PT1663110E - Utilizações de interferões com a estrutura espacial alterada - Google Patents

Description

ΕΡ1663110Β1

DESCRIÇÃO

UTILIZAÇÕES DE INTERFERÕES COM A ESTRUTURA ESPACIAL

ALTERADA

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se a um interferão supercomposto recombinante (rSIFN-co), que pode ser obtido por um processo que compreende a introdução em E. coli da sequência polinucleotidica, mostrada na figura 1, com uma configuração espacial alterada. Uma caracteristica do rSIFN-co nesta invenção é que ele não só pode inibir a duplicação do ADN (ácido desoxirribonucleico) do virus da hepatite B, mas também a secreção de HBsAg e de HBeAg.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 rSIFN-co é uma nova molécula de interferão construído com o aminoácido conservativo mais popular encontrado em subtipos de IFN-α humanos naturais utilizando métodos de engenharia genética. Estes foram descritos nas patentes dos Estados Unidos N°s 4.695.623 e 4.897.471. Foi provado que o rSIFN-co tem atividade de IFN de largo espectro e atividade inibidora de vírus e de tumores, e atividade das células natural killer. A patente dos Estados Unidos N° 5.372.808 pela Amgen, Inc. aborda o rSIFN-co de tratamento. A patente chinesa N° 97.193.506,8 pela Amgen, Inc. aborda a repetição do tratamento da hepatite C com rSIFN-co. A patente chinesa N° 98.114.663,5 pela Shenzhen Jiusheng Bio-engineering Ltd. aborda o tratamento da hepatite B e da hepatite C com rSIFN-co. A Food and Drug Administration (FDA) dos Estados Unidos autorizou a Amgen a produzir rSIFN-co com E. coli, 1 ΕΡ1663110Β1 para o tratamento da hepatite C clínica no final de 1997.

Os pacientes com hepatite B podem ser identificados quando se deteta o HBsAg e o HBeAg. 0 IFN-α é de utilização comum em clínicas para o tratamento da hepatite B. 0 IFN liga-se aos recetores superficiais da membrana celular, inibindo a duplicação do ADN e do ARN (ácido ribonucleico), incluindo a indução de algumas enzimas para evitar a duplicação do vírus em células infetadas com hepatite. Todos os IFNs podem inibir somente a duplicação do ADN dos vírus, não os antigénios "e" e "s".

Esta divulgação descreve o interferão supercomposto recombinante, o método para o produzir e utilizações dos mesmos.

Um surto de pneumonia atípica, referida como Síndrome Respiratória Aguda (SRA) e identificada pela primeira vez na província de Guangdong, na China, espalhou-se para vários paises. Casos semelhantes foram detetados em pacientes em Hong Kong, no Vietname e no Canadá a partir de fevereiro e março de 2003. A Organização Mundial da Saúde (OMS) emitiu um alerta global para a doença. Em meados de março de 2003, a SRA foi identificada em profissionais de saúde e membros do agregado familiar que tinham cuidado dos pacientes com doença respiratória severa no Extremo Oriente. Muitos desses casos foram reconduzidos através de múltiplas cadeias de transmissão a um profissional de saúde da província de Guangdong, que visitou Hong Kong, onde foi hospitalizado com pneumonia e morreu. No final de abril de 2003, milhares de casos de SRA e centenas de mortes relacionadas à SRA foram comunicados à OMS por de mais de 25 países de todo o mundo. A maioria destes casos ocorreu após a exposição a pacientes com SRA, em ambientes domésticos ou do setor da saúde. Esta divulgação fornece um 2 ΕΡ1663110Β1 método para prevenir e/ou tratar a SRA.

Uma outra preocupação atual de epidemia na Ásia é o virus da gripe aviária (H5N1). A gripe aviária é uma doença infeciosa das aves, causada por estirpes do tipo A do virus da gripe. Existem 15 subtipos de virus da gripe aviária, H5N1 é particularmente preocupante, porgue este sofre mutações rapidamente, infetando não só animais, mas também seres humanos. A contagem das mortes humanas por gripe aviária confirmadas, a 4 de fevereiro de 2004, foi de treze. Laboratórios da rede mundial da gripe da OMS têm trabalhado para controlar o virus e evitar mais mortes humanas. No entanto, para compreender plenamente a magnitude do H5N1 e as suas formas de distribuição, é necessário testar mais meticulosamente. Além disso, os medicamentos antivirais só são eficazes no tratamento ou na prevenção das estirpes do virus da gripe A contra os casos dos que se encontram em boa saúde. Veja-se http://www.who.int/csr/don/2004_01_15/en, 15 de janeiro de 2004 .

Os investigadores do St. Jude e de outros laboratórios da gripe de alto nível estão a competir para criar uma vacina humana protótipo contra H5N1. Eles esperam que as vacinas protótipo possam estar prontas em pouco menos de três semanas. No entanto, até que uma vacina seja criada, os cientistas estão preocupados que o vírus H5N1 pode evoluir para um super gripe humana. Veja-se o "The Wall Street Journal, Scientists Rush to Create Vaccine for Bird Flu - Just in Case", 28 de janeiro de 2004.

Esta divulgação descreve um interferão supercomposto recombinante, tal como definido anteriormente, um método para produzir o mesmo e as utilizações dos mesmos. Particularmente, o interferão supercomposto divulgado aqui 3 ΕΡ1663110Β1 é capaz de inibir, prevenir e/ou tratar os vírus da hepatite, os vírus da SRA, ou as doenças respiratórias superiores induzidas por vírus, e o vírus da gripe aviária.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Esta invenção fornece um método para a inibição, a prevenção ou o tratamento de doenças virais ou tumores num indivíduo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz do interferão supercomposto, obtido por um processo que compreende a introdução em E. coli da sequência polinucleotídica mostrada na figura 1.

Esta invenção fornece o método descrito anteriormente, em que o interferão supercomposto é administrado por via oral, via intravenosa, via intramuscular, via intraperitoneal, injeção subcutânea, administração nasal ou mucosal, ou por inalação por meio de um inalador.

Esta invenção fornece o método para prevenir ou tratar doenças virais, em que as doenças virais são a hepatite A, a hepatite B, a hepatite C, outros tipos de hepatites, infeções virais causadas por vírus de Epstein-Barr, citomegalovírus, vírus herpes simplex, ou outros tipos de vírus herpes, papovavírus, poxvírus, picornavírus, adenovírus, rinovírus, vírus da leucemia humana de células T do tipo I, ou de vírus da leucemia humana de células-T do tipo II, ou de vírus da leucemia humana de células-T do tipo III.

Esta invenção fornece um método para atividades anti-hepatiticas. Este pode inibir a replicação do ADN de VHB, a produção do HBsAg e do HBeAg.

Esta invenção fornece um método para prevenir ou 4 ΕΡ1663110Β1 tratar doenças por infeção das vias respiratórias superiores.

Esta invenção fornece um método para prevenir ou tratar tumores ou cancros, em que o tumor é o cancro da pele, o carcinoma das células basais e o melanoma maligno, o carcinoma das células renais, o cancro do fígado, o cancro da tiroide, o cancro da rinofaringe, o carcinoma sólido, o cancro da próstata, o cancro do estômago/abdominal, o cancro do esófago, o cancro do reto, o cancro do pâncreas, o cancro da mama, o cancro do ovário e o cancro da bexiga superficial, o hemangioma, o carcinoma epidermoide, o cancro do colo do útero, o cancro do pulmão de não-pequenas células, o cancro do pulmão de pequenas células, o glioma, a leucocitose, a leucocitose aguda e a leucocitose crónica, a leucemia mielocítica crónica, a leucemia de células pilosas, o linfadenoma, o mieloma múltiplo, a policitemia vera, ou o sarcoma de Kaposi.

Esta invenção fornece um método para a prevenção ou o tratamento da Síndrome respiratória aguda (SRA) ou das doenças respiratórias superiores induzidas por vírus num indivíduo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de interferão supercomposto recombinante como definido anteriormente. 0 interferão supercomposto pode ser administrado por via oral, via intravenosa, via intramuscular, via intraperitoneal, injeção subcutânea, administração nasal ou mucosal, ou por inalação por meio de um inalador.

Esta invenção fornece um método para inibir o agente causador da síndrome respiratória aguda, ou doenças respiratórias superiores induzidas por vírus, compreendendo o contacto do agente com uma quantidade eficaz de 5 ΕΡ1663110Β1 interferão supercomposto.

Esta invenção também fornece um método para a inibição do virus da sindrome respiratória aguda, as células infetadas pelo virus sindrome respiratória aguda, ou doenças respiratórias superiores induzidas por virus, compreendendo o contacto de uma quantidade eficaz de interferão supercomposto com os ditos virus ou células. Este contato pode ser direto ou indireto.

Esta invenção fornece uma composição que compreende uma quantidade eficaz do interferão supercomposto capaz de inibir, prevenir ou tratar o virus da sindrome respiratória aguda, as células infetadas pelo virus sindrome respiratória aguda, ou doenças respiratórias superiores induzidas por virus, e um portador adequado.

Esta invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade eficaz do interferão supercomposto recombinante como definido anteriormente capaz de inibir, prevenir ou tratar o virus da sindrome respiratória aguda, as células infetadas pelo virus sindrome respiratória aguda, ou doenças respiratórias superiores induzidas por virus num indivíduo, e um portador farmaceuticamente aceitável. É um objeto adicional da invenção um polinucleótido isolado tendo a sequência mostrada na figura 1. É um objeto adicional da invenção, o interferão recombinante tal como definido anteriormente, para utilização médico. É um objeto adicional da invenção, a utilização do interferão recombinante, tal como definido anteriormente 6 ΕΡ1663110Β1 para o fabrico de um medicamento.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FIGURAS

Figura 1. Sequência do ADNc do rSIFN-co concebida de acordo com a utilização de codões de E. coli e a sequência dos aminoácidos do rSIFN-co deduzida

Figura 2. Sequência de outro interferão supercomposto

Figura 3. Diagrama do vetor plasmídico de clonagem pLac T7

Figura 4. Diagrama do vetor plasmídico de expressão pHY-4

Figura 5. Processo de construção do plasmídeo de expressão PHY-5

Figura 6-A. Espectro de dicroísmo circular de Infergen® (Testado pelo Centro de Análises e Medições da

Universidade de Sichuan)

Intervalo espectral: 250 nm - 190 nm Sensibilidade: 2 m°/cm Caminho ótico: 0,20 cm

Equipamento: Dicroísmo Circular J-500C

Amostras: contém 30 pg/ml de IFN-conl, 5,9 mg/ml de

NaCl e 3,8 mg/ml de Na2P04, pH 7,0. O Infergen® (interferão alfacon-1), fabricado pela Amgen Inc., também conhecido como interferão de consenso, é comercializado para o tratamento de adultos com infeções pelo vírus da hepatite C (VHC) crónica. Este é atualmente o único interferão bio otimizado, aprovado pela FDA, desenvolvido através de uma conceção racional de medicamentos e o único interferão com dados no rótulo, especificamente para pacientes que não respondem à 7 ΕΡ1663110Β1 terapia ou refratários. 0 departamento de vendas da InterMune forçou o relance do Infergen® em janeiro de 2002, com uma campanha ativa para educar hepatologistas dos Estados Unidos sobre a utilização seguro e adequado do Infergen®, o que representa uma nova esperança para os mais de 50 por cento dos pacientes com VHC, aos quais outras terapias atualmente disponíveis falharam. Veja-se o endereço http://www.intermune.com/wt/itmn/infergen, 27/08/2003

Figura 6-B. Espectro de dicroísmo circular de Infergen® da referência [Journal of Interferon and Cytokine Research. 16:489-499(1996)]

Espectros de dicroísmo circular das subformas do interferão de consenso. O interferão de consenso foi fracionado utilizando uma coluna de troca aniónica. As amostras foram tratadas por diálise em fosfato de sódio, 10 mM, pH 7,4. As medições foram efetuadas num espectropolarímetro Jasco J-170, numa cela termostática a 15°C. (-), forma acilada, (—) forma cis terminal, (···), forma met terminal. A. Espectro de UV distante. B. Espectro de UV próximo.

Figura 6-C. Espectro de dicroísmo circular do rSIFN-co Intervalo espectral: 320 nm - 250 nm Sensibilidade: 2 m°/cm Caminho ótico: 2 cm

Equipamento: Dicroísmo Circular J-500C

Amostras: contém 0,5 mg do rSIFN-co, 5,9 mg/ml de NaCl e 3,8 mg/ml de Na2PC>4, pH 7,0.

Figura 6-D. Espectro de dicroísmo circular do rSIFN-co Intervalo espectral: 250 nm - 190 nm Sensibilidade: 2 m°/cm Caminho ótico: 0,20 cm 8 ΕΡ1663110Β1

Equipamento: Dicroísmo Circular J-500C

Amostras: contém 30 pg/ml de rSIFN-co, 5, 9 mg/ml de NaCl e de 3,8 mg/ml de Na2PC>4, pH 7,0.

Claramente, tal como evidenciado pelos espectros anteriores, a estrutura secundária ou mesmo terciária do rSIFN-co é diferente da do Infergen®.

Figura 7A-C. Nebulizador do interferão supercomposto recombinante Altura: 9 0 mm

Largura: 25 mm (inferior), 6 mm (superior)

Peso: 9 g

Volume libertado: 0,1 ml

Figura 7D. Nebulizador do interferão supercomposto recombinante. Ao utilizar o nebulizador pela primeira vez, retire a tampa e descarregue no ar várias vezes até que esguiche algum liquido. Não é necessário testar o nebulizador para as utilizações posteriores. Para a utilização, seguir as ilustrações mostradas na figura, isto é: (1) pré-nebulizar e (2) Pressionar o adaptador para libertar o medicamento.

Figura 8. Comparação dos efeitos de diferentes

interferões na inibição da expressão dos genes de VHB

Figura 9A-1. Curvas de alterações da temperatura corporal do grupo A (5 pacientes)

Esta figura é o registo das mudanças de temperatura corporal em 5 pacientes do grupo A.

Figura 9A-2. Curvas de alterações da temperatura corporal do grupo A (6 pacientes)

Esta figura é o registo das mudanças de temperatura corporal dos outros 6 pacientes do grupo A. 9 ΕΡ1663110Β1

Figura 9B-1. Curvas de alterações da temperatura corporal do grupo B (5 pacientes)

Esta figura é o registo das mudanças de temperatura corporal em 5 pacientes do grupo B.

Figura 9B-2. Curvas de alterações da temperatura corporal do grupo B (5 pacientes)

Esta figura é o registo das mudanças de temperatura corporal nos outros 5 pacientes do grupo B.

Figura 10. Cristal I do rSIFN-co

Figura 11. Cristal II do rSIFN-co

Figura 12. A difração de raios X do cristal rSIFN-co

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Esta invenção fornece um método para a produção de um interferão supercomposto recombinante, com a configuração espacial alterada e com uma atividade antiviral melhorada, compreendendo as etapas de: (a) Introdução da molécula de ácido nucleico, como mostrado na figura 1, que codifica para o dito interferão com codões preferenciais para a expressão num hospedeiro de E. coli, e (b) Posicionamento do hospedeiro introduzido em condições que permitam a expressão do dito interferão.

Esta invenção fornece o método para a produção do interferão, compreendendo ainda a recuperação do interferão expresso. 10 ΕΡ1663110Β1

Esta invenção fornece um interferão supercomposto recombinante, com a configuração espacial alterada, tal como descrito anteriormente. Esta invenção revela que as proteínas com a mesma sequência primária podem ter atividades biológicas diferentes. Tal como é ilustrado no exemplo seguinte, esta invenção divulga duas proteínas com sequências de aminoácidos idênticas, mas com atividades diferentes. A eficácia desta atividade pode em alguns casos ser melhorada e, às vezes, a proteína com a configuração espacial alterada poderá revelar uma função nova. São divulgados também os equivalentes ou os mímicos do interferão recombinante, como descrito anteriormente.

Um equivalente é uma molécula que é semelhante em função ao interferão composto. Um equivalente pode ser um mutante de deleção, de substituição, ou reposição da sequência original. Os mímicos podem ser um peptídeo, polipeptídeo ou uma entidade química pequena. 0 interferão aqui descrito inclui, mas não está limitado a interferão α, β, ou ω. Numa realização, este é o IFN-la, o IFN-2b ou outros mutantes.

Numa realização, o interferão supercomposto divulgado tem uma maior eficácia do que o interferão descrito na patente dos Estados Unidos Nos 4.695.623 ou 4.897.471. Acredita-se que este interferão supercomposto tenha uma estrutura secundária ou terciária única. (Veja-se por exemplo a figura 6.) 0 interferão supercomposto descrito aqui tem uma modificação ou modificações na estrutura espacial resultantes das mudanças do seu processo de produção. 11 ΕΡ1663110Β1 0 interferão supercomposto descrito anteriormente pode ser produzido por um sistema de expressão de alta eficiência, que utiliza um promotor especial. Numa realização, o promotor é Pbad. Como pode ser facilmente apreciado por outros peritos gerais da tecnologia. Outros promotores indutíveis, tais como promotores de choque térmico ou promotores indutíveis de metais pesados, podem ser utilizados nesta invenção. 0 interferão supercomposto pode também ser produzido com o seu gene como ADNc sintetizado artificialmente, com ajuste da sua sequência do tipo selvagem, de acordo com a preferência de codões de E. coli. Extensiva discussão sobre a dita (preferência) utilização de codões pode ser encontrada na patente dos Estados Unidos N° 4.695.623. Veja-se por exemplo, a coluna 6, linha 41 - à coluna 7, linha 35. 0 interferão supercomposto descrito anteriormente possui atividade antiviral ou anti tumoral, e, portanto, é útil para a inibição, a prevenção ou o tratamento de doenças virais, tumores ou cancros.

Tal como aqui utilizado, as doenças virais incluem, mas não estão limitados a hepatite A, hepatite B, hepatite C, outros tipos de hepatites, infeções causadas por vírus de Epstein-Barr, citomegalovírus, vírus herpes simplex, outros vírus herpes, papovavirus, poxvirus, picornavírus, adenovírus, rinovírus, vírus da leucemia humana de células T do tipo I, ou vírus da leucemia humana de células-T do tipo II, ou vírus da leucemia humana de células-T do tipo III .

Os nomes alternativos da infeção virai respiratória superior são, constipação comum e constipações. Esta é uma 12 ΕΡ1663110Β1 infeção virai contagiosa das vias respiratórias superiores, caracterizada por uma inflamação das membranas mucosas, espirros, e garganta dorida. Esta é geralmente causada por mais de 200 tipos diferentes de virus, conhecidos como os rinovírus. As constipações não são causadas pelos mesmos virus responsáveis pela gripe. As constipações são transmitidas através das goticulas da tosse ou dos espirros de outras pessoas constipadas ou por contacto das mãos com objetos contaminados por alguém constipado. A incidência das constipações é mais elevada entre as crianças, e a incidência diminui com a idade porque a imunidade ao virus que causa a constipação ocorre após a doença. Gradualmente, a imunidade a uma grande variedade de vírus que causam as constipações é desenvolvida nos adultos. As crianças podem ter 10 constipações por ano, e os adultos podem ter 3 constipações por ano.

Os centros para controlo e prevenção de doenças dos Estados Unidos estimaram que a incidência média anual de infeções das vias respiratórias superiores (IVRS) nos Estados Unidos é de 429 milhões de casos, resultando em mais de 2,5 milhares de milhões de dólares dos estados unidos em custos de saúde diretos e indiretos. A constipação comum é mais frequentemente causada por uma das várias centenas de rinovírus (52%) , mas os coronavírus (8%) ou o vírus sincicial respiratório (7%) também podem conduzir à infeção. Outros virus, como influenza (6%), parainfluenza e adenovírus, podem produzir sintomas respiratórios, mas estes são frequentemente associados à pneumonia, à febre ou aos arrepios.

As constipações ocorrem com um padrão sazonal, que geralmente começa em meados de setembro e termina do final de abril ao início de maio. A constipação comum é bastante 13 ΕΡ1663110Β1 contagiosa e pode ser transmitida por contacto de pessoa para pessoa ou por goticulas dispersas no ar. Os sintomas respiratórios superiores, geralmente, começam entre 1 a 2 dias após a exposição e, geralmente, duram entre 1 a 2 semanas, embora a disseminação virai e o contágio possam continuar por 2 a 3 semanas. Os sintomas podem persistir com a ocorrência de complicações como a sinusite ou, envolvendo as vias respiratórias inferiores, tais como a bronquite ou a pneumonia. A constipação comum tem uma variedade de sintomas evidentes, incluindo mal-estar, congestão nasal, rinorreia, tosse não produtiva, garganta dorida ligeiramente e em alguns casos, uma febre baixa. Devido à similaridade dos sintomas, uma constipação pode ser confundida com a rinite alérgica perene, mas as alergias podem geralmente ser excluídas dada as diferenças de cronicidade.

Se um paciente se apresenta com uma IVRS virai, o espectro de remédios é extenso. Como a maioria destas infeções são auto limitantes, os médicos costumam recomendar repouso e fluidos, mas outros tratamentos incluem terapias ambientais e nutricionais, produtos de descongestionamento e anti-histaminicos, de venda livre e indivíduos a receita médica, novas formulações nasais de anti-histaminicos e anticolinérgicos, e antibióticos. A tabela 1 lista os medicamentos usados normalmente, para a tosse e a constipação, e os seus efeitos secundários. 14 ΕΡ1663110Β1

Tabela 1. Um perfil dos medicamentos comuns para a tosse e _para a constipação e os seus efeitos secundários_

Medicação Objetivo Efeitos secundários e considerações especiais Agonistas beta 2 em aerossol (por exemplo, albuterol) Reverter os broncospasmos pós- inflamatórios Aumenta a frequência cardíaca e pode causar tremores Produtos combinados líquidos à base de álcool Tratar múltiplos sintomas Problemas potenciais de sonolência e coordenação Agonistas alfa 1 (via oral) (por exemplo, pseudoefedrina, fenilpropanolamina) Descongestionam ento Pode causar taquicardia, nervosismo, estimulação transitória, tonturas, sonolência, elevação da pressão arterial Compostos anticolinérgicos: brometo de ipratrópio (aplicação tópica) Secagem Pode causar secura nasal e epistaxe ocasional Outros anticolinérgicos (por exemplo, metescopolamina, atropina, hiosciamina) Secagem Pode causar hipotensão ortostática, disfunção da regulação do calor, boca seca, constipação Anti-histamínicos (via oral) (por exemplo, clorfeniramina, difenidramina) Secagem Sonolência, boca seca, hipertensão ortostática Cápsulas de benzonatato Supressão da tosse, anestesia local Mastigar pode entorpecer a boca, pode causar sedação, tonturas Codeína, hidrocodona Supressão da tosse Sonolência, obstipação, náuseas 15 ΕΡ1663110Β1

Dextrometorfano Supressão da tosse Possível sonolência, mas efeitos secundários pouco frequentes Guaifenesina Promover a expetoração (fluidificação do muco) Sem efeitos secundários, deve ser tomado com muita água para melhorar a eficácia Descongestionantes tópicos (por exemplo, oximetazolina, fenilefrina) Descongestionam ento Queimadura local, utilização prolongado pode causar dependência Pastilhas de zinco e de vitamina C Possível redução na severidade e duração dos sintomas Possível alteração do paladar, aumento de cálculos de oxalato se suscetível

Resumo do endereço

http://www.physsportsmed.com/issues/1998/02feb/swain.htm A utilização do interferão supercomposto para prevenir ou tratar a IVRS

Cerca de 70~80% das IVRS são causadas por vírus, tais como o vírus sincicial respiratório, o adenovírus, o rinovírus, o vírus coxsackie, o coronavírus e a suas variantes, o vírus da gripe A e a suas variantes, o vírus da gripe B e as suas variantes, o vírus parainfluenza e a suas variantes, ou enterovírus e a suas variantes. Uma das principais causas da IVRS em adultos é o rinovírus. Para as crianças, o vírus sincicial respiratório e o vírus parainfluenza são duas das principais causas de IVRS. 16 ΕΡ1663110Β1 0 interferão supercomposto desempenha um papel importante na luta contra os vírus que causam a IVRS. 0 interferão supercomposto ganha os seus efeitos antivirais principalmente através de dois mecanismos: 1. Ligando-se à superfície de células sensíveis e induzindo-as a produzir a proteína antivírus, em seguida, bloquear a duplicação e reprodução do vírus in vivo. 2. 0 interferão supercomposto pode ajustar a resposta imunitária, incluindo a resposta imunitária das células T, a atividade das células NK, a função de fagocitose do monokaryon, e mesmo a formação de alguns anticorpos in vivo.

No tratamento para a IVRS, o interferão supercomposto pode ser aplicado diretamente à área afetada por meio de uma inspiração de nebulizador. Este método de tratamento permite o interferão de atingir as células alvo diretamente. Consequentemente comercializar o fornecimento na forma de nebulizador, em vez da via oral ou injeção, seria mais seguro e mais eficaz para administrar o interferão.

Utilização do interferão supercomposto para prevenir ou tratar a SRA A distribuição do interferão supercomposto começou em maio de 2003, com o consentimento do grupo de trabalho de Sichuan para a prevenção e o controlo de SRA. O nebulizador do interferão supercomposto foi distribuído pelos médicos e enfermeiros em hospitais, por áreas povoadas com um alto risco de SRA, e pelo grupo de investigação nacional para a prevenção e o controlo da SRA. Entre os 3.000 usuários a 17 ΕΡ1663110Β1 partir de 19 de dezembro de 2003, não houveram comunicados de nenhuns efeitos secundários relacionados com a utilização do nebulizador. Além disso, nenhum dos médicos nem dos enfermeiros, nenhuma das pessoas da província de Sichuan, ou de outras organizações que têm utilizado o nebulizador do interferão supercomposto, foram infetados pela SRA.

Por conseguinte, esta invenção proporciona um método para a inibição, a prevenção ou o tratamento da replicação do vírus ou das células infetadas por vírus, por contacto do dito vírus ou das células infetadas com uma quantidade eficaz de interferão supercomposto, como definido anteriormente.

Este interferão supercomposto é útil para a inibição, prevenção ou tratamento dos seguintes cancros ou tumores:

Cancro de pele Carcinoma das células basais Melanoma maligno Carcinoma de células renais cancro do fígado cancro de tiroide Cancro rinofaringe Carcinoma sólido Cancro da próstata Cancro do estômago/abdominal Cancro do esófago Cancro do reto Cancro do pâncreas Cancro da mama Cancro do ovário e cancro da bexiga superficial Hemangioma Carcinoma epidermoide Cancro do colo do útero Cancro do pulmão de não-pequenas células Cancro do pulmão de pequenas células 18 ΕΡ1663110Β1

Glioma Doença maligna de Hemal Leucocitose Leucocitose aguda Leucocitose crónica Leucemia mielocítica crónica Leucemia de células pilosas Linfadenoma Mieloma múltiplo Policitemia Vera Outros Sarcoma de Kaposi

Paciente ns 1. Uma paciente com cancro do ovário começou a receber injeções. Ela recebeu injeções de 15 pg a 14 de julho, 16 de julho, 18 de julho, 20 de julho e 22 de julho. A 14 de julho, foram observados 2000 ml de liquido peritoneal. A paciente foi submetida a quimioterapia a 22 de julho. A 3 de agosto, o peritoneu da paciente foi aberto. Esperava-se encontrar 21 de fluido, mas foram observados apenas 200 ml de fluido. O ovário direito e esquerdo e os gânglios linfáticos estavam cancerosos. Todos os outros órgãos não foram afetados.

Paciente ns 2. Um paciente com cancro renal foi tratado da seguinte maneira. Num período de meio mês, o paciente recebeu três injeções de 9 pg de rSIFN-co e 3 injeções de 15pg de rSIFN-co. No primeiro mês completo após essas injeções, ele recebeu injeções de 9 pg e 15 pg de rSIFN-co de dois em dois dias. A biópsia renal não mostrou metástase após este regime de tratamento. O paciente mostrou uma recuperação completa. Cada semestre, após a recuperação, o paciente recebeu injeções de 15mg de rSIFN-co 15 vezes ao longo de um período de um mês.

Portanto, esta invenção fornece um método para a inibição do crescimento de células tumorais ou cancerosas, por contacto o interferão supercomposto como definido anteriormente, com as ditas células tumorais ou cancerosas. 19 ΕΡ1663110Β1

Numa outra realização, o interferão supercomposto inibe a duplicação do ADN e a secreção do HBsAg e do HBeAg do vírus da hepatite B.

Esta invenção também fornece os códigos de genes artificiais para o interferão de supercomposto. Conceber um gene artificial reentra da perícia geral. Muitos métodos para a criação de sequências de nucleótidos e outras técnicas de biologia molecular têm sido descritos anteriormente. Veja-se por exemplo, Joseph Sambrook and David W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, de dezembro de 2000, publicado por Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Esta invenção fornece um vetor que compreende a sequência polinucleotídica mostrada na figura 1, que codifica para o interferão supercomposto como definido anteriormente.

Esta invenção fornece um sistema de expressão que compreende o vetor, tal como definido anteriormente. As células incluem, mas não estão limitadas a, células procarióticas ou eucarióticas.

Esta invenção também fornece uma célula hospedeira que compreende o vetor, tal como definido anteriormente.

Esta invenção fornece um processo para a produção do interferão supercomposto recombinante, tal como definido anteriormente, que compreende a introdução da sequência polinucleotídica mostrada na figura 1, com a preferência de codões selecionados para E. coli hospedeira, fazendo a cultura do dito hospedeiro introduzido, em condições adequadas para a expressão do dito interferão composto e fazendo a colheita do interferão composto expresso. 20 ΕΡ1663110Β1 0 processo pode compreender a extração do interferão supercomposto a partir do meio da fermentação, a recolha do corpo de inclusão, a desnaturação e renaturação da proteína colhida. A alta eficácia do processo pode ser mantida, mesmo quando o interferão supercomposto é utilizado com um agente e a uma concentração específica. 0 processo também compreende a separação e a purificação do interferão supercomposto. 0 processo compreende ainda a liofilização do interferão supercomposto purificado. 0 processo compreende a produção da injeção líquida do interferão supercomposto.

Esta invenção também fornece o interferão supercomposto produzido pelos processos anteriores.

Esta invenção fornece uma composição que compreende o interferão supercomposto recombinante, como definido anteriormente e um portador adequado.

Esta invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende o interferão supercomposto recombinante, como definido anteriormente e um portador farmaceuticamente aceitável.

Esta invenção fornece um método para o tratamento ou prevenção de doenças virais ou de tumores num indivíduo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de interferão supercomposto, como definido anteriormente.

Esta invenção fornece o método descrito anteriormente, em que as doenças virais incluem, mas não estão limitadas a, hepatite A, hepatite B, hepatite C, outros tipos de 21 ΕΡ1663110Β1 hepatites, infeções virais causadas por vírus de Epstein-Barr, citomegalovírus, vírus herpes simplex, ou outros tipos de vírus herpes, papovavírus, poxvírus, picornavírus, adenovírus, rinovírus, vírus da leucemia humana de células T do tipo I, ou de vírus da leucemia humana de células-T do tipo II, ou de vírus da leucemia humana de células-T do tipo III.

Esta invenção fornece o método descrito anteriormente, em que o interferão supercomposto foi administrado por via oral, via intravenosa, via intramuscular, via intraperitoneal, injeção subcutânea, administração nasal ou mucosal, ou por inalação por meio de um inalador.

Esta invenção fornece o método descrito anteriormente, em que o interferão supercomposto foi administrado seguindo o protocolo de injeções de 9 yg ou 15 yg de dois em dois dias, três vezes por semana, durante 24 semanas.

Foi surpreendente descobrir que o rSIFN-co, do qual foi alterada a estrutura espacial, não só é uma preparação para inibir a duplicação do ADN da hepatite B, mas também para inibir a secreção do HBsAg e do HBeAg em células 2.2.15.

Um objetivo desta invenção é proporcionar uma preparação do rSIFN-co para inibir diretamente a duplicação do ADN dos vírus da hepatite B e a secreção do HBeAg e do HBsAg da hepatite B, e de as diminuir até aos níveis normais.

Numa realização, o rSIFN-co foi produzido com técnicas recombinantes. Com a condição da sequência de aminoácidos fixa, o ADN do IFN foi reconcebido de acordo com a utilização de codões de E. coli, em seguida, o gene do 22 ΕΡ1663110Β1 rSIFN-co foi sintetizado artificialmente. 0 ADNc do rSIFN-co foi clonado no vetor de alta expressão de E. Coli, por técnicas de recombinação de ADN, e uma alta expressão de rSIFN-co foi adquirida, utilizando o mecanismo de indução/ ativação da L-arabinose para ativar a transcrição do promotor P Bad.

Em comparação com a indução térmica comum, os sistemas de indução de pH e de indução de IPTG da engenharia genética, o sistema de indução/ativação da arabinose tem algumas vantagens: (1) os sistemas comuns aliviam a função do promotor criando um padrão de "desrepressão". Os promotores induzem então, a expressão de genes a jusante. As alterações de temperatura e de pH e a adição de IPTG não podem ativar os promotores diretamente. No sistema aqui divulgado, a L-arabinose, não só desativa e reprime, mas também ativa, a transcrição do promotor PBAD, o qual induz uma alta expressão do rSIFN-co. Por conseguinte, o sistema de indução/ativação da arabinose é um sistema de expressão mais eficaz. (2) A relação entre a dosagem de exógeno e de L-arabinose é linear. Isto significa que a concentração de arabinose pode ser alterada para ajustar o nível de expressão do gene exógeno. Portanto, é mais fácil de controlar o nível de expressão do gene exógeno em E. coli por arabinose, do que pela alteração da temperatura e do valor de pH. Esta característica é importante para a formação de corpos de inclusão. (3) A L-arabinose é versátil, barata e segura, o que pelo contrário, são as desvantagens de outros indutores, tais como o IPTG.

Esta realização cria uma estirpe de engenharia de E. coli, que exprime o rSIFN-co, eficaz e resistente, com um sistema de indução/ativação da L-arabinose. A estirpe é cultivada e fermentada sob condições adequadas para colher os corpos bacterianos. Os corpos de inclusão são, em 23 ΕΡ1663110Β1 seguida purificados, depois de destruir as bactérias e de lavar repetidamente. 0 resultado final, a massa de alta pureza, a proteína do rSIFN-co com a configuração espacial alterada para esta invenção e para o tratamento clínico, foi adquirido a partir da desnaturação e renaturação de corpos de inclusão e de uma série de etapas de purificação.

As seguintes são algumas preparações do rSIFN-co: comprimidos, cápsulas, líquidos para consumo oral, pastas, injeções, nebulizadores, supositórios e soluções. As injeções são recomendadas. É comum injetar o medicamento subcutaneamente ou intravenosamente. 0 portador do medicamento poderia ser qualquer portador de medicamento aceitável, incluindo carboidratos, cellulosum, adesivo, colapso, emoliente, enchimento, agente que se dissolve por adição, amortização, conservante, agente espessante, emparelhamento, etc.

Esta invenção também fornece uma composição farmacêutica que compreende a composição anterior e um portador farmaceuticamente aceitável.

Para os objetivos desta invenção, "portadores farmaceuticamente aceitáveis" significa qualquer dos portadores farmacêuticos padrão. Exemplos de suportes adequados são bem conhecidos na tecnologia e podem incluir, mas não estão limitados a, qualquer um dos portadores farmacêuticos padrão, tal como uma solução salina tamponada com fosfato e vários agentes molhantes. Outros portadores podem incluir aditivos utilizados na forma de comprimidos, grânulos, cápsulas, etc. Tipicamente, tais portadores contêm excipientes tais como o amido, o leite, o açúcar, certos tipos de argila, a gelatina, o ácido esteárico ou os seus sais, estearato de magnésio ou de cálcio, talco, gorduras vegetais ou óleos, gomas, glicóis ou outros 24 ΕΡ1663110Β1 excipientes conhecidos. Tais portadores podem também incluir aditivos de aroma e cor ou outros ingredientes. As composições que compreendem tais portadores são formuladas por métodos convencionais bem conhecidos.

Esta invenção fornece um método para prevenir ou tratar a sindrome respiratória aguda, ou doenças respiratórias superiores induzidas por vírus, de um indivíduo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de interferão supercomposto recombinante, como definido anteriormente.

Numa realização do método anterior, o interferão é a, β ou ω. 0 interferão anteriormente pode intravenosa, via supercomposto, tal como definido ser administrado por via oral, via intramuscular, via intraperitoneal, injeção subcutânea, administraçao nasal ou mucosal, ou por inalação por meio de um inalador.

Numa realizaçao, o interferão é emitido por um dispositivo de nebulização.

Numa realização específica, o dispositivo é descrito na figura 7.

Numa das realizações, o interferão é liofilizado.

Esta invenção fornece um método para inibir o agente causador da sindrome respiratória aguda, ou de doenças respiratórias superiores induzidas por vírus, que compreende o contacto do agente com uma quantidade eficaz de interferão supercomposto, como definido anteriormente. 25 ΕΡ1663110Β1

Foi determinado que o agente que causa a doença é um virus. Ver, por exemplo Rota et al., (2003), Characterization of a Novel Coronavirus Associated with Severe Acute Respiratory Syndrome. Science 1085952 www.sciencexpress.org e Marra et al., (2003), The Genome Sequence of the SARS-Associated Coronavirus. Science 1085853 www.sciencexpress.org.

Esta invenção também fornece um método para inibir o virus da sindrome respiratória aguda ou células infetadas pelo virus da sindrome respiratória aguda grave, ou doenças respiratórias superiores induzidas por virus ou células infetadas com virus capazes de induzir doenças respiratórias superiores, que compreende por em contacto uma quantidade eficaz de interferão supercomposto, como definido anteriormente, com o dito virus ou célula. Este contato pode ser direto ou indireto.

Esta invenção fornece uma composição que compreende uma quantidade eficaz de interferão supercomposto, tal como definido anteriormente, capaz de inibir o vírus da sindrome respiratória aguda ou células infetadas pelo virus da sindrome respiratória aguda grave, ou doenças respiratórias superiores induzidas por virus ou células infetadas com vírus capazes de induzir doenças respiratórias superiores, e um portador adequado.

Esta invenção fornece uma composição que compreende uma quantidade eficaz de interferão supercomposto, tal como definido anteriormente, capaz de prevenir ou tratar a sindrome respiratória aguda, ou doenças respiratórias superiores induzidas por vírus, de um indivíduo e um portador adequado.

Esta invenção fornece uma composição farmacêutica que 26 ΕΡ1663110Β1 compreende uma quantidade eficaz de interferão supercomposto, tal como definido anteriormente, capaz de inibir o virus da sindrome respiratória aguda ou células infetadas pelo virus da sindrome respiratória aguda grave, ou doenças respiratórias superiores induzidas por virus, e um portador farmaceuticamente aceitável.

Esta invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade eficaz de interferão supercomposto, tal como definido anteriormente, capaz de prevenir ou tratar a sindrome respiratória aguda, ou doenças respiratórias superiores induzidas por virus, de um indivíduo e um portador farmaceuticamente aceitável. A presente invenção fornece um dispositivo para administrar a composição farmacêutica descrita anteriormente.

Numa realização preferida, o indivíduo é um ser humano. Como pode ser facilmente apreciado, o interferão supercomposto, tal como definido anteriormente, pode ser utilizado noutros animais ou mamíferos.

Esta invenção fornece um método para a prevenção da sindrome respiratória aguda ou de doenças respiratórias superiores induzidas por vírus, em seres humanos, compreendendo a aplicação do interferão supercomposto como definido anteriormente, três vezes por dia através de um nebulizador que contém vinte microgramas de interferão, igual de dez milhões de unidades de atividade em três mililitros.

Esta invenção será mais bem compreendida a partir dos exemplos que se seguem. No entanto, um perito na tecnologia apreciará rapidamente que os métodos e os resultados 27 ΕΡ1663110Β1 específicos discutidos ilustram meramente a invenção, como descrito mais completamente nas reivindicações que seguem depois. DETALHES EXPERIMENTAIS EXEMPLO 1 0 rSIFN-co é uma nova molécula de interferão construído de acordo com os aminoácidos conservativos do subtipo de IFN-α humano utilizando métodos de engenharia genética. Foi provado que o rSIFN-co tem atividades de IFN de largo espectro, tais como a alta atividade antiviral e de inibição de tumores, especialmente para o tratamento eficaz da hepatite C. 0 codão de E. coli foi utilizado para reconceber o ADNc do rSIFN-co e depois para sintetizar artificialmente o ADNc do rSIFN-co a partir de sequências de ADN do rSIFN-co publicadas e de sequências de aminoácidos deduzidas (figura D . A fim de obter a proteína do rSIFN-co pura, o ADN do rSIFN-co foi clonado no vetor de expressão elevada de E. coli, e a L-arabinose, que pode ativar o promotor PBad forte em vetores, foi utilizada para induzir a expressão elevada do gene do rSIFN-co. Síntese da sequência do ADNc de E. coli Reconcepção da sequência do ADNc do rSIFN-co 0 ADNc do rSIFN-co foi reconcebido de acordo com a utilização de codões de E. Coli, para alcançar uma expressão elevada em E. coli. A sequência de aminoácidos deduzida, a partir da sequência do ADNc do rSIFN-co 28 ΕΡ1663110Β1 reconcebida, coincide completamente com a sequência de aminoácidos primitiva do rSIFN-co publicado (figura 1). Síntese da sequência do ADNc do rSIFN-co Síntese semi molecular da extremidade 5' e da extremidade 3' do ADNc do rSIFN-co

Duas semi moléculas podem ser diretamente sintetizadas: a extremidade 5' do ADNc do rSIFN-co de 280 pb (fragmento I) e a extremidade 3' de 268 pb (fragmento II) por PCR. Há 41 pb que se sobrepõem entre o fragmento II e o fragmento I. (1) O fragmento de oligodesoxinucleótido de síntese química:

Oligómero A: 5'atgtgcgacctgccgcagacccactccctgggtaaccgtcgtgctctgatcctgctggctca GATGCGTCGTATCTCCCCGTTCTCCTGCCTGAAAGACCGTCACGAC3'

Oligómero B:

5' CTGAAAGACCGTCACGACTTCGGTTTCCCGCAGGAGAGGTTCGACGGTAACCAGTTCCAGA AGCTCAGGCTATCTCCGTTCTGCACGAAATGATCCAGCAGACCTTC3’

Oligómero C: 5'GCTGCTGGTACAGTTCGGTGTAGAATTTTTCÇAGCAGGGATTCOTCCCAAGCAGCGGAGGAG TCTTTGGTGGAGAACAGGTTGAAGGTCTGCTGGATCATTTC3'

Oligómero D: 5 1ATCCCTGCTGGAAAAATTCTACACCGAACTGTACCAGCAGCTGAACGACCTGGAAGCTTGCG TTATCCAGGAAGTTGGTGTTGAAGAAACCCCGGTGATGAAC3·

Oligómero E: 5' GAAGAAACCCCGCTGATGAACGTTGACTCCATCCTGGCTGTTAAAAAATACTTCCAGCGTAT CACCCTGTACCTGACCGAAAAAAAATACTCCCCGTGCGCTTGGG3 ’

Oligómero F: 29 ΕΡ1663110Β1

5' TTATTCTTTACGACGCAGACGTTCCTGCAGGTTGGTGGACAGGGAGAAGGAACGCATGATTT A PCR I para o fragmento I: oligodesoxinucleótido B como modelo, oligodesoxinucleótidos A e C como iniciadores, fragmento I de 280 pb sintetizado. _Mistura para a PCR I (unidades: μΐ)_ água destilada esterilizada 39 tampão de 10* Pfu (Stratagen American Ltd.) 5 mistura de dNTP (concentração de dNTP, 2,5 mmol/1) 2 iniciador de oligómero A (25 pmol/l) 1 iniciador de oligómero C (25 ymol/l) 1 modelo de oligómero B (1 pmol/l) 1

Polimerase do ADN de Pfu (Stratagen American Ltd.) (25 1ϋ/μΐ)_ _Volume total_50 μΐ PCR, ciclo: 95 I 2 m -> (95°C 45 s -> 65°C 1 m -> 72°C 1 m) x 25 ciclos -> 72 °C 10 m -> 40C oligodesoxinucleótido E D e F como iniciadores, A PCR II para o fragmento II: como modelo, oligodesoxinucleótidos Fragmento II de 268 pb sintetizado. 30 ΕΡ1663110Β1

Mistura para a PCR II (unidades: μΐ) água destilada esterilizada 39 tampão de 10x Pfu (Stratagen American 5

Ltd.) mistura de dNTP (concentração de dNTP, 2,5 2 mmol/1) iniciador do oligómero D (25 pmol/l) 1 iniciador do oligómero F (25 pmol/l) 1 modelo do oligómero E (1 ymol/l) 1 polimerase do ADN de Pfu (Stratagen 1

American Ltd.) (25 U/μΙ)

Volume total 50 μΐ

Ciclo de PCR: o mesmo que da PCR I_

Montagem do ADNc do rSIFN-co

Os fragmentos I e II foram montados em conjunto para obter a sequência molecular completa do ADNc do rSIFN-co utilizando o método de PCR de sobreposição e de extensão. As enzimas de restrição Nde I e Pst I foram introduzidas para clonar a sequência do ADNc do rSIFN-co no plasmideo. (1) Os oligonucleótidos iniciadores de sintese química Oligómero G: 5'ATCGGCCATATGTGCGACCTGCCGCAGACCC3'

Oligómero H: 5'ACTGCCAGGCTGCAGTTATTCTTTACGACGCAGACGTTCC3' (unidades: μΐ) 38 5 2 1 1 1 1 1 50 μΐ (2) A PCR de sobreposição e de extensão Mistura para a PCR água destilada esterilizada tampão de 10* Pfu (Stratagen americana Ltd.) mistura de dNTP (concentração de dNTP de 2,5 mmol/1) iniciador G (25 pmol/l) iniciador H (25 pmol/l) * preduction do fragmento I (1 pmol/l) * preduction do fragmento II (1 pmol/l) ADN-polimerase Pfu (Stratagen American Ltd.) (2,5 U/μΙ)

Volume total 31 ΕΡ1663110Β1

* Separar e purificar o produto da PCR com o kit de purificação para PCR, StrataPrep, produzido pela Stratagen American Ltd. e dissolver em água destilada esterilizada. Ciclo de PCR: o mesmo gue da PCR I

Análise de sequência e clonagem do gene do rSIFN-co 0 plasmideo pLac T7 como vetor de clonagem. 0 plasmideo pLac T7 é reconstruído com o plasmideo pBluescript II KS(+) produzido por Stratagen (figura 3). A produção de ADNc do rSIFN-co por PCR, purificada com o kit de purificação de PCR da StrataPrep. Digerir o ADNc e o plasmideo pLac T7 com Ndel e PstI. Executar a eletroforese em gel de agarose a 1% e separar estes fragmentos de ADN de dupla digestão. Recuperar o fragmento do ADN do rSIFN-co de 507 pb e o fragmento do ADN do plasmideo de 2,9 kb. Ligar estes fragmentos com ligase de ADN T4, para formar um plasmideo recombinante. Transformar as células competentes DH5a (Gibco) com o plasmideo recombinante, cultura a 37°C durante a noite. Identificar a colónia recombinante positiva, chamada pHY-1.

Executar a sequenciação de ADN com SequiTherm™ Cycle Sequencing Kit produzido pela American Epicentre Technologies Ltd., utilizando Ll-COR modelo 4000L. Os iniciadores são T7 e T3, iniciadores de sequência comuns, o resultado da sequenciação de ADN corresponde ao concebido teoricamente.

Purificar o rSIFN-co, sequenciar os aminoácidos da extremidade N, a sequência de aminoácidos da extremidade N coincide com a concebida experimentalmente, que é como se segue: 32 ΕΡ1663110Β1 N- Cys-Asp-Leu-Pro-Gln-Thr-His-Ser-Leu-Gly-Asn-Arg-Arg-Ala-Leu-

Construção, transformação, identificação, e estabilidade hereditária do vetor de expressão

Construção e transformação do vetor de expressão 0 vetor de expressão pHY-4 de E. coli, digerido (veja-se a figura 3) com a Nde I para linearizar e subsequentemente digerir com a Xba I. Executar a eletroforese em gel de agarose, 1%, e purificar o fragmento de 4,8 kb do pHY-4, resultante da digestão com Nde I e Xba I, com o QIAEX II kit produzido pela QIAGEN Germany Ltd.

Ao mesmo tempo, o plasmídeo do pHY-4 é digerido duplamente com Nde I e Xba I. Executar a eletroforese em gel de agarose, 1%, e purificar o fragmento de 715 pb. Ligar os fragmentos do rSIFN-co e do pHY-4 com ligase de ADN T4 para construir o plasmídeo recombinante (veja-se a figura 4) . Transformar as células competentes DH5a com o plasmídeo recombinante. Espalhar as células transformadas na placa LB com Amp, cultivar a 37°C durante a noite.

Rastreio da estirpe de clonagem positiva

Escolher aleatoriamente colónias de E. coli da placa LB anterior, rastrear as estirpes positivas, que contêm o vetor recombinante, por digestão com endonuclease e análise por PCR. Nomear um dos plasmídeos recombinantes positivos, como pHY-5, e nomear a estirpe que contém o plasmídeo pHY-5, como PVIII. Amplificar e armazenar a estirpe positiva em glicerol a -80°C. 33 ΕΡ1663110Β1

Alta expressão do gene do rSIFN-co em E. coli

No plasmídeo pHY-5, o gene do rSIFN-co está sob o controlo de um promotor forte o Pbad· Este promotor é regulado positivamente e negativamente pelo produto do gene araC. 0 araC é um regulador transcricional, que forma um complexo com a arabinose. Na ausência de arabinose, o dimero de araC liga-se em 02 e li, formando um anel de 210 pb. Esta conformação leva à inibição completa da transcrição. Na presença de arabinose o dimero é libertado em 02 e liga-se em l2 e I2, levando à transcrição. A ligação da arabinose desativa, reprime, e até ativa a transcrição do promotor PBad, que estimula o Pbad, induzindo a alta expressão do rSIFN-co. O nivel de expressão do rSIFN-co em PVIII é mais do que 50% do total de proteínas em E. coli.

Sumário O rSIFN-co é uma nova molécula de interferão construída artificialmente de acordo com os aminoácidos conservativos num subtipo de IFN-α humano. Foi provado ser um medicamento anti-hepático eficaz. A fim de obter uma quantidade suficiente de proteína do rSIFN-co pura, foi construída uma estirpe de E. coli recombinante estável, que expressa altamente a proteína do rSIFN-co.

Em primeiro lugar, de acordo com a sequência de aminoácidos do rSIFN-co, publicada, o codão de E. coli foi utilizado para sintetizar a totalidade do ADNc do rSIFN-co. Este fragmento de ADN foi sequenciado, provando que a sequência de codões de 501 pb e a sequência do codão terminal TAA são válidas e idênticas às concebidas teoricamente. Uma análise posterior revelou que a sequência de aminoácidos da extremidade N e a composição de aminoácidos do rSIFN-co, produzido pela estirpe 34 ΕΡ1663110Β1 recombinante, eram ambas idênticas às previstas. O ADNc do rSIFN-co foi clonado no vetor de alta expressão de E. Coli, o plasmideo pHY-4, para construir o plasmideo recombinante pHY-5. A estirpe LMG194 de E. coli foi ainda transformada com o plasmideo PHY-4, para obter o transformante de alta expressão do rSIFN-co, estável. Este transformante foi cultivado durante 30 gerações. A hereditariedade do plasmideo recombinante PHY-5 em LMG194 de E. coli era normal e estável, e a expressão do rSIFN-co foi alta e constante. A LMG194 de E. coli, que contém o plasmideo recombinante pHY-5, é na verdade uma estirpe de engenharia de alta expressão, ideal.

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Press, Cold Spring Harbour, NY. 1989. 10. Guzman, L. M et al.: Tight regulation, modulation, and high-level express-ion by vectors containing the arabinose PBAD promoter. J. Bacteriol. 1995, 177 : 4121-4130. 36 ΕΡ1663110Β1 SEQUÊNCIA DO ADNc do rSIFN-co CONCEBIDA DE ACORDO COM A UTILIZAÇÃO DE CODÕES de E. coli E A SEQUÊNCIA DOS AMINOÁCIDOS DO rSIFN-co DEDUZIDA 5' 11 21 31 41 51

+1MCD LPQTHSL GNR RALI LLA

1 ATGTGCGACC TGCCGCAGAC CCACTCCCTG GGTAACOGTC GTGCTCTGAT GCTGCTGGCT

TACACGCTGG ACGGOGTCTG GGTGAGGG AC OCATTGGCAG CACGAGACTA GGACG ACCGA 5' 71 81 91 101 111

+1QMR RI SP FSC LKD RHDF GFP 61 CAGATGCGTC GTATCTCCCC GTTCTCCTGC CTGAAAGACC GTCACGACTT CGGTTTCCCG GTCTACGCAG CATAGAGGGG CAAGAGGACG GACTTTCTGG CAGTGCTGAA GCCAAAGGGC 5’ 131 141 151 161 171 ·

+1 QEEFDONQFQKAQ AISVLHE 121 CAGGAAGAAT TCGACGGTAA CCAGTTCCAG AAÁGCTCAGG CTATCTCCGT TCTGCACGAA GTCCTrCTTA AGCTGCCATT GGTCAAGGTC TTTCGAGTCC G ATAGAGGCA AGACGTGCTT 5* 191 201 211 221 231

+1 MIQ-QTFN LFS TKD SSAA WDE 181 ATGATCCAGC AGACCTTCAA CCTGTTCTCC ACC AAAGACT CCTCCGCTGC TTOGGACGAA TACTAGGTCG TCTGGAAGTT GGACAAGAGG TGGTTTCTGA GGAGGCGACG AACCCTGCTT 5’ 251 261 27 1 281 291

+1 SLLEKFYTELYQQLNDLÉAC 241 TCCCTGCTGG AAAAATTCTA CACCGAACTG TACCAGCAGC TGAACGACCT GGAAGCTTGC AGGOACGACC T.TTTTAAGAT GTGGCTTOAC ATGGTCGTCG ACTTGCTGGA CCTTCGAACG 5’ 311 . 321 . 331 341 ! 3-51

+1V IQ EVGV-EETPLMN V D S I LA 301GTTATCCAGG AAGTTGGTGT TGA AGAAACC CCGCTGATGA ACGTTGACTC CATCCTGGCT CAATAGGTCC TTCAACCACA ACTTCTTTGG GGCGACTACT TGCA ACTGAG GTAGGACCGA 37 ΕΡ1663110Β1 5’ 371 ti. 381 / ' 39Í 401 ' 411

+1 V K K Y- P' Q R I T h Y 1 T E K K Y S P C' . '

361 ΟΤΓΑΛΑΑΑΑΤ ACTTCCAGCGfATC ACCCTCrTACCTOACCG AAAÂAÂAATA CTCCCCGIGC CAATTTTTTA mUGGTCGC ATAGTGGGAC AtGGACTGGC TrTTTTTTATGAGGGGCACG 5' 431 441 451 461 471

+1A WEVV RAE IMRSF S L S T N L

Q 421GCTTGGGAAG TTGTTCGTGG TGAAATCATG CGTTCCTTCT CCCTGTCCAC CAACCTGCAG CGAACCCTTC AACAAGCACG ACTTTAGTAC GCAAGGAAGA gggacaggtg gttggacgtc 5' 491 501 +1 ERL RRKE #

481 GAACGTCTGC GTOGTAAAGA ATAA CTTGCAGACG CAGCATTTCT TATT EXEMPLO 2 A separação e purificação do rSIFN-co 1. Fermentação

Inocular a estirpe recombinante em meio LB, agitando (200 rpm) a 37°C durante a noite (aproximadamente 18 horas), em seguida, adicionar 30% de glicerol ao meio da fermentação para obter uma concentração final de 15%, atribuir a um tubo de 1 ml e manter a -20 °C, tal como semente para a produção.

Adicionar 1% da semente ao meio LB, agitando (200 rpm) a 37°C durante a noite, para aumentar a escala da semente, em seguida, adicione ao meio RM com uma proporção de 10%, cultivando a 37°C. Adicionar arabinose (solução a 20%) a 0,02%, como um indutor quando a OD600 atinge cerca de 2,0. 38 ΕΡ1663110Β1

Após 4 horas, parar o processo de cultura, recolher as bactérias por centrifugação, ressuspender o sedimento com tampão A, e manter a -20°C durante a noite. Descongelar e romper as bactérias no homogeneizador, de seguida centrifugar. Lavar o precipitado com tampão B, com tampão C, e água destilada para obter um corpo de inclusão, relativamente puro. 2. Desnaturação e renaturação

Dissolver o corpo de inclusão em guanidina-HCl (ou ureia) de 6 mol/1. A solução será um pouco turva. Centrifugar esta solução a uma velocidade de 10.000 rpm. Determinar a concentração de proteína do sobrenadante. Este sobrenadante é chamado de "solução de desnaturação". Adicionar a solução de desnaturação ao tampão de renaturação, e manter a concentração final de proteína a 0,3 mg/ml. É melhor adicionar a solução totalmente desnaturada em três etapas, em vez de uma etapa. Manter a solução durante a noite a 4°C. Posteriormente, dialisar tampão PB 10 mol/1, 5 mol/1 e água destilada, em seguida ajustar o seu pH com 2 mol/1 HAc-NaAc. Deixar descansar e depois filtrar. 3. Purificação

Cromatografia de troca aniónica POROS HS/M:

Coluna eguivalente com HAc-NaAc 20 mmol/1 (pH 5,0) l

Carregar as amostras a uma velocidade de 30 ml/min

Lavar com 20 CV de HAc-NaAc 20 mmol/1 (pH 5,0) i

Lavar com 5 CV de NaCl 0,15 mol/1 + HAc-NaAc 20 mmol/1 (pH 5, 0) 39 ΕΡ1663110Β1

Lavar com 3 CV de NaCl 0,18 mol/1 + HAc-NaAc 20 mmol/1 (pH 5,0)

I

Eluir a proteína alvo com NaCl 0,25 mol/1 + HAc-NaAc 20 mmol/1 (pH 5,0)

Quelação de fluxo rápido sepharose™: Adicionar tampão PB de 0,2 mol/1 (pH 6,6) e NaCl de 4 mol/1 à solução de HS para ajustar o pH da solução para um pH 6,0 e a concentração de NaCl para 1 mol/1.

Coluna com tampão D I

Carregar a uma velocidade de 1 ml/min

I

Lavar com tampão E I

Lavar com tampão F

I

Eluir com tampão G

Condensar a solução eluída por POROS HS/M. Por vezes, uma etapa de purificação por sephacryl S-100 pode ser adicionada para satisfazer requisitos de pureza mais rigorosos.

Nota:

Tampão A: Tris-HCl 100 mmol/1, pH 7,5 - EDTA 10 mmol/1 - NaCl 100 mmol/1

Tampão B: Tris-HCl 50 mmol/1, pH 7,5 - ureia 1 mol/1 -EDTA 10 mmol/1 - 0,5% de Triton X-100

Tampão C: Tris-HCl 50 mmol/1, pH 7,5 - ureia 2 mol/1 - 40 ΕΡ1663110Β1 EDTA 10 mmol/1 - 0,5% de Triton X-100

Tampão D: NaCl 1 mol/1 - — Na2HP04 50 mmol/1 (pH 5,5) Tampão E : NaCl 1 mol/1 - — Na2HP04 50 mmol/1 (PH 5,0) Tampão F : NaCl 1 mol/1 - — Na2HP04 50 mmol/1 (PH 4,0) Tampão G: NaCl 1 mol/1 - — Na2HP04 50 mmol/1 (pH 3, 6) Tampão de renaturação: arginina 0,5 mol/1 - Tris- 150 mmol/1, pH 7,5 - EDTA 0,2 mmol/1 Meio LB: 1 1 Triptona 10 g Extratos de levedura 5 g NaCl 10 g Meio RM: 1 1 Caseina 20 g MgCl 1 mmol/1 (0, 203 ; g) Na2HP04 4 g, KH2P04 3 g, NaCl 0,5 g NH4CI 1 g

Após a purificação, o tampão foi mudado para PBS (pH 7,0) juntamente com o da etapa de condensação por POROS HS/M. Isto é chamado de "Solução mãe da proteina". Esta pode ser utilizada diretamente na preparação de injeções ou nebulizadores, ou armazenada entre 2°C a 8°C. Fórmula para a injeção: Pó liofilizado 34,5 pg/ml 10 mmol/1

Solução

Solução de rSIFN-co 34,5 pg/ml PB (pH 7,0) 25 mmol/1 41 ΕΡ1663110Β1 Glicina 0,4 mol/1

NaCl 0,1 mol/1

Para o nebulizador:

EDTA

Tween 80 0, 01% 0, 05%

Citrato trissódico

Glicerina

Cloreto de Sódio

Fenilmetanol

HSA 10 mmo1/1 1,26% 0, 03% 0,5% 0, 1% rSIFN-co 10 pg/ml

PROCESSO DE CONTROLO DE QUALIDADE

Durante a purificação, testes do teor de proteína, da pureza da proteína, da atividade específica e pirogénico, são realizados após cada etapa. Quando a solução mãe é obtida, todos os testes elencados na tabela são feitos um após o outro. A qualidade do produto é controlada de acordo com "Chinese Requirements for Biologics". 42 ΕΡ1663110Β1 1 Solução de proteína original

Lowry

Elemento do teste Método Solução mãe da proteína: Teste do teor em proteína Lowry Teste da pureza da proteína SDS-PAGE não-redutora (eletroforese em gel de poliacrilamida-dodecil sulfato de sódio) Análise por HPLC Teste dos pesos moleculares SDS-PAGE redutora Teste da atividade específica De acordo com o método em "Specific Activity Test of Interferon" Teste de vestígios de ADN exogenético Utilizando o kit de marcação e de deteção de ADN Teste da atividade dos vestígios de antibióticos De acordo com o método em "Chemical and Other Test Methods for Biologics" Teste da endotoxina bacteriana De acordo com o Método em "Reguirements for Bacterial Endotoxin Test of Biologics" Teste para ponto isoelétrico Eletroforese de focalização isoelétrica Teste para identificar as características da proteína Espectro de UV (intervalo de comprimento de onda: 190 - 380nm) Mapeamento péptido (hidrolisado por enzima pancreática, analisados por coluna C-18) Teste de Sequência da extremidade N Teste de Sequência da extremidade C Dicroismo Circular Análise de Aminoácidos Produto semiacabado Teste da endotoxina bacteriana De acordo com o método em "Requirements for Bacterial Endotoxin Test of Biologics" 43 ΕΡ1663110Β1

Produto Verificação do aspeto Químico De acordo com o método em "Chemical and Other Test Methods for Biologics" Teste da atividade específica De acordo com o método em "Specific Activity Test of Interferon" Teste da esterilidade De acordo com o método em "c" Teste da toxicidade anormal Teste em ratinho Teste pirogénico De acordo com o método em "Requirements for Pyrogen Test of Biologics" Teste da estabilidade do produto Nota: "Chemical and Other Test Methods for Biologics", "Requirements for Pyrogen Test of Biologics" e "Requirements for Bacterial Endotoxin Test of Biologics" podem ser todos encontrados em "Chinese Requirements for Biologics." "Chinese Requirements for Biologics," PAN Zhengan, ZHANG Xinhui, DUAN Zhibing, et al., Chinese Biologics Standardization committee. Publicado por Chemical Industry Publishing Company, 2000. EXEMPLO 3

Estabilidade do pó liofilizado de injeção do interferão supercomposto recombinante

As experiências de estabilidade foram realizadas com amostras de pó liofilizado de injeção do interferão supercomposto recombinante (rSIFN-co) em duas especificações e em três lotes. As experiências começaram em abril de 2000. 1. Fonte da amostra

As amostras foram fornecidas pela Sichuan Huiyang 44 ΕΡ1663110Β1

Life-engineering Ltd., província de Sichuan. Lotes: 990101-03, 990101-05, 990102-03, 990102-05, 990103-03, 990103-05 2. Especificações da amostra

Cada amostra desta experiência deve estar em conformidade com os reguisitos indicados na tabela seguinte.

Tabela 1 Padrão de amostras da experiência

Elementos Padrões 1. Aparência pó branco solto 2. Tempo de dissolução dissolve-se rapidamente na água para injeção (até 2 minutos) à temperatura ambiente 3. Limpidez líquido incolor ou com um pouco de brilho leitoso, não deve ser turvo, nem conter impurezas ou um depósito indiscernivel 4. Valor de pH 6,5 ~ 7,5 5. Potência (Ul/dose) 80% ~ 150% da quantidade indicada (9 pg: 4,5xl06 UI, 15 pg: 7,5xl06 UI) 6. Humidade não mais do que 3,0% (p/p) 3. Conteúdo experimental

Testar as amostras a 2 ~ 8°C: As amostras do teste foram colocadas num frigorífico a 2 8°C, em seguida, foram testados os elementos anteriores destas amostras, no Io, 3o, 6o, 9o, 12°, 18°, 24°, 30° e 36° mês, respetivamente. Foram registados os resultados.

Testar as amostras a 25°C: As amostras de teste foram colocadas num termostato a 25°C, em seguida, foram testados os elementos anteriores destas amostras, no Io, 3o, 6o, 9o, 12°, 18°, 24° e 30° mês, respetivamente. Foram registados os resultados. 45 ΕΡ1663110Β1

Testar as amostras a 25°C: As amostras de teste foram colocadas num termostato a 25°C, em seguida, os elementos anteriores destas amostras foram testados, no Io, 3o, 6o, 9o, 12°, 18° e 24° mês, respetivamente. Foram registados os resultados. 4. Resultados e conclusão 1) A 37°C, de acordo com dados recolhidos em pontos designados durante o teste e comparados com os dados anteriores ao teste, a potência começou a diminuir a partir do 6o mês, e as mudanças foram semelhantes nos três lotes. A aparência dos outros elementos não sofreu alterações. 2) A 25°C, de acordo com dados recolhidos em pontos designados durante o teste e comparados com os dados anteriores ao teste, a potência só sofreu uma ligeira alteração, e as mudanças foram semelhantes nos três lotes. A aparência dos outros elementos não sofreu alterações. 3) A 2 - 8°C, de acordo com os dados recolhidos em pontos designados durante o teste e comparados com os dados anteriores ao teste, as potências dos três lotes eram estáveis. A aparência dos outros elementos também não sofreu alterações.

Em conclusão, é sugerido que o pó liofilizado do interferão supercomposto recombinante, para a injeção deve ser mais bem armazenado e transportado a temperaturas baixas. Na ausência de tais condições, o produto também pode ser armazenado durante períodos curtos (isto é, 3 meses), à temperatura ambiente. 46 ΕΡ1663110Β1 EXEMPLO 3.5

Fluxograma da Produção do rSIFN-co 1 Produção 1.1 Fermentação

Usar a mistura de LB + M9 como meio de cultura. A quantidade de inoculo será de 1,5%. Agitar a OD600 = 0,4 (cerca de 3,5 horas) a 32°C, em seguida aumentar a temperatura para 42°C. Continuar a agitação durante mais 6 horas, a expressão do rSIFN-co irá alcançar o nível máximo. A avaliação através do varrimento do gel resultante da SDS-PAGE mostra que o nível de expressão é de até 57%, que é o mais alto padrão na China. 1.2 Purificação

Centrifugar a solução das bactérias para recolher o precipitado bacteriano

Lavagem salina fisiológica por duas (2) vezes

I

Adição de tampão (Tris-HCl 50 mM, EDTA 1 mM, NaCl 100 mM, Triton X-100 1%, ureia 1 - 2 M), sonicar para romper as células bacterianas durante 20 - 30 minutos l

Precipitar a solução tampão e lavar algumas vezes até que a cor se transforme em branco puro l

Usar o guanidina-HCl 7M para desnaturar

I

Diluir o guanidina-HCl para renaturar, deixar durante a noite 47

I ΕΡ1663110Β1

Usar Sephadex G25 para dessalinizar

I

Usar NaCl 0,1 M para aplicar à CM-Sepharose

I

Fazer eluição em etapas para recolher o pico ativo (continuação)

I

Após dessalinizar o pico ativo, aplicar à coluna de HPLC

carregada positivamente I

Usar NaCl 0,1 M para fazer a eluição em etapas, recolher o pico ativo que é o produto de rSIFN-co

I

Adicionar o portador de proteção e o agente de liofilização

I

Separar os materiais liofilizados (rSIFN-co) A pureza do produto (rSIFN-co) a partir deste processo de produção é mostrada a 95% sob o ensaio de SDS-PAGE, em que o peso molecular de 14,5 Kda. A HPLC de fase inversa mostra um único pico e a pureza é de até 97%. A sua atividade especifica é de até lxlO9 Ul/mg de proteína. 1.3 Embalagem e Inspeção

Após purificação por HPLC, 2% de albumina sérica humana, 1% de sacarose e 1% de glucose são adicionadas ao rSIFN-co. Em seguida, é separada e liofilizada em amostra para injeção. Quando testado sob o sistema de verificação Wish-VVS, o resultado foi de 4,5><108 UI. Quando testado com inspeção asséptica e inspeção de pirogénio sob a exigência padrão da China, os resultados foram negativos. Este resultado está em conformidade com os requisitos para a injeção IV. 48 ΕΡ1663110Β1 2. Controlo de Qualidade 2.1 Características biológicas (1) Ao usar LB + M9 para cultivar bactérias, as caracteristicas devem coincidir com as caracteristicas típicas de bactérias E. coli. Não foram detetadas outras bactérias. (2) Quando é feito o esfregaço para a técnica de Gram e analisado ao microscópio, é negativo para bactérias. (3) A reação aos antibióticos é a mesma que a destas bactérias iniciais. (4) A análise no microscópio eletrónico mostra as caracteristicas típicas de bactérias E. coli. Não foram detetados micoplasma, esporos de vírus ou outros micro poluentes. (5) 0 teste de reação bioquímica mostra as caracteristicas da bactéria E. coli. 2.2 Controlo de qualidade da expressão do interferão (1) A expressão do interferão (cultivadas numa plataforma de agitação) corresponde à quantidade de expressão de bactérias transferidas inicialmente. (2) Quando testado com o soro anti-interferão, uma reação é identificada. (3) A análise de plasmídeos: a digestão de restrição corresponde ao plasmídeo inicial. 49 ΕΡ1663110Β1 2.3 Produto da estirpe bacteriana 0 produto da estirpe bacteriana denota o espécime da estirpe das bactérias iniciais que foi produzida a partir dos procedimentos mostrados em 1.2. 0 produto da estirpe bacteriana deve ser analisado da seguinte forma para assegurar que não há derivação: Usar o meio LB para plaquear 2-3 partes e cultivar. Separar e retirar 5-10 grupos de bactérias para o teste da expressão do interferão. Repetir o teste pelo menos duas (2) vezes. Usar somente a que mostra a % mais elevada de ser produto da estirpe bacteriana. 2.4 Inoculo O inoculo denota o produto da estirpe bacteriana escolhido, após a fermentação. A quantidade, o tempo de cultivação e o valor de OD do inoculo, mais adequados podem ser decididos de acordo com a estirpe bacteriana. Um procedimento bacteriano antipoluido deve ser aplicado para qualquer inoculo que seja produzido. 2.5 Crescimento da estirpe bacteriana O crescimento da estirpe bacteriana seria, feito num ambiente de uma sala livre de bactérias, onde não mais do que um tipo de bactéria está a ser cultivado na mesma sala. O mesmo meio de cultura será usado tanto para a estirpe bacteriana como para o inoculo. O meio usado para O rSIFN-co é O LB. 2.6 Fermentação (1) A fermentação só ocorre numa sala de fermentação 50 ΕΡ1663110Β1 limpa com um ambiente de fermentação de uma única bactéria. (2) A limpeza do recipiente e do tubo de fermentação é feita por duas vezes, antes e depois da inserção do meio de cultura. Em seguida, o recipiente deve ser congelado para atingir a temperatura adequada para a inoculação. (3) Evitar a utilização de antibiótico, o qual pode afetar o crescimento celular no meio de cultura. (4) Os parâmetros de fermentação tais como a temperatura, o valor de pH, o oxigénio dissolvido e o tempo necessário podem variar de acordo com diferentes tipos de estirpes bacterianas. 2.7 Colheita das bactérias (1) Centrifugar a solução bacteriana para recolher as bactérias ou usar outro método. Todos os aparelhos devem ser limpos antes e depois da operação. A solução de resíduos deve ser escoada após o procedimento de limpeza. (2) As bactérias devem ser mantidas a 4 - 8°C se elas vão ser divididas no prazo de 24 horas. Caso contrário, elas devem ser mantidas a -30°C. As que são mantidas sob tais condições podem ser usadas no prazo de 6 meses. 2.8 Lise das células bacterianas (1) Usar a solução tampão adequada para equilibrar a estirpe bacteriana. A lise celular pode ser realizada 51 ΕΡ1663110Β1 por métodos físicos, químicos ou biológicos. Usar a centrífuga para precipitar as bactérias e aplicar as soluções de limpeza. (2) Se o método químico é usado para separar as células, não devem ser utilizadas soluções prejudiciais para os seres humanos. 2.9 Purificação (1) A purificação vai eliminar a maioria dos conteúdos que não sejam o interferão. No processo de purificação, nenhuns materiais tóxicos devem ser encontrados se forem adicionados elementos extra. (2) Se for usada a cromatograf ia de afinidade de anticorpos para a purificação, deve haver uma indicação da fonte e do grau de pureza. Além disso, deve ser realizada uma análise do IgG de baixa qualidade. (3) Durante o processo de purificação, a remoção do pirogénio é essencial. Todos os aparelhos devem ser verificados para eliminar esta interferência. (4) 0 interferão altamente concentrado é conhecido como "produto intermediário". Após as análises e os testes, adicionar albumina para aumentar a concentração a 2%, o que agora é conhecido como "produto intermediário de albumina". Após os exames e os testes, deve ser mantido a -30°C e nunca ser descongelado antes de usar. Este produto deve ser usado no prazo de 6 meses. (5) A albumina que é utilizada neste processo, também 52 ΕΡ1663110Β1 deve cumprir os testes e os requisitos, tais como: a verificação de RBSAG ser negativa e uma indicação da proporção entre o monómero, o dimero e o polímero. 2.10 Produção num tubo de produto (1) Filtração: Usar 0,22 μ de membrana para filtrar as bactérias. O produto deve ser manipulado com técnicas asséticas. As amostras devem ser levadas a testar o valor do interferão. (2) Diluição: Diluir o produto intermediário de albumina com 2% de diluente. Não deve ser adicionado nenhum conservante. O produto pode ser liofilizado após a verificação asséptica e a verificação de pirogénio. 2.11 Liofilização A liofilização não deve afetar a atividade do interferão, e o teor de água do dito liofilizado será mantido. 2.12 Verificação

Existem dois tipos de rSIFN-co produzidos. Um deles é para injeção e outro para utilização tópico. As especificações são diferentes para os dois. Existem produtos intermediários e produtos finais para cada tipo. No tipo de injeção, os produtos intermediários incluem o interferão purificado, o produto intermediário de albumina e o produto intermediário de albumina sem bactérias. O produto final do tipo para injeção irá denotar somente o produto liofilizado. O produto intermediário do tipo tópico denota apenas o interferão 53 ΕΡ1663110Β1 purificado. 0 produto final do tipo tópico denota somente produtos liofilizados formados de líquidos embalados separados. 2.13 Embalagem

Existem embalagens diferentes para o tipo de injeção e para o tipo tópico. 2.14 Armazenamento 0 produto deve ser mantido a 4°C. A solução de purificação não deve ser armazenada num estado congelado. 2.15 Validade 0 período de validade é de dois (2) anos após o procedimento de liofilização para produtos liofilizados. 0 período de validade é de 6 meses após a embalagem individual para os produtos liquefeitos. EXEMPLO 4 O rSIFN-co inibe a duplicação ADN-VHB e secreção do HBsAg e do HBeAg.

Materiais

Solvente e método de dosagem: Adicionar 1 ml de solução salina em cada frasco, dissolver e misturar com meio de cultura MEM em diferentes concentrações. Misturar no momento.

Medicamentos de controlo: IFN-a2b (Intrão A) como um pó liofilizado, comprado da Schering Plough. De 3xl06 U 54 ΕΡ1663110Β1 cada, misturar até 3><106 Ul/ml com meio de cultura, Infergen® (solução liquida), comprado da Amgen, 9 pg, 0,3 ml cada um, igual a 9xl06UI, e misturar com 9*106 Ul/ml de meio de cultura, preservar a 4°C, células 2.2.15: linhagem de células 2.2.15 de hepatoma (Hep G2) clonadas e transfectadas por ADN do VHB, construído pelo Mount Sinai Medicai Center.

Reagente: MEM em pó da Gibco American Ltd., soro de sangue fetal de gado da HycloneLab American Ltd., G-418 (Geneticina), MEM distribuidor da Gibco American Ltd., L-glutamil, importado e embalado por JING KE Chemical Ltd., caixa de radioimunoensaio em fase sólida de HBsAg e HBeAg, do Northward Reagent Institute of Chinese Isotope Ltd., Biograncetina, Northern China Medicine, e Lipofectina, Gibco American Ltd.

Bens e equipamentos experimentais: frasco de cultura da Tunclon™, Dinamarca, placa de cultura de 24 poços e de 96 poços da Corning American Ltd., caixa de incubação de dióxido de carbono, Shel-Lab American Ltd., meio de cultura MEM, lOOml: 10% do soro de sangue fetal de gado, 3% Glutamil a 1%, G418 a 380 pg/ml, biograncetina 50 U/ml. Método:

Cultura de células 2.2.15: Foram adicionados, 0,25% de enzima pancreática na placa de cultura cheia de células 2.2.15, digerir a 37°C durante 3 minutos, e adicionar o meio de cultura para parar a digestão, e agitar a placa para dispersar as células, reproduzir com a proporção de 1:3. Elas vão alcançar o crescimento completo em 10 dias.

Teste de toxicidade: Definir grupos de concentrações diferentes e um grupo de controlo, em que as células não 55 ΕΡ1663110Β1 são tratadas com medicamentos. Digerir as células, e dosar para uma solução de 100.000 células/ml. Inocular na placa de cultura de 96 poços, 200 μΐ por cada poço, cultivar a 37°C durante 24 horas com 5% de C02. Testar quando a camada de células simples crescer.

Dosar o rSIFN-co para uma solução de 1,8*107Ul/ml, em seguida, preparar uma série de soluções diluidas em gradientes duplos. Adicionar à placa de cultura de 96 poços, três poços por concentração. Mudar a solução de 4 em 4 dias. Testar o efeito citopático ao microscópio após 8 dias. Destruídas completamente como 4, 75% como 3, 50% como 2, 25% como 1, zero como 0. Calcular a lesão celular média e velocidade de inibição das diferentes concentrações. Calcular TC50 e TC0 de acordo com o método de Reed Muench. TC50 — Antiloçf (B +

50-B A-B X C) A = log da concentração de medicamento > 50%, B = log da concentração de medicamento < 50%, C = log do poder de diluição.

Teste de inibição para o HBeAg e o HBsAg: Separar em grupos de contraste de HBeAg e HBsAg positivos e negativos, grupo de contraste celular e grupos de concentração de medicamentos. Inocular 700.000 células/ml de células 2.2.15 numa placa de cultura de 6 poços, 3 ml em cada poço, cultivar a 37°C durante 24 horas com 5% de C02, em seguida, preparar 5 soluções diluídas com um gradiente de terceiro grau (Preparar 5 soluções, cada uma com uma concentração de proteína diferente. A concentração da solução 2 é 3 vezes inferior à da solução 1, a concentração da solução de 3 é 3 vezes inferior à da solução 2, etc) 4,5xl06 Ul/ml, 1,5x10® Ul/ml, 0,5x10® Ul/ml, 0,17x10® Ul/ml, e 0,056x10® Ul/ml, um poço por concentração, cultivar a 37°C durante 24 horas com 56 ΕΡ1663110Β1 5% de C02.

Mudar as soluções de 4 em 4 dias, utilizando a mesma solução. Colher todos os meios de cultura no 8o dia. Conservar a -20°C. Repetir o teste 3 vezes para estimar HBsAg e HBeAg com a caixa de radioimunoensaio em fase sólida (Northward Reagent Institute of Chinese Isotope Ltd.). Estimar o valor de cpm de cada poço com uma máguina de contagem de raios γ. Cálculo dos Efeitos: Calcular o valor médio de cpm dos grupos de contraste e dos grupos de concentrações diferentes e o seu desvio padrão, o valor de P/N, tais como velocidade de inibição, IC50 e SI.

D

Velocidade de inibição do antigénio (%)

A-B A x 100 A = cpm do grupo de controlo, B = cpm do grupo de teste, 2) Contagem da concentração de eficiência mediana do medicamento ., 50-5 IC50 de inibição do antigénio = Antllog (B + - x C)

A-B A = log da concentração de medicamento > 50%, B = log da concentração de medicamento < 50%, C = log do poder de diluição. 3) O SI de conformação interespacial alterou o efeito do rSIFN-co sobre o HBsAg e o HBeAg em cultura de células 2.2.15:

SI TC50 IC50 4) Estimar as diferenças de cpm de cada grau de diluição do grupo de controlo por meio do teste t de Student 57 ΕΡ1663110Β1

Southern blot: (1) Extração de ADN-VHB em células 2.2.15: Cultivar as células durante 8 dias. Exsucção do meio de cultura (células separadas do meio de cultura por meio de escoamento do meio de cultura). Adicionar tampão de lise para romper as células, em seguida extrair 2 vezes com uma mistura de fenol, clorofórmio e álcool isoamilico (1:1:1), centrifugar a 10.000 g. Recolher o sobrenadante adicionando álcool anidro para depositar o ácido nucleico. Secagem a vácuo, dissolver em 20μ1 de tampão TE. (2) Eletroforese: Adicionar tampão de carregamento 6XADN, eletroforese em gel de agarose a 1,5%, IV/cm, a uma pressão constante, durante 14 - 18 h. (3) Desnaturação e hibridização: mergulhar o gel em HC1, em tampão de desnaturação e em tampão de neutralização, respetivamente. (4) Transmembrana: Fazer uma transferência ordenada de ADN para a membrana Hybond-N. Aquecer, hibridizar e expor com hibridização de dot blot. Rastrear e analisar a densidade relativa com o programa pró-gel. Calcular a velocidade de inibição e a IC50.

Resultados

Os resultados das tabelas 4.1, 4.2 e 4.3 mostram que: após cultivação expoente a uma concentração máxima de inócuo, durante 8 dias, com células 2.2.15, os máximos são de 9,0 ± 0xl06UI/ml para a concentração máxima de inócuo, de 46,0 ± 5,25% (P < O. 001) para a velocidade média de inibição do HbeAg por rSIFN-co, de 4,54 ± 1,32x10® UI/ml para a IC50, de 3,96 para o SI, para o HbsAg são de 44,8 ± 6,6% para a velocidade, de 6,49 ± 0.42xl09 Ul/ml para a IC50, de 2,77 para o SI. Isto mostra que o rSIFN-co pode inibir significativamente a atividade do HBeAg e do HBsAg, mas que o IFN do grupo de contraste e o Infergen ® não podem. Também foi provado em clinica que o rSIFN-co pode diminuir o HBeAg e o HBsAg ou restituir os seus níveis normais. 58 ΟΩ Ο

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Preparação do rSIFN-co

Preparaçao da injeção liofilizada Pó liofilizado

Solução mãe do rSIFN-co 34,5 pg/ml 10 mmol/1 0,4 mol/1 PB (pH 7, 0) Glicina Técnica de preparação: Pesar os materiais de acordo com a receita. Dissolver com água estéril e livre de pirogénio. Filtrar através de uma membrana de 0,22 pm para remover as bactérias, preservar a 6 - 10°C. Encher os frascos, depois de assegurar que estão estéreis e livres de pirogénio, com 0,3 ml/frasco, ou 0,5 ml/frasco, e liofilizar num liofilizador.

Preparação da injeção liquida

Solução

Solução mãe do rSIFN-co 34,5 pg/ml 2 5 mmo1/1 0,1 mol/1 PB (pH 7,0) NaCl

Preparação: Pesar materiais de acordo com a receita. Adicionar até ao nível desejado de água estéril e livre de pirogénio. Filtrar através de uma membrana de 0,22 pm para remover as bactérias, preservar a 6 - 10°C. Encher os frascos hermeticamente fechados, depois de assegurar que estão estéreis e livres de pirogénio, com 0,3 ml/frasco, ou 0,5 ml/frasco, armazenar a 2 - 10°C e proteger da luz. 66 ΕΡ1663110Β1 EXEMPLO 6

Toxicidade aguda do rSIFN-co

Tratar os ratinhos com uma dose elevada (150 pg/kg, o que equivale a 1000 vezes a dose normal por quilo, utilizada no tratamento de pacientes adultos) de rSIFN-co de uma só vez através de injeção intramuscular. Em seguida, observar e registar as suas mortes e as reações tóxicas. Os resultados mostram que: 24 horas após a injeção, nenhuma reação anormal tinha sido registada. Os órgãos dos animais que tinham sido selecionados para serem mortos também não mostraram sinais de mudanças anormais. Os restantes ratinhos foram todos mantidos vivos e após duas semanas estavam normais. Os pesos dos ratinhos no grupo de Ycontrolo e no grupo experimental aumentaram todos, e a proporção de aumento não mostrou nenhuma diferença óbvia entre os dois grupos (P > 0,05), de acordo com os seus pesos no décimo quarto dia. Não foram vistas alterações anormais nos principais órgãos desses ratinhos, após duas semanas. 1 Material experimental 1.1 Animais 40 ratinhos adultos saudáveis, pesando 18 - 22 g, metade machos e metade fêmeas, qualificados pelo centro de controlo de animais para experiências de Sichuan. 1.2 Medicamentos

Solução esterilizada de rSIFN-co (Oferecida pela Sichuan Huiyang Life-engineering Ltd.), 0,15 mg/ml, Lote: 981201, o rSIFN-co foi administrado por via intramuscular 67 ΕΡ1663110Β1 em solução salina. 2. Método

Separar os 40 ratinhos em dois grupos de forma aleatória, uma para o medicamento experimental, outro para o controlo. Injetar o medicamento ou a solução salina na mesma proporção (0,1 ml/10 g) através do músculo para cada ratinho, de acordo com o grupo ao qual pertencem. (150 pg/kg de rSIFN-co para o grupo experimental, e solução salina para o grupo de controlo). Após a injeção, observar e registar a toxicidade aguda mostrada nos ratinhos. Matar metade dos ratinhos (metade machos e metade fêmeas) para verificar se houveram quaisquer alterações patológicas anormais nos seus órgãos principais, tais como o coração, o baço, o fígado, os pulmões, os rins, a glândula suprarrenal, estômago, duodeno, etc, após 24 horas. Os restantes são mantidos e observados até ao décimo quarto dia. Pesar todos os ratinhos, matá-los e, em seguida, observar a aparência dos órgãos elencados anteriormente para ver se existem quaisquer anormalidades. Retirar o tecido patológico e examiná-lo, utilizando o exame para avaliar a diferença dos aumentos de peso nos dois grupos. 3. Resultados

Os resultados mostram que não foi observada toxicidade aguda, após todos os ratinhos terem sido tratados com rSIFN-co intramuscular, com 150 pg/kg de cada vez, o que equivale a 1000 vezes a dose normal por quilo, utilizada no tratamento de pacientes adultos. Nos 14 dias após a injeção, todos os ratinhos viviam bem. Eles comeram, beberam, exercitaram-se e excretaram normalmente e mostraram condições normais de pelo. Nenhum deles morreu. A observação dos principais órgãos dos ratinhos selecionados 68 ΕΡ1663110Β1 aleatoriamente não mostra alterações anormais, 24 horas após a injeção. Todos os ratinhos restantes foram mortos, 14 dias após a injeção. As autópsias também não mostraram alterações. Os pesos dos ratinhos dos dois grupos aumentaram, mas nenhuma diferença óbvia foi demonstrada quando avaliadas com o método estatístico (p > 0,05) . Veja-se a tabela 6.1:

Tabela 6.1 Influência nos pesos dos ratinhos após a injeção do rSIFN-co

Grupo Dose Animal Pesos antes da injeção (g) Pesos após a injeção (g) Valor do aumento dos pesos (g) Controlo 0 20 19,8 ± 1,7 30,8 ±2,8 11,0 ± 2,9 rSIFN-co 150 20 19,4 ± 1,7 32,1 ± 3,3 12,7 ± 4,3 4. Conclusão

De acordo com as condições desta experiência, não houveram reações tóxicas em nenhum dos ratinhos, após a injeção de rSIFN-co com 150 yg/kg. A conclusão que se pode retirar é de que a dose máxima tolerável de injeção intramuscular em ratinhos é de 150 yg/kg, o que equivale a 1000 vezes a dose normal por quilo, utilizada no tratamento de pacientes adultos. EXEMPLO 7

Os efeitos clínicos do interferão supercomposto recombinante (rSIFN-co) O interferão supercomposto recombinante (rSIFN-co) é uma invenção para a terapia de doenças virais, especialmente para as hepatites. Entretanto, pode inibir a atividade dos vírus EB, VSV, dos vírus herpes simplex, dos cornavírus, dos vírus do sarampo, etc. Utilizando o sistema 69 ΕΡ1663110Β1 das células wish/VSV como o ensaio para a atividade antiviral, os resultados mostraram que: o outro rIFN, era de 0,9xl01 2 3 4 5 6 7 8 Ul/mg, o Intron A era de 2,0xl08 Ul/mg e o rSIFN-co era de 9xl08 Ul/mg. A atividade antiviral do rSIFN-co é muito mais elevada do que a dos dois primeiros.

Com a autorização da State Food and Drug

Administration (SFDA), da República Popular da China, os ensaios clínicos foram realizados no hospital West China da universidade de Sichuan, no segundo hospital da universidade médica de Chongqing e no primeiro hospital da escola de medicina da universidade de Zhejiang desde fevereiro de 2003. O tratamento clínico, que se concentra sobre a hepatite B é realizado sob a orientação do teste aleatório, de dupla ocultação multicêntrico. O IFN-alb foi utilizado como controlo, e os resultados preliminares mostraram o seguinte: O efeito do rSIFN-co comparado com o do IFN-alb no tratamento da hepatite B crónica ativa 70 1

Padrão de seleção dos pacientes: Os padrões 1-4 são eficazes para ambos os tratamentos com o rSIFN-co (9 pg) e 2 com o IFN-alb (5 MU, 50 pg) , e o padrão 1-5 são para o tratamento com rSIFN-co (15 pg). 3 1) . Idade: 18 - 65 4 2) . Nos últimos seis meses o teste de HbsAg deu positivo, 5 o teste de HbeAg deu positivo e o ensaio de PCR cópias de 6 ADN-VHB > 105/ml 7 3) . ALT > duas vezes o valor normal 8 4) . Nunca recebeu tratamento com IFN, ou recebeu o ΕΡ1663110Β1 tratamento com a lamividina mas falhou ou teve uma recaída 5) Recebeu uma vez tratamento com outros IFNs (3 MU ou 5 MU) , há seis meses atrás, seguido do padrão de SFDA, mas falhou ou teve uma recaída 2. Avaliação dos efeitos:

Em referência às recomendações do décimo comité nacional da China do vírus da hepatite e da hepatopatia, os efeitos foram divididos em três graus de acordo com o nível de ALT e com os testes de ADN-VHB e de HBeAg.

Resposta: nível normal de ALT, negativo para ADN-VHB, negativo para HBeAg

Resposta parcial: nível normal de ALT, negativo para ADN-VHB ou HBeAg

Resposta negativa: ALT, ADN-VHB e HBeAg inalterados

Os grupos de resposta e de resposta parcial foram considerados casos eficazes. 3. Resultados do ensaio clinico:

Grupo A: tratamento com o rSIFN-co (9 yg) 71 ΕΡ1663110Β1

Grupo B; 0 tratamento com IFN-glb (5 MU, 50 yg)

Período grupo Medicamento casos Velocidade efetiva Velocidade de transfência de HBsAg para negativo Velocidade de transfência de HbeAg para negativo Velocidade de transfência de ADN-VHB para negativo Velocidade de recuperação da função Heptal 8-12 semanas A rSIFN-co (9 pg) 32 46,88 (15) 9,38 (3) 28,12 (9) 37,50 (12) 84,38 (27) B IFN-cUb (5 MU, 5 0 pg) 32 21,88 (7) 0,00 (0) 9,38 (3) 15,62 (5) 56, 25 (18) 16 - 24 semanas A rSIFN-co (pg) 64 54, 69 (35) 7,81 (5) 25, 00 (16) 34,38 (22) 90, 62 (58) B IFN-alb (5 MU, 5 0 pg) 64 25, 00 (16) 0,00 (0) 9,38 (6) 18,75 (12) 78, 13 (50)

No Grupo C, os casos foram de tratamento prévio da hepatite B crónica ativa com outros IFNs (3 MU ou 5 MU) que falharam ou tiveram uma recaída e, em seguida, foram tratados com rSIFN-co (15 yg), por via subcutânea, todos os dias, durante 24 semanas. Os casos totais foram 13. Após 12 semanas de tratamento, 7 de 13 (53,85%) foram eficazes. Em 3 de 13 (23,08%) o HBeAg foi transferido para negativo, em 7 de 13 (53,85%) o ADN-VHB foi transferido para negativo, em 11 de 13 (84,62%) as funções heptal voltaram ao normal. 4. Os efeitos secundários do rSIFN-co comparados com os do IFN-alb no tratamento

Os efeitos secundários do IFN incluem febre, náusea, mialgia, anorexia, perda de cabelo, leucopenia e trombocitopenia, etc. A dose máxima de IFN-alb é de 5 MUI por tempo, a dose de rotina é de 3 MUI. Quando é tomada a dose de rotina, 90% dos pacientes têm efeitos secundários de grau I - II (padrão da OMS). Eles tiveram febre inferior a 38°C, náusea, mialgia, anorexia, etc. Quando é tomada a dose máxima, a taxa de efeitos secundários não subiu obviamente, mas foram mais graves. A dose máxima de 72 ΕΡ1663110Β1 rSIFN-co é de 24 pg, por via subcutânea, todos os dias, durante 3 meses. A dose de rotina é de 9 pg. Quando foram utilizadas as doses de rotina, menos de 50% dos pacientes tiveram efeitos secundários de grau I - II (padrão da OMS), incluindo febre abaixo de 38°C, náusea, mialgia, anorexia, leucopenia e trombocitopenia ligeira. Com a dosagem máxima, cerca de 50% dos pacientes sofreram de leucopenia e trombocitopenia, após utilizarem rSIFN-co por um mês, mas estes efeitos secundários desapareceram após a interrupção do tratamento durante uma semana. Este é seguro para utilização continuado.

As observações do rSIFN-co para tratar a hepatite C 1. Padrão de seleção dos pacientes 1) Idade: 18 - 65 2) anticorpo VHC positivo 3) ALT >1,5 vezes o valor normal, dura mais de 6 meses 2. Avaliação dos efeitos:

Referindo-se ao padrão de Infergen® para o tratamento da hepatite C e de acordo com o nivel ALT e o teste de HCV-RNA, os efeitos foram divididos em três graus:

Resposta: nivel normal de ALT, negativa para VHC-RNA

Resposta parcial: nivel normal de ALT, VHC-RNA inalterada

Resposta negativa: ALT e VHC-RNA inalterada 73 ΕΡ1663110Β1 3. Efeitos clinicos 0 ensaio clínico foi realizado em simultâneo com o tratamento da hepatite B. 46 casos receberam o tratamento, 9 pg de cada vez, por via subcutânea, todos dias durante 24 semanas. Após o tratamento, 26 de 46 (56,52%) têm efeitos óbvios, em 12 de 46 (26,08%) o VHC-ARN foi transferido para negativo, em 26 de 46 (56,52%) as funções heptal voltaram ao normal. EXEMPLO 8

Interferão supercomposto recombinante nebulizador

Componente principal: Interferão supercomposto recombinante

Caracteristicas: Líquido, sem material insolúvel

Farmacologia: 0 interferão supercomposto recombinante tem um largo espetro de atividade antiviral. Os seus efeitos são 5-20 vezes mais elevados do que os dos interferões (IFNs), que estão disponíveis no mercado. Este pode inibir o crescimento de coronavírus em cultura de células. 0 mecanismo é a interrupção da reação de combinação entre o IFN e o recetor correspondente, e a indução da expressão de 2'5'-A sintetase e da proteína quinase R na célula alvo, consequentemente, inibindo a expressão da proteína virai. O IFN pode induzir a expressão de várias proteínas antivirais para inibir a reprodução de proteínas virais, melhorar a função das células natural killer (NK) e outras funções reguladoras do sistema imunitário, e inibir a invasão de vírus. Toxicidade aguda: Todos os ratinhos estão vivos após a dose máxima (1000 vezes para a dose humana) por via 74 ΕΡ1663110Β1 subcutânea, não foi observada LD50.

Indicação: Prevenção da Síndrome respiratória aguda

Dosagem e administração: Nebulizador para ambos a cavidade nasal e a garganta, três vezes por dia.

Reações adversas: Não houve relato de reações adversas do nebulizador de rIFN. Este não induziu alergia. Se a estimulação é ocasional, a reação gastrointestinal adversa é minima, e nenhuma outra reação adversa obvia foi observada durante o tratamento, é seguro continuar a utilização. Todas as reações passaram por si próprias.

Aviso: Os pacientes alérgicos ao IFN-α e produções de E. coli não podem usar este produto.

Precauções: Antes da primeira utilização, nebulizar duas vezes para expulsar o ar. Se houver algum material de precipitação turvo, se o produto expirou, ou houver material no frasco, não usá-lo.

Utilização pediátrico: Não é claro.

Utilização geriátrico: Não é claro.

As mães que amamentam e as mulheres grávidas: Proibido Interações medicamentosas: Não é claro.

Overdose: Excesso 150 pg (7,5*107 UI) de cada vez, febre, anorexia, mialgia, arrepios vão acontecer mais frequentemente. Não há nenhuma reação adversa grave.

Fornecido: 1 nebulizador/ embalagem, 20 pg (lxlO7 UI)/3 ml 75 ΕΡ1663110Β1

Armazenamento: Conservar a 4 - 8°C. Nao congelar, proteger da luz.

Validade: Aproximadamente um ano

Fabricação: Fabricado por Sichuan Huiyang life- engineering Ltd.

Endereço: 8 Yusa Road, Sala 902, Edifício A Chengdu, 610017

Sichuan, República Popular da China Exemplo 9-Ά

Efeito in vitro de um novo estilo de interferão composto recombinante em coronavirus associado à SRA

Amostra fornecida pela: companhia Huiyang Life

Engineering Lt, província de Sichuan

Instituição: Departamento de Biologia Molecular do

Instituto de Micro-organismo e Epidemiologia da Academia de Ciências Médicas Militares

Dados originais: Conservados nos arquivos do Departamento de Biologia Molecular do Instituto de Micro-organismo e Epidemiologia da Academia de Ciências Médicas Militares 1 Materiais

Medicamento: Novo tipo de interferão composto recombinante, de 9 pg cada, fornecidos pela companhia Huiyang Life Engineering Lt, província de Sichuan, número do lote: 20020501. Células: Vero E6, fornecido pelo Departamento de Biologia Molecular do Instituto de Micro-organismo e Epidemiologia da Academia de Ciências Médicas Militares. 76 ΕΡ1663110Β1 Vírus: Coronavírus associado à SRA, BJ-01, fornecido pelo Departamento de Biologia Molecular do Instituto de Micro-organismo e Epidemiologia da Academia de Ciências Médicas Militares.

Meio celular: DMEM complementado com 10% de FBS. 2. Condição O vírus foi analisado num laboratório de biossegurança de 3o grau 3. Método CPE (efeito citopático) ensaio de TCID50: Foram plaqueados 100 pL de células Vero E6 em placas de 96 poços a 2χ104 células por poço.'Após 24 horas de incubação a 37 °C, a monocamada de células Vero E6 foi tratada com 9 níveis de diluição de coronavírus associado à SRA, por diluição de 10 vezes, em 4 poços por diluição. As células foram incubadas a 37°C e 5% de C02. CPE (efeito citopático) foi examinado diariamente por microscopia. O CPE de menos de 25% foi determinado como +, de 26 - 50% como ++, de 51 -75% como +++, de 76 - 100% como ++++. CPE foi registado. Em seguida, foi calculada a TCID50pelo método de Reed-Muench. A citotoxicidade do medicamento: As células Vero E6 foram inoculadas em placas de 96 poços a 2xl04células (100 μΐ) por poço. Após 24 horas de incubação a 37°C, as células cresceram até à monocamada. O medicamento foi diluído para 36, 18, 9, 4,5 e 2,25 pg/ml (concentração final) e adicionado a poços, quatro poços para cada. As células normais foram definidas como grupo de controlo. O CPE do grupo do medicamento foi observado diariamente durante um período de 5 dias e, em seguida, a concentração de medicamento que não apresentava toxicidade foi determinada.

Ensaio de CPE da atividade do medicamento contra o 77 ΕΡ1663110Β1 coronavírus associado à SRA: Foram plaqueados ΙΟΟμΙ das células Vero E6 em placas de 96 poços a 2xl04 células por poço. 'Após 24 horas de incubação a 37°C, as células cresceram até à monocamada. 0 medicamento à concentração máxima que não apresentava citotoxicidade foi diluído em 5 níveis de diluição de 2 vezes e adicionados a poços (100 pL por poço) . Por incubação a 37°C com 5% de CO 2, durante 24 horas, foram adicionadas diferentes concentrações de vírus (10^3, 1CT4, IO”5) . Após o tratamento com o vírus durante 48 - 72 horas, o CPE foi examinado (CPE de menos de 25% foi determinado como +, de 26 - 50% como ++, de 51 - 75% como +++, de 76 - 100% como ++++, de células normais como -). As células foram divididas no grupo normal, no grupo de controlo do medicamento, e nas diferentes diluições do grupo de controlo do vírus, quatro poços por grupo. O CPE foi examinado diariamente. A atividade antiviral do interferão foi avaliada, até o efeito citopático ter sido obviamente exibido no grupo de controlo do vírus. A experiência foi repetida. A IC50 do medicamento foi calculada pelo método de Reed-Muench. 4. Resultados A toxicidade de vírus: A TCID50 do vírus foi de 1CT8 A citotoxicidade do medicamento: a concentração de interferão composto recombinante que não apresentou citotoxicidade foi de 18 pg/ml, a forma das células era semelhante ao grupo de controlo, e nenhum efeito citopático foi exibido. O efeito antiviral do medicamento: mostrado na tabela 9-A.l e na tabela 9-A.2 78 ΕΡ1663110Β1

Tabela 9-A.l, o efeito antiviral do novo tipo de interferão _composto recombinante (primeira experiência)

Concentração do IFN (pg/ml) CPE a diferentes concentrações de vírus ΚΓ3 1(T4 1(T1 18 - - - 9 - - - 4,5 ++ - - 2,25 +++ ++ - 1,125 ++++ ++++ ++ Grupo de controlo do vírus ++++ ++++ +++ Grupo normal - - - Grupo de controlo do medicamento - - -

Tabela 9-A.2, o efeito antiviral do novo tipo de interferão _composto recombinante (segunda experiência)_

Concentração do IFN (pg/ml) CPE a diferentes concentrações de vírus 10“3 IO"4 10"1 18 - - - 9 - - - 4,5 + - - 2,25 +++ ++ - 1,125 ++++ ++++ ++ Grupo de controlo do vírus ++++ ++++ ++++ Grupo normal - - - Grupo de controlo do medicamento - - - 79 1

Conclusão A concentração do novo tipo de interferão composto recombinante que não apresentou citotoxicidade foi de 18 pg/ml. As suas IC50 foram 1,27, 2,25, e 4,04 pg/ml, respetivamente, de acordo com a concentração de 10“1 (1000 TCID50), IO-4 (1000 TCID50), 103 (100000 TCID50) de coronavirus associado à SRA (tabela 9-A.3). ΕΡ1663110Β1

Tabela 9-A.3, IC50 de IFN a diferentes concentrações de vírus

Diluição do virus IC50 de IFN (pg/ml) 1CT3 4,04 1 O i—1 2,25 10 5 1,27

Investigador principal: Jin-yan Wang

Assistente de laboratório: Yan-hong Zhao, Xiao-guang Ji, Xiao-yu Li.

Dados originais: Conservados em arquivos do Departamento de Biologia Molecular do Instituto de Micro-organismo e Epidemiologia da Academia de Ciências Médicas Militares

Data: De 12 a 30 de maio de 2003

Exemplo 9-B

Efeito in vitro da injeção de um novo tipo de interferão composto recombinante e, interferão recombinante -cx-2b, em coronavírus associado à SRA

Amostra fornecida pela: Huiyang Life Engineering Ltd., província de Sichuan

Instituição: Departamento de Biologia Molecular do

Instituto de Micro-organismo e Epidemiologia da Academia de Ciências Médicas Militares

Dados originais: Conservados nos arquivos do Departamento de Biologia Molecular do Instituto de Micro-organismo e Epidemiologia da Academia de Ciências Médicas Militares 80 ΕΡ1663110Β1 1 Materiais

Medicamento: Novo tipo de interferão composto recombinante, 618 pg/ml, fornecido pela Huiyang Life Engineering Ltd., província de Sichuan, Anfulong (recombinante injeção interferão-a-2b), fornecido pela Hua-li-da Biology Engineering Company Ltd., cidade de Tianjin, 30 pg/vial (300. 0000 Ul/vial), Número do Lote: 20030105. Células: Vero E 6í fornecidas pelo Departamento de

Biologia Molecular do Instituto de Micro-organismo e Epidemiologia da Academia de Ciências Médicas Militares

Virus: Coronavírus associado à SRA, BJ-01, fornecido pelo Departamento de Biologia Molecular do Instituto de Micro-organismo e Epidemiologia da Academia de Ciências Médicas Militares.

Condição Os vírus foram analisados num laboratório de biossegurança de 3o grau 2. Método A TCID50 foi medida com o ensaio de CPE: As células Vero E6 foram inoculadas em placas de 96 poços a 2xl04 células por poço (100 μΐ). Após uma incubação de 24 horas a 37°C, as monocamadas de Vero E6 foram tratadas com 9 níveis de diluição de coronavírus associado à SRA, de 10 vezes decrescentes, cada diluição em quatro poços. As células foram incubadas a 37°C e 5% de dióxido de carbono. O CPE foi examinado diariamente por microscopia de contraste de fase. O CPE de menos de 25% foi determinado como +, de 26 -50% como ++, de 51 - 75% como +++, de 76 - 100% como ++++. O CPE foi registado. Em seguida, a TCID50 foi calculada 81 ΕΡ1663110Β1 pelo método de Reed-Muench.

As TC 5o dos IFNs foram medidas pelo ensaio de MTT: As células Vero Ee foram inoculadas em placas de 96 poços a 2χ104 células por poço (100 μΐ) . Após uma incubação de 24 horas a 37°C, o líquido sobrenadante foi removido, quando as células cresceram até à monocamada, em seguida as Vero E6 foram tratadas com diferentes concentrações de IFN, cada diluição em quatro poços. O grupo normal foi definido. Após 5 dias de observação, as células foram misturadas com MTT durante 4 horas. Em seguida, remover o líquido, e depois, DMSO foi adicionado às células durante meia hora. O OD570nm foi medido num leitor de microplacas. Finalmente, a TC50 foi calculada pelo método de Reed-Muench. A atividade dos INFs contra coronavirus associado à SRA foi medida com o ensaio de MTT: Foram inoculadas 100 μΐ de células Vero E6 em placas de 96 poços a 2xl04 células por poço. Após uma incubação de 24 horas a 37°C, as células atingiram a monocamada. A diluição do medicamento à concentração que não exibe nenhuma citotoxicidade foi de 5 vezes decrescente e houveram 5 níveis de diluição. Em seguida, cada diluição foi adicionada a 4 poços, 100 μΐ por poço. Após uma incubação de 24 horas a 37°C e 5% de CO2, a solução de IFN foi removida, em seguida, diferentes concentrações de diluições de vírus (10000, 1000, 100 TCID50) foram adicionadas a placas, 4 poços por diluição. As células foram divididas no grupo normal, no grupo de controlo do medicamento, e nas diferentes diluições do grupo de controlo do vírus (10000, 1000, 100 TCID50) . As células foram incubadas a 37°C e 5% de C02 durante 48 - 72 horas, até o efeito citopático ter sido exibido no grupo de controlo do vírus, o CPE foi registado (CPE de menos de 25% foi determinado como +, de 26 - 50% como + + , de 51 - 75% como +++, de 76 - 100% como + + + + , de células normais como 82 ΕΡ1663110Β1 -) . A capacidade de crescimento das células foi medida com o ensaio de MTT e, em seguida, o efeito antiviral dos INFs foi avaliado. A experiência foi repetida três vezes. A IC50 do medicamento foi calculada pelo método de Reed-Muench. 3. Resultados TCID50 do vírus: A TCID50 de virus foi de 10 7' TC50 dos IFNs: A concentração do novo tipo de interferão composto recombinante que não apresenta citotoxicidade foi de 100 pg/ml, e a do IFN-a-2b recombinante foi de 12,5 pg/ml, a forma das células era idêntica no grupo normal, a essa concentração. A TC50 do novo tipo de interferão composto recombinante foi de 139,18 pg/ml, e a do IFN-a-2b recombinante foi de 17,18 pg/ml.

Tabela 9-B.l TC50 dos IFNs IFN TC50 (pg/ml) Valor médio (X ± SD, n = 3) Ia experiência 2a experiência 3a experiência novo tipo de interferão composto recombinante 141,42 125,96 150,08 139,18 ± 12,22 IFN-a-2b 17,68 15, 75 18, 10 17,18 ± 1,25 O efeito antiviral do medicamento: Foram observados os efeitos antivirais de dois IFNs in vitro. Os resultados das experiências estão apresentados na tabela 9-B.2, e os resultados de TI estão apresentados na tabela 9-B.3. 83 ΕΡ1663110Β1

TabeJ La 9-B.2, A atividade antiviral dos IFNs IFNs concentração do vírus (TCID50) IC50 (pg/ml) Ia experiência 2a experiência 3a experiência Valor médio (X±SD, n = 3 novo tipo de interferão composto recombinante 10000 0,79 1,04 0,93 0, 92 ± 0,12 IFN-a-2b 5, 04 4,56 4, 65 4,75 ± 0,25 novo tipo de interferão composto recombinante 1000 0,19 0,18 0,18 0, 18 ± 0,01 IFN-a-2b 1, 18 1, 19 1, 12 1, 16 ± 0,04 novo tipo de interferão composto recombinante 100 0,08 0,10 0, 11 0, 10 ± 0,02 IFN-a-2b 0,33 0,21 0,30 0,28 ± 0,06

Tabela 9-B.3, A atividade antiviral dos IFNs IFNs Concentração do vírus (TCIDso) TC50 (pg/ml) IC50 (pg/ml) TI (TC50/ IC50) novo tipo de interferão composto recombinante 10000 139,18 0, 92 151,28 TFN-a-2b 17, 18 4,75 3, 62 novo tipo de interferão composto recombinante 1000 139,18 0,18 773,22 IFN-a-2b 17, 18 1,16 14,78 novo tipo de interferão composto recombinante 100 139,18 0,10 1391,80 IFN-a-2b 17, 18 0,28 61,36 84 ΕΡ1663110Β1 4. Conclusão 0 efeito de proteção do novo tipo de interferão composto recombinante e do IFN-a-2b em Vero E6 foi observado in vitro, e a capacidade antiviral dos IFNs foi manifestada. A IC50 do novo tipo de interferão composto recombinante em coronavirus associado à SRA, à concentração de 10000, 1000, 100 foi de 0,92, 0,18 e 0,10 pg/ml em três experiências, o IT destas foi 151,28, 773,32 e 1391,80, respetivamente. A IC50 do IFN-a-2b foi de 4,75, 1,16, e 0,28 pg/ml, o IT (indice de tratamento) destas foi 3,62, 14,78, 61,36, respetivamente.

Sobretudo, os dois testes (vejam-se os exemplos anteriores 9A e 9B) do efeito antiviral do rSIFN-co contra SRA in vitro, ambos testemunharam que mesmo a dose eficaz do rSIFN-co para inibir o vírus da SRA é 1/5 da do interferão a-2b, que é utilizado clinicamente na China, neste momento, o índice de Tratamento (IT) do rSIFN-co é de cerca de 50 vezes o do interferão a-2b. (Veja-se: O efeito in vitro de um novo tipo de interferão composto recombinante e da injeção do interferão-a2b recombinante, em coronavirus associado à SRA. Pelo Instituto de

Microbiologia e Epidemiologia, da Academia Militar de Ciências Médicas)

Foram usados trinta mil nebulizadores de rSIFN-co entre os enfermeiros e os médicos da linha da frente, e pessoas em alto risco na província de Sichuan. O resultado mostra que nenhum dos enfermeiros e médicos foi infetado com SRA na província de Sichuan.

Investigador principal: Jin-yan Wang

Assistentes de laboratório: Yan-hong Zhao, Xiao-guang Ji, 85 ΕΡ1663110Β1

Min Zhang, Jing-hua, Zhao.

Data: De 1 a 30 de julho de 2003 Exemplo 10:

COMPARAÇÃO DOS EFEITOS INIBITÓRIOS DE DIFERENTES INTERFERÕES NA EXPRESSÃO DOS GENES DO VHB O ADN do vírus da hepatite B (VHB) contém elementos de consenso para a proteínas de transactivação cuja atividade de ligação é regulada por interferões. Tratamento dos hepatócitos infetados por VHB com interferões leva à inibição da expressão do gene do VHB. O objetivo do presente estudo foi de caracterizar os efeitos de diferentes interferões na transcrição regulada pelo VHB. Utilizando a transfecção transitória das células de hepatoma humano com plasmídeos repórter, que contêm o gene da luciferase de pirilampo, sob o controlo do intensificador de VHB (EnH) I, do EnH II e do core promotor. 0 requerente estudou as atividades biológicas de três interferões diferentes na transcrição.

Materiais e Métodos 1. Interferões: IFN-conl (Infergen®) , IFN-Hui-Yang (SIFN-co-γ) e IFN-beta lb 2. Plasmídeo repórter: Os fragmentos de ADN que contêm o intensif icador de VHB (EnH) I, EnH II e o core promotor foram preparadas utilizando PCR e blunt-end clonado no local Smal I do promotor e intensificador-menos pirilampo luciferase plasmídeo repórter pGL3-Basic (Promega, WI, EUA) .0 plasmídeo repórter resultante foi nomeado como pGL3-VHB-Luc. 86 ΕΡ1663110Β1 3. Cultura de células e transfecção de ADN: As células HepG2 foram cultivadas em meio DMEM complementado com 10% de FBS e 100 U/ml de penicilina e 100 pg/ml de estreptomicina. As células foram mantidas a 30°C, numa incubadora a 5% de C02. As células foram transfectadas com o plasmideo repórter pGL3-VHB-Luc, utilizando o kit de transfecção de lipofectina da Boehringer. Após 18 horas, o meio que continha os reagentes de transfecção foi removido e foi adicionado meio fresco, com ou sem interferões. As células foram mantidas em cultura por mais 48 horas. 4. Ensaio da Luciferase: Quarenta e oito horas após a adição de interferão, as células foram colhidas e a lise das células foi preparada. A concentração de proteína dos lisados de células foi medida utilizando o kit de ensaio de proteína da Bio-Rad. A atividade da luciferase foi medida utilizando os sistemas de ensaio repórter de luciferase da Promega, de acordo com as instruções do fabricante.

RESULTADOS A expressão da atividade da luciferase em lizados celulares tratados com interferões diferentes

Sem tratamento IFN-conl IFN-Hui-Yang IFN-beta lb 100 48 + 8 29 + 6 64 + 10

Este resultado mostra que o SIFN-co-γ inibe de modo mais eficaz na expressão da expressão do gene do VHB. 87 ΕΡ1663110Β1

Exemplo 11: EFEITOS SECUNDÁRIOS E MUDANÇAS NA TEMPERATURA CORPORAL QUANDO SE USA O SIFN-CO-γ Há geralmente mais efeitos secundários ao usar o interferão. Os efeitos secundários incluem: náuseas, dores musculares, perda de apetite, perda de cabelo, hipoleucocitoses (hipoleucemia, hipoleucocitoses, hipoleukia) e diminuição das plaquetas sanguíneas, etc.

MÉTODO

Os pacientes da amostra são divididos em dois grupos. No grupo A, 11 pacientes foram injetados com 9 pg de Infergen®. No Grupo B, 10 pacientes foram injetados com 9 pg de SIFN-co-γ. Ambos os grupos foram monitorizados durante 48 horas após as injeções. A primeira monitorização foi registada uma hora após a injeção. Depois disso, os registos foram feitos de 2 em 2 horas.

Na tabela 11.1 são comparados os efeitos secundários entre os pacientes que foram injetados com 9 pg de Infergen® e 9 pg de SIFN-co-γ. 88 ΕΡ1663110Β1

Tabela 11.1. Efeitos secundários SIFN-co-γ 9 μg Infergen® 9 pg Indivíduos: n=l 0 Indivíduos: n=l 1 Sistema corporal Reações N° efetivo de indivíduos N° efetivo de indivíduos Em geral Fraqueza 3 3 Aquecimento das solas dos pés 1 Sensibilidade ao frio 3 4 Falta de forças nas pernas 3 Lombalgia ligeira 2 1 Dor corporal 4 5 Sistema nervoso central / sistema nervoso periférico Dor de cabeça 3 6 Vertigens 2 11 Sonolência 3 Gastroenterostomia Falta de apetite 1 Celiodinia 1 Diarreia 1 Sistema músculo-esquelético Mialgia 1 2 Artralgia 2 Sistema respiratório Nariz entupido 1 Paropsia Olhos inchados 1

RESULTADOS

Para aqueles pacientes que foram injetados com SIFN-co-γ, os efeitos secundários foram menores. Eles tinham alguns sintomas comuns semelhantes aos da gripe, tais como: dor de cabeça, fraqueza, sensibilidade ao frio, dor muscular, hidrose, artralgia (artrodinia, artronalgia). Os efeitos secundários destes pacientes, a quem foi administrado o Infergen®, foram piores do que daqueles que foram injetados com SIFN-co-γ. 89 ΕΡ1663110Β1 A partir das figuras 9A-1, 9A-2, 9B-1, e 9B-2, foi óbvio que as temperaturas corporais dos pacientes da amostra do grupo A foram mais elevadas do que as dos pacientes do grupo B. Também reflete, que a resistência do SIFN-co-γ era muito melhor do que a do Infergen®.

Exemplo 12:

CRESCIMENTO DE CRISTAIS DO SIFN-CO-γ E TESTE DOS PARÂMETROS DE CRISTALOGRAFIA 0 cristal de SIFN-co-γ. Dois tipos de cristal foram encontrados após a execução de tentativas e experiências, sistematicamente, (vejam-se as figuras 10 a 12) 1 Crescimento de cristais

Dissolver a proteína do SIFN-co-γ com água pura (H20) até uma densidade de 3 mg/ml. Busca da cristalização utilizando Hampton Research Crystal Screen I e II que foi produzido pela empresa Hampton. Utilizando o método de difusão por suspensão de gota, 500 μΐ de líquido, gota de 1 μΐ de proteína + 1 μΐ de líquido, à temperatura de 293 K. Os primeiros 2 tipos diferentes de cristais pequenos foram encontrados, como elencado na tabela 12.1. 90 ΕΡ1663110Β1

Tabela 12.1. Rastreio do SIFN-co-γ Cristalino

Condição I II Diluente Tris-HCl 0,1 M, pH = 8,75 HEPES 0,1M, pH = 7,13 Precipitante PEG550 MME 17,5% (p/v) PEG6K 10% (p/v) Aditivos NaCl 0,1 M MPD a 3% (v/v) Temperatura 293 K 293 K Tamanho do cristal (mm) 0,2 x 0,2 x 0,1 CN O o X C\1 o o X KO o Cristalograma Figura 10 Figura 11 2.Aquisição e processamento de dados 0 Cristal I foi utilizado para recolher os dados de difração de raios X e para a análise preliminar de cristalografia. Os parâmetros também foram testados. Os dados de difração foram recolhidos à temperatura ambiente. 0 Crystal I (condição I) foi inserido num tubo de parede fina de silicone. Utilizando o detetor BrukerAXS smart CCD, a fonte de luz é CuKa (λ = 1,5418 Â) gerada pelo gerador de raios X, Nonius FR591. A intensidade da luz de 2000 KW (40 kv x 50 mA) , o comprimento de onda de 1,00 Â, com uma exposição de 60 segundos, Δφ = 2o, a distância entre o cristal e o detetor era de 50 mm. Os dados foram processados utilizando Proteum Procedure Package da empresa Bruker. Veja-se a figura 12 para o padrão de difração do cristal (parcialmente). Veja-se a tabela 12.2 para o resultado do processo. 91 ΕΡ1663110Β1

Tabela 12.2. Os resultados dos parâmetros de Cristalografia

Parâmetros a (Â) 82, 67 b (Á) 108,04 c (Á) 135,01 Oí (°) 90,00 β (°) 90,00 Y (°) 98,35

Grupo espacial P2 ou P2i Nitidez da separação 5 Á Molécula Assimétrica n° 10 Dissolução 57,6%

Além disso, não houve crescimento de cristais de SIFN-co-γ, com base nas publicações anteriores. O resultado mais próximo do SIFN-co-γ foi huIFN-a2b mas o rastreio foi muito complicado. Após semear 3 vezes, o cristal cresceu para 0,5 x 0,5 x 0,3 mm, a nitidez de separação foi de 2,9 Â, o grupo espacial foi o P2i. Os cristais também eram grandes, o número da molécula assimétrica foi de 6, e a dissolução foi de cerca de 60%. 92 ΕΡ1663110Β1

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • US 4695623 A [0002] [0032] [0035] • US 4897471 A [0002] [0032] • US 5372808 A [0002] • CN 97193506 [0002] • CN 98114663 [0002]

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Chemical and Other Test Methods for Biologics'', ' ' Requirement s for Pyrogen Test of Biologics'’'' and ''Requirements for Bacterial Endotoxin Test of Biologics'''' all can be found in the ''Chinese

Requirements for Biologics.'’'' '''Chinese Requirements for Biologics. PAN ZHENGAN ; ZHANG XINHUI ; DUAN ZHIBING et al. Chinese Biologics Standardization committee. Chemical Industry Publishing Company, 2000 [0133]

Lisboa, 6 de Março de 2014 95

Claims (13)

1. ΕΡ1663110Β1 REIVINDICAÇÕES 1. Um polinucleótido isolado que tem a sequência mostrada na figura 1.
2. 2. Um interferão recombinante que pode ser obtido por um processo que compreende a introdução em E. coli da sequência polinucleotidica mostrada na figura 1.
3. 3. Uma composição que compreende o interferão recombinante da reivindicação 2.
4. 4. Uma composição farmacêutica que compreende o interferão recombinante da reivindicação 2 e um portador farmaceuticamente aceitável.
5. 5. Um vetor que compreende o polinucleótido da reivindicação 1.
6. 6. Uma célula hospedeira isolada que compreende o vetor da reivindicação 5.
7. 7. 0 interferão recombinante da reivindicação 2 para utilização médica.
8. 8. 0 interferão recombinante da reivindicação 2 para utilização como um medicamento para a prevenção ou tratamento da sindrome respiratória aguda.
9. 9. 0 interferão recombinante para a utilização da reivindicação 7, em que o interferão é administrado por via oral, via intravenosa, via intramuscular, via intraperitoneal, injeção subcutânea, administração nasal ou mucosal, ou por inalação por meio de um inalador. 1 ΕΡ1663110Β1
10. 10. O interferão recombinante para a utilização da reivindicação 7, em que o interferão é libertado por um dispositivo nebulizador.
11. 11. O interferão recombinante para a utilização da reivindicação 7, em que o interferão é liofilizado.
12. 12. Um processo para a preparação do interferão recombinante da reivindicação 2, que compreende: a introdução em E. coli hospedeira da sequência polinucleotídica mostrada na figura 1, - a cultura da célula hospedeira em condições adequadas para a expressão do interferão recombinante, e - a colheita do interferão recombinante.
13. 13. A utilização do interferão recombinante da reivindicação 2 para o fabrico de um medicamento. Lisboa, 6 de Março de 2014 2