PT1736160E

PT1736160E - Oligossacáridos de algina e seus derivados assim como o seu fabrico e a sua utilização

Info

Publication number: PT1736160E
Application number: PT57066573T
Authority: PT
Inventors: Meiyu Geng; Xianliang Xin; Guangqiang Sun
Original assignee: Ocean Univ China
Priority date: 2004-03-24
Filing date: 2005-02-25
Publication date: 2015-11-20
Also published as: KR20070007397A; MA28971B1; US8835403B2; ES2552218T3; CA2561873C; UA85226C2; US9493496B2; BRPI0509217A8; PL1736160T3; US20070254848A1; EP1736160B1; AU2005223923B2; JP4709203B2; EA200601756A1; EA011417B1; US10213456B2; JP2007530718A; WO2005089776A1; US20190255092A1; BRPI0509217A

Description

DESCRIÇÃO

OLIGOSSACÁRIDOS DE ALGINA E SEUS DERIVADOS ASSIM COMO O SEU

FABRICO E A SUA UTILIZAÇÃO

Descrição Técnica A presente invenção refere-se a um oligossacárido de alginato e seus derivados, à sua preparação, e às suas utilizações no tratamento da doença de Alzheimer (AD) e diabetes.

Antecedentes da Técnica A AD e a diabetes são doenças presentemente comuns e que ocorrem com frequência que colocam graves riscos para a saúde dos seres humanos. Particularmente, a sua incidência aumenta com o crescimento da população idosa. Por isso, a profilaxia e o tratamento destas doenças tornam-se cada vez mais críticos. É improvável que os fármacos atuais para prevenir e curar a AD revolucionem o tratamento da AD devido à sua limitação ao mero alívio sintomático ou aos seus graves efeitos adversos. Os fármacos normalmente utilizados para a diabetes são principalmente a insulina e outros fármacos hipoglicémicos orais, a maioria dos quais são desvantajosos em termos de inconveniência para utilizar e de toxicidade. Particularmente, eles na verdade não são fármacos eficazes para a diabetes de tipo 2. Descobriu-se que a ocorrência da AD e da diabetes de tipo 2 está relacionada com a deposição de amilóide-beta (A β) e amilina (IAAP) a fibrilogénese subsequente e o aumento de radicais livres oxidativos, o que dá origem ao fato de que a inibição da formação de fibrilha da amilóide-beta e a amilina torna-se a perspetiva para a profilaxia e tratamento destas doenças.

Os alginatos são os principais componentes da parede celular das algas castanhas, que são polissacáridos aniónicos lineares compostos por ácido β-D-manurónico (ManA) e ácido a-L-gulurónico (GulA), ligado por pontes 1-4 glucosidicas. 0 alginato pertence aos polímeros elevados com um peso molecular de vários 104 até 106 com fontes abundantes. 0 alginato tem sido largamente aplicado na produção alimentar, engenharia química e medicina, etc. Estudos recentes revelaram que o alginato possui uma variedade de bioatividades. Contudo, a sua aplicação como um fármaco está limitada até certo ponto pelo seu grande peso molecular. Por isso, o oligossacárido degradado a partir do alginato por diferentes métodos é altamente valioso para a glicoquímica, glicobiologia, glicoengenharia e estudo de fármacos à base de sacáridos, etc. Os métodos parar degradar alginato incluem a degradação enzimática, física e química, contudo, a necessidade de utilizar enzimas específicas tem limitado a aplicação da degradação enzimática. A degradação física, que é normalmente utilizada em combinação com outros métodos, não pode proporcionar facilmente oligossacáridos devido ao peso molecular final de cerca de 50 000 Da dos seus produtos. A degradação química utilizada para polissacáridos inclui a hidrólise acídica e a degradação oxidativa. A hidrólise acídica está limitada pela sua capacidade para obter oligossacáridos com um peso molecular de 4000 ou menos quando realizada a uma temperatura normal e sob pressão normal. CN1341665 descreve um método de preparação de ácido manurónico com um grau de polimerização simples que inclui os seguintes passos: dissolver o alginato de sódio em água, adicionar liase de algina para fazer a reação, aquecer com banho de água a ferver para desactivar a liase, centrifugar e remover as impurezas precipitadas, regular o valor do pH da solução obtida, centrifugar e remover o precipitado produzido, utilizando licor alcalino para dissolver e regular o valor do pH, adicionar álcool etílico para produzir precipitado, secar e utilizar uma coluna de cromatografia de permuta iónica para fazer a separação, utilizando eluente para realizar a eluição. 0 produto obtido possui atividade antitumoral e pode ser utilizada para desenvolver medicina antitumoral. 0 documento CN1454992 refere-se a um método de preparação da liase de ficocolóide que inclui os passos de preparar o meio de cultura, esterilizar e inocular uma fermentação de vibração e agitação numa incubadora. Após o licor fermentado obtido ser esterilizado, é filtrado utilizando um filtro millipore, depois o fluido do sobrenadante fluido é filtrado por prensa e concentrado até à secura, depois a cromatografia hidrofóbica pode ser utilizada para remover o ficocolóide combinada com produto. 0 documento CN1341665 proporciona um método para a separação de ácido oligomanurónico de acordo com o grau de polimerização por tratamento de uma mistura dos diferentes ácidos oligomanurónicos no grau de polimerização pela cromatografia de permuta aniónica utilizando uma solução de composto de bicarbonato como um eluente. EP1153933 revela um ácido poliurónico possuindo um grau médio de polimerização inferior a 20. É também revelado um método que compreende os passos: (a) proporcionar uma solução contendo 5% em peso ou mais de um ácido poliurónico de elevado peso molecular predominantemente como o seu sal de litio; (b) adicionar peróxido de hidrogénio e um sal ferroso à solução preparada no passo (a) para degradar oxidativamente o ácido poliurónico de elevado peso molecular; e (c) isolar um ácido poliurónico possuindo um grau médio de polimerização inferior a 20 obtido no passo (b). O documento CN 1 408 360 revela a utilização de oligose de alginato útil contra a demência induzida por escopolamina.

Revelação da Invenção

Para resolver os problemas acima descritos e através de estudos profundos dos inventores, descobriu-se que um oligossacárido de alginato com um peso molecular de 4 000 ou inferior pode ser obtido por hidrólise ácida a uma temperatura elevada e sob uma pressão elevada, e seus derivados cujo terminal reduzido na posição 1 é o radical carboxilo podem ser preparados no obtido por hidrólise ácida a uma temperatura elevada e sob uma pressão elevada, e seus derivados cujo terminal reduzido na posição 1 é o radical carboxilo podem ser preparados na presença de oxidantes. A invenção ficará completada nas condições acima descritas. A presente invenção proporciona um oligossacárido de alginato e seus derivados com um peso molecular baixo, ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis, e proporciona um processo para os preparar. A presente invenção também proporciona um medicamento para a profilaxia e o tratamento de AD e diabetes compreendendo o oligossacárido de alginato de baixo peso molecular acima mencionado ou seus derivados, ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis. A presente invenção refere-se a um oligossacárido de alginato representado pela fórmula (I) e seus derivados ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis. 0 referido oligossacárido é composto por ácidos β-D-manurónicos ligados por pontes a-1,4 glicosídicas,

(I) em gue, n representa 0 ou um inteiro de 1 até 19.

Na presente invenção, um exemplo dos referidos derivados de oligossacárido de alginato é um composto representado pela fórmula (II), na gual o terminal reduzido na posição 1 é o radical carboxilo,

(Π) em gue, n representa 0 ou um inteiro de 1 até 19.

Na referida fórmula (I) e (II), n é preferencialmente 2 até 10, e mais preferencialmente 4 até 8. A razão pela gual os efeitos biológicos do tetrassacárido para dodecassacárido (preferencialmente, hexassacárido para decassacárido) são melhores permanece pouco clara, o gue pode ser provocado pela responsabilidade destes oligossacáridos para serem reconhecidos e aceites pelas células.

Os referidos derivados de oligossacárido de alginato incluem ainda, por exemplo, os derivados, dos quais uma parte dos grupos hidroxilo no ácido manurónico são sulfatados.

Os sais farmaceuticamente aceitáveis do referido oligossacárido de alginato e seus derivados podem ser, por exemplo, sais de sódio, potássio, cálcio, magnésio e afins. Os sais de sódio são preferidos. Os sais f armaceut icamente aceitáveis podem ser preparados por métodos convencionais. A presente invenção também se refere a um processo para preparar o referido oligossacárido de alginato e seus derivados, em que uma solução de alginato é reagida durante cerca de 2 até 6 h numa autoclave a pH 2-6 e uma temperatura de cerca de 100-120 °C; e o seu pH é então ajustado para cerca de 7. O produto de degradação oxidativa é obtido através da adição de um oxidante à solução de oligossacárido de alginato.

Numa forma de realização preferida da invenção, 0,5-5% de solução aquosa de alginato de sódio é aquecida durante 4 h num autoclave a pH 4 e uma temperatura de 110 °C. Após a reação estar completa, o reagente é removido por sucção e arrefecido, e depois o pH é ajustado para 7 adicionando solução de NaOH. Enquanto se agita, o filtrado é lentamente vertido para álcool industrial que é 4 vezes o volume do filtrado, e ficou em repouso durante a noite para permitir a precipitação. O precipitado é removido por filtração com sucção até à secura, e é desidratado por lavagem com etanol absoluto. É obtido um bolo de filtrado branco e seco num forno a 60 °C para produzir um oligossacárido de alginato bruto. O oligossacárido de alginato bruto é formulado para uma solução a 10%, e é precipitado com uma solução de etanol a 95%. 0 precipitado é lavado com etanol absoluto, seco e formulado para uma solução a 5%. A solução é filtrada através de uma película de 3 pm para remover impurezas, depois dessalinizada numa coluna Bio-Gel-P6 (1,6x180 cm) com 0,2 mol/L NH4HCO3 como a fase móvel e o produto é recolhido através de múltiplos passos. O eluato é medido pelo método de sulfato-carbazole. As frações contendo sacáridos são recolhidas, concentradas sob uma pressão reduzida e dessalinizadas, e liofilizadas para produzir oligossacáridos de alginato. A preparação dos derivados representados pela fórmula (II) é como a seguir descrito: é adicionado um oxidante e reagido durante 15 min até 2 h à temperatura de 100-120 °C depois a solução de alginato acima é reagida durante cerca de 2 até 6 h num autoclave a pH 2-6 e uma temperatura de cerca de 100-120 °C. Numa forma de realização da invenção, é adicionado 25 ml de sulfato de cobre a 5% a 50 ml de NaOH (aq) a 10%, misturado imediatamente, e imediatamente adicionado com 40 ml de solução de oligossacárido de alginato a 5%. A mistura resultante é aquecida num banho de água a ferver até não surgir mais nenhum precipitado vermelho tijolo. A mistura é centrifugada para remover os precipitados. É removido algum sobrenadante e adicionado a NaOH (aq) a 10% e solução de sulfato de cobre a 5% de acordo com a proporção acima para verificar qualquer surgimento de precipitados vermelho tijolo. Se for negativo, o sobrenadante é adicionado ao álcool industrial que é 4 vezes o volume do sobrenadante, e ficou em repouso durante a noite para permitir a precipitação. O precipitado é removido por filtração com sucção até à secura, desidratado com etanol absoluto repetidamente e seco num forno a 60 °C. A separação é realizada do mesmo modo que o oligossacárido de alginato da fórmula (I). A invenção também proporciona uma composição farmacêutica contendo uma quantidade eficaz do referido oligossacárido de alginato ou seus derivados, ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis e veículos farmaceuticamente aceitáveis. A composição farmacêutica pode ser utilizada como um medicamento para a profilaxia e o tratamento da doença de Alzheimer.

Além disso, a composição farmacêutica pode ser utilizada como um inibidor da formação de fibrilhas e um promotor da desagregação de fibrilhas da proteína β amilóide. A composição farmacêutica também pode ser utilizada como um medicamento para a profilaxia e o tratamento da diabetes.

Para além disso, a composição farmacêutica pode ser utilizada como um inibidor da formação de fibrilhas da proteína amilóide dos ilhéus pancreáticos e inibidor do polipéptido amilóide do ilhéu. À luz da presente dificuldade da falta de medicamentos eficazes para a profilaxia e o tratamento de AD e diabetes, é especialmente importante que o oligossacárido de alginato da presente invenção seja utilizado o fabrico de um medicamento para a profilaxia e o tratamento da AD e da diabetes.

Descrição dos desenhos A Figura 1 é a curva de eluição do oligossacárido de alginato de acordo com a presente invenção separada por uma coluna Bio-Gel-P6 após hidrólise ácida. A Figura 2 é o espetro de MALDI-TOF do oligossacárido de alginato de acordo com a presente invenção. A Figura 3 é a curva de eluição do produto da degradação oxidativa do oligossacárido de alginato separado por uma coluna Bio-Gel-P6. A Figura 4 é o espetro de MALDI-TOF do produto da degradação oxidativa do oligossacárido de alginato (modo positivo). A Figura 5 apresenta o efeito do oligossacárido de alginato de acordo com a presente invenção na latência de murganhos com AD induzidos por Αβ4-40. A Figura 6 apresenta o efeito do oligossacárido de alginato de acordo com a presente invenção sobre os números de erro de murganhos com AD induzidos por Αβ4_40. A Figura 7 apresenta os efeitos protetores do oligossacárido de alginato de acordo com a presente invenção em células SH-SY5Y debilitadas por Αβ25-35 · A Figura 8 apresenta os efeitos protetores do oligossacárido de alginato de acordo com a presente invenção em células SH-SY5Y debilitadas por Αβι_40. A Figura 9 apresenta os efeitos inibidores do oligossacárido de alginato de acordo com a presente invenção sobre a formação de fibrilhas de Αβ4-40 normal e induzida por heparina. A Figura 10 apresenta a desestabilidade do oligossacárido de alginato de acordo com a presente invenção na fibrilha Αβι_40. A Figura 11 apresenta os efeitos do oligossacárido de alginato de acordo com a presente invenção na conformação de Αβ4-40 em solução a 250 mg/ml. A Figura 12 apresenta os efeitos protetores do oligossacárido de alginato de acordo com a presente invenção em células NIT debilitadas por IAAP. A Figura 13 apresenta o efeito da mistura do produto da degradação oxidativa do oligossacárido de alginato de acordo com a presente invenção na latência de murganhos com AD induzidos por Αβι-40 testado com o teste de labirinto de água de Morris. A Figura 14 apresenta o efeito da mistura do produto de degradação oxidativa do oligossacárido de alginato de acordo com a presente invenção na distância da natação dos murganhos com AD induzidos por Αβ^ο testados com teste de labirinto de água de Morris. A Figura 15 apresenta o efeito da mistura do produto de degradação oxidativa do oligossacárido de alginato de acordo com a presente invenção na primeira vez chegando a placa original de murganhos com AD induzidos por Αβι-40 testados com o teste de labirinto de água de Morris. A Figura 16 apresenta o efeito da mistura do produto de degradação oxidativa do oligossacárido de alginato de acordo com a presente invenção nos números que cruzam a placa original de murganhos com AD induzidos por Αβι-40 testados com o teste de labirinto de água de Morris. A Figura 17 apresenta os efeitos protetores da mistura do produto de degradação oxidativa do oligossacárido de alginato de acordo com a presente invenção em células NIT debilitadas por IAAP.

Formas de realização 1 Preparação do oligossacárido de alginato É adicionado 1 g de polimananuronato de sódio (peso molecular médio de 8 235 Da, fornecido por Lantai Pharm.LTD., Ocean University of China) a água destilada para obter uma solução de 1%, ajustado o pH para 4 com HC1, colocado num autoclave e aquecido a 110 °C durante 4 h. Após arrefecimento, o pH da solução é ajustado para 7 com NaOH (aq.). Com agitação, o filtrado é lentamente vertido para álcool industrial que é 4 vezes o volume do filtrado, e ficou em repouso durante a noite para precipitar. O precipitado do álcool é removido por filtração com sucção até à secura, e é desidratado lavando com etanol absoluto. Um bolo de filtrado branco é obtido e seco num forno a 60 °C para produzir um oligossacárido de alginato bruto. O oligossacárido de alginato bruto é formulado para uma solução a 10%, e é precipitado com solução de etanol a 95%. O precipitado é lavado com etanol absoluto, e formulado para uma solução a 5% após a secagem. A solução é filtrada através de uma película de 3 ym para remover impurezas, e depois dessalinizado numa coluna Bio-Gel-P6 (1,6x180 cm) com 0,2 mol/L de NH4HCO3 como a fase móvel e recolhido por múltiplos passos. O eluído é medido pelo método de sulfato-carbazole, e os componentes incluindo açúcares são recolhidos, concentrados sob uma pressão reduzida e dessalinizado numa coluna G-10. O componente de volume externo é ainda separado por uma coluna a Bio-Gel-PlO (1,6x180 cm) e liofilizado para produzir uma série de oligossacáridos de alginato (Fig. 1). 2 Preparação do produto da degradação oxidativa do oligossacárido de alginato É formulado 5 g do oligossacárido de alginato acima preparado para uma solução a 5%. É adicionado 25 ml de solução de sulfato de cobre a 5% a 50 ml de 10% NaOH (aq), e misturados imediatamente, e imediatamente adicionados com 40 ml de solução de oligossacárido de alginato a 5%. A mistura resultante é aquecida num banho de água a ferver até não ser criado mais precipitado vermelho tijolo. A mistura é centrifugada para remover precipitados. Algum sobrenadante é removido e adicionado a NaOH (aq) a 10% e solução de sulfato de cobre a 5% de acordo com a proporção acima para verificar o precipitado vermelho tijolo. Se for negativo, a sobrenadante é adicionada a álcool industrial que é 4 vezes o volume do sobrenadante, e ficou em repouso durante a noite para permitir a precipitação. O precipitado é removido por filtração com sucção até à secura, desidratado com etanol absoluto repetidamente e seco num forno a 60 °C. Assim, é obtido um produto de oligossacárido de alginato oxidativo bruto. O produto de degradação oxidativa bruto de oligossacárido de alginato é formulado numa solução a 10%, e precipitado com solução de etanol a 95%. O precipitado é lavado com etanol absoluto, e formulado numa solução a 5% após secagem. A solução é filtrada através de uma película de 3 ym para remover as impurezas, e depois dessalinizada numa coluna Bio-Gel-P6 (1,6x180 cm) com 0,2 mol/L de NH4HC03 como a fase móvel e recolhido por múltiplos passos. O eluído é medido pelo método de sulfato-carbazole, e os componentes incluindo açúcares são recolhidos, concentrados sob uma pressão reduzida e dessalinizados numa coluna G-10. O componente do volume exterior é ainda separado por uma coluna Bio-Gel-PlO (1,6x180 cm) e liofilizado para produzir uma série de produtos de degradação oxidativa (Fig. 2). 3 Identificação da estrutura dos oligossacáridos de alginato

As estruturas dos oligossacáridos contidos na fração obtida a partir da preparação dos oligossacáridos de alginato são identificadas. Está confirmado que os oligossacáridos são oligossacáridos de alginato compostos por ácido β-D-manurónico ligados por pontes 1,4 glicosídicas. A fórmula estrutural é:

(I) em que, n representa 0 ou um inteiro de 1 até 19.

De aqui em diante, a fração a cerca de 292 ml do eluído (a fração marcada como "6" na Fig. 1, de aqui em diante referida como Componente 6) é tomada como um exemplo para ilustrar a análise da estrutura dos oligossacáridos acima. 3.1 Espetrograma de absorção ultravioleta A fração dos oligossacáridos a cerca de 292 ml do eluído é diluída para uma concentração apropriada, e sujeita a rastreio a 190-400 nm com um espectrofotómetro UV-2102 UV-VIS. Descobriu-se que não surge nenhum pico de absorção específico na região ultravioleta, indicando que a estrutura é desprovida de ligações duplas conjugadas. Contudo, surgem picos de absorção não específicos a 190-200 nm. Assim, durante a dessalinização do oligossacárido, pode ser detetada on-line na região ultravioleta acima. 3.2 Análise do espetro de infravermelhos É pesado 0,5 mg da fracção de oligossacáridos acima. O espetro de infravermelhos é determinado com um espectrofotómetro de infravermelhos inteligente NEXUS-470 com pastilhas de KBr. Os picos a 3420,79 cm-1, 3214, 64 cm-1, e 2924, 61 cirT1 são atribuíveis a vibrações de extensão simétricas do grupo hidroxilo; o pico a 1600,25 citT1 é atribuível à vibração de extensão de simetria do grupo carbonilo do carboxilato; o pico a 1406,54 citT1 é atribuível à vibração de cisalhamento do grupo hidroxilo; o pico a 1146,42 citT1 é atribuível à vibração de extensão de simetria da ligação C-0 do grupo carboxilo; o pico a 1045,77 citT1 é atribuível à vibração de extensão de anti-simetrias de éter anidro; e o pico a 804,02 citT1 é atribuível à vibração de extensão de anti-simetrias do esqueleto de ácido manurónico. Está indicado que esse composto possui o grupo carboxilo, grupo hidroxilo e o esqueleto do ácido manurónico cíclico.

3.3 Análise de MS A análise de MS é realizada com um espetómetro de massa de tipo MALDI-TOF, BIFLEX II (Bruker Daltonics Co. ) . Como observado em função do espetro (Fig. 2, tabela 1), o pico de m/z 1073, 9 é o pico de ião molecular [M-H]-1; o pico de m/z 1096, 6 é [M+Na-2H] 1; o pico de m/z 1028,0 é [M-H20-C0-H]_1; o pico de m/z 821,2 é [M-ManA-CH20-2H20-H]-1; m/z 704,3 é [M-2ManA-H20-H]-1; m/z 634,4 é [M-2ManA-2 (CH20) -CO-H]-1; o pico de m/z 536,5 é [M-2H]2~; e o pico de m/z 357,4 é [M-3H]3~. No espetro ESI-MS da fracção dos oligossacáridos acima, o pico de ião molecular é m/z 1073,9, indica que o seu peso molecular é 1074.

3.4 Espetroscopia de ressonância magnética nuclear do oligossacárido de alginato ΤΗ NMR e 13C NMR do oligossacárido de alginato representado pela fórmula (I) (n=4) são obtidos pelo espetrómetro JNMECP600 NMR. Os resultados são apresentados na tabela 2 e 3.

De acordo com os resultados da análise acima, está confirmado que o oligossacárido de alginato na fração acima é o hexassacárido manurónico possuindo a seguinte estrutura (la) :

(Ia) 3.5 Determinação do conteúdo de ácido manurónico no oligossacárido de alginato (espectroscopia de 1H-NMR) A composição do oligossacárido de alginato é determinada por 1H-NMR de elevada resolução para quantificar a proporção de ácido manurónico para ácido gulurónico (M/G) no oligossacárido de alginato de acordo com a intensidade de sinal do protão do carbono anomérico. São pesados 3 a 5 mg da amostra seca, dissolvidos em D20 a pD neutro e adicionado com 0,3 mg de EDTA. A amostra é determinada por um espetómetro de NMR Bruker DPX-300. O espetro é reportado a 70 °C, de modo a que o pico de D20 esteja distante da região de ressonância do protão anomérico. A intensidade relativa do sinal é expressa pelo integral da área do pico. Os resultados indicam que os sinais H-l do radical M surgem a 4,64 ppm e 4,66 ppm (i.e. os sinais H-l do radical M nas sequências MM e MG, respetivamente); todos os sinais H-l do radical G surge a 5,05 ppm (pico duplo) . O teor relativo de M e G na amostra pode ser expresso pela sua intensidade do pico de H-l, como a seguinte equação:

em que, I representa a intensidade do pico, expressa pelo integral da área do pico. O teor relativo de ácido D-manurónico na amostra é 98,07% através do método acima descrito, indicando que o oligossacárido de alginato é principalmente composto por ácido manurónico. 4 Identificação da estrutura do produto da degradação oxidativa do oligossacárido de alginato É identificada a estrutura produto da degradação oxidativa do oligossacárido na fração obtida a partir da preparação do produto da degradação oxidativa do oligossacárido de alginato. Está confirmado que o produto da degradação oxidativa é um derivado do oligossacárido de alginato composto por β-D-ácido manurónico ligado por ligações 1,4-glicosidicas, nas quais o terminal reduzido na posição 1 é um radical carboxilo. A fórmula estrutural é:

(Π) em que, n representa 0 ou um inteiro de 1 até 19. 0 componente 6 é tomado como um exemplo para ilustrar a análise da estrutura do produto da degradação oxidativa do oligossacárido acima. 4.1 Espetrograma de absorção ultravioleta

Uma quantidade apropriada do produto de degradação oxidativa é diluída até uma certa concentração com água destilada, e rastreada com um espectrofotómetro Shimdzu UV-260 UV (190 nm~700nm) no comprimento de onda total.

Verificou-se que não surgiu nenhum pico de absorção específico nas regiões do ultravioleta e da luz visível. 4.2 Análise de espetro de infravermelhos O espetro de infravermelhos do produto da degradação oxidativa do oligossacárido de alginato é determinado por um espectrómetro de infravermelhos inteligente NICOLE NEXUS-470. Os resultados são apresentados na tabela 4.

4.3 Análise de 1H-NMR

Os espetros de 1H-NMR e 13C-NMR do produto da degradação oxidativa são obtidos por espetómetro de NMR Bruker Auance DPX- 300. Como observado a partir do espetro de 1H-NMR, é composto principalmente dos sinais de seis átomos de hidrogénio em ácido β-D-manurónico. Após o padrão de acoplagem de cada sinal ser atribuído, descobriu-se que o produto da degradação oxidativa do oligossacárido de alginato é composto principalmente por ácido manurónico. Se o terminal reduzido na posição 1 é o grupo aldeído, os desvios químicos de H-l a e H-Ιβ devem ser 5,11 ppm e 4,81 ppm, respetivamente. Uma vez que o terminal reduzido na posição 1 do oligossacárido de alginato é oxidado para originar o grupo carboxilo a partir do grupo aldeído, H-l desaparece, por isso os sinais a 5,11 ppm e 4,81 ppm desaparece. Como se pode observar a partir do espetro 13C-NMR, é principalmente composto pelos sinais dos seis átomos de carbono no β-D-ácido manurónico. Após acoplamento o padrão de cada sinal é atribuído, descobriu-se que a molécula intermediária é principalmente composta por ácido manurónico. Em comparação com o espetro do intermediário, o sinal do terminal reduzido C—1 de ácido manurónico (94 ppm) desaparece. O sinal do terminal reduzido C-l (175,81 ppm) é desviado em direcção ao campo baixo. A razão é que o terminal reduzido na posição 1 do oligossacárido de alginato é oxidada no grupo carboxilo a partir do grupo aldeído e o desvio químico de C-l é alterado desde cerca de 94 ppm do grupo aldeído para 175,81 ppm do grupo carboxilo.

4.4 Análise de MS A análise de MS é realizada com um espetómetro de massa BIFLEX III tipo MALDI-TOF (Bruker Daltonics Co. ) . Os resultados são apresentados na Fig. 4. Como observado a partir da Fig. 4, o pico de m/z 1113,7 é [M+Na]+1; o pico de m/z 1113,7 é [M-O+Na] +1; o pico de m/z 1083,7 é [M-CH20+Na]+1; o pico de m/z 1067, 6 é [M -CH20-0+Na]+1; o pico de m/z 1053, 6 é [M-2 (CH20) +Na]+1; o pico de m/z 979, 6 é [M-3 (CH20) -C02+Na]+1; e o pico de m/z 921,6 é [M- 4 (CH20)-C02- CO+Na]+1. A análise de MS do produto da degradação oxidativa do oligossacárido de alginato é apresentada na tabela 5.

No espetro de MALDI-TOF do produto da degradação oxidativa do oligossacárido de alginato, o pico de m/z 1113,7 é [M+Na]+1, indicando que o peso molecular do produto da degradação oxidativa do oligossacárido de alginato é 1090,7. O peso molecular aumentou dezasseis vezes em comparação com o do oligossacárido de alginato hidrolisado com ácido (M=1075), isto é, é adicionado um átomo de oxigénio à molécula, que pode ser considerado que o oligossacárido de alginato seja oxidado durante a preparação.

De acordo com os resultados da análise acima, a estrutura do produto da degradação oxidativa do oligossacárido de alginato é a fórmula (lia):

( Ha ) 5 Avaliação do oligossacárido de alginato na doença de Alzheimer (AD)

Um 6-mero separado com uma coluna de Bio-Gel-P6 é utilizado como um exemplo para demonstrar a sua atividade. Assim, o oligossacárido de alginato é referido como "6-mero" nas seguintes experiências. 5.1 Efeitos de 6-mero em murganhos com AD induzida por Αβΐ-40

Foram pesados murganhos Balb/c machos (18-22 g, adquiridos do Laboratory Centre da Shandong University) e atribuídos aleatoriamente a seis grupos como se segue: um grupo de controlo, um grupo modelo, um grupo tratado com 6-mero de baixa concentração (15 mg/kg), um grupo tratado com 6-mero de concentração média (30 mg/kg), um grupo tratado com 6-mero de concentração alta (60 mg/kg), e um grupo tratado com Huperzine A (HBY, com uma concentração de 0,2 mg/kg) . Os murganhos foram administrados oralmente com fármacos correspondentes no dia 3 após agrupamento. Os fármacos foram administrados uma vez por dia consecutivamente com uma dosagem de 0,5 ml/20 g até a experiência estar completa. Os murganhos dos grupos de controlo e de modelo foram administrados simultaneamente com uma quantidade equivalente de soro fisiológico normal.

No 8o dia após a administração do fármaco, os murganhos são injetados com Αβ4-40 envelhecido exceto o grupo do veiculo como o método de referência (Jhoo JH et al. , β-amiloid (1-42)-induced learning and memory deficits in mice: involvement of oxidative burdens in the hippocampus and cerebral cortex. Behavioural Brain Research (2004) 155: 185-196) para induzir o modelo de AD. A solução Αβ4-40 envelhecida é injetada no ventrículo cerebral direito. Os resultados dos ensaios de aquisição testados com o teste de labirinto de água de Morris demonstram que os murganhos tratados com Αβ apresentam uma latência de escape mais prolongada (P<0,05 , P<0,01), comparado com os grupos de controlo e modelo, indicando que os murganhos do modelo de AD estão estabelecidos (Fig.6). Contudo, no Io dia do teste, este aumento da latência de escape é encurtada em todos os grupos tratados com o fármaco exceto o grupo tratado com 15 mg/kg de 6- mero. E a latência de escape do grupo tratado com o 6-mero a 60 mg/kg foi de significância estatística em comparação com a do grupo modelo (P<0,05) . No 2o e 3o dia de teste, a latência de escape de todos os grupos tratados com o fármaco são encurtados, em que A do grupo tratado com 6-mero a 60 mg/kg e o grupo tratado com HBY possuem significância estatística em comparação com a do grupo modelo (P<0,05).

No 4o dia de teste do teste de labirinto de água de Morris, a placa original é removida e a percentagem de tempo de murganhos gue estão na fase da placa original durante 60 s é registada. Os resultados demonstram gue os murganhos no grupo modelo apresentaram uma latência muito mais baixa enviesada do gue o grupo de controlo (P<0,05), e a latência enviesada é significativamente elevada após a administração do 6-mero em comparação com a do grupo modelo (P<0,05) (tabela 7).

No 25° dia após a injeção de Αβ, os murganhos são ainda treinados para a tarefa de evitar a passagem passiva. Na tarefa, cada murganho é colocado no compartimento iluminado do dispositivo, virado para fora do compartimento escuro, e a porta é aberta, permitindo o acesso ao compartimento escuro. Assim que o murganho entra no compartimento escuro, recebe um choque eléctrico nas patas a que não pode escapar (36 V) através de uma grelha no chão de aço inoxidável. 0 teste é realizado de forma semelhante após 24 h. 0 tempo de entrada de cada murganho na câmara escura (latência de passagem, estando o teste máximo limitado a 3 min) e o número de entradas no compartimento escuro (número de erros) são registados.

Os resultados da tarefa de evitar a passagem passiva são apresentados nas figuras 5 e 6. Cada grupo possui 8 animais. Os resultados são apresentados como média ± SE. 0 simbolo # significa diferença significativa em comparação com o grupo de controlo (P<0,05) . * significa diferença significativa em comparação com o grupo modelo (P<0,05). A latência de passagem do grupo tratado com Αβ4_40 é encurtada (P<0,01) e o número de erros é aumentado (P<0,05) em comparação com o do grupo de controlo, indicando o estabelecimento bem sucedido de murganhos com AD. Contudo, a latência de passagem é significativamente prolongada nos grupos tratados com 6-mero de 30 e 60 mg/kg e o grupo tratado com HBY, e o número de erros é significativamente reduzido nos grupos tratados com 6-mero e HBY, indicando que o 6-mero possui a função de melhorar significativamente a actividade de aprendizagem e de memória em modelos induzidos com Αβ1_40.

Efeitos de β-mero nos indicadores bioquímicos do cérebro de murganhos com AD induzida por Άβ

Após o teste de comportamento, os ratos são decapitados. 0 córtex cerebral e o hipocampo são dissecados em gelo imediatamente, e armazenados a -80 °C após uma congelação rápida em azoto liquido durante 1 hora. As actividades de MD A, SOD, GSH-PX, Na+, K+-ATPase, AchE e CHAT nas regiões do cérebro são determinadas utilizando os respetivos kits. Os homogenatos do córtex cerebral e do hipocampo são preparados com soro fisiológico com uma concentração final de 10% e 5%. Os sobrenadantes foram obtidos após centrifugação a 3600 rpm para testar as actividades de MDA, CuZn-SOD, GSH-PX, Na+K+-ATPase, AchE, e CHAT. A atividade de ChAT é determinada com o método de marcação com isótopo. Os outros indices e a quantidade de proteínas totais são testados com os respectivos kits fornecidos pelo Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute.

(1) Efeitos de 6-mero na atividade de ChAT de murganhos com AD A atividade de ChAT no córtex cerebral é marcadamente diminuída após o tratamento com Αβ, em comparação com o grupo de controlo (p<0,05). Todavia, a sua atividade é aumentada após o tratamento de 6-mero e HBY, em que os efeitos curativos a 30 mg/kg e 60 mg/kg de 6-mero e de HBY possuem uma significância estatística (tabela 8).

(2) Efeitos de 6-mero na atividade de SOD de murganhos AD A atividade de SOD no cérebro diminuiu após o tratamento com Αβ, mas não possui significância estatística em comparação com o grupo de controlo. A sua atividade aumentou significativamente no córtex cerebral e no hipocampo após o tratamento de 6-mero a uma dosagem de 60 mg/kg, indicando que o mecanismo do efeito de 6-mero na AD está relacionado com o melhoramento da actividade antioxidante (tabela 9).

(3) Efeitos de 6-mero no teor de MDA de murganhos com AD 0 teor de MDA no córtex cerebral e no hipocampo não tem uma diferença significativa em comparação com o grupo de controlo. 0 seu conteúdo diminuiu no cérebro após o tratamento de HBY e 6-mero a uma dosagem de 30 mg/kg e 60 mg/kg, indicando que ambos possuem a capacidade para melhorar a resposta à oxidação e lesão de radicais livres no cérebro e proteger o cérebro de lesão oxidativa (tabela 10).

(4) Efeitos de 6-mero na atividade de GSH-PX de murganhos com AD A atividade de GSH-PX no córtex cerebral e no hipocampo diminui após a utilização de Αβ com diferença significativa em relação ao grupo de controlo no hipocampo (p <0,05). A sua atividade aumenta no córtex cerebral após o tratamento de 6-mero, em que a atividade é significativamente diferente após o tratamento do oligossacárido de alginato numa dosagem de 60 mg/kg e HBY (p <0,05). Os resultados estão apresentados na tabela 11.

(5) Efeitos de 6-mero na atividade de Na+, K+-ATPase de murganhos com AD A atividade de Na+, K+-ATPase no córtex cerebral e no hipocampo é significativamente diminuída após o tratamento com Αβ em comparação com o grupo de controlo, indicando que Αβ afetou significativamente o metabolismo da energia de neurónios no cérebro. Contudo, a sua atividade aumentou marcadamente após o tratamento do oligossacárido de alginato a três dosagens diferentes, em que a atividade aumentou significativamente após o tratamento com 60 mg/kg no hipocampo em comparação com HBY, indicando que o melhoramento do nível de metabolismo de energia no cérebro pode ser um dos mecanismos do oligossacárido de alginato para proteger as funções do cérebro e anti-AD. Os resultados são apresentados na tabela 12.

5.2 Efeitos protetores de 6-mero nos neurónios danificados por Αβ in vitro

Os neurónios do córtex cerebral primário de rato são cultivados como o método de referência (Banker GA, et al., Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res, 1977, 126:397-425) . As células cultivadas durante 1 semana são utilizadas nesta experiência. 0 que é dizer, no 8o dia as células são pré-tratadas com uma série de concentrações de 6-mero (concentração final de 0, 10, 50, 100 mg/ml) durante 24 h, seguido pela adição de Αβ25-35 envelhecido (Primeiramente resolvido em água destilada com uma concentração de 1 mg/ml, depois ficaram a 37 °C durante 7 dias para ficarem envelhecidas em Αβ25_35 e armazenadas a -20 °C para utilização) com uma concentração final de 30 μΜ. Após 24 h a 37 °C, é adicionado 10 μΐ de MTT com uma concentração de 5 mg/ml. Após 4 h a 37 °C, o sobrenadante é removido e é adicionado 150 μΐ de DMSO. Depois a absorvência a 570 nm (630 nm como referência) é registada com um leitor de ELISA (Rainbow, TECAN, Áustria).

Descobriu-se que após os neurónios primários serem incubados com 30 μΜ de Αβ25-35 envelhecido, a redução de MTT é fortemente diminuída e a taxa de sobrevivência das células é significativamente reduzida para 54,5 ± 8,9% (P<0,001) após o tratamento de Αβ25-35 envelhecido. O 6-mero a uma dosagem de 10, 50, 100 pg/ml pode aumentar significativamente as células sobreviventes danificadas por Αβ25_35 de um modo dependente da dose (A taxa de sobreviventes é de 72,0 ± 11,2%, 77,1 ± 8,1% e 82,3 ± 11,6% respetivamente). O 6-mero possui efeitos protetores semelhantes na linha de células neuronais SH-SY5Y como os neurónios primários. SH-SY5Y danificado com 30 μΜ de Αβ25-35 envelhecido (Fig.7) e 2 μΜ de Αβι-40 (Fig· 8) durante 48 h pode induzir uma série de alterações, por exemplo, lesão das células, número reduzido de células, ocorrência de algumas células redondas e células em suspensão. Além disso, a taxa de sobrevivência das células é reduzida para 73,3+9,4% e 64,1+2,5% respetivamente. Todavia, o oligossacárido de alginato a uma dosagem de 50 e 100 pg/ml pode inibir significativamente a neurotoxicidade de Αβ, por exemplo, a ocorrência de células em suspensão é reduzida e a taxa de sobrevivência aumenta.

As experiências acima revelaram que o 6-mero pode encurtar a latência de escape e aumentar os números de cruzamento da placa original e encurtar o tempo de chegada da placa original em murganhos com AD induzidos com Αβι-40, implicando a sua atvidade de melhoramento de comportamento em murganhos tratados com Αβ. Este resultado in vivo assim como os efeitos de proteção in vitro em linhas de células neuronais primárias sugere que o 6-mero possui a atividade anti-AD.

6 Estudo do mecanismo de ação de 6-mero em AD 6.1 Efeitos de 6-mero na apoptose da linha celular SH-SY5Y induzida por Αβ25-35

As células SH-SY5Y são incubadas em placas de 6 poços a uma densidade de 2xl05 células por poço. No dia após o plaqueamento, as células são pré-tratadas com concentrações variáveis (0, 50, 100 pg/ml) de 6-mero durante 24 h, seguido pela adição de 30 μΜ de Αβ25-35 envelhecido (adquirido a Sigma. Co.) . Após 48 h a 37 °C, as células são digeridas, recolhidas, lavadas, centrifugadas a 1200 rpm e incubadas com 200 ml de uma mistura de 5 mg/ml de iodeto de propídio (Hyclone Co. ) e 100 U/ml de RNase (Hyclone Co. ) . Depois as células são medidas por citometria de fluxo (BD Co., US), com 8000 células por amostra.

Verificou-se que as células SH-SY5Y estimuladas com 30 μΜ de Αβ25-35 envelhecido durante 48 h apresentam 24,8 ± 1,9% de células hipodiplóides. Contudo, o pré-tratamento com 50 e 100 pg/ml de 6-mero durante 24 h suprimiu significativamente a apoptose induzida por Αβ25_35 envelhecido, e as percentagens observadas de células hipodiplóides são 10,2 ± 1,3% e 5,1 ± 0,7%, respetivamente.

Para além disso, descobriu-se que o 6-mero também para significativamente a cascata apoptótica revertendo a sobrecarga de ião cálcio intracelular cálcio e acumulação de ROS, e por regulação positiva da expressão de Bcl-2 e regulação negativa da expressão de P53 e Caspase-3 induzidas por Αβ. Todos esses fatores contribuem para o potencial terapêutico de 6-mero no tratamento de AD. 6.2 Mecanismo molecular de 6-mero na toxicidade anti-neuronal de Άβ (1) Efeitos de 6-mero na formação da fibrilha de Αβι_40 É incubado Αβ4_40 fresco isoladamente ou com 6-mero (concentração final de 10, 50, e 100 pg/ml, respetivamente) a 37 °C durante 24 h. Após incubação, é adicionado Th-T e a intensidade da fluorescência é monitorizada a Em=450nm e Ex=4 8 Onm.

Os resultados demonstram que o 6-mero (a uma dosagem de 10, 50, 100 pg/ml) pode inibir a acumulação de Αβ4-40, em que o efeito inibidor de 100 pg/ml 6-mero é bastante óbvio. A intensidade de fluorescência é 10,46±0,94, 9,18±1,32 e 7,81±1,38 (p<0,05, 0,05 e 0,001, respetivamente), respetivamente. Os mesmos efeitos de 6-mero na formação da fibrilha de Αβ4_40 são estudados com TEM (Fig.9), indicando que o 6-mero pode inibir significativamente a formação de fibrilha de Αβ4-40. Além disso, descobriu-se que o 6-mero

apresentou um efeito inibidor significativo na formação da fibrilha de Αβ4_40 facilitada por heparina utilizando TEM. Na Fig. 9, A apresenta o resultado da incubação com Αβ4_40 isoladamente durante 24 h; B apresenta o resultado da incubação com uma mistura de Αβ4-40 e heparina 24 h; C apresenta o resultado da incubação com uma mistura de Αβ4-40 e 6-mero durante 24 h; D apresenta o resultado da incubação com uma mistura de Αβ4_40, heparina e 6-mero durante 24 h; E apresenta o resultado da incubação com Αβ4_40 isoladamente durante 48 h; F apresenta o resultado da incubação com uma mistura de Αβ4-40 e heparina durante 48 h; G apresenta o resultado da incubação com a mistura de Αβ4-40 e 6-mer durante 48 h; e H apresenta o resultado da incubação com uma mistura de Αβι-4ο, heparina e 6-mero durante 48 h. (2) Efeitos de 6-mero na desestabilidade de fibrilha Αβι_40 . É envelhecida 1 mg/ml de Αβ4_40 resolvido em água destilada a 37 °C durante 7 d, após os quais é exposto a 6-mero durante 3 dias. A amostra é corada com acetato de urânio e TEM (JEM 1200EX) revela que Αβ4-40 isoladamente conduz à formação de fibras torcidas longas, após envelhecimento durante 7 dias (Fig.lOA). Na presença de heparina durante mais 24 h, as fibras longas, torcidas tornam-se mais densas e compridas em comparação com aquelas formadas na ausência de heparina (Fig.lOB). De salientar, que na presença de 6-mero durante mais 3 dias, as fibras longas e agregadas de Αβ são transformadas em fibras pequenas, irregulares e curtas (Fig.lOC). Estas descobertas sugerem que o 6-mero é capaz de reverter realizando a fibrilha Αβ, sublinhando a ação de desestabilização de 6-mero na fibrilha Αβ pré-formada e desse modo potencialmente a intervenção terapêutica. (3) Efeitos de 6-mero na conformação de Αβι-40 0 espetro de CD (J-500A, JASCO, Japão) de Αβ4-40 monomérico (250 pg/ml em TBS (100 mM Tris, 50 mM NaCl, pH 7,4)) incubado a 37 °C durante 12 h é principalmente caracterizado pela estrutura secundária de folhas β (Fig. 11A) . A exposição simultânea de Αβ4_40 monomérico a 6-mero (100 yg/ml) durante 12 h previne a formação de folhas β (Fig. 11 C). Contudo, a heparina acelera significativamente a transição conformacional para a estrutura de folhas β (Fig. 1 IB) . (4) Interação entre 6-mero e Αβ A técnica de SPR (BIAcore X, Uppsala, Suécia) é utilizada para caraterizar a interação de 6-mero e Αβ. Diferentes graus de Αβ4-40 envelhecido (envelhecido durante 0, 0,5, 1, 2, 4, 6dias a 37 °C) em solução de tampão HBS EP (0,01 MHEPES, 150 mmol/L, NaCl, 3,4 mmol/L EDTA-Na2, 0,005 vol% Tween-20, pH 7,4) com 5 concentrações são fluidos através do chip de sensor imobilizado em 6-mero. A taxa de flocos é de 5 μΐ/min, e o volume da injecção e de 10 μΐ. O sensorgrama de ligação é registado e o chip do sensor é regenerado com NaCl a 2 M.

Descobriu-se que diferentes graus de Αβ4-40 envelhecido podem todos eles ligar-se a 6-mero. A afinidade de ligação é a mais fraca para Αβ4_40 fresca e 6-mero com um valor de KD de 6,85E~07 Μ. A afinidade de ligação aumenta com o grau de envelhecimento (os valores de KD são l,07E-07, 9,06E-08,5,43E-08,2,15E-08,1,45E-08 M, respetivamente), e torna-se essencialmente estável após envelhecimento durante 2 dias.

Outros estudos revelam que o 6-mero se liga a Αβ de comprimento total, através de Hisl3~Lysl6, e liga-se a Αβ25-35 através de Ser26~Lys28. A ligação do 6-mero com Αβ fresca pode contribuir para a sua inibição na fibrilogénese de Αβ. A ligação de 6-mero com Αβ envelhecido pode contribuir para a desestabilidade da fibrilha de Αβ.

Os estudos acima revelam que os mecanismos moleculares são atribuídos ao fato de o 6-mero dificultar todo o processo fibrilhogenético e particularmente desmontar a fibrilha Αβ pré-formada. Estes resultados indicam que o 6-mero, atuando como um antagonista da cascata de Αβ total, é um potencial candidato preventivo e terapêutico para a AD, que proporciona a prova do principio para uma nova estratégia para o tratamento da AD. 7 Estudo de 6-mero em modelos de diabetes 7.1 Efeitos protetores de 6-mero em células beta pancreáticas debilitadas por amilina in vitro A linha celular de células beta pancreáticas humanas NIT é cultivada com meio DMEM contendo 10% de FBS. As células são incubadas em placas de 96 poços numa densidade de lxlO4 células/poço. No dia após o plaqueamento, elas são pré-tratadas com concentrações variáveis de 6-mero (concentração final de 0, 10, 50, 100 pg/ml) durante 24 h, seguido pela adição de amilina envelhecida com uma concentração final de 30 μΜ. Após 48 h a 37 °C, a sobrevivência das células é medida pelo método MTT.

Os resultados demonstram que o 6-mero pode aumentar as células sobreviventes debilitadas pela amilina de um modo dependente da dose (Fig.12). Cada grupo possui 6 animais. Os resultados são apresentados como média ± SE. ## significa diferença estatística em comparação com o grupo de controlo (p<0.01) * e * significam diferença estatística em comparação com o grupo tratado com IAPP (p<0,05 e p<0,01). Os resultados sugerem que o 6-mero possui efeitos protetores em células beta pancreáticas debilitadas com amilina. 7.2 Efeitos de 6-mero nos murganhos diabéticos induzidos por estreptozotocina (STZ) in vivo

Sessenta murganhos NIH machos (com pesos de 18-22 g) são divididos aleatoriamente nos grupos de controlo, modelo, tratados com 6-mero a 50, 150, 450 mg/kg e tratado com dimetildiguanida a 5 mg/kg. Os murganhos são injetados intraperitonealmente com 150 mg/kg de STZ exceto o grupo de controlo no Io dia. Depois, os murganhos são administrados consequentemente fármacos consecutivamente durante 10 dias e os globos oculares são removidos para extrair sangue no 11° dia. O sangue é removido para medir a concentração da glucose. A concentração em cada grupo tratado com 6-mero é significativamente mais baixa do que aquela no grupo modelo, indicando que o 6-mero possui efeitos terapêuticos em murganhos diabéticos induzidos por STZ (tabela 13) .

As mesmas experiências são realizadas com 2-mero até 22-mero isoladamente ou sua mistura ou os seus produtos de degradação oxidativa. Os resultados são semelhantes aos do 6-mero para indicar a sua potencial atividade em AD e diabetes. As Figuras 13 até 16 apresentam os resultados de comportamento da mistura dos produtos de degradação oxidativa dos oligossacáridos de alginato em murganhos com AD induzida por Αβι-40 injetada no cérebro. Cada grupo tem 8 animais. Os resultados são apresentados como média ±SE. 0 símbolo # e ## representa a diferença estatística em comparação com o grupo de controlo (p<0,05, p<0,01), e * e ** representam a diferença estatística em comparação com o grupo modelo (p<0,05, p<0,01) . Os resultados revelam que a mistura dos produtos de degradação oxidativa dos oligossacáridos pode melhorar significativamente a capacidade de aprendizagem e de memória dos murganhos AD. As Figuras 17 demonstraram os resultados protectores da mistura dos produtos de degradação oxidativa dos oligossacáridos de alginato na linha celular de células beta pancreáticas NIT debilitadas por IAAp (amilina). Cada grupo tem 6 animais. Os resultados são apresentados como média ±SE. 0 símbolo ## representa a diferença estatística em comparação com o grupo de controlo (p<0,01), e * e ** representam a diferença estatística em comparação com o grupo modelo (p<0,05, p<0,01). Os resultados revelam que a mistura dos produtos de degradação oxidativa dos oligossacáridos de alginato possui um efeito preventivo e curativo significativo na diabetes. 8 Análise estatística

Os resultados são analisados estatisticamente utilizando o software Statview expresso como média +SE e comparados por análise de variância (ANOVA).

Com base nos resultados acima, pode ser preparada a composição farmacêutica contendo uma quantidade eficaz dos oligossacáridos de alginato e os veículos farmaceuticamente aceitáveis. A referida composição farmacêutica inclui um inibidor da formação de fibrilhas da proteína amilóide-β e um inibidor da formação de fibrilhas da proteína de ilhéu amilóide. 0 oligossacárido de alginato de acordo com a presente invenção possui valores importantes na preparação de fármacos para a profilaxia e o tratamento da AD e da diabetes.

Lisboa, 6 de Novembro de 2015

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Derivados de oligossacárido de alginato como apresentado pela seguinte fórmula II ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis, em que o oligossacárido de alginato é composto por ácido β-D-manurónico ligado por ligações a-1,4 glicosidicas:

(Π) em que, n representa 0 ou um inteiro de 1 até 19.
2. Derivados de oligossacárido de alginato ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis de acordo com a reivindicação 1, caracterizados por n ser 2 até 12.
3. Derivados de oligossacárido de alginato ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis de acordo com a reivindicação 1, caracterizados por n ser 4 até 8.
4. Processo para preparar os derivados de oligossacárido de alginato ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis de acordo com a reivindicação 1, compreendendo o processo os seguintes passos: uma solução aquosa de alginato é reagida durante cerca de 2 até 6 h numa autoclave a pH 2-6 e uma temperatura de cerca de 100-120 °C; o pH é ajustado para cerca de 7 após a reação ser parada; e um oxidante é adicionado e reagido durante 15 min até 2 h a uma temperatura de 100-120 °C.
5. Processo de acordo com a reivindicação 4, caraterizado por o referido alginato ser alginato de sódio e ser reagido durante 4 h nas condições de pH 4 e 110 °C.
6. Processo de acordo com a reivindicação 4, caraterizado por após ajustar o pH para cerca de 7, ser adicionado álcool para produzir um precipitado; o precipitado é removido por filtração com sucção, desidratado, seco e dessalinizado.
7. Processo de acordo com a reivindicação 4, caraterizado por o referido oxidante ser hidróxido de cobre e reagido durante 30 min a uma temperatura de 100 °C.
8. Composição farmacêutica contendo uma quantidade eficaz dos derivados de oligossacárido de alginato ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 3, e veículos farmaceuticamente aceitáveis.
9. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 8, caraterizada por a composição ser qualquer uma selecionada a partir do grupo que consiste num medicamento para a profilaxia e tratamento da doença de Alzheimer, um inibidor de formação de fibrilhas da proteína amilóide-β, um medicamento para a profilaxia e tratamento da diabetes, um inibidor de formação de fibrilhas da proteína amilóide do ilhéu e um promotor da desagregação de fibrilhas.
10. Oligossacárido de alginato de fórmula I ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis, em que o oligossacárido de alginato é composto por ácido β-D-manurónico ligado por ligações a-1,4 glicosídicas:

(I) em que, n representa 0 ou um inteiro de 1 até 19, para a utilização para a profilaxia e tratamento da doença de Alzheimer, como inibidor da formação de fibrilhas da proteína amilóide-β, para a profilaxia e tratamento da diabetes, como inibidor de formação de fibrilhas da proteína amilóide do ilhéu e como promotor de desagregação de fibrilhas. Lisboa, 6 de Novembro de 2015