PT1615638E - Utilização de derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole na terapia anti-cancro - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"UTILIZAÇÃO DE DERIVADOS DE 7-NITRO-2,1,3-BENZOXADIAZOLE NA TERAPIA ΑΝΤΙ-CANCRO" A presente invenção diz respeito à utilização de derivados de 7-nitro-2,1,3 benzoxadiazole para a terapia anti-cancro. Mais especificamente, a invenção relaciona-se com a utilização de derivados do composto heterociclico conhecido como 7-nitrobenzofurazano ou 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole, enquanto agentes que possuem uma forte actividade inibidora face à vasta família de glutationa S-transferases (GST) com uma elevada expressão nas células cancerosas, e que as tornam particularmente resistentes a muitos factores de stress. Assim, estes compostos são úteis na produção de medicamentos para terapias anti-cancro e podem ser utilizados quer separadamente, quer em combinação com outros agentes quimioterapêuticos.

Conforme é sabido, a maioria dos fármacos anti-cancro utilizados no tratamento oncológico durante o século XX consiste em moléculas que não são selectivas em relação às células cancerosas e são portanto altamente tóxicas para o organismo. Os fármacos anti-cancro típicos incluem como elementos amplamente difundidos os agentes alquilantes, os quais podem modificar de forma não selectiva o DNA e RNA, e os antimetabolitos que, ao copiar as bases do DNA e de 2 ΡΕ1615638 outras moléculas naturais, interferem com a síntese de ácidos nucleicos e de proteínas e com outros processos metabólicos vitais, actuando como antagonistas e inibi-dores. A investigação no domínio oncológico desde sempre tentou chegar a fármacos que, de uma forma tão selectiva quanto possível, fossem capazes de inibir o crescimento das células cancerosas sem interferir com as células normais. Por essa razão, a investigação oncológica focalizou-se, por exemplo, nas moléculas que inibem as enzimas chave para a sobrevivência de células transformadas.

Estas moléculas incluem os inibidores da telo-merase, uma enzima cuja actividade permite que as células cancerosas continuem a dividir-se durante um período de tempo prolongado quando em comparação com o período de sobrevivência das células normais, tornando-as assim "imortais". Outras enzimas importantes e alvo de estudo são a tirosina-cinase, envolvida no início do cancro e de outras doenças proliferativas tais como a psoríase e a arteriosclerose. Uma outra linha de investigação importante centra-se no desenvolvimento de inibidores específicos da farnesil transferase, uma enzima essencial para desencadear a proteína p21, que está envolvida na proliferação celular e na transformação neoplásica.

Uma outra enzima importante na transdução do sinal é a proteína-cinase C (PKC) , que está directamente 3 ΡΕ1615638 implicada nos processos de proliferação e de diferenciação, bem como na regulação do fenótipo de multiresistência medicamentosa (MDR). São conhecidos vários inibidores naturais da PKC, os quais servem de base para o desenvolvimento de novos medicamentos.

Uma outra classe de enzimas chave diz respeito às enzimas que regulam o ciclo celular, particularmente as cinases dependentes da ciclina (CDK), cujos inibidores provocam um bloqueio do ciclo celular em muitas linhas de células cancerosas e podem, por conseguinte, ser utilizadas como citostáticos e como citotóxicos.

Uma enzima que tem vindo a despertar bastante interesse ao longo dos últimos anos na área da oncologia é a glutationa S-transferase (GST, EC 2.5. 1.18). Trata-se na verdade de uma família de isoenzimas de origem natural e largamente propagadas, que catalisam o ataque nucleofílico do átomo de enxofre da glutationa (GSH) em grupos electrofílicos de moléculas de substrato. Sabe-se que a glutationa é um tripéptido composto por ácido glutâmico, cisteína e glicina, sendo o composto de baixo peso molecular mais importante que pode ser encontrado em células de animais ou plantas contendo o grupo tiol. As glutationa S-transferases catalisam a conjugação da glutationa com muitos tipos diferentes de xenobióticos, reduzindo assim drasticamente a sua reactividade e tornando estes compostos mais hidrossolúveis de forma a favorecer a sua eliminação. 4 ΡΕ1615638

Na base deste mecanismo, a actividade da GST foi considerada como sendo um dos factores responsáveis pelo fenómeno de resistência farmacológica observado em células cancerosas, visto que muitos medicamentos anti-cancro são reconhecidos como substratos por estas enzimas (Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 25, (1990), 47-70; Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 30, (1995), 445-600; Câncer Cells Mon. Rev. 2, (1990), 15-22; Câncer Res. 54, 4313-4320; Eur. J. Câncer 32A, (1996), 967-978). A GST tem uma expressão elevada em muitas formas de cancro nos humanos e desempenha um papel fundamental na desintoxicação de vários medicamentos anti-cancro ou dos seus metabolitos utilizados no tratamento oncológico. A enzima realiza a conjugação da glutationa dos medicamentos anti-cancro tais como as mostardas de azoto, clorambucil, ciclofosfamida, mitoxantrona e antraquinona, e poderia retirar a toxicidade de outros medicamentos ao não actuar directamente nas moléculas mas sim num seu metabolito.

As GSTs constituem uma familia multigénica de isoenzimas que foram subdivididas, de acordo com a sua imunogenicidade e estrutura primária, em pelo menos dez classes, incluindo as classes Alfa, Pi e Mu. A classe enzimática hiperexpressa em grandes quantidades nos cancros é a Pi (GST-Pi), tal como observado em vários tecidos humanos cancerosos e pré-cancerosos (Mol. Pharmacol. 50, (1996), 149-159). Este aumento da expressão enzimática verificou-se tanto em linhas de células resistentes a 5 ΡΕ1615638 agentes alquilantes (Câncer Res. 49, (1989), 6185-6192/ Br. J. Câncer, 74, (1996),S93-S98), como em linhas de células cancerosas resistentes à doxorubicina e à cisplatina (Câncer Res. 49, (1989), 7020-7025; Câncer 78, 1996, 416-421; J. Biol. Chem. 261, (1986), 15544-15549), e sugeriu ainda a utilização da enzima GST de classe Pi como um marcador tumoral para fins de diagnóstico precoce.

Além disso, muitos estudos revelaram claramente que a hiperexpressão da GST em tumores faz com que os medicamentos anti-cancro sejam resistentes não só através da conjugação com a glutationa, mas também através de outros mecanismos que não foram ainda totalmente clarificados. Foi recentemente constatada a existência de uma correlação entre a quantidade de GST de classe Pi transferida no núcleo de células cancerosas e a resistência adquirida por estas mesmas células a medicamentos tais como a doxorubicina e a cisplatina, tendo sido avançada a hipótese de que a GST Pi presente no núcleo protegerá o DNA dos danos causados pela quimioterapia (Faseb J. 15, (2001), 2702-2714).

Foi já largamente demonstrado que as GSTs actuam também no processo de morte celular programada (apoptose). Em condições de stress celular, tais como após o tratamento com radiação UV ou agentes de oxidação, a proteina cinase c-Jun N-terminal (JNK) é activada, a qual está envolvida na resposta celular de mamíferos ao stress, regulando o ciclo celular, reparando o DNA ou induzindo a apoptose. 6 ΡΕ1615638

Recentemente, foi purificado um inibidor proteico da JNK, identificado como GST Pi (J.Biol. Chem. 216 , (2001), 20999- 21003). Esta proteína liga-se, através da região que compreende os resíduos 194-201 , à parte C-terminal da proteína cinase JNK, e sabe-se hoje que os factores que provocam o stress celular envolvem a dissociação do complexo GST Pi/JNK e, assim, a activação da cinase. A par com estes resultados, foi também constatado que inibidores específicos da GST Pi, tais como os peptidomiméticos da glutationa TER-117 [Terrapin 117: γ-L-glutamil-S-(benzil)-L-cisteinil-R-(-)-fenilglicina] e TER-293, desencadeiam a proteína cinase JNK ao favorecerem a dissociação da GST Pi do complexo GST Pi/JNK (EMBO J. 18, 1999, 1321-1334; J. Biol. Chem. 276, (2001), 20999-21003).

Verificou-se igualmente que a GSTM1-1, uma glutationa S-transferase pertencente à classe Mu, se liga à parte N-terminal de uma outra cinase que regula o sinal apoptótico, designada por ASK1 (cinase reguladora do sinal de apoptose), inibindo a sua actividade. Foi demonstrado que um choque térmico, ao provocar a dissociação do complexo GSTM1-1/ASK1, faz disparar a ASK1. Esta cinase está, por sua vez, envolvida numa série de reacções de activação de outras proteínas e fosforilatos JNK e cinase p38, os quais são mediadores conhecidos da resposta celular aos factores de stress (J. Biol. Chem. 276, 2001, 12749-12755; J. Biol. Chem. 277, (2002), 30792-30797). 7 ΡΕ1615638

Em conclusão, uma das principais funções da GST parece ser a da regulação descendente da cascata de sinais ligados à JNK por meio de múltiplos mecanismos: a enzima GST Mu actua ao nível da cinase ASK1 e portanto indirectamente na JNK, enquanto que a enzima GST Pi actua directamente na JNK.

As observações supracitadas mostram que a hiperexpressão de GST em células cancerosas representa um mecanismo de protecção contra factores de stress de tipo endógeno e também aqueles que são causados pelos medicamentos anti-cancro. Assim sendo, as células cancerosas podem ganhar uma resistência a esses medicamentos e deixar de responder aos estímulos apoptóticos.

Atendendo ao que precede, a procura de inibidores da GST eficazes tornou-se num dos principais objectivos, de forma a modular a resistência celular aos medicamentos anti-cancro.

Um dos primeiros inibidores de GSTs a ser utilizado foi o ácido etacrínico, um princípio activo há muito empregue como diurético (tendo sido recentemente substituído pela furosemida para este fim) , e que sensibiliza as células cancerosas ao efeito citotóxico dos agentes alquilantes. Embora reconhecido como sendo um substrato de algumas isoenzimas de GST, o ácido etacrínico actua igualmente como um inibidor destas enzimas. Neste contexto, foram obtidos resultados consideráveis ao ΡΕ1615638 utilizar o ácido etacrinico para diminuir a resistência das células cancerosas ao melfalan, carmustina, mitomicina C, doxorubicina e, em menor grau, ao clorambucil em doentes portadores de leucemia linfoblástica crónica (Advanced Drug Delivery Reviews 26, (1997), 91-104). A ausência de especificidade no que respeita às isoformas de GST hiperexpressas em células malignas, bem como um determinado número de efeitos secundários significativos, tais como uma diurese acentuada, desencorajaram o uso de ácido etacrinico na prática clinica, pelo que alguns inibidores selectivos em relação a classes enzi-máticas específicas de GST foram depois introduzidos como uma alternativa (Advanced Drug Delivery Reviews, loc. cit.) .

Estes são os peptidomiméticos da glutationa acima referidos, incluindo, por exemplo, TER 199 [éster dietilico de γ-glutamil-S-(benzil)-cisteinil-R(-)-fenilglicina] que penetra rapidamente nas células e, sendo um pró-medicamento, é activado pelas esterases intracelulares. Na forma activa, o TER-117 acima referido inibe selectivamente as GSTs de classe Pi, potenciando o efeito das mostardas de azoto e em geral dos agentes alquilantes em várias linhas de células cancerosas, tais como as do cólon HT29 e as do carcinoma do ovário SKOV-3, que apresentam uma hiper-expressão da isoenzima GST Pi (Câncer Chemother. Pharmacol. 37, (1996), 363-370) . 9 ΡΕ1615638

Em ambos os casos do ácido etacrinico e do TER 199, a acção pretendida consiste no aumento do efeito de outros agentes citotóxicos (agentes alquilantes) em células cancerosas resistentes. Uma classe diferente de agentes citotóxicos baseada em substâncias análogas à glutationa (Advanced Drug Delivery Reviews, anteriormente citado) consiste em moléculas que não inibem a GST mas exploram o seu poder catalítico de modo a ser activada. Estes pró-medicamentos diferem quanto à sua selectividade relativa a várias isoenzimas e quanto aos diversos agentes activados que deles derivam. Um exemplo é o TER 286, cuja estrutura tem a capacidade de ligação à GST de uma substância peptidomimética-GSH e a citotoxicidade de uma mostarda de azoto alquilante. Quando activada por isoenzimas das classes Pi e Alfa, a citotoxina latente TER 286 liberta um análogo da ciclofosfamida com a actividade citotóxica inerente. A presente invenção relaciona-se, portanto, com a esfera de investigação sobre novos inibidores selectivos para as classes enzimáticas da glutationa S-transferase hiperexpressa nas células cancerosas, de modo a proporcionar derivados que sejam activos enquanto agentes anti-cancro, quer no que respeita ao seu poder citotóxico intrínseco, quer à sua capacidade para inibir a actividade de desintoxicação das GSTs relativamente a outros agentes quimioterapêuticos.

Tal como mencionado anteriormente, algumas cias- 10 ΡΕ1615638 ses de GST encontram-se hiperexpressas em muitas células cancerosas, tanto que algumas isoformas, tais como a GSTP1-1, pertencente à classe GST Pi, podem ser utilizadas como marcadores tumorais. Esta hiperexpressão enzimática, documentada em relação à maioria dos cancros, torna as células cancerosas resistentes aos medicamentos não apenas no que toca à actividade desintoxicante catalisada por essas enzimas, mas também pela actividade apoptótica que revelam possuir, interferindo nos mecanismos de transdução de sinal que regulam a apoptose.

Nos estudos que conduziram à presente invenção, constatou-se que alguns derivados específicos do 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole revelam - em várias linhas de células cancerosas - uma actividade inibidora selectiva considerável em relação às isoformas da GST em análise, bem como um elevado poder citotóxico. Estas moléculas ligam-se selectivamente ao ponto hidrofóbico das GSTs (onde está ligado o co-substrato que tem que ser conjugado com a glu-tationa) e inibem fortemente a actividade destas iso-enzimas.

Os derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole que foram considerados de acordo com a presente invenção podem ser facilmente preparados a partir do 4-cloro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole, uma molécula fluorogénica bem conhecida no dominio da bioquímica, utilizado para marcar compostos amina e tiol (FEBS Lett. 6, (1970), 346-348/

Eur.J. Biochem. 54, (1975), 117-126; Eur. J. Biochem. 54 ΡΕ1615638 (1975), 127-133). 0 4-cloro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole é bem reconhecido como um co-substrato pela GST de classe Alfa, mas é igualmente utilizado como um substrato pelas GSTs Pi e Mu, gerando o produto 4-glutationil-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole (Anal. Biochem. 218, (1994), 463-465; J.Biol. Chem. 271,(1996), 16193-16198). Esta molécula é uma boa inibidora da GST, mas penetra nas células com dificuldade e é rapidamente expelida pelas mesmas.

Os derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole (também designado por 4-nitrobenzofurazano) foram já alvo de atenção devido às suas possíveis aplicações clinicas enquanto fármacos anti-cancro. Os primeiros estudos sobre compostos desta familia remontam aos últimos anos da década de 60, com algumas publicações que realçam a sua potencial actividade citotóxica (J. Med. Chem. 11, (1968), 305-311). Estudos mais recentes revelam que alguns 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazóis são potentes inibidores da sintese de ácidos nucleicos e proteínas nalgumas linhas de células normais e cancerosas nos mamíferos (Chem. Biol. Interactions 42, (1982), 195-207), mas os resultados que de uma maneira geral foram obtidos com estes trabalhos mostram-se contraditórios, pelo que esta área da investigação parece não ter avançado mais.

Por outro lado, a presente invenção propõe a utilização, enquanto inibidores das GSTs e agentes anti-cancro, de derivados específicos do 4-cloro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole que não haviam sido referidos como possiveis agentes anti-cancro em estudos anteriores. 12 ΡΕ1615638

Os derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole que são objecto da presente invenção caracterizam-se pela presença de uma ponte de tioéter na posição 4, à qual está ligado um grupo alifático ou aromático com as carac-terísticas de um mau grupo separável. Este último contém também, preferencialmente, pelo menos um grupo -OH. Os referidos derivados possuem a capacidade de penetrar rapidamente nas células cancerosas, onde desempenham uma actividade citotóxica notável. Esta acção é provavelmente devida à inibição da actividade desintoxicante (tal como demonstrado pelo resultado experimental específico obtido in vitro com isoenzimas purificadas) e à actividade anti-apoptótica das GSTs, particularmente da isoforma GSTP1-1 que se encontra hiperexpressa em linhas celulares cancerosas. Assim, a utilização de derivados de acordo com a presente invenção permite fazer um tratamento destinado a inibir o crescimento de células cancerosas - os alvos principais destes compostos altamente selectivos - interferindo de forma menos eficaz com a fisiologia das células normais.

No que se refere à estrutura química dos compostos de acordo com a presente invenção, deverá salientar-se que a natureza dos grupos separáveis presentes no seu esqueleto tem como resultado reacções de permuta lentas ou nulas com tióis endógenos tais como a glutationa, assim como a formação de um σ-adutor estável com GSH, conforme mostrado na secção experimental mais adiante. As reacções 13 ΡΕ1615638 de permuta com tióis endógenos são um fenómeno documentado no caso de outros derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole estudados na anterior linha de investigação supracitada. No decorrer dos ensaios experimentais anteriormente mencionados, foram testados alguns dos derivados -0-, -NR- e -S-de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole e, em particular, entre os derivados -S-, foram testados compostos em que o grupo de ligação com enxofre na posição 4 é alternativamente um grupo fenilo, benzilo, acetilo ou ciano. Os resultados modestos e contraditórios descritos são provavelmente atribuíveis à presença - nestes compostos - de bons grupos separáveis tais como cloro, tiocianato, fenoxi-, feniltio-e benziltio-. Estes grupos favorecem as reacções de permuta com a glutationa, levando à formação de adutores com esta última. Estes adutores são preferencialmente expelidos pelas células através de glicoproteinas de membrana especificas pertencentes à familia de proteínas envolvidas no processo de resistência farmacológica a vários agentes (proteína de multiresistência medicamentosa, MRP) (Free Rad.Biol. Med. 27, (1999), 985-991).

Além disso, tal como referido anteriormente, alguns dos compostos descritos na literatura citada apresentam problemas consideráveis de solubilidade que comprometem a possibilidade de uma administração ín vivo. Por outro lado, nos derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole, de acordo com a presente invenção, a existência de pelo menos um grupo -OH contribui para proporcionar estes compostos com uma boa solubilidade em meio aquoso, ao mesmo 14 ΡΕ1615638 tempo que mantêm um grau de apolaridade de modo a permitir a interacção com o ponto de ligação hidrofóbico do substrato das GSTs, e para expressar a sua forte actividade de inibição enzimática.

Fora do dominio oncológico, são já conhecidas algumas aplicações dos derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole funcionalizados na posição 4 através de uma ponte de tioéter, por exemplo como reagentes fluorescentes no estudo do metabolismo de certos inibidores de tiol na conversão da angiotensina I para a angiotensina II (patentes U.S. N° 4395556 e N° 4469870), e geralmente como sondas fluorescentes para a marcação de ácidos nucleicos ou proteínas. São descritos outros derivados 4-S-de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole no pedido de patente dos Estados Unidos N° 2002/0189032 e no pedido de patente europeia EP-A-1261591, nos quais aqueles são propostos para utilização como corantes de fibras de queratina e, em particular, para aplicação capilar.

Por conseguinte, a presente invenção proporciona especificamente a utilização de derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole de fórmula geral (I),

15 ΡΕ1615638 em que:

Ri é seleccionado do grupo composto por alquilo linear, ramificado ou cíclico contendo até 12 átomos de carbono, alcenilo linear, ramificado ou cíclico contendo até 12 átomos de carbono, alcinilo linear, ramificado ou cíclico contendo até 12 átomos de carbono, sendo um átomo de hidrogénio de Ri opcionalmente substituído com um grupo escolhido de entre os grupos compostos por OR2, N02, NR2R3, em que R2 e R3 são independentemente escolhidos do grupo composto por H, alquilo, alcenilo ou alcinilo linear, ramificado ou cíclico contendo até 12 átomos de carbono, e em que o referido grupo S-Ri não é um bom grupo separável, para a preparação de um medicamento inibidor da GST destinado ao tratamento de formas de cancro. De acordo com a presente invenção, os inibidores selectivos da GST acima referidos podem ser empregues de forma vantajosa em terapias antineoplásicas, administrando-os separadamente como agentes citotóxicos ou em combinação com outros agentes quimioterapêuticos a fim de aumentar o seu efeito terapêutico, reduzindo o efeito de resistência farmacológica .

De acordo com alguns modos de realização, a presente invenção relaciona-se com a utilização de derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole de fórmula geral (I), em que Ri é um hidroxialquilo linear ou ramificado contendo até 12 átomos de carbono, e é preferencialmente escolhido entre 4-hidroxibutilo e 6-hidroxi-hexilo. 16 ΡΕ1615638

Os ingredientes activos preferidos para a utilização proposta de acordo com a presente invenção correspondem a um dos seguintes: 4-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-iltio)butanol 6-(7-nitro-2,1, 3-benzoxadiazol-4-iltio)hexanol.

De acordo com um outro aspecto, a presente invenção relaciona-se mais especificamente com a utilização de derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole de fórmula geral (I) para o tratamento de várias formas de cancro, e nomeadamente as formas que se caracterizam por uma hiper-expressão da GST. As isoformas enzimáticas acima mencionadas, que se encontram hiperexpressas em tumores sólidos, linfomas e leucemias, podem pertencer às classes GST Pi, GST Mu e GST Alfa da glutationa S-transferase, e podem mais especificamente ser as isoformas GSTP1-1, GSTM2-2 e GSTA1-1.

Um outro objecto especifico da presente invenção é uma composição farmacêutica para o tratamento do cancro incluindo - como um ingrediente activo- pelo menos um dos derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole de fórmula geral (I), em conjunto com um ou mais adjuvantes e/ou veículos farmaceuticamente aceitáveis.

As preparações farmacêuticas adequadas para a administração terapêutica de inibidores da GST, de acordo com a presente invenção, podem ser formuladas com base em 17 ΡΕ1615638 técnicas convencionais conhecidas dos especialistas nesta matéria, utilizando excipientes e veículos farmaceutica-mente aceitáveis de modo a obter preparações adequadas para injecção parentérica (injecção intravenosa, intramuscular ou subcutânea), para administração sob a forma sólida ou líquida, para administração transdérmica, rectal, intra-vaginal ou local, por exemplo, nas membranas mucosas do tracto oronasal e outras semelhantes. A percentagem de ingrediente activo na composição e o método de tratamento anti-cancro podem variar de modo a obter uma dosagem óptima. A dose a ser administrada tem em conta os seguintes factores: a via de administração, a duração do tratamento, o estado e o peso do paciente, a actividade do ingrediente activo e a resposta do paciente.

Uma vez determinada a dosagem conveniente do ingrediente activo, a formulação e a escolha de excipientes e adjuvantes adequados a cada necessidade poderão ser efectuadas com base no conhecimento comum nesta matéria.

Alguns resultados experimentais obtidos no âmbito da presente invenção, incluindo os dados relativos à actividade biológica e às características - enquanto inibidores da GST - de alguns derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole cuja síntese é também descrita, são abaixo apresentados como exemplos. Alguns dos referidos resultados experimentais são também mostrados nos gráficos dos desenhos que acompanham o presente documento, e em que: 18 ΡΕ1615638 A Figura 1 mostra um teste de "Scatchard plot" quanto à ligação do derivado de 7-nitro-benzofurazano referido como N° 2 no seguinte (6-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-iltio)hexanol) à GSTP1-1; no gráfico, v é o rácio entre a alteração de fluorescência observada para uma dada concentração do ligando e a alteração de fluorescência observada na concentração de saturação do ligando; L é a concentração do ligando livre; A Figura 2 mostra o espectro de 15 μΜ do derivado de 7-nitro-benzofurazano N°2 em 0,1 M de tampão de K-fosfato, pH 6.5 (Quadros A e B, linhas contínuas), e o espectro de 15 μΜ do derivado de 7-nitro-benzofurazano N° 2 ligado a quantidades estequiométricas de GSTP1-1, na presença de 1 mM GSH (Quadro A, linha tracejada) ou de 1 mM S-metilglutationa (Quadro B, linha tracejada); A Figura 3 mostra a actividade da caspase-3 nas linhas celulares CEM 1.3 e K562 após tratamento com derivado de 7-nitro-benzofurazano N° 2 () e nas células de controlo (·) ; a percentagem de apoptose nas linhas celulares CEM 1.3 e K562 após tratamento com o derivado de 7-nitro-benzofurazano N° 2 (□) e nas células de controlo (O) ; a actividade foi expressa como a alteração de fluorescência observada por minuto por número de células; a apoptose foi determinada por análise da fragmentação nuclear após a marcação das células com corante Hoechst 33342; 19 ΡΕ1615638 A Figura 4 mostra os resultados da análise de citometria de fluxo realizada nas linhas celulares K562 e CEM 1.3 tratadas respectivamente com 10 μΜ e 2 μΜ do derivado N° 2; após os tratamentos de 12 e 24 h, as células foram lavadas e marcadas quer com Anexina V-FITC quer com PI, o que permitiu a diferenciação das células intactas, das células apoptóticas precoces e tardias, ou das células necróticas; A Figura 5 (A, B e C) mostra as análises de "Western blot" de linhas celulares K562 e CEM 1.3 tratadas respectivamente com 10 μΜ e 2 μΜ do derivado N° 2; GSTPl-1, c-Jun, JNK e as isoformas JNK e c-Jun fosfo-activadas foram detectadas por anticorpos específicos; A β-actina foi utilizada como controlo de carga (Quadros A e C) ; a dissociação do complexo GST/JNK foi avaliada por análise de imunoprecipitação; os lisados foram imunoprecipitados utilizando um anticorpo anti-JNK policlonal e depois submetidos a análises de "Western blot"; A GST e a JNK foram detectadas por anticorpos específicos (Quadro B); e a Figura 6 mostra as variações de peso registadas em ratinhos num teste de toxicidade aguda in vivo comparando o efeito da administração parentérica de diferentes dosagens do composto de teste N° 2 da invenção, em comparação com os grupos de controlo que receberam soro fisiológico ou o veículo apenas. 20 ΡΕ1615638

No que diz respeito à síntese, tal como anteriormente, os derivados que constituem o objecto da presente invenção podem ser preparados a partir de um composto inicial facilmente disponível, 4-cloro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole (Sigma-Aldrich, Fine Chemicals), sem excluir métodos de síntese alternativos. EXEMPLO 1 4- (7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-iltio)butanol.

Fez-se reagir uma solução mista de 4-cloro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole (1 mmole) e de 4-mercapto-l-butanol (Sigma-Aldrich, Fine Chemicals) (2 mmoles) em 20 mL de etanol: 1:1 tampão de fosfato de potássio, a um pH 7.0 durante 6 horas numa béquer graduado, à temperatura de 25°C. O pH foi continuamente monitorizado visando mantê-lo neutro através da adição de pequenas quantidades de KOH. No final da reacção, o 4-mercapto-l-butanol em excesso foi feitoi reagir com 1,5 mmoles de 3-bromopiruvato. O produto da reacção, 4-(7-nitro-2,1,3-benzoxa-diazol-4-iltio)butanol, é um composto insolúvel amarelo escuro que é recolhido por filtração e lavado duas vezes com 15 mL de água destilada fria. O produto final mostra ser 98% puro através da análise de HPLC. 21 ΡΕ1615638 0 peso molecular do composto determinado por espectrometria de massa é de 269 Da. O espectro de UV visível na água é caracterizado por um pico de absorção máxima nos 431 nm (ε = 15 mM-1 cm-1) e o espectro de fluorescência na água apresenta um pico de emissão máxima nos 525 nm. EXEMPLO 2 6- (7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-iltio)hexanol.

Fez-se reagir uma solução mista de 4-cloro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole (1 mmole) e de 6-mercapto-l-hexanol (Sigma-Aldrich, Fine Chemicals) (2 mmoles) em 20 mL d etanol: 1:1 tampão de fosfato de potássio, a um pH de 7.0 durante 6 horas num béquer graduado, à temperatura de 25°C. O pH foi continuamente monitorizado visando mantê-lo neutro através da adição de pequenas quantidades de KOH. No final da reacção, o 6-mercapto-l-hexanol foi colocado a reagir com 1,5 mmoles de 3-bromopiruvato. O produto da reacção, 6-(7-nitro-2,1,3-benzoxa-diazol-4-iltio)hexanol, é um composto insolúvel amarelo escuro que é recolhido por filtração e lavado duas vezes com 15 mL de água destilada fria. O produto final mostra ser 98% puro através da 22 ΡΕ1615638 análise de HPLC. 0 peso molecular do composto determinado por espectrometria de massa é de 298 Da. 0 espectro de UV visível é caracterizado por um pico de absorção máxima nos 432 nm (ε = 15 mM’1 cm-1) e o espectro de fluorescência apresenta um pico de emissão máxima nos 525 nm. EXEMPLO COMPARATIVO 3 2-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-iltio)imidazole

Fez-se reagir uma solução de 4-cloro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole (1 mmole) e 2-mercaptoimidazole (Sigma-Aldrich, Fine Chemicals) (1 mmole) em 6 mL de eta-nol:água 0,3:1, contendo 2,5 mmoles de piridina (Sigma-Aldrich, Fine Chemicals). Após 1 hora de incubação a 25°C, a solução foi filtrada, lavada duas vezes com 10 mL de água destilada fria e seca sob vácuo. O produto insolúvel, 2-(7-nitro-2,1,3-benzoxa-diazol-4-iltio)imidazole, é de cor laranja e é 98% puro conforme demonstrado pela análise de HPLC. O peso molecular do composto determinado por espectrometria de massa é de 264 Da. O composto tem um espectro visível de UV caracterizado por um pico de absorção máxima nos 401 nm (ε 23 ΡΕ1615638 = 11,5 mM 1 cm x) e não apresenta qualquer espectro de emissão de fluorescência. EXEMPLO COMPARATIVO 4 4- (7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-iltio)fenol

Fez-se reaqir uma solução mista de 4-cloro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole (1 mmole) e 4-mercaptofenol (Sigma-Aldrich, Fine Chemicals) (2 mmoles) em 20 mL de etanol: 1:1 tampão de fosfato de potássio, a um pH 7.0 durante 6 horas num béquer graduado, à temperatura de 25°C. O pH foi mantido neutro através da adição de pequenas quantidades de KOH. No final da reacção, o 4-mercaptofenol em excesso foi colocado a reagir com 1,5 mmoles de 3-bromopiruvato. O produto da reacção, 4-(7-nitro-2,1,3-benzoxa-diazol-4-iltio)fenol, foi recolhido por filtração, lavado duas vezes com 15 mL de água destilada fria e seco sob vácuo. O produto final é um composto insolúvel castanho e mostra ser 98% puro através da análise de HPLC. O peso molecular do composto determinado por espectrometria de massa é de 289 Da. O composto tem um espectro de UV visivel na água caracterizado por um pico de absorção máxima nos 428 nm (ε = ll,5mM_1 cm-1) e não apresenta qualquer espectro de emissão de fluorescência. 24 ΡΕ1615638 EXEMPLO COMPARATIVO 5 Ácido 3-(7-nitro-2,l,3-benzoxadiazol-4-iltio)propiónico

Fez-se reagir uma solução de 4-cloro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole (1 mmole) e ácido 3-mercaptopropiónico (Sigma-Aldrich, Fine Chemicals) (1 mmole) em 6 mL de álcool etilicorágua 0,3:1 contendo 2,5 mmoles de piridina.

Após uma hora de incubação a 25°C, a solução foi filtrada, lavada duas vezes com 10 mL de água destilada fria e depois seca sob vácuo. O produto reaccional insolúvel, ácido 3-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-iltio)-propiónico, é de cor amarela escura e mostra ser 98% puro através da análise de HPLC. O peso molecular é de 270 Da. O composto tem um espectro de UV visível na água caracterizado por um pico de absorção máxima nos 428 nm (ε = 12ΠΤΜ"1 cm"1) e o espectro de fluorescência apresenta um pico de emissão máxima nos 525 nm.

Estudo da actlvldade biológica da inibição da qlutationa S-transferase pelos derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole

Procedimento experimental - Foram utilizados os derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole dos Exemplos 1 e 2, preparados de acordo com os procedimentos descritos nos 25 ΡΕ1615638 referidos exemplos. Para fins de comparação, foram igualmente avaliados os desempenhos dos seguintes compostos: os compostos dos Exemplos 3 e 4, caracterizados por grupos separáveis moderados; o composto do Exemplo 5, caracterizado por um grupo separável basicamente mau, modificado pela substituição de um hidrogénio com um grupo COOH; o derivado 6-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ilamino)-etanol, em que S é substituido por NH na fórmula, em que o grupo NHRi não é um grupo separável.

Este último serviu de controlo para assegurar que a citotoxicidade está ligada à inibição da GST. Obteve-se 6-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ilamino)hexanol ao fazer reagir 1 mmole de 4-cloro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole com 1 mmole de 6-amino-l-hexanol (Sigma-Aldrich, Fine Chemicals) em 6 mL de álcool etilico:água 0,3:1 contendo 2,5 mmoles de piridina.

Estes compostos foram testados como inibidores da actividade das isoenzimas GSTP1-1, GSTA1-1 e GSTM2-2 pertencentes às classes de GST mais representativas: as classes Pi, Mu e Alpha. A GSTA1-1, M2-2 e Pl-1, expressas na Escherichia coli, foram purificadas utilizando uma passagem cromato-gráfica numa resina de afinidade capaz de reter selecti-vamente a GST (J.Biol. Chem. 270, (1995), 1249-1253). 26 ΡΕ1615638 A actividade da GST foi testada a 25°C com um tampão de fosfato de potássio a 0,1 M, a um pH de 6.5, na presença dos substratos, i.e. da glutationa (Sigma-Aldrich,

Fine Chemicals) numa concentração de 1 mM, e de 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno (CDNB) (Sigma-Aldrich, Fine Chemicals) 1 mM (Methods Enzymol. 77,1981, 398-405).

Durante o teste para determinar a CI50 (concentração de inibidor à qual é observada uma inibição da actividade enzimática de 50%), a mistura activa foi adicionada das várias quantidades do derivado de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole a testar. A actividade enzimática foi avaliada por via espectrofotométrica a 340 nm, um comprimento de onda em que é absorvido o produto da reacção S-(2,4-dinitrobenzeno)-glutationa (GS-NBD) (ε = 9,6 mM-1 cm'1).

Resultados - Os valores da CI50 (μΜ) dos derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole são apresentados na Tabela 1 abaixo. A tabela mostra os valores IC50 relativos aos vários inibidores testados em relação às três isoenzimas representativas de cada classe de GST.

Cada composto é indicado na tabela com um número que corresponde ao respectivo exemplo de sintese, enquanto o derivado amina de comparação é indicado com o número 6. ΡΕ1615638 27

Tabela 1 (1) 4- (7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-iltio)butanol (2) 6- (7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-iltio)hexanol (3) 2- (7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-iltio)imidazole (4) 4-(7-nitro-2,l,3-benzoxadiazol-4-iltio)fenol (5) ácido 3-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-iltio)propiónico (6) 6-(7-nitro-2,l,3-benzoxadiazol-4-ilamino)hexanol

Inibição da actividade da GST - valores IC5q (μΜ)

Enzima GSTA1-1 GST Pl-1 GST M2-2 Composto N° (D 56, 00 2,00 0,03 (2) 25, 00 0,80 0,01 (3) 11,00 6, 30 0,01 (4) 6,50 0,70 0,03 (5) O O 5, 74 0,31 (6) >100 >100 1,80

Tal como mencionado anteriormente, a capacidade de inibição relativamente às várias isoenzimas da GST do derivado 6-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ilamino)etanol foi igualmente testada. O átomo de enxofre na última fórmula é substituído por um grupo amina de modo a avaliar se a citotoxicidade está ligada à inibição da GST. A análise destes dados iniciais mostra que o composto perdeu praticamente a sua capacidade para inibir a GSTP1-1 (IC50 - 100 μΜ) mas mantém uma capacidade inibidora elevada no que se refere à GSTM2-2 com um IC50 de 1,8 μΜ. 28 ΡΕ1615638

No que diz respeito ao inibidor análogo cuja fórmula inclui enxofre, verifica-se um IC50 muito mais baixo (maior capacidade inibidora) em relação ao controlo, sendo nomeadamente de 0,80 μΜ para a GSTP1-1 e de 0,01 μΜ para a GSTM2-2.

Mecanismo da interacção entre os derivados de 7-nitro-benzofurazano e as GSTs

Ligação dos derivados de 7-nitro-benzofurazano às GSTs

Procedimento experimental - A afinidade dos derivados de 7-nitro-benzofurazano com as GSTs humanas foi obtida medindo-se o amortecimento da fluorescência intrínseca da proteína que ocorre após a ligação dos inibidores (a excitação situou-se nos 295 nm e a emissão registou-se aos 340 nm) . A fluorescência intrínseca foi medida num espectrofluorímetro de contagem de um único fotão (Fluoro-max, S.A. Instruments, Paris, França). Num ensaio experimental típico, a fluorescência de 340 nm foi registada antes e depois da adição de quantidades variáveis de um inibidor seleccionado a 4 μΜ de GST em 0,1 M de tampão K-fosfato com um pH de 6.5 e contendo 1 mM de GSH.

Resultados - Os dados representativos obtidos com a GSTP1-1 e o derivado de 7-nitro-benzofurazano N° 2 (exemplo de síntese 2) são apresentados como uma análise "Scatchard plot" na Figura 1. A constante de dissociação obtida relativamente ao complexo inibidor-GSTPl-1 é de KD = 29 ΡΕ1615638 0,8 μΜ, a qual se sobrepõe ao valor de IC5o obtido cineticamente e apresentado na Tabela 1. É notório que a GSH é essencial para uma boa afinidade entre o derivado do 7-nitro-benzofurazano e a GST: de facto, na ausência de GSH, a afinidade diminui em cerca de duas ordens de magnitude.

Prova espectroscópica quanto à formação do σ-adutor no local activo

Procedimento Experimental - O espectro visivel de UV de 15 μΜ do derivado do 7-nitro-benzofurazano N° 2 na presença de quantidades estequiométricas de GSTPl-1 e GSH 1 mM foi obtido a 25°C em 0,1 M de tampão K-fosfato com um pH de 6.5.

Resultados - Na presença de GSTPl-1 e GSH, observa-se o desaparecimento imediato da banda de 432 nm, tipica do derivado do 7-nitro-benzofurazano, assim como o aumento paralelo de uma banda centrada nos 348 nm (Figura 2, Quadro A) . O grupo tiol da GSH é essencial para obter esta alteração do espectro. De facto, não se observa qualquer alteração no espectro visivel de UV quando o derivado 7-nitro-benzofurazano (50 μΜ) é incubado com quantidades estequiométricas de GSTPl-1 e 1 mM de S- metilglutationa (Figura 2, Quadro B).

Este comportamento pode ser explicado pelos relatórios anteriores que mostram que os 7-nitrobenzofu-razanos são excelentes electrófilos, formando prontamente 30 ΡΕ1615638 os σ-adutores com muitos nucleófilos (J. Chem. Soc., Perkin Trans 2, (2002) 257-261). O comportamento habitual observado é um ataque cineticamente preferido do nucleófilo na posição 6 do anel de 7-nitrobenzofurazano, seguido de uma isomerização lenta do adutor-4 mais estável que absorve entre 300 e 400 nm. Nas condições experimentais acima referidas o σ-adutor pode ser formado por uma interacção covalente entre o derivado 7-nitrobenzofurazano e o grupo tiol da GSH ligado ao local activo da GSTP1-1, tal como demonstrado no esquema A.

Esta hipótese está de acordo com a abordagem de acoplamento realizada para prever a orientação do ligando no local de ligação da GST. A comparação entre as energias de ligação para o σ-adutor na posição 6 e na posição 4 revela uma estabilização de ordem de magnitude dois do composto 4-substituído. 31 ΡΕ1615638

Com base nos dados acima expostos, é evidente que a espécie de inibidor que efectivamente inibe a GSTP1-1 é o σ-adutor formado entre o derivado de 7-nitro-benzofurazano e a GSH. As GSTs são muito eficazes na catálise da formação do σ-adutor entre os derivados de 7-nitro-benzofurazano e a GSH. Maus grupos separáveis, tais como os grupos alquiltio, poderão estabilizar o σ-adutor ao evitar a formação do derivado 4-glutationil-7-nitro mono-substituido. Além disso, estes σ-adutores caracterizam-se por uma carga negativa localizada no grupo 7-nitro que pode ser especificamente estabilizada pela enzima. De facto, na ausência da GSTP1-1, são obtidas quantidades detectáveis do σ-adutor na solução apenas em concentrações de GSH superiores a 5 mM, e a constante de equilíbrio calculada para esta reacção é de K = 20 mM. Com base nesta constante de equilíbrio, a quantidade de σ-adutor formada com 1 mM de GSH (na concentração de GSH utilizada nos nossos ensaios) e na ausência de GSTP1-1 é de cerca de 5% da concentração de 7-nitro-benzofurazano. Por conseguinte, a afinidade da GSTP1-1 em relação às reais espécies inibidoras torna-se 4 x 10~8 M. Esta forte afinidade indica que a GSTP1-1 é um alvo muito seleccionado para esta molécula no interior da célula.

Ensaios em linhas celulares quanto à actividade anti-cancro dos derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole

Procedimento Experimental - Foram utilizadas quatro linhas de células cancerosas para testar a actividade anti-cancro dos derivados de 7-nitro-2,1,3- 32 ΡΕ1615638 mielóide humana), HepG2 CEM 1.3 (leucemia T-(carcinoma pulmonar de benzoxadiazole: K562 (leucemia (carcinoma hepático humano), linfoblástica humana) e GLC-4 pequenas células).

As linhas de células cancerosas humanas foram mantidas em RPMI 1640 (contendo L-glutamina a 2 mM e 0,1 g/L de penicilina-G/sulfato de estreptomicina) enriquecido com 5% de soro fetal bovino (FBS) , a 37°C, 5% de C02 e uma humidade de 98%.

As células foram colocadas em placas de 96 poços a uma densidade de 15.000 células por poço, num volume de meio de cultura de 100 pL. Após decorridas 24 horas, cada um dos derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole a ser testado, na concentração apropriada, foi adicionado ao meio de cultura. Ao mesmo tempo, foram preparados alguns ensaios de controlo adicionando aos poços o solvente no qual o composto foi dissolvido (% v/v de DMSO em PBS) . Todas as medições foram realizadas em quadruplicado.

As células foram incubadas durante 48 horas a 37°C, com 5% de C02.

De modo a obter um perfil de resposta à dose para cada derivado de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole em estudo, foi aplicado um processo de avaliação baseado no método descrito por Shekan et al (J. Natl. Câncer. Inst. 82, (1990), 1107-1112). 33 ΡΕ1615638

Após a incubação, o crescimento celular percentual foi avaliado por um procedimento de fixação das células in-situ, seguido de um teste de SRB utilizando um processo de coloração com sulforodamina B capaz de se ligar especificamente a proteínas. 0 produto ao qual foi aplicado o corante foi então solubilizado e quantificado por via espectrofotométrica a fim de determinar o crescimento das células tratadas com o composto em estudo relativamente àquelas que foram tratadas apenas com o solvente.

De maneira a medir igualmente a actividade das GSTs endógenas presentes nas células, foram utilizadas as mesmas linhas de células cancerosas: K562, HepG2, CEM 1.3 e GLC-4. Neste caso, as células em cultura foram tratadas com tripsina consoante necessário, recolhidas por centrifugação e lavadas duas vezes em PBS. As células foram então novamente suspensas em dois volumes de PBS e lisadas por sonicação. 0 lisado celular foi centrifugado a 15.000 g durante 15 minutos. O sobrenadante foi recolhido e utilizado para o teste enzimático das GSTs descritas no exemplo anterior.

Uma unidade de GST é definida como a quantidade de enzima que catalisa a formação de 1 pmole de produto (GS-DNB) por minuto a 25°C. A concentração proteica foi determinada pela aplicação do método do ácido bicinconinico (Pierce). 34 ΡΕ1615638

Resultados - Os valores IC5o (a concentração do composto na qual é observada uma inibição de 50% do crescimento celular em relação às células não tratadas), expressos em μΜ, dos derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole são apresentados na Tabela 2.

Aos compostos listados na Tabela 2 foi atribuida a mesma sequência numérica daqueles que foram utilizados no ensaio acima descrito. Tal como no ensaio experimental anterior, os compostos (3)-(6) são apresentados para efeitos de comparação com os compostos reivindicados (1) e (2).

Tabela 2

Ensaios de actividade em linhas celulares - valores IC5o (μΜ)

Linha celular CEM 1.3 GLC-4 K562

HepG2

Composto N‘ d! 0,2 3,2 2,2 3,2 (2; 0,1 1,4 0,8 2, 9 o: 3, 9 10 16 (4) 2,4 7,5 6, 4 16, 3 (5) 6, 5 16, 5 38 25 (6) >50 >50 >50 >50 (1) 4-(7-nitro-2,l,3-benzoxadiazol-4-iltio)butanol (2) 6-(7-nitro-2,l,3-benzoxadiazol-4-iltio)hexanol (3) 2-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-iltio)imidazole (4) 4- (7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-iltio)fenol (5) ácido 3-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-iltio)propiónico (6) 6-(7-nitro-2,l,3-benzoxadiazol-4-ilamino)hexanol 35 ΡΕ1615638

Com base no teste SRB, os derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole de acordo com a fórmula (1) mostram uma excelente actividade citotóxica. Os valores IC50 obtidos nas linhas celulares são da mesma magnitude que os valores IC50 obtidos com a isoforma enzimática purificada GSTP1-1.

Para corroborar esta correspondência, o composto 6-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ilamino)etanol foi testado nas várias linhas celulares e revelou não ter qualquer actividade inibidora em relação à isoforma enzimática GSTP1-1, mas apresentou um IC50 de cerca de 2 μΜ para a isoforma enzimática GSTM2-2. Este composto consegue penetrar facilmente nas células, tal como se pode deduzir pela intensa fluorescência verificada 6 horas após a incubação com várias concentrações de 6-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ilamino)hexanol. Todas as linhas de células cancerosas testadas eram ainda viáveis 48 horas depois da incubação com 50 μΜ de 6-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-ilamino)hexanol. A tabela 3 apresenta os valores da actividade especifica relativa à GST (unidade de proteina/mg) calculada nas linhas celulares utilizadas no ensaio de citotoxicidade.

Tabela 3 36 ΡΕ1615638

Actividade específica da GST (unidade de proteína/mg) Linha celular CEM 1.3 GLC-4 K562 HepG2 Actividade específica 0,21 0,35 0,52 0,02 A linha de células cancerosas que mostrou maior resistência ao tratamento com os derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole foi a do carcinoma hepático HepG2. Esta linha de células cancerosas é também a que apresenta a actividade especifica de GST mais baixa, tal como se pode ver na Tabela 3, assim como uma composição isoenzimática de GST que é diferente das restantes linhas de células cancerosas.

De facto, os estudos de caracterização levados a cabo com um grande número de linhas celulares confirmam que a GSTP1-1 é a isoforma enzimática dominante na maioria das linhas de células cancerosas (1-30 pg/mg de proteína) e que os elevados níveis de expressão desta isoenzima parecem estar correlacionados com a capacidade proliferativa e com a imortalização destas linhas de células cancerosas (Mol. Pharmacol. 50, 1996, 149-159).

Assim, na linha de células cancerosas HepG2, a concentração de GSTP1-1 é muito baixa e a isoforma enzimática dominante é a GSTA1-1, cuja concentração em termos absolutos é ainda cerca de 1% da concentração de GSTPl-1 encontrada na maioria das linhas de células cancerosas (Biochim Biophys Acta 1225, 1994, 223-230). 37 ΡΕ1615638

Por fim, é interessante notar como a mais elevada citotoxicidade dos compostos anti-cancro testados foi verificada relativamente às linhas celulares de leucemia CEM 1.3 e K562, as quais são evidentemente mais sensiveis a este tipo de intervenção em relação às linhas de cancro sólido. A capacidade dos derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole para aumentar a citotoxicidade de medicamentos anti-cancro em células resistentes

Em células cancerosas, a resistência a muitos medicamentos anti-cancro está frequentemente associada a uma elevada expressão de P-glicoproteína, uma proteína membranária pertencente à família geral dos transportadores do tipo ABC (módulo de ligação ao ATP -"ATP-binding cassette")· Este ensaio experimental teve como objectivo testar o efeito do 6-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-iltio)-hexanol na toxicidade do medicamento vinblastina para a CEMVBL100, uma linha de leucemia resistente à vinblastina (com hiperexpressão de P-glicoproteína).

Procedimento Experimental - As células foram colocadas em faixas de 96 poços a uma densidade de 15.000 células por poço, num volume de meio de cultura de 100 pL. Após 24 horas, adicionou-se ao meio de cultura uma concentração adequada de vinblastina entre 25 nM e 1000 nM. O teste foi realizado quer na ausência quer na presença de várias concentrações de 6- (7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4- 38 ΡΕ1615638 iltio)hexanol que variaram entre 0,1 μΜ e 1 μΜ. Simultaneamente, foram preparados alguns ensaios de controlo adicionando-se aos poços o solvente no qual o composto foi dissolvido (% v/v de DMSO em PBS) . Todas as medições foram efectuadas em quadriplicado. Após 48 horas de incubação, foi obtido um perfil de resposta à dosagem utilizando o teste de SRB (J. Natl. Câncer. Inst. 82, (1990), 1107-1112, loc. cit.)· A toxicidade do 6-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-iltio)hexanol separadamente foi também avaliada para a linha de leucemia resistente CEMVBL100.

Resultados - Tal como mostrado na Tabela 4, o 6-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-iltio)hexanol (0,5 μΜ) provoca um aumento acentuado da sensibilidade das células leucémicas ao medicamento de vinblastina.

Tabela 4

Efeito do 6-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol -4-iltio)hexanol sobre a toxicidade da vinblastina (IC50 nM) Derivado de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole ausente 0,5 μΜ CEM VLB100 340 50 Deverá ainda sublinhar-se que a linha celular CEMVBL100 não apresenta um aumento acentuado na resistência, em termos de IC5o, em relação a outras linhas de células que não têm uma expressão elevada de P-glicoproteína. Esta constatação sugere que a hiperexpressão de P-glicoproteina não interfere com a acção citotóxica dos 39 ΡΕ1615638 derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole.

Análise da apoptose nas linhas celulares K562 e CEM 1.3 A indução da apoptose nas células pelo derivado de 7-nitro-benzofurazano N° 2 foi determinada pela medição da activação da caspase-3, assim como por análise morfológica e análise de citometria de fluxo.

Activação da Caspase-3

Procedimento Experimental - A activação da Caspase-3 desempenha um papel fundamental na iniciação da fase activa da apoptose que resulta na morte celular. Assim, a actividade da caspase-3 protease pode ser utilizada para monitorizar a apoptose.

Os aglomerados celulares de diferentes horas de incubação com o derivado de 7-nitrobenzofurazano N° 2 (res-pectivamente 10 μΜ e 2 μΜ com K562 e CEM 1.3) foram novamente colocados em suspensão com tampão de lise (100 mM Hepes, pH 7.6, 0,1% Chaps,l mM EDTA, 1 mM Fluoreto de Fenil-metil-sulfonilo e 10 mM DTT) durante 20 minutos em gelo e os aglomerados de células foram desfeitos por soni-cação durante 10 segundos. Os lisados, após centrifugação, foram utilizados para medir a actividade da caspase-3. O substrato utilizado foi o peptideo fluorescente modelo Ac-DEVD-AFC (Acetil-Asp-GluVal-Asp-7-amino-4-trifluorometil-cumarina), o qual foi proteolisado pela caspase-3 resul- 40 ΡΕ1615638 tando numa emissão de fluorescência a 505 nm (excitação a 400 nm). Como controlo, os lisados foram incubados durante 30 min. a 30°C com o inibidor de caspase DEVD-CHO antes da avaliação da actividade enzimática. A actividade da caspase foi expressa como a alteração de fluorescência observada por minuto por número de células.

Resultados - A incubação com o derivado 7-nitro-benzofurazano N° 2 desencadeia a activação da caspase-3 em ambas as linhas celulares CEM 1.3 e K562. Tal como mostrado na Figura 3, observou-se um aumento significativo da caspase-3 nas células K562 após decorridas 24 horas do tratamento com o derivado N° 2. Foi obtido um resultado semelhante com as células CEM 1.3.

Análise Morfológica

Procedimento Experimental - As linhas de células K562 e CEM1.3 foram tratadas durante 24 h com 10 μΜ e 2 μΜ, respectivamente, do derivado N° 2. As células apoptóticas foram detectadas com o microscópio de fluorescência mediante a análise da fragmentação nuclear após marcação com corante Hoechst 33342 (Calbiochem-Novabiochem).

Resultados - Os dados representativos com as células K562 mostram a condensação da cromatina e a fragmentação nuclear, representando estas os passos finais da apoptose. 41 ΡΕ1615638

Análise de Citometria de Fluxo

Procedimento Experimental - As células foram lavadas em PBS, e marcadas com iodeto de propídio e com o corante impermeável Anexina V-FITC (Bender MedSystems, Viena, Áustria). As células marcadas foram analisadas utilizando um Citómetro de Fluxo FAC-Scan (Becton-

Dickinson, CA) . Os dados foram registados e analisados estatisticamente pelo software WinMDI versão 2.8. A marcação simultânea de células com Anexina V-FITC e PI permite a diferenciação de células intactas, células apoptóticas precoces ou células apoptóticas tardias.

Resultados - A Figura 4 mostra os resultados da análise de citometria de fluxo efectuada para ambas as linhas celulares K562 e CEM1.3. Observou-se um aumento progressivo de células apoptóticas num periodo de incubação de até 24 h. O tratamento de 12 h com o derivado N° 2 induz 30% e 34% da apoptose em linhas de células K562 e CEM1.3, respectivamente, enquanto que, após 24 h, a apoptose aumenta para 41 % e 47% nas linhas de células K562 e CEM1.3 respectivamente.

Em conclusão, os resultados obtidos com três abordagens experimentais diferentes mostram claramente a capacidade pro-apoptótica do derivado do 7-nitro-benzofurazano nas linhas de células leucémicas CEM e K562.

Definição do mecanismo intracelular 42 ΡΕ1615638 0 mecanismo pelo qual o inibidor da GST induz a apoptose é parcialmente delineado abaixo, onde se descreve a interacção do derivado N° 2 com a via mediada por JNK intracelular nas linhas de células linfoblastóides CEM e de leucemia mielógena K562.

Análise de "Western Blot" e ensaio de imunoprecipitação

Procedimento Experimental - As células foram lavadas com PBS e recolhidas por centrifugação. Os aglomerados celulares foram novamente suspensos em tampão de lise contendo 10 mM de Tris-HCl (pH 7.4), 5 mM EDTA, 150 mM NaCI, 0,5% IGEPAL CA-630, e inibidores da protease (Sigma Co.). Após 30 minutos de incubação em gelo, o aglomerado celular foi desfeito por sonicação durante 10 segundos. Os lisados foram então centrifugados e os sobre-nadantes foram introduzidos em 12% de gel de poliacrilamida e transferidos para uma membrana de nitrocelulose. As isoformas policlonais anti-GSTPl-1 (1:1000), anti-c-Jun e anti-JNK (1:200); ou monoclonais JNK e c-Jun anti-fosfo-activadas (1:200; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); e a β-actina (1:5000; Sigma Co.) foram utilizadas como anticorpos primários. A β-actina foi utilizada como controlo.

Para a análise de imunoprecipitação, os aglomerados celulares foram novamente suspensos em tampão de lise e desfeitos por sonicação durante 10 segundos. Os lisados 43 ΡΕ1615638 foram depois centrifugados a 14.000 g durante 15 minutos a 4°C. As proteinas foram incubadas em tampão de lise com um anti-corpo anti-JNK durante 2h a 4°C. Os imunocomplexos foram absorvidos com proteina A-Sefarose durante 30 min. a 4°C. Após três lavagens com tampão de lise, os aglomerados imunes foram fervidos numa amostra de tampão SDS. As proteinas foram introduzidas em 15% de SDS-gel de poliacrilamida e transferidas para a nitrocelulose. A GST, JNK e fosfo-JNK foram detectadas por anticorpos específicos .

Resultados - A Figura 5 (A, B e C) mostra as análises de "Western blot" efectuadas às linhas de células K562 e CEM1.3 tratadas, respectivamente, com 10 μΜ e 2 μΜ do derivado N° 2. A análise de "Western blot" mostra as formas basais e fosforiladas de JNK e de c-Jun. Em ambas as linhas celulares, a fosfo-JNK é claramente aumentada após meia-hora de incubação com o derivado N° 2 e permanece em niveis elevados até 24 horas. A tendência de fosfoactivação de c-Jun na linha celular K562 é semelhante à activação da JNK; esta é rapidamente detectada após meia-hora de incubação com o derivado N° 2 e permanece em niveis elevados até 12 horas (Quadro A). A fosfoactivação de c-Jun na linha celular CEM1.3 segue uma tendência diferente; observa-se um rápido aumento de fosfo-c-Jun na meia-hora seguinte à adição do derivado N° 2 mas que logo diminui e atinge o nivel basal após 12 horas de tratamento (Quadro C). 44 ΡΕ1615638

Estes dados sugerem que a indução da apoptose está dependente da activação da via JNK/c-Jun mesmo se a modalidade da resposta celular parece ser diferente. Em particular, poderá ser avançada a hipótese de uma indução dependente do tipo histológico da via de cinase da proteína activada pelo mitogénio (MAP).

Para avaliar se o tratamento das células com o derivado N° 2 afecta a quantidade do complexo GST-JNK, os lisados celulares K562 foram imunoprecipitados com um anticorpo anti-JNK e utilizados para a análise de "Western blot". A Figura 5, Quadro B, mostra que a quantidade de GSTP1-1 em co-precipitação com JNK diminui rapidamente nas células tratadas com o derivado N° 2 e aumenta ligeiramente apenas quando decorridas 3 horas.

Assim, a activação da via JNK/c-Jun ocorre através da dissociação da GSTP1-1 do complexo GST-JNK que é desencadeada pelo derivado N° 2. 0 que precede permite chegar à seguinte conclusão: Em resposta a diversos estímulos que induzem o stress oxidativo, incluindo a radiação UV e os medicamentos anti-cancro, a activação da família da cinase MAP é necessária para a activação dos genes e a modificação pós-transla-cional de proteínas que, por sua vez, é necessária para a indução da apoptose. Além da activação redox (por redução-oxidação) desta via de sinalização, a adição do composto 45 ΡΕ1615638 peptidomimético GSH (TER117) e do seu éster dietílico (TER199), um inibidor específico da isoenzima GSTP1-1, provoca a dissociação do complexo GSTP1-1-JNK resultando assim na activação da JNK. Esta última induz a fosforilação do substrato c-Jun que regula a transcrição dos genes envolvidos na apoptose celular. (J Pharmacol. Exp. Ther. 296, (2001) 1-6) .

Do mesmo modo, os derivados de 7-nitro-benzofura-zano da presente invenção são inibidores da GST muito eficazes que poderiam preparar a célula para a apoptose ao induzir a dissociação da GSTP1-1 da JNK. Foi demonstrado que o derivado n° 2 do 7-nitro-benzofurazano se comporta como um substrato suicida para as GSTs: este é conjugado com GSH no local activo da GST, levando a um intermediário σ-adutor que inibe fortemente a enzima (KD = 4 x 10“8 M com GSTP1-1) . Esta interacção peculiar sugere que a GSTP1-1 é um alvo muito selectivo para esta molécula. No interior da célula, o derivado N° 2 do 7-nitro-benzofurazano induz a dissociação da GSTPl-1 da JNK, resultando na fosfo-activa-ção quer da JNK quer da c-Jun. O derivado N° 2 de 7-nitro-benzofurazano desencadeia um processo típico de apoptose nas células K562 e CEM1.3 que inclui a contracção celular, a translocação do fosfolípido fosfatidil-serina para a superfície da célula, a activação da caspase e a condensação da cromatina.

Teste da toxicidade aguda in vivo 46 ΡΕ1615638 0 teste utilizou 25 fêmeas da estirpe de ratinhos BDF1 (18-20 g Claries River Lab. Lecco, Itália) divididas em 5 grupos de 5 ratinhos cada. Três destes grupos foram tratados com uma administração única, por injecção intra-peritoneal (i.p.), de 6-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-iltio)hexanol nas seguintes concentrações: a) 125 mg/kg, b) 25 mg/kg, c) 5 mg/kg. Os outros dois grupos foram utilizados como grupos de controlo e receberam as seguintes administrações: d) um veiculo de azeite contendo 2,5% de DMSO, e e) um soro fisiológico.

Os ratinhos foram seguidos durante 15 dias, fornecendo-lhes alimentos e água em abundância, e registando as variações de peso de cada ratinho. A evolução do peso está representada no diagrama em anexo como Figura 6, onde se mostra que, após 15 dias de tratamento, os ratinhos apresentavam apenas ligeiras variações de peso. Além disso, verificou-se o peso do figado e do baço de cada ratinho para saber se este se mantinha dentro da normalidade, apontando assim para a ausência de toxicidade do 6-(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-iltio)hexanol mesmo na concentração máxima utilizada (125 mg/kg).

Todos os dados obtidos contribuem para confirmar que a actividade citotóxica considerável dos derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole sobre as células cancerosas se deve à inibição da actividade desintoxicante e anti-apoptótica da GSTP1-1, e que as células cancerosas são o 47 ΡΕ1615638 primeiro alvo destes compostos desde que haja uma hiperexpressão de GSTP1-1.

Por conseguinte, os derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole de acordo com a presente invenção têm uma eventual aplicação promissora enquanto agentes anti-cancro. Poderão ainda ser utilizados em combinação com outros agentes quimioterapêuticos a fim de prevenir, reduzir ou eliminar o efeito de resistência farmacológica observado em pacientes submetidos a quimioterapia contra o cancro.

Lisboa, 14 de Dezembro de 2006

Claims (7)

1. ΡΕ1615638 1 REIVINDICAÇÕES 1. benzoxadiazole Utilização de derivados de fórmula geral (I), de 7-nitro-2,1,3-

   em que, Ri é seleccionado do grupo composto por alquilo linear, ramificado ou cíclico contendo até 12 átomos de carbono, alcenilo linear, ramificado ou ciclico contendo até 12 átomos de carbono, alcinilo linear, ramificado ou cíclico contendo até 12 átomos de carbono, sendo um átomo de hidrogénio de Ri opcionalmente substituído com um grupo escolhido de entre os grupos compostos por OR2, NO2, NR2R3, em que R2 e R3 são independentemente escolhidos do grupo composto por H, alquilo, alcenilo ou alcinilo linear, ramificado ou cíclico contendo até 12 átomos de carbono, e em que o referido grupo S-Ri não é um bom grupo separável, para a preparação de um medicamento inibidor da GST destinado ao tratamento de formas de cancro. 2 ΡΕ1615638
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que Ri é um hidroxialquilo linear ou ramificado contendo até 12 átomos de carbono.
3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 2, em que Ri é seleccionado de entre 4-hidroxibutilo e 6-hidroxi-hexilo.
4. 4. Utilização de acordo com a reivindicação 3, em que o derivado de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole corresponde a um dos seguintes: 4- (7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-iltio)butanol 6- (7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-iltio)hexanol.
5. 5. Composição farmacêutica para o tratamento do cancro compreendendo como ingrediente activo, pelo menos, um dos derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole de fórmula geral (I), em conjunto com um ou mais adjuvantes e/ou veiculos farmacologicamente aceitáveis.
6. 6. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 5 compreendendo, em combinação com pelo menos um dos referidos derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole de fórmula geral (I), um ou mais de outros agentes quimioterapêuticos. 3 ΡΕ1615638
7. 7. Composição farmacêutica destinada ao tratamento do cancro, adequada para prevenir, reduzir ou eliminar a resistência medicamentosa, e a qual compreende como ingrediente activo pelo menos um dos derivados de 7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole de fórmula geral (I), em combinação com um ou mais de outros agentes quimioterapêuticos. Lisboa, 14 de Dezembro de 2006