PT1720979E

PT1720979E - Utilização de um meio de cultura de células sem soro para a produção de il-18bp em células de mamífero

Info

Publication number: PT1720979E
Application number: PT05729822T
Authority: PT
Inventors: Thierry Ziegler; Yehoshua Aloni; Orit Aharonovitz
Original assignee: Ares Trading Sa
Priority date: 2004-03-01
Filing date: 2005-02-28
Publication date: 2007-10-25
Also published as: DK1720979T3; DE602005002829T2; CA2554238C; RS50531B; CA2554238A1; CY1107014T1; US7553665B2; ATE375385T1; NO335825B1; EP1720979B1; WO2005083058A1; JP4713567B2; ES2292127T3; SI1720979T1; AU2005217154A1; US20070196895A1; DE602005002829D1; JP2007525228A; NO20064379L; PL1720979T3

Description

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DESCRIÇÃO "UTILIZAÇÃO DE UM MEIO DE CULTURA DE CÉLULAS SEM SORO PARA A PRODUÇÃO DE IL-18BP EM CÉLULAS DE MAMÍFERO"

ÁREA DA INVENÇÃO A presente invenção situa-se na área da cultura de células de mamifero em condições de cultura sem soro. Em particular, refere-se ao crescimento de células de mamifero, como células de ovário de hamster chinês (CHO). As células produzem uma proteína recombinante denominada proteína de ligação à interleuquina-18 (IL-18BP).

CONTEXTO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a um processo que utiliza um meio sem soro para o crescimento e manutenção de células de mamífero em cultura.

Hoje em dia, a cultura de células é amplamente utilizada para a produção de vários produtos biologicamente activos, como vacinas virais, anticorpos monoclonais, imunorreguladores diferentes de anticorpos, factores de crescimento polipeptídicos, hormonas, enzimas, antigenes específicos de tumores, etc. Estes são produzidos por células normais ou transformadas e geneticamente manipuladas.

No passado, para a cultura de células, o meio de cultura era suplementado com soro, que é um nutriente universal para o crescimento e manutenção de todas as linhas de células de mamífero que dão origem a produtos biologicamente activos. O soro contém hormonas, factores de crescimento, proteínas transportadoras, factores de ligação e espalhamento, nutrientes, elementos vestigiais, etc. Os meios de cultura continham habitualmente até cerca de 10% 2 de soro animal, como soro fetal de bovino (FBS), também denominado soro fetal de vitelo (FCS).

Apesar da sua utilização disseminada, o soro tem muitas limitações. Contém niveis elevados de numerosas proteínas que interferem com as quantidades limitadas da proteína de interesse desejada produzida pelas células. Estas proteínas derivadas do soro devem ser separadas do produto durante o processamento a jusante, como purificação da proteína de interesse, o que complica o processo e aumenta o custo. 0 advento da BSE (Encefalopatia Espongiforme Bovina), uma doença neurodegenerativa transmissível do gado com um longo período de latência ou incubação, levantou preocupações de regulamentação no que se refere à utilização de soros derivados de animais na preparação de produtos biologicamente activos.

Em consequência, há uma grande necessidade de desenvolver meios alternativos sem fontes de animais que suportem o crescimento de células e mantenham as células durante a produção de produtos biologicamente activos.

Em geral, os meios de cultura de células compreendem muitos componentes de diferentes categorias, como aminoácidos, vitaminas, sais, ácidos gordos e outros compostos: -Aminoácidos: Por exemplo, a patente U.S. 6 048 728 (Inlow et al.) revela que os seguintes aminoácidos podem ser utilizados num meio de cultura de células: Alanina, Arginina, Ácido Aspártico, Cisteína, Ácido Glutâmico, Glutamina, Glicina, Histidina, Isoleucina, Leucina, Lisina, Metionina, Fenilalanina, Prolina, Serina, Triptofano, Tirosina, Treonina e Valina. -Vitaminas: A patente U.S. 2003/0096414 (Ciccarone et al.) ou U.S. 5 811 299 (Renner et al.), por exemplo, descrevem que as seguintes vitaminas podem ser utilizadas 3 num meio de cultura de células: Biotina, Pantotenato, Cloreto de Colina, Ácido Fólico, Mio-Inositol, Niacinamida, Piridoxina, Riboflavina, Vitamina B12, Tiamina, Putrescina. -Sais: Por exemplo, a patente U.S. 6 399 381 (Blum et al.) revela um meio que compreende CaCl2, KC1, MgCl2, NaCl, Fosfato de Sódio Monobásico, Fosfato de Sódio Dibásico, Selenito de Sódio, CuSCU, ZnCl2- Outro exemplo de um documento que revela os sais inorgânicos que podem ser utilizados num meio de cultura é U.S. 2003/0153042 (Arnold et al.), que descreve um meio que compreende CaCl2, KC1, MgCl2, NaCl, Fosfato de Sódio Monobásico, Fosfato de Sódio Dibásico, CuCl2.2H20, ZnCl2. -Ácidos Gordos: Ácidos gordos que se sabe serem utilizados em meios são Ácido Araquidónico, Ácido

Linoleico, Ácido Oleico, Ácido Láurico, Ácido Mirístico, bem como Metil-beta-Ciclodextrina, ver, por exemplo, a patente U.S. 5 045 468 (Darfler) . Deve notar-se que a ciclodextrina não é um lipido per se, mas é capaz de formar um complexo com lipidos e, assim, é utilizada para solubilizar lipidos no meio de cultura de células. -Outros componentes, particularmente utilizados no contexto de meios de cultura de células sem soro, são compostos tais como glucose, glutamina, piruvato de Na, insulina ou etanolamina (por exemplo, EP 274 445), ou um agente protector, como Pluronic F68. O Pluronic® F68 (também conhecido como Poloxâmero 188) é um copolímero de bloco de óxido de etileno (EO) e óxido de propileno (PO) . O experimentado na área também conhece "meios básicos" padrão. Estes meios já contêm vários dos componentes de meios mencionados acima. Exemplos desses meios que são amplamente aplicados são Meio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM), Meio do Roswell Park Memorial Institute (RPMI) ou meio de Ham. 4

Para o desenvolvimento e fornecimento de produtos biologicamente activos, como proteínas terapêuticas ou vacinas, devem ser produzidas grandes quantidades. Células adequadas que são amplamente utilizadas para a produção de polipéptidos são células de Ovário de Hamster Chinês (CHO).

As células CHO foram primeiramente cultivadas por Puck (J. Exp. Med. 108, 945, 1958) a partir de uma biopsia de um ovário de um hamster chinês fêmea. A partir destas células originais prepararam-se algumas sub-linhas com várias características. Uma destas linhas de células CHO, CHO-K1, requer prolina e é diplóide para o gene da di-hidrofolato redutase (DHFR). Outra linha derivada desta linha de células é uma linha de células CHO deficiente em DHFR (CHO DUK Bll) (PNAS JJ_, 1980, 4216-4220), que é caracterizada por perda da função de DHFR em consequência de uma mutação num gene de DHFR e perda subsequente do outro gene.

Outras células que são frequentemente utilizadas para a produção de proteínas destinadas a serem administradas a humanos são linhas de células humanas como a linha de células de fibrossarcoma humano HT1080 ou a linha de células de rim embrionário humano 293.

Uma proteína terapêutica de interesse é a proteína de ligação à Interleuquina-18 (IL-18BP). A IL-18BP é uma proteína solúvel com afinidade elevada para a IL-18. Foi primeiramente isolada de urina humana, e os cDNAs humano e de ratinho, bem como o gene humano, foram clonados (Novick et al., 1999; WO 99/09063). A proteína foi denominada proteína de ligação à IL-18 (IL-18BP). O nome internacional não registado da IL-18BP é tadekinig alfa. A IL-18BP não é o domínio extracelular de um dos receptores conhecidos da IL-18, é uma proteína segregada e naturalmente em circulação. Pertence a uma nova família de 5 proteínas segregadas que também inclui várias proteínas codificadas por Poxvírus (Novick et al., 1999). A IL-18BP urinária e a recombinante ligam-se especificamente à IL-18 com afinidade elevada e modulam a afinidade biológica da IL-18. 0 gene da IL-18BP foi localizado no cromossoma humano llql3, e não se encontrou nenhum exão codificador para um domínio transmembranar numa sequência genómica de 8,3 kb. Até agora foram encontradas em humanos quatro variantes de processamento ou isoformas da IL-18BP geradas por processamento alternativo de mRNA. Foram denominadas IL-18BP a, b, c e d, em que todas partilham o mesmo terminal N e diferem no terminal C (Novick et al., 1999). Estas isoformas variam quanto à sua capacidade para se ligarem à IL-18. Sabe-se que, das quatro, as isoformas da IL-18BP a e c têm capacidade neutralizadora para a IL-18. A isoforma da IL-18BP humana liga-se à IL-18 murina. A IL-18BP foi sugerida como proteína terapêutica nalgumas doenças e perturbações, como psoríase, Doença de Crohn, artrite reumatóide, artrite psoriática, lesão do fígado, sepsia, aterosclerose, doenças cardíacas isquémicas, alergias, etc., por exemplo, revelado em WO9909063, WO0107480, WO0162285, WO0185201, WO02060479, WO02096456, W003080104, W002092008, W002101049, W003013577.

Assim, é necessário um processo de fabrico eficiente para a produção de IL-18BP em cultura de células, preferivelmente um processo operado em condições sem soro.

RESUMO DA INVENÇÃO A presente invenção baseia-se no desenvolvimento de um processo para a cultura de células num meio de cultura de células sem componentes derivados de soro animal e, ao mesmo tempo, altamente eficaz para o crescimento de células 6 e manutenção de culturas de células de mamífero. Procede-se à cultura das células para produzir proteínas nas células.

De acordo com a presente invenção, as células produzem IL-18BP ou foram modificadas para produzirem IL-18BP. A proteína pode ser isolada e purificada do meio de cultura de células (sobrenadante) e formulada numa composição farmacêutica destinada a ser administrada a humanos ou animais.

Em consequência, num primeiro aspecto, a invenção refere-se a um processo para a cultura de células que produzem IL-18BP, que compreende o passo das células crescerem num meio de cultura de células sem componentes derivados de soro animal, em que o meio de cultura de células compreende:

Asparagina numa concentração que varia desde cerca de 800 até cerca de 900 mg/1;

Cloreto de Sódio numa concentração que varia desde cerca de 3000 até cerca de 4500 mg/1;

Selenito numa concentração que varia desde cerca de 0,005 até cerca de 0,015 mg/1;

Hidrolisado de trigo numa concentração que varia desde cerca de 5000 até cerca de 15000 mg/1, e Insulina numa concentração que varia desde cerca de 2,5 até cerca de 6 mg/1.

Num segundo aspecto, a invenção refere-se a um processo para a produção de IL-18BP, que compreende o passo de cultivar células que expressam a IL-18BP num meio de cultura de células sem componentes derivados de soro animal, em que o meio de cultura de células compreende:

Cloreto de Sódio numa concentração que varia desde cerca de 3000 até cerca de 4500 mg/1; 7

Um terceiro aspecto da invenção refere-se à utilização de um meio de acordo com a invenção para a produção de uma proteína de interesse.

Num quarto aspecto, a invenção refere-se à utilização do meio da invenção para o crescimento de células em cultura.

Um quinto aspecto da invenção refere-se à utilização de um meio de acordo com a invenção para a manutenção de células em cultura durante a fase de produção de um polipéptido de interesse.

DESCRIÇÃO BREVE DAS FIGURAS

Fiq. 1 Células CHO que expressam a IL-18BP foram cultivadas em suspensão em meio sem soro de acordo com a invenção com diluições repetidas com meio fresco durante 60 dias (n=10) . A Fig. 1 mostra a densidade de células viáveis.

Fig. 2 Mostra as células viáveis cumuladas.

Fiq. 3 Mostra o tempo de duplicação.

Fig. 4 Mostra a concentração de glucose e lactato no sobrenadante.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO A presente invenção baseia-se no desenvolvimento de um processo para o crescimento e manutenção de células que expressam a IL-18BP e para a produção de IL-18BP num meio 8 de cultura de células que não tem componentes derivados do soro.

Em consequência, a presente invenção refere-se a um processo para a produção de IL-18BP que compreende o passo de cultivar uma célula que expressa a IL-18BP num meio de cultura de células sem componentes derivados de soro animal, em que o meio de cultura de células compreende:

Asparagina numa concentração que varia desde cerca de 700 até cerca de 1000 mg/1, preferivelmente desde cerca de 800 até cerca de 900 mg/1;

Cloreto de Sódio numa concentração que varia desde cerca de 2000 até cerca de 5000, preferivelmente desde cerca de 3000 até cerca de 4500 mg/1;

Selenito numa concentração que varia desde cerca de 0,003 até cerca de 0,02 mg/1, preferivelmente desde cerca de 0,005 até cerca de 0,015 mg/1;

Hidrolisado de trigo numa concentração que varia desde cerca de 3000 até cerca de 20000 mg/1, preferivelmente desde cerca de 5000 até cerca de 15000 mg/1, e Insulina numa concentração que varia desde cerca de 1 até cerca de 8 mg/1, preferivelmente desde cerca de 2,5 até cerca de 6 mg/1. A invenção também se refere a um processo para cultivar células que expressam a IL-18BP, que compreende o passo da célula crescer num meio de cultura de células sem componentes derivados de soro animal, em que o meio de cultura de células compreende:

Cloreto de Sódio numa concentração que varia desde cerca de 2000 até cerca de 5000, preferivelmente desde cerca de 3000 até cerca de 4500 mg/1; 9

Selenito numa concentração que varia desde cerca de 0, 003 até cerca de 0,02 mg/1, preferivelmente desde cerca de 0,005 até cerca de 0,015 mg/1;

Hidrolisado de trigo numa concentração que varia desde cerca de 3000 até cerca de 20000 mg/1, preferivelmente desde cerca de 5000 até cerca de 15000 mg/1, e Insulina numa concentração que varia desde cerca de 1 até cerca de 8 mg/1, preferivelmente desde cerca de 2,5 até cerca de 6 mg/1.

Preferivelmente, o processo também compreende o passo de recolher o meio que compreende a proteína de interesse.

Noutra especificação preferida, o processo também compreende isolar a proteína de interesse.

Noutra especificação preferida, o processo também compreende formular a proteína isolada com um transportador farmaceuticamente aceitável para obter uma composição farmacêutica.

Num terceiro aspecto, a invenção refere-se à utilização de um meio de cultura de células que compreende:

Hidrolisado de trigo numa concentração que varia desde cerca de 3000 até cerca de 20000 mg/1, preferivelmente desde cerca de 5000 até cerca de 15000 mg/1, e 10

Insulina numa concentração que varia desde cerca de 1 até cerca de 8 mg/1, preferivelmente desde cerca de 2,5 até cerca de 6 mg/1, para a produção de um polipéptido de interesse.

Num quarto aspecto, a invenção refere-se à utilização de um meio de cultura de células que compreende:

Hidrolisado de trigo numa concentração que varia desde cerca de 3000 até cerca de 20000 mg/1, preferivelmente desde cerca de 5000 até cerca de 15000 mg/1, e Insulina numa concentração que varia desde cerca de 1 até cerca de 8 mg/1, preferivelmente desde cerca de 2,5 até cerca de 6 mg/1, para o crescimento de células que expressam a IL-18BP em cultura.

Num quinto aspecto, a invenção refere-se à utilização de um meio de cultura de células que compreende:

Cloreto de Sódio numa concentração que varia desde cerca de 2000 até cerca de 5000, preferivelmente desde cerca de 3000 até cerca de 4500 mg/1; 11

Hidrolisado de trigo numa concentração que varia desde cerca de 3000 até cerca de 20000 mg/1, preferivelmente desde cerca de 5000 até cerca de 15000 mg/1, e Insulina numa concentração que varia desde cerca de 1 até cerca de 8 mg/1, preferivelmente desde cerca de 2,5 até cerca de 6 mg/1, para a manutenção de células que expressam a IL-18BP em cultura, por exemplo, durante a fase de produção de um polipéptido de interesse.

De acordo com os processos e utilizações da presente invenção, o meio de cultura de células compreende:

No contexto da presente invenção, a Asparagina pode ser utilizada em qualquer concentração que varie desde cerca de 700 até 1000 mg/1, por exemplo, a 705, 710, 715, 720, 725, 12 730, 735, 740, 745, 750, 755, 760, 765, 770, 775, 780, 785 790, 795, 800, 805, 810, 815, 820, 825, 830, 835, 840, 845 850, 855, 860, 865, 870, 875, 880, 885, 890, 895, 900, 905 910, 915, 920, 925, 930, 935, 940, 945, 950, 955, 960, 965 970, 675, 980, 985, 990, 995 mg/ml.

No contexto da presente invenção, o Cloreto de Sódio pode ser utilizado numa concentração que varie desde cerca de 2000 até cerca de 5000 mg/1, por exemplo, a 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900 mg/1.

No contexto da presente invenção, o Selenito pode ser utilizado numa concentração que varie desde cerca de 0,003 até cerca de 0,02 mg/1, por exemplo, a 0,0035, 0,004, 0,0045, 0,005, 0,0055, 0,006, 0,0065, 0,007, 0,0075, 0,008, 0,0085, 0,009, 0,0095, 0,01, 0,011, 0,012, 0,013, 0,014, 0,015, 0,016, 0,017, 0,018, 0,019, 0,02 mg/1.

No contexto da presente invenção, o Hidrolisado de trigo pode ser utilizado numa concentração que varie desde cerca de 3000 até cerca de 20000 mg/1, por exemplo, a 3500, 4000, 4500, 5000, 5500 , 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 8500, 9000, 9500, 9600, 9700, 9800 , 9900 , 10000, 10100, 10200, 10300, 10400, 10500, 10600, 10700, 10800, 10900, 11000, 11500, 12000, 12500, 13000, 13500, 14000, 14500, 15000, 15500, mg/1. 16000, 16500, 17000, 18000 , 18500, 19000, 19500

No contexto da presente invenção, a Insulina pode ser utilizada numa concentração que varie desde cerca de 1 até cerca de 8 mg/1, por exemplo, a 1,25, 1,5, 1,75, 2, 2,25, 2,5, 2,75, 3, 3,25, 3,5, 3,75, 4, 4,25, 4,5, 4,75, 5, 5,25, 5,5, 5,75, 6, 6,25, 6,5, 6,75, 7, 7,25, 7,5, 7,75, 8, 8,25, 8,5, 8,75 mg/ml. 13

Como mostrado nos Exemplos abaixo, o processo da invenção utilizando um meio que compreende estes componentes nas gamas indicadas suportou excelente crescimento e manutenção de células durante um periodo de tempo prolongado. 0 passo de cultura do processo da invenção pode ser efectuado em qualquer ambiente adequado, como placas de Petri, balões T ou garrafas rotativas, mas preferivelmente em reactores com volumes maiores, por exemplo, um biorreactor. Balões T e garrafas rotativas são particularmente adequados para o crescimento de células; para a produção de proteínas, as células são preferivelmente mantidas num biorreactor.

As células a serem utilizadas no contexto dos vários aspectos da presente invenção são preferivelmente células de mamífero. Podem ter origem humana ou animal. Exemplos de células de mamífero que podem ser cultivadas no processo de acordo com a presente invenção incluem, por exemplo, células 3T3, células COS, células de osteossarcoma humano, células MRC-5, células BHK, células VERO, células CHO, células rCHO-tPA, células rCHO - Antigene de Superfície de Hep B, células HEK 293, células rHEK 293, células rC127 -Antigene de Superfície de Hep B, células de Fibroblastos Humanos Normais, células de Estroma, células de Hepatócitos, células PER.C6 e células de amniócitos permanentes humanos. Exemplos de hibridomas que podem ser cultivados no processo de acordo com a presente invenção incluem, por exemplo, células DA4.4, células 123A, células 127A, células GAMMA e células 67-9-B. É altamente preferido cultivar uma célula de Ovário de Hamster Chinês (célula CHO) de acordo com a presente invenção. 14

As células cultivadas de acordo com a presente invenção podem crescer em suspensão ou, para células dependentes de ancoragem, ligadas a um suporte sólido. Podem utilizar-se micro-transportadores e discos Fibra-Cel® numa cultura de células de mamífero para o crescimento de células dependentes de ancoragem, que se contam entre as plataformas tecnológicas estabelecidas para a produção industrial de proteínas (ver, por exemplo, Bohak et al.r 1987; Petti et al.r 1994).

No contexto dos processos e utilizações da presente invenção, a Asparagina é vantajosamente compreendida por Asparagina.H2O (TLC 99%, TLC significa Cromatografia em Camada Fina). 0 Selenito pode estar presente no meio, por exemplo, na forma de selenito de sódio. 0 Hidrolisado de trigo é um componente derivado de plantas que faz parte do meio da invenção, com base no facto das células também poderem utilizar aminoácidos que estejam em forma peptídica. A dimensão dos péptidos pode variar desde dois aminoácidos até muitos aminoácidos. Os péptidos derivados da hidrólise de proteínas proporcionam uma fonte suplementar (indefinida) de aminoácidos numa forma que suporta um crescimento superior de algumas linhas/tipos de células. A insulina a ser utilizada no contexto do meio da invenção pode derivar de qualquer fonte e espécie, desde que suporte o crescimento e manutenção da linha de células ou tipo de células particular para o qual se utiliza o meio. Preferivelmente, a insulina pode ser recombinante. É suplementarmente preferido que a insulina derive da espécie correspondente à espécie de onde deriva a linha de células ou tipo de células, ou que seja insulina humana. 15

Gamas de concentrações preferidas dos compostos do meio a serem utilizadas no processo da invenção são as seguintes:

Asparagina numa concentração que varia desde cerca de 810 até cerca de 850 mg/1, muito preferivelmente cerca de 830.

Cloreto de Sódio numa concentração que varia desde cerca de 3400 até cerca de 3600 mg/1, muito preferivelmente cerca de 3500 mg/1.

Selenito numa concentração que varia desde cerca de 0,01 até cerca de 0,012 mg/1, muito preferivelmente cerca de 0,0110 mg/1.

Hidrolisado de trigo numa concentração que varia desde cerca de 8000 até cerca de 12000 mg/1, muito preferivelmente cerca de 10000 mg/1.

Insulina numa concentração que varia desde cerca de 3 até cerca de 5 mg/1, muito preferivelmente cerca de 4 mg/1.

Numa especificação preferida, o meio também compreende glucose numa concentração que varia desde cerca de 500 até cerca de 5500 mg/1, preferivelmente cerca de 1000 mg/1 ou cerca de 4500 ou cerca de 5000 mg/1.

Noutra especificação preferida, o meio compreende um ou mais aminoácidos. Os aminoácidos são seleccionados de entre Alanina, Arginina, Ácido Aspártico, Cisteina, Ácido Glutâmico, Glicina, Histidina, Isoleucina, Leucina, Lisina, Metionina, Fenilalanina, Prolina, Serina, Triptofano, Tirosina, Treonina e Valina, mas não Glutamina.

Numa especificação alternativa, adiciona-se Glutamina ao meio. A Glutamina pode ser preferivelmente adicionada ao meio durante a cultura de células (por exemplo, modo de crescimento, manutenção, produção). 16

Preferivelmente, o meio de acordo com a invenção também compreende vitaminas. Vitaminas preferidas no meio da invenção são seleccionadas de entre Biotina, Pantotenato, Cloreto de colina, Ácido Fólico, Mio-Inositol, Niacinamida, Piridoxina, Riboflavina, Vitamina B12, Tiamina e Putrescina. 0 meio de acordo com a invenção também compreende preferivelmente sais inorgânicos e elementos vestigiais. Os iões são preferivelmente Ca2+, K+, Mg2+, Na+, Cl”, Fosfato, Cu2+, Zn2+. Os sais e elementos vestigiais são preferivelmente seleccionados de entre CaCl2 anidro, KC1, MgCl2 anidro, NaCl, Fosfato de Sódio Monobásico, Fosfato de Sódio Dibásico, CuCl2.2H20 e ZnCl2.

Preferivelmente, o meio da invenção também compreende um tampão. Podem utilizar-se muitos tampões no contexto do meio da invenção, como tampão de bicarbonato de sódio, Tris, BES (Ácido N,N-bis(2-hidroxietil)-2-amino-etanossulfónico), tampão de Glicina ou afins. Um tampão zwitteriónico é particularmente útil para o meio da invenção. Um tampão zwitteriónico preferido que pode ser utilizado é HEPES (Ácido N-(2-hidroxietil)piperazino-N'-2-etanossulfónico) em forma ácida.

Ainda noutra especificação preferida, o meio também compreende ácidos gordos. Esses ácidos gordos são preferivelmente seleccionados de entre Ácido Araquidónico, Ácido Linoleico, Ácido Oleico, Ácido Láurico, Ácido Miristico e Ciclodextrina, que não é um lipido per se mas meramente solubiliza lipidos presentes no meio. A Ciclodextrina é, preferivelmente, Metil-beta-ciclodextrina.

Podem utilizar-se outros hidrolisados no contexto da presente invenção, desde que não derivem de fontes animais. Preferivelmente, o meio da invenção também pode compreender um hidrolisado de soja. 17

Também é preferido que o meio da invenção compreenda suplementarmente esteróides, tais como, por exemplo, cortisona ou hidrocortisona, e/ou fontes de energia suplementares, tais como, por exemplo, piruvato, por exemplo, piruvato de Na, e/ou um agente protector, como Pluronic F68.

No contexto dos processos e utilizações da presente invenção, pode utilizar-se qualquer meio sem soro básico conhecido e adequado, desde que estejam presentes os compostos seguintes:

Hidrolisado de trigo numa concentração que varia desde cerca de 3000 até cerca de 20000 mg/1, preferivelmente desde cerca de 5000 até cerca de 15000 mg/1, e Insulina numa concentração que varia desde cerca de 1 até cerca de 8 mg/1, preferivelmente desde cerca de 2,5 até cerca de 6 mg/1. 18

Listam-se abaixo exemplos de meios sem soro básicos conhecidos:

Msio Fabricante N° do Catálogo EX-CBLL 302 JRH 14312-tQQQM EX-CÊLL 32S MH 1433S-t000M CH0-C03 Sigma 0149© cm m PFM S64D3â4$A CBD*S*SFM ii Gibcc 12S52-G9S CHQ-DHFR Sigma OSS62 PtoÇHGS Csmforax BE12-766Q SF&MCHG MyC&sne SH3054&01 Ultra CHÔ Cambrax 12-724Q HyQ FF CHO HyOoji® SH30220.01 HyQSFXCNQ HyOorse SH301S7.01 HyQ CDM4CHQ HyCtone SH305SB.01 ÍS CHO-CD Irviísa BcfefítiBe #aim iscnav frvtíse ScíentSfte #9197

Os processos e utilizações da invenção servem preferivelmente para produzir um polipéptido de interesse. 0 polipéptido de interesse pode ser, por exemplo, uma proteína segregada naturalmente, uma proteína normalmente citoplasmática, uma proteína normalmente transmembranar ou um anticorpo humano ou humanizado. Quando a proteína de interesse for uma proteína normalmente citoplasmática ou normalmente transmembranar, a proteína será preferivelmente manipulada de modo a se tornar solúvel. 0 polipéptido de interesse pode ter qualquer origem. Polipéptidos de interesse preferidos têm origem humana; 19 mais preferivelmente, as proteínas de interesse são proteínas terapêuticas. A proteína de interesse pode ser uma hormona, uma proteína de ligação a citoquinas, um interferão, um receptor solúvel ou um anticorpo.

Proteínas terapêuticas que podem ser produzidas de acordo com um método da presente invenção incluem, por exemplo, gonadotropina coriónica, hormona estimulante do folículo, hormona lutropino-coriogonadotrópica, hormona estimulante da tiróide, hormona de crescimento humano, interferões (por exemplo, interferão beta-la, interferão beta-lb), receptores de interferões (por exemplo, receptor do interferão gama), receptores do TNF p55 e p75, proteínas de fusão TACI-Fc, interleuquinas (por exemplo, interleuquina-2, interleuquina-11), proteínas de ligação a interleuquinas (por exemplo, proteínas de ligação à interleuquina-18), anticorpos anti-CDlla, eritropoietina, factor estimulador de colónias de granulócitos, factor estimulador de colónias de granulócitos-macrófagos, hormonas peptídicas da pituitária, gonadotropina da menopausa, factores de crescimento do tipo insulina (por exemplo, somatomedina-C), factor de crescimento de queratinócitos, factor neurotrófico derivado da linha de células gliais, trombomodulina, factor de crescimento de fibroblastos básico, insulina, Factor VIII, somatropina, proteína morfogenética do osso-2, factor de crescimento derivado de plaquetas, hirudina, epoietina, proteína de fusão LFA-3/IgGl recombinante, glucocerebrosidase e respectivas muteínas, fragmentos, formas solúveis, derivados funcionais e proteínas de fusão. 0 polipéptido pode ser particularmente seleccionado do grupo que consiste em gonadotropina coriónica (CG), hormona estimulante do folículo (FSH), hormona lutropino- 20 coriogonadotrópica (LH), hormona estimulante da tiróide (TSH), hormona de crescimento humano (hGH), interferões (por exemplo, interferão beta-la, interferão beta-lb), receptores de interferões (por exemplo, receptor do interferão gama), receptores do TNF p55 e p75, interleuquinas (por exemplo, interleuquina-2, interleuquina-11), proteínas de ligação a interleuquinas (por exemplo, proteína de ligação à interleuquina-18), anticorpos anti-CDlla e respectivas muteínas, fragmentos, formas solúveis, derivados funcionais e proteínas de fusão.

Outros polipéptidos de interesse incluem, por exemplo, eritropoietina, factor estimulador de colónias de granulócitos, factor estimulador de colónias de granulócitos-macrófagos, hormonas peptídicas da pituitária, gonadotropina da menopausa, factores de crescimento do tipo insulina (por exemplo, somatomedina-C), factor de crescimento de queratinócitos, factor neurotrófico derivado da linha de células gliais, trombomodulina, factor de crescimento de fibroblastos básico, insulina, Factor VIII, somatropina, proteína morfogenética do osso-2, factor de crescimento derivado de plaquetas, hirudina, epoietina, proteína de fusão LFA-3/IgGl recombinante, gluco-cerebrosidase e respectivas muteínas, fragmentos, formas solúveis, derivados funcionais e proteínas de fusão.

Se a proteína de interesse for formulada com um transportador farmaceuticamente aceitável, o resultado do processo é uma composição farmacêutica.

Pretende-se que a definição de "farmaceuticamente aceitável" abranja qualquer transportador que não interfira na eficácia da actividade biológica do ingrediente activo e que não seja tóxico para o hospedeiro ao qual é administrado. Por exemplo, para administração parentérica, a(s) proteína(s) activa(s) pode(m) ser formulada(s) numa 21 forma galénica unitária para injecção, em veículos tais como solução salina, solução de dextrose, albumina do soro e solução de Ringer. A composição farmacêutica formulada de acordo com a invenção pode então ser administrada a um indivíduo de uma variedade de modos. As vias de administração incluem as vias intradérmica, transdérmica (por exemplo, em formulações de libertação lenta), intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, oral, intracraniana, epidural, tópica, rectal e intranasal. Pode utilizar-se qualquer outra via de administração terapeuticamente eficaz, por exemplo, absorção através de tecidos epiteliais ou endoteliais ou por terapia genética, em que uma molécula de DNA que codifica o agente activo é administrada ao paciente (por exemplo, via um vector), o que faz com que o agente activo seja expresso e segregado in vivo. Adicionalmente, a(s) proteína(s) de acordo com a invenção pode (m) ser administrada(s) juntamente com outros componentes de agentes biologicamente activos, como surfactantes, excipientes, transportadores, diluentes e veículos farmaceuticamente aceitáveis.

Para administração parentérica (por exemplo, intravenosa, subcutânea, intramuscular), a(s) proteína (s) activa(s) pode(m) ser formulada(s) na forma de uma solução, suspensão, emulsão ou pó liofilizado em associação com um veículo parentérico farmaceuticamente aceitável (por exemplo, água, solução salina, solução de dextrose) e aditivos que mantenham a isotonicidade (por exemplo, manitol) ou estabilidade química (por exemplo, conservantes e tampões). A formulação é esterilizada por técnicas habitualmente utilizadas. 22

Os processos e utilizações da presente invenção destinam-se a produzir a proteína de ligação à interleuquina-18 (IL-18BP). A IL-18BP pode ser nativa, isto é, IL-18BP de ocorrência natural. Preferivelmente, a IL- 18BP a ser produzida é de origem humana. Uma vez que a IL-18BP é uma proteína solúvel e segregada, é libertada para o sobrenadante da cultura de células, através do seu péptido de sinal natural ou através de um péptido de sinal heterólogo, isto é, um péptido de sinal derivado de outra proteína segregada que pode ser mais eficiente no sistema de expressão particular utilizado. 0 termo "proteína de ligação à IL-18" é aqui utilizado como sinónimo de "IL-18BP". Este termo refere-se a proteínas de ligação à IL-18 como as definidas em WO 99/09063 ou em Novick et al., 1999. O termo IL-18BP inclui variantes de processamento e/ou isoformas de proteínas de ligação à IL-18, como as definidas em Kim et al., 2000, em particular as isoformas humanas a e c da IL-18BP. O termo "IL-18BP", tal como é aqui utilizado, também inclui muteínas, derivados funcionais, fracções activas, proteínas fundidas, proteínas permutadas de forma circular e tiras da IL-18BP como definido em WO 99/09063. A IL-18BP que é produzida utilizando o meio da presente invenção é preferivelmente glicosilada.

Tal como é aqui utilizado, o termo "muteínas" refere-se a análogos de uma IL-18BP, ou análogos de uma IL-18BP virai, em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos de uma IL-18BP natural ou IL-18BP virai estão substituídos por diferentes resíduos de aminoácidos, ou estão deletados, ou um ou mais resíduos de aminoácidos são adicionados à sequência natural de uma IL-18BP, ou de uma IL-18BP virai, sem alterar consideravelmente a actividade dos produtos 23 resultantes em comparação com a IL-18BP de tipo selvagem ou IL-18BP virai. Estas muteínas são preparadas por sínteses conhecidas e/ou por técnicas de mutagénese dirigida a sítios, ou por qualquer outra técnica adequada para esse fim.

Muteínas de acordo com a presente invenção incluem proteínas codificadas por um ácido nucleico, como DNA ou RN A, que hibridiza para DNA ou RNA, que codifica uma IL-18BP ou codifica uma IL-18BP virai (WO 99/09063) em condições restritas. O termo "condições restritas" refere-se a condições de hibridização e lavagem subsequente que os habitualmente experimentados na área designam habitualmente de "restritas". Ver Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", supra, Interscience, N.I., §§6.3 e 6.4 (1987, 1992). Sem limitação, exemplos de condições restritas incluem condições de lavagem a 12-20°C abaixo da T.f. calculada do híbrido em estudo, por exemplo, em 2 x SSC e SDS 0,5% durante 5 minutos, 2 x SSC e SDS 0,1% durante 15 minutos; 0,1 x SSC e SDS 0,5% a 37°C durante 30-60 minutos e depois um 0,1 x SSC e SDS 0,5% a 68°C durante 30-60 minutos. Os habitualmente experimentados nesta área entendem que condições de restrição também dependem do comprimento das sequências de DNA, sondas oligonucleotídicas (como 10-40 bases) ou sondas oligonucleotídicas misturadas. Se forem utilizadas sondas misturadas, é preferível utilizar cloreto de tetrametilamónio (TMAC) em vez de SSC. Ver Ausubel, supra.

Identidade reflecte uma relação entre duas ou mais sequências polipeptídicas ou duas ou mais sequências polinucleotídicas, que é determinada por comparação das sequências. Em geral, identidade refere-se a uma correspondência exacta nucleótido-nucleótido ou aminoácido-aminoácido das duas sequências polinucleotídicas ou 24 polipeptídicas, respectivamente, em todo o comprimento das sequências a serem comparadas.

Para sequências que não têm uma correspondência exacta pode determinar-se uma "% de identidade". Em geral, as duas sequências a serem comparadas são alinhadas para se obter uma correlação máxima entre as sequências. Este procedimento pode incluir inserir "hiatos" numa ou em ambas as sequências, para aumentar o grau do alinhamento. Pode determinar-se uma % de identidade em todo o comprimento de cada uma das sequências a serem comparadas (denominado alinhamento global), que é particularmente adequado para sequências do mesmo comprimento ou de comprimento muito semelhante, ou em comprimentos menores e definidos (denominado alinhamento local), que é mais adequado para sequências de comprimento desigual. Métodos de comparação da identidade e homologia de duas ou mais sequências são bem conhecidos na área. Assim, por exemplo, podem utilizar-se programas disponibilizados no Pacote de Análise de Sequências de Wisconsin, versão 9.1 (Devereux, J., et al., 1984), por exemplo, os programas BESTFIT e GAP, para determinar a % de identidade entre dois polinucleótidos e a % de identidade e % de homologia entre duas sequências polipeptídicas. 0 programa BESTFIT utiliza o algoritmo de "homologia local" de Smith e Waterman (1981) e encontra a melhor região única de semelhança entre duas sequências. Outros programas para determinar a identidade e/ou semelhança entre sequências também são conhecidos na área, por exemplo, a família de programas BLAST (Altschul, S. F., et al., 1990, Altschul, S. F., et al., 1997, acessíveis pela página de entrada do NCBI em www.ncbi.nlm.nih.gov) e FASTA (Pearson, W. R., 1990).

Preferivelmente, qualquer uma dessas muteínas tem uma sequência de aminoácidos que duplica de modo suficiente a 25 sequência de uma IL-18BP, ou que duplica de modo suficiente a sequência de uma IL-18BP virai, de modo a ter actividade substancialmente semelhante à da IL-18BP. Uma actividade da IL-18BP é a sua capacidade para se ligar à IL-18. Desde que a muteina tenha actividade de ligação substancial à IL-18, pode considerar-se que tem actividade substancialmente semelhante à da IL-18BP. Assim, pode determinar-se se uma dada muteina tem substancialmente a mesma actividade da IL-18BP por experimentação de rotina, que compreende sujeitar essa muteina, por exemplo, a um simples ensaio de competição em sanduíche para determinar se se liga, ou não, a uma IL-18 apropriadamente etiquetada, como radioimunoensaio ou ensaio ELISA.

Numa especificação preferida, qualquer uma dessas muteínas tem pelo menos 40% de identidade ou homologia com a sequência de uma IL-18BP ou um homólogo da IL-18BP codificado de forma virai, como definido em WO 99/09063. Mais preferivelmente, tem pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou, muito preferivelmente, pelo menos 90% ou 95% de identidade ou homologia com aquela.

Alterações preferidas de muteínas de acordo com a presente invenção são as conhecidas como substituições "conservativas". Substituições conservativas de aminoácidos de polipéptidos ou proteínas IL-18BP ou de IL-18BPS virais podem incluir aminoácidos sinónimos num grupo com propriedades físico-químicas suficientemente semelhantes para que substituições entre membros do grupo conservem a função biológica da molécula (Grantham, 1974) . É claro que também podem ser feitas inserções e deleções de aminoácidos nas sequências definidas acima sem alterar a sua função, particularmente se as inserções ou deleções envolverem apenas alguns aminoácidos, por exemplo, menos de trinta e 26 preferivelmente menos de dez, e não removerem nem deslocarem aminoácidos que são críticos para uma conformação funcional, por exemplo, resíduos cisteína. Proteínas e muteínas produzidas por essas deleções e/ou inserções pertencem ao âmbito da presente invenção. 0 termo "proteína fundida" refere-se a um polipéptido que compreende uma IL-18BP, ou uma IL-18BP virai, ou respectiva muteína ou fragmento, fundido a outra proteína, que, por exemplo, tem um tempo de permanência prolongado em fluidos corporais. Assim, uma IL-18BP ou uma IL-18BP virai pode ser fundida a outra proteína, polipéptido ou afins, por exemplo, uma imunoglobulina ou respectivo fragmento.

Como "fracções activas" de uma IL-18BP, ou de uma IL-18BP virai, muteínas e proteínas fundidas, a presente invenção abrange qualquer fragmento ou precursores da cadeia polipeptídica da molécula proteica isoladamente ou em conjunto com moléculas associadas ou resíduos ligados àquele, por exemplo, resíduos de açúcar ou fosfato, ou agregados da molécula proteica ou os próprios resíduos açúcar, desde que essa fracção tenha actividade substancialmente semelhante à da IL-18BP.

As sequências da IL-18BP e suas variantes de processamento/isoformas podem ser encontradas em WO 99/09063 ou em Novick et ai., 1999, bem como em Kim et al., 2000.

Se a IL-18BP da invenção for utilizada como composição farmacêutica, essa composição farmacêutica pode ser utilizada para o tratamento e/ou prevenção de algumas doenças ou perturbações. Essas doenças ou perturbações são preferivelmente perturbações mediadas pela IL-18. Em particular, a IL-18BP purificada pode ser utilizada para o tratamento e/ou prevenção de psoríase, artrite psoriática, Doença de Crohn, artrite reumatóide, lesão do fígado, como 27 cirrose alcoólica do fígado, sepsia, aterosclerose, doenças cardíacas isquémicas, alergias, em particular hipersensibilidade do tipo retardado, e traumatismo craniano fechado, como revelado em WO9909063, WO0107480, WO0162285, W00185201, W002060479, WO02096456, W003080104, W002092008, W002101049, W003013577.

Tendo agora descrito completamente esta invenção, os experimentados na área apreciarão que a mesma pode ser implementada numa gama ampla de parâmetros, concentrações e condições equivalentes sem abandonar o espírito e âmbito da invenção e sem experimentação desnecessária.

Se bem que esta invenção tenha sido descrita relativamente a formas de realização específicas, entender-se-á que pode ser sujeita a outras modificações. Pretende-se que esta candidatura abranja quaisquer variações, utilizações ou adaptações da invenção seguindo, em geral, os princípios da invenção, e incluindo esses afastamentos da presente revelação como é prática conhecida ou habitual na área à qual pertence a invenção e tal como podem ser aplicados às características essenciais aqui apresentadas anteriormente, como se segue no âmbito das reivindicações em apêndice. EXEMPLO 1: Crescimento de células CHO que expressam a IL-18BP em meio sem soro 1.1. Preparação de meio sem soro (SFM) designado "SM- 005" O meio de cultura de células utilizado para as experiências de 1.2. consistiu num meio adaptado para conter os componentes seguintes nas concentrações seguintes: - Asparagina numa concentração de 830 mg/1; 28 - Cloreto de Sódio numa concentração de 3500 mg/1; - Selenito numa concentração de 0,0110 mg/1; - Hidrolisado de trigo numa concentração de 10000 mg/1, e - Insulina numa concentração de 4 mg/1.

Este meio também continha 4,5 g/1 de glucose. Se o meio for utilizado para o modo de produção, a concentração de glucose pode ser diminuída para 1 g/1. O meio também continha todos os aminoácidos exceptuando Glutamina. Também estavam presentes neste meio vitaminas, sais, ácidos gordos, tampão HEPES, Pluronic F68, Hidrocortisona, Piruvato de Na e Hidrolisado de Soja. O meio é identificado abaixo como SM-005. 1.2. Crescimento de células em suspensão

Inocularam-se balões T ou garrafas rotativas com células de um clone CHO que expressa e segrega a IL-18BP que tinha sido previamente estabelecido. Estas células cresceram em suspensão e foram primeiramente expandidas. Durante o processo de expansão das células, as células foram cultivadas em suspensão e foram sistematicamente diluídas com volumes definidos de meio SM-005 fresco em dias fixados. Para fins de monitorização, mediram-se a densidade celular e concentração de glucose e lactato em cada passo de diluição (ver figuras) .

No dia 0 descongelou-se um frasco do Banco de Células Primárias previamente estabelecido. Em seguida, as células originárias deste frasco foram inoculadas num Balão de Cultura de Tecidos de 75 cm2 (TCF 75 cm2) num volume total de 30 ml de meio SM-005 fresco. A concentração resultante de células no TCF atingiu aproximadamente 0,20 milhões de células/ml. Por fim, o TCF foi incubado com agitação a uma temperatura de 37°C. 29

No dia 4 transferiu-se a cultura para um TCF 175 cm2 e diluiu-se o sistema para 120 ml por adição de meio SM-005 fresco e pré-aquecido.

No dia 8 transferiu-se a cultura para uma RB 850 cm2 e diluiu-se o sistema para 400 ml por adição de meio SM-005 fresco e pré-aquecido.

No dia 12 diluiu-se a cultura para 1200 ml (razão de diluição 1/3) por adição de meio SM-005 fresco e pré-aquecido, que depois foi separada em 3 garrafas rotativas RB 850 cm2, cada uma contendo 400 ml.

No dia 16 diluiu-se a cultura para 4800 ml (razão de diluição 1/4) por adição de meio fresco e pré-aquecido, que depois foi separada em 6 RB 1750 cm2, cada uma contendo 800 ml. A partir do dia 20 (D20, D23, D26... até D62) , as RB 1750 cm2 foram diluidas de modo repetitivo de 3 em 3 dias, respeitando uma razão de diluição de 1/4. Em cada dia de diluição gerou-se o número necessário de RB 1750 cm2 (pelo menos 4 RB 1750 cm2) . Assim, cada RB 1750 cm2 foi diluída de 800 ml para 3200 ml por adição de meio fresco e pré-aquecido e depois foi separada em 4 RB 1750 cm2, cada uma contendo 800 ml.

Para inocular biorreactores, o número necessário de garrafas rotativas foi recolhido num dia de diluição (entre D20 e D60), reunido numa garrafa de vidro esterilizada e transferido para biorreactores. 30

Tabela 1: Descrição esquemática do processo de preparação da inoculação. A partir do dia 20, as células foram diluídas com uma razão de diluição fixa de 1/4.

Dia Operação Volume 0 Descongelação Frasco de MCB -> TCF 75 cm2 30 ml 4 Diluição com meio fresco TCF 75 cm2 -> TCF 150 cm2 120 ml 8 Diluição com meio fresco TCF 150 cm2 -> RB 850 cm2 400 ml 12 Diluição com meio fresco 1 x RB 850 cm2 -> 3 x RB 850 cm2 1200 ml 16 Diluição com meio fresco 3 x RB 850 cm2 -> 6 x RB 1750 cm2 4800 ml A partir de D20, de 3 em 3 dias Diluição com meio fresco Diluições repetitivas com uma razão de separação 1/4 em RB 1750 cm2; 800 ml por RB 1750 cm2 Dia da diluição D20 < D < D62 Recolha da inoculação de células para semear o biorreactor

As Figuras 1 até 4 mostram os dados medidos durante o processo de preparação da inoculação (n=10). A Fig. 1 mostra a densidade de células viáveis, a Fig. 2 as células viáveis cumuladas, a Fig. 3 o tempo de duplicação e a Fig. 4 a concentração no sobrenadante de glucose e lactato.

Após uma fase de adaptação de 20 dias, o crescimento das células é muito consistente e reprodutível no meio sem soro. As condições estáveis de crescimento permitem sub-cultivar células facilmente por diluição repetida com uma razão de 1:4 durante um período de tempo prolongado (testado até ao dia 62, como mostrado nas Figs. 1, 2, 3, 4) . 31

REFERÊNCIAS 1. Altschul, S. F., et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410, 1990. 2. Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular

Biology", supra, Interscience, N.I., §§6.3 e 6.4 (1987, 1992). 3. Altschul S. F. et al., Nucleic Acids Res., 25:389-3402, 1997. 4. Bohak et al. 1987 Bohak Z, Kadouri A et al., (1987) "Novel anchorage matrices for suspension culture of mammalian cells" Biopolymers. 26 Suplemento: S205-213. 5. Devereux J et al., Nucleic Acids Res, 12, 387-395, 1984. 6. Grantham et al., Science, Volume 185, páginas 862-864 (1974). 7. Kim SH, Eisenstein M, Reznikov L, Fantuzzi G, Novick D, Rubinstein M, Dinarello CA. "Structural requirements of six naturally occurring isoforms of the IL-18 binding protein to inhibit IL-18". Proc Natl Acad Sei USA 2000/97:1190-1195. 8. Novick, D, Kim, S-H, Fantuzzi, G, Reznikov, L, Dinarello, C, e Rubinstein, M (1999). Immunity 10, 127-136. 9. Pearson, Methods Enzymol. 1990;183:63-98. 10. Petti SA, Lages AC et al. (1994) "Three-dimensional mammalian cell growth on nonwoven polyester fabric disks" Biotechnol Prog. 10(5):548-550. 11. Puck et al., J.Exp.Med. 108, 945, 1958

Lisboa, 12 de Outubro de 2007

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a cultura de células que produzem IL-18BP, que compreende o passo das células crescerem num meio de cultura de células sem componentes derivados de soro animal, em que o meio de cultura de células compreende: Asparagina numa concentração que varia desde cerca de 800 até cerca de 900 mg/1; Cloreto de Sódio numa concentração que varia desde cerca de 3000 até cerca de 4500 mg/1; Selenito numa concentração que varia desde cerca de 0,005 até cerca de 0,015 mg/1; Hidrolisado de trigo numa concentração que varia desde cerca de 5000 até cerca de 15000 mg/1, e Insulina numa concentração que varia desde cerca de 2.5 até cerca de 6 mg/1.

2. Processo para a produção de IL-18BP, que compreende o passo de cultivar uma célula que expressa a IL-18BP num meio de cultura de células sem componentes derivados de soro animal, em que o meio de cultura de células compreende: Asparagina numa concentração que varia desde cerca de 800 até cerca de 900 mg/1; Cloreto de Sódio numa concentração que varia desde cerca de 3000 até cerca de 4500 mg/1; Selenito numa concentração que varia desde cerca de 0,005 até cerca de 0,015 mg/1; Hidrolisado de trigo numa concentração que varia desde cerca de 5000 até cerca de 15000 mg/1, e Insulina numa concentração que varia desde cerca de 2.5 até cerca de 6 mg/1. 2

3. Processo de acordo com a Reivindicação 1 ou 2, que compreende suplementarmente o passo de recolher o meio que compreende a proteina de interesse.

4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, que compreende suplementarmente o isolamento da proteina de interesse.

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, que compreende suplementarmente formular a proteina isolada com um transportador farmaceuticamente aceitável para obter uma composição farmacêutica.

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que as células são células de Ovário de Hamster Chinês (CHO).

7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o meio compreende suplementarmente glucose numa concentração que varia desde cerca de 500 até cerca de 5500 mg/1.

8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o meio compreende suplementarmente aminoácidos seleccionados de entre Alanina, Arginina, Ácido Aspártico, Cisteina, Ácido Glutâmico, Glicina, Histidina, Isoleucina, Leucina, Lisina, Metionina, Fenilalanina, Prolina, Serina, Triptofano, Tirosina, Treonina e Valina, mas não Glutamina.

9. Processo de acordo com a Reivindicação 8, em que o meio compreende suplementarmente Glutamina. 3

10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o meio compreende suplementarmente vitaminas seleccionadas de entre Biotina, Pantotenato, Cloreto de colina, Ácido Fólico, Mio-Inositol, Niacinamida, Piridoxina, Riboflavina, Vitamina B12, Tiamina e Putrescina.

11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o meio compreende suplementarmente sais seleccionados de entre CaCl2, KC1, MgCÍ2, Fosfato de Sódio, CuCl2 e ZnCl2.

12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o meio compreende suplementarmente um tampão.

13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o meio compreende suplementarmente ácidos gordos seleccionados de entre Ácido Araquidónico, Ácido Linoleico, Ácido Oleico, Ácido Láurico, Ácido Miristico.

14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o meio compreende suplementarmente Ciclodextrina.

15. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o meio compreende suplementarmente um hidrolisado de soja.

16. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o meio compreende suplementarmente hidrocortisona. 4

17. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o meio compreende suplementarmente um agente protector, em particular Pluronic F68.

18. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que o meio compreende suplementarmente piruvato.

19. Utilização de um meio de cultura de células que compreende: Asparagina numa concentração que varia desde cerca de 800 até cerca de 900 mg/l; Cloreto de Sódio numa concentração que varia desde cerca de 3000 até cerca de 4500 mg/l; Selenito numa concentração que varia desde cerca de 0,005 até cerca de 0,015 mg/l; Hidrolisado de trigo numa concentração que varia desde cerca de 5000 até cerca de 15000 mg/l, e Insulina numa concentração que varia desde cerca de 2,5 até cerca de 6 mg/l, para o crescimento de células que expressam a IL-18BP em cultura.

20. Utilização de um meio de cultura de células que compreende: Asparagina numa concentração que varia desde cerca de 800 até cerca de 900 mg/l; Cloreto de Sódio numa concentração que varia desde cerca de 3000 até cerca de 4500 mg/l; Selenito numa concentração que varia desde cerca de 0,005 até cerca de 0,015 mg/l; Hidrolisado de trigo numa concentração que varia desde cerca de 5000 até cerca de 15000 mg/l, e 5 Insulina numa concentração que varia desde cerca de 2.5 até cerca de 6 mg/1, para a produção de IL-18BP em células que expressam a IL-18BP.

21. Utilização de um meio de cultura de células que compreende: Asparagina numa concentração que varia desde cerca de 800 até cerca de 900 mg/1; Cloreto de Sódio numa concentração que varia desde cerca de 3000 até cerca de 4500 mg/1; Selenito numa concentração que varia desde cerca de 0,005 até cerca de 0,015 mg/1; Hidrolisado de trigo numa concentração que varia desde cerca de 5000 até cerca de 15000 mg/1, e Insulina numa concentração que varia desde cerca de 2.5 até cerca de 6 mg/1, para a manutenção de células que expressam a IL-18BP em cultura. Lisboa, 12 de Outubro de 2007