PT1877098E - Conjugados éster de alfa aminoácido - fármaco hidrolisáveis por carboxilesterase - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Conjugados éster de alfa aminoácido - fármaco hidrolisáveis por carboxilesterase" A presente invenção refere-se ao aumento ou prolongamento da actividade de um composto que inibe a actividade da enzima intracelular histona-desacetilase alvo pela conjugação covalente de um motivo éster de alfa-aminoácido ao modulador, mais especificamente a inibidores aos quais um motivo éster de alfa-aminoácido foi covalentemente conjugado, para utilização num método de tratamento do corpo humano ou animal por terapia. A invenção refere-se também a um método para a identificação destes conjugados possuindo propriedades superiores relativamente ao inibidor progenitor não conjugado. A invenção refere-se ainda à utilização de moduladores contendo motivos éster de aminoácido que permitem a acumulação selectiva de conjugados de aminoácidos no interior de células da linhagem monócito-macrófago.

Anterioridade da invenção

Muitas enzimas e receptores intracelulares são alvos para fármacos farmaceuticamente úteis que modulam as suas actividades por ligação aos seus locais activos. Apresentam-se Exemplos na Tabela 1 adiante. Para atingirem as enzimas e receptores alvo, os compostos moduladores têm evidentemente que atravessar a membrana celular a partir do plasma/fluido extracelular. Em geral, os moduladores de carga neutra atravessam a membrana celular mais facilmente do que espécies carregadas. É então estabelecido um equilíbrio dinâmico através do qual o modulador se equilibra entre o plasma e o interior da célula. Em resultado do equilíbrio, os tempos de residência e concentrações intracelulares de muitos moduladores de enzimas e receptores intracelulares são frequentemente muito baixos, especialmente em casos onde o modulador é rapidamente depurado do plasma. As potências dos moduladores são portanto fracas apesar das suas elevadas afinidades de ligação para com a enzima ou o receptor alvos. 2 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ

Seria portanto desejável que estivesse disponível um método para aumentar a concentração intracelular de um determinado modulador de uma enzima ou de um receptor intracelulares. Isto resultaria numa potência acrescida, e por prolongamento da residência do modulador no interior da célula resultariam propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas melhoradas. Seriam conseguidas uma exposição mais consistente e reduzidas frequências de dosagem. Poderia ser obtido um benefício adicional se o fármaco pudesse ser direccionado para as células alvo específicas responsáveis pela sua acção terapêutica, reduzindo a exposição sistémica e portanto os efeitos secundários.

Breve descrição da invenção A presente invenção descreve um tal método, e descreve moduladores melhorados que incorporam os princípios estruturais nos quais o método se baseia. Tira vantagem do facto de que as moléculas lipófilas (baixa polaridade ou carga neutra) passam através da membrana celular e entram nas células com relativa facilidade, e as moléculas hidrófilas (maior polaridade, carregadas) não. Portanto, se um motivo lipófilo for ligado a um determinado modulador, permitindo que o modulador entre na célula, e se esse motivo for convertido na célula num com maior polaridade, é de esperar que o modulador com o motivo de maior polaridade ligado se vá acumular no interior da célula. Desde que um tal motivo esteja ligado ao modulador de uma maneira que não altere o seu modo de ligação à enzima ou ao receptor alvos, é portanto de esperar que a acumulação do modulador com o motivo de maior polaridade ligado resulte numa actividade prolongada e/ou aumentada. A presente invenção refere-se a moduladores que são inibidores de histona-desacetilase. A presente invenção faz uso do facto de haver enzimas carboxilesterases no interior das células, que podem ser utilizadas para hidrolisar um motivo éster de alfa-aminoácido ligado a um determinado modulador no ácido progenitor. Portanto, um modulador pode ser administrado sob a forma de um conjugado covalente com um éster de alfa-aminoácido, forma em que prontamente entra na célula onde é hidrolisado eficientemente por uma ou mais carboxilesterases 3 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ intracelulares, e ο resultante conjugado alfa-aminoácido-modulador acumula-se no interior da célula, aumentando a potência global e/ou o tempo de residência activo. Verificou-se também que por modificação do motivo alfa-aminoácido ou do modo pelo qual este é conjugado, os moduladores podem ser direccionados para monócitos e macrófagos. Aqui, a menos que seja especificado "monócito" ou "monócitos", o termo macrófago ou macrófagos será utilizado para denotar macrófagos (incluindo macrófagos associados a tumores) e/ou monócitos.

Descrição detalhada da invenção

Portanto, num aspecto geral a presente invenção proporciona um conjugado covalente de um éster de alfa-aminoácido e um inibidor da actividade da enzima intracelular histona-desacetilase alvo para utilização num método de tratamento do corpo humano ou animal por terapia, em que: o grupo éster do conjugado é hidrolisável por uma ou mais enzimas carboxilesterase intracelulares no ácido correspondente; o azoto do grupo amino do éster de aminoácido não está ligado directamente a uma porção carbonilo, ou é deixado não substituído; e o éster de alfa-aminoácido é ligado covalentemente ao inibidor numa posição remota relativamente à interface de ligação entre o inibidor e a enzima histona-desacetilase, e/ou é conjugado com o inibidor de maneira a que o modo de ligação do inibidor conjugado e do referido ácido correspondente à enzima histona-desacetilase seja o mesmo que o do inibidor não conjugado; em que a posição de conjugação é remota/o modo de ligação é o mesmo quando o conjugado possui uma potência num ensaio da actividade celular pelo menos tão elevada quanto a do inibidor não conjugado no mesmo ensaio, em que o ensaio da actividade celular é um ensaio de inibição da proliferação celular realizado com células cancerosas U937.

Como indicado, a invenção refere-se à modificação de inibidores de histona-desacetilase. Embora o princípio da invenção seja de aplicação geral, não restrita pela identidade química do inibidor, é fortemente preferido que o inibidor seja um que exerça o seu efeito por ligação reversível à histona-desacetilase alvo, em oposição àqueles cujo efeito se deve a ligação covalente à histona-desacetilase alvo. 4 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ

Uma vez que, para uma utilidade prática, o conjugado hidrolisado por carboxilesterase tem que reter a actividade de ligação intracelular do modulador progenitor à sua enzima histona-desacetilase alvo, a ligação do motivo éster tem que ter em conta esse requisito, o qual será cumprido se o motivo éster de alfa-aminoácido para a carboxilesterase for ligado ao modulador de maneira a que o modo de ligação do correspondente produto da hidrólise pela carboxilesterase (ie o ácido correspondente) ao alvo seja essencialmente o mesmo que o do modulador não conjugado. Em geral isto é conseguido por ligação covalente do motivo éster para a carboxilesterase ao modulador numa posição remota relativamente à interface de ligação entre o modulador e a enzima histona-desacetilase alvo. Desta maneira, o motivo é disposto de modo a estender-se ao solvente, em vez de potencialmente interferir com o modo de ligação.

Em adição, o motivo aminoácido para a carboxilesterase obviamente tem que ser um substrato para a carboxilesterase se o primeiro vai ser hidrolisado por esta última no interior da célula. As carboxilesterases intracelulares são bastante promíscuas em geral, na medida em que a sua capacidade para hidrolisar não depende de requisitos estruturais muito restritos do substrato éster de aminoácido. Portanto, a maioria dos modos de conjugação covalente do motivo aminoácido para a carboxilesterase a um modulador irão permitir a hidrólise. A ligação através de uma cadeia ligante flexível será como normalmente isso é conseguido.

Será notado que qualquer modificação química de um fármaco pode subtilmente alterar a sua geometria de ligação, e a estratégia química para a ligação do motivo éster para a carboxilesterase pode introduzir interacções de ligação adicionais com o alvo, ou pode substituir uma ou mais dessas interacções. Portanto o requisito do modo de ligação do conjugado hidrolisado ao alvo ser o mesmo que o do modulador não conjugado deve ser interpretado como requerendo que não haja perturbação significativa do modo de ligação, por outras palavras, que o modo de ligação seja essencialmente o mesmo que o do modulador não conjugado. Quando o requisito é cumprido, as principais características de ligação do 5 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ modulador progenitor são retidas, e os moduladores modificados e não modificados têm um conjunto global comum de caracteristicas de ligação. Os pontos de vista de "mesmo modo de ligação" e "ligação remota" são similares, porque, como acima referido, a maneira usual de conseguir o requisito de "mesmo modo de ligação" consiste em ligar o motivo para a carboxilesterase num ponto na molécula moduladora que é remoto relativamente à interface de ligação entre o inibidor e a enzima histona-desacetilase alvo. Contudo, deverá notar-se que estes requisitos não implicam que o conjugado e/ou o seu correspondente ácido tenham que ter a mesma potência moduladora in vitro ou in vivo que o modulador progenitor. Como aqui se utilizam, contudo, as caracteristicas de 'mesmo modo de ligação' e 'ligação remota' são consideradas cumpridas quando o éster tem uma potência num ensaio de actividade celular pelo menos tão elevada quanto a do modulador progenitor no mesmo ensaio, sendo o ensaio celular um ensaio de proliferação celular realizado com células cancerosas U937. Em geral, prefere-se que o ácido carboxilico hidrolisado por esterases tenha uma potência num ensaio de inibição de histona-desacetilase in vitro não inferior a um décimo da potência do modulador progenitor nesse ensaio.

Embora os métodos de química médica tradicionais de mapeamento das relações estrutura-actividade sejam perfeitamente capazes de identificar uma estratégia de ligação que vá ao encontro dos requisitos de "mesmo modo de ligação" e "ligação remota" anteriores, técnicas modernas tais como RMN e cristalografia de raios-X avançaram ao ponto em que é muito comum o modo de ligação de um inibidor conhecido de histona-desacetilase ser conhecido, ou determinável. Essa informação está na grande maioria dos casos no domínio público, ou pode ser modelada utilizando métodos de modelação baseados em computador, tais como atracagem de ligandos ("ligand docking") e modelação de homologia, baseados nos modos de ligação conhecidos de moduladores estruturalmente similares, ou na estrutura conhecida do local activo da histona-desacetilase. Com o conhecimento do modo de ligação do modulador obtido por estas técnicas, pode ser identificada uma localização adequada para ligação do motivo éster para a carboxilesterase, usualmente (como referido acima) num ponto no modulador que é 6 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ remoto relativamente à interface de ligação entre o inibidor e a enzima histona-desacetilase alvo.

As enzimas carboxilesterase intracelulares capazes de hidrolisar o grupo éster do alfa-aminoácido conjugado no ácido correspondente incluem os três isotipos conhecidos da enzima carboxilesterase humana ("hCE"), hCE-1 (também conhecida como CES-1), hCE-2 (também conhecida como CES-2) e hCE-3 (Drug Disc. Today 2005, 10, 313-325) . Embora estas sejam consideradas as principais enzimas, outras enzimas para carboxiléster tais como a bifenil-hidrolase (BPH), podem também ter um papel na hidrólise dos conjugados. O ensaio em células lisadas que se descreve adiante é um método simples de confirmação de que um determinado conjugado de modulador e éster de alfa-aminoácido, ou um determinado éster de alfa-aminoácido a avaliar como possível motivo éster para a carboxilesterase, é hidrolisado conforme requerido. Estas enzimas podem também ser prontamente expressas utilizando técnicas recombinantes, e as enzimas recombinantes podem ser utilizadas para determinar ou confirmar que ocorre hidrólise. É uma característica da invenção o facto de o conjugado desejado reter o motivo alfa-aminoácido ligado covalentemente quando hidrolisado pela(s) carboxilesterase(s) no interior da célula, pois é o grupo carboxilo polar desse motivo que previne ou reduz a depuração do conjugado hidrolisado da célula, e desse modo contribui para a sua acumulação no interior da célula. De facto, a potência celular do modulador modificado é predominantemente devida à acumulação do ácido e sua modulação da actividade do alvo (embora o éster não hidrolisado também exerça a sua actividade sobre o alvo enquanto permanece por hidrolisar). Como as células em geral contêm vários tipos de enzimas peptidase, é preferível que o conjugado, ou mais especialmente o conjugado hidrolisado (o ácido correspondente), não seja um substrato para essas peptidases. Em particular, é fortemente preferido que o grupo éster de alfa-aminoácido não seja o elemento C-terminal de um motivo dipeptídico no conjugado. Contudo, para além dessa limitação do modo de ligação covalente, o grupo éster de alfa-aminoácido pode ser covalentemente ligado ao modulador por via 7 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ do seu grupo amino ou por via do seu carbono alfa. Em alguns casos o modulador terá um ponto de ligação conveniente para o motivo éster para a carboxilesterase, e em outros casos terá gue ser pensada uma estratégia de síntese para a sua ligação.

Verificou-se gue células gue apenas expressam as carboxilesterases hCE-2, e/ou hCE-3 e formas recombinantes destas enzimas, apenas irão hidrolisar conjugados de éster de aminoácido nos seus ácidos resultantes se o azoto do grupo alfa-aminoácido, não estiver substituído ou estiver directamente ligado a um grupo carbonilo, enguanto células contendo hCE-1, ou hCE-1 recombinante podem hidrolisar conjugados de aminoácidos com uma ampla gama de grupos no azoto. Este requisito de selectividade de hCE-2 e hCE-3 pode ser tornado uma vantagem quando é necessário que o modulador tenha como alvo enzimas ou receptores em determinados tipos de células apenas. Verificou-se que as quantidades relativas destas três enzimas carboxilesterase variam entre tipos de células (veja-se a Figura 1 e a base de dados em http:/symatlas.gnf.org/SymAtlas (note-se que nesta base de dados hCE3/CES3 é referida pelo símbolo FLJ21736)). Quando se pretende que o modulador actue apenas em tipos de células onde se encontra hCE-1, a ligação de um motivo éster para a carboxilesterase em que o grupo amino está directamente ligado a um grupo outro que não carbonilo resulta na acumulação do conjugado de modulador hidrolisado preferencial em células com concentrações eficazes de hCE-1. Dito de outro modo, a acumulação específica do ácido derivado do conjugado de modulador em células que expressam hCE-1 é conseguida pela ligação do motivo éster de aminoácido ao modulador de uma maneira tal que o átomo de azoto do éster de aminoácido não esteja ligado directamente a um carbonilo, ou seja deixado não substituído.

Sabe-se que os macrófagos desempenham um papel chave em desordens inflamatórias através da libertação de citoquinas, em particular TNFa e IL-1 (van Roon et al., Arthritis and Rheumatism, 2003, 1229-1238). Na artrite reumatóide são os principais contribuidores para a inflamação das articulações e para a destruição das articulações (Conell em N. Eng J. Med. 2004, 350, 2591-2602). Os macrófagos estão também envolvidos no crescimento e desenvolvimento de tumores (Naldini e Carraro 8 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ em Curr Drug Targets Inflamm Allergy, 2005, 3-8 ) . Portanto, os agentes que selectivamente têm como alvo células macrófagos podem ter valor no tratamento do cancro, inflamação e doença auto-imune. Atingir tipos de células específicos será de esperar que conduza a efeitos secundários reduzidos. A presente invenção permite um método para direccionar moduladores para macrófagos, que se baseia na observação anterior de que a maneira como o motivo éster para a carboxilesterase se liga ao modulador determina se este é hidrolisado por carboxilesterases específicas, e portanto se o ácido resultante se acumula ou não em diferentes tipos de células. Especificamente, verificou-se que os macrófagos contêm a carboxilesterase humana hCE-1 enquanto outros tipos de células não. Nos conjugados da invenção, o azoto do motivo éster está substituído mas não directamente ligado a uma porção grupo carbonilo de modo que o éster será apenas hidrolisado por hCE-1 e portanto os conjugados de modulador hidrolisado por esterase apenas se irão acumular em macrófagos.

Existem evidentemente muitos grupos éster possíveis que podem, em princípio, estar presentes no motivo éster para a carboxilesterase para ligação ao modulador. Do mesmo modo, existem muitos alfa-aminoácidos, tanto naturais como não naturais, que diferem na cadeia lateral no carbono alfa, que podem ser utilizados como ésteres no motivo éster para a carboxilesterase. Alguns ésteres de alfa-aminoácidos são rapidamente hidrolisados por um ou mais dos isotipos hCE-1, -2 e -3, ou células contendo estas enzimas, enquanto outros são mais lentamente hidrolisados, ou são hidrolisados apenas numa extensão muito pequena. Em geral, se a carboxilesterase hidrolisa o éster de aminoácido livre no ácido progenitor, irá, sujeito à dependência do N-carbonilo de hCE-2 e hCE-3 acima discutida, também hidrolisar o motivo éster quando covalentemente conjugado com o modulador. Portanto, o ensaio das células lisadas e/ou o ensaio da carboxilesterase isolada aqui descritos proporcionam um primeiro rastreio directo, rápido e simples para ésteres que possuem o perfil requerido de hidrólise. Os motivos éster seleccionados desta maneira podem então ser novamente ensaiados no mesmo ensaio da carboxilesterase quando conjugados com o modulador por via da química de conjugação escolhida, para confirmar que são ainda 9 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ um substrato para a carboxilesterase nesse contexto. Os tipos adequados de ésteres serão discutidos adiante, mas neste ponto pode-se mencionar que se verificou que os ésteres t-butilicos de alfa-aminoácidos são substratos relativamente fracos para hCE-1, -2 e -3, enquanto os ésteres ciclopentílicos são eficazmente hidrolisados. Os alfa-aminoácidos adequados serão também discutidos com mais detalhes adiante, mas neste ponto pode-se mencionar que a fenilalanina, a homofenilalanina, a fenilglicina e a leucina são geralmente adequados, e são preferidos ésteres de álcoois secundários.

Como indicado acima, o éster de alfa-aminoácido pode ser conjugado com o modulador através do grupo amino do éster de aminoácido, ou através do carbono alfa (por exemplo, através da sua cadeia lateral) do éster de aminoácido. Pode estar presente um radical ligante entre o motivo éster para a carboxilesterase e o modulador. Por exemplo, o éster de alfa-aminoácido pode ser conjugado com o modulador na forma de um radical de fórmula (IA), (IB) ou (IC): em que

Ri é um grupo éster que é hidrolisável por uma ou mais enzimas carboxilesterase intracelulares num grupo ácido carboxílico; R2 é a cadeia lateral de um alf a-aminoácido natural ou não natural; R4 é hidrogénio; ou alquilo C1-C6 , cicloalquilo C3-C7, arilo ou heteroarilo, opcionalmente substituídos; 10 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ Β é um anel heterocíclico monocíclico de 5 ou 6 átomos no anel em que Ri está ligado a um carbono do anel adjacente ao azoto do anel mostrado, e o anel B está opcionalmente fundido com um segundo anel carbociclico ou heterocíclico de 5 ou 6 átomos no anel, caso em que a ligação a L pode ser a partir de um átomo do anel no referido segundo anel Y é uma ligação, -C(=S)-NR3-, -C(=NH)NR3- ou -S(=0)2NR3- em que r3 é hidrogénio ou alquilo Ci-C6 opcionalmente substituído; Y1 é uma ligação, -(C=0)-, -S(C>2)-, -C(=0)0-, -0C(=0)-, -(C=0)NR3-, -NR3(C=0)-, -S(02)NR3-, -NR3S(02)- ou -NR3 (C=0)NR5-, em que R3 e r5 são, independentemente, hidrogénio ou alquilo (Ci-Cô) opcionalmente substituído, L é um radical bivalente de fórmula - (Alk1)m(Q) n (Alk2) p- em que m, n e p são independentemente 0 ou 1, Q é (i) um radical bivalente carbociclico ou heterocíclico, mono- ou bicíclico, opcionalmente substituído, possuindo 5-13 membros no anel, ou (ii), no caso em que ambos de m e p são 0, um radical bivalente de fórmula -X2-Q2- ou -Q2-X2- em que X2 é -O-, -S- ou NRA- onde RA é hidrogénio ou alquilo C1-C3 opcionalmente substituído, e Q1 é um radical bivalente carbociclico ou heterocíclico, mono- ou bicíclico, opcionalmente substituído, possuindo 5-13 membros no anel,

Alk1 e Alk2 representam, independentemente, radicais cicloalquilo C3-C7 bivalentes opcionalmente substituídos, ou radicais alquileno Ci-Cê, alcenileno C2-C6 ou alcinileno C2-C6 lineares ou ramificados, opcionalmente substituídos, que podem opcionalmente conter ou terminar em uma ligação éter (-0-), tioéter (-S-) ou amino (-NRA-) em que RA é hidrogénio ou alquilo C1-C3 opcionalmente substituído; X representa uma ligação, -C(=0)-; -S(=0)2-; -NR3C(=0)-, —C (=0) NR3 —, -NR3C(=0)NR5-, -NR3S(=0)2- OU -S(=0)2NR3- em que r3 e R5 são independentemente hidrogénio ou alquilo Cq-C6 opcionalmente substituído; z é 0 ou 1; s é 0 ou 1; e 11 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ

Alk3 representa um radical cicloalquilo C3-C7 bivalente opcionalmente substituído, ou um radical alquileno Ci-C6, alcenileno C2-C6, ou alcinileno C2-C6 lineares ou ramificados opcionalmente substituídos que podem opcionalmente conter ou terminar em uma ligação éter (-0-), tioéter (-S-) ou amino (-NRA-) em que RA é hidrogénio ou alquilo C1-C3 opcionalmente substituído; em que o átomo de azoto do grupo amino do éster de aminoácido não está ligado directamente a uma porção carbonilo ou é deixado não substituído. 0 termo "éster" ou a expressão "grupo carboxilo esterifiçado" significam um grupo Rg0(C=0)- em que R9 é o grupo que caracteriza o éster, conceptualmente derivado do álcool RgOH.

Como aqui se utiliza, o termo "alquilo (Ca-Cb) " em que a e b são números inteiros, refere-se a um radical alquilo de cadeia linear ou ramificada possuindo de a a b átomos de carbono. Assim, quando a é 1 e b é 6, por exemplo, o termo inclui metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, t-butilo, n-pentilo e n-hexilo.

Como aqui se utiliza, o termo "radical alquileno (Ca-Ct>) bivalente" em que a e b são números inteiros, refere-se a uma cadeia hidrocarboneto saturada possuindo de a a b átomos de carbono e duas valências insatisfeitas.

Como aqui se utiliza, o termo "alcenilo (Ca-Cb) " em que a e b são números inteiros refere-se a uma porção alcenilo de cadeia linear ou ramificada possuindo de a a b átomos de carbono possuindo pelo menos uma ligação dupla de estereoquímica E ou Z quando aplicável. 0 termo inclui, por exemplo, vinilo, alilo, 1- e 2-butenilo e 2-metil-2-propenilo.

Como aqui se utiliza, o termo "radical alcenileno (Ca-Cb) bivalente" significa uma cadeia hidrocarboneto possuindo de a a b átomos de carbono, pelo menos uma ligação dupla, e duas valências insatisfeitas.

Como aqui se utiliza, o termo "alcinilo Ca-Cb" em que a e b são números inteiros, refere-se a grupos hidrocarboneto de 12 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ cadeia linear ou cadeia ramificada possuindo de dois a seis átomos de carbono e possuindo, em adição, uma ligação tripla. Este termo incluirá, por exemplo, etinilo, 1-propinilo, 1- e 2-butinilo, 2-metil-2-propinilo, 2-pentinilo, 3-pentinilo, 4-pentinilo, 2-hexinilo, 3-hexinilo, 4-hexinilo e 5-hexinilo.

Como aqui se utiliza, o termo "radical alcinileno (Ca-Cb) bivalente" em que a e b são números inteiros, refere-se a uma cadeia hidrocarboneto bivalente possuindo de 2 a 6 átomos de carbono, e pelo menos uma ligação tripla.

Como aqui se utiliza, o termo "carbocíclico" refere-se a um radical mono-, bi- ou triciclico possuindo até 16 átomos no anel, em que todos são carbono, e inclui arilo e cicloalquilo.

Como aqui se utiliza, o termo "cicloalquilo" refere-se a um radical carbocíclico monocíclico saturado possuindo de 3-8 átomos de carbono e inclui, por exemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclo-hexilo, ciclo-heptilo e ciclo-octilo.

Como aqui se utiliza, o termo "arilo" sem qualificação refere-se a um radical carbocíclico aromático mono-, bi- ou tri-cíclico, e inclui radicais possuindo dois anéis carbocíclicos aromáticos monocíclicos que estão ligados directamente por uma ligação covalente. São ilustrativos destes radicais o fenilo, o bifenilo e o naftilo.

Como aqui se utiliza, o termo "heteroarilo" sem qualificação refere-se a um radical aromático mono-, bi- ou tri-cíclico contendo um ou mais heteroátomos seleccionados entre S, N e 0, e inclui radicais possuindo dois destes anéis monocíclicos, ou um destes anéis monocíclicos e um anel arilo monocíclico, que estão ligados directamente por uma ligação covalente. São ilustrativos destes radicais tienilo, benztienilo, furilo, benzfurilo, pirrolilo, imidazolilo, benzimidazolilo, tiazolilo, benztiazolilo, isotiazolilo, benzisotiazolilo, pirazolilo, oxazolilo, benzoxazolilo, isoxazolilo, benzisoxazolilo, isotiazolilo, triazolilo, benztriazolilo, tiadiazolilo, oxadiazolilo, piridinilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, triazinilo, indolilo e indazolilo. 13 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ

Como aqui se utilizam, os termos "heterociclilo" ou "heterociclico", sem qualificação, incluem "heteroarilo" como definido acima, e no seu significado não aromático referem-se a um radical não aromático mono-, bi- ou tri-ciclico contendo um ou mais heteroátomos seleccionados entre S, N e 0, e a grupos consistindo em um radical não aromático monociclico contendo um ou mais destes heteroátomos que está covalentemente ligado a outro destes radicais ou a um radical carbociclico monociclico. São ilustrativos destes radicais os grupos pirrolilo, furanilo, tienilo, piperidinilo, imidazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, tiazolilo, tiadiazolilo, pirazolilo, piridinilo, pirrolidinilo, pirimidinilo, morfolinilo, piperazinilo, indolilo, morfolinilo, benzfuranilo, piranilo, isoxazolilo, benzimidazolilo, metilenodioxifenilo, etilenodioxifenilo, maleimido e succinimido. A menos que de outro modo especificado no contexto em que ocorre, o termo "substituído" aplicado aqui a qualquer porção significa substituído com até quatro substituintes compatíveis, cada um podendo ser, independentemente, por exemplo, alquilo (Ci-Cõ) , alcoxi (Ci-Cê) , hidroxi, hidroxialquilo (Ci-Cõ) , mercapto, mercaptoalquilo (Ci-Cê) , alquiltio (Ci-Cõ), fenilo, halo (incluindo fluoro, bromo e cloro), trifluorometilo, trifluorometoxi, nitro, nitrilo (-CN) , oxo, -COOH, -COORa, -CORa, -so2ra, -CONH2, -S02NH2, -CONH ra, -so2nhra, -conrarb, -so2nrarb, -nh2, -nhra, -nrarb, -oconh2, -oconhra, -oconrarb, -nhcora, -nhcoora, -nrbcoora, -nhso2ora, -nrbso2oh, -nrbso2ora, -nhconh2, -nraconh2, -nhconhrb, -nraconhrb , -NHCONRaRb ou -NRaCONRaRb em que RA e RB são, independentemente, um alquilo (Ci-Cê) , cicloalquilo (Cs-Ce) , fenilo ou heteroarilo monociclico possuindo 5 ou 6 átomos no anel. Um "substituinte opcional" pode ser um dos grupos substituintes anteriores. A expressão "cadeia lateral de um alfa-aminoácido natural ou não natural" refere-se ao grupo R1 num aminoácido natural ou não natural de fórmula NH2-CH (R1)-COOH.

Os exemplos de cadeias laterais de alfa-aminoácidos naturais incluem as de alanina, arginina, asparagina, ácido 14 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ aspártico, cisteína, cistina, ácido glutâmico, histidina, 5-hidroxilisina, 4-hidroxiprolina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofano, tirosina, valina, ácido α-aminoadípico, ácido a-amino-n-butírico, 3,4-di-hidroxifenilalanina, homosserina, a-metilserina, ornitina, ácido pipecólico e tiroxina.

Os alfa-aminoácidos naturais que contêm substituintes funcionais, por exemplo grupos amino, carboxilo, hidroxi, mercapto, guanidilo, imidazolilo ou indolilo nas suas cadeias laterais caracteristicas incluem arginina, lisina, ácido glutâmico, ácido aspártico, triptofano, histidina, serina, treonina, tirosina e cisteína. Quando R2 nos compostos da invenção é uma destas cadeias laterais, o substituinte funcional pode ser opcionalmente protegido. 0 termo "protegido" quando utilizado em relação a um substituinte funcional numa cadeia lateral de um alfa-aminoácido natural, significa um derivado de um destes substituintes que substancialmente não é funcional. Por exemplo, os grupos carboxilo podem ser esterifiçados (por exemplo sob a forma de um éster de alquilo Ci-Cg), os grupos amino podem ser convertidos em amidas (por exemplo sob a forma de uma NHCO-alquil C1-C6 amida) ou carbamatos (por exemplo sob a forma de um carbamato de NHC (=0) 0-alquilo Ci-C6 ou de NHC(=0)0CH2Ph) , os grupos hidroxilo podem ser convertidos em éteres (por exemplo um éter 0-alquilo Ci-C6 ou um 0(alquil C2-C6)fenilo) ou ésteres (por exemplo um éster OC(=0)-alquilo C2-C6) e os grupos tiol podem ser convertidos em tioéteres (por exemplo um tioéter de terc-butilo ou de benzilo) ou tioésteres (por exemplo um tioéster SC(=0)-alquilo Ci-C6) .

Os exemplos de cadeias laterais de alfa-aminoácidos não naturais incluem os referidos adiante na discussão de grupos R2 adequados para utilização em compostos da presente invenção. O grupo éster Rí

Em adição ao requisito de que o grupo éster tem que ser hidrolisável por uma ou mais enzimas intracelulares, pode ser preferível para algumas aplicações (por exemplo para 15 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ administração sistémica do conjugado) que seja resistente à hidrólise por enzimas hidrolisantes de carboxiléster no plasma, pois isto assegura que o modulador conjugado irá sobreviver após administração sistémica durante tempo suficiente para penetrar nas células sob a forma do éster. É simples testar um qualquer determinado conjugado para medir a sua semivida no plasma sob a forma do éster, por incubação no plasma. Contudo, verificou-se que os ésteres conceptualmente derivados de álcoois secundários são mais estáveis relativamente às enzimas hidrolisantes de carboxiléster do plasma do que os que são derivados de álcoois primários.

Adicionalmente, também se verificou que embora os ésteres conceptualmente derivados de álcoois terciários sejam geralmente estáveis relativamente a enzimas hidrolisantes de carboxiléster do plasma, são frequentemente também relativamente estáveis relativamente a carboxilesterases intracelulares. Tendo em conta estas verificações, é presentemente preferido que Ri nas fórmulas (IA), (IB) e (IC) acima, seja um grupo éster de fórmula -(C=0)0Rg em que R9 é (i) R7R8CH- em que R7 é alquil (C1-C3) - (Z1) a-alquilo (C1-C3)- ou alcenil (C2-C3) - (Z1) a-alquilo (C1-C3)- em que a é 0 ou 1 e Z1 é -0-, -S- ou -NH-, opcionalmente substituídos, e R8 é hidrogénio ou alquilo (C1-C3)- ou R7 e R8 tomados em conjunto com o carbono ao qual estão ligados formam um anel cicloalquilo C3-C7 opcionalmente substituído ou um anel heterocíclico opcionalmente substituído de 5 ou 6 átomos no anel; ou (ii) fenilo ou um anel heterocíclico monocíclico possuindo 5 ou 6 átomos no anel, opcionalmente substituídos. Dentro destas classes, R9 pode ser, por exemplo, metilo, etilo, n- ou iso-propilo, n- ou sec-butilo, ciclo-hexilo, alilo, fenilo, benzilo, 2-, 3- ou 4-piridilmetilo, N- metilpiperidin-4-ilo, tetra-hidrofuran-3-ilo ou metoxietilo. Presentemente prefere-se que Rg seja ciclopentilo. A cadeia lateral de aminoácido R2

Sujeito ao requisito de que o grupo éster R7 seja hidrolisável por enzimas carboxilesterase intracelulares, a selecção do grupo da cadeia lateral R2 pode determinar a velocidade da hidrólise. Por exemplo, quando o carbono no R2 adjacente ao carbono alfa do aminoácido não contém uma ramificação eg quando R2 é etilo, isobutilo ou benzilo, o 16 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ éster é mais prontamente hidrolisado do que quando R2 é ramificado eg isopropilo ou t-butilo.

Os exemplos de cadeias laterais de aminoácidos incluem grupos alquilo C1-C6, fenilo, 2-, 3- ou 4-hidroxifenilo, 2-, 3- ou 4-metoxifenilo, 2-, 3- ou 4-piridilmetilo, benzilo, feniletilo, 2-, 3- ou 4-hidroxibenzilo, 2,- 3- ou 4- benziloxibenzilo, 2-, 3- ou 4-alcoxibenzilo Ci-C6 e benziloxi (alquilo Ci-Cô) ; o grupo caracterizante de um α-aminoácido natural, em que qualquer grupo funcional pode estar protegido; grupos -[Alk]nR6 onde Alk é um grupo alquilo (Ci-Cô) ou alcenilo (C2-C6) opcionalmente interrompidos por um ou mais átomos -0- ou -S- ou grupos -N(R7)- [onde R7 é um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo (Ci-Cê) ] , n é 0 ou 1, e Rê é um grupo cicloalquilo ou cicloalcenilo, opcionalmente substituídos; um grupo benzilo substituído no anel fenilo por um grupo de fórmula -OCH2COR8 onde Rg é hidroxilo, amino, alcoxi (Ci-Cê) , fenilalcoxi (Ci-Cõ) , alquilamino (Ci-Cê) , di(alquil (Ci-

Ce))amino, fenilalquilamino (Ci-Cõ) , o resíduo de um aminoácido ou halogeneto de ácido, um seu derivado éster ou amida, estando o referido resíduo ligado através de uma ligação amida, sendo o referido aminoácido seleccionado entre glicina, a- ou β-alanina, valina, leucina, isoleucina, fenilalanina, tirosina, triptofano, serina, treonina, cisteína, metionina, asparagina, glutamina, lisina, histidina, arginina, ácido glutâmico e ácido aspártico; um grupo alquil (Ci-C6)-heterocíclico, quer não substituído quer mono- ou di-substituído no anel heterocíclico com halo, nitro, carboxi, alcoxi (Ci-C6) , ciano, alcanoílo (Ci-C6) , trifluorometil-alquilo (Ci-C6) , hidroxi, formilo, amino, alquilamino (Ci-C6) , di-alquilamino (Ci-C6) , mercapto, alquiltio (Ci-Cõ) , hidroxialquilo (Ci~C6) , mercaptoalquilo (Ci-C6) ou alquil (Ci-C6)fenilmetilo; e um grupo -CRaRbRc em que: 17 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ cada um de Ra, Rb e Rc é independentemente hidrogénio, alquilo (Ci-C6) , alcenilo (C2-C6), alcinilo (C2-C6) , fenilalquilo (Ci-C6) , cicloalquilo (C3-C8) ; ou

Rc é hidrogénio e Ra e Rb são, independentemente, fenilo ou heteroarilo tal como piridilo; ou

Rc é hidrogénio, alquilo (Ci-C6) , alcenilo (C2-C6) , alcinilo (C2-C6) , fenilalquilo (Ci-Cõ) , ou cicloalquilo (C3-Cs) , e Ra e Rb em conjunto com o átomo de carbono ao qual estão ligados formam um cicloalquilo de 3 a 8 membros ou um anel heterociclico de 5 a 6 membros; ou

Ra, Rb e Rc em conjunto com o átomo de carbono ao qual estão ligados formam um anel triciclico (por exemplo adamantilo); ou

Ra e Rb são, cada um independentemente, alquilo (C2-Ce), alcenilo (C2-Ce) , alcinilo (02-0ε) , fenilalquilo (Ci-C6> , ou um grupo como definido para Rc adiante, outro que não hidrogénio, ou Ra e Rb em conjunto com o átomo de carbono ao qual estão ligados formam um cicloalquilo ou um anel heterociclico, e Rc é hidrogénio, -OH, -SH, halogéneo, -CN, -C02H, perf luoroalquilo (C1-C4) , -CH2OH, -C02- alquilo (Οι-Οε) , -O-alquilo (Οι-Οε) , -O-alcenilo (02-0β) , -S-alquilo (Ci-C6) , -SO-alquilo (Ci-C6) , -S02-alquilo (Ci-Ce) , -S-alcenilo (02-0β) , -SO-alcenilo (02-0β) , -S02_ alcenilo (C2-C6> ou um grupo -Q-W em que Q representa uma ligação ou -0-, -S-, -S0- ou -S02- e W representa um grupo fenilo, fenilalquilo, cicloalquilo (C3-C8), cicloalquil-alquilo (C3-C8) , cicloalcenilo (C4-C8), cicloalcenil-alquilo (C4-C8) , heteroarilo ou heteroarilalquilo, em que o grupo W pode opcionalmente estar substituído com um ou mais substituintes independentemente seleccionados entre, hidroxilo, halogéneo, -CN, -C02H, -C02-alquilo (Ci-C6) , -C0NH2, -CONH-alquilo (Ci-Cõ) , -CONH (alquilo Ci-C6)2, -CHO, -CH20H, perf luoroalquilo (Ci-C4) , -O-alquilo (Ci-C6) , -S- alquilo (Ci-C6) , -SO-alquilo (Ci-C6) , -S02-alquilo (Ci-C6) , -N02, -NH2, -NH-alquilo (Ci-C6), -N (alquilo (Ci-C6))2r -NHCO-alquilo (Ci-C6), alquilo (Ci-C6), alcenilo (C2-C6) , alcinilo (C2-C6) , cicloalquilo (C3-C8) , cicloalcenilo (C4-Cs) , fenilo ou benzilo. 18 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ

Os exemplos de grupos R2 particulares incluem benzilo, fenilo, ciclo-hexilmetilo, piridin-3-ilmetilo, terc-butoximetilo, iso-butilo, sec-butilo, terc-butilo, l-benziltio-l-metiletilo, 1-metiltio-l-metiletilo e 1-mercapto-1-metiletilo, feniletilo. Presentemente os grupos r2 preferidos incluem fenilo, benzilo, terc-butoximetilo, feniletilo e iso-butilo. O grupo R4 R4 pode ser alquilo Ci~Ce, cicloalquilo C3-C7, arilo ou heteroarilo, opcionalmente substituídos, por exemplo metilo, etilo, n- ou iso-propilo, ciclopropilo, ciclopentilo, ciclo-hexilo, fenilo ou piridilo.

O anel ou sistema de anel B 0 anel ou sistema de anel B podem ser escolhidos de entre, por exemplo, os seguintes:

O radical -Y-L-X-[CH2] z~

Quando o éster de alfa-aminoácido está conjugado com o inibidor sob a forma de um radical de fórmula (IA), este radical (ou ligação) surge da estratégia química particular escolhida para ligar o motivo éster de aminoácido RiCH(R2)NH-ao modulador. Evidentemente a estratégia química para esse acoplamento pode variar amplamente, e portanto são possíveis muitas combinações das variáveis Y, L, X e z.

Deve também notar-se que os benefícios do motivo de éster aminoácido para a carboxilesterase descrito acima (fácil de entrar na célula, hidrólise pela carboxilesterase no interior da célula e acumulação no interior da célula de produto da 19 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ hidrólise, ácido carboxilico activo) são mais bem conseguidos quando a ligação entre o motivo éster de aminoácido e o modulador não é um substrato para a actividade de peptidase no interior da célula, o que pode resultar na clivagem do aminoácido da molécula. É evidente que a estabilidade relativamente às peptidases intracelulares é facilmente testada por incubação do composto com o conteúdo de células lisadas e análise quanto a esta clivagem.

Com as observações gerais anteriores em mente, tomando as variáveis que constroem o radical -Y-L-X-[0¾] z-, uma de cada vez: z pode ser 0 ou 1, de modo a que seja opcional um radical metileno ligado ao modulador.

Os exemplos específicos preferidos de Y incluem uma ligação.

No radical L, os exemplos de radicais Alk1 e Alk2 , quando presentes, incluem —ch2-, -ch2ch2- -ch2ch2ch2-, -ch2ch2ch2ch2-, -ch=ch-, -ch=chch2-, -ch2ch=ch-, ch2ch=chch2-, -c=c-, -c=cch2-, CH2C=C- e CH2C^CCH2. Exemplos adicionais de Alk1 e Alk2 incluem -CH2W-, -CH2CH2W- -CH2CH2WCH2-, -CH2CH2WCH (CH3) -, -CH2WCH2CH2-, -CH2WCH2CH2WCH2- e -WCH2CH2- onde W é -0-, -S-, -NH-, -N(CH3)- ou -CH2CH2N(CH2CH2OH) CH2-. Outros exemplos de Alk1 e Alk2 incluem radicais ciclopropilo, ciclopentilo e ciclo-hexilo bivalentes.

Em L, quando n é 0, o radical é uma cadeia hidrocarboneto (opcionalmente substituída e talvez possuindo uma ligação éter, tioéter ou amino). Presentemente prefere-se que não haja substituintes opcionais em L. Quando m e p são ambos 0, L é um radical carbocíclico ou heterocíclico mono- ou bicíclico bivalente com 5-13 átomos no anel (opcionalmente substituído). Quando n é 1 e pelo menos um de m e p é 1, L é um radical bivalente incluindo uma cadeia ou cadeias hidrocarboneto e um radical carbocíclico ou heterocíclico mono- ou bicíclico com 5-13 átomos no anel (opcionalmente substituído). Quando presente, Q pode ser, por exemplo, um radical fenilo, naftilo, ciclopropilo, ciclopentilo ou 20 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ ciclo-hexilo bivalente, ou um radical heterocíclico mono-, ou bi-cíclico possuindo 5 a 13 membros no anel, tal como um radical piperidinilo, piperazinilo, indolilo, piridilo, tienilo ou pirrolilo, mas é presentemente preferido 1,4-fenileno.

Especificamente, em algumas concretizações da invenção, m e p podem ser 0, sendo n igual a 1. Em outras concretizações, n e p podem ser 0, sendo m igual a 1. Em outras concretizações, m, n e p podem ser todos 0. Em ainda outras concretizações m pode ser 0, n pode ser 1, sendo Q um radical heterocíclico monocíclico, e p pode ser 0 ou 1. Alk1 e Alk2, quando presentes, podem ser seleccionados entre -CH2-, -CH2CH2-, e -CH2CH2CH2- e Q pode ser 1,4-fenileno.

Os exemplos específicos do radical -Y-L-X-[CH2] z_ incluem -(CH2)v-, "(CH2) vO-(CH2)wO-

e

em que vél, 2, 3 ou 4 e w é 1, 2 ou 3, tal como -CH2- e -CH20. O radical -L-Y1-

Quando o éster de alfa-aminoácido está conjugado com o inibidor na forma de um radical de fórmula (IB), este radical (ou ligação) surge da estratégia química particular escolhida para ligar o carbono alfa do motivo éster de aminoácido na fórmula (IB) ou (IC) ao modulador. (Neste ultimo caso, o radical -L-Y1- está ligado indirectamente ao carbono alfa através dos átomos intervenientes do anel do sistema de anel B.) Evidentemente a estratégia química para esse acoplamento pode variar amplamente, e portanto são possíveis muitas combinações das variáveis L e Y1.

Por exemplo, L pode ser como discutido acima no contexto do radical -Y-L-X-[CH2] z-. Por exemplo, em algumas concretizações m e n são 1 e p é 0; Q é -0-; e Alk1 é um radical alquileno Ci-C6 , alcenileno C2-C6 ou alcinileno C2-C6 , lineares ou ramificados, opcionalmente substituídos, que podem opcionalmente conter ou terminar numa ligação éter 21 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ (-0-) , tioéter (-S-) ou amino (-NRA-) em que RA é hidrogénio ou alquilo Ci-C4 opcionalmente substituído. Em outras concretizações, m, n e p podem ser, cada um, 1, e em cada caso Q pode ser, por exemplo um radical 1,4-fenileno, ou um radical ciclopentilo, ciclo-hexilo, piperidinilo ou piperazinilo. Em todas as concretizações, Y1 pode ser, por exemplo, uma ligação, ou -(C=0)-, -(C=0)NH- e - (C=0)0-.

Para compostos da invenção que se destinam a administração sistémica, os ésteres com uma velocidade de clivagem pela carboxilesterase lenta são preferidos, pois são menos susceptíveis a metabolismo pré-sistémico. A sua capacidade para atingir o seu tecido alvo intactos é portanto aumentada, e o éster pode ser convertido no interior das células do tecido alvo no produto ácido. Contudo, para administração local, quando o éster é directamente aplicado no tecido alvo ou a ele dirigido, por exemplo, por inalação, será frequentemente desejável que o éster tenha uma velocidade rápida de clivagem por esterases, para minimizar a exposição sistémica e consequentes efeitos secundários indesejáveis. Quando o motivo para esterase está ligado ao modulador através do seu grupo amino, como na fórmula (IA) acima, se o carbono adjacente ao carbono alfa do éster de alfa-aminoácido está mono-substituído, ie R2 é CH2RZ (sendo Rz o mono-substituinte) então os ésteres tendem a ser clivados mais rapidamente do que se esse carbono estiver di- ou tri-substituído, como no caso acima em que R2 é, por exemplo, fenilo ou ciclo-hexilo. Similarmente, quando o motivo para esterase está ligado ao modulador através de um átomo de carbono como nas fórmulas (IB) e (IC) acima, se um átomo de carbono ao qual os motivos para esterase R4NHCH(Ri)- ou R4-(anel B)- estão ligados não está substituído, ie R4NHCH(Ri)- ou R4-(anel B)- estão ligados a um radical metileno (-CH2)-, então os ésteres tendem a ser clivados mais rapidamente do que se esse carbono estiver substituído, ou fizer parte de um sistema de anel tal como um anel fenilo ou ciclo-hexilo.

Moduladores de Enzimas e Receptores Intracelulares

Os princípios da presente invenção podem ser aplicados a moduladores de uma ampla gama de alvos intracelulares que estão implicados num ampla gama de doenças. Como discutido, os 22 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ modos de ligação de moduladores conhecidos aos seus alvos são geralmente conhecidos logo após os próprios moduladores serem conhecidos. Em adição, técnicas modernas como a cristalografia de raios X e a RMN são capazes de revelar essas topologias e geometrias de ligação, tal como são os métodos de guímica médica tradicionais de caracterizar as relações estrutura-actividade. Com este conhecimento, é directa a identificação de onde, na estrutura de uma determinado modulador, um motivo éster para a carboxilesterase pode ser ligado sem ruptura da ligação do modulador à enzima ou ao receptor por utilização de dados estruturais. Por exemplo, a Tabela 1 lista algumas enzimas ou receptores alvos intracelulares dos quais existem dados publicados da estrutura cristalina. A presente invenção refere-se a inibidores de histona-desacetilase. Os restantes moduladores são proporcionados para referência.

Tabela 1

Alvo Referência da estrutura cristalina Doença Alvo CD45 Nam et al., J Exp Med 201, 441 (2005) Doença auto-imune Lck Zhu et ai., Estrutura 7, 651 (1999) Inflamação ZAP-70 Jin et al., J Biol Chem 279, 42818 (2004) Doença auto-imune PDE4 Huai et al., Biochemistry 42, 13220 (2003) Inflamação PDE3 Scapin et al., Biochemistry 43, 6091 (2004) Asma IMPDH Intchak et al., Cell 85, 921 (1996) Psoriase MAPK p3 8 Wang et al., Structure 6, 1117 (1998) Inflamação C0X2 Kiefer et al., J Biol Chem 278, 45763, (2003) Inflamação Adenosina-quinase Schumacher et al., J Mol Biol 298, 875 (2000) Inflamação PLA2 Chandra et al., Biochemistry B 10914 (2002) Psoriase 23 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ PLC Essen et al., Bíochemistry 36, 1704, (1997) Artrite reumatóide PLD Leiros et al., J Mol Biol 339, 805 (2004) Inflamação iNOS Rosenfeld et al., Bíochemistry 41, 13915 (2002) Inflamação hidrolase LTA4 Rudberg et al., J Biol Chem 279, 27376 (2004) Inflamação ICE Okamato et al., Chem Pharm Buli 47, 11 (1999) Artrite reumatóide GSK3p Bertrand et al., J Mol Biol 333, 393 (2003) Artrite reumatóide PKC Xu et al., JBC 279, 50401 (2004) Inflamação PARP Ruf et al., PNAS (USA) 93, 7481 (1996) Desordens proliferativas MetAP2 Sheppard et al Bioorg Med Chem Lett 14, 865 (2004) Artrite reumatóide receptor de corticosteróides Bledsoe et al., Cell 110, 93 (2002) Inflamação PI3K Walker et al., Mol Cell Biol 6, 909 (2000) Desordens proliferativas Raf Wan et al., Cell 116, 855 (2004) Desordens proliferativas AKT/PKB Yang et al., Nat Struct Biol 9, 940 (2002) Desordens proliferativas HDAC Finnin et al., Nature 401, 188 (1999) Desordens proliferativas c-Abl Nagar et al., Câncer Res 62, 4236 (2002) Desordens proliferativas IGF—IR Munshi et al., Acta Crystallogr Sect D 59, 1725 (2003) Desordens proliferativas Timidilato- sintetase Stout et al., Structure 6, 839 (1998) Desordens proliferativas Glicinamida-ribonucleótido-formiltransferase Klein et al., J Mol Biol 249, 153 (1995) Desordens proliferativas 24 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ

Purina-Nucleósido-fosforilase Koelner et al., J Mol Biol 280, 153 (1998) Desordens proliferativas Estrona-sulfatase Hernandez-Guzman et al., J Biol Chem 278, 22989 (2003) Desordens proliferativas EGF-RTK Stamos et al., J Biol Chem 277, 46265 (2002) Desordens proliferativas quinase Src Lamers et al., J Mol Biol 285, 713 (1999) Desordens proliferativas VEGFR2 McTigue et al., Structure 7, 319 (19999) Desordens proliferativas Superóxido- dismutase Hough et al., J Mol Biol 287, 579 (1999) Desordens proliferativas Ornitina- descarboxilase Almrud et al., J Mol Biol 295, 7 (2000) Desordens proliferativas Topoisomerase II Classen et al., PNAS (USA) 100, 10629 (2003) Desordens proliferativas Topoisomerase I Staker et al., PNAS (USA), 99, 15387 (2002) Desordens proliferativas Receptor de androgénio Matias et al., J Biol Chem 275, 26164 (2000) Desordens proliferativas JNK Heo et al., EMBO J 23, 2185 (2004) Desordens proliferativas Farnesil-transferase Curtin et al., Bioorg Med Chem Lett 13, 1367 (2003) Desordens proliferativas CDK Davis et al., Science 291, 134 (2001) Desordens proliferativas Di-hidrofolato-redutase Gargaro et al., J Mol Biol 277, 119 (1998) Desordens proliferativas Flt3 Griffith et al., Mol Cell 13, 169 (2004) Desordens proliferativas Anidrase carbónica Stams et al., Protein Sei 7, 556 (1998) Desordens proliferativas Timidina-fosforilase Norman et al., Structure 12, 75 (2004) Desordens proliferativas Di- hidropirimidina- desidrogenase Dobritzsch et ai., JBC 211, 13155, (2002) Desordens proliferativas Manosidase α Van den Elsen et al., EMBO J 20, 3008 (2001) Desordens proliferativas 25 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ

Peptidil-prolil-isomerase (Pinl) Ranganathan et al., Cell 89, 875 (1997) Desordens proliferativas Receptor Retinóide X Egea et al., EMBO J 19, 2592 (2000) Desordens proliferativas β-Glucuronidase Jain et al., Nat Struct Biol 3, 375 (1996) Desordens proliferativas Glutationa-transferase Oakley et al., J Mol Biol 291, 913 (1999) Desordens proliferativas hsp90 Jez et al., Chem Biol 10, 361 (2003) Desordens proliferativas IMPDH Intchak et al., Cell 85, 921 (1996) Desordens proliferativas Fosfolipase A2 Chandra et al., Bíochemístry 41, 10914 (2002) Desordens proliferativas Fosfolipase C Essen et al., Bíochemístry 36, 1704, (1997) Desordens proliferativas Fosfolipase D Leiros et al., J Mol Biol 339, 805 (2004) Desordens proliferativas MetAP2 Sheppard et al. Bioorg Med Chem Lett 14, 865 (2004) Desordens proliferativas PTP-1 B Andersen et al., J Biol Chem 275, 7101 (2000) Desordens proliferativas Quinase Aurora Fancelli et ai., no prelo Desordens proliferativas PDK-1 Komander et al., Biochem J 375, 255 (2003) Desordens proliferativas HMGCoA-redutase Istvan e Deisenhofer Science 292, 1160 (2001) Ateriosclerose Oxidoesqualeno- ciclase Lenhart et al., Chem Biol 9, 639 (2002) Hipercolesterolemia estimulador de piruvato- desidrogenase Mattevi et al., Science 255, 1544 (1992) Doença cardiovascular Adenilato-ciclase Zhang et al., Nature 386, 247 (1997) Doença cardiovascular agonista de PPARy Ebdurp et al., J Med Chem 46, 1306 (2003) Diabetes 26 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ

Álcool- desidrogenase Bahnson et ai., PNAS USA 94, 12797 (1997) Envenenamento por álcool Lipase sensível a hormonas Wei et al., Nat Struct Biol 6, 340 (1999) Diabetes resistente a insulina Adenosina-quinase Mathews et al., Biochemistry 37, 15607 (1998) Epilepsia Aldose-redutase Urzhmsee al., Structure 5, 601 (1997) Diabetes Receptor de vitamina D3 Tocchini-Vatentini et al., PNAS USA 98, 5491 (2001) Osteoporose Proteína-tirosina-fosfatase Andersen et al., J Biol Chem 275, 7101 (2000) Diabetes Protease de HIV Louis et al., Biochemistry 37, 2105 (1998) HIV Polimerase de HCV Bressanelli et al., PNAS USA 96, 13034 (1999) Hepatite C Neuraminidase Taylor et al., J Med Chem 41, 798 (1998) Influenza Transcritase inversa Das et al., J Mol Biol 264, 1085 (1996) HIV Protease de CMV Khayat et al., Biochemistry 42, 885 (2003) Infecção por CMV Timidina-quinase Champness et al., Proteins 32, 350 (1998) Infecções de herpes Integrase de HIV Molteni et al., Acta Crystallogr Sect D 57, 536 (2001) HIV

Para fins de ilustração, faz-se referência a inibidores conhecidos de 5 dos alvos intracelulares acima, cujo modo de ligação ao alvo é conhecido. Estes exemplos ilustram como estes dados estruturais podem ser utilizados para determinar as posições apropriadas para a ligação do motivo éster para a carboxilesterase. Mostra-se um esquema dos locais activos juntamente com os inibidores representativos. Em geral, as posições remotas relativamente à interface de ligação entre o modulador e o alvo, e que portanto apontam da interface de ligação da enzima para o solvente, são locais adequados para a 27 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ ligação do motivo éster para a carboxilesterase e esses estão indicados nos diagramas.

HDAC

Grupo de ligação a metal

Quinase Aurora (exemplo de referência)

28 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ

Quinase ΡΙ3 (exemplo de referência)

Local de ligação de adenina Local aceitador de ligações de H guinases MAP P38 (exemplo de referência)

29 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ

Quinase IKK (exemplo de referência)

Uma abordagem similar pode também ser utilizada para outros exemplos identificados na Tabela 1. 0 método da invenção, para aumentar a potência celular e/ou o tempo de residência intracelular de um inibidor da actividade da histona-desacetilase alvo, pode envolver vários passos:

Passo 1: Identificar uma posição ou posições num determinado inibidor da actividade da enzima histona-desacetilase intracelular alvo, ou numa pluralidade de determinados inibidores da actividade da enzima histona-desacetilase intracelular alvo que partilham o mesmo modo de ligação à enzima histona-desacetilase alvo, sendo as referidas posição ou posições remotas relativamente à interface de ligação entre o(s) inibidor(es) e a enzima histona-desacetilase alvo.

Usualmente estas posições são identificadas a partir da estrutura co-cristalina de raios-X (ou estrutura derivada por RMN) da enzima histona-desacetilase alvo com um modulador conhecido (ou um seu análogo estrutural próximo) ligado à enzima, por inspecção da estrutura. Alternativamente a estrutura cristalina de raios-X da enzima histona-desacetilase alvo com o modulador atracado no local activo das enzimas é modelado por métodos gráficos em computador, e o modelo é 30 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ inspeccionado. A presunção é que é improvável que a modificação estrutural do modulador nas posições remotas relativamente à interface de ligação interferira significativamente com a ligação do modulador ao local activo da enzima. As posições adequadas irão normalmente surgir da estrutura co-cristalina ou modelo atracado orientadas no sentido do solvente.

Passo 2: Modificar covalentemente o(s) inibidor(es) por ligação de um radical éster de alfa-aminoácido, ou uma gama de diferentes radicais éster de alfa-aminoácido em uma ou mais das posições identificadas no Passo 1. A ligação de radicais éster de alfa-aminoácido (ie os motivos para carboxilesterase potenciais) pode ser por via de uma funcionalidade de acoplamento covalente existente no(s) modulador(es), ou por via de uma funcionalidade adequada especificamente introduzida para esse fim. Os motivos para carboxilesterase podem ser espaçados do volume molecular principal por um elemento espaçador ou ligante, para posicionar o motivo mais fundo no sentido do solvente e desse modo reduzir ainda mais qualquer pequeno efeito do motivo sobre o modo de ligação do modulador e/ou para assegurar que o motivo é acessível à carboxilesterase por redução da interferência estereoquímica que possa resultar do volume molecular principal do modulador. O realização do Passo 2 resulta na preparação de um ou, mais usualmente, uma pequena biblioteca de moduladores candidatos, cada um covalentemente modificado relativamente ao inibidor seu progenitor pela introdução de uma variedade de radicais éster de aminoácido, em um ou mais pontos de ligação identificados no Passo 1.

Passo 3: Testar o(s) modulador(es) conjugado(s) com alfa-aminoácido preparados no Passo 2 para determinar a sua actividade contra a enzima histona-desacetilase alvo.

Como é normal em química médica, a(s) versão(ões) do motivo para a carboxilesterase do(s) modulador(es) progenitor(es), preparada(s) em resultado da realização dos Passos 1 e 2, são preferivelmente testadas em ensaios 31 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ apropriados para determinar se a retenção esperada de actividade moduladora foi de facto retida, e em que grau e com que perfil de potência. De acordo com a finalidade subjacente da invenção, que é causar a acumulação de actividade moduladora em células, os ensaios adequados irão normalmente incluir ensaios em linhas celulares para determinar o grau de actividade celular, e perfil de potência, dos moduladores modificados. Outros ensaios que podem ser empregues no Passo 3 incluem ensaios de inibição enzimática in vitro para determinar a actividade intrínseca do modulador modificado e seu produto de hidrólise pela carboxilesterase putativa; ensaios para determinar a velocidade de conversão dos moduladores modificados no correspondente ácido carboxílico por carboxilesterases; e ensaios para determinar a velocidade e/ou o nível de acumulação do produto da hidrólise pela carboxilesterase (o ácido carboxílico) em células. Nestes ensaios, podem-se utilizar células monocíticas e não monocíticas, e/ou um painel de carboxilesterases isoladas, para identificar compostos que apresentam selectividade celular.

Se necessário ou desejável, o Passo 3 pode ser repetido com um conjunto diferente de versões candidatas conjugadas a éster de alfa-aminoácido do modulador progenitor.

Passo 4: A partir dos dados adquiridos no Passo 3, seleccionar uma ou mais das versões testadas conjugadas a éster de alfa-aminoácido do(s) modulador(es) progenitor(es) que causam modulação da actividade da histona-desacetilase no interior de células, são convertidas em, e se acumulam na forma de, o ácido carboxílico correspondente no interior das células, e que apresentam uma potência celular aumentada ou prolongada.

Os Passos 1-4 descritos acima representam um algoritmo genérico para a implementação dos princípios da presente invenção. A aplicação do algoritmo está ilustrada no Exemplo de Referência A adiante, aplicado a um inibidor conhecido da enzima intracelular di-hidrofolato-redutase (DHFR). 32 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ

Exemplo de Referência A 0 ácido fólico (pteroílglutâmico) é uma vitamina que é um componente chave na biossintese de nucleótidos de purina e de pirimidina. Após a absorção por ingestão o folato é reduzido a di-hidrofolato e depois adicionalmente reduzido a tetra-hidrofolato pela enzima di-hidrofolato-redutase (DHFR). A inibição da DHFR conduz a uma redução na biossintese de nucleótidos resultando na inibição da biossintese de ADN e numa divisão celular reduzida. Os inibidores de DHFR são amplamente utilizados no tratamento do cancro (Bertino J, J. Clin. Oncol. 11, 5-14, 1993), doenças celulares proliferativas tais como artrite reumatóide (Cronstein N., Pharmacol. Rev. 57, 163-1723), psoriase e rejeição de transplantes. Os inibidores de DHFR verificaram-se também úteis como agentes anti-infecciosos (Salter A., Rev. Infect. Dis. 4,196-236, 1982) e antiparasiticos (Plowe C. BMJ 328, 545-548, 2004).

Foram sugeridos muitos tipos de compostos inibidores de DHFR, e vários destes compostos são utilizados como agentes anticancerosos, anti-inflamatórios, anti-infecciosos e antiparasiticos. Um molde genérico para inibidores de DHFR conhecidos é mostrado adiante:

1 O metotrexato, ácido (S)-2-(4-(((2,4-diaminopteridin-6-il)metil)metilamino)benzamido)pentanodióico, é o inibidor de DHFR mais amplamente utilizado e contém uma funcionalidade glutamato que lhe permite ser activamente transportado para, e ser retido no interior de, células. Contudo as células cancerosas podem tornar-se resistentes ao metotrexato por modificação deste mecanismo de transporte activo. Adicionalmente, as células que não de mamífero não possuem o sistema de transporte activo e o metotrexato tem uma utilidade limitada como agente anti-infeccioso. Inibidores de DHFR lipófilos tais como o trimetrexato (2,4-diamino-5-metil-6- 33 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ [(3,4,5-trimetoxianilino)metil]quinazolina) (2 G = CH) (patente GB 1345502) e análogos tais como (2 G = N) (Gangjee et al. J.Med.Chem. 1993, 36, 3437-3443) que podem ser captados por difusão passiva foram portanto desenvolvidos tanto para ultrapassar a resistência de células cancerosas como para utilização como agentes anti-infecciosos. OMe

2

Contudo, agentes que se difundem passivamente para o interior das células irão também sair da célula prontamente e não são prontamente retidos no interior da célula. Assim, um inibidor de DHFR modificado de acordo com a presente invenção, que é lipófilo mas cuja actividade se acumula no interior da célula, pode ter vantagens significativas. Adicionalmente, ambas as classes de inibidores de DHFR têm efeitos secundários que limitam as doses que podem ser utilizadas em medicina. Um inibidor de DHFR cuja actividade se acumula selectivamente em macrófagos pode ter valor pois sabe-se que os macrófagos, através da produção de citóquinas, desempenham um papel chave em desordens inflamatórias e crescem as evidências de que têm um papel negativo no cancro.

Passo 1 do Algoritmo Geral Descrito Acima A estrutura por RMN de DHFR com trimetrexato (2 G = CH) atracado no local activo está publicada (Polshakov, V.I. et al., Protein Sei. 1999, 8, 467-481) e é evidente que a posição mais apropriada para ligar um motivo para carboxilesterase de acordo com a invenção era no anel fenilo como mostrado adiante, deduziu-se que a ligação nesse ponto em análogos estruturais próximos conhecidos de trimetrexato, tais como (2 G = N) seria também adequada. A figura 2 mostra (2 G = N) atracado em DHFR mostrando que um ponto adequado para a ligação é a posição 4 do anel aromático pois este aponta para longe do local activo da enzima. 34 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ

Passo 2 do Algoritmo Geral Descrito Acima

Os compostos em que o motivo para carboxilesterase está ligado através do seu azoto de alfa-aminoácido foram preparados como mostrado nos esquemas I e II. Dentro desta série, foram preparados compostos com e sem um carbonilo para identificar potenciais compostos selectivos para macrófagos.

Esquema I

35 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ

Esquema II

Foram também preparados compostos em que o motivo para esterase foi ligado ao modulador através da cadeia lateral do alfa-aminoácido, esquemas III e IV. Nesta série foram também preparados compostos com substituição de alquilo no azoto para identificar compostos selectivos para macrófagos (esquema IV). 36 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ

Esquema III

37 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ

Passo 3 do Algoritmo Geral Descrito Acima

Os compostos incluindo o análogo de trimetrexato (2 G = N) foram testados no ensaio com enzima DHFR, no ensaio de proliferação celular, utilizando linhas celulares tanto monociticas como não monociticas, e no ensaio com células lisadas de modo a determinar a capacidade de clivagem dos ésteres por linhas celulares monociticas e não monociticas. Os detalhes de todos estes ensaios são apresentados adiante. 38 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ

Passo 4 do Algoritmo Geral Descrito Acima

Como mostrado na Tabela 2 foram identificados compostos cujos ácidos possuem actividade contra a enzima comparável à do análogo de trimetrexato (2 G = N). Pode também observar-se que alterando o modo como o motivo para esterase está ligado pode levar a um composto (6) que é 100 vezes mais potente em células U937 e 15 vezes mais potente na HCT116 do que o análogo não modificado (2 G=N).

Adicionalmente, modificações do ligante ou do substituinte no azoto do motivo para esterase permitiram a identificação de compostos 4 e 5 que apresentaram clivagem selectiva em linhas celulares monociticas mas não em não monociticas e que foram significativamente mais anti-proliferativos em linhas celulares monociticas do que em linhas celulares não monociticas (veja-se a tabela 2).

Tabela 2 U937 (Linha celular monocítica) HCT116 (linha celular não monocítica) Composto IC50 nM enzima1 (ácido) IC50 nM proliferação celular Razão IC50 célula/ enzima Acido produzido2 ng/ml IC50 nM proliferação celular Razao IC50 Célula/ enzima Ácido produzido2 ng/ml (2 G=N) r ] fVrV^ 10 2200 220 NA 1700 170 NA 3 2700 (11) 5100 1,9 80 7300 1, 4 180 m, | Ή 4 1033 (25) 310 0, 3 970 6900 6, 6 40 5 4000 (10) 310 o co 210 6700 1, 7 2 39 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ 6 1700 (8) 23 0, 013 110 110 «3* 0 0 150

Notas 10s números entre parêntesis referem-se a IC50 da enzima para o ácido resultante da clivagem dos ésteres 2 A quantidade de ácido produzido após incubação do éster durante 80 minutos no ensaio da carboxilesterase em células lisadas descrito adiante

Utilizando estratégias similares o conceito foi aplicado com sucesso a uma gama de alvos intracelulares como delineado nos exemplos adiante. A titulo de ilustração adicional dos princípios da presente invenção, são apresentados os Exemplos que se seguem. Nas sínteses dos compostos descritas adiante:

Os reagentes e solventes (qualidade para HPLC) comercialmente disponíveis foram utilizados sem purificação adicional. A irradiação de micro-ondas foi realizada utilizando um reactor de micro-ondas focado CEM Discover. Os solventes foram removidos utilizando um GeneVac Series I sem aquecimento ou um Genevac Series II com VacRamp a 30°C. A purificação de compostos por coluna de cromatografia flash foi realizada utilizando sílica-gel, dimensão de partículas de 40-63 pm (230-400 mesh) obtida de Silicycle. A purificação de compostos por HPLC preparativa foi realizada num sistema Gilson utilizando colunas de fase inversa ThermoHypersil-Keystone Hyperprep HS C18 (12 pm, 100 X 21,2 mm), gradiente de 20-100% de B (A= água/TFA a 0,1%, B= acetonitrilo/TFA a 0,1%) ao longo de 9,5 min, caudal = 30 ml/min, solvente de injecção DMSO:acetonitrilo 2:1 (1,6 ml), detecção UV a 215 nm.

Os espectros de ΧΗ RMN foram registados num espectrómetro Bruker 400 MHz AV em solventes deuterados. Os desvios químicos (δ) estão em partes por milhão. A análise por cromatografia de camada fina (TLC) foi realizada com placas Kieselgel 60 F254 (Merck) e visualizada utilizando luz UV. A HPLCMS analítica foi realizada em sistemas Agilent HP1100, Waters 600 ou Waters 1525 LC utilizando colunas de fase inversa Hypersil 40 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ BDS C18 (5 μιη, 2,1 X 50 mm), gradiente de 0-95% de B (A= água/ TFA a 0,1%, B= acetonitrilo/ TFA a 0,1%) ao longo de 2,10 min, caudal = 1,0 ml/min. Os espectros de UV foram registados a 215 nm utilizando um detector de arranjo de díodos Gilson G1315A Diode Array Detector, um detector de UV de comprimento de onda único G1214A, um detector de UV de comprimento de onda duplo Waters 2487, um detector de UV de comprimento de onda duplo Waters 2488 ou um detector de UV de arranjo de díodos Waters 2996. Os espectros de massa foram obtidos na gama m/z de 150 a 850 a uma velocidade de amostragem de 2 varrimentos por segundo ou 1 varrimento por 1,2 segundos utilizando um Micromass LCT com interface Z-spray ou um Micromass LCT com interface Z-spray ou MUX. Os dados foram integrados e reportados utilizando software OpenLynx e OpenLynx Browser.

Foram utilizadas as seguintes abreviaturas:

MeOH = MeOH EtOH = EtOH EtOAc = EtOAc

Boc = terc-butoxicarbonilo DCM = DCM DMF = dimetilformamida DMSO = dimetilsulfóxido TFA = ácido trifluoroacético THF = tetra-hidrofurano

Na2C03 = carbonato de sódio HC1 = ácido clorídrico DIPEA = diisopropiletilamina

NaH = hidreto de sódio

NaOH = hidróxido de sódio

NaHC03 = hidrogenocarbonato de sódio

Pd/C = paládio sobre carbono TBME = éter terc-butilmetílico N2 = azoto

PyBop = hexafluorofosfato de benzotriazol-l-il-oxi-tris- pirrolidinofosfónio

Na2S04 = sulfato de sódio

Et3N = trietilamina NH3 = amoníaco TMSCI = trimetilclorossilano NH4CI = cloreto de amónio LÍAIH4 = hidreto de alumínio e lítio 41 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ

PyBrOP = hexafluorofosfato de bromo-tris-pirrolidinofosfónio

MgS04 = MgS04 nBuLi = n-butil-lítio CO2 = dióxido de carbono

EDCI = cloridrato de N- (3-dimetilaminopropil)-N etilcarbodiimida

Et20 = éter dietílico

LiOH = hidróxido de litio HOBt = 1-hidroxibenzotriazole ELS = dispersão de luz evaporativa (Evaporative Light Scattering) TLC = cromatografia de camada fina (Thin Layer Chromatography) ml = mililitro g = grama(s) mg = miligrama(s) mol = moles mmol = milimole(s) LCMS = cromatografia liquida de alta resolução/espectrometria de massa (High Performance Liguid Chromatography / Mass Spectrometry) RMN = ressonância magnetic nuclear (Nuclear Magnetic

Resonance) t.a. = temperatura ambiente min = minuto(s) h = hora(s)

INTERMEDIÁRIOS

Foram utilizados os seguintes blocos de construção para a síntese dos moduladores modificados:

42 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ

Síntese de éster ciclopentílico de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-4-hidroxibutírico e éster 1-terc-butílico de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-4-hidroxibutírico

43 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ (S)-2-amino-4-(terc-

Etapa 1 - Síntese de ácido butildimetilsilaniloxi)butírico h2n

o A uma suspensão de L-homosserina (1 g, 8,4 mmol) em acetonitrilo (10 ml) a 0°C adicionou-se 1,8-diazabiciclo-[5.4.0]undec-7-eno (1,32 ml, 8,8 mmol, 1,05 eq) . Adicionou-se então cloreto de terc-butildimetilsililo (1,33 g, 8,8 mmol, 1,05 eq) em porções ao longo de 5 min e deixou-se aquecer a mistura reaccional até à t.a. e agitou-se durante 16 h. Formou-se um precipitado branco que foi removido por filtração e lavado com acetonitrilo antes de secagem sob vácuo. O composto do titulo foi isolado sob a forma de um sólido branco (1,8 g, 92%). RMN (500 MHz, DMSO) , õ: 7,5 (1H, s 1), 3,7 (1H, m) , 3,35 (4H, m 1), 1,95 (1H, m), 1,70 (1H, m), 0,9 (9H, s), 0,1 (6H, s).

Etapa 2 - Síntese de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-4-(terc-butildimetilsilaniloxi)butírico

O

Tratou-se uma suspensão do produto da Etapa 1 (1,8 g, 7,7 mmol) em DCM (100 ml) a 0°C com trietilamina (2,15 ml, 15,4 mmol, 2 eq) e dicarbonato de di-terc-butilo (1,77 g, 8,1 mmol, 1,05 eq) . Agitou-se a mistura reaccional à t.a. durante 16 h para completar a reacção. Removeu-se o DCM sob pressão reduzida e tratou-se a mistura com EtOAc / salmoura. Secou-se a camada do EtOAc sobre MgS04 e evaporou-se sob pressão reduzida. Tomou-se para adiante o produto bruto sem purificação adicional (2,53 g, 99%). ΤΗ RMN (500 MHz, CDCI3) , 5: 7,5 (1H, s 1), 5,85 (1H, d, J = 6,5Hz), 4,3 (1H, m) , 44 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ 3,75 (2Η, m) , 1,95 (2Η, m) , 1,40 (9Η, s), 0,85 (9Η, s) 0, 1 (6Η, s) .

Etapa 3 - Síntese de éster ciclopentílico de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-4-(terc-butildimetilsilaniloxi)butírico

A uma solução do produto da Etapa 2 (2,53 g, 7,6 mmol) em DCM (50 ml) a 0°C adicionou-se ciclopentanol (1,39 ml, 15,3 ml, 2 eq) , EDCI (1,61 g, 8,4 mmol, 1,1 eq) e DMAP

(0,093 g, 0,76 mmol, 0,1 eq) . Agitou-se a mistura reaccional durante 16 h à t.a. antes de evaporação sob pressão reduzida. Dissolveu-se o resíduo bruto em EtOAc (100 ml) e lavou-se com HC1 1 M, Na2C03 1 M e salmoura. Secou-se então a camada orgânica sobre MgSCq e evaporou-se sob pressão reduzida. Purificou-se o produto por cromatografia em coluna utilizando EtOAc / heptano (1:4) para obter o composto do título (2,24 g, 73%). Pureza em LCMS de 100%, m/z 402,5 [M++H] , ΤΗ RMN (250 MHz, CDC13) , δ: 5,2 (1H, d, J = 6,3Hz), 5,15 (lH,m), 4,2 (1H, m) , 3,6 (2H, m) , 2,0 (1H, m) , 1,95-1,55 (9H, m 1), 1,4 (9H,s), 0,85 (9H,s), 0,1 (6H,s).

Etapa 4 - Síntese de éster ciclopentílico de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-4-hidroxibutírico

Dissolveu-se o produto da Etapa 3 (1,57 g, 3,9 mmol) em ácido acético:THF:água (3:1:1, 100 ml). Agitou-se a mistura

reaccional a 30°C durante 16 h para completar a reacção. Adicionou-se EtOAc (200 ml) e lavou-se com Na2C03 1 M, HC1 1 M e salmoura. Secaram-se os extractos de EtOAc sobre MgS04 e evaporaram-se sob pressão reduzida para originar o produto sob a forma de um óleo límpido que cristalizou por repouso (1,0 g, 95%) . Pureza em LCMS de 100%, m/z 310,3 [M++Na] , 1H RMN 45 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ (250 ΜΗζ, CDC13), δ: 5,4 (1Η, d, J = 6,5Ηζ), 5,2 (1Η, m) , 4,4 (1Η, m), 3,65 (2Η, m), 2,15 (1Η, m), 1,9-1,55 (9Η, m 1), 1,45 (9Η, s) .

Etapa 5 - Síntese de éster ciclopentílico de ácido (S)-4-bromo-2-terc-butoxicarbonilaminobutírico

Br

A uma pasta de N-bromossuccinimida (1,86 g, 10,4 mmol) em DCM (16,2 ml) adicionou-se uma solução de trifenilfosfina (2,56 g, 9,74 mmol) em DCM (7,2 ml). Agitou-se a solução durante mais 5 min após a adição. Adicionou-se piridina (338 μΐ, 4,18 mmol), seguida por uma solução do produto da Etapa 4 (1,00 g, 3,48 mmol) em DCM (8,8 ml). Agitou-se a solução durante 18 h, concentrou-se sob pressão reduzida e formou-se um azeótropo do solvente residual com tolueno (3 x 16 ml) . Triturou-se o resíduo com éter dietílico (10 ml) e acetato de etilo : heptano (1:9, 2 x 10 ml) . Concentraram-se as soluções combinadas de éter e heptano sobre sílica e purificaram-se por cromatografia em coluna eluindo com EtOAc / heptano (1:9 a 2:8) para proporcionar o composto do título (1,02 g, 84%). ΧΗ RMN (300 ΜΗζ, CDC13), δ: 5,30-5, 05 (2H, m) , 4, 45-4,30 (1H, m), 3,45 (2H, t, J = 7,3 Hz), 2,50-2,30 (1H, m) , 2,25-2,10 (1H, m) , 1,95-1,60 (8H, m lg), 1,47 (9H, s). Síntese de éster ciclopentílico de ácido (S)-2-amino-4-metilpentanóico

o Etapa 1 O

NaHCO- DCM Etapa 2

O 46 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ

Etapa 1 - Síntese de éster ciclopentílico de ácido (S)-2-amino-4-metilpentanóico - ácido tolueno-4-sulfónico

A uma suspensão de (S)-leucina (15 g, 0,11 mol) em ciclo-hexano (400 ml) adicionou-se ciclopentanol (103,78 ml, 1,14 mmol) e ácido p-toluenossulfónico (23,93 g, 0,13 mol). Aqueceu-se a suspensão em refluxo para efectuar o sulfato. Após refluxar a solução durante 16 h, arrefeceu-se para obter uma suspensão branca. Adicionou-se heptano (500 ml) à mistura e filtrou-se a suspensão para originar o produto sob a forma de um sólido branco (35 g, 85%). RMN (300 MHz, MeOD) , δ: 1,01 (6H, t, J = 5,8Hz), 1,54-2,03 (11 H, m) , 2,39 (3H, s), 3,96 (1H, t, J = 6,5Hz), 5,26-5,36 (1H, m), 7,25 (2H, d, J = 7, 9Hz) , 7,72 (2H, d, J = 8,3Hz).

Etapa 2 - Síntese de éster ciclopentílico de ácido (S)-2-amino-4-metilpentanóico

Lavou-se uma solução do produto da Etapa 1 (2,57 g, 0,013 mol) em DCM (5 ml) com solução aq. sat. de NaHC03 (2 x 3 ml). Extractaram-se as camadas aq. combinadas de novo com DCM (3x4 ml) . Secaram-se as camadas orgânicas combinadas (MgS04) , e removeu-se o solvente in vacuo para originar o composto do título sob a forma de um óleo incolor (1,10 g, 80%). ΤΗ RMN (300 MHz, CDC13), δ: 0,90 (6H, t, J = 6,4Hz), 1,23-1,94 (11 H, m), 3,38 (1H, dd, J = 8,4, 5,9Hz), 5,11-5,22 (1H, m). 47 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ Síntese de éster ciclopentílico de ácido (S)-aminofenilacético

H,N

Preparou-se éster ciclopentílico de ácido (S)-aminofenilacético a partir de ácido (S)-aminofenilacético seguindo o mesmo procedimento utilizado para a síntese do éster ciclopentílico de ácido (S)-2-amino-4-metilpentanóico Síntese de éster 1-ciclopentílico de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilaminopentanodióico

γ OH NHBoc , EDCI. DMAP DCM Etapa 1

O NHBoc

PdfC, H, ElOH

Etapa 2

NHBoc

Etapa 1 - Síntese de éster 5-benzílico, éster 1-ciclopentílico de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilaminopentanodióico

A uma solução agitada de éster 5-benzílico de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilaminopentanodióico (5 g, 14,8 mmol) numa mistura de DCM (50 ml) e DMF (30 ml) a 0°C adicionou-se ciclopentanol (2,7 ml, 29,6 mmol), EDCI (4,25 g, 22,2 mmol) e DMAP (0,18 g, 1,48 mmol). Continuou-se a agitação à t.a. durante a noite, tempo após o qual a LCMS mostrou que a reacção estava completa. Removeu-se o DCM sob pressão reduzida. Diluiu-se a mistura reaccional com EtOAc (200 ml), 48 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ lavou-se com água (100 ml), HC1 aq 1 M (50 ml) seguido por NaHC03 aq sat (50 ml) . Secou-se a camada do EtOAc (Na2S04) , filtrou-se e concentrou-se in vacuo para originar um óleo viscoso que solidificou por repouso durante a noite. A trituração com Et20 (2 x 10 ml) produziu o composto do titulo sob a forma de um sólido branco (43,78 g, 80%). Pureza em LCMS de 94%.

Etapa 2 - Síntese de éster 1-ciclopentílico de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilaminopentanodióico

Agitou-se uma mistura do produto da Etapa 1 (1,3 g, 3,20 mmol), e Pd/ C a 10% (0,5 g) em EtOH (150 ml) sob H2 (balão) à t.a. durante 4 h, tempo após o qual a LCMS mostrou que a reacção estava completa. Filtrou-se a mistura reaccional através de uma almofada de celite, lavou-se com EtOH (20 ml) e concentrou-se in vacuo para originar um sólido branco. Para remover o EtOH residual dissolveu-se o sólido numa mistura de tolueno / THF (5/1) (20 ml) e concentrou-se in vacuo para obter o composto do titulo (0,8 g, 79%) . 1H RMN (400 MHz, MeOD) , õ: 1,35 (9H, s), 1,60-2,10 (10H, m) , 4,05 (1H, m), 5,20 (1H, m). Síntese de éster 1-terc-butílico de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilaminopentanodióico

NHBoc

Preparou-se éster 1-terc-butílico de ácido (S)— 2-terc-butoxicarbonilaminopentanodióico a partir de éster 5-benzílico de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilaminopentanodióico seguindo o mesmo procedimento utilizado para a síntese do éster 1- ciclopentílico de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino- pentanodióico 49 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ Síntese de éster terc-butílico de ácido_(S) -2- benziloxicarbonilamino-4-bromobutírico I 0 Ύ nh2 o

OH

Dicarbonato de dibenzilo, NaOH - Dioxano, água Etapa 1

Ύ NHZ O

OH

Etapa 2

1) EtOCOCI, NEtj, THF 2) NaBHí, THF/água

O' NHZ ^Br NBS, PPh3, DCM, Piridina I 0Λο-υ

Etapa 3

~^OH NHZ

Etapa 1 - Síntese de éster 1-terc-butílico de ácido (S)-2-benziloxicarbonilaminossuccínico I °

NHZ O

Dissolveram-se éster 1-terc-butílico de ácido (S)— 2 — aminossuccínico (0,9 g, 4,75 mmol) e hidróxido de sódio (0,28 g, 7,13 mmol, 1,5 eq) em água a 25% em dioxano (50 ml). Agitou-se a solução a 5°C e adicionou-se lentamente dicarbonato de dibenzilo (2 g, 4,13 mmol, 1,5 eq) em dioxano (10 ml). Agitou-se a mistura a 0°C durante lhe depois à t.a. durante a noite. Adicionou-se água (10 ml) e extractou-se a mistura com EtOAc (2 x 20 ml). Extractou-se a fase orgânica de novo com uma solução aq. sat. de bicarbonato de sódio (2 x 10 ml) . Acidificaram-se as camadas aq. combinadas a pH 1 com HC1 1 M, e extractou-se com EtOAc (3 x 10 ml) . Secaram-se as fracções orgânicas combinadas sobre MgS04 e concentraram-se sob pressão reduzida. Purificou-se o produto por cromatografia em coluna (35% de EtOAc em heptano) para produzir o composto do título sob a forma de um óleo incolor (0,76 g, 50%) . m/z 346 [M+23]+, RMN (300 MHz, CDC13) , δ: 7,39-7,32 (5H, m) , 5,72 (1H, d, J = 8, 1Hz) , 5,13 (2H, s), 4,58-4,50 (1H, m) , 3,10-2,99 (1H, m) , 2, 94-2,83 91 H, m), 1,45 (9H, s). 50 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ

Etapa 2 - Síntese de éster terc-butílico de ácido (S)-2-benziloxicarbonilamino-4-hidroxibutírico

A uma solução do produto da Etapa 1 (0,6 g, 1,87 mmol) em THF anidro (20 ml) a -20°C foram adicionados lentamente trietilamina (0,032 ml, 2,24 mmol, 1,2 eq) e clorofiormato de etilo (0,021 ml, 2,24 mmol, 1,2 eq). Agitou-se a mistura a -20°C durante 2 h. O sólido formado foi removido por filtração e lavado com THF (2 x 10 ml). Adicionou-se o filtrado gota a gota a uma solução de boro-hidreto de sódio (0,2 g, 5,61 mmol, 3 eq) a 0°C e agitou-se à t.a. durante 4 h. Removeu-se o solvente sob pressão reduzida, diluiu-se o resíduo com água (10 ml), acidificou-se a pH 5 com HC1 1 M e extractou-se com EtOAc. Combinaram-se as fracções orgânicas, lavaram-se com hidróxido de sódio aq. a 10%, água e salmoura, secaram-se sobre MgSCR e concentraram-se sob pressão reduzida para originar o composto do título sob a forma de um óleo (0,3 g, 51%). m/z 332 [M+23] + .

Etapa 3 - Síntese de éster terc-butílico de ácido (S)-2-benziloxicarbonilamino-4-bromobutírico

A uma solução de N-bromossuccinimida (0,52 g, 2,91 mmol, 3 eq) em DCM (10 ml) adicionou-se lentamente uma solução de trifenilfosfina (0,71 g, 2,72 mmol, 2,8 eq) em DCM (10 ml). Agitou-se a mistura à t.a. durante 5 min. Adicionaram-se piridina (0,094 ml, 1,16 mmol, 1,2 eq) e uma solução do produto da Etapa 2 (0,3 g, 0,97 mmol, 1 eq) em DCM (20 ml), gota a gota, e agitou-se a mistura à t.a. durante a noite.

Removeu-se o solvente sob pressão reduzida, formou-se um azeótropo do resíduo com tolueno (2 x 15 ml) e triturou-se com éter dietílico (2 x 25 ml) e EtOAc a 10% em heptanos. Combinaram-se as soluções da trituração e evaporaram-se até à secura. Purificou-se o produto bruto por cromatografia em 51 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ coluna (15% de EtOAc em heptanos) para originar o composto do título sob a forma de um óleo límpido (0,16 g, 44%) . m/z 395 [M+23]\ aH RMN (300 MHz, CDC13) , δ: 7, 39-7,30 (5H, m) , 5,40 (1H, d, J = 6, 8Hz) , 5,12 (2H, s), 4,38 (1H, q, J = 7,7Hz), 3, 47-3,38 (2H, m) , 5, 49-2,33 (1H, m), 2,28-2,13 (1H, m), 1,48 (9H, s). EXEMPLO 1

Este exemplo descreve a modificação do inibidor de HDAC (Histona-desacetilase) conhecido, Suberoílanilida de ácido hidroxâmico (composto 7) aqui referido como "SAHA", pela ligação de motivos éster de aminoácido em pontos remotos relativamente à interface de ligação com o alvo, em que não ocorre ruptura do seu modo de ligação.

Composto 7: Suberoílanilida de ácido hidroxâmico (SAHA)

O

O SAHA foi adquirido a BioCat GmbH, Heidelberg, Alemanha.

Procedimento padrão de lavagem para a química das resinas A resina foi lavada na seguinte sequência: DMF, MeOH, DMF, MeOH, DCM, MeOH, DCM, MeOH x 2, TBME x 2.

Teste de clivagem da resina

Uma pequena quantidade de resina de 2-clorotritilo funcionalizada com hidroxilamina (ca 0,3 ml de mistura reaccional, ca 10 mg de resina) foi tratada com TFA a 2%/DCM (0,5 ml) durante 10 min à t.a. A resina foi filtrada e o filtrado foi concentrado por sopragem com uma corrente de N2 gasoso. Foi obtida a LCMS do resíduo. 52 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ

Preparação de Resina de 2-Clorotritil-hidroxilamina Derivatizada com Ácido Subérico

Etapa 1 - Imobilização em resina de 2-clorotritil-0-NH2

O

OMe O A um balão de fundo redondo carregado com resina de 2-clorotritil-0-NH2 (6 g, carga de 1,14 mmol/g, 6,84 mmol) e DCM (60 ml) adicionou-se DIPEA (5,30 g, 41,0 mmol, 6 eq). Adicionou-se lentamente 8-cloro-8-oxo-octanoato de metilo (4,2 g, 20,5 mmol, 3 eq) à mistura reaccional com agitação orbital e agitou-se a mistura reaccional durante 48 h. Filtrou-se a resina e lavou-se utilizando o procedimento padrão de lavagem. Secou-se a resina sob vácuo. A pureza em LCMS foi determinada por detecção ELS, 100%, m/z 204 [M++H] + .

Etapa 2 - Saponificação

A um balão de fundo redondo carregado com a resina da Etapa 1 (4 g, carga de 1,14 mmol/g, 4,56 mmol) adicionaram-se THF (16 ml) e MeOH (16 ml). À mistura reaccional adicionou-se uma solução de NaOH (0,91 g, 22,8 mmol, 5 eq) em água (16 ml). Agitou-se a mistura reaccional durante 48 h. A resina foi filtrada e lavada com água x 2, MeOH x 2, seguidos pelo procedimento padrão de lavagem. Secou-se a resina sob vácuo. A pureza em LCMS foi determinada por detecção ELS, 100% m/z 190 [M++H]+.

Preparação de derivados de SAHA

Os compostos baseados em SAHA foram preparados pelos métodos delineados adiante.

Os compostos (8), (9) e (10) foram preparados pela metodologia descrita no esquema seguinte: 53 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ

etilo t-butilo ΊΧί Η,. Pdfc EtOAc

@r< "xyt

Etapa 3

PyBOP, D) ΡΕΑ, DMF Etapa 4

As Etapas la 5 são exemplificadas para R = ciclopentilo

Etapa 1 - Síntese de éster ciclopentílico de ácido (S)-(3-nitrobenzilamino)fenilacético

Dissolveu-se brometo de 3-nitrobenzilo (46 mmol) em DMF (180 ml) e adicionou-se carbonato de potássio (92 mmol), seguido pelo éster de (S)-fenilglicina (10,6 g, 46 mmol). Agitou-se a mistura reaccional durante 17 h à t.a. antes de evaporação até à secura. Redissolveu-se o resíduo em EtOAc (150 ml) e lavou-se com água (3 x 80 ml), secou-se (Na2S04) 54 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ filtrou-se e concentrou-se até à secura. Após purificação por cromatografia flash em coluna (30% de EtOAc / hexano) o éster foi obtido e utilizado directamente na Etapa 2.

Etapa 2 - Síntese de éster ciclopentílico de ácido (S)-[terc-butoxicarbonil-(3-nitrobenzil)amino]fenilacético

Dissolveu-se o produto da Etapa 1 (40,9 mmol) em THF (250 ml) antes da adição de carbonato de potássio (61,4 mmol) e água (150 ml). Adicionou-se dicarbonato de di-terc-butilo (163 mmol) e aqueceu-se a mistura reaccional a 50°C durante 18 h. Adicionou-se DCM à mistura resultante e lavou-se consecutivamente com HC1 0,1 M (150 ml), NaHCCb aq. sat. e água (150 ml) . Secou-se a camada de DCM (Na2SC>4) , filtrou-se e concentrou-se até à secura. Após purificação por cromatografia flash em coluna (5% de EtOAc / hexano) isolou-se o sulfato do título e utilizou-se directamente na Etapa 3.

Etapa 3 - Síntese de éster ciclopentílico de ácido (S)-[(3-aminobenzil)-terc-butoxicarbonilamino]fenilacético

Dissolveu-se o produto da Etapa 2 (11,5 mmol) em EtOAc (150 ml) antes da adição de catalisador Pd/C (10% molhado) (0,8 g) e hidrogenou-se sob pressão de balão à t.a. durante 18 h. Filtrou-se a mistura reaccional através de uma almofada de celite e evaporou-se até à secura para originar um sólido. 55 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ

Etapa 4 - Acoplamento da resina

A resina de 2-clorotritil-hidroxilamina derivatizada com ácido subérico (1,0 g, carga 0,83 mmol/g) foi intumescida em DMF (15 ml) e adicionou-se PyBOP (1,36 g, 2,61 mmol), seguido de DIPEA (1,5 ml, 8,7 mmol). Dissolveu-se o produto da Etapa 3 (2,61 mmol) em DCM (15 ml) e adicionou-se à mistura reaccional. Agitou-se a mistura reaccional durante 24 h à t.a. A resina foi filtrada e lavada utilizando o procedimento padrão de lavagem. Secou-se a resina sob vácuo.

Etapa 5 - Síntese de éster ciclopentílico de ácido (S)-[3-(7-hidroxicarbamoíl-heptanoílamino)benzilamino]fenilacético, composto (S)

0 produto da Etapa 4 (carga de 0,83 mmol) foi suavemente agitado em TFA a 2%/DCM (10 ml) durante 20 min. Filtrou-se a resina. Evaporou-se o filtrado sob pressão reduzida à t.a. Tratou-se novamente a resina com TFA a 2%/DCM (10 ml) e filtrou-se após 20 min. Evaporaram-se os filtrados combinados até à secura sob pressão reduzida à t.a. para originar um resíduo oleoso. Deixou-se o resíduo repousar em TFA a 20%/DCM durante 40 min. Após evaporação até à secura, também sob pressão reduzida à t.a., purificou-se o produto bruto por HPLC preparativa.

Dados analíticos para o Composto 8

Pureza em LCMS 100%, m/z 496 [M++H]+, 2Η RMN ( 40 0 MHz, MeOD), δ: 1,30-1,70 (16H, m), 2,00 (2H, t), 2,30 (2H, t), 4,05 (2H, dd) , 5,00 (1H, m), 5,15 (1H, m), 7,05 (1H, m) , 7,30 (2H, m) , 7,40 (5H, m) , 7,75 (1H, m) . 56 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ

Dados analíticos para o Composto (10)

Pureza em LCMS 97%, m/z 484 [M++H]+, XH RMN ( 400 MHz,

MeOD), δ: 1,30 (13H, m), 1,45-1,65 (4H, m) , 1,93-2,05 (2H, m) , 2,20-2, 40 (2H, m) , 3,99 (2H, q) , 4,65-4, 95 (1H, m) 7,05 (1H, d), 7,25-7,33 (2 H, m), 7,35-7,50 (5H, m), 7,75 (1H, s).

Etapa 6 - Saponificação

Suspendeu-se o produto da Etapa 5 em que R = Et (1,4 g, carga de 0,83 mmol) em THF (8,6 ml) e MeOH (8,6 ml) e adicionou-se solução 1,4 M de hidróxido de sódio (5,98 mmol). Agitou-se a mistura durante 24 h e filtrou-se a resina e lavou-se com água x 2, MeOH x 2, seguidos pelo procedimento padrão de lavagem. Secou-se a resina sob vácuo.

Etapa 7 - Síntese de ácido (S)-[3-(7-hidroxicarbamoíl- heptanoílamino) benzilamino] fenilacético (9)

O produto da Etapa 6 (1,44 g, carga de 0,83 mmol) foi então suavemente agitado em TF A a 2%/DCM (10 ml) durante 20 min. Filtrou-se a resina e evaporou-se o filtrado sob pressão reduzida à t.a. Tratou-se novamente a resina com TFA a 2% /DCM (10 ml) e filtrou-se após 20 min. Evaporaram-se os filtrados combinados até à secura sob pressão reduzida à t.a. para originar um resíduo oleoso. Deixou-se o resíduo repousar em TFA a 20%/DCM durante 40 min. Após evaporação até à secura, sob pressão reduzida à t.a., purificou-se o produto bruto por HPLC preparativa para obter o composto (9). Pureza em LCMS de 100%, m/z 428 [M++H]+, ΤΗ RMN (400 MHz, MeOD), δ: 1,20-1,35 57 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ (4Η, m) , 1,50-1,65 (4Η, m) , 2,00 (2Η, m) , 2,30 (2Η, m) , 4,00 (2 Η, dd) , 4,90 (1Η, m) , 7,05 (1Η, m) , 7,25-7,50 (7Η, m) , 7,70 (1Η, m) .

Preparou-se ο composto (24) seguindo a mesma metodologia descrita para a síntese do composto (8). éster ciclopentílico de ácido ({(R)-[4-7-hidroxicarbamoil-heptanoílamino)fenil)fenilmetiljamino)acético (24)

O

Pureza em LCMS 95%, m/z 496 [M++H]+, XH RMN (400 MHz, DMSO) , 5:1,30-1,50 (6H, m), 1,50-1, 70 (8H, m), 1,80 (2H, m) , 2,10 (2H, t), 2,45 (2H, t), 4,1 (2H, dd) , 5,25 (1H, m) , 5,35 (1H, m), 7,45 (2H, d), 7,60 (5H, m), 7,80 (2H, d), 10,00-10,10 (2H, s lg), 10,50 (1H, s) . EXEMPLO DE REFERÊNCIA 2

Este exemplo descreve a modificação do inibidor de Quinase Aurora A ("Aurora A") conhecido, N-{4-(7-metoxi-6-metoxiquinolin-4-iloxi)fenil}benzamida (composto (11)) pela ligação de um motivo éster de aminoácido num ponto em que não ocorre ruptura do seu modo de ligação.

Composto (11): N-{4-(7-metoxi-6-metoxiquinolin-4-iloxi)fenilJbenzamida

0 composto (11) foi preparado como descrito na Patente US 6,143,764 58 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ

Os compostos baseados no composto (11) foram preparados pelos métodos delineados adiante.

Os compostos (12) e (13) foram preparados pelo método descrito no esquema seguinte:

59 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ

Etapa 1 - Síntese de N-(4-Hidroxifenil)benzamida

A uma solução de 4-aminofenol (4,27 g, 39,1 mmol) em DMF (50 ml), a 0°C sob uma atmosfera de árgon, adicionou-se trietilamina (7,44 ml, 53,4 mmol, 1,5 eq) . Agitou-se a mistura reaccional durante 10 min antes da adição lenta de cloreto de benzoílo (5 g, 35,6 mmol, 1 eq) ao longo de um período de 5 min. Deixou-se a mistura reaccional aquecer até à t.a. e agitou-se ao longo de 18 h. Removeu-se a DMF sob pressão reduzida e tratou-se a mistura com EtOAc/água. Resultou a precipitação de um sólido branco que foi removido por filtração e seco sob pressão reduzida para originar o composto do título (8,0 g, 96%). ΤΗ RMN (270 MHz, DMSO) , δ: 10,0 (1H, s), 9,35 (1H, s), 7,9 (2H, d, J = 7,2Hz), 7,5 (5H, m) , 6,75 (2H, d, J = 7,4Hz).

Etapa 2 - Síntese de N-[4-(7-benziloxi-6-metoxiquinolin-4- íloxí)fenil]benzamida

A um balão de fundo redondo carregado com 4-cloro-6-metoxi-7-benziloxiquinolina [veja-se Org. Synth. Col. Vol. 3, 272 (1955) e US006143764A (Kirin Beer Kabushiki Kaisha) para os métodos de síntese] (1,09 g, 3,6 mmol) adicionou-se o produto da Etapa 1 (2,33 g, 10,9 mmol, 3 eq) . Aqueceu-se a mistura reaccional a 140°C durante 3 h. Após arrefecimento até à t.a., adicionou-se água à mistura reaccional e extractou-se a mistura 3 vezes com EtOAc. Lavou-se a camada do EtOAc combinada com NaOH aq. a 5%, salmoura e secou-se sobre MgS04. 60 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ

Removeu-se ο solvente sob pressão reduzida e purificou-se por cromatografia em coluna eluindo com EtOAc / heptano (2:1) para obter o composto do título (0,56 g, 32%). m/z 477 [M++H].

Etapa 3 - Síntese de N—[4—(7—hidroxi—6—metoxiquinolin—4—

Aqueceu-se uma mistura do produto da Etapa 2 (0,56 g, 1,17 mmol) e Pd/C a 10% (0,08 g) em ciclo-hexeno a 10% / EtOH (80 ml) sob refluxo durante 3 h. O catalisador Pd/C foi filtrado através de uma almofada de celite, lavando duas vezes com MeOH. Concentrou-se o filtrado sob pressão reduzida para obter o composto do título sob a forma de um sólido amarelo (0,34 g, 75%). m/z 387 [M++H].

Etapa 4 - Síntese de éster ciclopentílico de ácido (S)-4-[4-(4-Benzoílaminofenoxi)-6-metoxiquinolin-7-iloxi]-2-terc-butoxicarbonilaminobutírico

A uma solução do produto da Etapa 3 (0,2 g, 0,52 mmol) em DCM anidro (30 ml) a 0°C adicionou-se éster ciclopentílico de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-4-hidroxibutírico (0,223 g, 0,78 mmol, 1,5 eq) em 5 ml de DCM. Adicionaram-se então Ph3P (0,557 g, 2,1 mmol, 4,1 eq) e DIAD (0,412 ml, 2,1 mmol, 4,1 eq) e deixou-se aquecer a mistura reaccional até à t.a. e agitou-se durante 16 h. Evaporou-se a mistura 61 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ reaccional bruta sob pressão reduzida e purificou-se por cromatografia em coluna para originar o composto do titulo (0,135 g, 46%). m/z 656,3 [M++H].

Etapa 5 - Síntese de éster ciclopentílico de ácido ((S)-2-amino-4-[4-(4-benzoílaminofenoxi)-6-metoxiquinolin-7-iloxi]butírico) (12)

A uma solução do produto da Etapa 4 (5,8 mg, 0,009 mmol) em DCM (1 ml) adicionou-se TFA (1 ml) . Deixou-se a mistura reaccional agitar durante 16 h antes de evaporação sob pressão reduzida, formando um azeótropo com tolueno para remover os vestígios de TFA. Isolou-se o composto (12) sob a forma de um sólido esbranquiçado (4,7 mg) . Pureza em LCMS de 95%, m/ z 556,2 [M+ + H] , ΤΗ RMN (270 MHz, DMSO), δ: 10,4 (1H, s) , 8, 8 (1H, d, J = 6,5Hz) , 8 , 55 (2H,s D, 8,01 (4H , m) , 7, 65 (4H, m) , 7,35 (1H, d, J = 7,6Hz), 6,75 (1H, d, J = 6,5Hz), 5,25 (1H, m) , 4,35 (3H, m) , 4,0 (3H, s), 2,4 (2H, m) , 1,85-1,4 (8H, m 1) .

Etapa 6 — Síntese de ácido (S)—4—[4—(4—benzoílaminofenoxi)—6— metoxiquinolin-7-iloxi]-2-terc-butoxicarbonilaminobutírico

A uma solução do produto da Etapa 4 (17 mg, 0,02 mmol) em THF (1 ml) adicionou-se NaOH 2 M (0,026 ml, 0,046 mmol, 2 eq). Após 16 h, a reacção estava incompleta de modo que se 62 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ adicionaram mais 2 equivalentes de NaOH. A agitação estava completa após 6 h e removeu-se o THF sob pressão reduzida. Diluiu-se a camada aq. com 3 ml de água e acidificou-se a pH 6 com HC1 1 Μ. O composto do título foi extractado para EtOAc, seco sobre MgS04 e isolado sob a forma de um sólido branco. Utilizou-se directamente na Etapa 7 sem purificação adicional.

Etapa 7 - Síntese de ácido (S)-4-[4-(4-benzoílaminofenoxi)-6-metoxiquinolin-7-iloxi]-2-terc-butilcarbonilaminobutírico (13)

A uma solução do produto da Etapa 6 (6,5 mg, 0,011 mmol) em DCM (1 ml) adicionou-se TFA (1 ml) . Deixou-se a mistura reaccional agitar durante 6 h e depois evaporou-se sob pressão reduzida para originar o composto do título (13) sob a forma de um sólido esbranquiçado (90%). Pureza em LCMS de 100%, m/z 488,2 [M++H] , XH RMN (300 MHz, MeOD) , õ: 8,75 (1H, d, J = 7, 8Hz) , 8,00 (4H, m) , 7,65 (4H, m) , 7,4 (1H, d, J = 7,6Hz), 6,95 (1H, d, J = 8,0Hz) , 4,6 (2H, m) , 4,3 (1H, m) , 4,2 (3H, s), 2,6 (2H, m). O composto (14) foi preparado pelo método descrito no esquema seguinte: 63 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ XX * 0¾ Λ Etapa 1 Η°η

0.0

Cl 14DDC DIWF Etapa 2

OU

°Ol

4?

Ciclo-hexeno/etanol Pd/C

Etapa 3 <Λ

K,CO,, DMF ΝΗ2

Etapa 4 Br °tx NH &

0 1 O.

V tx

Pd(OH)2, H2 EtOAc

Etapa 5 x

As Etapas 1, 2 e 3 sao as mesmas que foram descritas acima para a sintese do composto (12). 64 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ

Etapa 4 - Síntese de éster terc-butílico de ácido (S)-4-[4-(4-benzoílaminofenoxi)-6-metoxiquinolin-7-iloxi]-2-benziloxicarbonilaminobutírico

«Λ I

Dissolveram-se o produto da Etapa 3 (0,15 g, 0,39 mmol) , éster terc-butílico de ácido (S)-2-benziloxicarbonilamino-4-bromobutírico (0,16 g, 0,43 mmol, 1,1 eq) e K2CO3 (0,11 g, 0,78 mmol, 2 eq) em DMF anidra (10 ml) sob uma atmosfera de azoto. Agitou-se a mistura reaccional a 35°C durante a noite antes de remover a DMF sob pressão reduzida. Dissolveu-se o resíduo em DCM e lavou-se com água seguida de salmoura. Secou-se a camada orgânica sobre MgSCq e evaporou-se sob pressão reduzida. A cromatografia em coluna (eluindo com MeOH/ DCM a 1%) produziu o composto do título (0,16 g, 60%). m/z 678 [M+H]' + , X RMN (300 MHz r CDCI3) , δ: 8, 49 (1H, d, J = 5, 3Hz) , 7, 98 (1H, s) , 7, 92 (2H r dd, J = 8,2, 1, 4Hz), 7,80- 7 , 72 (2H, m) , 7 , 63- OO (4H, m) , 7 ,43- -7, 29 (4H, m) , 7,24-7,17 (2H , m) , 6, 64 (1H, d, J = 8 , 9Hz ), 6, 49 (1H, d, J = 5,3Hz), 5 ,15 (2H, s) , 4 , 66- 4,57 (1H, m) , 4, 43- 4,: 34 (1H, m) , 3,85 (3H, s ) , 2,55- 2, 33 (2H, m) , 1, 41 (9H, m ) ·

Etapa 5 - Síntese de éster terc-butílico de ácido -(S)-2- amino-4-[4-(4-benzoílaminofenoxi)-6-metoxiquinolin-7-iloxi]butírico (14)

Dissolveu-se o produto da Etapa 4 (0,045 g, 0,066 mmol), em EtOAc anidro (5 ml) e adicionou-se Pd(OH)2/C sob uma 65 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ atmosfera de azoto. Desgaseificou-se a mistura reaccional e agitou-se sob uma atmosfera de hidrogénio à t.a. durante a noite. 0 catalisador foi removido por filtração através de uma almofada de celite e removeu-se o solvente sob pressão reduzida. Purificou-se o composto (14) por HPLC preparativa. m/ z 544 [M+H] + , XH RMN (300 MHz , CD30D) , δ : 8, 67 (1H, d, J = 6,8Hz), 7, 98 (4H,d, J = 8, 7Hz) , 7, 90 (1H, s) , 7, 68- 7,51 (4H, m) , 7, 42 -7,36 ( 2H, m) r 6,97 (1H, d, J = 6,6Hz), 4, 52 (2H, t, J = 5, r 7Hz) \—1 00 CM t, r J = = 6, 5Hz) , 4, 13 (3H, s ) , 2,69- -2,45 (2H, m) , 1,53 (9H, s) .

Preparou-se o composto (25) pelo método descrito no esquema seguinte:

Etapa 1 - Síntese de éster ciclopentílico de ácido (S)-4-[4-(4-benzoílaminofenoxi)-6-metoxiquinolin-7-iloxi]-2-ciclo-hexilaminobutírico (25)

Ao composto (12) (37 mg, 0, 066 mmol) em MeOH anidro (1 ml) adicionou-se 100 pL de uma solução 1 M de ciclo-hexanona em MeOH e 1 gota de ácido acético. Agitou-se a mistura reaccional à t.a. durante 3 h. Adicionou-se então cianoboro-hidreto de sódio (10,3 mg, 0,165 mmol) e deixou-se a mistura reaccional a agitar durante 4 h à t.a., antes de concentração sob vácuo. A purificação por HPLC preparativa produziu o composto do título (25) sob a forma de um sal de di-TFA. m/z 638 [M+H]+. ΤΗ RMN (300 MHz, CD3OD) δ: 8,72 (1H, d, J = 6,8 Hz), 8,02-7, 98 (4H, m) , 7,93 (1H, s), 7,67 (1H, s), 66 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ 7, 66-7, 53 (3Η, m) , 7,42 (2Η, m) , 6,99 (1Η, d, J = 6,8 Hz), 5,38 (1H, m), 4,49 (3H, m), 4,14 (3H, s), 3,27 (11 H, m), 2,66 (2H, m), 2,20 (2H, m), 12,05-1,46 (16H, m). EXEMPLO DE REFERENCIA 3

Este exemplo descreve a modificação do inibidor de quinase P38 conhecido, 6-amino-5-(2,4-difluorobenzoil)-1-(2,6-difluorofenil)-lH-piridin-2-ona (composto 3258) pela ligação de um motivo éster de aminoácido num ponto em que não ocorre ruptura do seu modo de ligação.

Composto (15): 6-Amino-5-(2,4-difluorobenzoíl)-1-(2,6-difluorofenil)-lH-piridin-2-ona

Preparou-se o composto (15) como descrito em W003/076405.

Os compostos baseados no composto (15) foram preparados pelos métodos delineados adiante.

Os compostos (16) e (17) foram preparados pelo método descrito no esquema seguinte:

Composto (17) Composto (16) 67 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ

Etapa 1 - Síntese de (S)-4-{4-[6-amino-5-(2,4-difluorobenzoíl)-2-oxo-2H-piridin—1-il]-3,5-difluorofenoxi}-2-terc-butoxicarbonilaminobutirato de ciclopentilo

A uma mistura agitada de 6-amino-5-(2,4-difluorobenzoil)-1-(2,6-difluoro-4-hidroxifenil)-lH-piridin-2-ona [preparada pelos métodos descritos em W003/076405] (100 mg, 0,265 mmol) e K2CO3 em DMF (1,5 ml) adicionou-se éster ciclopentilico de ácido (L)-5-bromo-2-terc-butoxicarbonilaminopentanóico (96 mg, 0,265 mmol). Agitou-se a mistura reaccional a 60°C durante 2 h. Diluiu-se a mistura reaccional com EtOAc (15 ml) e lavou-se com NaHCCé aq sat (3 ml) e água (10 ml) . Secou-se a camada do EtOAc (Na2S04) , filtrou-se e concentrou-se até à secura. A purificação por cromatografia flash (20% de EtOAc / heptano) produziu o composto do titulo sob a forma de um sólido branco (50 mg, 29%) . Pureza em LCMS de 100%, m/z 648 [M++H] , ΤΗ RMN (400 MHz, MeOD), 5:1,30 (9H, s), 1, 40-1,65 (6H, m), 1, 70-1,85 (2H, m) , 1,95-2,30 (2H, m) , 4,00-4,10 (2H, m) , 4,15-4,20 (1H, m), 5,05-5,10 (1H, m) , 5,65 (1H, d), 6,70-6,80 (2H, m) , 6,95-7,05 (2H, m) , 7, 25-7, 45 (2H, m) .

Etapa 2 - Síntese de (S)-2-amino-4-{4-[6-amino-5-(2,4- difluorobenzoil)-2-oxo-2H-piridin-l-il]-3,5-difluorofenoxi}-butanoato trifluoroacetato de ciclopentilo (16)

Deixou-se repousar uma mistura do produto da Etapa 1 (10 mg) e TFA a 20%/DCM (0,5 ml) à t.a. durante 3 h.

Concentrou-se a mistura reaccional até à secura por sopragem sob N2. Triturou-se o resíduo com Et20 (0,3 ml x 2) para originar o composto (16) sob a forma de um sólido branco (9,3 mg, 91%). Pureza em LCMS de 100%, m/z 548 [M++H] , RMN 68 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ (400 ΜΗζ, MeOD) , δ: 1,55-1, 80 (6Η, m) , 1,85-2, 00 (2Η, m) , 2,30-2,50 (2 Η, m) , 4,15-4,30 (3 Η, m), 5,25-5,35 (1Η, m), 5,75 (1Η, d), 6,85-6,95 (2Η, m), 7,05-7,15 (2Η, m), 7,40-7,55 (2 Η, m) .

Etapa 3 - Síntese de ácido (S)-2-amino-4-{4-[6-amino-5-(2,4-difluorobenzoíl)-2-oxo-2H-piridin-l-il]-3,5-difluorofenoxi}-butanóico (17)

A uma solução do composto (16) (20 mg, 0,0317 mmol) numa mistura de MeOH (0,3 ml) e THF (0,3 ml) adicionou-se NaOH aq 2 M (0,3 ml) . Deixou-se repousar a mistura reaccional à TA durante 3h. Depois de completa a reacção evaporou-se a mistura reaccional até à secura por sopragem sob um fluxo de N2, acidificou-se a pH 1-2 por adição gota a gota de HC1 aq 2 M. Recolheu-se o resultante sólido branco formado por filtração. Rendimento = 9 mg, 48%., pureza em LCMS 97%, m/z 480 [M++H] , ΧΗ RMN (400 MHz, MeOD), δ: 2,35-2,55 (2H, m, CH2) , 4,15-4,20 (1H, m, CH) , 4,25-4, 35 (2H, m, CH2), 5,75 (1H, d, CH), 6,85-7, 00 (2H, m, Ar), 7, 05-7,20 (2H, m, Ar), 7,40-7,55 (2H, m, Ar) . O composto (18) foi preparado seguinte: pelo método descrito no esquema

Composto (18) 69 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ

Etapa 1 - Síntese de éster terc-butílico de ácido (S)-4-{4-[6-amino-5-(2,4-difluorobenzoíl)-2-oxo-2H-piridin-l-il]-3,5-difluorofenoxi}-2-benziloxicarbonilaminobutírico

A uma solução de 6-amino-5-(2,4-difluorobenzoíl)-l-(2,6-difluoro-4-hidroxifenil)-lH-piridin-2-ona (100 mg, 0,26 mmol) e éster t-butílico de ácido (S)-2-benziloxicarbonilamino-4-bromobutírico (108 mg, 0,29 mmol) em acetona (2 mL) adicionaram-se iodeto de sódio (79 mg, 0,53 mmol) e carbonato de potássio (146 mg, 1,06 mmol). Aqueceu-se a mistura reaccional em refluxo durante 12 h, arrefeceu-se e submeteu-se a partição entre água (20 ml) e acetato de etilo (20 ml) . Extractou-se novamente a camada aquosa com acetato de etilo (2x10 ml) e lavaram-se os extractos orgânicos combinados com salmoura (20 ml), secaram-se (MgSCM e concentraram-se sob pressão reduzida para originar um óleo amarelo. Submeteu-se este residuo a cromatografia em coluna [silica-gel, 40% de acetato de etilo-heptano] para originar o produto desejado (186 mg, 79%) sob a forma de um sólido incolor, m/z 670 [M+H] .

Etapa 2 - Síntese de éster terc-butílico de ácido (S)-2-amino-4—{4—[6-amino-5-(2,4-difluorobenzoíl)-2-oxo-2H-piridin-l-il]-3,5-difluorofenoxi}butírico

Dissolveu-se éster terc-butilico de ácido (S)—4—{4 — [6-amino-5-(2,4-difluorobenzoíl)-2-oxo-2H-piridin-l-il]-3,5-difluorofenoxi}-2-benziloxicarbonilaminobutírico (140 mg, 0,2 mmol) em acetato de etilo (15 mL) contendo 10% de hidróxido de paládio sobre carbono (20 mg) e agitou-se sob uma atmosfera de hidrogénio (1 atm) durante 1 h. Purgou-se a mistura reaccional com N2 e filtrou-se através de Celite® com lavagem com mais acetato de etilo. Concentrou-se o filtrado 70 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ sob pressão reduzida para originar um sólido que se submeteu a cromatografia em coluna [silica-gel: 5% de MeOH em diclorometano]. Isto originou o produto pretendido (60 mg, 54%) sob a forma de um sólido cinzento: pureza em LCMS 98%, m/z 536 [M+H] +, 1H RMN (300 MHz, CDC13) 7,65-7, 44 (1H, m) , 7,39-7,29 (2H, m), 6,96-6,82 (2H, m), 6,66 (2H, d lg, J=8,1 Hz), 5,82 (1H, d, J=9,9 Hz), 4,20-4, 07 (3H, m) , 3,48 (1H, dd, J=4,8, 8,7 Hz), 2,22-2,15 (1H, m), 1,91-1,84 (1H, m) , 1,62 (2H, s lg), 1,43 (9H, s). EXEMPLO DE REFERENCIA 4

Este exemplo descreve a modificação do inibidor de DHFR conhecido, 5-metil-6-((3,4,5-trimetoxifenilamino)metil)pirido-[2,3-d]pirimidino-2,4-diamina (composto (2 G=N)) pela ligação de um motivo éster de aminoácido num ponto em que não ocorre ruptura do seu modo de ligação.

Composto (2 G=N): 5-Metil-6-((3,4,5-trimetoxifenilamino)-metilo)pirido[2,3-d]pirimidino-2,4-diamina OMe

O composto (2 G=N) foi preparado por uma modificação do método descrito em J. Med. Chem. 1993, 36, 3437-3443.

Agitaram-se 2,4-diamino-5-metilpirido[2,3-d]pirimidino-6-carbonitrilo (0,10 g, 0,5 mmol), 3,4, 5-trimetoxianilina (0,10 g, 0,55 mmol) e níquel de Raney (0,7 g, húmido) em ácido acético (20 ml) à t.a. sob uma atmosfera de hidrogénio. Após 2 h filtrou-se a mistura reaccional através de celite e evaporou-se o solvente sob pressão reduzida. Purificou-se o resíduo bruto por HPLC de fase inversa para produzir o composto (2 G=N) sob a forma de um sólido (22 mg, 16%). Pureza em LCMS de 94%, m/z 371,1 [M+H]+, 1H RMN (400 MHz, DMSO) , δ: 8,5 (1H, s), 7,0 (2H, s 1), 6,2 (2H, s 1), 6,0 (2H, s), 5,7 (1H, m) , 4,2 (2H, d), 3,7 (6H, s) , 3,5 (3H, s) , 2,7 (3H, s) . 71 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ

Os compostos baseados no composto (2 G=N) foram preparados pelos métodos delineados adiante.

Os compostos (6) e (19) foram preparados pelo método descrito no esquema seguinte:

Etapa 2

Ácido fórmico Et-N, EtOH Pd/C

Etapa 1 - Síntese de 4-metil-2-(4-nitrobenzamido)pentanoato de (S)-ciclopentilo

Adicionou-se cloreto de 4-nitrobenzoilo (0,60 g, 3,9 mmol) em DCM (2 ml) gota a gota ao longo de 10 min a uma solução de 2-amino-4-metilpentanoato de (S)-ciclopentilo 72 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ (0,70 g, 3,5 mmol) e diisopropiletilamina (0,94 ml, 5,3 mmol) em DCM (10 ml) a -5°C sob uma atmosfera de azoto. Depois da adição completa deixou-se a mistura reaccional aquecer até à t.a. e agitou-se durante mais 30 min. Verteu-se a mistura reaccional em NaHCC>3 aq. sat. e extractou-se a camada aquosa com DCM. Combinaram-se os extractos orgânicos, lavaram-se com salmoura, secaram-se sobre MgS04 e evaporaram-se sob pressão reduzida para produzir o composto do titulo sob a forma de um sólido oleoso com rendimento quantitativo. Pureza em LCMS de 92%, m/z 347,1 [M+H]+.

Etapa 2 - Síntese de 2-(4-aminobenzamido)-4-metilpentanoato de (S)-ciclopentilo

Dissolveram-se trietilamina (1,09 g, 10,8 mmol) e ácido fórmico (0,50 g, 10,8 mmol) em EtOH (10 ml) e adicionaram-se a

uma solução do produto da Etapa 1 (1,2 g, 3,4 mmol) em EtOH

(10 ml). Adicionou-se Pd/C a 10% (aproximadamente 10% mol) e aqueceu-se a mistura em refluxo. Após lha mistura reaccional quente foi filtrada através de celite e lavou-se o resíduo com MeOH. Combinaram-se o filtrado e as lavagens e evaporaram-se, e submeteu-se o resíduo a partição entre DCM e NaHC03 aq. sat. Lavou-se a camada orgânica com salmoura, secou-se sobre MgS04 e evaporou-se sob pressão reduzida para produzir o composto do título sob a forma de um sólido branco (0,80 g, 73%) . Pureza em LCMS de 97%, m/z 319,2 [M+H]+, ΤΗ RMN (400 MHz, CDC13) , δ: 7,6 (2H, dd) , 6,6 (2H, dd), 5,2 (1H, m) , 6,4 (1H, d) 4,7 (1H, m) , 4,0 (2H, s), 1,9 (2H, m) , 1,7 (5H, m), 1,6 (4H, m), 0,9 (6H, dd). 73 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ

Etapa 3 - Síntese de éster ciclopentílico de ácido (S)-2-{4-[(2,4-diamino-5-metilpirido[2,3-d]pirimidin-6-ilmetil)amino]-benzoílamino}-4-metilpentanóico (6)

Agitaram-se 2, 4-diamino-5-metilpirido[2,3-d]pirimidino-6-carbonitrilo (0,47 g, 2,4 mmol), o produto da Etapa 2 (300 mg, 0,94 mmol) e níquel de Raney (1 g, húmido) em ácido acético (40 ml), à t.a. sob uma atmosfera de hidrogénio. Após 48 h filtrou-se a mistura reaccional através de celite e evaporou-se o solvente sob pressão reduzida. Carregou-se o material em MeOH numa coluna SCX e eluíu-se com uma solução de amónia a 1% em MeOH. Adsorveu-se então o produto bruto sobre sílica e purificou-se por cromatografia em coluna (10% de MeOH/DCM) para produzir o composto (6) (60 mg, 13%). Pureza em LCMS de 95 %, m/z 506,1 [M+H]+, 1H RMN (400 MHz, DMSO), δ: 8,5 (1H, s), 8,2 (1H, d), 7,7 (2H, d), 7,0 (2H, s 1), 6,7 (2H, d), 6,5 (1H, m) , 6,2 (2H, s 1), 5,1 (1H, m) , 4,4 (1H, m) , 4,3 (2H, d), 2,7 (3H, s), 1,7 (11H, m) , 0,9 (6H, dd) .

Etapa 4 - Síntese de ácido (S) -2-(4-((2,4-diamino-5-metilpirido[2,3-d]pirimidin-6-il)metilamino)benzamido)-4-metilpentanóico (19)

Suspendeu-se o produto da Etapa 3 (39 μΜ) em EtOH (1,0 ml) . Adicionou-se uma solução de hidróxido de litio 1 M (156 μΐ) e deixou-se a suspensão agitar durante 48 h. Subsequentemente removeu-se o EtOH sob pressão reduzida, 74 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ diluiu-se ο material residual com água e levou-se a pH 4 com ácido acético diluído. Lavou-se a solução com DCM, evaporou-se e submeteu-se a purificação em SCX para produzir o composto (19). Pureza em LCMS 92%, m/z 438 [M+H]+; ΧΗ RMN (400 MHz, DMSO) õ: 8,5 (1H, s), 8,1 (1H, d), 7,7 (2H, d), 7,2 (2H, s lg), 6,7 (2H, d), 6,5 (1H, t), 6,4 (2H, s lg), 4,4 (1H, m) , 4,3 (2H, d), 2,7 (3H, s), 1,8 - 1,6 (2H, m) , 1,6 - 1,5 (1H, m), 0,9 (6H, dd). O composto (5) e o correspondente ácido foram preparados pelo método descrito no esquema seguinte:

75 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ

Etapa 1 - Síntese de 4-metil-2-(4-nitrobenzilamino)pentanoato de (S)-ciclopentilo

A uma solução de 2-amino-4-metilpentanoato de (S)-ciclopentilo (2,00 g, 10,0 iranol) e 4-nitrobenzaldeído (3,04 g, 20,0 iranol) em DCM (40 ml) adicionou-se ácido acético glacial (2 gotas). Deixou-se a solução agitar à t.a. durante 1 h após o que se adicionou triacetoxiboro-hidreto de sódio (6,40 g, 30,2 mmol) numa só porção. Após agitação durante 3 h, verteu-se a solução em HC1 aq. 1 M, deixou-se agitar durante 30 min, neutralizou-se com NaOH aq. 1 M e extractou-se com DCM. Lavaram-se os extractos orgânicos combinados com água e salmoura, secaram-se sobre MgS04, e evaporaram-se sob pressão reduzida. Purificou-se o material bruto por cromatografia (5% de EtOAc / iso-hexano) para produzir o composto do título sob a forma de um óleo (1,51 g) . Utilizou-se este material sem purificação adicional no passo seguinte. Pureza em LCMS de 71%, m/z 335,1 [M-H]+.

Etapa 2 - Síntese de éster ciclopentílico de ácido (S)-2-(4-aminobenzilamino)-4-metilpentanóico

Dissolveu-se o produto da Etapa 1 (0,90 g, 2,7 mmol) em

EtOH (5 ml) e adicionou-se a uma suspensão de níquel de Raney (~0,5 g) e mono-hidrato de hidrazina (0,38 ml, 8,1 mmol) em EtOH (5 ml). Após aquecimento sob refluxo durante lha mistura reaccional quente foi filtrada através de celite e lavou-se o resíduo com MeOH. Combinaram-se o filtrado e as lavagens e evaporaram-se, e submeteu-se o resíduo a partição entre DCM e hidrogenocarbonato de sódio aq. sat. Lavou-se a 76 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ camada orgânica com salmoura, secou-se sobre MgSC>4 e evaporou-se sob pressão reduzida. Purificou-se o material

bruto por cromatografia (20% de EtOAc / iso-hexano) para produzir o composto do titulo sob a forma de um óleo (0,50 g, 61%) . Pureza em LCMS de 99%, m/z 305,2 [M+H]+, 1H RMN (400 MHz, CDC13) , õ: 7,1 (2H, d), 6,6 (2H, d), 5,2 (1H, m) , 3,7 (1H, d), 3,5 (1H, d), 3,2 (1H, t), 1,9 (2H, m) , 1,7 (5H, m), 1,6 (4H, m), 0,9 (6H, dd).

Etapa 3 - Síntese de éster ciclopentílico de ácido (S)-2-{4-[(2,4-diamino-5-metilpirido[2,3-d]pirimidin-6-ilmetil)amino]-benzilamino}-4-metilpentanóico (5)

Agitaram-se 2,4-diamino-5-metilpirido[2,3-d]pirimidino-6-carbonitrilo (0,16 g, 0,83 inmol), o produto da Etapa 2 (100 mg, 0,33 mmol) e níquel de Raney (1 g, húmido) em ácido acético (10 ml), à t.a. sob uma atmosfera de hidrogénio. Após 5 h filtrou-se a mistura reaccional através de celite e evaporou-se o solvente sob pressão reduzida. Carregou-se o material em MeOH sobre uma coluna SCX e eluíu-se com uma solução a 1% de amónia em MeOH. Adsorveu-se então o produto bruto em sílica e purificou-se por cromatografia em coluna (10% de MeOH/DCM) para produzir o composto do título (5)

(30 mg, 19%). Pureza em LCMS de 95 %, m/z 492,1 [M+H]+, RMN (400 MHz, DMSO) , δ: 8,5 (1H, s) , 7,2 (2H, s 1), 7,0 (2H, d), 6,6 (2H, d), 6,2 (2H, s 1), 5,8 (1H, m), 5,1 (1H, m), 4,2 (2H, s), 3,6 (1H, m) , 3,4 (1H, m) , 3,1 (1H, m) , 2,7 (3H, s), 1,5 (11 H, m), 0,8 (6H, dd). 77 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ

Etapa 4 - Síntese de ácido (S)-2-{4-[(2,4-diamino-5-metilpirido[2,3-d]pirimidin-6-ilmetil)amino]benzilamino}-4-metilpentanóico

Suspendeu-se o produto da Etapa 3 (39 μΜ) em EtOH (1,0 ml). Adicionou-se uma solução de hidróxido de litio 1 M (156 μΐ) e deixou-se a suspensão agitar durante 48 h. Subsequentemente removeu-se o EtOH sob pressão reduzida, diluiu-se o material residual com água e levou-se a pH 4 com ácido acético diluído. Lavou-se a solução com DCM, evaporou-se e submeteu-se a purificação em SCX para produzir o composto do título. LCMS : 95% de pureza a Rt 0,52 e 1,91 min, m/z (ES + ) 424 [M+H] +; RMN (400 MHz, DMSO) δ: 8,5 (1H, s), 7,1 (2H, d), 7,0 (2H, s lg), 6,6 (2H, d), 6,2 (2H, s lg), 5,7 (1H, t), 4,3 (2H, d), 3,6 (1H, m), 3,3 (2H, obscurecido por água), 2,7 (3H, s), 1,8 (1H, m), 1,3 (1H, m), 1,2 (1H, m). O composto (3) foi preparado pelo método descrito no esquema seguinte: 78 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ

OjN

NHBoc"

Br

NaH, THF. DMF Etapa 1

Ácido fórmico EtjN, RdíC EtOH ^„-0 NHBoc

Etapa 2

NHBoc TFA/DCM Etapa 4

Etapa 1 - Síntese de 2-(terc-butoxicarbonilamino)-4-(4-nitrofenoxi)butanoato de (S)-ciclopentilo

A uma solução de 4-nitrofenol (2,18 g, 15,7 mmol) em tetra-hidrofurano (100 ml), a 0°C e sob azoto, adicionou-se hidreto de sódio (0,63 g, 15,7 mmol). Após aquecimento até à t.a. e agitação durante 10 min, adicionou-se uma solução de 4-bromo-2-(terc-butoxicarbonilamino)butanoato de (S)- ciclopentilo (5,0 g, 14,3 mmol) em DMF (20 ml) . Aqueceu-se a mistura reaccional a 60°C durante 10 h, após as quais se arrefeceu a mistura reaccional até à t.a. e se verteu sobre éter/ carbonato de sódio. Recolheu-se a camada orgânica e lavou-se com solução de carbonato de sódio aq. 2 M, HC1 1 M e 79 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ salmoura antes de secagem sobre MgS04 e concentrou-se sob pressão reduzida para produzir um óleo que solidificou por repouso para obter o composto do titulo (4,0 g, 69%). Pureza em LCMS de 97%, m/z 407, 1 [M+H]+, ΤΗ RMN (400 MHz, CDC13) , δ: 8,2 (2H, d), 7,4 (1H, d), 7,1 (2H, d), 5,1 (1H, m) , 4,1 (3H, m), 2,1 (2H, m), 1,8 (2H, m), 1,6 (6H, m), 1,4 (9H, s).

Etapa 2 - Síntese de 4-(4-aminofenoxi)-2-(terc-butoxicarbonil-amino)butanoato de (S)-ciclopentilo

Dissolveram-se trietilamina (0,77 ml, 5,2 mmol) e ácido fórmico (0,19 ml, 5,2 mmol) em EtOH (4 ml) e adicionaram-se a uma solução do produto da Etapa 1 (0,7 g, 1,7 mmol) em EtOH (4 ml). Adicionou-se Pd/C a 10% (aproximadamente 10% mol) e aqueceu-se a mistura em refluxo. Após 2 h a mistura reaccional quente foi filtrada através de celite e lavou-se o resíduo com MeOH. Combinaram-se o filtrado e as lavagens e evaporaram-se, e submeteu-se o resíduo a partição entre DCM e hidrogenocarbonato de sódio aq. sat. Lavou-se a camada orgânica com salmoura, secou-se sobre MgS04 e concentrou-se sob pressão reduzida. Purificou-se o resíduo por cromatografia em coluna (eluição com gradiente, 10-40% de EtOAc em hexano) para produzir o composto do título (0,3 g, 46%). Pureza em LCMS de 93%, m/z 379, 1 [M+H]+, ΤΗ RMN (400 MHz, CDC13) , δ: 6,9 (2H, d), 6,8 (2H, d), 5,3 (2H, m) , 4,4 (1H, m) 4,0 (2H, m) , 2,3 (1H, m) , 2,2 (1H, m) , 1,9 (2H, m) , 1,7 (4H, m) , 1,6 (2H, m) , 1,4 (9H, s) .

Etapa 3 - Síntese de 2-(terc-butoxicarbonilamino)-4-(4-((2,4-diamino-5-metilpirido[2,3-d]pirimidin-6-il)metilamino)fenoxí)butanoato de (S)-ciclopentilo

Agitaram-se 2,4-diamino-5-metilpirido[2,3-d]pirimidino-6-carbonitrilo (0,50 g, 2,5 mmol), o produto da Etapa 2 (0,38 g, 80 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ 1,0 mmol) e níquel de Raney (3 g, húmido) em ácido acético (40 ml), à t.a. e sob uma atmosfera de hidrogénio. Após 16 h filtrou-se a mistura reaccional através de celite e evaporou-se o solvente sob pressão reduzida. Carregou-se o

material em MeOH sobre uma coluna SCX e eluíu-se com uma solução a 1% de amónia em MeOH. Adsorveu-se então o produto bruto sobre sílica e purificou-se por cromatografia em coluna (5% de MeOH/DCM) para produzir o composto do título (145 mg, 26%) . Pureza em LCMS de 95%, m/z 566,2 [M+H]+, ΤΗ RMN (400 MHz, DMSO), δ: 8,5 (1H, s), 7,3 (2H, m), 7,0 (2H, m), 6,7 (2H, d), 6,6 (2H, d), 6,2 (2H, s 1), 5,5 (1H, s 1), 5,1 (1H, m) , 4,1 (3H, m) , 3,9 (2H, m) , 2,6 (3H, s) , 2,0 (1H, m) , 1,8 (3H, m), 1,6 (6H, m), 1,4 (9H, s).

Etapa 4 - Síntese de éster ciclopentílico de ácido (S)-2-amino-4-{4-[(2,4-diamino-5-metilpirido[2,3-d]pirimidin-6-ilmetil)amino]fenoxijbutírico (3)

A uma solução do produto da Etapa 3 (145 mg, 0,26 mmol) em DCM (3 ml) adicionou-se ácido trifluoroacético (3 ml) e agitou-se a mistura reaccional durante 30 min à t.a. Evaporou-se o solvente sob pressão reduzida e purificou-se o resíduo bruto por carga em MeOH sobre uma coluna SCX e eluindo com uma solução a 1% de amónia em MeOH para produzir composto (3) (39 mg, 33%). Pureza em LCMS de 94 %, m/z 466,1 [M+H]+, ΤΗ RMN (400 MHz, DMSO), δ: 8,5 (1H, s), 7,0 (2H, s 1), 6,7 (2H, d), 6,6 (2H, d), 6,2 (2H, s 1), 5,5 (1H, s 1), 5,1 (1H, m) , 4,1 (2H, s), 3,9 (2H, m) , 3,4 (1H, m) , 2,7 (3H, s), 2,0 (2H, m) , 1,8 (3H, m) , 1,6 (6H, m) . O composto (4) foi preparado pelo método descrito no esquema seguinte: 81 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ 02Ν

NHBOC'

NaH, THF, DMF

Βγ

Etapa 1

OjN NHBoc

TFA/DCM

Etapa 2

OjN

MeOH Etapa 3

Na(OAc)3BH4

Etapa 4

Ácido fórmico Et,N, Pd/C EtOH

H2N

Ni de Raney AcOH

Etapa 5

A Etapa 1 é a mesma que se descreveu para o composto (3).

Etapa 2 - Síntese de 2-amino-4-(4-nitrofenoxi)butanoato de (S)-ciclopentilo

A uma solução do produto da Etapa 1 (4,0 g, 9,8 mmol) em DCM (12 ml) adicionou-se ácido trifluoroacético (12 ml). Após 82 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ agitação à t.a. durante 1 h diluiu-se a mistura reaccional com DCM, arrefeceu-se em gelo e neutralizou-se pela adição de amónia aq. Recolheu-se a camada orgânica e lavou-se com água, hidrogenocarbonato de sódio aq. e salmoura, depois secou-se sobre MgS04 e concentrou-se sob pressão reduzida para produzir o composto do titulo sob a forma de um óleo amarelo (3,0 g, 100%) . Pureza em LCMS de 97%, m/z 309,1 [M+H]+, ΤΗ RMN (400 MHz, CDC13) , δ: 8,2 (2H, d), 7,0 (2H, d), 5,2 (1H, m) , 4,2 (2H, m), 3,6 (1H, dd), 1,7-1,5 (10H, m).

Etapa 3 - Síntese de 2-(ciclo-hexilamino)-4-(4-nitrofenoxi)-butanoato de (S)-ciclopentilo

A um balão contendo o produto da Etapa 2 (1,0 g, 3,3 mmol) e ciclo-hexanona (0,34 ml, 3,3 mmol) sob azoto adicionou-se MeOH anidro (10 ml). Após agitação durante 12 h à t.a. adicionou-se triacetoxiboro-hidreto de sódio (2,07 g, 9,75 mmol). Após 4 h verteu-se a mistura reaccional lentamente numa mistura de DCM / HC1 aq. (1 M) . Após agitação durante 10 min recolheu-se a camada orgânica e lavou-se com hidrogenocarbonato de sódio e salmoura, depois secou-se sobre MgS04 e concentrou-se sob pressão reduzida para produzir o composto do titulo sob a forma de um sólido oleoso amarelo (1,21 g, 95%). Pureza em LCMS de 92%, m/z 391,1 [M+H]+.

Etapa 4 - Síntese de 4-(4-aminofenoxi)-2-(ciclo-hexilamino)-butanoato de (S)-ciclopentilo h2n

Dissolveram-se trietilamina (1,29 ml, 9,3 mmol) e ácido fórmico (348 μΐ, 9,3 mmol) em EtOH (10 ml) e adicionaram-se a uma solução do produto da Etapa 3 (1,2 g, 3,1 mmol) em EtOH (10 ml). Adicionou-se Pd/C a 10% (aproximadamente 10% mol) e 83 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ aqueceu-se a mistura em refluxo. Após 30 min a mistura reaccional quente foi filtrada através de celite e lavou-se o resíduo com MeOH. Combinaram-se o filtrado e as lavagens e evaporaram-se, e submeteu-se o resíduo a partição entre DCM e NaHCCb aq. sat. Lavou-se a camada orgânica com salmoura, secou-se sobre MgS04 e concentrou-se sob pressão reduzida para produzir o composto do título (1,01 g, 92%). Pureza em LCMS de 94%, m/z 361,1 [M+H]+, ΤΗ RMN (400 MHz, CDC13) , δ: 6,7 (2H, d), 6,6 (2H, d), 5,2 (1H, m) , 4,0 (1H, m) , 3,9 (1H, m) , 3,5 (1H, dd) , 2,3 (1H, m) , 2,1 (1H, m) , 1,9 (4H, m) , 1,7 (7H, m) , 1,6 (3H, m) , 1,3-0,9 (5H, m) .

Etapa 5 - Síntese de éster ciclopentílico de ácido (S)-2-ciclo-hexilamino-4-{4-[(2,4-diamino-5-metilpirido[2,3-d]-pirimidin-6-ilmetil)amino]fenoxijbutírico (4)

Agitaram-se 2,4-diamino-5-metilpirido[2,3-d]pirimidino-6-carbonitrilo (0,50 g, 2,5 mmol), o produto da Etapa 4 (0,36 g, 1,0 mmol) e níquel de Raney (3 g, húmido) em ácido acético (40 ml) à t.a. e sob uma atmosfera de hidrogénio. Após 48 h filtrou-se a mistura reaccional através de celite e evaporou-se o solvente sob pressão reduzida. Carregou-se o material em MeOH sobre uma coluna SCX e eluíu-se com uma

solução a 1% de amónia em MeOH. Adsorveu-se então o produto bruto sobre sílica e purificou-se por cromatografia em coluna (10% de MeOH/DCM) para produzir o composto do título (76 mg, 14%) . Pureza em LCMS de 90%, m/z 548,2 [M+H]+, 2H RMN (400 MHz, DMSO) , δ: 8,5 (1H, s), 7,0 (2H, s 1), 6,7 (2H, d), 6,6 (2H, d), 6,2 (2H, s 1), 5,5 (1H, m), 5,1 (1H, m) , 4,1 (2H, s), 3,9 (2H, m) , 3,4 (1H, m) , 2,7 (3H, s), 2,3 (1H, m) , 1,9 (1H, m), 1,8 (4H, m), 1,6 (11 H, m), 1,1 (5H, m). EXEMPLO DE REFERÊNCIA 5

Este exemplo descreve a modificação do inibidor de quinase PI3 conhecido, N-[5-(4-cloro-3-metanossulfonilfenil)-4-metiltiazol-2-il]acetamida (composto (20)) pela ligação de 84 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ um motivo éster de aminoácido num ponto em que não ocorre ruptura do seu modo de ligação.

Composto (20): N-[5-(4—cloro—3—methanossulfonilfenil)—4— metiltiazol—2—il]acetamida

o=s=o 0 composto (20) foi preparado como descrito em WO03072552.

Os compostos baseados no composto (20) foram preparados pelos métodos delineados adiante.

Os compostos (21) e (22) foram preparados pelo método descrito no esquema seguinte: 85 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ

Acido clorossulfónico - Ct οι-

Etapa 1

0=5—0 Cl i) Na2S03, NaHCO, água/dioxano ii) Mel, DMF Etapa 2

Br2, dioxano

Etapa 3

de 2-cloro-5-(2-

Etapa 1 - Síntese de cloreto oxopropil)benzenossulfonilo r

Cl o o=s=

I

Cl

Adicionou-se 4-clorofenilacetona (4 g, 0,023 mol) gota a gota a ácido clorossulfónico (30 ml, 0,45 mol) a -10°C sob N2 com agitação suave. Deixou-se a mistura reaccional aquecer 86 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ até à t.a. e continuou-se a agitação durante 18 h. Extinguiu-se cuidadosamente a reacção por adição, gota a gota, de gelo moído (500 ml) . Extractou-se a solução aq. com EtOAc (3 x 250 ml) . Combinaram-se as camadas de EtOAc, secaram-se (Na3S04) , filtraram-se e concentraram-se até à secura in vacuo para originar o composto do título em bruto (6,3 g, 65%) que se utilizou no passo seguinte sem purificação adicional. Pureza em LCMS de 92%. ΧΗ RMN (400 MHz, CDC13) , δ: 2,30 (3H, s), 3,85 (2H, s), 7,50 (1H, d), 7,65 (1H, d), 7,95 (1H, s).

Etapa 2 - Síntese de 1-(4-cloro-3-metanossulfonilfenil)propan-2-ona

o=s=o

Agitou-se uma mistura de Na2S03 (3,79 g, 0,030 mol) e NaHC03 (2,53 g, 0,030 mol) em água (90 ml) a 70°C. A esta solução adicionou-se uma solução do produto da Etapa 1 (4,65 g, 0,015 mol) em dioxano (190 ml). Continuou-se a agitação a 70°C durante 1 h. Após arrefecimento até à t.a. concentrou-se a mistura reaccional até à secura in vacuo originando um sólido castanho. Adicionou-se DMF (190 ml) seguida por Mel (1,88 ml, 0,030 mol). Agitou-se a mistura reaccional a 40 °C durante 1 h. Depois de completa a reacção verteu-se a mistura reaccional em água (90 ml) e extractou-se com EtOAc (500 ml). Secou-se o EtOAc (Na2S04) , filtrou-se e concentrou-se in vacuo para originar o composto do título sob a forma de um sólido castanho (2,49 g, 67%) que se utilizou no passo seguinte sem purificação adicional. Pureza em LCMS de 81%, m/z 247 [M++H]; ΧΗ RMN (400 MHz, CDC13) , δ: 2,15 (3H, s), 3,20 (3H, s), 3,75 (2H, s), 7,35 (1H, d), 7,45 (1H, d), 7,85 (1H, S) . 87 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ

Etapa 3 - Síntese de 1-bromo-l-(4-cloro-3-metanossulfonil-fenil)propan-2-ona

Br

A uma solução agitada do produto da Etapa 2 (1,88 g, 7,60 mmol) em 1,4-dioxano (120 ml) adicionou-se bromo (0,292 ml, 5,72 mmol), gota a gota, à t.a., originando uma solução cor-de-laranja escura. Continuou-se a agitação durante 18 h. Evaporou-se a mistura reaccional até à secura in vacuo evitando aquecer acima de 30°C durante a evaporação. Redissolveu-se o resíduo em EtOAc (100 ml) e lavou-se com NaHCCg aq sat (20 ml) seguido de água (20 ml) . Secou-se a camada do EtOAc (Na2S04) , filtrou-se e concentrou-se in vacuo. A purificação por cromatografia flash (50% de EtOAc / heptano) originou o composto do título sob a forma de um óleo amarelo (2,0 g, 80%) . Pureza em LCMS de 74%, m/z 325/327 [M++H]; ΧΗ RMN (400 MHz, CDC13) , δ: 2,35 (3H, s), 3,25 (3H, s), 5,35 (1H, s), 7,50 (1H, d), 7,65 (1H, dd), 8,05 (1H, s).

Etapa 4 - Síntese de 5-(4-cloro-3-metanossulfonilfenil)-4-metiltiazol-2-ilamina

Agitou-se uma mistura do produto da Etapa 3 (2 g, 6,15 mmol) e tioureia (468 mg, 6,15 mmol) em EtOH (65 ml) a 70°C durante 1,5 h. Arrefeceu-se então a mistura reaccional até à t.a. e ocorreu precipitação. Recolheu-se o sólido creme por filtração para produzir o composto do título (1,2 g, 64%). Pureza em LCMS de 91%, m/z 303 [M++H] , ΤΗ RMN (400 MHz, MeOD) , δ: 2,35 (3H, s), 3,35 (3H, s), 7, 75-7, 85 (2H, m) , 8,15 (1H, s) . 88 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ

Etapa 5 - Síntese de éster ciclopentílico de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-4-[5-(4-cloro-3-metanossulfonilfenil)-4-metiltiazol-2-ilcarbamoíl]butírico

A uma mistura agitada de éster 1-ciclopentilico de ácido 2-terc-butoxicarbonilaminopentanodióico (208 mg, 0,66 mmol), EDCI (190 mg, 0,99 mmol) e HOBt (107 mg, 0,79 mmol) em DMF (1,5 ml) adicionou-se gota a gota uma solução do produto da Etapa 4 (200 mg, 0,66 mmol) em DMF (1,5 ml) à t.a.

Adicionou-se trietilamina (0,138 ml,0,99 mmol) e continuou-se a agitação durante 18 h. Diluiu-se a mistura reaccional com água (10 ml) e extractou-se com EtOAc (15 ml) . Lavou-se a camada do EtOAc com água (10 ml), secou-se (Na2S04),

filtrou-se e concentrou-se in vacuo. A purificação por TLC preparativa (70% de EtOAc/ heptano, Rf = 0,5) produziu o composto do titulo (160 mg, 40%). Pureza em LCMS de 91%, m/z 600/602 [M++H] , ΤΗ RMN (400 MHz, DMSO) , δ: 1,45-1,55 (9H, s), 1,65-2,15 (10H, m), 2,45 (3H, s), 2,70 (2H, m) , 3,45 (3H, s), 4,10-4,25 (1H, m) , 5,25 (1H, m) , 7, 75-7, 90 (2H, m) , 8,25 (1H, s) .

Etapa 6 - Síntese de éster ciclopentílico de ácido (S)-2- amino-4-[5-(4-cloro-3-metanossulfonilfenil)-4-metiltiazol-2-ilcarbamoíl]butírico (21)

Deixou-se (140 mg, 0,233 3 h. Após a reaccional in 100%). Pureza

Etapa 5 durante mistura (143 mg, RMN agitar uma solução do produto da mmol) em TFA a 20% / DCM (2 ml) à t.a., reacção completa concentrou-se a vacuo para originar composto (21) em LCMS de 97%, m/z 500/502 [M++H] , 89 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ (400 ΜΗζ, MeOD), δ: 1,35-1,85 (8Η, m), 2,00-2,20 (2Η, m), 2,25 (3 Η, s) , 2,60 (2 Η, m), 3,20 (3Η, s), 3,85-4, 00 (1Η, m), 5,10 (1Η, m) , 7,50-7,65 (2Η, m), 7,95 (1Η, s).

Etapa 7 - Síntese de ácido (S)-2-terc-butoxicarbonilamino-4-[5-(4-cloro-3-metanossulfonilfenil)-4-metiltiazol-2-ilcarbamoíl]butírico

A uma solução do produto do Etapa 5 (20 mg, 0,033 mmol) numa mistura de THF (0,5 ml) e MeOH (0,5 ml) adicionou-se NaOH 2 M aq. (0,5 ml). Deixou-se a mistura em repouso à t.a. durante 3 h. Depois de completa a reacção, concentrou-se a mistura reaccional até próximo da secura e adicionou-se HC1 1 M gota a gota até pH 1-2. Recolheu-se o precipitado resultante por filtração sob ligeira pressão. Lavou-se o sólido com água (0,5 ml) e secou-se completamente in vácuo para obter o composto do título (12 mg, 68%) . Pureza em LCMS de 94%, m/z 532/534 [M++H] , XH RMN (400 ΜΗζ, CDC13) , δ: 1,55-1,70 (9 Η, s), 2,15-2,55 (2H, m), 2,60 (3H, s), 2, 75-2,90 (2H, m) , 3,55 (3H, s), 4, 25-4, 45 (1H, m) , 7, 85-8,00 (2H, m) , 8,35 (1H, S) .

Etapa 8 - Síntese de ácido (S)-2-amino-4-[5-(4-cloro-3-metanossulfonilfenil)-4-metiltiazol-2-ilcarbamoíl]-butírico (22)

Deixou-se uma solução do produto da Etapa 7 (12 mg, 0, 0225 mmol) em TFA a 20% / DCM (0,3 ml) em repouso à t.a. durante 3 h. Após a reacção completa concentrou-se a mistura reaccional in vácuo para originar o composto do título (22) 90 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ (12 mg, 100%). Pureza em LCMS de 94%, m/z 432/434 [M++H] , ΧΗ RMN (400 MHz, MeOD) , õ: 2,10-2,25 (2H, m) , 2,30 (3H, s), 2,65-2,75 (2H, m), 3,25 (3H, s), 3,95-4,05 (1H, m), 7,60-7,80 (2H, m), 8,05 (1H, s). O composto (23) foi preparado pelo método descrito no esquema

Br2, dioxano Etapa 3

As Etapas 1, 2, 3 e 4 sao as mesmas que se descreveram para a preparação dos compostos (21) e (22)

Etapa 5 - Síntese de éster terc-butílico de ácido (S)-2-amino-4-[5-(4-cloro-3-metanossulfonilfenil)-4-metiltiazol-2-ilcarbamoíl]butírico

Este composto foi preparado a partir de éster 1-terc-butílico de ácido 2-terc-butoxicarbonilaminopentanodióico e 5- 91 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ (4-clorο-3-metanossulfonilfenil)-4-metiltiazol-2-ilamina (produto da Etapa 4) seguindo o procedimento descrito para a síntese do composto (21).

Etapa 6 - Síntese de éster terc-butílico de ácido (S)-2- amino-4-[5-(4-cloro-3-metanossulfonilfenil)-4-metiltiazol-2-ilcarbamoíl]butírico (23)

Cl

A uma solução do produto da Etapa 5 (50 mg, 0,085 mmol) em EtOAc (0,25 ml) adicionou-se solução de HC1 2 M / éter (0,25 ml) à t.a. Agitou-se vigorosamente a mistura reaccional durante 4 h. Tratou-se a mistura reaccional novamente com uma mistura de EtOAc (0,25 ml) e HC1 2 M / éter (0,25 ml) . Continuou-se a agitação durante 1 h. Recolheu-se o precipitado formado por filtração sob gravidade, submeteu-se a partição entre EtOAc (3 ml) e NaHC03 aq. sat. (0,5 ml). Lavou-se a camada do EtOAc com água (1 ml), secou-se (Na2S04) , filtrou-se e concentrou-se In vacuo para originar o composto (23) (6,5 mg, 16%). Pureza em LCMS de 95%, m/z 488/490 [M++H] , XH RMN (400 MHz, MeOD) , õ: 1,35-1, 40 (9H, s), 1,80-2,05 (2H, m) , 2,30 (3H, s), 2,45-2,55 (2H, m), 3,25 (3H, s), 3,30-3,35 (1H, m) , 7, 60-7, 70 (2H, m), 8,05 (1H, s) .

Ensaios Biológicos

Ensaio da actividade inibidora de histona-desacetilase A capacidade dos compostos inibirem actividades de histona-desacetilase foi medida utilizando o ensaio comercialmente disponível da actividade fluorescente de HDAC da Biomol. Em resumo, o substrato Fluor de Lys™, uma lisina com uma acetilação em épsilon-amino, é incubado com a fonte de actividade de histona-desacetilase (extracto nuclear de células HeLa) na presença ou ausência de inibidor. A desacetilação do substrato sensibiliza o substrato ao revelador de Fluor de Lys™ , que gera um fluoróforo. Assim, a 92 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ incubação do substrato com uma fonte de actividade de HDAC resulta num aumento de sinal que é diminuído na presença de um inibidor de HDAC.

Os resultados estão expressos em percentagem relativamente ao controlo, medida na ausência de inibidor, sendo o sinal de fundo subtraído de todas as amostras, como se segue:-

% de actividade = ((S^B) / (S°-B)) xlOO em que S1 é o sinal na presença de substrato, enzima e inibidor, S° é o sinal na presença de substrato, enzima e o veículo em que o inibidor é dissolvido, e B é o sinal de fundo medido na ausência de enzima.

Os valores de IC50 foram determinados por análise de regressão não linear, após ajustamento dos resultados de oito pontos de dados à equação para resposta à dose sigmóide com declive variável (% de actividade contra log da concentração de composto), utilizando o software Graphpad Prism.

Utilizou-se a actividade de histona-desacetilase de extracto nuclear bruto derivado de células HeLa para o rastreio. A preparação, adquirida a 4C (Seneffe, Bélgica), foi preparada a partir de células HeLa colhidas enquanto na fase de crescimento exponencial. 0 extracto nuclear foi preparado de acordo com Dignam JD 1983 Nucl. Acid. Res. 11, 1475-1489, congelado instantaneamente em azoto líquido e armazenado a -80°C. A composição do tampão final era de Hepes 20 mM, KC1 100 mM, EDTA 0,2 mM, DTT 0,5 mM, PMSF 0,2 mM e glicerol a 20% (v/v).

Ensaio da Actividade Inibidora de Quinase Aurora A A capacidade dos compostos inibirem a actividade de

Quinase Aurora A foi medida utilizando um ensaio em microplaca. Em resumo, pré-revestiram-se placas de 96 poços Flashplates® (PerkinElmer Life Sciences) com proteína básica de mielina (MBP) . A MBP (100 ul de 100 mg/ml em PBS) foi incubada a 37°C durante 1 h, seguida de incubação durante a 93 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ noite a 4°C. As placas foram então lavadas com PBS e deixadas secar ao ar.

Para determinar a actividade de Quinase Aurora A, incubaram-se 40 ng de enzima (ProQuinase: recombinante, Quinase Aurora A humana de comprimento completo, fundida no terminal N com GST e expressa por baculovírus em células de insecto Sf21) em tampão de ensaio (Tris 50 mM (pH7,5), NaCl 10 mM, MgCl2 2,5 mM, DTT 1 mM, DMSO a 0,4%), ATP 10 μΜ (Km da enzima) e [γ-33Ρ]-ATP 0,5 pCi e com várias concentrações de inibidor. Os poços sem inibidor foram utilizados como controlos de veículo e os poços não contendo enzima foram utilizados para medir o sinal 'de fundo'. As placas foram incubadas durante a noite a 30°C. Após incubação, removeu-se o conteúdo dos poços e lavaram-se as placas três vezes com PBS contendo pirofosfato de tetra-sódio 10 mM antes da contagem da cintilação utilizando um Wallac MicroBeta TriLux.

Geraram-se curvas de resposta à dose a partir de 10 concentrações (concentração final de topo de 10 μΜ, com diluições de 3 vezes), utilizando poços em triplicado.

Os valores de IC50 foram determinados por análise de regressão não linear, após ajustamento dos resultados de pontos de dados à equação para resposta à dose sigmóide com declive variável (% de actividade contra log da concentração de composto), utilizando o software Xlfit.

Ensaio da Actividade Inibidora de Di-hidrofolato-redutase (DHFR) A capacidade dos compostos inibirem a actividade de DHFR foi medida num ensaio baseado na capacidade da DHFR catalisar a redução reversível dependente de NADPH do ácido di-hidrofólico a ácido tetra-hidrofólico utilizando um kit Sigma (número de Catálogo CS0340). Este utiliza um tampão de ensaio exclusivo e DHFR humana recombinante a 7,5 xlCT4 Unidades por reacção, NADPH a 60 μΜ e ácido di-hidrofólico a 50 μΜ. Seguiu-se a reacção monitorizando a diminuição na absorvância a 340 nm, durante um período de 2 minutos, à temperatura ambiente, e calculou-se a actividade da enzima sob a forma da taxa de diminuição na absorvância. A actividade da enzima na 94 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ presença de inibidor foi expressa como a percentagem da actividade sem inibidor e a IC50 do inibidor foi determinada a partir da curva de resposta à dose sigmóide utilizando o software Xlfit (% de actividade contra log da concentração de composto). Cada amostra foi corrida em triplicado e cada curva de resposta à dose foi composta por 10 diluições do inibidor.

Ensaio da Actividade Inibidora de Quinase MAP α P38

A capacidade de compostos para inibir a actividade de quinase MAP α p38 (enzima humana de comprimento completo expressa em E. coli na forma de um proteína marcada no terminal N com GST), foi medida num ensaio realizado por Upstate (Dundee RU) . Num volume final de reacção de 25 μΐ, incubou-se a quinase MAP α p38 (5-10 mU) com Tris 25 mM, pH 7,5, EGTA 0,02 mM, proteína básica de mielina a 0,33 mg/ml, acetato de magnésio 10 mM, ATP 90 μΜ (Km de 97 μΜ) e [γ33Ρ]-ATP (actividade específica aprox. de 500 cpm/pmol). Iniciou-se a reacção pela adição da mistura de MgATP. Após incubação durante 40 minutos à temperatura ambiente, parou-se a reacção pela adição de 5 μΐ de uma solução a 3% de ácido fosfórico. Aplicaram-se 10 μΐ de mistura reaccional pontualmente num filtro Filtermat P30 e lavou-se três vezes durante 5 minutos com ácido fosfórico 75 mM e uma vez com metanol, antes de secagem e contagem de cintilação.

Geraram-se curvas de resposta à dose a partir de diluições Ιέ log em série de uma solução-mãe de inibidor em DMSO. Efectuaram-se nove passos de diluição desde uma concentração final de topo de 10 μΜ, e incluiu-se um branco 'sem composto'. Correram-se as amostras em duplicado. Os dados das contagens de cintilação foram recolhidos e submetidos a análise de ajustamento livre através do software Graphpad Prism. A partir da curva gerada determinou-se a concentração que origina 50% de inibição.

Ensaio de Inibição de Quinase PI3 γ A medição da actividade de quinase PI3 γ depende da ligação específica e de elevada afinidade do domínio de homologia pleckstrin (PH) de GRP1 a PIP3, o produto da actividade da quinase PI3. Forma-se um complexo entre o 95 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ anticorpo monoclonal anti-GST marcado com európio, um domínio PH de GRP1 marcado com GST, PIP3 biotinilado e estreptavidina-aloficocianina(APC). Este complexo gera um sinal estável de transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET, do inglês Fluorescence Resonance Energy Transfer) resolvido no tempo, que é diminuído pela competição de PIP3, gerado no ensaio da quinase PI3, com ο PIP3 biotinilado. 0 ensaio foi realizado em Upstate (Dundee, RU) como se segue: num volume final de reacção de 20 μΐ, incubou-se quinase PI3 γ (enzima humana recombinante, marcada no terminal N com Hisô, de comprimento completo, expressa por baculovírus em células de insecto Sf21) em tampão de ensaio contendo fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato 10 μΜ e MgATP 100 μΜ (Km da enzima 117 μΜ). Iniciou-se a reacção pela adição da mistura de MgATP. Após incubação durante 30 minutos à temperatura ambiente, parou-se a reacção pela adição de 5 μΐ de solução de paragem contendo EDTA e fosfatidilinositol-3,4,5-trisfosfato biotinilado. Finalmente, adicionaram-se 5 μΐ de tampão de detecção, que continha anticorpo monoclonal anti-GST marcado com európio, domínio PH de GRP1 marcado com GST e estreptavidina-APC. A placa foi então lida em modo de fluorescência resolvida no tempo e determinou-se o sinal de fluorescência resolvida no tempo homogénea (HTRF, do inglês Homogenous Time-Resolved Fluorescence) de acordo com a fórmula HTRF = 10000 x (Em665nm/Em620nm).

Geraram-se pontos de dados em duplicado a partir de uma diluição em série b2 log de uma solução-mãe do composto em DMSO. Efectuaram-se nove passos de diluições desde uma concentração final de topo de 10 μΜ, e incluiu-se um branco 'sem composto'. Os dados de razão HTRF foram transformados em % da actividade dos controlos e analisados com uma aplicação de resposta à dose sigmóide de quatro parâmetros (declive variável). Determinou-se a concentração que origina 50% de inibição (IC50).

Ensaio de Inibição da Proliferação Celular

Colheram-se linhas celulares de cancro (U937 e HCT116) a crescer em fase log e semearam-se a 1000 - 2000 células/poço (100 μΐ de volume final) em placas de cultura de tecido de 96 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ 96 poços. Após 24 h de crescimento trataram-se as células crescidas com composto. Incubaram-se então novamente as placas durante mais 72 - 96 h antes de se conduzir um ensaio de viabilidade celular WST-1 de acordo com as instruções do fornecedor (Roche Applied Science).

Os resultados foram expressos como percentagem de inibição relativamente ao controlo, medido na ausência de inibidor, como se segue:- % de inibição = 100 - ((S1/S°)xl00) onde S1 é o sinal na presença de inibidor e S° é o sinal na presença de DMSO.

Geraram-se curvas de resposta à dose a partir de 8 concentrações (concentração final de topo 10 μΜ, com diluições de 3 vezes), utilizando 6 réplicas.

Os valores de IC50 foram determinados por análise de regressão não linear, após ajustamento dos resultados à equação para resposta à dose sigmóide com declive variável (% de actividade contra log da concentração de composto), utilizando o software Graphpad Prism.

Estimulação por LPS de sangue completo humano

Colheu-se sangue complete por punctura venosa utilizando recipientes Vacutainer heparinizados (Becton Dickinson) e diluiu-se num volume igual de meio de cultura de tecidos RPMI1640. Plaquearam-se 100 μΐ em placas de cultura de tecidos de 96 poços de fundo em V. Adicionou-se inibidor em 100 μΐ de meio RPMI1640, e 2 h mais tarde estimulou-se o sangue com LPS (estirpe 005:B5 de E. coli, Sigma) numa concentração final de 100 ng/ml e incubou-se a 37°C em 5% de CO2 durante 6 h. Mediram-se os níveis de TNF-α a partir dos sobrenadantes isentos de células por ELISA em sanduíche (R&D Systems #QTA00B). 97 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ

Ensaio da Carboxilesterase em Células Lisadas

Preparação de extracto celular

Lavaram-se células tumorais U937 ou HCT116 (~109) com 4 volumes de PBS de Dulbecco (~1 litro) e sedimentaram-se a 525 g durante 10 min a 4°C. Repetiu-se este procedimento duas vezes e ressuspendeu-se a pelete celular final em 35 ml de tampão de homogeneização frio (Trizma 10 mM, NaCl 130 mM, CaCl2 0,5 mM, pH 7,0 a 25°C). Prepararam-se os homogenatos por cavitação em azoto (700 psi durante 50 min a 4°C). Manteve-se o homogenato em gelo e suplementou-se com um cocktail de inibidores nas concentrações finais de:

Leupeptina 1 μΜ Aprotinina 0,1 μΜ E64 8 μΜ

Pepstatina 1,5 μΜ Bestatina 162 μΜ Quimiostatina 33 μΜ

Após clarificação do homogenato celular por centrifugação a 525 g durante 10 min, utilizou-se o sobrenadante resultante como fonte de actividade de esterase e armazenou-se a -80°C até ser necessário.

Medição da clivagem do éster

A hidrólise de ésteres nos correspondentes ácidos carboxilicos pode ser medida utilizando o extracto celular preparado como acima. Para este efeito incubou-se extracto celular (~30 pg / volume total de ensaio de 0,5 ml) a 37°C num tampão de Tris-HCl 25 mM, NaCl 125 mM, pH 7,5, a 25°C. No tempo zero o éster (substrato) foi adicionado numa concentração final de 2,5 μΜ e as amostras foram incubadas a 37°C durante o tempo apropriado (usualmente 0 ou 80 min). Pararam-se as reacções por adição de 3 x volumes de acetonitrilo. Para as amostras do tempo zero adicionou-se o acetonitrilo antes do composto éster. Após centrifugação a 12 000 g durante 5 min, analisaram-se as amostras quanto ao éster e seu correspondente ácido carboxilico à temperatura ambiente por LCMS (Sciex API 3000, bomba binária HP1100, CTC PAL) . A cromatografia foi baseada numa coluna AceCN 98 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ (75*2,1 mm) e numa fase móvel de 5-95% de acetonitrilo em água /ácido fórmico a 0,1%.

Quantificação da expressão de hCE-1, hCE-2 e hCE-3 em linhas celulares monociticas e não monociticas

Utilizaram-se iniciadores específicos de genes para amplificar hCE-1, -2 e -3 de ADNc humano por PCR. Clonaram-se os produtos da PCR num vector plasmídico e verificaram-se as sequências. Foram então diluídos em série para utilizar como curvas padrão em reacções PCR em tempo real. Extraiu-se o ARN total de várias linhas celulares humanas e preparou-se o ADNc. Para quantificar os níveis absolutos de hCE nas linhas celulares, compararam-se os níveis de expressão génica com os padrões dos produtos de PCR clonados num ensaio de PCR em tempo real SYBR Green. A Figura 1 mostra que hCE-Ι é apenas expresso numa quantidade significativa numa linha celular monocítica.

Resultados Biológicos

Os compostos referidos nos Exemplos 1-5 acima foram investigados nos ensaios de inibição enzimática, proliferação celular e clivagem de éster descritos acima e os resultados estão apresentados nas Tabelas 3 e 4.

Potência

Tabela 3 HDAC Inibição enzimática IC50 nM (HDAC -extracto nuclear de células Hela) Proliferação celular IC50 nM (células U937) Razão IC50 célula/enzima Modulador Não modificado Composto (7) (SAHA) 100 400 4 Modulador Modificado Composto (8) (éster ciclopentilico) 100 50 0,5 Ácido resultante da clivagem do éster de Modulador Modificado Composto (9) 70 Inactivo NA Modulador Modificado Composto (10) (éster t-butilico) 130 1300 10 99 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ

Os resultados acima mostram que: i) os compostos modificados com éster de aminoácido (Compostos 8 e 10) e o ácido (Composto 9) que resultaria da clivagem do motivo éster possuem IC50 no ensaio enzimático comparáveis com o valor para o inibidor de HDAC não modificado (SAHA - Composto 7) indicando que o motivo éster de alfa-aminoácido estava ligado a SAHA num ponto que não corrompeu o seu modo de ligação. (ii) apesar de os ésteres (Compostos 8 e 10) e o ácido (Composto 9) terem actividades comparáveis com as do inibidor não modificado (SAHA - Composto 7) há um aumento significativo na potência celular do éster ciclopentílico clivável por esterases (Composto 8) relativamente ao inibidor não modificado (Composto 7) mas uma diminuição substancial em potência celular no caso do éster t-butilico estável a esterases (Composto 10), indicando que este último não acumulou o ácido nas células para gerar potência celular aumentada. (iii) a maior actividade no ensaio de proliferação celular para o Composto 8 relativamente à contrapartida não modificada, o Composto 7 (ou o derivado éster não hidrolisável, Composto 10), indica que o éster é hidrolisado no ácido progenitor, Composto 9, na célula onde se acumula e exerce um maior efeito inibidor.

Tabela 3 (continuação)

Quinase Aurora Inibição enzimática IC50 nM (Quinase Aurora A) Proliferação celular IC50 nM (células U937) Razão IC50 célula/enzima Modulador Não Modificado Composto(11) 350 430 1,3 Modulador Modificado Composto (12) (éster ciclopentilico) 2300 3, 5 0,0015 Ácido resultante da clivagem do éster de Modulador Modificado Composto (13) 500 >5000 NA Modulador Modificado Composto (14) (éster t-butilico) 3000 75 0, 025 100 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ

Os resultados acima mostram que: (i) o inibidor modificado com alfa-aminoácido, o Composto 13, que resultaria da clivagem do motivo éster no Composto 12, possui um valor de IC50 no ensaio enzimático comparável ao do inibidor de Quinase Aurora não modificado (Composto 11) indicando que é possível ligar o motivo éster de alfa-aminoácido num ponto que não corrompe a ligação a Quinase Aurora A. (ii) apesar de o ácido (Composto 13) ter uma actividade enzimática comparável à do inibidor não modificado (Composto 11) e do éster (Composto 12) ser um inibidor fraco, há um aumento significativo na potência celular do Composto 12 relativamente ao inibidor não modificado (Composto 11). O éster t-butílico menos prontamente clivável (Composto 14) possui uma actividade enzimática comparável à do éster ciclopentílico clivável (Composto 12) mas é praticamente 20 vezes menos activo no ensaio celular; (iii) a maior actividade no ensaio de proliferação celular do Composto 12 relativamente à contrapartida não modificada (Composto 11) e ao éster t-butílico menos prontamente clivado (composto 14) indica que o éster ciclopentílico é hidrolisado no ácido progenitor na célula, onde se acumula, e exerce maior efeito inibidor.

Tabela 3 (continuação) quinase MAP P38 Inibição enzimática IC50 nM (quinase ΜΑΡ P38) Inibição de produção de TNFa em sangue completo humano IC50 nM Razão IC50 WB/enzima Modulador não modificado Composto (15) 50 300 6 Modulador Modificado Composto (16) (éster ciclopentílico) 25 20 CO O Ácido resultante da clivagem do éster de Modulador Modificado Composto (17) 30 não testado NA Modulador Modificado Composto (18) (éster t-butílico) 40 750 18 101 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ

Os resultados acima mostram que: (i) o inibidor modificado com alfa-aminoácido, Composto 16, e o ácido, Composto 17, que resultaria da clivagem do motivo éster no Composto 16, possuem valores de IC50 no ensaio enzimático comparáveis ao valor para o inibidor de quinase MAP P38 não modificado (Composto 15) indicando que é possível ligar o motivo éster de alfa-aminoácido num ponto que não corrompe a ligação à quinase MAP P38. (ii) o ácido, Composto 17, possui actividade contra a enzima comparável à do inibidor não modificado (Composto 15) e do éster t-butílico (Composto 18). Contudo há um aumento significativo na capacidade do éster ciclopentílico (Composto 16) inibir a produção de TNF no interior de células monocíticas presentes em sangue completo em comparação com o inibidor não modificado (Composto 15) e o éster t-butílico menos prontamente clivado (Composto 18). (iii) a maior actividade no ensaio do sangue completo para o Composto 16 relativamente à contrapartida não modificada, Composto 15, e o éster t-butílico menos prontamente clivado, Composto 18, indica que o éster ciclopentílico é hidrolisado no ácido progenitor na célula, onde se acumula, e exerce um maior efeito inibidor.

Tabela 3 (continuação) DHFR Inibição enzimática IC50 nM (DHFR) Proliferação celular IC50 nM (células U937) Razão IC50 célula/enzima Modulador não modificado Composto (2 G=N) 10 2200 220 Modulador Modificado Composto (6) (éster ciclopentilico) 1700 23 0,013 Ácido resultante da clivagem do éster do Modulador Modificado Composto (19) 10 Não testado Não aplicável

Os resultados acima mostram que: 102 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ (i) ο inibidor modificado com alfa-aminoácido, Composto 19, que resultaria da clivagem do motivo éster no Composto 6, possui um valor de IC50 no ensaio enzimático comparável ao do inibidor de DHFR não modificado (Composto 2 (G=N)) indicando que é possível ligar o motivo éster de alfa-aminoácido num ponto que não corrompe a ligação a DHFR. (ii) apesar do ácido (Composto 19) possuir uma actividade inibidora da enzima comparável à do inibidor não modificado (Composto 2 (G=N)), o éster (Composto 6) é significativamente mais potente na inibição da proliferação celular do que o inibidor não modificado (Composto 2 (G=N)). (iii) a maior actividade no ensaio de proliferação celular do Composto 6 relativamente à contrapartida não modificada (Composto 2 (G=N)) indica que o éster ciclopentílico é hidrolisado no ácido progenitor na célula, onde se acumula, e exerce maior efeito inibidor.

Tabela 3 (continuação)

Quinase PI3 Inibição enzimática IC50 nM (Quinase PI3) Inibição da produção de TNFa em sangue completo humano IC50 nM Razão IC50 WB/enzima Modulador não modificado Composto (20) 500 8500 17 Modulador modificado Composto (21) (éster ciclopentilico) 2700 400 0,15 Ácido resultante da clivagem do éster de modulador modificado (22) 3600 Não testado Não aplicável Modulador modificado Composto (23) (éster t-butílico) 7100 5200 0, 75

Os resultados acima mostram que: (i) o inibidor modificado com éster de alfa-aminoácido, Composto 21, e o ácido, Composto 22, que resultaria da clivagem do motivo éster no Composto 21, possuem valores de IC50 no ensaio enzimático dentro de um factor de 10 do valor para o inibidor de quinase PI3 não modificado (Composto 20), indicando que é possível ligar o motivo éster de alfa- 103 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ aminoácido num ponto que ainda retém ligação razoável a quinase PI3. (ii) apesar do ácido, Composto 22, possuir actividade comparável à do inibidor não modificado (Composto 20) e do éster (Composto 21), há um aumento significativo na potência do éster para inibir a produção de TNF em células monocíticas presentes em sangue completo comparativamente com o inibidor não modificado (Composto 20) e o éster t-butílico menos prontamente clivado (Composto 23). (iii) a maior actividade no ensaio do sangue completo para o Composto 21 relativamente à contrapartida não modificada, Composto 20, e ao éster t-butilico menos prontamente clivado, Composto 23, indica que o éster ciclopentílico é hidrolisado no ácido progenitor na célula, onde se acumula, e exerce uma maior efeito inibidor.

Se1ectividade

Tabela 4: Comparação da proliferação celular e da clivagem do éster para uma linha celular monocitica e uma não monocitica. HDAC U937 (Linha celular monocitica) HCT116 (linha celular não monocitica) Composto Proliferação celular IC50 nM Ácido produzido 1ng/ml Proliferação celular IC50 nM Ácido produzido 1ng/ml Modulador não modificado Composto (7) 400 Não aplicável 700 Não aplicável Modulador modificado Composto (24) 60 110 2100 1 1 a quantidade de ácido produzido após incubação do composto modificado (Composto 24) durante 80 min no ensaio com carboxilesterase em células lisadas descrito acima.

Os resultados acima mostram: i) que o composto não modificado (composto 7) não apresenta selectividade entre uma linha celular monocitica e uma não monocitica enquanto isto pode ser conseguido por ligação de um motivo éster apropriado, como no Composto 24. 104 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ ii) esta selectividade correlaciona-se com a clivagem melhorada do éster no ácido pela linha celular monocitica. iii) a actividade celular melhorada é apenas observada na linha celular onde é produzido o ácido, indicando que esta melhoria na potência celular se deve à acumulação do ácido.

Tabela 4 (continuação)

Quinase Aurora A U937 (Linha celular monocitica) HCT116 (linha celular não monocitica) Composto Proliferação celular IC50 nM Ácido produzido ^g/ml Proliferação celular IC50 nM Ácido produzido ^g/ml Modulador não modificado Composto (10) 430 NA 560 NA Modulador modificado Composto (25) 1900 50 6100 0 1 A quantidade de ácido produzido após incubação do composto (25) durante 80 minutos no ensaio com carboxilesterase em células lisadas descrito acima.

Os resultados acima mostram: i) que o composto não modificado (composto (10) não apresenta selectividade entre uma linha celular monocitica e uma não monocitica enquanto isto é conseguido pela ligação de um motivo éster apropriado, como no Composto 25. ii) esta selectividade correlaciona-se com a clivagem melhorada do éster no ácido pela linha celular monocitica. iii) a actividade celular melhorada é apenas observada na linha celular onde é produzido o ácido, indicando que esta melhoria na potência celular se deve à acumulação do ácido. 105 ΕΡ 1 877 098/ΡΤ

Tabela 4 (continuação) DHFR U937 (Linha celular monocítica) HCT116 (linha celular não monocítica) Composto Proliferação celular IC50 nM Ácido produzido 1ng/ml Proliferação celular IC50 nM Ácido produzido 1ng/ml Modulador não modificado Composto (2 G=N) 2200 Não aplicável 1700 NA Modulador modificado Composto (5) 310 210 6700 2 1 A quantidade de ácido produzido após incubação do composto (5) durante 80 min no ensaio com carboxilesterase em células lisadas descrito acima.

Os resultados acima mostram que: (i) o composto não modificado (composto 2 G = N) não apresenta selectividade entre linhas celulares monocíticas e não monociticas enquanto isto pode ser conseguido por ligação de um motivo éster apropriado como no composto 5. (ii) esta selectividade correlaciona-se com a clivagem melhorada do éster no ácido pela linha celular monocítica. (iii) a actividade celular melhorada é apenas observada na linha celular onde é produzido o ácido, indicando que esta melhoria na potência celular se deve à acumulação do ácido.

Lisboa, 2013-07-25

Claims (15)

1. ΕΡ 1 877 098/ΡΤ 1/4 REIVINDICAÇÕES 1. Conjugado covalente de um éster de alfa-aminoácido e um inibidor da actividade da enzima intracelular histona-desacetilase alvo para utilização num método de tratamento do corpo humano ou animal por terapia, em que: o grupo éster do conjugado é hidrolisável por uma ou mais enzimas carboxilesterase intracelulares no ácido correspondente; o azoto do grupo amino do éster de aminoácido não está ligado directamente a uma porção carbonilo, ou é deixado não substituído; e o éster de alfa-aminoácido está conjugado ao inibidor numa posição remota relativamente à interface de ligação entre o inibidor e a enzima histona-desacetilase, em que a posição de conjugação está remota quando o conjugado possui uma potência num ensaio de actividade celular pelo menos tão elevada quanto a do inibidor não conjugado no mesmo ensaio, sendo este ensaio da actividade celular um ensaio de inibição da proliferação celular realizado com células cancerosas U937.
2. 2. Conjugado covalente de um éster de alfa-aminoácido e um inibidor da actividade da enzima intracelular histona-desacetilase alvo para utilização num método de tratamento do corpo humano ou animal por terapia, em que: o grupo éster do conjugado é hidrolisável por uma ou mais enzimas carboxilesterase intracelulares no ácido correspondente; o azoto do grupo amino do éster de aminoácido não está ligado directamente a uma porção carbonilo, ou é deixado não substituído; e o éster de alfa-aminoácido está conjugado com o inibidor de maneira a que o modo de ligação do inibidor conjugado e do referido ácido correspondente, à enzima histona-desacetilase, seja o mesmo que o do inibidor não conjugado, em que o modo de ligação é o mesmo quando o conjugado possui uma potência num ensaio da actividade celular pelo menos tão elevada quanto a do inibidor não conjugado no mesmo ensaio, sendo o ensaio da actividade celular um ensaio de inibição da proliferação celular realizado com células cancerosas U937. ΕΡ 1 877 098/ΡΤ 2/4
3. 3. Conjugado covalente para utilização de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, em que o conjugado se destina a utilização no tratamento de uma desordem proliferativa.
4. 4. Conjugado para utilização como reivindicado na reivindicação 1 ou na reivindicação 2 em que o éster de alfa-aminoácido conjugado covalentemente não é o elemento C-terminal de um motivo dipeptídico do inibidor conjugado.
5. 5. Conjugado para utilização como reivindicado em qualquer das reivindicações anteriores em que o inibidor é um que se liga não covalentemente à enzima histona-desacetilase.
6. 6. Conjugado para utilização como reivindicado em qualquer das reivindicações anteriores em que o éster de alfa-aminoácido está conjugado covalentemente com o inibidor através de um radical ligante.
7. 7. Conjugado para utilização como reivindicado em qualquer das reivindicações anteriores em que o éster de alfa-aminoácido está conjugado com o inibidor através do grupo amino do éster de aminoácido.
8. 8. Conjugado para utilização como reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 7 em que o éster de alfa-aminoácido está conjugado com o inibidor através do carbono alfa do éster de aminoácido.
9. 9. Conjugado para utilização como reivindicado em qualquer das reivindicações anteriores em que o éster é hidrolisável por células contendo uma ou mais das enzimas carboxilesterase intracelulares hCE-1, hCE-2 e hCE-3 no alfa-aminoácido correspondente.
10. 10. Conjugado para utilização como reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 7 em que o éster é hidrolisável por células contendo a enzima carboxilesterase intracelular hCE-1 no alfa-aminoácido correspondente e não por células contendo hCE-2 ou hCE-3. ΕΡ 1 877 098/ΡΤ 3/4
11. 11. Conjugado para utilização como reivindicado na reivindicação 10 em que o azoto do grupo amino do éster de aminoácido está substituído mas não directamente ligado a um grupo carbonilo.
12. 12. Composição farmacêutica para utilização num método de tratamento do corpo humano ou animal por terapia, em que a composição compreende um conjugado como reivindicado em qualquer das reivindicações 1 a 11 e um transportador farmaceuticamente aceitável.
13. 13. Composição farmacêutica para utilização como reivindicado na reivindicação 12 que está adaptado para administração tópica e em que, no conjugado, (a) quando o éster de alfa-aminoácido está ligado ao inibidor através do seu grupo amino, o carbono adjacente ao carbono alfa do éster de alfa-aminoácido está mono-substituído, ou (b) quando o éster de alfa-aminoácido está ligado ao inibidor através de um átomo de carbono do aminoácido, o átomo de carbono adjacente a esse átomo de carbono do aminoácido não está substituído.
14. 14. Método in vitro para aumentar ou prolongar selectivamente a potência intracelular e/ou tempo de residência de um inibidor da actividade da enzima intracelular histona-desacetilase alvo em macrófagos e/ou monócitos relativamente a outros tipos de células, compreendendo o tratamento de uma população mista de células com um conjugado do inibidor como reivindicado na reivindicação 11.
15. 15. Método de identificação de um conjugado covalente de um éster de alfa-aminoácido de um determinado inibidor da actividade da enzima intracelular histona-desacetilase alvo, o referido conjugado possuindo potência celular aumentada ou prolongada relativamente ao determinado inibidor, em que o método compreende: (i) identificação de uma posição ou posições num determinado inibidor da actividade da enzima intracelular histona-desacetilase alvo, ou numa pluralidade de determinados inibidores da actividade da enzima intracelular histona-desacetilase alvo que partilham o mesmo modo de ligação à enzima histona-desacetilase alvo, sendo as referidas posição ou posições remotas relativamente à interface de ΕΡ 1 877 098/ΡΤ 4/4 ligação entre o(s) inibidor(es) e a enzima histona-desacetilase alvo; (ii) modificação covalente do(s) inibidor(es) por ligação de um radical éster de alfa-aminoácido, ou uma gama de diferentes radicais éster de alfa-aminoácido em uma ou mais das posições identificadas em (i); (iii) teste do(s) inibidor(es) conjugado(s) com alfa-aminoácido preparados em (ii) para determinar a sua actividade contra a enzima histona-desacetilase alvo; e (iv) a partir dos dados adquiridos em (iii), selecção de uma ou mais das versões conjugadas com éster de alfa-aminoácido testadas do(s) determinado(s) inibidor(es), que causam modulação da actividade de histona-desacetilase no interior de células, que são convertidas em, e se acumulam sob a forma de, o ácido carboxilico correspondente, no interior das células, e que apresentam potência celular aumentada ou prolongada. Lisboa, 2013-07-25