivíduo sujeito à terapia imunomoduladora do presente invento é um indivíduo que recebe uma vacina. A vacina pode ser uma vacina profilática ou uma vacina terapêutica. Uma vacina profilática compreende um ou mais epítopos associados a um distúrbio para o qual o indivíduo pode estar em risco (p.ex., antigénios de M. tuberculosís como vacina para prevenção de tuberculose). As vacinas terapêuticas compreendem um ou mais epítopos associados a um determinado distúrbio que afecte o indivíduo, tal como antigénios superficiais de M. tuberculosís ou M. bovis em pacientes de tuberculose, antigénios para os quais o indivíduo é alérgico (í.e., terapia de dessensibilização da alergia) em indivíduos sujeitos a alergias, células tumorais de um indivíduo com cancro (p.ex., tal como descrito na Patente U.S. 5484596), ou antigénios associados a tumores em pacientes de cancro. 0 PIM pode ser dado em conjunto com a vacina (p.ex., na mesma injecção ou numa injecção contemporânea, mas separada) ou o PIM pode ser administrado separadamente (p.ex., pelo menos 12 horas antes ou depois da administração da vacina). Em certas concretizações, o antigénio ou antigénios da vacina fazem parte do PIM, através de ligação covalente ou não covalente ao PIM. Noutras concretizações, o PIM pode ser administrado sozinho ou como uma vacina profilática para aumentar a resistência a infecção por uma ampla variedade de patogénios bacterianos ou virais, incluindo organismos naturais ou geneticamente modificados empregues como agentes de guerra biológica ou terrorismo. A administração de terapia de polinucleótidos imunomoduladores a um indivíduo recebendo uma vacina resulta numa resposta imunitária à vacina que muda para uma resposta de tipo Thl em comparação com indivíduos que recebam a vacina sem PIM. A mudança para uma resposta de tipo Thl pode ser reconhecida através de uma resposta de hipersensibilidade de tipo retardado (DTH) ao antigénio ou antigénios da vacina, aumento de IFN-γ e outras citocinas associadas a respostas de tipo Thl, produção de CTL específicos para o antigénio ou antigénios da vacina, níveis baixos ou reduzidos de IgE específica para o antigénio ou antigénios da vacina, uma redução nos anticorpos associados a Th2 específicos para o antigénio ou antigénios da vacina, e/ou 88 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ um aumento nos anticorpos associados a Thl específicos para o antigénio ou antigénios da vacina. No caso de vacinas terapêuticas, a administração do PIM e da vacina resulta em melhoria de um ou mais sintomas do distúrbio que se pretende que a vacina trate. Tal como será aparente a um perito na especialidade, o sintoma ou sintomas exactos e o modo da sua melhoria dependerá do distúrbio que se pretende tratar. Por exemplo, quando a vacina terapêutica é para tuberculose, o tratamento de PIM com vacina resulta em reduzida tosse, dor pleural ou da parede do tórax, febre e/ou outros sintomas conhecidos na especialidade. Quando a vacina é um alergénio utilizado em terapia de dessensibilização de alergia, o tratamento resulta numa redução nos sintomas de alergia (p.ex., redução em rinite, conjuntivite alérgica, níveis de IgE em circulação, e/ou níveis de histamina em circulação).
Outras concretizações do presente invento referem-se a terapia imunomoduladora de indivíduos possuindo uma doença ou distúrbio preexistente, tal como cancro ou uma doença infecciosa. 0 cancro é um alvo atractivo para imunomodulação porque a maioria dos cancros expressa antigénios associados a tumores e/ou específicos de tumores que não se verificam noutras células do corpo. A estimulação de um resposta de tipo Thl contra células tumorais resulta em matança directa e/ou intermediária de células tumorais pelo sistema imunitário, conduzindo a uma redução nas células de cancro e/ou uma redução nos sintomas. A administração de um PIM a um indivíduo possuindo cancro resulta em estimulação de uma resposta imunitária de tipo Thl contra as células tumorais. Uma tal resposta imunitária pode matar células tumorais, através de acção directa de células do sistema imunitário celular (p.ex., CTL, células NK) ou componentes do sistema imunitário humoral, ou através de efeitos intermediários em células próximas de células alvo do sistema imunitário. Ver, por exemplo, Cho et al., Nat. Biotechnol. 18: 509-514, 2000. No contexto de cancro, a administração de PIM pode ainda compreender a administração de um ou mais agentes terapêuticos adicionais tais como, por exemplo, anticorpos antitumorais, regímenes de quimioterapia e/ou tratamento de radiação. Os anticorpos antitumorais, incluindo, mas não se limitando a fragmentos de anticorpos antitumorais e/ou derivados destes, e anticorpos antitumorais monoclonais, fragmentos e/ou derivados destes, 89 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ são conhecidos na especialidade tal como a administração de tais reagentes anticorpos em terapia do cancro (p.ex., Rituxan® (rituximab); Herceptin® (trastuzumab)) . A administração de um ou mais agentes terapêuticos adicionais pode ocorrer antes, após e/ou concorrente com a administração dos PIM. A terapia imunomoduladora de acordo com o presente invento é também útil para indivíduos com doenças infecciosas, particularmente doenças infecciosas que sejam resistentes a respostas imunitárias humorais (p.ex., doenças causadas por infecções micobacterianas e patogénios intracelulares). A terapia imunomoduladora pode ser utilizada para o tratamento de doenças infecciosas causadas por patogénios celulares (p.ex., bactérias ou protozoários) ou através de patogénios subcelulares (p.ex., virus). A terapia de PIM pode ser administrada a indivíduos sofrendo de doenças micobacterianas tais como tuberculose (p.ex., infecções de M. tuberculosis e/ou M. bovis) , lepra (i.e., infecções de M. leprae), ou infecções de M. marinum ou M. ulcerans. A terapia de PIM é também útil para o tratamento de infecções virais, incluindo infecções por vírus influenza, vírus sincicial respiratório (RSV), vírus da hepatite B, vírus da hepatite C, herpesvírus, particularmente vírus de herpes simplex, e vírus de papiloma. As doenças causadas por parasitas intracelulares tais como malária (p.ex., infecção por Plasmodium vivax, P. ovale, P. falciparum e/ou P. malariae), leishmaniose (p.ex., infecção por Leishmania donovani, L. tropica, L. mexicana, L. braziliensis, L. peruviana, L. infantum, L. chagasi, e/ou L. aethiopica), e toxoplasmose {i.e., infecção por Toxoplasmosis gondii) também beneficiam de terapia de PIM. A terapia de PIM é também útil para tratamento de doenças parasitárias tais como esquistossomíase (i.e., infecção por platelmintas sanguíneos do género Schistosoma tais como S. haematobium, S. mansoni, S. japonicum, e S. mekongi) e clonorquíase {i.e., infecção por Clonorchis sinensis). A administração de um PIM a um indivíduo sofrendo de uma doença infecciosa resulta numa melhoria dos sintomas da doença infecciosa. Nalgumas concretizações, a doença infecciosa não é uma doença virai. 90
ΕΡ 1 992 635/PT Ο presente invento refere-se ainda ao aumento ou estimulação de pelo menos uma citocina associada a Thl num indivíduo, incluindo IL-2, IL-12, TNF-β, IFN-γ e IFN-oí. Em certas concretizações, o presente invento refere-se a aumento ou estimulação de IFN-γ num indivíduo, particularmente num indivíduo necessitado de maiores níveis de IFN-γ, através de administração de uma quantidade eficaz de um PIM ao indivíduo para que seja aumentado o IFN-γ. Os indivíduos necessitados de maior IFN-γ são os que possuem distúrbios que geralmente respondem à administração de IFN-γ. Tais distúrbios incluem vários distúrbios inflamatórios incluindo, mas não se limitando a, colite ulcerosa. Tais distúrbios incluem também vários distúrbios fibróticos, incluindo, mas não se limitando a, fibrose pulmonar idiopática (FPI), esclerodermia, fibrose induzida por radiação cutânea, fibrose hepática incluindo fibrose hepática induzida por esquistossomíase, fibrose renal bem como outras condições que podem ser melhoradas através da administração de IFN-γ. A administração de PIM de acordo com o presente invento resulta num aumento nos níveis de IFN-γ, e resulta na melhoria de um ou mais sintomas, estabilização de um ou mais sintomas, e/ou prevenção ou retardamento da progressão (p.ex., redução ou eliminação de lesões ou sintomas adicionais) do distúrbio que responde a IFN-γ. O presente invento pode ser praticado em combinação com outras terapias que constituam o padrão dos cuidados para o distúrbio, tais como a administração de agentes anti-inflamatórios como terapia sistémica de corticosteróides (p.ex., cortisona) em FPI.
Em certas concretizações, o presente invento refere-se a aumento do interferão de tipo I, incluindo IFN-oí, IFN-β e IFN-ω, num indivíduo, particularmente num indivíduo necessitado de maiores níveis de interferão de tipo I, através de administração de uma quantidade eficaz de um PIM ao indivíduo para que os níveis de interferão de tipo I sejam aumentados. Em certas concretizações, o presente invento refere-se a aumento de IFN-oí num indivíduo, particularmente num indivíduo necessitado de maiores níveis de IFN-oí, através de administração de uma quantidade eficaz de um PIM ao indivíduo para que sejam aumentados os níveis de IFN-oí. Os indivíduos necessitados de IFN-oí aumentado são os que possuem 91
ΕΡ 1 992 635/PT distúrbios que geralmente respondem à administração de IFN-a, incluindo IFN-α recombinante, incluindo, mas não se limitando a, infecções virais e cancro. Nalgumas concretizações em que se deseja produção de niveis maiores de IFN-α, o PIM contém pelo menos uma sequência palindrómica com pelo menos os seguintes comprimentos (em bases): 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 ou 30, e, nalgumas concretizações, o PIM contém pelo menos uma sequência palindrómica com um comprimento superior a 30 bases. A administração do PIM de acordo com o presente invento resulta num aumento nos niveis de IFN-oí, e resulta na melhoria de um ou mais sintomas, estabilização de um ou mais sintomas, e/ou prevenção ou atraso da progressão (p.ex., redução ou eliminação de lesões ou sintomas adicionais) do distúrbio que responde a IFN-α. Os métodos do presente invento podem ser praticados em combinação com outras terapias que constituam o padrão dos cuidados para o distúrbio, tais como administração de agentes antivirais para infecções virais.
Também, o presente invento refere-se à redução de niveis, particularmente niveis séricos, de IgE num indivíduo possuindo um distúrbio relacionado com IgE através da administração de uma quantidade eficaz de um PIM ao indivíduo. Em tais concretizações, o polinucleótido imunomodulador pode ser administrado sozinho (p.ex., sem antigénio) ou administrado com antigénio, tal como um alergénio. A redução em IgE resulta numa melhoria de um ou mais sintomas do distúrbio relacionado com IgE. Tais sintomas incluem sintomas de alergia tais como rinite, conjuntivite, em menor sensibilidade a alergénios, uma redução nos sintomas de alergia num indivíduo com alergias, ou uma redução na gravidade de uma resposta alérgica. Assim, o presente invento também se refere a tratamento de uma condição alérgica num indivíduo. Nalgumas concretizações, o tratamento de uma condição alérgica inclui a administração do polinucleótido imunomodulador com uma determinada quantidade ou dose de antigénio. Com a administração de qualquer antigénio adicional, a quantidade ou dose de antigénio administrada pode permanecer a mesma, pode diminuir ou pode aumentar (tal como em terapia convencional de dessensibilização) ao longo do curso do tratamento. 92 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ
Nalgumas concretizações, ο presente invento refere-se a estimulação da produção de CTL num indivíduo, particularmente num indivíduo necessitado de maior número e/ou actividade de CTL, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de um PIM ao indivíduo para que a produção de CTL seja aumentada. Os indivíduos a necessitar de maior produção de CTL são os que possuem distúrbios que geralmente respondem à actividade de CTL. Tais distúrbios incluem, mas não se limitam a, cancro e infecções intracelulares. A administração de PIM de acordo com o presente invento resulta num aumento dos níveis de CTL, e resulta na melhoria de um ou mais sintomas, estabilização de um ou mais sintomas, e/ou prevenção ou retardamento da progressão (p.ex., redução ou eliminação de lesões ou sintomas adicionais) do distúrbio que responde a actividade de CTL presente. 0 presente invento inclui quaisquer concretizações aqui descritas, tais como a administração de PIM na forma de complexo polinucleótido imunomodulador/microtransportador (com ou sem antigénio, ou com ou sem antigénio durante um curso de administrações), ou em íntima associação com um antigénio.
Tal como será aparente a um perito na especialidade, o presente invento pode ser praticado em combinação com outras terapias para a indicação particular para a qual o PIM é administrado. Por exemplo, a terapia de PIM pode ser administrada em conjunto com fármacos anti-malária tais como cloroquina para pacientes de malária, em conjunto com fármacos leishmanicidas tais como pentamidina e/ou alopurinol para pacientes de leishmaniose, em conjunto com fármacos anti-micobacterianos tais como isoniazida, rifampina e/ou etambutol em pacientes de tuberculose, ou em conjunto com terapia de dessensibilização a alergénios para pacientes atópicos (alergia).
Tal como aqui descrito, a administração de PIM pode ainda compreender a administração de um ou mais agentes imunoterapêuticos adicionais (i.e., um agente que actue através do sistema imunitário e/ou seja derivado do sistema imunitário) incluindo, mas não se limitando a, citocina, adjuvantes e anticorpos (incluindo, mas não se limitando a, fragmentos e/ou derivados de anticorpos e anticorpos 93
ΕΡ 1 992 635/PT monoclonais, fragmentos e/ou derivados destes). Exemplos de anticorpos terapêuticos incluem os utilizados no contexto de cancro (p.ex., anticorpos antitumorais). A administração de tais agentes imunoterapêuticos adicionais aplica-se a todos os métodos aqui descritos.
Um PIM pode também ser administrado em conjunto com um adjuvante. A administração de um antigénio com um PIM e um adjuvante conduz a uma potenciação de uma resposta imunitária a um antigénio e assim, pode resultar numa maior resposta imunitária em comparação com a que resulta de uma composição compreendendo o PIM e o antigénio sozinhos. Os adjuvantes são conhecidos na especialidade e incluem, mas não se limitam a, emulsões de óleo em água, emulsões de água em óleo, alúmen (sais de alumínio), lipossomas e micropartículas, incluindo mas não se limitando a, poliestireno, amido, polifosfazeno e polilactida/poliglicósidos. Outros adjuvantes adequados incluem também, mas não se limitam a, MF59, DETOX™ (Ribi), misturas de esqualeno (SAF-1), péptido de muramilo, derivados de saponina, preparações de parede celular de micobactérias, monofosforil-lípido A, derivados de ácido micólico, tensioactivos não iónicos de copolímeros de blocos, Quil A, subunidade B da toxina da cólera, polifosfazeno e derivados, e complexos imunoestimuladores (ISCOM) tais como os descritos por Takahashi et al., Nature 344: 873-875, 1990, bem como adjuvantes baseados em lípidos e outros aqui descritos. Para utilização veterinária e para produção de anticorpos em animais, podem ser utilizados componentes mitogénicos do adjuvante de Freund (completo e incompleto).
Administração e avaliação da resposta imunitária O PIM pode ser administrado em combinação com outros agentes farmacêuticos e/ou imunogénicos e/ou imunoestimuladores, tal como aqui descrito, e pode ser combinado com um transportador fisiologicamente aceitável destes (e como tal o presente invento inclui estas composições). O PIM pode ser qualquer um dos aqui descritos.
Assim, o PIM pode ser administrado em conjunto com outros agentes imunoterapêuticos incluindo, mas não se limitando a, citocina, adjuvantes e anticorpos. 94
ΕΡ 1 992 635/PT
Tal como com todas as composições imunogénicas, as quantidades imunologicamente eficazes e o método de administração da formulação do PIM particular podem variar com base no indivíduo, de qual a condição a tratar e doutros factores evidentes a um perito na especialidade. Os factores a considerar incluem a antigenicidade do antigénio se administrado, de se o PIM será ou não administrado com ou covalentemente unido a uma molécula de entrega adjuvante e/ou um antigénio, a via de administração e o número de doses de imunização a administrar. Tais factores são conhecidos na especialidade e está bem dentro da perícia na especialidade fazer tais determinações sem demasiada experimentação. Um intervalo de dosagem adequado é um que proporcione a modulação desejada da resposta imunitária (p.ex., estimulação de IFN-a e/ou IFN-γ). Quando é desejada uma resposta imunitária a um antigénio, um intervalo de dosagem adequado é um que proporcione a modulação desejada da resposta imunitária ao antigénio. Geralmente, a dosagem é determinada através da quantidade de PIM administrada ao paciente, em vez da quantidade global de composição contendo PIM administrada. Intervalos de dosagem úteis de PIM, dados em quantidades de PIM entregues, podem ser, por exemplo, cerca de qualquer um dos seguintes: 1 a 500 pg/kg, 100 a 400 pg/kg, 200 a 300 pg/kg, 1 a 100 pg/kg, 100 a 200 pg/kg, 300 a 400 pg/kg, 400 a 500 pg/kg. A quantidade absoluta dada a cada paciente depende de propriedades farmacológicas tais como biodisponibilidade, taxa de eliminação e via de administração. A quantidade eficaz e o método de administração da formulação de PIM particular podem variar com base em cada paciente, no resultado desejado e/ou no tipo de distúrbio, no estádio da doença e noutros factores evidentes a um perito na especialidade. A via ou vias de administração úteis numa determinada aplicação são aparentes a um perito na especialidade. As vias de administração incluem mas não se limitam a tópica, dérmica, transdérmica, transmucosa, epidérmica; parentérica, gastrointestinal, e nasofaríngica e pulmonar, incluindo transbrônquica e transalveolar. Um intervalo de dosagem adequado é um que proporcione suficiente composição contendo PIM para se obter uma concentração tecidual de cerca de 1-10 pM medidos através dos níveis sanguíneos. A quantidade absoluta dada a cada paciente depende 95
ΕΡ 1 992 635/PT de propriedades farmacológicas tais como biodisponibilidade, taxa de eliminação e via de administração.
Tal como aqui descrito, APC e tecidos com elevada concentração de APC são alvos preferidos para o PIM. Assim, a administração de PIM a pele e/ou mucosa de mamífero, onde as APC estão presentes em concentração relativamente elevada, é preferida. 0 presente invento proporciona formulações de PIM adequadas para aplicação tópica incluindo, mas não se limitando a, implantes, unguentos, cremes, enxagúes e géis fisiologicamente aceitáveis. A administração tópica é, por exemplo, através de um penso ou ligadura possuindo disperso nele um sistema de entrega, através de administração directa de um sistema de entrega em incisões ou feridas abertas, ou através de dispositivo de administração transdérmica dirigido a um local de interesse. Os cremes, enxagúes, géis e unguentos possuindo disperso neles um PIM são adequados para utilizar como unguentos tópicos ou agentes de preenchimento de feridas.
As vias preferidas de administração dérmica são as que forem menos invasivas. Entres estes os meios preferidos são a transmissão transdérmica, a administração epidérmica e a injecção subcutânea. Destes meios, a administração epidérmica é preferida para as maiores concentrações de APC que se espera estarem no tecido intradérmico. A administração transdérmica é alcançada através de aplicação de um creme, enxagúe, gel, etc. capaz de permitir que o PIM penetre na pele e entre na corrente sanguínea. Composições adequadas para administração transdérmica incluem, mas não se limitam a, suspensões, óleos, cremes e unguentos farmaceuticamente aceitáveis aplicados directamente na pele ou incorporados num transportador protector tal como um dispositivo transdérmico (designado "penso"). Exemplos de cremes, unguentos, etc. adequados podem ser verificados, por exemplo, em "Physician's Desk Reference".
Para transmissão transdérmica, a iontoforese é um método adequado. A transmissão iontoforética pode ser alcançada utilizando pensos comercialmente disponíveis que entregam o 96
ΕΡ 1 992 635/PT seu produto continuamente através da pele intacta durante períodos de vários dias ou mais. A utilização deste método permite a transmissão controlada de composições farmacêuticas em concentrações relativamente grandes, permite a infusão de fármacos de combinação e permite a utilização contemporânea de um promotor da absorção.
Um produto penso exemplar para utilizar neste método é o produto com a marca registada LECTRO PATCH de General Medicai Company de Los Angeles, CA. Este produto mantém electronicamente eléctrodos reservatório a pH neutro e pode ser adaptado para proporcionar dosagens de concentrações diferentes, para dosear continuamente e/ou periodicamente. A preparação e utilização do penso devem ser efectuadas de acordo com as instruções impressas pelo fabricante que acompanham o produto LECTRO PATCH; essas instruções são aqui incorporadas por esta referência. Outros sistemas de penso oclusivo são também adequados.
Para transmissão transdérmica, a entrega ultra-sónica de baixa frequência é também um método adequado. Mitragotri et ai., Science 269: 850-853, 1995. A aplicação de frequências ultra-sónicas de baixa frequência (cerca de 1 MHz) permite a entrega geral controlada das composições terapêuticas, incluindo as de peso molecular elevado. A administração epidérmica envolve essencialmente irritação mecânica ou química da camada mais externa da epiderme o suficiente para provocar uma resposta imunitária ao irritante. Especificamente, a irritação deve ser suficiente para atrair APC ao local de irritação.
Um meio irritante mecânico exemplar emprega uma multiplicidade de dentes curtos de diâmetro muito estreito que podem ser utilizados para irritar a pele e atrair APC ao local de irritação, para tomar um PIM transferido desde a extremidade dos dentes. Por exemplo, o teste da tuberculina velha MONO-VACC fabricado por Pasteur Merieux de Lyon, França contém um dispositivo adequado para a introdução de composições contendo PIM. 97 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ Ο dispositivo (que é distribuído nos EUA por Connaught Laboratories, Inc. de Swiftwater, PA) consiste num recipiente de plástico possuindo um êmbolo de seringa numa extremidade e um disco de dentes na outra. 0 disco de dentes suporta uma multiplicidade de dentes de diâmetro estreito com um comprimento que arranhará apenas a camada mais externa de células epidérmicas. Cada um dos dentes no estojo de MONO-VACC é revestido com tuberculina velha; no presente invento, cada agulha é revestida com uma composição farmacêutica de formulação de PIM. A utilização do dispositivo é de preferência de acordo com as instruções escritas do fabricante incluídas com o produto dispositivo. Dispositivos semelhantes que também podem ser utilizados nesta concretização são os que são actualmente utilizados para efectuar testes de alergias.
Outra abordagem adequada à administração epidérmica de PIM é através da utilização de um químico que irrite as células mais exteriores da epiderme, provocando assim uma resposta imunitária suficiente para atrair APC à área. Um exemplo é um agente queratinolítico, tal como o ácido salicílico utilizado no creme depilatório tópico comercialmente disponível vendido por Noxema Corporation com a marca NAIR. Esta abordagem pode também ser utilizada para alcançar administração epitelial na mucosa. 0 irritante químico pode também ser aplicado em conjunto com o irritante mecânico (tal como por exemplo ocorreria se o dente tipo MONO-VACC fosse também revestido com o irritante químico). 0 PIM pode ser suspenso num transportador que também contenha o irritante químico ou co-administrado com ele.
As vias parentéricas de administração incluem mas não se limitam a injecção eléctrica (iontoforese) ou directa tal como injecção directa numa linha venosa central, injecção intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intradérmica ou subcutânea. As formulações de PIM adequadas para administração parentérica são geralmente formuladas em água pura ou água para injecção e podem compreender ainda tampões de pH, sais, agentes de volume, conservantes e outros excipientes farmaceuticamente aceitáveis. 0 polinucleótido imunomodulador para injecção parentérica pode ser formulado em soluções isotónicas estéreis farmaceuticamente aceitáveis tais como 98 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ solução salina e solução salina tamponada com fosfato para inj ecção.
Vias gastrointestinais de administração incluem, mas não se limitam a, ingestão e rectal. 0 presente invento inclui formulações de PIM adequadas para administração gastrointestinal incluindo, mas não se limitando a, pós, comprimidos ou líquidos para ingestão e supositórios para administração rectal farmaceuticamente aceitáveis. Tal como será aparente a um perito na especialidade, os comprimidos ou supositórios compreenderão ainda sólidos farmaceuticamente aceitáveis, tais como amido, para proporcionar volume à composição.
As administrações nasofaríngica e pulmonar são alcançadas por inalação e incluem vias de entrega tais como a via intranasal, transbrônquica e transalveolar. 0 presente invento inclui formulações de PIM adequadas para administração por inalação incluindo, mas não se limitando a, suspensões líquidas para formação de aerossóis bem como formas em pó para sistemas de entrega por inalação de pó seco. Dispositivos adequados para administração por inalação de formulações de PIM incluem, mas não se limitam a, atomizadores, vaporizadores, nebulizadores e dispositivos de entrega por inalação de pó seco.
Tal como é bem conhecido na especialidade, as soluções ou suspensões utilizadas para as vias de administração aqui descritas podem incluir qualquer um ou mais de um dos seguintes componentes: um diluente estéril tal como água para injecção, solução salina, óleos fixados, polietilenoglicóis, glicerina, propilenoglicol ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos tais como álcool benzílico ou metilparabenos; antioxidantes tais como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes tais como ácido etilenodiaminotetra-acético; tampões tais como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para o ajustamento da tonicidade tal como cloreto de sódio ou dextrose. 0 pH pode ser ajustado com ácidos ou bases, tais como ácido clorídrico ou hidróxido de sódio. A preparação parentérica pode ser encerrada em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de múltiplas doses feitos de vidro ou plástico. 99 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ
Tal como é bem conhecido na especialidade, composições farmacêuticas adequadas para utilização injectável incluem soluções aquosas estéreis (quando solúveis em água) ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injectáveis estéreis. Para administração intravenosa, transportadores adequados incluem solução salina fisiológica, água bacteriostática, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) ou solução salina tamponada com fosfato (PBS) . Em todos os casos, a composição tem de ser estéril e deve ser liquida até ao ponto em que exista facilidade em utilizar uma seringa. Deve ser estável sob as condições de fabrico e armazenamento e tem de ser conservada contra a acção contaminante de microrganismos tais como bactérias e fungos. 0 transportador pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol liquido, e semelhantes) e misturas adequadas destes. A fluidez correcta pode ser mantida, por exemplo, através da utilização de um revestimento tal como lecitina, através da manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e através da utilização de tensioactivos. A prevenção da acção de microrganismos pode ser alcançada através de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal e semelhantes. Pode ser preferível incluir na composição agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, poli-álcoois tais como manitol, sorbitol, cloreto de sódio. Uma absorção prolongada das composições injectáveis pode ser obtida incluindo na composição um agente que atrase a absorção, por exemplo, mono-estearato de alumínio e gelatina.
Tal como é bem conhecido na especialidade, soluções injectáveis estéreis podem ser preparadas através da incorporação do composto ou compostos activos na quantidade necessária num solvente apropriado com a ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguida de esterilização por filtração. Geralmente, as dispersões são preparadas através da incorporação do composto activo num veículo estéril que contenha um meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos dos enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injectáveis 100 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ estéreis, os métodos preferidos de preparação são secagem em vácuo e secagem por congelação que rendam um pó do ingrediente activo mais qualquer ingrediente adicional desejado de uma solução destes previamente esterilizada por filtração. A escolha das vias de entrega pode ser utilizada para modular a resposta imunitária desencadeada. Por exemplo, os títulos de IgG e actividades de CTL foram idênticos quando foi administrado um vector de vírus influenza através das vias intramuscular ou epidérmica (pistola de genes); no entanto, a inoculação muscular rendeu principalmente IgG2a, enquanto a via epidérmica rendeu principalmente IgGl. Pertmer et al. , J. Virol. 70: 6119-6125, 1996. Assim, um perito na especialidade pode tirar vantagem de ligeiras diferenças na imunogenicidade desencadeada por diferentes vias de administração dos polinucleótidos imunomoduladores do presente invento.
Pretende-se que as composições e os métodos de administração acima mencionados descrevam mas não limitem os métodos de administração das formulações de PIM do presente invento. Os métodos de produção das várias composições e dispositivos estão dentro da capacidade de um perito na especialidade e não são aqui descritos em detalhe. A análise (tanto qualitativa como quantitativa) da resposta imunitária ao PIM pode ser através de qualquer método conhecido na especialidade, incluindo mas não se limitando a, medição da produção de anticorpo específico do antigénio (incluindo a medição das subclasses específicas de anticorpo), activação de populações específicas de linfócitos tais como células T CD4+, células B, células NK ou CTL, maturação de células dendríticas (incluindo células dendríticas plasmacitóides), produção de citocinas e quimiocinas tais como IFN-y, IFN-oí, IFN-ω, TNF-α, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IP-10, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MIG ou ΜΙΡ-3β e/ou libertação de histamina. Os métodos para medição de respostas de anticorpos específicas incluem ensaio enzimático imunossorvente (ELISA) e são bem conhecidos na especialidade. A medição do número de tipos específicos de linfócitos tais como células T CD4+ pode ser alcançada, por exemplo, com separação de células activada com fluorescência (FACS). A medição da activação de determinadas populações celulares pode 101
ΕΡ 1 992 635/PT ser alcançada através da determinação de marcadores, por exemplo, marcadores da superfície celular, específicos para activação do tipo celular particular. A expressão do marcador celular pode ser medida, por exemplo, através da medição da expressão de ARN ou da medição da expressão na superfície celular do marcador particular através, por exemplo, de análise FACS. A citotoxicidade e os ensaios de CTL podem ser efectuados por exemplo, tal como descrito em Raz et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91: 9519-9523, 1994 e Cho et al., 2000. As concentrações de citocina podem ser medidas, por exemplo, através de ELISA. A medição da maturação de células dendríticas pode ser efectuada por exemplo tal como descrito em Hartmann et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 96: 9305-9310, 1999. Estes e outros ensaios para avaliar a resposta imunitária a um imunogénio são bem conhecidos na especialidade. Ver, por exemplo, "Selected Methods in Cellular Immunology", (1980) Mishell e Shiigi, eds., W.H. Freeman and Co. A análise (tanto qualitativa como quantitativa) da resposta imunitária ao PIM pode também ser através da medição do nível de citocinas, quimiocinas e/ou outras moléculas que sejam induzidas por citocinas, tais como IFN-γ e/ou IFN-a, cuja produção é estimulada por PIM. Assim, os PIM do presente invento podem também estimular a expressão de citocinas indutoras de IFN-γ e/ou IFN-α, quimiocinas e proteínas inflamatórias incluindo, mas não se limitando a, IP-10 (proteína de 10 kDa induzida por interferão) , monocina induzida por IFN-γ, e proteína 1 quimiotáctica dos monócitos (MCP-1). A resposta imunitária a PIM pode também ser analisada através da medição do nível de citocinas, quimiocinas e/ou outras moléculas que se saiba terem actividades antivirais, incluindo 2,5-oligoadenilato-sintetase (2,5-OAS), gene-54K que estimula interferão (ISG-54K), MxA, MxB e proteína 1 de ligação a guanilato (GBP-1). Assim, moléculas antivirais e moléculas induzidas por IFN-γ e/ou IFN-α podem ser utilizadas como marcadores da actividade do PIM. A medição da produção e/ou da expressão génica de tais moléculas induzidas por interferão pode ser através de qualquer método conhecido na especialidade, incluindo, mas não se limitando a, ELISA e PCR quantitativa para medir a produção de ARN. 102
ΕΡ 1 992 635/PT
De preferência, uma resposta de tipo Thl é estimulada, i.e., desencadeada e/ou aumentada. Em relação ao presente invento, a estimulação de uma resposta imunitária de tipo Thl pode ser determinada in vitro ou ex vivo através da medição da produção de citocinas a partir de células tratadas com PIM em comparação com as tratadas sem PIM. Os métodos para determinar a produção de citocinas das células incluem os métodos aqui descritos e qualquer um conhecido na especialidade. 0 tipo de citocinas produzidas em resposta ao tratamento de PIM indica uma resposta imunitária pelas células tendente para tipo Thl ou tipo Th2. Tal como aqui se utiliza, o termo produção de citocinas "tendente para tipo Thl" refere-se à maior produção mensurável de citocinas associadas a uma resposta imunitária de tipo Thl na presença de um estimulador em comparação com a produção de tais citocinas na ausência de estimulação. Exemplos de tais citocinas tendentes para tipo Thl incluem, mas não se limitam a, IL-2, IL-12, IFN-γ e IFN-α. Em contraste, "citocinas tendentes para tipo Th2" referem-se às associadas a uma resposta imunitária de tipo Th2, e incluem, mas não se limitam a, IL-4, IL-5, e IL-13. Células úteis para a determinação da actividade de PIM incluem células do sistema imunitário, células primárias isoladas de um hospedeiro e/ou linhas celulares, de preferência APC e linfócitos, ainda de maior preferência macrófagos e células T. A estimulação de uma resposta imunitária de tipo Thl pode também ser medida num hospedeiro tratado com um PIM e pode ser determinada através de qualquer método conhecido na especialidade incluindo, mas não se limitando a: (1) uma redução nos níveis de IL-4 ou IL-5 medida antes e após provocação com o antigénio; ou a detecção de níveis inferiores (ou mesmo ausentes) de IL-4 ou IL-5 num hospedeiro tratado com PIM, opcionalmente em comparação com um controlo sensibilizado com antigénio ou sensibilizado e provocado, tratado sem PIM; (2) um aumento nos níveis de IL-12, IL-18 e/ou IFN (α, β ou γ) antes e após provocação com o antigénio; ou detecção de maiores níveis de IL-12, IL-18 e/ou IFN (α, β ou γ) num hospedeiro tratado com PIM em comparação com um controlo sensibilizado com antigénio ou sensibilizado e provocado, tratado sem PIM; (3) produção de anticorpo "tendente a tipo Thl" num hospedeiro tratado com PIM em comparação com um controlo tratado sem PIM; e/ou (4) uma redução nos níveis de 103 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ
IgE específica do antigénio medidos antes e após provocação com o antigénio; ou a detecção de níveis inferiores (ou mesmo ausentes) de IgE específica do antigénio num hospedeiro tratado com PIM em comparação com um controlo sensibilizado com antigénio ou sensibilizado e provocado, tratado sem PIM. Uma variedade destas determinações pode ser feita através da medição das citocinas produzidas por APC e/ou linfócitos, de preferência macrófagos e/ou células T, in vitro ou ex vivo utilizando métodos aqui descritos ou qualquer um conhecido na especialidade. Algumas destas determinações podem ser feitas através da medição da classe e/ou subclasse dos anticorpos específicos do antigénio utilizando métodos aqui descritos ou qualquer um conhecido na especialidade. A classe e/ou subclasse de anticorpos específicos do antigénio produzidos em resposta a tratamento de PIM indicam uma resposta imunitária pelas células tendente a tipo Thl ou tipo Th2. Tal como aqui se utiliza, o termo produção de anticorpos "tendente a tipo Thl" refere-se ao aumento mensurável da produção de anticorpos associada a uma resposta imunitária de tipo Thl (i.e., anticorpos associados a Thl). Pode ser medido um ou mais anticorpos associados a Thl. Exemplos de tais anticorpos tendentes a tipo Thl incluem, mas não se limitam a, IgGl e/ou IgG3 humano (ver, p. ex., Widhe et al., Scand. J. Immunol. 47: 575-581, 1998 e de Martino et al., Ann. Alergia Asthma Immunol 83: 160-164, 1999) e IgG2a de murídeo. Em contraste, "anticorpos tendentes a tipo Th2" refere-se aos associados a uma resposta imunitária de tipo Th2, e incluem, mas não se limitam a, IgG2, IgG4 e/ou IgE humanos (ver, p. ex., Widhe et al. , 1998, e de Martino et al. , 1999) e IgGl e/ou IgE de murídeo. A indução de citocinas tendentes a tipo Thl que ocorre em resultado da administração de PIM produz maiores respostas imunitárias celulares, tais como as efectuadas por células NK, células assassinas citotóxicas, células auxiliares Thl e de memória. Estas respostas são particularmente benéficas para utilizar em vacinação protectora ou terapêutica contra vírus, fungos, parasitas protozoários, bactérias, doenças alérgicas e asma, bem como tumores. 104 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ
Nalgumas concretizações, uma resposta Th2 é suprimida (reduzida) . A supressão de uma resposta Th2 pode ser determinada, por exemplo, através de redução nos níveis de citocinas associadas a Th2, tais como IL-4 e IL-5, redução nos níveis de anticorpos associados a Th2, bem como uma redução da IgE e uma redução na libertação de histamina em resposta ao alergénio.
Estojos São também aqui descritos estojos. Em certos casos, os estojos compreendem geralmente um ou mais recipientes compreendendo qualquer PIM aqui descrito. Os estojos podem ainda compreender um conjunto adequado de instruções, geralmente instruções escritas, referentes à utilização do PIM para qualquer um dos métodos aqui descritos (p.ex., imunomodulação, melhoria de um ou mais sintomas de uma doença infecciosa, aumento dos níveis de IFN-γ, aumento dos níveis de IFN-α, ou melhoria de um distúrbio relacionado com IgE).
Os estojos podem compreender o PIM empacotado em qualquer embalagem conveniente e apropriada. Por exemplo, se o PIM for uma formulação seca (p.ex., um pó liofilizado ou seco), é normalmente utilizado um frasco com uma tampa elástica, para que o PIM possa ser facilmente ressuspenso através de injecção de líquido através da tampa elástica. Ampolas com tampas não elásticas removíveis (p.ex., vidro selado) ou tampas elásticas são muito convenientemente utilizadas para formulações líquidas de PIM. Estão também contempladas embalagens para utilizar em combinação com um dispositivo específico, tal como um inalador, um dispositivo de administração nasal (p.ex., um atomizador) ou um dispositivo de infusão tal como uma minibomba.
As instruções referentes à utilização do PIM incluem geralmente informação quanto a dosagem, programas de dosagem e via de administração para o método de utilização pretendido. Os recipientes do PIM podem ser unidades-dose, embalagens do todo (p.ex., embalagens multi-dose) ou doses em subunidades. As instruções fornecidas nos estojos são tipicamente instruções escritas numa etiqueta ou folheto informativo (p.ex., uma folha de papel incluída no estojo), mas instruções 105
ΕΡ 1 992 635/PT de leitura por máquinas (p.ex., instruções contidas num disco de armazenamento magnético ou óptico) são também aceitáveis.
Nalgumas concretizações, os estojos compreendem ainda um antigénio (ou um ou mais antigénios) , que podem ou não ser empacotados no mesmo recipiente (formulação) que o PIM ou PIM. 0 antigénio foi aqui descrito.
Em certas concretizações, os estojos compreendem um PIM na forma de um complexo polinucleótido imunomodulador/ microtransportador (PIM/MT) e podem compreender ainda um conjunto de instruções, geralmente instruções escritas, relacionadas com a utilização do complexo PIM/MT para qualquer um dos métodos aqui descritos (p.ex., imunomodulação, melhoria de um ou mais sintomas de uma doença infecciosa, aumento dos níveis de IFN-γ, aumento dos níveis de IFN-α, ou melhoria de um distúrbio relacionado com IgE).
Nalgumas concretizações, os estojos compreendendo materiais para produção do complexo PIM/MT incluem geralmente recipientes separados de PIM e MT, embora em certas concretizações sejam fornecidos os materiais para a produção do MT em vez do MT já formado. 0 PIM e o MT são de preferência fornecidos numa forma que permita a formação de complexo PIM/MT após mistura do PIM e do MT fornecidos. Esta configuração é preferida quando o complexo PIM/MT está ligado através de ligação não covalente. Esta configuração é também preferida quando se pretende que o PIM e o MT sejam ligados de forma cruzada através de um agente de reticulação heterobifuncional; sendo o PIM ou o MT fornecido numa forma "activada" (p.ex., ligado ao agente de reticulação heterobifuncional para que a porção reactiva com o PIM fique disponível).
Os estojos para os complexos PIM/MT compreendendo um MT de fase líquida compreendem de preferência um ou mais recipientes incluindo materiais para produção do MT de fase líquida. Por exemplo, um estojo de PIM/MT para MT de emulsão de óleo em água pode compreender um ou mais recipientes contendo uma fase oleosa e uma fase aquosa. 0 conteúdo do recipiente é emulsionado para produzir o MT, que pode ser então misturado com o PIM, de preferência um PIM que tenha 106 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ sido modificado para incorporar uma porção hidrófoba. Tais materiais incluem óleo e água, para produção de emulsões de óleo em água, ou recipientes de componentes de lipossomas liofilizados (p.ex., uma mistura de fosfolipidos, colesterol e um tensioactivo) mais um ou mais recipientes de uma fase aquosa (p.ex., um tampão aquoso farmaceuticamente aceitável). Em certos casos, os estojos compreendem um PIM na forma de uma composição de agente de condensação catiónico-PIM-agente estabilizante (CIS) num ou mais recipientes compreendendo qualquer composição particulada CIS imunomoduladora tal como aqui descrita. Alternativamente, os estojos podem compreender um ou mais recipientes dos componentes das composições CIS do presente invento. As configurações desta concretização incluem estojos com um recipiente de mistura PIM/agente estabilizante e um recipiente de agente de condensação catiónico e estojos com um recipiente de PIM, um recipiente de agente estabilizante, e um recipiente de agente de condensação catiónico. Os estojos podem ainda compreender um conjunto adequado de instruções, geralmente instruções escritas, relacionadas com a utilização da composição particulada CIS para qualquer um dos métodos aqui descritos (p.ex., imunomodulação, melhoria de um ou mais sintomas de uma doença infecciosa, aumento dos niveis de IFN-γ, aumento dos níveis de IFN-α, ou melhoria de um distúrbio relacionado com IgE) . As concretizações de estojo que compreendem recipientes dos componentes das composições CIS incluirão geralmente instruções para produção das composições CIS de acordo com os métodos aqui divulgados. Para além da composição CIS e/ou de componentes da composição CIS do presente invento, as concretizações de estojo podem também encerrar instruções para produção das composições CIS de acordo com os métodos aqui divulgados e instruções para utilização nas composições CIS imunomoduladoras para qualquer um dos métodos aqui descritos.
Os seguintes Exemplos são proporcionados para ilustrar, mas não limitar, o presente invento. As sequências apresentadas nos Exemplos são apenas para fins ilustrativos. 107 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ
EXEMPLOS
Exemplo 1: Imunomodulagão de células humanas através de polinucleótidos imunomoduladores
Polinucleótidos imunomoduladores (PIM) ou amostras de controlo, incluindo polinucleótidos sem uma sequência imunomoduladora (5'-TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3' (SEQ IDN0:2)), SAC e apenas meio, foram testados quanto à actividade imunomoduladora em células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC). Foi também testado o polinucleótido imunomodulador padrão 5’-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA (SEQ ID N0:1). A menos que observado em contrário, os polinucleótidos testados eram oligodesoxinucleótidos fosforotioato inteiramente modificados.
Sangue periférico foi colhido a partir de voluntários através de punção venosa utilizando seringas heparinizadas. O sangue foi vertido sobre uma almofada de FICOLL® (Amersham Pharmacia Biotech) e centrifugado. As PBMC, situadas na interface de FICOLL®, foram colhidas, depois lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS). As células foram ressuspensas e cultivadas em placas de 48 ou 96 poços a 2χ106 células/ml em RPMI 1640 com soro humano AB inactivado pelo calor a 10% mais 50 unidades/ml de penicilina, 50 gg/ml de estreptomicina, 300 pg/ml de glutamina, piruvato de sódio 1 mM e aminoácidos não essenciais (NEAA)em MEM 1χ.
As células foram cultivadas na presença de amostras de teste (PIM ou controlos) a doses que variam de 0,2 a 20 pg/ml durante 24 horas, depois foi colhido meio livre de células de cada poço e ensaiou-se quanto à concentração de IFN-γ e/ou IFN-α. 0 IFN-γ e o IFN-oc foram ensaiados utilizando estojos de ELISA CYTOSCREEN™ de BioSource International, Inc., de acordo com as instruções do fabricante. Geralmente, as amostras de teste foram testadas com PBMC de 4 dadores humanos.
Os PIM estimularam a secreção de IFN-γ e/ou IFN-oc pelas PBMC humanas. No ensaio de PBMC humanas, os niveis de fundo de IFN-γ podem variar, mesmo significativamente, com o dador. Outras citocinas tais como IFN-α, no entanto, demonstram um padrão geralmente estável de activação e exibem rotineiramente 108 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ níveis de fundo baixos sob condições não estimuladas. Exemplos de resultados de tais ensaios com PBMC estão resumidos nas Tabelas 2-7.
Num ensaio de titulação da dose, PBMC de 4 dadores foram estimuladas com 0,2 a 20 pg/ml de SEQ ID NO: 27 tal como descrito acima. A quantidade de IFN-α e IFN-γ produzida foi avaliada tal como descrito acima e foi calculada a média dos resultados dos 4 dadores e os resultados médios são apresentados na Tabela 2.
Tabela 2. Titulação do PIM - IFN (pg/ml) SEQ ID NO:27 (pg/ml) IFN-γ IFN-Oí 20 412 749 8 583 4036 3, 2 203 4073 1,3 39 887 0,5 15 108 0,2 11 50
Tal como se pode observar a partir dos resultados apresentados na Tabela 2, a capacidade para induzir produção de IFN-oc aumentou à medida que a dose de PIM diminuía e tornou-se óptima a aproximadamente 3-8 pg/ml, após o que a actividade diminuiu com a dose. Ensaios adicionais confirmaram este resultado. PBMC de quatro dadores foram estimuladas com 20 pg/ml de PIM ou controlos e a estimulação da produção de IFN-α e IFN-γ foi avaliada tal como descrito acima. Entre os polinucleótidos testados estavam: 5’-TCGTCGAACGTTCGTTAACGTTCG (SEQ ID NO:5); 5’-TCGTCGAACGTTCGTT (SEQ ID NO:12); 5'-TCGTCGGAACGTTCGAGATG (SEQ ID NO:14); 5'-TCGTCGTGAACGTTCGAGATGA (SEQ ID NO:13); 5'-TCGTCGAACGTTCCTTAACGTTCC (SEQ ID NO:6); 109
ΕΡ 1 992 635/PT 5'-TCGTCGTAACGTTCGAGATG (SEQ ID NO:15); 5'-TCGTCGAACGTTTTAACGTT (SEQ ID NO:31); 5'-TCGTTCAACGTTCGTTAACGTTCG (SEQ ID NO:9); 5'-TCGTCGGACGTTCGAGATG (SEQ ID NO:16); 5'-TCGTCGTACGTTCGAGATG (SEQ ID NO:17); 5'-TCGTCGTTCGTTCGAGATG (SEQ ID NO:18); 5'-TCGTCGAACCTTCGTTAACCTTCG (SEQ ID NO:ll); 5'-TGATCGTCGAACGTTCGAGATG (SEQ ID NO:24); 5'-TGATCGAACGTTCGTTAACGTTCG (SEQ ID NO:8); 5'-TGATTCAACGTTCGTTAACGTTCG (SEQ ID NO:10); 5'-TCAACGTTCGTTAACGTTCGTT (SEQ ID NO:4).
Foi calculada a média dos resultados da produção de citocinas pelas PBMC de cada dador e os resultados médios são apresentados na Tabela 3.
Tabela 3. Ensaios de PBMC humanas - IFN (pg/ml) teste ou controlo (SEQ ID NO:) IFN-γ IFN-a 2(não-PIM) 11 50 1 (PIM padrão) 205 141 27 335 842 5 297 517 35 308 686 12 153 157 14 340 576 13 297 142 7 510 594 6 554 103 15 204 194 31 169 178 9 310 57 16 274 421 17 387 208 110
ΕΡ 1 992 635/PT teste ou controlo (SEQ ID NO:) IFN-γ IFN-Oí 18 78 50 11 36 50 24 462 708 8 650 704 10 111 66 4 126 50 meio 11 50
Tal como demonstrado na Tabela 3, os PIM que estimularam a produção de mais IFN-α que um padrão PIM, SEQ ID NO:l, incluem pelo menos uma sequência TCG na extremidade 5' do polinucleótido ou próximo desta (uma sequência 5'-TCG) e uma sequência palindrómica de pelo menos 8 bases de comprimento adjacente ou a 3 bases da sequência 5'-TCG. Em general, a estimulação da produção de IFN-γ espelhou a estimulação da produção de IFN-α, embora o intervalo de variação na estimulação de IFN-γ fosse menor que para IFN-α. Nos polinucleótidos em que a sequência palindrómica e a 5'-TCG estava separadas, foi geralmente preferível para a produção de IFN-α que a separação fosse em, ou se sobrepusesse com um segundo trinucleótido TCG (ver, por exemplo, SEQ ID NO:14). Os PIM contendo uma 5'-TCG mas nenhuma sequência palindrómica tal como descrito acima induziram níveis muito baixos de IFN-γ e não induziram produção de IFN-α (ver, por exemplo, SEQ ID NO: 18 e 11). Os PIM contendo palíndromas de 6-8 bases mas nenhum trinucleótido 5'-TCG induziram IFN-γ mas apenas níveis baixos de IFN-α (ver, por exemplo, SEQ ID NO:l e 4) . Notavelmente, os PIM contendo um TCG a até três bases removidas da extremidade 5' do polinucleótido e contendo uma sequência palindrómica de pelo menos 10 bases de comprimento induziram um nível particularmente elevado de IFN-α em comparação com um padrão PIM sem uma 5'-TCG, SEQ ID NO:l (ver, por exemplo, SEQ ID NO:24 e 8).
Foi efectuado um ensaio para testar a dependência da dose de PIM da estimulação da produção de IFN-α. Os PIM testados neste ensaio variaram na posição da sequência palindrómica no polinucleótido e/ou na posição de pelo menos uma sequência TCG 111 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ na extremidade 5'. Entre os polinucleótidos testados estavam alguns dinucleótidos CG e sequências 5'-TCG mas sem sequências palindrómicas com 8 bases ou mais de comprimento (por exemplo, SEQ ID NO:11; SEQ ID NO:18; 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT (SEQ ID NO:3)). Foram também testados polinucleótidos com dinucleótidos CG e sequências palindrómicas com 8 bases ou mais de comprimento mas sem trinucleótidos 5'-TCG (por exemplo, SEQ ID N0:1; SEQ ID NO:4; 5'-ATCATCTCGAACGTTCGACGA (SEQ ID NO:29) ; 5'-AACGTTCGAACGTTCGAACGTTT (SEQ ID NO:67); 5'-TCAACGTTCGAACGTTCGAACGTT (SEQ ID NO:68); 5'-GACGATCGTCGACGATCGTC (SEQ ID NO:85)). PBMC de quatro dadores foram estimuladas com 0,8, 4,0 ou 20 pg/ml de PIM ou controlos. A estimulação da produção de IFN-α foi avaliada tal como descrito acima e a média dos resultados dos 4 dadores está relatada na Tabela 4.
Tabela 4. Ensaios de PBMC humanas - IFN-oc (pg/ml) teste ou controlo (SEQ ID NO:) 20 pg/ml 4,0 pg/ml 0,8 pg/ml 2 (não-PIM) 52 52 52 1 (PIM padrão) 52 108 52 27 8626 7908 715 52 2425 4249 1085 39 2388 9325 3590 38 1874 7744 4635 57 1991 4262 9780 58 915 1654 5965 59 616 3221 1147 24 1848 2233 71 8 1023 544 52 29 1000 3325 95 35 3507 8734 63 60 1978 517 52 61 7256 13767 599 62 11157 16722 2254 63 17077 12510 360 64 569 2896 80 112 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ teste ou controlo (SEQ ID NO:) 20 pg/ml 4,0 pg/ml 0,8 pg/ml 65 2007 1158 55 6 6 3926 718 64 67 246 2399 52 68 520 1558 1254 85 52 411 52 4 158 124 52 18 473 618 52 11 52 261 756 3 138 289 53 meio 52
Os resultados apresentados na Tabela 4 apoiam a importância de uma sequência palindrómica com pelo menos 8 bases de comprimento e pelo menos uma sequência TCG na extremidade 5' do polinucleótido ou próximo desta para estimulação de IFN-cí a partir de PBMC humanas.
Foi efectuado outro ensaio para testar a dependência da dose de PIM na estimulação da produção de IFN-α. Os PIM testados nestes ensaios variaram na presença de dinucleótidos CG e sequências 5'-TCG no polinucleótido. Entre os polinucleótidos testados estavam alguns com sequências palindrómicas mas sem dinucleótidos CG (por exemplo, SEQ ID NO:2/ 5'-TGCTTGCAAGCTTGCAAGCA (SEQ IDNO:90), 5'-TCAGTCAGTCAGCTGACTG ACTGA (SEQ ID NO:96) e/ou sem uma sequência 5'-TCG (por exemplo, SEQ ID N0:1, 90, 96/ 5' -ACCGATAACGTTGCCGGTGACGGCACCACG (SEQ ID NO:92), 5'-AACAACAACGTTGTTGTT (SEQ ID NO:95), 5'-ACCGA TAACGTTGCCGGTGACGGCACCACG (SEQ ID NO: 25) , 5 ' -AACAACAACGTTGTTGTT (SEQ ID NO:94)). Foi também testado neste ensaio o polinucleótido 5'-TCGTTGCAAGCTTGCAACGA (SEQ IDNO:91). Alguns dos PIM variaram na composição da estrutura fosfato. PBMC de três dadores foram estimuladas com 0,8, 4,0 ou 20 pg/ml de PIM ou controlos. A estimulação da produção de IFN-α foi avaliada utilizando PBMC de 3 dadores tal como descrito acima e os resultados médios para os 3 dadores estão relatados na Tabela 5. 113 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ
Tabela 5. Ensaios de PBMC humanas - IFN-α, (pg/ml) teste ou controlo (SEQ ID NO:) 20 pg/ml 4,0 pg/ml 0,8 pg/ml meio 43 - - 2(não-PIM) 43 43 43 1 (PIM padrão) 43 371 43 27 823 4958 1893 53 1968 13779 13550 54 142 5090 2832 97 1244 12097 5173 42 1790 7923 4249 90 43 43 50 96 58 613 43 91 1177 1539 870 25 43 43 43 92 43 903 43 94 235 56 43 95 216 84 43 26 25420 19903 4136 30 1125 7543 5955 32 1483 5088 2933 33 6031 24061 14111 34 15012 17241 6979 93 1355 6193 1762
Tal como se pode observar a partir dos resultados apresentados na Tabela 5, a inversão dos dinucleótidos CG na sequência altamente activa SEQ ID NO:42 em dinucleótidos GC abole a capacidade de SEQ ID NO:90 para induzir IFN-oí. Semelhantemente SEQ ID NO:96, um polinucleótido palindrómico sem dinucleótidos CG também é inactivo. 114 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ
Tal como se pode observar na Tabela 5, dois polinucleótidos fosfodiéster representativos, SEQ ID NO:25 e SEQ ID NO:94, e suas versões fosforotioato completamente modificadas, SEQ ID NO:92 e SEQ ID NO:95, respectivamente, não foram activos na indução de IFN-cí a partir de PBMC humanas. Embora as SEQ ID NO: 25 e 92 contenham vários dinucleótidos CG, incluindo o motivo AACGTT, elas não incluem TCG nem uma sequência palindrómica de pelo menos 8 bases. As SEQ ID NO:94 e 95 são palindromas de 18 bases e contêm um dinucleótido CG, mas nenhum trinucleótido TCG. Assim, estes polinucleótidos não se ajustam aos motivos aqui descritos.
As SEQ ID NO: 26, 30, 32, e 33, contendo todas ligações fosforotioato (SEQ ID NO: 30 e 32) ou ligações quiméricas fosforotioato/fosfodiéster (SEQ ID NO:26 e 33), induziram elevadas quantidades de IFN-α a partir de PBMC humanas. Tanto a SEQ ID NO:34 (que contêm ligações quiméricas fosforotioato/fosfodiéster) como a 93 (todas ligações fosforotioato) induziram IFN-α a partir de PBMC humanas.
Num ensaio para testar o efeito do comprimento de uma sequência palindrómica na estimulação de IFN-α, PBMC de quatro dadores foram estimulados com 2 pg/ml ou 20 pg/ml de PIM ou controlos, a estimulação da produção de IFN-α foi avaliada tal como descrito acima e os resultados médios estão relatados na Tabela 6. Entre os polinucleótidos testados estavam 5'-TTCGAACGTTCGTTAACGTTCG (SEQ ID NO:20) e 5'-TCGTCGAACGTTCGAACGTTCG (SEQ ID N0:19).
Tabela 6. Ensaios de PBMC humanas - IFN-cí (pg/ml) teste ou controlo (SEQ ID NO:) 20 pg/ml 2 pg/ml 2 (não-PIM) 26 26 1 (PIM padrão) 93 34 5 2146 4018 20 2350 312 19 9844 15989 38 1935 15217 39 3729 14127 115 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ teste ou controlo (SEQ ID NO:) 20 pg/ml 2 pg/ml 40 4584 12550 43 4174 10362 27 2008 10062 41 543 12916 42 3935 14752 meio 26 26
Os resultados apresentados na Tabela 6 apoiam a importância de uma sequência palindrómica com pelo menos 8 bases de comprimento e pelo menos uma sequência TCG na extremidade 5' do polinucleótido ou próximo desta para estimulação de IFN-α por PBMC humanas.
Num ensaio para testar a actividade estimuladora de IFN-oí de PIM com uma variedade de palindromas com 12 bases, PBMC de quatro dadores foram estimuladas com 0,8, 4 ou 20 pg/ml de PIM ou controlos, a estimulação da produção de IFN-α foi avaliada tal como descrito acima e os resultados médios estão relatados na Tabela 7.
Tabela 7. Ensaios de PBMC humanas - IFN-oc (pg/ml) teste ou controlo (SEQ ID NO:) 20 pg/ml 4 pg/ml 0,8 pg/ml 2 (não-PIM) 169 133 133 1 (PIM padrão) 190 238 143 27 3010 6473 2775 44 4951 10420 5468 45 3821 7221 2864 46 1403 5296 5169 47 2798 6731 3992 48 3082 9190 4113 51 2701 5699 1727 69 1886 8299 5195 116
ΕΡ 1 992 635/PT teste ou controlo (SEQ ID NO:) 20 pg/ml 4 pg/ml 0,8 pg/ml 70 7893 8429 5553 71 10647 10525 6173 72 9652 9101 5095 73 10419 9376 4896 74 9883 9085 5635 75 10269 8153 3888 76 10551 9773 5062 49 5424 7762 2788 50 6112 8517 3239 42 7634 8208 5472 43 6777 6768 4472 77 3694 4725 768 78 2542 4257 4311 79 1201 5725 5757 39 7454 9965 6622 80 2938 4137 1412 81 5914 4918 865 82 3451 4249 4170 84 3454 5363 2255 86 10742 11881 6332 87 5110 5950 4139 114 4779 5491 2907 meio 204 204 204
Os resultados apresentados na Tabela 7 indicam que qualquer um dos PIM testados com palíndromas com 12 bases era activo na estimulação de IFN-oí por PBMC humanas. Estes PIM contêm um palindroma de 12 bases com a sequência TCGX1X2CGX2'Xi' CGA (SEQ ID NO:198) na qual não há limitações de nucleótidos para Xi e X2/ apesar da formação de troços de CGCG, CCGG e GCGC, que foram anteriormente descritos como sequências imunoinibidoras ou sequências neutralizadoras do 117 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ sistema imunitário (Krieg et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95: 12631-12636, 1998). Por exemplo, as SEQ ID NO:49 e 50 são activas na estimulação de IFN-oí e contêm a sequência CGCG. SEQ ID NO:49 exemplifica um polinucleótido imunomodulador contendo a SEQ ID NO:161 descrita acima. SEQ ID NO:50 exemplifica um polinucleótido imunomodulador contendo a SEQ ID NO:162 descrita acima.
Os PIM com palindromas maiores induziram níveis mais elevados de IFN-oí de PBMC humanas, particularmente a doses de PIM inferiores. Tal como se pode observar nos resultados do ensaio mostrados na Fig. 1, a quantidade de IFN-oí produzida pelas células em resposta a SEQ ID NO:172 foi significativamente mais elevada que SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:27 e SEQ ID NO:l à dose de 0,4 pg/ml de PIM. Também, a quantidade de IFN-oí produzida em resposta a SEQ ID NO: 172 foi significativamente mais elevada que SEQ ID NO: 27 e SEQ ID NO:1 à dose de 0,8 pg/ml de PIM (p<0,001). O comprimento do palindroma nos PIM é de: 2 8 bases em SEQ ID NO: 172, 22 bases em SEQ ID NO: 113, 12 bases em SEQ ID NO:27, e 8 bases em SEQ ID NO:l.
Noutro ensaio, o comprimento global do PIM e o comprimento do palindroma do PIM foram comparados na indução da produção de IFN-oí de PBMC humanas. Entre os polinucleótidos testados estavam: SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO: 12,
SEQ ID NO:27, 5'-TCGTCGAACGTTCGAGATG (SEQ ID NO:166); 5’-TCGTC GAACGTTCGAGAT (SEQ ID NO: 99) ; 5' -TCGTCGAACGTTCGAG (SEQ ID NO: 100) ; 5' -TCGTCGAACGTTCGA (SEQ ID NO:101); 5'- TCGAACGTTCGAG (SEQ ID NO:102); 5' -TCGAACGTTCGA (SEQ ID NO:103); 5 ' -TCGAACGTTCG (SEQ ID NO: 104) ; 5 ' -TCGACGTCGA (SEQ ID NO: 105) ;
5'-TCGTCGAACGTTCG (SEQ ID NO:167); 5'-TCGTCGAACGTT (SEQ ID NO: 199); 5'-TCGTTCGAACGTTCGAA (SEQ IDNO:54); 5'-TTCGAACGTTCGAA (SEQ ID NO:98). PBMC de quatro dadores foram estimuladas com 0,8, 4,0 ou 20 pg/ml de PIM ou controlos e a produção resultante de IFN-oí foi avaliada tal como descrito acima. Os resultados médios para os 4 dadores a cada concentração de PIM estão relatados na Tabela 8. 118 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ
Tabela 8. Ensaios de PBMC humanas - IFN-α (pg/ml) IFN-oí PIM Teste (SEQ ID NO:) ou controlo 20 pg/ml 4 pg/ml 0, 8 pg/ml Comprimento total (bases) Palíndroma (bases) 1 (PIM padrão) 128 412 52 22 8 2 (não-PIM) 52 52 52 22 - 27 1181 5697 1264 21 12 166 1527 4827 2095 19 12 99 204 4254 2093 18 12 100 451 3835 2115 16 12 101 601 3065 547 15 12 102 1016 3529 533 13 12 103 484 1091 83 12 12 104 321 52 52 11 10 105 52 52 52 10 10 12 224 1692 63 16 10 167 319 556 69 14 10 199 52 52 52 12 6 54 99 3143 1133 17 14 98 1027 2321 744 14 14 meio 82 82 82
Os resultados apresentados na Tabela 8 indicam que, para os polinucleótidos testados, o comprimento mínimo total do polinucleótido para estimular a produção de IFN-α em PBMC humanas tem cerca de 12 bases com um palíndroma de cerca de 10 bases de comprimento. Assim, nalgumas concretizações em que é desejada a produção de elevados níveis de IFN-α, o PIM contém pelo menos uma sequência palindrómica com pelo menos os seguintes comprimentos (em bases): 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28 ou 30, e, nalgumas concretizações, o PIM contém pelo menos uma sequência palindrómica com um comprimento superior a 30 bases. 119 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ
Noutro ensaio, PBMC de três dadores foram estimuladas com 0,8, 4,0 ou 20 μg/ml de PIM ou controlos. A estimulação da produção de IFN-a, IFN-β e IFN-ω foi avaliada tal como descrito acima. IFN-ω foi avaliado utilizando um estojo de ELISA de PBL Biomedical Laboratories e o limite inferior e superior de detecção de IFN-ω foi de 48 pg/ml e 6000 pg/ml, respectivamente. IFN-β foi ensaiado utilizando um estojo de ELISA de BioSource e o limite inferior e superior de detecção foi de 12 Ul/ml e 3046 Ul/ml, respectivamente. Os resultados médios para os 3 dadores a cada concentração de PIM estão relatados na Tabela 9.
Tabela 9. Ensaios de PBMC humanas - IFN-a ou IFN-ω (pg/ml) IFN-a IFN-ω teste (SEQ ID NO:) ou controlo 20 pg/ml 4,0 pg/ml 0, 8 pg/ml 20 pg/ml 4,0 pg/ml 0, 8 pg/ml meio 16 - - 48 - - 2(não-PIM) 14 16 14 48 48 48 1 (PIM padrão) 49 198 19 48 48 48 27 700 7394 2146 76 629 163 39 2716 6180 5922 284 741 604 38 nd nd nd 228 632 650 nd = não determinado
Tal com se pode observar na Tabela 9, os PIM do presente invento estimulam a produção de IFN-ω de PBMC humanas bem como a produção de IFN-α. No ensaio descrito acima, não foi detectado IFN-β.
Noutro ensaio, formas dúplex de polinucleótidos foram comparadas com formas não dúplex na indução da produção de IFN-α por PBMC humanas. Entre os polinucleótidos testados estavam: SEQ ID NO:l, SEQ ID NO: 90, SEQ. ID NO:27, e 5'-TCGTCGAACGTTCGAGATGAT/5’-ATCATCTCGAACGTTCGACGA (SEQ ID NO:182 - dúplex de SEQ ID NO:27 e SEQ ID NO:29). PBMC de três dadores foram estimuladas com 0,4, 0,8, 4,0 ou 20 pg/ml de PIM ou controlos e a produção resultante de IFN-α foi avaliada tal como descrito acima. Os dúplices foram comparados com as 120 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ sequências simples utilizando a mesma dose total de polinucleótido (p.ex., 4 pg/ml de SEQ ID NO:27 em comparação com 4 pg/ml de SEQ ID NO: 182 de cadeia dupla que continha 2 pg/ml de SEQ ID NO:27 e 2 pg/ml de SEQ ID NO:29). Os resultados médios para os 3 dadores a cada concentração de PIM estão relatados na Tabela 10.
Tabela 10. Ensaios de PBMC humanas - IFN-α (pg/ml) IFN-cx teste (SEQ ID NO:) ou controlo 20 pg/ml 4 pg/ml 0,8 pg/ml 0,4 pg/ml 27 592 3719 254 57 182 (27/29 dpx) 386 2612 4725 1027 1 124 312 52 52 90 52 nd nd nd meio 52 52 52 52 nd= não determinado
Tal como se pode observar na Tabela 10, SEQ ID NO:182, a forma dúplex de SEQ ID NO:27 é mais activa que SEQ ID NO:27 na estimulação da produção de IFN-α a doses inferiores de PIM. A doses mais elevadas (4 e 20 pg/ml), SEQ ID NO:27 foi de algum modo mais estimuladora.
Noutro ensaio, um polinucleótido contendo bases modificadas e polinucleótidos sem bases modificadas foram comparados na indução da produção de IFN-α por PBMC humanas. Entre os polinucleótidos testados estavam: SEQ ID NO:l, SEQ ID NO:2, 5’-TCGTCGAACGTTCGAGATGAT (SEQ ID NO:27), e 5'-TCXTCXAACXTTCXAGATGAT (X=7-desaza-dG, SEQ ID NO:193). SEQ ID NO:27 e SEQ ID NO:193 têm a mesma sequência nucleotidica excepto quanto às substituições desaza-dG para os quatro dG em SEQ ID NO:27. PBMC de quatro dadores foram estimuladas com 0,8, 4,0 ou 20 pg/ml de PIM ou controlos e a produção resultante de IFN-α foi avaliada tal como descrito acima. Os resultados médios para os 4 dadores a cada concentração de PIM estão relatados na Tabela 11. 121
ΕΡ 1 992 635/PT
Tabela 11. Ensaios de PBMC humanas - IFN-α (pg/ml) IFN-a teste (SEQ ID NO:) ou controlo 20 pg/ml 4 pg/ml 0,8 pg/ml 1 (PIM padrão) 129 118 80 2 (não-PIM) 102 102 102 27 10248 13871 3798 193 10754 12262 193 meio 102
Tal como se pode observar na Tabela 11, SEQ ID NO:193 tem actividade estimuladora de IFN-oc comparável a SEQ ID NO: 27 excepto na dose de 0,8 pg/ml.
As formas simples e de cadeia dupla dos polinucleótidos contendo bases modificadas foram ensaiadas quanto à actividade na indução de produção de IFN-α por PBMC humanas. Entre os polinucleótidos testados estavam: SEQ ID NO:l de cadeia simples e dupla, SEQ ID NO: 2 de cadeia simples, SEQ ID NO: 29 de cadeia simples, SEQ ID NO:27 de cadeia simples e de cadeia dupla, SEQ ID NO:187 de cadeia simples e dupla, SEQ ID NO:188 de cadeia simples e dupla, SEQ ID NO:189 de cadeia simples e dupla, SEQ ID NO:190 de cadeia simples e dupla, SEQ ID NO:194 de cadeia simples, e SEQ ID NO: 197 de cadeia simples. As SEQ ID NO: 187, 188, 189, 190, 194 e 197 têm a mesma sequência nucleotidica que SEQ ID NO: 27 excepto quanto às substituições observadas: 5'-TCGTCGAA*CGT*TCGAGATGAT (A* = 2-amino-dA; T* = 2-tio-dT) (SEQ ID NO:189) ; 5'-TCGTCGA*A*CGT*T*CGAGATGAT (A* = 2-amino-dA; T* = 2-tio-dT) (SEQ ID NO:190); 5'-TCG*TCG*AACG*TTCG*AG*ATG*AT (G* = 7-desaza-8-aza-dG) (SEQ ID NO:187); 5'-TCG*AACG*TTCG*AACG*TTCG*AACG*TT (G* = 7-desaza-8-aza-dG) (SEQ ID NO:194); 5 ' -TCGTCGA*A*CGTTCGA*GA*TGA*T (A* = 2-amino-dA) (SEQ ID NO:188); 122
ΕΡ 1 992 635/PT 5'-TCGA*A*CGTTCGA*A*CGTTCGA*A*CGTT (A* = 2-amino-dA) (SEQ ID NO:197). PBMC de oito dadores foram estimuladas variadamente com 0,2, 0,4, 0,8, 1,6, 4,0 ou 8 pg/ml de PIM ou controlos e a produção resultante de IFN-α foi avaliada tal como descrito acima. Os dúplices foram comparados com as sequências simples utilizando a mesma dose total de polinucleótido (p.ex., 4 pg/ml de SEQ ID NO: 27 em comparação com 4 pg/ml de SEQ ID NO:182 de cadeia dupla que continha 2 pg/ml de SEQ ID NO:27 e 2 pg/ml de SEQ ID NO:29). Os resultados médios para os 8 dadores a cada concentração de PIM estão relatados na Tabela 12.
Tabela 12. Ensaios de PBMC humanas - IFN-α (pg/ml) IFN-α (pg/ml) teste (SEQ ID NO:) ou controlo 8 pg/ml 4 pg/ml 1,6 pg/ml 0, 8 pg/ml 0,4 pg/ml 0, 2 pg/ml 2 (não-PIM) nd 87 nd nd nd nd 90 nd 77 nd nd nd nd 1 (PIM padrão) nd 288 nd 77 77 nd 1 dúplex 81 126 1988 1740 258 77 27 nd 8850 nd 955 77 nd 29 nd 6040 nd 85 77 nd 182 (27/29 dúplex) 747 2162 6462 7280 1862 89 187 nd 1050 nd 139 77 nd 183 (187/29 dúplex) 91 117 311 1081 411 119 188 nd 644 nd 3360 147 nd 184 (188/29 dúplex) 225 978 5483 10057 5022 527 189 nd 845 nd 302 79 nd 185 (189/29 dúplex) 257 638 7345 7973 2711 314 190 nd 3064 nd 150 77 nd 186 (190/29 dúplex) 491 2673 6085 6603 1703 194 194 nd 164 nd 645 77 nd 197 nd 4833 nd 5742 1224 nd SAC (1:5000) 96 meios 77 nd = não determinado 123 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ
Tal como se pode observar na Tabela 12, a utilização de certas bases modificadas no PIM pode resultar em polinucleótidos que têm actividade estimuladora de IFN-α. Com a excepção de 183, estes resultados mostram também que a formação de um polinucleótido dúplex com a sequência complementar conduz a um PIM altamente activo para estimulação da produção de IFN-α, particularmente a doses mais baixas. Os polinucleótidos que não puderam formar dúplices por si mesmos, p.ex., SEQ ID NO: 189 e SEQ ID NO: 190, induziram pouco IFN-a enquanto sequências maiores (p.ex., SEQ ID NO:172, um 30-mero com um palindroma de 28 bases) e o dúplex SEQ ID NO: 182 induziram mais IFN-α a doses baixas (p.ex., 0,4 e 0,8 pg/ml) que SEQ ID NO:27 e outros PIM com palindromas inferiores a 28 bases de comprimento (tal como mostrado na Tabela 12 e Fig. 1) . Tal como aqui discutido, certas bases modificadas podem aumentar a estabilidade dos dúplices formados.
Exemplo 2: Activação de células B humanas por polinucleótidos imunomoduladores A capacidade dos PIM para activar células B humanas foi determinada através da medição da proliferação de células B e da produção de IL-6 em resposta à incubação com PIM. PBMC humanas foram incubadas com contas MACS de CD19 (Miltenyi Biotec) e passadas através de um magneto, separando as células B CD19+ através de selecção positiva (>98% CD19+ determinado através de FACS). Para o ensaio de proliferação, as células B foram cultivadas a lxl05/poço (5xl05/ml) em placas de 96 poços 96 de fundo redondo. As células foram incubadas em triplicado com 2 pg/ml de PIM ou controlo durante 72 horas. No final do período de cultura, as placas foram pulsadas com 3H-timidina (1 pCi/poço, Amersham) e incubadas durante mais 8 horas. As placas foram então colhidas e a incorporação radioactiva determinada utilizando técnicas de cintilação líquida padrão, e os dados foram colhidos em contagens por minuto (cpm). Para a secreção de IL-6, células B foram cultivadas a 0,5-lxlOs/poço em placas de 48 poços com 5 pg/ml de PIM ou controlo durante 48 horas, depois os sobrenadantes da cultura foram colhidos e ensaiados quanto a IL-6 utilizando ELISA com pares de anticorpos CytoSet de acordo com as instruções do fabricante (BioSource). Os limites de detecção máximo/mínimo foram 4000/2 pg/ml. 124 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ
Os resultados do ensaio de proliferação de células B apresentados na Tabela 13 são a média dos valores das cpm da proliferação celular em triplicado para as células de cada dador e a média dos valores das cpm para ambos os dadores. Os resultados para o ensaio de IL-6 de células B apresentados na Tabela 13 são a quantidade de IL-6 produzida pelas células de cada dador e o valor médio para ambos os dadores.
Tabela 13. Ensaios de Células B Humanas
Ensaio de proliferação (cpm) Ensaio de IL-6 (pq/ml) teste (SEQ ID NO:) ou controlo Dador 1 Dador 2 Média Dador 1 Dador 2 Média meio 415 575 495 26 28 27 1 (PIM padrão) 27 731 43 403 35 567 222 531 377 2 (não-PIM) 6748 7704 7226 52 126 89 43 22 695 26 456 24 576 187 935 561 38 45 364 27 327 36 346 248 984 616 40 60 250 52 916 56 583 172 336 254 19 22 683 29 569 26 126 173 257 215 LPS 1647 544 1096 34 21 28
Dos resultados apresentados na Tabela 13, os compostos contendo dinucleótidos CG induziram proliferação de células B e produção de IL-6. Tal como se pode observar dos resultados apresentados na Tabela 9, embora uma boa actividade estimuladora de células B em polinucleótidos imunoestimuladores esteja dependente da presença de um dinucleótido CG, não parece requerer os motivos mais especializados aqui descritos para elevada indução de IFN-oí.
Noutro ensaio, formas dúplex de polinucleótidos foram comparadas com formas não dúplex na activação de células B. Entre os polinucleótidos testados estavam: SEQ ID N0:1, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 27 e SEQ ID NO: 182 - dúplex de SEQ ID NO: 27 e SEQ ID NO: 29. Células B de três dadores foram estimuladas com 1,0 ou 5,0 pq/ml de PIM ou controlo e a 125
ΕΡ 1 992 635/PT proliferação celular e produção de IL-6 resultantes foram avaliadas tal como descrito acima. Os resultados médios para os 3 dadores a cada concentração de PIM estão relatados na Tabela 14.
Tabela 14. Ensaios de Células B Humanas
Ensaio de proliferação (cpm) Ensaio de IL-6 (pg/ml) teste (SEQ ID NO:) ou controlo 5 pg/ml 1 pg/ml 5 pg/ml 1 pg/ml 1 57921 11307 554 73 27 66735 24529 723 322 182 (27/29 dpx) 78047 25344 809 281 90 3333 2181 5 4 meio 2104 2104 4 4
Dos resultados apresentados na Tabela 14, SEQ ID NO:182, a forma dúplex de SEQ ID NO:27 é aproximadamente equivalente a SEQ ID NO:27 na activação de células B medida através da estimulação da produção de IL-6 e proliferação celular.
Exemplo 3: Imunomodulagão de células de murídeo através de polinucleótidos imunomoduladores
Polinucleótidos imunomoduladores ou polinucleótidos de controlo foram ensaiados quanto à actividade imunomoduladora em esplenócitos de ratinho. Os polinucleótidos testados eram oligodesoxinucleótidos fosforotioato completamente modificados. Entre os polinucleótidos testados estavam SEQ ID N0:1 (controlo positivo) e SEQ ID NO: 2 (controlo negativo). mais
Fragmentos de baço de ratinhos Balb/c foram digeridos com colagenase/dispase (0,1 U/ml/0,8 U/ml) dissolvida em solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante 45 minutos a 37°C, depois mecanicamente dispersa forçando os fragmentos digeridos através de ecrãs metálicos. Os esplenócitos dispersos foram sedimentados por centrifugação, depois ressuspensos em meio fresco (RPMI 1640 com soro fetal de vitelo a 10%, 126 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ 50 unidades/ml de penicilina, 50 pg/ml de estreptomicina, glutamina 2 mM e β-mercaptoetanol 0,05 mM).
Os esplenócitos de ratinho foram dispensados para poços de placas de 96 poços (7χ107 células/ml) e incubados durante uma hora a 37°C. Foram adicionados às células 100 μΐ de amostra de teste ou de controlo concentrada 2* e incubou-se mais 24 horas. Cada amostra de teste ou de controlo foi testada em duplicado. O meio foi colhido de cada poço e congelado a -80°C antes dos testes. O meio colhido foi descongelado e testado quanto às concentrações de citocina através de ELISA. Os polinucleótidos foram testados a várias concentrações incluindo 5,0, 1,0 e 0,1 pg/ml. Entre os polinucleótidos testados estavam 5'-TGACTGTGAACGTTCGAAATGA (SEQ ID NO: 36) e 5' -TGACTGTGAACGTTCGAAGTGA (SEQ ID NO:37). As amostras de controlo incluíram apenas meio e PANSORBIN®, Staphylococcus aureus (SAC) (CalBiochem) fixado em formalina, morto com calor. A IL-6, IL-12 e IFN-γ foram ensaiadas utilizando um ELISA em formato de sanduíche. Meio do ensaio de esplenócitos de ratinho foi incubado em placas de microtitulação revestidas com anticorpo monoclonal anti-IL-6, anti-IL-12 p40/p70 ou anti-IFN-γ (Nunc). A citocina ligada (IL-6, IL-12 ou IFN-γ) foi detectada utilizando um anticorpo anti-citocina biotinilado (anti-IL-6, anti-IL-12 p40/p70 ou anti-IFN-γ) e um anticorpo secundário conjugado com estreptavidina-peroxidase de rábano, revelada com o substrato cromogénico da peroxidase 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) na presença de peroxidase, e quantificada através da medição da absorvância a 450 nm utilizando um leitor de microplacas de precisão Emax (Molecular Devices). Aos valores de IL-6 inferiores a 45 pg/ml foi-lhes atribuído um valor de 45 pg/ml (i.e., 45=<45). Aos valores de IL-12 p40/p70 inferiores a 36 pg/ml foi-lhes atribuído um valor de 36 pg/ml (i.e., 36=<36). Aos valores de IFN-γ inferiores a 54 pg/ml foi-lhes atribuído um valor de 54 pg/ml (i.e., 54=<54).
As Tabelas 15 e 16 resumem os resultados do ensaio para produção de citocina em resposta a PIM. Os polinucleótidos imunomoduladores contendo um dinucleótido CG estimularam geralmente a secreção de IL-6, IL-12 e IFN-γ por esplenócitos 127
ΕΡ 1 992 635/PT de murídeo independentemente da presença dos motivos mais especializados aqui descritos para elevada indução de IFN-a.
Tabela 15. Ensaio de Esplenócitos de Murideo - IL-6 (pg/ml)
Teste (SEQ ID NO:) ou Controlo Dose (pg/ml) Rep. 1 Rep. 2 Méd. 1 (PIM padrão) 5, 0 4623 4655 4639 O \—1 999 961 980 0,1 47 45 46 2 (não-PIM) 5, 0 45 45 45 1,0 45 45 45 SAC 308 296 302 Meios — — 45 5 5, 0 4755 4653 4704 1,0 1055 985 1020 0,1 45 46 46 20 5, 0 4953 5464 5209 O «·. \—1 1318 1413 1366 \—1 «·. o 90 124 107 19 o LO 4421 4726 4574 1,0 645 740 693 \—1 «·. O 45 45 45 38 5, 0 4267 4350 4309 1,0 613 673 643 0,1 89 160 125 39 5, 0 4775 4819 4797 1,0 802 731 767 0,1 213 147 180 40 5, 0 2644 2217 2431 1,0 341 251 296 0,1 45 45 45 43 5, 0 101 105 103 128
ΕΡ 1 992 635/PT
Teste (SEQ ID NO:) ou Controlo Dose (pg/ml) Rep. 1 Rep. 2 Méd. O \—1 45 45 45 0,1 45 45 45 27 o LO 4809 5245 5027 O \—1 2182 2693 2438 \—1 o 216 242 229 41 o LO 4781 5504 5143 o \—1 1979 2285 2132 \—1 o 316 372 344 42 o LO 2706 3242 2974 o \—1 460 577 519 \—1 o 66 70 68 44 o LO 2458 2585 2522 o \—1 358 321 340 \—1 o 45 45 45 45 o LO 3920 3667 3794 o \—1 1177 1117 1147 \—1 o 45 45 45 46 o LO 45 45 45 1,01 45 45 45 \—1 o 45 45 45 47 o LO 163 213 188 o \—1 45 45 45 \—1 o 45 45 45 48 o LO 182 216 199 o \—1 45 45 45 \—1 o 45 45 45 49 o LO 690 765 728 o \—1 66 73 70 \—1 o 45 45 45 50 o LO 45 45 45 129
ΕΡ 1 992 635/PT
Teste (SEQ ID NO:) ou Controlo Dose (pg/ml) Rep. 1 Rep. 2 Méd. O \—1 45 45 45 0,1 45 45 45 51 o LO 1942 1868 1905 O \—1 224 197 211 \—1 o 45 45 45 52 o LO 1421 1234 1328 o \—1 456 488 472 \—1 o 45 45 45 36 o LO 3656 3834 3745 o \—1 858 991 925 \—1 o 45 45 45 36 o LO 3716 3750 3733 o \—1 897 934 916 \—1 o 45 45 45 37 o LO 4253 4643 4448 o \—1 1256 1218 1237 \—1 o 157 190 174 37 o LO 4457 4323 4390 o \—1 1099 941 1020 \—1 o 88 109 99 130
ΕΡ 1 992 635/PT
Tabela 16. Ensaio de Esplenócitos de Murídeo - IL-12 & IFN-γ IL-12 (pg/ml) IFN-γ (pg/ml) Teste (SEQ ID NO:) ou Controlo Dose (ug/ml) Rep. 1 Rep. 2 Méd. Rep. 1 Rep. 2 Méd. 1 (PIM padrão) O LO 1915 1737 1826 1858 2589 2089 1/0 1419 1424 1422 1941 1954 1948 \—1 «·. O 573 603 588 179 395 287 2 (não-PIM) 5, 0 38 36 37 54 54 54 1/0 36 43 40 54 54 54 SAC 609 620 615 11889 13338 12614 media — — 44 — — 54 5 5, 0 1773 1679 1726 1331 1463 1397 1/0 2099 2193 2146 1878 1811 1845 \—1 «·. o 651 649 650 271 157 214 20 5, 0 1838 2023 1931 2822 3342 3082 1/0 2245 2315 2280 2662 3402 3032 \—1 o 1016 1077 1047 513 1392 953 19 5, 0 1364 1458 1411 1997 2686 2343 1/0 1513 1702 1608 1427 2375 1901 \—1 o 648 597 623 58 54 56 38 5, 0 1822 1870 1846 3168 3851 3510 1/0 1963 2239 2101 3440 3721 3581 0,1 1207 1430 1319 446 1364 905 39 5, 0 2476 2344 2410 3578 3065 3322 O \—1 2856 2504 2680 2415 3497 2956 0,1 2101 2085 2093 1403 1217 1310 40 5, 0 902 797 850 605 502 554 1,0 1244 1216 1230 1116 318 717 \—1 o 304 210 257 54 54 54 43 5, 0 940 720 830 54 54 54 1,0 721 852 787 54 54 54 0,1 37 36 37 54 54 54 131
ΕΡ 1 992 635/PT IL-12 (pg/ml) IFN-γ (pg/ml) Teste (SEQ ID NO:) ou Controlo Dose (ug/ml) Rep. 1 Rep. 2 Méd. Rep. 1 Rep. 2 Méd. 27 O LO 1978 2295 2137 3603 4546 4075 O \—1 1833 2373 2103 3634 4735 4185 \—1 o 1761 1945 1853 2401 2313 2357 41 o LO 1590 1898 1744 3328 4447 3888 o \—1 1611 1910 1761 4197 3402 3800 \—1 o 1738 1853 1796 3030 3016 3023 42 o LO 1507 1887 1697 2747 3203 2975 o \—1 2185 2269 2227 2609 4162 3386 \—1 o 6 69 6 69 6 69 192 206 199 44 o LO 1870 1805 1838 2593 2802 2698 o \—1 2058 1854 1956 1464 1747 1606 \—1 o 235 214 225 54 54 54 45 o LO 1716 1597 1657 2153 1776 1965 o \—1 1341 1175 1258 1567 1368 1468 \—1 o 646 446 546 54 54 54 46 o LO 525 392 459 54 54 54 o \—1 234 132 183 54 54 54 \—1 o 36 36 36 54 54 54 47 o LO 746 738 742 54 54 54 o \—1 757 752 755 54 54 54 \—1 o 59 64 62 54 54 54 48 o LO 578 676 627 54 54 54 o \—1 697 786 742 54 54 54 \—1 o 41 51 46 54 54 54 49 o LO 1095 1288 1192 376 778 577 1,0 1510 1551 1531 54 54 54 \—1 o 79 111 95 54 54 54 50 o LO 586 424 505 54 54 54 o \—1 206 178 192 54 54 54 132 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ IL-12 (pg/ml) IFN-γ (pg/ml) Teste (SEQ ID NO:) ou Controlo Dose (ug/ml) Rep. 1 Rep. 2 Méd. Rep. 1 Rep. 2 Méd. 0,1 39 44 42 54 54 54 51 5, 0 1341 1117 1229 955 1023 989 1,0 1412 1257 1335 426 845 636 0,1 92 75 84 54 54 54 52 5, 0 1855 1557 1706 2408 2107 2258 O \—1 2961 2821 198 4421 5632 5027 0,1 205 245 225 54 934 494 36 5, 0 1717 1656 1687 3390 3338 3364 O \—1 1480 1510 1495 2547 2832 2690 \—1 o 700 571 636 384 264 324 36 5, 0 1478 1565 1522 2281 2200 2241 0 1 1 1293 1235 1264 2073 3112 2593 \—1 o 666 590 628 54 448 251 37 o LO 1679 1918 1799 3240 3748 3494 1,0 1603 1561 1582 3950 4437 4194 0,1 1232 1235 1234 1548 2044 1796 37 5, 0 2064 3202 2633 2419 2631 2525 O \—1 1895 2417 2156 1894 3332 2613 0,1 831 1430 1131 293 530 412
Dos resultados apresentados nas Tabelas 15 e 16, todos os compostos contendo motivos CpG induziram produção de IL-12 a partir de esplenócitos de murídeo e a maioria, mas não todos, os compostos contendo motivos CpG induziram produção de IL-6 e IFN-γ a partir de esplenócitos de murideo. Tal como se pode observar a partir dos resultados apresentados nas Tabela 15 e 16, embora a actividade estimuladora de IL-6, IL-12 e IFN-γ dos polinucleótidos imunoestimuladores nos esplenócitos de murideo seja geralmente dependente da presença de um dinucleótido CG, não parece requerer os motivos mais especializados aqui descritos para elevada indução de IFN-a. 133
ΕΡ 1 992 635/PT
Exemplo 4; Estimulação da expressão génica indutível por interferão através de polinucleótidos imunomoduladores
Tal como aqui demonstrado, os polinucleótidos imunomoduladores podem induzir produção de IFN-γ e/ou IFN-a a partir de PBMC. Os PIM foram ensaiados quanto à actividade em PBMC humanas para indução da expressão de ARNm de qenes de citocinas adicionais, genes de quimiocinas, e outros genes utilizando uma técnica de PCR quantitativa, a técnica TaqMan. Os polinucleótidos testados eram oligodesoxinucleótidos fosforotioato completamente modificados. Entre os polinucleótidos testados estavam SEQ ID N0:1 (controlo positivo) e SEQ ID NO:2 (controlo negativo). PMBC humanas foram preparadas tal como descrito no Exemplo 1. As células foram cultivadas na presença de amostras de teste (PIM ou controlos) a 5 pg/ml durante 24 horas. 0 ARN total foi extraído utilizando o protocolo de Qiagen RNeasy Mini (Qiagen) e convertido em ADNc utilizando oligo dT (Promega), hexâmeros aleatórios (Promega), e SuperScript RT II (InVitrogen) . O ADNc foi diluído 1:10 e a PCR conduzida utilizando QuantiTect SYBR green PCR master mix (Qiagen) e iniciadores nus (sintetizados por Operon) ou QuantiTect probe PCR master mix (Qiagen) e iniciadores PDAR com sondas marcadas (Applied BioSystems). As reacções foram conduzidas utilizando o Detector de Sequências GeneAmp 5700 (PE BioSystems).
Exemplos das sequências para iniciadores sintetizados são como se segue (listados de 5' para 3'):
Ubiquitina (F: CACTTGGTCCTGCGCTTGA (SEQ ID N0:200), R: CAATTGGGAATGCAACAACTTTAT (SEQ ID NO:201)); 2,5-OAS (F: AGGGAGCATGAAAACACATTTCA (SEQ ID NO:202), R: TTGCTGGTAGTTTATGACTAATTCCAAG (SEQ ID NO:203)); GBP-1 (F: TGGAACGTGTGAAAGCTGAGTCT (SEQ ID NO:204), R: CATCTGCTCATTCTTTCTTTGCA (SEQ ID NO:205)); IFN-oc (F: CCCAGGAGGAGTTTGGCAA (SEQ ID NO:206), R: TGCTGGATCATCTCATGGAGG (SEQ ID NO:207)); ISG-54K (F: CTGGACTGGCAATAGCAAGCT (SEQ ID NO:208), R: AGAGGGTCAATGGCGTTCTG (SEQ ID NO:209)); 134 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ MCP-2 (F: CTGCTCATGGCAGCCACTTT (SEQ IDNO:210), R: AGCAGGTGATTGGAATGGAAA (SEQ ID N0:211)); MIG (F: CATCTTGCTGGTTCTGATTGGA (SEQ ID NO:212), R: TGGTGCTGATGCAGGAACAG (SEQ ID NO:213)); TNF-α (F: CTTCTGCCTGCTGCACTTTG (SEQ ID NO:214), R: CTGGGCCAGAGGGCTGAT (SEQ ID NO:215)). IFN-γ, IL-Ια, IL-6, IP-10, MCP-3, e ΜΙΡ-3β, foram medidos utilizando PDAR fornecidos por PE BioSystems. Os valores limiares do ciclo (CT) para cada gene foram normalizados para ubiquitina utilizando a fórmula 1,8 (UBQ_GENE) (100000) , onde UBQ é o CT médio das corridas de ubiquitina em triplicado, GENE é o CT médio de corridas em duplicado do gene de interesse, e 100 000 é escolhido arbitrariamente como um factor para levar todos os valores acima de 0. Ao controlo negativo para cada experiência, estimulação apenas com meio, é atribuído um valor de 1 e todos os dados são expressos como vezes de indução em relação ao controlo negativo. A Tabela 17 resume os resultados do ensaio para expressão génica de citocinas, quimiocinas e proteínas inflamatórias de PBMC em resposta ao PIM SEQ ID NO: 27. Foi também testado o polinucleótido 5'-GGTGCATCGATGCAGGGGGG (SEQ IDNO:154). Os dados são apresentados como a média de vezes de indução em relação ao controlo de meio (dado o valor de 1,0) com EPM. 135
ΕΡ 1 992 635/PT
Tabela 17. Perfil de expressão génica modulada por PIM
Teste ou IL-Ioí IP- 10 MCP-2 MCP- -3 MIG Controlo (SEQ ID NO) média EPM média EPM média EPM média EPM média EPM meio 1,0 0,0 1,0 0,0 1,0 0,0 1,0 0, 0 1,0 0, 0 2 2,0 0,7 0, 6 0,3 0,2 0,1 0,9 0,1 0, 6 0,1 1 1,7 0,4 2,7 0,6 28,3 21,2 3,0 1,0 3, 0 0,9 27 0,4 0,2 94,0 27,5 198,8 59, 6 8,0 2,2 8, 8 2,0 154 0,2 0,1 145,4 65,1 284,8 108,7 8,5 1,4 14,5 7,0 MI P- 3 β 2,5- OAS GBP-1 ISG-54K média EPM média EPM média EPM média EPM meio 1,0 0,0 1,0 0,0 1,0 0,0 1,0 0, 0 2 1,2 0,3 0,7 0,2 1,0 0,1 0,7 0,1 1 2,9 0,9 7,6 3,3 2,5 0, 6 4,9 2,1 27 6,9 1,8 16,5 2,3 5,9 0,4 27,1 2, 6 154 10,5 2,1 15,7 1,3 5,7 1,1 31, 9 2,1
Tal como mostrado na Tabela 17, SEQ ID NO: 27 aumentou fortemente a expressão das quimiocinas IP-10, MCP-2, MCP-3, MIG, e ΜΙΡ-3β. A expressão de IL-Ια diminuiu na presença de SEQ ID NO:27. Adicionalmente, SEQ ID NO:27 aumentou marcadamente a expressão dos genes indutiveis por IFN-a, 2,5-oligoadenilato-sintetase (2,5-OAS), gene-54K que estimula interferão (ISG-54K) e proteína 1 de ligação a guanilato (GBP-1).
Nestes ensaios, o PIM SEQ ID NO:27 não teve qualquer efeito significativo nos níveis de ARNm expresso das citocinas G-CSF, IL-Ιβ, IL-6, IL-12 p40, IL-23, TNF-α, ou das quimiocinas BCA-1, IL-8, LPTN, MCP-1, MDC, ΜΙΡ-la, MlP-lb, MIP-3a, RANTES, e TARC.
Exemplo 5: Estimulação da actividade lítica de células NK através de polinucleótidos imunomoduladores
Os PIM do presente invento estimulam a actividade lítica melhorada das células assassinas naturais (NK) em comparação com um PIM padrão. A actividade lítica das células NK foi 136 ΕΡ 1 992 635/ΡΤ avaliada através da lise de células alvo K562. Resumidamente, foram estimuladas PBMC com 10 mg/ml de PIM (dose óptima previamente obtida) ou polinucleótido de controlo negativo durante 48 horas em cultura. As PBMC tratadas foram então co-cultivadas com células alvo tumorais K562 carregadas com 51Cr a um intervalo de proporções efectorraivo durante 4 horas. O 51Cr libertado após lise celular foi medido através de um contador de cintilações TopCount NXT (Packard) e relatado como contagens por minuto (cpm).
Os resultados da estimulação de células NK de dois dadores diferentes de PBMC são mostrados na Fig. 2. As PIM utilizadas nos ensaios foram SEQ ID NOrl, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:172 e SEQ ID NO:113. O comprimento do palindroma nos PIM é de: 28 bases em SEQ ID NO: 172, 22 bases em SEQ ID NO: 113, 12 bases em SEQ ID NO:27, e 8 bases em SEQ ID NO:l. SEQ ID NO: 90, um controlo não PIM, tem um comprimento de palindroma de 20 bases mas não contém uma sequência 5'-C, G-3'. Nesta experiência, os PIM com palindromas de 12 bases de comprimento ou mais estimularam uma quantidade crescente de actividade litica de células NK em comparação com o padrão PIM SEQ ID N0:1 com um comprimento de palindroma de 8 bases.
Lisboa, 2012-03-07

Claims (11)

  1. ΕΡ 1 992 635/PT 1/2 REIVINDICAÇÕES compreendendo a em que a sequência extremidade 5' do 1. Polinucleótido imunomodulador sequência apresentada em SEQ ID NO:171, apresentada em SEQ ID NO:171 está na polinucleótido.
  2. 2. Polinucleótido imunomodulador de acordo com a reivindicação 1, em que o polinucleótido consiste na sequência apresentada em SEQ ID NO:171.
  3. 3. Polinucleótido imunomodulador de acordo com a reivindicação 1 ou 2 em que os nucleósidos são unidos através de ésteres de fosforotioato.
  4. 4. Composição imunomoduladora compreendendo um polinucleótido imunomodulador de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
  5. 5. Polinucleótido imunomodulador de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 para utilizar na modulação de uma resposta imunitária num indivíduo.
  6. 6. Polinucleótido imunomodulador de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 para utilizar no aumento de interferão-gama (IFN-γ) num indivíduo.
  7. 7. Polinucleótido imunomodulador de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 para utilizar no aumento de interferão-alfa (IFN-oí) num indivíduo.
  8. 8. Polinucleótido imunomodulador de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 para utilizar na melhoria de um sintoma de uma doença infecciosa num indivíduo.
  9. 9. Polinucleótido imunomodulador de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 para utilizar na melhoria de um sintoma de um distúrbio relacionado com IgE num indivíduo.
  10. 10. Utilização de um polinucleótido imunomodulador de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3 para o fabrico de um medicamento para tratamento de asma. ΕΡ 1 992 635/PT 2/2
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