PT1589031E

PT1589031E - Produção de policétidos e outros produtos naturais

Info

Publication number: PT1589031E
Application number: PT05075774T
Authority: PT
Inventors: Matthew Alan Gregory; Sabine Gaisser; Hrvoje Petkovic; Steven Moss
Original assignee: Biotica Tech Ltd
Priority date: 2002-07-16
Filing date: 2003-07-16
Publication date: 2007-11-28
Also published as: DK1589031T3; AU2003246965A1; EP2277898A2; EP1655372A2; EP1521828A2; DE60315723T2; EP1655372A3; EP1521828B1; US20150266896A1; JP2008194041A; US9605001B2; HK1077845A1; CA2492153A1; US20060078980A1; ATE370161T1; EP1589031B1; DE60315723D1; CN1668741A; JP2010075187A; US20080021211A1

Description

ΕΡ 1 589 031 /PT

DESCRIÇÃO "Produção de policétidos e outros produtos naturais" DOMÍNIO do Invento O presente invento refere-se à produção de policétidos e outros produtos naturais e a bibliotecas de compostos e compostos individuais novos. Uma área importante é o isolamento e utilização potencial de novos análogos de ligandos de FKBP e células hospedeiras que produzem estes compostos. O invento concerne em particular a métodos para a transformação eficiente de estirpes que produzem análogos de FKBP e células recombinantes em que os genes clonados ou as cassetes de genes são expressos para gerar novos compostos tais como policétidos (especialmente rapamicina) análogos de ligandos de FKBP, e a processos para a sua preparação, e a meios ai empregues (e.g. ácidos nucleicos, vectores, cassetes de genes e estirpes geneticamente modificadas).

Anterioridade do Invento A rapamicina (sirolimus) (Figura 1) é um macrólido lipófilo produzido por Streptomyces hygroscopicus NRRL 5491 (Sehgal et al., 1975; Vézina et al., 1975; Patente U.S. No. 3,929,992; Patente U.S. No. 3,993,749) com uma porção 1,2,3-tricarbonilo ligada a uma lactona do ácido pipecólico (Paiva et al., 1991). Outros macrólidos relacionados (Figura 2) incluem FK506 (tacrolimus) (Schreiber e Crabtree, 1992), FK520 (ascomicina ou imunomicina) (Wu et al., 2000), FK525 (Hatanaka H, et al., 1989, FK523 (Hatanaka, H., et al., 1988), antascomicinas (Fehr, T., et al., 1996) e meridamicina (Salituro et al., 1995). Para os fins deste invento, a rapamicina é descrita pela convenção de numeração de McAlpine et al. (1991), de preferência às convenções de numeração de Findlay et al. (1980) ou do Chemical Abstracts (11° índice Cumulativo, 1982-1986 p60719CS). O modo de acção versátil da rapamicina demonstra o valor farmacológico do composto e enfatiza a necessidade de isolar novos derivados do fármaco. A rapamicina apresenta actividade antifúngica moderada, principalmente contra as espécies 2

ΕΡ 1 589 031 /PT Cândida, mas também contra os fungos filamentosos (Baker et al., 1978; Sehgal et al., 1975; Vézina et al, 1975; Patente U.S. No. 3,929,992; Patente U.S. No. 3,993,749). A rapamicina inibe a proliferação celular ao atingir as vias de transdução de sinal numa diversidade de tipos de células, e.g. ao inibir as vias de sinalização que permitem o progresso da fase Gi para a fase S do ciclo celular (Kuo et al., 1992). Nas células, a rapamicina inibe a sinalização do receptor de IL-2 e a subsequente autoproliferação das células, resultando em imunossupressão. Os efeitos inibitórios da rapamicina não se limitam às células, uma vez que a rapamicina inibe a proliferação de muitos tipos de células de mamíferos (Brunn et al., 1996). A rapamicina é, portanto, um potente imunossupressor com aplicações terapêuticas estabelecidas ou previsíveis na prevenção da rejeição de alotransplantes de órgãos e no tratamento de doenças auto-imunes (Kahan et al., 1991). Parece provocar menos efeitos secundários do que os tratamentos anti-rejeição Standard (Navia, 1996). A 40-0-(2-hidroxi)etil-rapamicina (SDZ RAD, Certican, Everolimus) é um análogo semi-sintético da rapamicina que apresenta efeitos farmacológicos imunossupressores (Sedrani, R. et al., 1998; U.S. 5,665,772). A eficácia clínica do fármaco está presentemente sob investigação em ensaios clínicos da Fase III (Kirchner et al., 2000). O éster de rapamicina CCI-779 (Wyeth-Ayerst) inibe o crescimento celular in vitro e inibe o crescimento tumoral in vivo (Yu et al., 2001). O fármaco está presentemente em ensaios clínicos da Fase iii. O valor da rapamicina no tratamento de psoríase crónica em placas (Kirby e Griffiths, 2001), a utilização potencial em efeitos tais como estimulação da excrescência de neurite em células PC12 (Lyons et al., 1994), o bloqueio das respostas proliferativas às citocinas por células vasculares e do músculo liso após lesão mecânica (Gregory et al., 1993) e o seu papel na prevenção de fibrose no alotransplante (Waller e Nicholson, 2001) são áreas de intensa pesquisa (Kahan e Camardo, 2001). Relatórios recentes revelam que a rapamicina está associada a mais baixa incidência de cancro em pacientes com alotransplantes de órgãos sob terapia imunossupressora a longo prazo do que aqueles sob outros regimes imunossupressores, e que esta reduzida incidência de cancro é devida à inibição da angiogénese (Guba et al., 2002). Tem sido relatado que as actividades neurotróficas dos ligandos de imunofilina são 3

ΕΡ 1 589 031 /PT independentes da sua actividade imunossupressora (Steiner et al., 1997) e que a estimulação do crescimento nervoso é promovida pela quebra do complexo receptor esteróide maduro, como realçado no pedido de patente WO01/03692. Têm sido relatados efeitos secundários tais como hiperlipidemia e trombocitopenia bem como potenciais efeitos teratogénicos (Hentges et al., 2001; Kahan e Camardo, 2001). O esqueleto de policétido da rapamicina é sintetizado por condensação de cabeça-à-cauda de um total de sete unidades de propionato e sete unidades de acetato numa unidade de iniciação de ácido ciclo-hexanocarboxílico derivado de chiquimato (Paiva et al., 1991). O iminoácido derivado de L-lisina, ácido pipecólico, é condensado via uma ligação amida no último acetato da estrutura policétido (Paiva et al., 1993) e segue-se lactonização para formar o macrociclo. Foi sequenciada uma região genómica de 107 kb contendo o "cluster" de genes biossintético (Schwecke et al., 1995). A análise das estruturas de leitura abertas revelou três grandes genes codificando a sintase de policétido modular (PKS) (Aparicio et al., 1996; Schwecke et al., 1995). Inserido entre os genes de PKS está o gene rapp que codifica uma proteína com uma similaridade de sequência relativamente aos domínios de activação das sintetases de péptidos não ribossómicos e que se pensa actuar analogamente (Kõnig et al., 1997). A região que codifica os genes para PKS é flanqueada em ambos os lados por 24 estruturas de leitura abertas adicionais que codificam enzimas que se crê serem necessárias para a biossíntese de rapamicina (Molnár et ai., 1996). Estas incluem as seguintes enzimas de modificação pós-policétido: duas monooxigenases do citocromo P-450, designadas por RapJ e RapN, uma ferredoxina associada RapO, e três potenciais O-metiltransferases dependentes de SAM, Rapl, RapM e RapQ. Outros genes adjacentes têm papéis putativos na regulação e exportação de rapamicina (Moinar et al., 1996). O "cluster" também contém o gene rapL cujo produto RapL foi proposto catalisar a formação do precursor de rapamicina, ácido L-pipecólico através da ciclodesaminação da L-lisina (Khaw et al., 1998; Paiva et al., 1993). A introdução de uma mutação de desvio de estrutura no rapL deu origem a um mutante incapaz de produzir quantidades significativas de rapamicina e a alimentação de ácido L-pipecólico ao meio de crescimento restaurou os níveis do tipo 4

ΕΡ 1 589 031 /PT selvagem da produção de rapamicina (Khaw et al., 1998). Os precursores biossintéticos do anel ciclo-hexano de rapamicina têm origem na via do ácido chiquimico (Lowden et al, 1996; Lowden et al., 2001). Outros macrólidos estreitamente relacionados tais como FK506 (tacrolimus) (Schreiber e Crabtree, 1992), FK520 (ascomicina ou imunomicina) (Wu et al., 2000), antascomicina (Fehr, T., et al., 1996) e meridamicina (Salituro et al, 1995) partilham um farmacóforo que interage com proteínas ligantes de FK506 (FKBPs) (Figura 2). Assim, a rapamicina e compostos relacionados, por exemplo, mas não se lhes limitando, FK506, FK520, 'hyg', FK523, meridamicina, antascomicina, FK525 e tsukubamicina podem ser considerados como "ligandos de FKBP". Foram publicados a sequência parcial do "cluster" de genes de FK506 (Motamedi et al., 1996; Motamedi et al., 1997; Motamedi e Shafiee, 1998), o "cluster" de 'hyg' (Ruan et al., 1997) e a sequência completa do "cluster" de genes de FK520 (Wu et al., 2000; Patente U.S. No. 6,150,513). Existe homologia significativa entre genes nestes "clusters" e no "cluster" de genes da rapamicina biossintética e semelhança na função enzimática (Motamedi et al., 1996) .

Crê-se que as acções farmacológicas da rapamicina caracterizadas até à data são mediadas pela interacção com receptores citosólicos designados por FKBPs ou imunofilinas. As imunofilinas (este termo é utilizado para designar proteínas ligantes a imunossupressores) catalisam a isomerização de ligações cís e trans peptidil-prolina e pertencem a uma familia altamente conservada de enzimas encontrada numa grande variedade de organismos (Rosen e Schreiber, 1992). Dois grandes grupos de enzimas pertencentes à familia das imunofilinas são representados pelos FKBPs e ciclofilinas (Schreiber e Crabtree, 1992). O principal receptor intracelular de rapamicina em células eucarióticas é o FKBPl2 (DiLella e Craig, 1991) e o complexo resultante interage especificamente com proteínas alvo para inibir a cascata de transdução de sinal da célula. O FK506, um agente imunossupressor relacionado estruturalmente com a rapamicina, também liga especificamente a FKBP12 mas afecta a imunossupressão através de um mecanismo diferente (Chang et al., 1991; Sigal e Dumont, 1992). A rapamicina e o FK506 competem pelo mesmo sitio de ligação, pelo que o FK506 pode 5

ΕΡ 1 589 031 /PT ter um efeito antagonista com a rapamicina quando os dois fármacos são utilizados em conjunto (Cao et al., 1995). A análise da estrutura cristalina do complexo FKBPl2-rapamicina identificou um farmacóforo de ligação a rapamicina, o chamado "domínio de ligação" (Van Duyne et al., 1993) (ver Figura 1) . O "domínio de ligação" é necessário para a interacção com a imunofilina e consiste, tanto para o FK506 como para a rapamicina, na região C-l a C-14 incluindo a ligação éster, o anel pipecolinilo, o dicarbonilo e o anel hemicetal (ver Figura 2). A interacção é caracterizada por muitos contactos hidrófobos e muitas ligações de hidrogénio incluindo uma com o grupo hidroxilo no anel ciclo-hexano. O anel pipecolinilo (C2 a N7) faz a penetração mais profunda na proteína onde é rodeado por resíduos de aminoácido aromáticos altamente conservados revestindo a cavidade de ligação hidrófoba. Tanto os grupos carbonilo em Cl como aqueles em C8 estão envolvidos na ligação de hidrogénio e o grupo carbonilo em C9 prolonga-se numa bolsa formada por três resíduos de aminoácido aromáticos completamente conservados (um resíduo de tirosina e dois resíduos de ácido fenilalanina) em FKBP12. O domínio do complexo imunofilina-ligando interagindo com a proteína alvo projecta-se de FKBP. O alvo do complexo rapamicina-FKBPl2 foi identificado em levedura como sendo TOR (alvo de rapamicina) (Alarcon et al., 1999) e a proteína de mamífero é conhecida por FRAP (proteína associada a FKBP-rapamicina) ou mTOR (alvo mamífero de rapamicina) (Brown et al., 1994). Estas proteínas apresentam similitude significativa com os domínios fosfotransferase de fosfatidilinositol-3-cinases e a observação de que uma mutação pontual no domínio de ligação a FKBPl2-rapamicina (FRB) de mTOR abole a actividade da mTOR cinase proporciona evidência para o envolvimento de FRB na função do domínio cinase (Vilella-Bach et al., 1999). Foi obtida a estrutura cristalina de FKBPl2-rapamicina com uma forma truncada de mTOR contendo o domínio FRB (Chen et al., 1995), definido assim o domínio "efector" de rapamicina (Choi et al., 1996; Liang et al., 1999). A análise da estrutura cristalina revelou que contactos proteína-proteína são relativamente limitados quando comparada com a interacção entre rapamicina e cada proteína. Não foram identificadas ligações hidrogénio entre rapamicina e FRB. A interacção é concentrada numa série de contactos hidrófobos 6

ΕΡ 1 589 031 /PT entre a região de trienos de rapamicina e principalmente resíduos aromáticos de FRB (Liang et ai., 1999). O átomo de rapamicina mais profundamente inserido é o metilo ligado ao C23 (ver Figura 2) . A região C23 a C34 e o anel ciclo-hexilo de rapamicina faz contactos hidrófobos superficiais com FRB. Foi evidente uma pequena alteração conformacional na rapamicina entre os complexos binário e ternário (Liang et al., 1999).

Foram detectadas divergências entre os efeitos biológicos dos análogos de rapamicina com grupo metoxi em C16 e a sua a sua capacidade de ligar FKBP12 e foi postulada a localização dos substituintes de C16 no espaço interfacial entre FKBP12 e mTOR (Luengo et al., 1995). A análise da estrutura cristalina de FKBP12 com a 28-O-metil-rapamicina não imunossupressora revelou uma diferença significativa na orientação do anel ciclo-hexilo que pode ter como resultado a quebra da ligação com mTOR (Kallen et al., 1996). A rapamicina tem impacto sobre as cascatas de sinalização na célula através da inibição da p70s6k cinase, uma cinase para serina/treonina de eucariotas superiores que fosforila a proteína ribossómica S6 (Ferrari et al., 1993; Kuo et al., 1992) . A proteína S6 está localizada na 40S subunidade ribossómica e crê-se que é um importante sítio funcional envolvido na ligação a ARNt e ARNm. Tem sido postulada uma função reguladora para a tradução de ARNm através de fosforilação de S6 por p70s6k (Kawasome et al., 1998). A rapamicina inibe a síntese proteica através dos seus efeitos sobre outros eventos relacionados com o crescimento, incluindo a actividade de cinases dependentes de ciclina, a fosforilação do modulador do elemento de resposta para o cAMP (CREM) e a fosforilação da proteína de ligação de factor de alongamento 4E-BP-1 (PHAS1) (Hung et al., 1996). O fármaco induz a acumulação da espécie desfosforilada de 4E-BP1 que liga ao factor de iniciação de tradução elF-4E, suprimindo, assim, o início da tradução de ARNms dependentes de cap (Hara et al., 1997; Raught et ai., 2001). Têm sido descritos uma ligação entre sinalização mTOR e síntese proteica localizada em neurónios; o efeito no estado de fosforilação de proteínas envolvido no controlo da 7

ΕΡ 1 589 031 /PT tradução; a abundância de componentes da maquinaria de tradução aos niveis da transcrição e tradução; o controlo da actividade da aminoácido permease e a coordenação da transcrição de muitas enzimas envolvidas nas vias metabólicas (Raught et al., 2001). As vias de sinalização sensíveis a rapamicina também parecem desempenhar um papel importante no desenvolvimento do cérebro embriónico, na aprendizagem e na formação da memória (Tang et al., 2002). Pesquisas sobre as proteínas TOR em levedura também revelaram os seus papéis na modulação de vias de sinalização sensíveis a nutrientes (Hardwick et ai., 1999). Similarmente, a mTOR tem sido identificada como um alvo directo para a acção da proteína cinase B e como tendo um papel chave na sinalização de insulina (Shepherd et al., 1998; Nave et al., 1999). A TOR de mamífero também tem sido implicada na polarização do citoesqueleto de actina e na regulação do início de tradução (Alarcon et al., 1999). As fosfatidilinositol-3-cinases, tais como mTOR, são funcionais em vários aspectos da patogénese de tumores tais como progressão do ciclo celular, adesão, sobrevivência celular e angiogénese(Roymans e Slegers, 2001). A maioria das imunofilinas não parece estar directamente envolvida em actividades imunossupressoras e conhece-se relativamente pouco acerca dos seus ligandos naturais embora tenha havido relatos de candidatos a ligandos naturais das FKBPs denominados proteínas associadas a FKBP (FAP) tais como FAP48 e FAPl. A interacção específica de FAPs com FKBPs durante a formação de complexos foi evitada pela rapamicina de um modo dependente da dose (Chambraud et al., 1996; Kunz et al., 2000). As imunofilinas parecem funcionar numa gama alargada de actividades celulares tais como enrolamento da proteína; montagem e tráfego de proteínas; corregulação de complexos moleculares incluindo proteínas de choque térmico; receptores esteróides; canais de iões; interacções célula a célula e transcrição e tradução de genes (Galat 2000; Hamilton e Steiner 1998) . Todas as imunofilinas possuem a propriedade de enrolamento de proteínas de isomerização cis-trans de peptidil-prolilo e encontram-se várias imunofilinas localizadas no retículo endoplasmático, um sítio principal de síntese proteica na célula. Além da FKBP12 (U.S. 5,109,112) outras imunofilinas incluem as FKBP12.6 (U.S. 5,457,182), FKBP13 (Hendrickson et al., 1993; U.S. 5,498,597), FKBP25 8

ΕΡ 1 589 031 /PT (Hung e Schreiber, 1992; Jin et al., 1992), FKBP14.6 (U.S. 5,354,845), FKBP52 (U.S. 5,763,590), FKBP60 (Yem et al., 1992) e FKBP65 (Patterson et al., 2000). A multidão das FKBP's que estão presentes em diferentes tipos de células também sublinha a utilidade de isolar novos análogos de ligandos de FKBP com domínios de ligação e/ou efector potencialmente alterados.

Estudos farmacocinéticos de rapamicina e de análogos de rapamicina têm demonstrado a necessidade de desenvolvimento de novos compostos de rapamicina que possam ser mais estáveis em solução, mais resistentes a ataque metabólico e que tenham biodisponibilidade melhorada. A modificação usando posições quimicamente disponíveis na molécula tem sido abordada, contudo, esta abordagem tem utilidade limitada, uma vez que os sítios disponíveis para modificação química são limitados e existe menor capacidade de modificar selectivamente uma posição particular. As abordagens biológicas à produção de novos análogos de rapamicina têm sido menos sucedidas devido às dificuldades encontradas em trabalhar com o organismo (Lomovskaya et al., 1997; Kieser et al., 2000) apesar da disponibilidade da sequência do "cluster" de genes biossintético de rapamicina de S. hygroscopicus (Schwecke et al., 1995) .

Tem sido reportada uma gama de análogos de rapamicina sintetizados usando os sítios quimicamente disponíveis de uma molécula. A descrição dos compostos que se seguem foi adaptada ao sistema de numeração da molécula de rapamicina descrita na Figura 1. Sítios quimicamente disponíveis na molécula para derivatização ou substituição incluem grupos hidroxilo em C40 e C28 (e.g. U.S. 5,665,772; U.S. 5,362,718), grupos metoxi em C39 e C16 (e.g. WO96/41807; U.S. 5, 728,710), grupos ceto em C32, C26 e C9 (e.g. U.S. 5, 378, 836; U.S. 5,138,051; U.S. 5,665,772). A hidrogenação em C17, C19 e/ou C21, alvejando o trieno, teve como resultado a retenção da actividade antifúngica mas perda de imunossupressão (e.g. U.S. 5,391,730; U.S. 5,023,262). Através de derivatização têm sido conseguidas melhorias significativas na estabilidade de uma molécula (e.g. formação de oximas em C32, C40 e/ou C28, U.S. 5,563,145, U.S. 5,446,048), resistência ao ataque metabólico (e.g. U.S. 9

ΕΡ 1 589 031 /PT 5,912,253), biodisponibilidade (e.g. U.S. 5,221,670; U.S. 5,955,457; WO98/04279) e na produção de profármacos (e.g. U.S. 6,015,815; U.S. 5,432,183). Contudo, a modificação química requer quantidades significativas de molde ("molde") de rapamicina e, como um composto base e ácido lábil, é difícil de trabalhar com ele. Podendo a derivatização química ser selectiva para o grupo, é frequentemente difícil ser selectiva para o sítio. Consequentemente, a modificação química invariavelmente requer múltiplos passos de protecção e desprotecção e produz produtos mistos com rendimentos variáveis.

Também tem sido descrito o isolamento de análogos de rapamicina usando métodos biológicos tais como biotransformação e modificação genética à base de fago. O isolamento de metabolitos menores tanto de estirpes mutantes e estirpes produtoras de rapamicina proporcionou pequenas quantidades de vários análogos de rapamicina. Estas estirpes têm frequentemente baixo rendimento e produz misturas de análogos de rapamicina. Foi reportado o isolamento de 27-0-desmetilrapamicina e 27-desmetoxi-rapamicina do sobrenadante da cultura de S. hygroscopicus NCIMB 40319 (Box et al., 1995). A actividade antifúngica de 27-O-desmetilrapamicina foi mais baixa do que a da rapamicina mas a inibição da actividade FKBP12 PPlase pareceu ser aumentada. A inibição da proliferação estimulada por ConA de células esplénicas de murino e a inibição da proliferação estimulada por lps de células B esplénicas de murino decresceu quando comparadas com rapamicina (Box et al., 1995). Similarmente, as actividades antifúngicas dos derivados de rapamicina prolilrapamicina, 27-O-desmetilrapamicina e 27-desmetoxi-rapamicina foram mais baixas do que a de rapamicina (Wong et al., 1998). análogos de rapamicina (16-O-desmetilrapamicina, 27-O-desmetilrapamicina, 39-O-desmetilrapamicina, 16,27-O-bisdesmetilrapamicina, prolilrapamicina, 26-O-desmetilprolilrapamicina, 9-desoxo-rapamicina, 27-desmetoxi-rapamicina, 27-desmetoxi-39-0-desmetilrapamicina, 9-desoxo-27-desmetoxi-rapamicina, 28-de-hidro-rapamicina, 9-desoxo-27-desmetoxi-39-0-desmetilrapamicina) foram também isolados a partir de Actinoplanes sp N902-109 após adição de alimentação de inibidores e/ou precursor de citocromo P450 à cultura ou após biotransformação de rapamicina isolada (Nishida et al., 1995). Contudo, a 10

ΕΡ 1 589 031 /PT utilização destes inibidores apenas permite o alvejamento de uma função enzimática particular e não é selectiva para o sitio. A produção racional de um só análogo seleccionado não é possível por este método. A produção resultante de misturas de análogos de rapamicina em vez de um a só produto desejado também tem impacto sobre o rendimento. A actividade inibitória da reacção de linfócito mistos (MLR) dos compostos foi avaliada e detectou-se pouco efeito sobre a actividade após a perda do grupo metilo em C27 ou/e C16. Acresce que, a 9-desoxo-rapamicina apresentou uma diminuição mais significativa na actividade e a perda do grupo metoxi em C2 7, do grupo hidroxi em C28 e a substituição de um grupo prolilo por um grupo pipecolinilo, teve como resultado uma redução na potência (Nishida et al., 1995). Similarmente, foram reportados a biotransformação de rapamicina e o isolamento de 16,39-O-bisdesmetilrapamicina (WO 94/09010). A retenção de actividade inibitória em ensaios de proliferação celular com compostos modificados no anel ciclo-hexilo, e.g. 39-0-desmetilrapamicina e modificações em C40 tais como SDZ RAD, identificam esta região da molécula como um alvo para a geração de novos análogos de rapamicina. Foram reportados novos análogos de rapamicina após alimentação de ácido ciclo-hexanocarboxílico, ácido ciclo-heptanocarboxílico, ácido ciclo-hex-l-enocarboxílico, ácido 3-metilciclo- hexanocarboxílico, ácido ciclo-hex-3-enocarboxílico, ácido 3-hidroxiciclo-hex-4-enocarboxílico e ácido ciclo-hept-1-enocarboxílico a culturas de S. hygroscopicus demonstrando assim a flexibilidade no módulo de carregamento da rapamicina policétido sintase (P.A.S. Lowden, Tese de doutoramento, Universidade de Cambridge, 1997) . Estes novos análogos de rapamicina foram produzidos em competição com o iniciador natural, ácido 4,5-di-hidroxiciclo-hex-l-enocarboxílico, tendo como resultado rendimentos reduzidos e produtos mistos.

Tem sido reportado o isolamento de estirpes recombinantes de S. hygroscopicus que produzem vários análogos de rapamicina, usando métodos biológicos mediados por tecnologia de fagos (Lomovskaya et al., 1997). Na presença de derivados de prolina adicionados, um mutante de deleção S. hygroscopicus rapL sintetizou os novos análogos de rapamicina prolilrapamicina, 4-hidroxiprolilrapamicina e 4-hidroxiprolill-26-desmetoxi-rapamicina (Khaw et al., 1998). 11

ΕΡ 1 589 031 /PT

Similarmente, identificaram-se como descrito na WO98/54308 as novas rapamicinas 3-hidroxi-prolil-rapamicina, 3-hidroxi-prolil-26-desmetoxi-rapamicina, e ácido trans-3-aza-biciclo[3,1,0]hexano-2-carboxílico-rapamicina. A actividade da prolilrapamicina e 4-hidroxiprolil-26-desmetoxi-rapamicina foi avaliada em ensaios de proliferação e a actividade inibitória do último composto era significativamente inferior à da rapamicina (Khaw et al., 1998). A deleção de cinco genes contíguos, rapQONML (responsável por modificações pós- policétido em C16, C27 e pela produção de ácido L-pipecólico) e a sua substituição com um marcador de resistência à neomicina em S. hygroscopicus ATCC29253 usando metodologia à base de fago teve como resultado a produção de 16-O-desmetil-27-desmetoxi-rapamicina quando alimentado com ácido pipecólico (Chung et al., 2001). Não foi demonstrada complementação deste mutante de deleção usando esta tecnologia. Além disso, a funcionalidade específica de sítio de rapM e rapQ permanece pouco clara, portanto, a concepção ("design") racional de análogos de rapamicina requerendo metilação em C16-OH ou C27-OH não foi permitida. A metodologia à base de fago sofre de uma série de desvantagens como se descreve com mais detalhe abaixo. Ela oferece um processo difícil e demorado de obter estirpes geneticamente manipuladas e tem uma reduzida versatilidade em comparação com a metodologia revelada nesta presente patente.

As abordagens convencionais para manipular genes modificadores de rapamicina usando métodos biológicos compreendem a mutação ou deleção de genes individuais no cromossoma da estirpe hospedeira ou/e a inserção de genes individuais como cópias extra de genes homólogos ou heterólogos quer individualmente quer como cassetes de genes (W001/79520, WO 03/048375). Contudo, o isolamento de novos análogos de rapamicina usando estes métodos biológicos tem sido limitado devido às dificuldades em transformar o organismo produtor de rapamicina S. hygroscopicus. Tem sido reportado que os métodos de transformação com ADN de plasmídeo ou transferência por conjugação usados comummente não tiveram sucesso com estirpe produtora de rapamicina (Lomovskya et al., 1997, Schweke et al., 1995, Kieser et al., 2000). O estado actual da técnica usa uma metodologia de Lomovskya et al. (1997), um método à base de fago de trabalho intensivo que 12

ΕΡ 1 589 031 /PT está gravemente limitado pelo tamanho dos fragmentos de ADN clonado transferido para S. hygroscopicus (Kieser et al., 2000). Esta tecnologia está limitada à transferência de um máximo de 6,4 kb de ADN clonado. Assim, quando complementar um mutante de deleção usando esta tecnologia, o manipulador está limitado à inclusão de ~2 genes funcionais além do desejado promotor, regiões de homologia e marcador de resistência. A informação genética para o "cluster" de genes biossintético de rapamicina está disponível desde 1995 (Schwecke et al., 1995), contudo, tem havido um progresso limitado nesta área (Khaw et al., 1998; Chung et al., 2001; WOOl/34816).

Sumário do Invento O presente invento proporciona um método de gerar análogos de ligandos de FKBP o qual incorpora uma unidade de iniciação não natural, compreendendo o referido método: (a) gerar uma estirpe recombinante na qual pelo menos o homólogo rapK foi delecionado ou inactivado; e (b) alimentar uma unidade de iniciação não natural à referida estirpe. O presente invento também proporciona métodos recombinantes para a transformação eficiente de estirpes que contêm um "cluster" biossintético codificando para um ligando de FKBP, por exemplo, mas não se lhes limitando, Streptomyces hygroscopicus subsp. hygroscopicus NRRL 5491, Actinoplanes sp. N902-109 FERM BP-3832, Streptomyces sp. AA6554, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus MA 6475 ATCC 14891,

Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus MA 6678 ATCC 55087, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus MA 6674, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus ATCC 55276, Streptomyces tsukubaensis No.9993 FERM BP-927, Streptomyces hygroscopicus subsp. yakushimaensis, Streptomyces sp. DSM 4137, Streptomyces sp. DSM 7348, Micromonospora n.sp. A92-306401 DSM 8429, Streptomyces sp. MA 6858 ATCC 55098, Streptomyces sp. MA 6848, compreendendo os referidos métodos: (a) construir um plasmideo conjugativo de deleção numa estirpe de E. coli que é dam”, dcm” ou dam” e dcm”. (b) gerar esporos da referida estirpe adequada para conjugação, onde a referida estirpe é feita crescer a uma 13

ΕΡ 1 589 031 /PT humidade de entre 10% e 40% e os esporos são colhidos entre o 5o e 30° dia; (c) conjugar a estirpe de E. coli do passo (a) com os esporos do passo (b) num meio que compreende, por litro: i) 0,5g a 5g de macerado de milho em pó, ii) 0,1 g a 5g de extracto de levedura, iii) 0,lg a lOg de carbonato de cálcio; e iv) 0,01 g a 0,5 g de sulfato de ferro; contendo os referidos meios adicionalmente BACTO Agar e amido e tendo sido secos para resultar numa perda de peso de 1-20%; e (d) opcionalmente cultivar a estirpe sob condições adequadas para produção de policétido.

Numa concretização preferida os métodos são usados para a transformação de Streptomyces hygroscopicus subsp. hygroscopicus (e.g. NRRL 5491), Actinoplanes sp. N902-109 (e.g. FERM BP-3832), Streptomyces sp. AA6554, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus (e.g. MA 6475 ATCC 14891), Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus (e.g. MA 6678 ATCC 55087), Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus (e.g.MA 6674), Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus (e.g. ATCC 55276), Streptomyces tsukubaensis No.9993 (e.g. FERM BP-927), Streptomyces hygroscopicus subsp. yakushimaensis, Streptomyces sp. (e.g. DSM 4137), Streptomyces sp. (e.g. DSM 7348), Micromonospora n.sp. A92-306401 (e.g. DSM 8429) ou Streptomyces sp. (e.g. MA 6858 ATCC 55098) . Numa concretização mais preferida, os métodos são usados para a transformação de: S. hygroscopicus subsp. hygroscopicus (e.g. NRRL 5491) ou S. hygroscopicus var. ascomyceticus (e.g. ATCC 14891) . Numa concretização ainda mais preferida, os métodos são usados para a transformação do produtor de rapamicina S hygroscopicus subsp. hygroscopicus (e.g. NRRL 5491).

Portanto o presente invento também proporciona uma estirpe recombinante que contém "clusters" biossintéticos que codificam ligandos de FKBP onde um ou mais genes auxiliares foram delecionados ou inactivados usando os métodos aqui descritos. 14

ΕΡ 1 589 031 /PT

Num outro aspecto, o presente invento proporciona métodos recombinantes e materiais para expressar combinações de enzimas de modificação de policétido de modo a produzir novos análogos de policétido. Numa concretização especifica, o presente invento proporciona métodos recombinantes e materiais para expressar as combinações de enzimas responsáveis por modificação pós-PKS e/ou fornecimento de precursor a partir de "clusters" biossintéticos que codificam ligandos de FKBP, por exemplo, mas não se lhes limitando, rapamicina, FK506, FK520, FK523, FK525, antascomicina, meridamicina, tsukubamicina e seus análogos e métodos para a produção de análogos em células hospedeiras recombinantes. Numa concretização preferida os métodos recombinantes e materiais são utilizados para expressar as combinações de enzimas responsáveis por modificação pós-PKS e/ou fornecimento de precursor na biossintese de rapamicina, FK520, FK506 e 'hyg' e métodos para a produção de análogos de rapamicina, FK520, FK506 e 'hyg' em células hospedeiras recombinantes. Numa concretização ainda mais preferida os métodos recombinantes e materiais são utilizados para expressar as combinações de enzimas responsáveis por modificação pós-PKS e/ou fornecimento de precursor na biossintese de rapamicina e métodos para a produção de análogos de rapamicina em células hospedeiras recombinantes.

Amplamente, o presente invento ocupa-se da alteração de um sistema de genes que tem uma porção de núcleo responsável pela produção de um produto básico, e uma multiplicidade de genes modificadores responsáveis por efectuar relativamente pequenas modificações no produto básico - e.g. efectuar glicosilação, oxidação, redução, alquilação, desalquilação, acilação ou ciclização do produto básico, e uma multiplicidade de genes de fornecimento de precursor que estão envolvidos na produção de compostos precursores particulares (e.g. pipecolato; ácido 4,5-di-hidroxiciclo-hex-l-enocarboxilico). Assim, o produto básico pode ser um policétido modular e os genes modificadores podem estar relacionados com glicosilação e/ou outras modificações da cadeia de policétido, e os genes de fornecimento de precursor pode estar envolvidos na produção e/ou incorporação de precursores naturais ou não naturais (e.g. pipecolato e/ou ácido 4,5-di-hidroxiciclo-hex-l-enocarboxílico no sistema de rapamicina ). 15

ΕΡ 1 589 031 /PT A porção de núcleo não pode funcionar adequadamente ou não pode mesmo funcionar na ausência de um gene de fornecimento de precursor (a menos que seja fornecido um composto precursor natural ou não natural ou este esteja de outro modo disponível).

Num aspecto, o invento proporciona métodos para a alteração de um sistema de genes com uma porção de núcleo que não pode funcionar devido a uma deleção ou inactivação de um gene de fornecimento de precursor. Sistemas de gene adequados incluem, não se lhes limitando, os "clusters" biossintéticos de rapamicina, antascomicina, FK520, FK506, 'hyg', FK523, meridamicina, FK525 e tsukubamicina. Neste aspecto do invento, o gene de fornecimento de precursor em falta é preferivelmente rapK ou um homólogo de rapK (e.g. fkbO no "cluster" de genes FK506 ou FK520). O sistema de genes é preferivelmente o "cluster" de rapamicina. O gene de fornecimento de precursor em falta é mais preferivelmente rapK. Este aspecto do invento proporciona métodos para a produção eficiente de uma multiplicidade de produtos básicos através da incorporação de precursores naturais ou não naturais (e.g. ácido 4,5-di- hidroxiciclo-hex-l-enocarboxílico). Os métodos também podem concretizar outros aspectos como se refere abaixo.

Outro tipo de sistema é um sistema de péptido não ribossómico ("NRP") onde o produto básico é um péptido e os genes modificadores são genes responsáveis por modificações a um péptido (glicosilação, redução etc), e os genes de fornecimento de precursor são genes envolvidos na produção de resíduos de aminoácido não usuais a ser incorporados no péptido. Os sistemas também podem ser de tipo misto, e.g. possuindo uma parte policétido e uma parte com uma origem biossintética diferente, e.g. NRP. De facto, a rapamicina como um exemplo disso, uma vez que o residuo pipecolato é um resíduo de aminoácido adicionado por uma enzima similar às encontradas nos sistemas NRP.

Estes genes modificadores e genes de fornecimento de precursor podem ser olhados como "genes auxiliares" para a síntese de policétido e o termo "genes auxiliares" como aqui usado pode referir-se a genes modificadores, genes de fornecimento de precursor ou a ambos. 16

ΕΡ 1 589 031 /PT A alteração do sistema de genes envolve a criação de um sistema de funcionamento alterado, no qual o conjunto de genes auxiliares foi alterado. Assim um ou mais genes auxiliares (e preferivelmente dois ou mais, três ou mais, quatro ou mais, cinco ou mais, seis ou mais ou sete ou mais) podem ter sido delecionados (ou tornados não funcionais) e/ou substituídos por genes diferentes.

Isto pode envolver um "sistema de deleção " compreendendo ácido nucleico que codifica um sistema de genes a que falta uma multiplicidade de genes funcionais auxiliares. Este sistema de deleção pode depois ser complementado com um ou mais genes funcionais auxiliares (que podem ser os mesmo ou diferentes dos genes que substituem). Isto pode ser realizado combinatoriamente, sendo um sistema de deleção complementado por uma multiplicidade de genes e conjuntos de genes diferentes.

Um sistema alterado que difere do sistema natural por lhe faltar um ou mais funções modificadoras pode ser produzido(a) produzindo um sistema de deleção e restaurando por complementação menos do que todos os genes delecionados; ou (b) delecionando ou inactivando selectivamente genes de um sistema existente. Num sistema alterado produzido de acordo com (b) os genes podem ser inactivados por mutagénese dirigida ao sítio de um sítio activo importante na função da proteína (mutação pontual no sítio activo), por truncagem do gene através mutação de desvio de estrutura, por uma deleção na estrutura de uma secção do gene importante para a sua função, tal como um sítio activo; deleção ou inactivação parcial por mutação pontual. Todos podem ser realizados por recombinação dupla e seleccionando para o genótipo mutante, ou por recombinação simples. Numa concretização preferida o sistema alterado é produzido pelo método (a) . Estes métodos também poderiam ser utilizados na produção de um sistema de deleção . A abordagem de "complementação" (a) é preferivelmente homóloga, por os genes "restaurados" serem do mesmo "cluster" de genes, contudo, a complementação heteróloga, na qual os genes "restaurados" são seleccionados de um "cluster" biossintético diferente que codifica ligandos de FKBP, é também contemplada pelo presente invento. Numa concretização preferida os genes "restaurados" são essencialmente os mesmos 17

ΕΡ 1 589 031 /PT genes delecionados, ou são suas variantes, que executam funções similares.

Num outro aspecto do invento, um sistema alterado com um gene de fornecimento de precursor delecionado (ou não funcional) pode ser alimentado com precursores alternativos de modo a produzir produtos variantes.

Um tipo de concretização preferido, aplicado a um sistema de policétido sintase ("PKS"), é um método para produzir policétidos compreendendo: (a) proporcionar uma estirpe de um organismo que contém um ou mais genes para PKS expressáveis para produzir um PKS funcionante que pode gerar um policétido no organismo, por exemplo genes para PKS que codificam um ligando de FKBP, faltando ao organismo um ou mais (e preferivelmente uma pluralidade) de genes funcionais auxiliares naturalmente associados aos referidos genes para PKS que codificam produtos de gene capazes de efectuar as modificações correspondentes do policétido; e (b) efectuar a complementação obrigando o referido organismo a expressar um ou mais genes auxiliares, constituindo os genes modificadores expressos um conjunto incompleto de genes auxiliares naturalmente associados aos referidos genes para PKS e/ou compreendendo um ou mais genes auxiliares variantes; e (c) cultivar a referida estirpe e opcionalmente isolar os análogos de policétido produzidos. 0 passo de proporcionar uma estirpe de um organismo contendo um ou mais genes para PKS pode incluir um passo de proporcionar ácido nucleico que codifica um "cluster" de genes compreendendo os referidos um ou mais genes para PKS e faltando-lhes os referidos um ou mais genes auxiliares; e introduzir o referido ácido nucleico no organismo.

Os genes para PKS são preferivelmente genes de rapamicina. Os genes auxiliares que faltam são preferivelmente um ou mais de rapK, rapl, rapQ, rapM, os genes contíguos rapN e O (aqui designados por rapN/Ο), rapL e rapJ. Em concretizações específicas contempladas pelo presente invento: i) falta um gene auxiliar, por exemplo, falta rapK; rapl; rapQ; rapM; rapL, rapN/Ο ou rapJ; preferivelmente quando falta um gene auxiliar, ele é seleccionado de entre o 18

ΕΡ 1 589 031 /PT grupo consistindo em rapK; rapJ; rapl; rapQ; rapM; rapN/O e ii) faltam dois genes auxiliares, por exemplo: faltam rapKrapI; rapKrapQ; rapKrapM; rapKrapNIO; rapKrapL; rapKrapJ; rapk/rapQ; raplrapM; raplrapNlO; raplrapL; raplrapJ; rapQrapM; rapQrapN/ 0; rapQrapL; rapQrapJ; rapMrapN/ O; rapMrapL; rapMrapJ; rapN/ OrapL; rapN/ OrapJ ou rapLrapJ;

iii) faltam três genes auxiliares, por exemplo: faltam rapKrapI rapQ; rapKrapI rapM; rapKrapI rapN/ O; rapKrapI rapL; rapKrapIrapJ; rapKrapQrapM; rapKrapQRapN/ O; rapKrapQrapL; rapKrapQrapJ; rapKrapMrapN/ 0; rapKrapMrapL; rapKrapMrapJ; rapKrapN/ OrapL; rapKrapN/ OrapJ; rapKrapLrapJ; rapIrapQrapM; raplrapQrapN/ O; rapIrapQrapL; rapIrapQrapJ; rapl rapMrapN/ O; rapIrapMrapL; rapl rapMrapJ; rapl rapN/OrapL; rapIrapN/OrapJ; rapIrapLrapJ; rapQrapMrapN/ 0; rapQrapMrapL; rapQrapMrapJ; rapQrapN/ OrapL; rapQrapN/ OrapJ; rapQrapLrapJ; rapMrapN/ OrapL; rapMrapN/ OrapJ; rapMrapLrap ou rapN/ OrapLrapJ iv) faltam quatro genes auxiliares, por exemplo: faltam rapKraplrapQrapM; rapKrapI rapQrapN/ 0; rapKrapI rapQrapL; rapKrapI rapQrapJ; rapKrapI rapMrapN/ O; rapKrapI rapMrapL; rapKrapI rapMrap J; rapKrapIrapN/ OrapL; rapKrapIrapN/ OrapJ; rapKrapIrapLrapJ; rapKrapQ rapMrapN/ O; rapKrapQrapMrapL; rapKrapQrapMrapJ; rapKrapQrapN/ OrapL; rapK, rapQ, rapN/ 0, rapJ; rapKrapQrapLrapJ; rapKrapMrapN/ OrapL; rapl rapQrapMrapJ; rapl rapQrapLrapJ; rapJrapMrapLrapJ; rapQrapMrapN/ OrapJ; rapKrapMrapN/ OrapJ; rapKrapMrapLrapJ; rapKrapN/ OrapLrapJ; rapl rapQrapMrapN/ 0; rapl rapQrapMrapL; rapl rapQrapN/ OrapL; rapl rapQrapN/ OrapJ; rapIrapMrapN/ OrapL; rapIrapMrapN/ OrapJ; rapl rapN/ OrapLrapJ; rapQrapMrapN/ OrapL; rapQrapMrapLrapJ; rapQrapN/ OrapLrapJ ou rapMrapN/ OrapLrapJ; v) faltam cinco genes auxiliares; por exemplo: faltam rapKrapI rapQrapMrapN/ 0; rapKrapIrapQrapMrapL; rapKrapIrapQrapMrapJ; rapKrapIrapQrapN/ OrapL; rapKrapIrapQrapN/ OrapJ; rapKrapIrapQrapLrapJ; rapKrapIrapMrapN/ OrapL; rapKrapIrapMrapN/ OrapJ; rapKrapIrapMrapLrapJ; rapKrapIrapN/ OrapLrapJ; rapKrapQrapMrapN/ OrapL; rapKrapQrapMrapN/ OrapJ; rapKrapQrapMrapLrapJ; rapKrapQrapN/ OrapLrapJ; rapKrapMrapN/ OrapLrapJ; rapIrapQrapMrapN/ OrapL; rapIrapQrapMrapN/ OrapJ; rapIrapQrapN/ OrapLrapJ; rapIrapMrapN/OrapLrapJ; rapQrapMrapN/OrapLrapJ ou raplrapQrapMrapLrapJ; vi) faltam seis genes auxiliares, por exemplo: faltam rapKrapI rapQrapMrapN/ OrapL; rapKrapI rapQ rapMrapN/ OrapJ; 19

ΕΡ 1 589 031 /PT rapKrap I rapQrâpMrapLrapJ; rapKrapIrapQrapN/ OrapLrapJ; rapKrapIrapMrapN/ OrapLrapJ; rapKrapQrapMrapN/ OrapLrapJ ou rapIrapQrepMrapN/ OrapLrapJ; ou vii)faltam sete genes auxiliares; e.g. faltam rapKrapIrapQrapMrapN/ OrapLrapJ. A expressão "faltam um ou mais genes auxiliares funcionais" cobre tanto a falta de um gene como a presença de um gene mas num estado de não funcionamento, e.g. porque foi especificamente incapacitado.

Num aspecto, o invento proporciona uma via nova e expedita para a incorporação eficiente de precursores naturais e não naturais em ligandos de FKBP. Estes incluem, não se lhes limitando, os sistemas rapamicina, antascomicina, FK520, FK506, hyg', FK523, meridamicina, FK525 e tsukubamicina policétido-sintase/péptido não ribossómico-sintase, o invento proporciona assim novos análogos dos seus correspondentes produtos naturais. Num aspecto especifico, o invento proporciona uma via nova e expedita para a incorporação eficiente de precursores naturais ou não naturais proporcionando novos análogos de rapamicina.

Portanto num aspecto, o presente invento proporciona um método de gerar análogos de ligandos de FKBP que incorpora uma unidade de iniciação não natural, compreendendo o referido método: (a) gerar uma estirpe recombinante na qual pelo menos o homólogo rapK foi delecionado ou inactivado; e (b) alimentar uma unidade de iniciação não natural à referida estirpe

Numa concretização preferida, a estirpe recombinante é gerada usando os métodos do presente invento.

Proporcionamos também bibliotecas de compostos e compostos individuais disponíveis usando esses sistemas. Assim, um composto típico é uma variante de um composto produzido naturalmente por um sistema de genes que tem uma porção de núcleo responsável pela produção de um produto básico, e uma multiplicidade de genes auxiliares responsáveis por efectuar 20

ΕΡ 1 589 031 /PT modificações relativamente pequenas no produto básico, sendo a variante produtivel por um sistema alterado de modo que um ou mais dos genes auxiliares estão ausentes, não funcionais, ou foram substituídos por variantes funcionais. Uma classe preferida de compostos é a dos análogos de rapamicina correspondendo a produtos de um sistema de rapamicina onde um ou mais dos genes seleccionados de entre o grupo consistindo em rapk, rapl, rapQ, rapM, rapN, rapO, rapL e rapJ genes estão ausentes, não funcionais ou são variantes.

Também proporcionamos novos análogos de FKBP, incluindo análogos de rapamicina. Estes compostos podem ter uma ou mais propriedades úteis, por exemplo mas sem limitação, utilidade como imunossupressores, agentes antifúngicos, agentes anticancro, agentes neuro-regenerativos, ou agentes para o tratamento de psoriase, artrite reumatóide, fibrose e outras doenças hiperproliferativas.

Como aqui utilizado, o termo " gene(s) modificador(es)" inclui os genes necessários para modificações pós-policétido sintase do policétido, por exemplo, mas não se lhes limitando, monooxigenases do citocromo P-450, ferredoxinas e 0-metiltransferases dependentes de SAM. No sistema de rapamicina estes genes modificadores incluem rapN/Ο, rapM, rapl, rapQ, e rapJ mas um perito na técnica reconhecerá que os sistemas PKS relacionados com a rapamicina (por exemplo mas sem limitação: FK506, FK520, antascomicina, 'hyg', FK523, meridamicina, FK525 e tsukubamicina) terão homólogos de pelo menos um subconjunto destes genes, alguns dos quais são ainda discutidos abaixo.

Como aqui utilizado, o termo "gene(s) de fornecimento de precursor" inclui os genes necessários para o fornecimento dos precursores naturais ou não naturais, os genes necessários para a sintese de quaisquer precursores incorporados naturalmente ou não naturalmente e os genes necessários para a incorporação de quaisquer precursores incorporados naturalmente ou não naturalmente. Por exemplo, mas não se lhes limitando, no sistema de rapamicina estes genes incluem rapL, rapK e rapP mas um perito na técnica reconhecerá que os sistemas PKS relacionados com rapamicina (por exemplo mas sem 21

ΕΡ 1 589 031 /PT limitação: FK506, FK520, antascomicina, 'hyg', FK523, meridamicina, FK525 e tsukubamicina) terão homólogos destes genes, alguns dos quais são ainda discutidos abaixo.

Como aqui utilizado, o termo " gene(s) auxiliar(es)" inclui referências a genes modificadores, genes de fornecimento de precursor ou ambos, genes modificadores e genes de fornecimento de precursor.

Como aqui utilizado, o termo "precursor" inclui as unidades de iniciação naturais (i.e. ácido 4,5-di- hidroxiciclohex-l-enocarboxilico), unidades de iniciação não naturais, e aminoácidos incorporados naturalmente (i.e. ácido pipecólico) e aminoácidos não incorporados naturalmente.

Como aqui utilizado, o termo "unidade de iniciação não natural" refere-se a quaisquer compostos que possam ser incorporados como unidade de iniciação em síntese de policétido que não sejam a unidade de iniciação usualmente escolhida por esse PKS.

Como aqui utilizado, o termo "ligandos de FKBP" refere-se a compostos que se ligam a imunofilina FKBP, contendo esses compostos preferencialmente uma a, β-dicetoamida onde o β-ceto está mascarado como hemi-acetal. Estes compostos incluem, não lhes estando limitados, rapamicina, FK520, FK506, antascomicina, hyg', FK523, meridamicina, FK525 e tsukubamicina.

Como aqui utilizado, o termo ""clusters" biossintéticos que codificam ligandos de FKBP" inclui, não se lhe limitando, o "cluster" de genes que dirige a síntese de rapamicina, FK506, FK520, 'hyg', FK523, antascomicina, meridamicina, FK525 e tsukubamicina.

Como aqui utilizado, o termo "estirpes que contêm "clusters" biossintéticos que codificam ligandos de FKBP" inclui, não se lhe limitando: Streptomyces hygroscopicus subsp. hygroscopicus {e.g. NRRL 5491), Actinoplanes sp. N902-109 (e.g. FERM BP-3832), Streptomyces sp. AA6554, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus MA 6475 (e.g. ATCC 14891),

Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus MA 6678 (e.g. 22

ΕΡ 1 589 031 /PT ATCC 55087), Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus MA 6674, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus (e.g. ATCC 55276), Streptomyces tsukubaensis No.9993 (e.g. FERM BP-927), Streptomyces hygroscopicus subsp. yakushimaensis, Streptomyces sp. {e.g. DSM 4137), Streptomyces sp. (e.g. DSM 7348),

Micromonospora n.sp. A92-306401 (e.g. DSM 8429) ou

Streptomyces sp. MA 6858 (e.g. ATCC 55098).

Como aqui utilizado, o termo "homólogo rapK" refere-se a homólogos do gene para rapamicina rapK de outros "clusters" biossintéticos que codificam ligandos de FKBP, por exemplo mas não se lhes limitando: o gene fkbO do "cluster" para FK520, o gene fkbO do "cluster" para FK506 e o 0rf5 no "cluster" para 'hyg'. Estes homólogos de rapKs desempenham a mesma função que rapK na sintese destes ligandos de FKBP relacionados, nomeadamente eles são essenciais para o fornecimento da unidade de iniciação natural. Preferivelmente, estes homólogos de rapK têm pelo menos 40% de identidade de sequência, preferivelmente pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de rapK como se mostra na Figura 27 (SEQ ID NO:13).

Descrição Detalhada do invento

Num aspecto, o presente invento proporciona um método novo e expedito para a transformação de S. hygroscopicus. A utilização de tecnologia de fagos para o isolamento de estirpes geneticamente modificadas de S. hygroscopicus foi anteriormente descrita (Khaw et al., 1998; Lomovskaya et al., 1997). Contudo, nenhum outro método, além da transfecção, foi alguma vez reportado para a introdução de ADN na estirpe produtora de rapamicina S. hygroscopicus. De facto, anteriormente tem sido afirmado que os métodos usados comummente de transformação com ADN de plasmídeo ou transferência por conjugação não tiveram sucesso com a estirpe produtora de rapamicina (Lomovskaya et al., 1997, Kieser et al., 2000; Schweke et al., 1995).

No presente invento, surpreendentemente foi estabelecido um protocolo de conjugação para transformar com sucesso S. hygroscopicus como se descreve no Exemplo 1. A metodologia 23 ΕΡ 1 589 031 /PT foi exemplificada pelo isolamento do mutante de deleção em S. hygroscopicus MG2-10 (Exemplo 2) e pela expressão de genes e combinações de genes como se descreve nos Exemplos 3, 5 e 15.

Portanto, num aspecto, o presente invento proporciona um método para produzir uma estirpe recombinante que contém "clusters" biossintéticos que codificam ligandos de FKBP onde um ou mais genes auxiliares foram delecionados ou inactivados, compreendendo o referido método: (a) a construção de um plasmideo conjugativo numa estirpe de E. coli que é dam“, dcm“ ou dam- e dcrrf; (b) a geração de esporos da referida estirpe adequada para conjugação, onde a referida estirpe é feita crescer a uma humidade de entre 10% e 40% e os esporos são colhidos entre o 5o e 30° dia; (c) a conjugação da estirpe de E. coli do passo (a) com os esporos do passo (b) num meio que compreende por litro: i) 0,5g a 5g de macerado de milho em pó, ii) 0,1 g a 5g de extracto de levedura, iii) 0,lg a lOg de carbonato de cálcio; e iv) 0,01 g a 0,5 g de sulfato de ferro; contendo os referidos meios adicionalmente BACTO Agar e amido e tendo sido secos para resultar numa perda de peso de 1-20%; e (d) opcionalmente cultivar a estirpe sob condições adequadas para produção de policétido.

Preferivelmente a estirpe de E coli do passo (a) é dam” e dcm“.

Preferivelmente, no passo (b) os esporos são colhidos entre o 10° e 25° dia ou entre o 14° e o 21° dia. Noutra concretização, no passo (b) a estirpe é feita crescer a uma humidade de entre 10 e 20%.

Numa concretização especifica o amido nos meios usados no passo (c) é amido de trigo. 24

ΕΡ 1 589 031 /PT

Em concretizações preferidas os meios usados no passo (c) compreende lg a 4g de macerado de milho em pó, lg a 4g de extracto de levedura, lg a 5g de carbonato de cálcio; e 0,2g a 0,4 g de sulfato de ferro por litro. Numa concretização mais preferida os meios compreende por litro: 2,5g de macerado de milho em pó, 3g de extracto de levedura, 3g de carbonato de cálcio; e 0,3g de sulfato de ferro; A estratégia de complementação revelada neste invento proporciona um método expedito para avaliar e identificar a função de cada gene auxiliar i.e. rapK, rapQ, rapN/O, rapM, rapL, rapJ e/ou rapl na biossíntese de rapamicina. O produto génico RapK foi anteriormente identificado como um candidato interessante para uma dioxigenase dependente de pteridina que poderia também catalisar um passo oxidativo na biossíntese de rapamicina (Molnár et al., 1996). O gene homólogo fkbO foi identificado no "cluster" de genes biossintético de FK506 e devido à similitude estrutural de rapamicina e FK506 foi postulado um papel para rapK na oxidação do grupo OH em C9 (Motamedi et al., 1996). As revelações dos Exemplos 3, 4 e 6, descrevendo a produção dependente de rapK de pré-rapamicina por S. hygroscopicus MG2-10[pSGsetrapK] sugere que RapK tem pelo menos uma função adicional na biossíntese de rapamicina.

Noutro aspecto, portanto, os métodos do presente invento conduzem à elucidação da função de RapK, nomeadamente de que a expressão do gene rapK é essencial para uma acumulação de qualquer produto macrólido ciclizado. Num outro aspecto, o presente invento descreve a complementação de S. hygroscopicus MG2-10 com fkbO, o homólogo de rapK do "cluster" de FK520, com a observação surpreendente da produção dependente de fkbO de pré-rapamicina por S. hygroscopicus MG2-10[pMGl69-l] (Exemplo 11) . Pode ser observado por um perito na técnica que o fkbO preenche uma função similar na produção de FK520 à de rapK e fkbO na produção de pré-rapamicina. Além disso, um perito na técnica reconhecerá que outros homólogos de rapK, incluindo mas não se lhes limitando, fkbO no "cluster" de FK506, fkbO no "cluster" de FK520 e 0rf5 no "cluster" de 'hyg' também preenchem a mesma função. Num outro aspecto do invento, os homólogos de rapK em "clusters" biossintéticos que codificam ligandos de FKBP, incluindo, mas não se lhes limitando, FK506, FK520, FK525, antascomicina, FK523, tsukubamicina, e 'hyg' 25

ΕΡ 1 589 031 /PT podem ser delecionados ou inactivados, proporcionando estirpes incapazes de fazer os seus correspondentes e conhecidos produtos naturais. Similarmente, a estratégia de complementação delineada acima proporciona um método expedito para investigar a função, especificidade e ordem dos produtos expressos de genes auxiliares na biossintese de outros policétidos ou péptidos não ribossómicos.

Numa classe preferida de concretização, o presente invento proporciona um método para a produção de uma estirpe hospedeira recombinante capaz de produzir análogos de rapamicina, envolvendo ainda a construção de deleções genómicas, incluindo, mas não se lhes limitando, rapQONMLKJI introduzida em S. hygroscopicus e complementação ou complementação parcial expressando genes simples ou combinações de genes, incluindo, mas não se lhes limitando, rapK, rapl, rapQ, rapM, os genes contíguos rapN e O (aqui designadas por rapN/Ο), rapL e rapJ, em cassetes de genes. Além disso, o invento proporciona um método de produzir os referidos análogos de rapamicina cultivando a referida estirpe hospedeira recombinante, e opcionalmente isolando os análogos de rapamicina produzidos. Assim, a estirpe recombinante MG2-10[pSGsetrapK], produzida por complementação da estirpe de deleção genómica S. hygroscopicus MG2-10, com rapK, foi cultivada para produzir 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-39-O-desmetil-rapamicina (pré-rapamicina).

Num outro aspecto desta classe do invento, a estratégia envolve a integração de um vector compreendendo um subconjunto de genes incluindo, mas não se lhes limitando, rapK, rapl, rapQ, rapM, rapN, rapO, rapL e rapJ no mutante de deleção S. hygroscopicus acima. Esta integração pode ser realizada usando uma variedade de funções de integração disponíveis incluindo mas não se lhes limitando: vectores à base de Φ031, vectores à base de pSAM2 integrase (e.g. em pPM927 (Smovkina et al., 1990)), R4 integrase (e.g. em pAT98 (Matsuura et al., 1996)), í>VWB integrase {e.g. em pKT02 (Van Mellaert et al., 1998)), ΦΒΤ1 integrase ((e.g. pRT801) Gregory et al., no prelo) e L5 integrase (e.g. Lee et al., 1991). Em alguns casos isto pode necessitar de alteração da estirpe hospedeira por adição do sítio attB específico para a integrase para permitir integração de elevada eficiência. Também poderiam ser usados 26

ΕΡ 1 589 031 /PT vectores de replicação, quer como substituições aos, ou além dos vectores à base de <DC31. Estes incluem, não se lhes limitando, vectores à base de pIJlOl (e.g. pIJ487, Kieser et al., 2000), pSG5 (e.g. pKC1139, Bierman et al.r 1992) e SCP2* (e.g. pIJ698, Kieser et al., 2000). Esta metodologia foi aqui exemplificada pela utilização de funções de integração φΒΊΊ e (pC31 especificas de sitio.

Embora a introdução de cassetes de genes em S. hygroscopícus tenha sido exemplificada no presente invento usando as funções de integração de cpBTl e de cpC31 especificas de sitio, os peritos na técnica reconhecerão que existem diversas estratégias diferentes descritas na literatura, incluindo as mencionadas acima que também poderiam ser utilizadas para introduzir essas cassetes de genes em, ou mais estirpes hospedeiras procarióticas preferivelmente actinomiceto. Estes incluem a utilização de vectores de integração específicos de sitio alternativos como descrito acima e nos seguintes artigos (Kieser et al., 2000; Van Mellaert et al., 1998; Lee et al., 1991; Smovkina et al., 1990; Matsuura et al., 1996). Alternativamente, podem-se integrar plasmideos contendo as cassetes de genes num sitio neutral no cromossoma usando sitios de recombinação homóloga. Além disso, para diversas estirpes hospedeiras de actinomiceto, incluindo S. hygroscopícus, as cassetes de genes podem ser introduzidas em plasmideos auto-replicantes (Kieser et al., 2000; WO98101571).

Num outro aspecto desta classe, o invento proporciona cassetes de genes para uma complementação das estirpes de deleção S. hygroscopícus recombinantes. Métodos para construir cassetes de genes e sua utilização heteróloga para produzir macrólidos glicosilados híbridos foram descritos anteriormente (Gaisser et al., 2002; W001/79520, WO 03/048375). O método de clonagem usado para isolar as cassetes de genes do presente invento difere significativamente da abordagem anteriormente descrita, pelo facto da cassete de genes ser montada directamente num vector de expressão em vez de se pré-montarem os genes em pUC18/19- plasmideos, proporcionando-se assim um procedimento de clonagem mais rápido. A abordagem é exemplificada como se descreve no Exemplo 3, 4, 5, 9 e 15. Como se descreve aqui, pode ser construído um vector adequado 27

ΕΡ 1 589 031 /PT (por exemplo, mas não se lhes limitando, pSGLitl) para utilização na construção das referidas cassetes de genes, onde um sitio de restrição adequado (por exemplo, mas não se lhes limitando, xbai), sensivel a metilação dam é inserido 5' do(s) gene(s) de interesse e um segundo sitio de restrição (por exemplo Xbal) pode ser inserido 3' dos genes de interesse. O perito manipulador reconhecerá que podem ser usados outros sitios de restrição em alternativa a Xbal e que o sitio sensivel a metilação pode ser 5' ou 3' do(s) gene(s) de interesse. A utilização de cassetes de genes permite a geração rápida e paralela de estirpes recombinantes múltiplas delecionadas em qualquer combinação de genes modificadores de uma só estirpe de deleção de S. hygroscopicus. A estratégia de clonagem facilita a montagem da biblioteca de cassetes de genes de uma maneira quer directa quer aleatória e é portanto uma poderosa ferramenta para a produção combinatória de novos análogos de rapamicina incluindo mas não exclusivamente limitados a 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-39-0-desmetil-rapamicina (pré-rapamicina), 9-desoxo-16-0-desmetil-27-0-desmetil-39-O-desmetil-rapamicina, 16-0-desmetil-27-desmetoxi-39-O-desmetil-rapamicina, 9-desoxo-16-0-desmetil-39-0-desmetil-rapamicina, 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-rapamicina, 16-0-desmetil-27-0-desmetil-39-0-desmetil-rapamicina, 9-desoxo-27-0-desmetil-39-0-desmetil-rapamicina, 9-desoxo-16-O-desmetil-27-O-desmetil-rapamicina, 27-0-desmetil-39-O-desmetil-rapamicina, 9-desoxo-16-0-desmetil-rapamicina, 9-desoxo-39-0-desmetil-rapamicina, 8-desoxo-15-0-desmetil-26-desmetoxi-38-0-desmetil-prolilrapamicina (pré-prolilrapamicina), 8-desoxo-15,-0-desmetil-26-0-desmetil-38-0- desmetil-prolilrapamicina, desmetil-prolilrapamicina, desmetil-prolilrapamicina, desmetil-prolilrapamicina, desmetoxi-prolilrapamicina, desmetil-prolilrapamicina, desmetil-prolilrapamicina, desmetil-proliltrapamicina, prolilrapamicina, 15-0-desmetil-26-desmetoxi-38-0- 8-desoxo-26-desmetoxi-38-0- 8-desoxo-15-0-desmetil-38-0- 8-desoxo-15-0-desmetil-26- 15-0-desmetil-26-0-desmetil-38-0- 8-desoxo-26-0-desmetil-38-0- 8-desoxo-15-0-desmetil-26-0- 15-0-desmetil-38-0-desmetil- 15-0-desmetil-26-0-desmetil-prolilrapamicina, 15-O-desmetil-26-desmetoxi-prolilrapamicina, 26-desmetoxi-38-0-desmetil-prolilrapamicina, 26-0-desmetil-38- 28

ΕΡ 1 589 031 /PT O-desmetil-prolilrapamicina, 8-desoxo-15-0-desmetil- prolilrapamicina, 8-desoxo-26-0-desmetil-prolilrapamicina, 8-desoxo-38-O-desmetil-prolilrapamicina, 15-O-desmetil- prolilrapamicina, 38-O-desmetil-prolilrapamicina, 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-39-desmetoxi-rapamicina, 9-desoxo-16-0-desmetil-27-0-desmetil-39-desmetoxi-rapamicina, 16-0- desmetil-27-desmetoxi-39-desmetoxi-rapamicina, 9-desoxo-27-desmetoxi-39-desmetoxi-rapamicina, 9-desoxo-16-0-desmetil-39-desmetoxi-rapamicina, 16-0-desmetil-27-0-desmetil-39- desmetoxi-rapamicina, 9-desoxo-27-0-desmetil-39-desmetoxi- rapamicina, 16-0-desmetil-39-desmetoxi-rapamicina, 27- desmetoxi-39-desmetoxi-rapamicina, 27-0-desmetil-39-desmetoxi-rapamicina, 9-desoxo-39-desmetoxi-rapamicina, 8-desoxo-15-0-desmetil-26-desmetoxi-38-desmetoxi-prolilrapamicina, 8-desoxo-15-0-desmetil-26-0-desmetil-38-desmetoxi-prolilrapamicina, 15-0-desmetil-26-desmetoxi-38-desmetoxi-prolilrapamicina, 8- desoxo-26-desmetoxi-38desmetoxi-prolilrapamicina, 8-desoxo-15-O-desmetil-38-desmetoxi-prolilrapamicina, 15-0-desmetil-26-0-desmetil-38-desmetoxi-prolilrapamicina, 8-desoxo-26-0- desmetil-38-desmetoxi-prolilrapamicina, 15-0-desmetil-38- desmetoxi-prolilrapamicina, 26-desmetoxi-38-desmetoxi- prolilrapamicina, 26-0-desmetil-38-desmetoxi-prolilrapamicina, 8- desoxo-38-desmetoxi-prolilrapamicina, 38-desmetoxi- prolilrapamicina, 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36- des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(hidroxiciclo-hexenil)rapamicina,9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(di-hidroxiciclo-hexil)rapamicina, 9- desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36-des(3-cis-metoxi-4-trans- hidroxiciclo-hexil)-36-(hidroxinorbornil)rapamicina,9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(3-metil-4-hidroxiciclo-hexil)rapamicina,9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(4-metil hidroxiciclo-hexil)rapamicina,9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(3-fluoro-4-hidroxiciclo-hexil)rapamicina, 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36- des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(3-hidroxi-4- fluorociclo-hexil)rapamicina, 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(3-cloro-4-hidroxiciclo-hexil)rapamicina, 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36-des (3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(3-hidroxi-4-clorociclo-hexil)rapamicina, 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36- des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(3-cis-4-cis- 29

ΕΡ 1 589 031 /PT di-hidroxiciclo-hexil)rapamicina, 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(3-trans-4-trans-di-hidroxiciclo-hexil)rapamicina, 9-desoxo-16-0-desmetil-27-0-desmetil-39-0-desmetilrapamicina, 9-desoxo-16-0-desmetil-270-desmetil-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(hidroxiciclo-hexenil)rapamicina, 9-desoxo-16-0-desmetil-27-0-desmetil-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(hidroxinorbornil)rapamicina, 9-desoxo-16-0-desmetil-27-0-desmetil-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(4-metil-hidroxiciclo-hexil)rapamicina.

Num outro aspecto desta classe, o presente invento proporciona um sistema para a produção combinatória de estirpes hospedeiras recombinantes capazes de produzir análogos de rapamicina, envolvendo a construção de uma deleção genómica rapQONMLKJI intoduzida em S. hygroscopicus e a sua complementação parcial por uma biblioteca combinatória de cassetes de genes compreendendo um ou uma pluralidade dos genes auxiliares delecionados rapQ, rapN/O, rapM, rapL, rapK, rapj, e rapl. A abordagem delineada compreende como parte da estratégia de clonagem combinar genes incluindo mas não exclusivamente limitados a rapK, rapl, rapQ, rapM, rapNIO, rapL e rapJ, e/ou genes com funções génicas similares, em qualquer possível combinação de genes e ordem de genes.

Outro aspecto do invento permite a melhoria da expressão de genes por alteração da ordem dos genes numa cassete de genes. Como aplicado à classe preferida, os genes podem compreender um ou mais de rapK, rapl, rapQ, rapM, rapN/O, rapL e rapj e/ou genes com funções similares, permitindo o arranjo dos genes numa multidão de permutações como delineado no Exemplo 5. A estratégia de clonagem delineada neste invento também permite a introdução de um marcador de histidina em combinação com uma sequência terminadora 3' de uma cassete de genes para melhorar a expressão de genes. Os peritos na técnica reconhecerão que poderiam ser usadas outras sequências terminadoras. 30

ΕΡ 1 589 031 /PT

Outro aspecto do invento descreve as múltiplas utilizações de sequências promotoras numa cassete de genes montada para optimizar a expressão de genes.

Será agora óbvio para um perito na técnica que poderiam ser construídas estirpes de deleção de S. hygroscopicus, compreendendo a deleção , mas não se lhes limitando, um gene ou um subconjunto dos genes rapQ, rapN/O, rapM, rapL, rapK, rapJ e rapi. Neste caso, as cassetes de genes para complementação ou complementação parcial compreenderiam geralmente genes simples ou uma pluralidade de genes seleccionada do subconjunto dos genes delecionados. É bem sabido dos peritos na técnica que existem homólogos para vários dos genes de modificadores de rapamicina e genes de fornecimento de precursor no "cluster" de sistemas de genes intimamente relacionados incluindo FK506 (Motamedi et al, 1996; Motamedi et al, 1997; Motamedi & Shafiee, 1998) e FK520 (Wu et al, 2000) . Estes incluem os seguintes, como se descreve no Quadro I abaixo:

Quadro I

Gene de Rapamicina Homólogo de FK506 Homólogo de FK520 'hyg' rapl (N.° Ac. CAA60470) fkbM (N.° Ac. AAC44360) fkbM (N.° Ac. AAF86398) rapJ (N.° Ac. CAA60469) fkbD (N.° Ac. AAC44359) fkbD (N.° Ac. AAF86397) rapK (N.° Ac. CAA60468) fkbO (N.° Ac. AAC68817) fkbO (N.° Ac. AAF86394) Orf5 (N.° Ac. AAC38060) rapL (N.° Ac. CAA60467) fkbL (Motamedi & Shafiee, 1998) fkbL (N.° Ac. AAF86391)

Embora o "cluster" de genes de outros sistemas intimamente relacionados, incluindo, mas não se lhes limitando, aqueles para a biossíntese de FK523, meridamicina, FK525, antascomicina e tsukubamicina não tenham sido sequenciados, pode-se esperar que estes apresentem uma grande semelhança com aqueles cujas sequências foram determinadas, e, em particular, que estes "cluster" de genes conterão homólogos próximos dos vários dos genes modificadores de rapamicina e de fornecimento de precursor. Portanto, num outro aspecto do invento, genes de "clusters" de genes heterólogos destes 31

ΕΡ 1 589 031 /PT sistemas intimamente relacionados, incluindo, mas não se lhes limitando, FK506, FK520, FK523, antascomicina, meridamicina, FK525, 'hyg' e tsukubamicina podem ser incluídos em cassetes de genes em lugar de ou além dos seus homólogos de rapamicina para complementação e/ou complementação parcial de uma estirpe produtora de rapamicina contendo uma deleção ou deleções de genes incluindo, mas não se lhes limitando, os genes rapK, rapl, rapQ, rapM, rapNIO, rapL e rapJ. É bem sabido dos peritos na técnica que os "clusters" de genes de policétido podem ser expressos em hospedeiros heterólogos (Pfeifer e Khosla, 2001) . Deste modo, o presente invento inclui a transferência do "cluster" de genes de biossintético rapamicina com ou sem genes de resistência e reguladores, completo ou contendo deleções, para, complementação em hospedeiros heterólogos. Métodos e vectores para a transferência tal como definida acima de grandes peças de ADN são bem conhecidas na especialidade (Rawlings, 2001; Staunton e Weissman, 2001) ou são proporcionadas aqui nos métodos revelados. Neste contexto uma estirpe de células hospedeiras preferida é um procariota, mais preferivelmente um actinomiceto ou Escherichia coli, ainda mais preferivelmente incluem, não se lhes limitando, S. hygroscopicus, S. hygroscopicus sp., S. hygroscopicus var. ascomyceticus, Streptomyces tsukubaensis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces lividans, Saccharopolyspora erythraea, Streptomyces fradiae, Streptomyces avermítilis, Streptomyces cínnamonensís, Streptomyces rimosus, Streptomyces albus, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces longisporoflavus, Streptomyces venezuelae, Micromonospora griseorobida, Amycolatopsís mediterranei ou Actinoplanes sp. N902-109.

Podem ser obtidos análogos de rapamicina por um processo compreendendo os passos de: a) construir uma estirpe de deleção, pelos métodos do invento; incluindo a deleção, mas não se lhes limitando, os genes rapK, rapQ, rapN/O, rapM, rapL, rapJ e rapl, ou um seu subconjunto, b) cultivar a estirpe sob condições adequadas para produção de policétido; 32

ΕΡ 1 589 031 /PT c) opcionalmente, isolar o intermediário de análogo de rapamicina produzido; d) construir uma estirpe de biotransformação contendo uma cassete de genes compreendendo todos os genes delecionados ou um subconjunto dos genes delecionados; e) alimentar o intermediário de análogo de rapamicina em sobrenadante da cultura ou isolado como no passo c) a uma cultura da estirpe de biotransformação sob condições de biotransformação adequadas f) opcionalmente isolar o análogo de rapamicina produzido.

Estirpes hospedeiras adequadas para a construção da estirpe de biotransformação incluem a estirpe hospedeira nativa na qual o "cluster" de genes biossintético de rapamicina foi delecionado, ou substancialmente delecionado ou inactivado, de modo a abolir a síntese de policétido, ou uma estirpe hospedeira heteróloga. Métodos para a expressão de cassetes de genes compreendendo um ou uma pluralidade de genes modificadores ou genes de fornecimento de precursor em hospedeiros heterólogos são descritos em WO 01/79520. Neste contexto, hospedeiros heterólogos adequados para biotransformação dos referidos intermediários de análogo de ligando de FKBP incluem, não se lhes limitando, S. hygroscopicus, S. hygroscopicus sp., S. hygroscopicus var. ascomyceticus, Streptomyces tsukubaensis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces lividans, Saccharopolyspora erythraea, Streptomyces fradiae, Streptomyces avermitilis, Streptomyces cinnamonensis, Streptomyces rimosus, Streptomyces albus, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces longisporoflavus, Streptomyces venezuelae, Micromonospora griseorubida, Amycolatopsís mediterranei, Escherichia coli e Actinoplanes sp. N902-109. A estreita relação estrutural entre a rapamicina e FK506, FK520, FK523, 'hyg', meridamicina, antascomicina, FK525 e tsukubamicina, entre outros, e as homologias estabelecidas entre genes envolvidos na biossíntese de rapamicina e FK506 e FK520 (vide supra), torna óbvia a aplicação dos métodos do presente invento a estes sistemas intimamente relacionados. Num outro aspecto, portanto, o invento inclui a construção de estirpes de deleção das estirpes produtoras de compostos intimamente relacionados, incluindo, mas não se lhes 33

ΕΡ 1 589 031 /PT limitando, FK506, FK520, FK523, 'hyg', antascomicina, meridamicina, FK525 e tsukubamicina contendo uma deleção ou deleções génicas de genes modificadores e/ou de fornecimento de precursor, e mais particularmente incluindo, mas não se lhes limitando, genes com funções similares como rapK, rapl, raPQ, rapM, rapN/O, rapL e rapJ, e a sua complementação ou complementação parcial com um gene ou cassetes de genes compreendendo todos os genes homólogos delecionados ou um subconjunto, ou seus homólogos funcionais dos "clusters" de genes heterólogos, incluindo, mas não se lhes limitando, rapK, rapl, rapQ, rapM, rapN/O, rapL e rapJ para produzir estirpes recombinantes capazes de produzir análogos de policétido divergindo do policétido progenitor na incorporação de precursores alternativos e/ou na extensão da modificação pós-PKS. Além disso, o invento proporciona um método de produzir os referidos análogos de policétido ao cultivar as referidas estirpes hospedeiras recombinantes, e opcionalmente isolar os análogos de policétido produzidos.

Num outro aspecto, o invento proporciona um método para a produção de estirpes hospedeiras recombinantes capazes de produzir análogos de policétido de ligandos de FKBP (diferentes de rapamicina) divergindo do policétido progenitor na incorporação de precursores alternativos e/ou na extensão da modificação pós-PKS, compreendendo a construção de uma estirpe de deleção genómica da qual foram removidos todos os genes auxiliares ou uma porção, e a sua complementação parcial por uma cassete de genes compreendendo um ou uma pluralidade dos genes delecionados e/ou dos seus homólogos, e além disso um método de produzir os referidos análogos de policétido ao cultivar a referida estirpe hospedeira recombinante, e opcionalmente isolar os análogos de policétido produzidos. É bem sabido na especialidade que, numa maioria dos casos, esses genes auxiliares estão co-localizados com genes de policétido sintase num "cluster" de genes (Hopwood, 1997; Motamedi e Shafiee, 1998; Wu et al., 2000) facilitando assim a criação de uma estirpe de deleção. Os genes auxiliares a serem delecionados podem ou não formar naturalmente uma sequência contígua, contudo, logo que a estirpe de deleção tenha sido criada, a complementação parcial por cassetes de genes proporciona uma abordagem expedita para a produção de estirpes recombinantes nas quais um ou uma pluralidade dos 34

ΕΡ 1 589 031 /PT referidos genes tenham sido delecionados. Portanto, num outro aspecto, o invento proporciona um método para a produção combinatória de estirpes hospedeiras recombinantes capazes de produzir análogos de policétido de ligandos de fkbp (diferentes de rapamicina) divergindo do policétido progenitor na incorporação de precursores alternativos e/ou na extensão da modificação pós-PKS, compreendendo a complementação parcial da referida estirpe de deleção genómica por uma biblioteca combinatória de cassetes de genes compreendendo um ou uma pluralidade dos genes delecionados, e além disso um método de produzir os referidos análogos de policétido ao cultivar as referidas estirpes hospedeiras recombinantes sob condições adequadas para produção de policétido, e opcionalmente isolar os análogos de policétido produzidos. Neste contexto, uma estirpe de células hospedeiras recombinante preferida é a procariota, mais preferivelmente um actinomiceto, ainda mais preferivelmente uma estirpe seleccionada de entre S. hygroscopicus, S. hygroscopicus sp., S. hygroscopicus var. ascomyceticus, Streptomyces tsukubaensis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces lividans, Saccharopolyspora erythraea, Streptomyces fradiae, Streptomyces avermitilis, Streptomyces cinnamonensis, Streptomyces rimosus, Streptomyces albus, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces longisporoflavus, Streptomyces venezuelae, Micromonospora griseorubida, Amycolatopsis mediterranei ou Actinoplanes sp. N902-109.

Os peritos na técnica reconhecerão que os métodos do presente invento poderiam ser aplicados a estirpes hospedeiras recombinantes nas quais a policétido sintase (PKS) tenha sido alterada por manipulação genética para expressar uma rapamicina modificada ou outro análogo de policétido. A especialidade anterior descreve vários métodos para a produção de novos policétidos por uma deleção ou inactivação de domínios individuais (W093/13663, W097/92358), construção de policétido sintases híbridas (WO98/01546, WO00/00618, WO00/01827) ou alteração de especificidade de domínio por mutagénese dirigida ao sítio (WO02/14482). É bem sabido na especialidade que os péptidos não ribossómicos são biossintetizados por Péptido não Ribossómico Sintases (NRPSs) via condensação passo a passo de sucessivos 35 ΕΡ 1 589 031 /PT blocos de construção de aminoácidos, num processo análogo ao da biossíntese de policétido (para revisão ver Marahiel et al., 1997; Schwarzer e Marahiel, 2001). É bem sabido que vários péptidos não ribossómicos incluem resíduos de aminoácido não usuais (modificados, aminoácidos proteinogénicos e/ou aminoácidos não proteinogénicos) e carboxi-ácidos, cujos genes biossintéticos estão co-localizados com os genes de péptido não ribossómico sintase no "cluster" de genes de péptido não ribossómico (Marahiel et al., 1997; Konz e Marahiel, 1999; Blanc et al., 1997). Em vários casos, o produto peptídico não ribossómico inicialmente libertado do NRPS é ainda modificado por um conjunto de enzimas, incluindo, mas não se lhes limitando, glicosil-transferases, reductases, acilação ou formação de anel heterocíclico (Konz e Marahiel, 1999; Blanc et al., 1995). Estes incluem os antibióticos cloroeremomicina, pristinamicina, vancomicina e bleomicina (Konz e Marahiel, 1999; Du et al., 2000). Os genes para estas enzimas pós-NRPS estão também tipicamente co-localizados no "cluster" de genes biossintético (Marahiel et al., 1997; Schwarzer e Marahiel, 2001). Portanto, num outro aspecto, o invento inclui um método para a produção de análogos de péptido não ribossómico, divergindo do progenitor de péptido não ribossómico na incorporação de aminoácidos precursores alternativos e/ou na extensão da modificação pós-NRPS, compreendendo a construção de uma estirpe de deleção genómica da qual foram removidos todos ou uma porção dos genes que codificam a síntese do precursor de aminoácido nativo e/ou as enzimas pós-NRPS, e a sua complementação parcial por uma cassete de genes compreendendo um ou uma pluralidade dos genes delecionados e/ou dos seus homólogos, e além disso um método de produzir os referidos análogos de péptido não ribossómico ao cultivar a referida estirpe hospedeira recombinante, e opcionalmente isolar os análogos de péptido não ribossómico produzidos. Os genes pós-NRPS e de biossíntese de precursor a serem delecionados podem ou não formar naturalmente uma sequência contígua, contudo, logo que a estirpe de deleção tenha sido criada a complementação parcial por cassetes de genes proporciona uma abordagem expedita para a produção de estirpes recombinantes nas quais um ou uma pluralidade dos referidos genes tenha sido delecionada. Portanto, num outro aspecto, o invento proporciona um método para a produção combinatória de 36

ΕΡ 1 589 031 /PT estirpes hospedeiras recombinantes capazes de produzir análogos de péptido não ribossómico divergindo do péptido não ribossómico progenitor na incorporação de precursores alternativos e/ou na extensão da modificação pós-NRPS, compreendendo a complementação parcial da referida estirpe de deleção genómica por uma biblioteca combinatória de cassetes de genes compreendendo um ou uma pluralidade dos genes delecionados, e além disso um método de produzir os referidos análogos de péptido não ribossómico ao cultivar as referidas estirpes hospedeiras recombinantes sob condições adequadas para produção de péptido não ribossómico, e opcionalmente isolar os análogos de péptido não ribossómico produzidos. Neste contexto, uma estirpe de células hospedeiras recombinantes preferida é a procariota, mais preferivelmente um actinomiceto, ainda mais preferivelmente uma estirpe seleccionada de entre S. hygroscopicus, S. hygroscopicus sp., S. hygroscopicus var. ascomyceticus, Streptomyces tsukubaensis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces lividans, Saccharopolyspora erythraea, Streptomyces fradiae, Streptomyces avermitilis, Streptomyces cinnamonensis,

Streptomyces rimosus, Streptomyces albus, Streptomyces griseofuscus, Streptomyces longisporoflavus, Streptomyces venezuelae, Micromonospora griseorubida, Amycolatopsis mediterranei ou Actinoplanes sp. N902-109. É bem sabido que muitos actinomicetos contêm múltiplos "clusters" de genes biossintéticos para diferentes metabolitos secundários, incluindo policétidos e péptidos não sintetizados ribossomicamente. Especificamente, tem sido demonstrado que estirpes de S. hygroscopicus produzem uma variedade de policétidos e péptidos não sintetizados ribossomicamente além da rapamicina, FK506, FK520, FK523, meridamicina, FK525, antascomicina e tsukubamicina. Estes incluem, não se lhes limitando, elaiofilina, bialafos, higromicina, augustmicina, endomicina (A, B), glebomicina, higroscopina, ossamicina e nigericina. Estes "clusters" de genes biossintéticos adicionais representam um requisito de competição para os precursores biossintéticos e uma exigência metabólica adicional para a estirpe hospedeira. De modo a melhorar a produção da desejada rapamicina, ou de outro policétido, análogo, pode ser portanto vantajoso delecionar ou inactivar quaisquer outros "clusters" de genes biossintéticos presentes 37

ΕΡ 1 589 031 /PT na estirpe hospedeira. Métodos para a deleção ou inactivação de "clusters" de genes biossintéticos são bem conhecidos na especialidade.

Num outro aspecto desta classe, o invento proporciona uma metodologia de mutassíntese para uma complementação de estirpes de deleção recombinantes.

Num outro aspecto, as estirpes de S. hygroscopicus do presente invento contendo uma deleção de rapL podem ser alimentadas com análogos do aminoácido incorporado naturalmente, ácido L-pipecólico, para produzir novos análogos de rapamicina nos quais o resíduo de pipecolilo é substituído. A especialidade anterior descreve que um mutante rapL pode ser complementado pela adição de ácido L-pipecólico à cultura (Khaw et al., 1998). Similarmente, foi demonstrado que foram isolados análogos de rapamicina após a alimentação e incorporação de análogos de ácido L-pipecólico, L-prolina, L-trans-4-hidroxiprolina, L-cis-4-hidroxiprolina, L-cis-3-hidroxiprolina, ácido trans-3-aza-biciclo[3,1, 0]hexano-2-carboxílico (WO98/54308). Usando S. hygroscopicus MG2-10 como acervo patrimonial de estirpe para expressar genes ou cassetes de genes que codificam para passos modificadores pós-PKS não incluindo homólogos de rapL ou rapL, é gerada uma biblioteca de estirpes de S. hygroscopicus, capaz de produzir uma pluralidade de produtos modificados por alimentação com análogos de ácido L-pipecólico. análogos de ácido L-pipecólico adequados incluem ácidos pipecólicos substituídos com alquil-, halo-, hidroxi-, e amino- e prolinas, e mais particularmente L-prolina, L-trans-4-hidroxiprolina, L-cís-4-hidroxiprolina, L-cís-3-hidroxiprolina, ácido trans-3-aza- biciclo[3,1,0]hexano-2-carboxílico e os análogos de ácido L-pipecólico que demonstraram catalisar a permuta PP-ATP medida por uma modificação do método de Lipmann (Nielsen et al., 1991) incluindo L-4-hidroxiprolina, 1-hidroxiprolina, 2-hidroxiprolina, 3-hidroxiprolina, trans-3-metil-L-prolina, cis-3-metilprolina, cis-3-metil-DL-prolina, cis,trans-4- metilprolina, cís-4-metil-DL-prolina, trans-4-metil-DL-prolina, trans-4-aminoprolina, cloridrato de cís-4-cloro-L-prolina, 5-iminoprolina, cis-5-metil-DL-prolina, ácido (+)-piperázico, ácido 5-cloropipecólico, ácido 5- hidroxipipecólico, ácido cis-4-hidroxi-L-pipecólico, ácido 38

ΕΡ 1 589 031 /PT trans-4-hidroxi-D-pipecólico, ácido 4-hidroxiallopipecólico, ácido tiazolidina-4-carboxilico (Nielsen et al., 1991). Esta abordagem é exemplificada no Exemplo 7. A produção de um número limitado de novos análogos de rapamicina após alimentação de análogos estruturais próximos da unidade de iniciação natural ácido 4,5-di-hidroxiciclo-hex-1-enocarboxílico a culturas de S. hygroscopicus foi anteriormente descrita, demonstrando assim que o módulo de carregamento da rapamicina policétido sintase tem alguma flexibilidade relativamente ao ácido iniciador (P.A.S. Lowden, Tese de doutoramento, Universidade de Cambridge, 1997). Contudo, estes métodos conduzem à produção da mistura de produtos. Num outro aspecto, o presente invento permite a produção de rapamicina e análogos de ligandos de FKBP relacionados por alimentação de estirpes do presente invento com análogos da unidade de iniciação ácido 4,5-di-hidroxiciclo-hex-l-enocarboxílico naturalmente incorporada para produzir análogos de rapamicina incorporando unidades de iniciação alternativas incluindo, mas não se lhes limitando, ácido ciclo-hexanocarboxilico, ácido 3-cis,4-trans-di- hidroxiciclo-hexanocarboxilico, ácido 1-ciclo-hexenocarboxílico, ácido 3-ciclo-hexenocarboxílico, ácido ciclo- heptanocarboxilico, ácido 2-norbornanocarboxílico, ácido 3-hidroxiciclo-hexanocarboxilico, ácido 4-hidroxiciclo- hexanocarboxílico, ácido 3-metilciclo-hexanocarboxílico, ácido 4-metilciclo-hexanocarboxílico, ácido 3-(cis/trans)-metoxiciclo-hexanocarboxilico, ácido 4-(cis/trans)metoxiciclo-hexanocarboxilico, ácido 4-oxociclo-hexanocarboxílico, ácido 3-fluoro-4-hidroxicarboxilico e ácido 4-fluoro-3- hidroxicarboxílico, ácido 3-ciclo-hexanooxidocarboxílico, ácido 3,4-cis-di-hidroxiciclo-hexanocarboxílico, ácido 3-cloro-4-hidroxicarboxílico e ácido 4-cloro-3- hidroxicarboxilico (e o par de diastereómeros oposto), ácido ciclo-hexilpropiónico, ácido 4-terc-butilciclo- hexanocarboxílico e seus ésteres e sais simples. Esta abordagem é exemplificada nos Exemplos 8, 19 e 20.

Adicionalmente, podem ser alimentados análogos estruturais de precursores biossintéticos da unidade de iniciação ácido 4,5-di-hidroxiciclo-hex-l-enocarboxilico (Lowden et al., 39

ΕΡ 1 589 031 /PT 2001), conduzindo à produção de novos análogos de rapamicina incorporando unidades de iniciação alternativas.

Contudo, estes métodos podem conduzir à produção de grupos mistos de produtos; portanto, o presente invento proporciona adicionalmente um método para remover a competição entre as unidades de iniciação produzidas endogenamente e os análogos de iniciador ácido alternativo que são alimentados de modo a melhorar a eficiência de produção de novos análogos de rapamicina.

De modo a remover a competição entre a unidade de iniciação natural produzida endogenamente e os análogos de iniciador ácido alternativo alimentados, é preferível interromper a biossintese da unidade de iniciação natural ácido 4,5-di-hidroxiciclo-hex-l-enocarboxilico. Isto pode ser conseguido por deleção ou inactivação de um ou mais dos genes envolvidos na biossintese da unidade de iniciação natural ácido 4,5-di-hidroxiciclo-hex-l-enocarboxilico a partir de ácido chiquímico (Lowden et al., 2001) ou da biossintese do próprio ácido chiquímico. Neste último caso, pode ser necessário suplementar as culturas com aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina, triptofano). Alternativamente, a produção endógena da unidade de iniciação natural ácido 4,5-di-hidroxiciclo-hex-l-enocarboxílico pode ser suprimida pela adição de um inibidor químico da biossintese de ácido chiquímico. Estes inibidores são bem conhecidos na literatura.

Num outro aspecto, o invento faz utilização da surpreendente descoberta de que rapK está envolvido no fornecimento de precursor(es) biossintético(s), e.g. unidade de iniciação de rapamicina ácido 4,5-di-hidroxiciclo-hex-l-enocarboxílico e que portanto a deleção ou inactivação de rapK ou um homólogo de rapK proporciona uma estirpe em falta de competição entre a unidade de iniciação natural e a unidade de iniciação não naturais alimentada. Noutro aspecto, o invento proporciona um método para a incorporação eficiente de ácidos alimentados incluindo, mas não se lhes limitando, os descritos abaixo.

Portanto, num aspecto do invento, o método compreende alimentar unidades de iniciação de fórmula 40

ΕΡ 1 589 031 /PT

CO2H onde x = ligação ou CH2 e Ri, R2, R3, R4, R5 e R6 podem ser iguais ou diferentes e podem ser, independentemente, Cl, F, OH, SH, H, alquilo, CN, Br, R7, OR7, C(0)R7 ou HNR7 onde R7 é um alquilo C1-C4; Ri e R3, R2 e R4, R3 e R5, R4 e R6, Ri e R5, ou R2 e Rô podem ser juntos quer numa ligação éter, numa ligação tia, numa ligação amino, quer numa ligação metileno, substituída ou não substituída, Ri e R2, R3 e R4 ou R5 e R6 podem ser tomados em conjunto como uma cetona; desde que não mais do que 4 de R4, R2, R3, R4, R5 ou R6 pode ser Cl; não mais do que 2 de R4, R2, R3, R4, R5 ou R6 possam ser HNR7; não mais do que 2 de R4, R2, R3, R4, R5 ou R6 possam ser SH e ambos os grupos R de um carbono no anel não sejam OH.

Numa concretização preferida, a unidade de iniciação não é seleccionada de entre o grupo consistindo em: ácido ciclo-hexanocarboxílico, ácido 3-cis,4-trans-di-hidroxiciclo-hexanocarboxílico, ácido ciclo-heptanocarboxílico e ácido 3-(cis/trans)-metilciclo-hexanocarboxílico.

Em concretizações preferidas: onde R4, R2, R3, R4, R5 ou R6 são uma combinação de substituição OH e F não mais do que 3 de Ri_6 são substituídos e os restantes são H. Onde R4, R2, R3, R4, Rs ou Rg são uma combinação de Cl e substituição OH não mais do que 3 de R4-6 são substituídos e os restantes são H. Onde quaisquer dois de R4, R2, R3, R4, R5 ou R6 são OH e quaisquer dois dos restantes grupos R são F sobre um carbono os restantes são H. Onde dois de R4, R2, R3, R4, R5 ou R6 são Cl, os restantes são H. Onde dois de R4, R2, R3, R4, R5 ou R6 são

Cl, não tendo origem no mesmo carbono, e um outro R é OH, os restantes são H. Onde um de R4, R2, R3, R4, R5 ou R6 é alquilo e os restantes são Η; o grupo alquilo terá um comprimento linear não superior a 3 carbonos. Onde um de R4, R2, R3, R4, R5 ou R6 é NHR7, os restantes são H.

Em concretizações muitíssimo preferidas: onde dois de R4, r2, R3, R4, Rs ou Rê são OH e um terceiro grupo R é F, os

restantes são H. Onde dois de R4, R2, R3, R4, R5 ou R6 são F, os restantes são H. Onde dois de R4, R2, R3, R4, R5 ou R6 são OH, os restantes são H. Onde dois de R4, R2, R3, R4, R5 ou R6 são OH 41 ΕΡ 1 589 031 /PT e um terceiro grupo R é Cl, os restantes são H. Onde dois de Ri, R2, R3, R4, Rs ou R6 são F, e um terceiro grupo R é OH, os restantes são H. Onde um de Ri, R2, R3, R4, Rs ou R6 é SH, os restantes são H. Onde um de Ri, R2, R3, R4, Rs ou R6 é SH e um segundo grupo R é OH (não tendo origem no mesmo carbono), os restantes são H.

Em concretizações ainda mais preferidas: onde um de Ri, r2, r3, r4, Rs ou R6 é F, os restantes são H. Onde de R4, R2, R3, R4, R5 ou R6 é Cl, os restantes são H. Onde um de R4, R2, R3, R4, Rs ou R6, é F e um segundo grupo R é OH (não tendo origem no mesmo carbono), os restantes são H. Onde um de R1; R2, R3, R4, R5 ou R6 é Cl e um segundo grupo R é OH (não tendo origem no mesmo carbono), os restantes são H. Onde um de R4, R2, R3, R4, Rs ou Rg é alquilo e os restantes são Η; o grupo alquilo não conterá mais do que 4 carbonos e tem um comprimento linear não superior a 3 carbonos. Onde um de R4, R2, R3, R4, R5 ou R6 é alquilo e um segundo grupo R é OH (não tendo origem no mesmo carbono) e os restantes são H; 0 grupo alquilo não conterá mais do que 4 carbonos e tem um comprimento linear não superior a 3 carbonos.

Um outro aspecto do invento compreende alimentar unidades de iniciação de fórmula

onde X = ligação ou CH2 e Ri, R2, R3, R4, R5 e R6 podem ser iguais ou diferentes e podem ser, independentemente, Cl, F, OH, SH, H, alquilo, CN, Br, R7, OR7, C(0)R7 ou HNR7 onde R7 é um alquilo C1-C4 ; R4 e R3, R2 e R4, R3 e R5, R4 e R6, Ri e R5, ou R2 e R6 podem ser juntos quer numa ligação éter, numa ligação tia, numa ligação amino quer numa ligação metileno, substituída ou não substituída, R4 e R2, R3 e R4 ou R5 e Rê podem ser tomados em conjunto como uma cetona; desde que não mais do que 4 de R4 R2, R3, R4, R5 ou R6 possam ser Cl; não mais do que 2 de R4, R2, R3, R4, R5 ou R6 possam ser hnr7; não mais do que 2 de R4, R2, R3, R4, R5 ou R6 possam ser SH e ambos os grupos R de um carbono no anel não seja OH. 42

ΕΡ 1 589 031 /PT

Numa concretização preferida, a unidade de iniciação não é seleccionada de entre o grupo consistindo em: ácido 1-ciclo-hexenocarboxílico e ácido 1-ciclo-heptenocarboxilico.

Em concretizações preferidas, onde Ri, R2, R3, R4, R5 ou R6 são uma combinação de substituição OH e F, não mais do que 3 de Ri_6 são substituídos e os restantes são H. Onde R4, R2, R3, R4, R5 ou R6 são uma combinação de Cl e substituição OH não mais do que 3 de R4_6 são substituídos e os restantes são H. Onde quaisquer dois de Ri, R2, R3, R4, R5 ou R6 são OH e dois dos restantes grupos R são F no mesmo carbono, os restantes são H. Onde dois de R4, R2, R3, R4, R5 ou R6 são Cl, os restantes são H. Onde dois de R4, R2, R3, R4, R5 ou R6 são Cl, não tendo origem no mesmo carbono, e um outro grupo R é OH, os restantes são H. Onde um de R4, R2, R3, R4, R5 ou R6 é alquilo e os restantes são Η; o grupo alquilo terá um comprimento linear não superior a 3 carbonos. Onde um de R4, R2, R3, R4, R5 ou R6 é NHR7, os restantes são H.

Em concretizações muitíssimo preferidas: onde dois de R4, R2, R3, R4, R5 ou R6 são OH e um terceiro grupo R é F, os restantes são H. Onde dois de R4, R2, R3, R4, R5 ou R6 são F, os restantes são H. Onde dois de R4, R2, R3, R4, R5 ou R6 são OH, os restantes são H. Onde dois de R4, R2, R3, R4, R5 ou R6 são OH e um terceiro grupo R é Cl, os restantes são H. Onde dois de Ri, R2, R3, R4, R5 ou R6 são F, e um terceiro grupo R é OH, os restantes são H. Onde um de R4, R2, R3, R4, R5 ou R6 é SH, os restantes são H. Onde um de R4, R2, R3, R4, R5 ou R6 é SH e um segundo grupo R é OH (não tendo origem no mesmo carbono), os restantes são H.

Em concretizações ainda mais preferidas: onde um de R4, R2, R3, R4, R5 ou R6 é F, os restantes são H. Onde de R4/ R2, R3, R4, R5 ou R6 são Cl, os restantes são H. Onde um de Ri, R2, R3, R4, R5 ou R6, são F e um segundo grupo R é OH (não tendo origem no mesmo carbono), os restantes são H. Onde um de R4, r2, R3, r4, R5 ou R6 é Cl, um segundo grupo R é OH (não tendo origem no mesmo carbono), os restantes são H. Onde um de R4, R2, R3, R4, R5 ou R6 é alquilo e os restantes são Η; o grupo alquilo não conterá mais do que 4 carbonos e tem um comprimento linear não superior a 3 carbonos. Onde um de R4, R2, r3, R4, R5 ou R6 é alquilo e um segundo grupo R é OH (não 43 ΕΡ 1 589 031 /PT tendo origem no mesmo carbono), os restantes são H; e o grupo alquilo não conterá mais do que 4 carbonos e tem um comprimento linear não superior a 3 carbonos.

Um outro aspecto do invento compreende alimentar unidades de iniciação de fórmula:

onde X = ligação ou CH2, Ri e R2, podem ser iguais ou diferentes e podem ser, independentemente, F, Cl, OH, SH, H, CN, OR7, C(0)R7, ou NHR7 onde R7 é um alquilo C1-C4, R7 e R2 também podem ser tomados em conjunto para formar uma cetona, um grupo espirociclopropilo ou com -OCH2-, -CH20-, -SCH2- ou -CH2S-; além disso R3, e R4 podem ser iguais ou diferentes e podem ser, independentemente, F, Cl, Br, OR7, H ou CN; desde que ambos os grupos R de um carbono no anel não sejam OH.

Numa concretização preferida a unidade de iniciação não será ácido 5-cis-hidroxil-3-ciclo-hexenocarboxilico.

Em concretizações preferidas: Onde dois de Ri, R2, R3, ou R4 são F, os restantes são H. Onde um de Ri, R2, R3, ou R4 é Cl, os restantes são H. Onde um de R3, ou R4 é F e um de Rl ou R2 é OH, os restantes são H. Onde um de R3 ou R4 é Cl e um de Ri ou R2 é OH, os restantes são H. Onde um de Ri ou R2 é SH, os restantes são H. Onde um de Ri, R2, R3, ou R4 é alquilo e os restantes são Η; o grupo alquilo não conterá mais do que 4 carbonos e tem um comprimento linear não superior a 3 carbonos. Onde um de R3 ou R4 é alquilo e Rx ou R2 é OH, os restantes são H; e o grupo alquilo não conterá mais do que 4 carbonos e tem um comprimento linear não superior a 3 carbonos.

Em concretizações muitíssimo preferidas onde um de Ri, R2, R3, ou R4 é F, os restantes são H. Onde um de Rlr R2, R3, ou R4 é Cl, os restantes são H.

Um outro aspecto do invento compreende alimentar unidades de iniciação de fórmula 44

ΕΡ 1 589 031 /PT

onde Ri, R2, R3, R4, R5 ou R6 podem ser iguais ou diferentes e podem ser, independentemente, Cl, F, OH, SH, H, alquilo, CN, Br, R7, OR7, C(0)R7 ou HNR7 onde R7 é um alquilo C1-C4 ; Ri e R3, R2 e R4, R3 e R5, R4 e R6, Ri e R5, ou R2 e R6 podem ser juntos quer numa ligação éter, numa ligação tia, numa ligação amino quer numa ligação metileno, substituída ou não substituída, R3 e R4 ou R5 e R6 podem ser tomados em conjunto como uma cetona; desde que ambos os grupos R de um carbono no anel não sejam OH.

Em concretizações preferidas: Onde dois de Ru r2, r3, r4, Rs ou R6 são F, os restantes são H. Onde dois de Ru r2, r3, r4, Rs OU R6 são OH, os restantes são H. Onde dois de Ru R2/ r3, R4, R5 ou R6 são OH, e um terceiro grupo R é F, os restantes são H. Onde dois de Ri, R2, R3, R4, R5 ou R6 são OH, e um terceiro grupo R é Cl, os restantes são H. Onde dois de Ri, R2, R3, R4, R5 ou R6 são F e um terceiro grupo R é OH, os restantes são H. Onde um de Ri, R2, R3, R4, R5 ou Ré é Br, os restantes são H. Onde um de Ri, R2, R3, R4, R5 ou R6 é Br e um

segundo grupo R é OH, os restantes são H

Em concretizações mais preferidas: Onde um de Ri, R2, R3, R4, R5 ou Rê é F, os restantes são H. Onde um de Ri, R2, R3, R4, R5 ou R6 são Cl, os restantes são H. Onde um de Ri, R2, R3, R4, R5 ou R6 é F e um segundo grupo R é OH (não tendo origem no mesmo carbono), os restantes são H. Onde um de Ri, R2, R3, R4, R5 ou R6 é Cl e um segundo grupo R é OH (não tendo origem no mesmo carbono), os restantes são H. Onde um de Ri, R2, R3, R4/ R5 ou R6 é SH, os restantes são H. Onde um Ri, R2, R3, R4, R5 ou R6 é SH e um segundo grupo R é OH (não tendo origem no mesmo carbono), os restantes são H. Onde um de Ri, R2, R3, R4, Rs ou R6 é alquilo e os restantes são Η; o grupo alquilo não conterá mais do que 4 carbonos e tem um comprimento linear não superior a 3 carbonos. Onde um de Ri, R2, R3, R4, Rs ou R6 alquilo e um segundo grupo R é OH (não tendo origem no mesmo carbono), os restantes são H; e o grupo alquilo não conterá mais do que 4 carbonos e tem um comprimento linear não superior a 3 carbonos. 45

ΕΡ 1 589 031 /PT

onde Ri, R2, R3, R4, R5 ou R6 podem ser iguais ou diferentes e podem ser, independentemente, Cl, F, OH, SH, H, alquilo, CN; Br, R7, OR7, C(0)R7 ou HNR7 onde R7 é um alquilo C1-C4 ; R4 e R3, R2 e R4, R3 e R5, R4 e R6, R4 e R5, ou R2 e R6 podem ser juntos quer numa ligação éter, numa ligação tia, numa ligação amino quer numa ligação metileno, substituída ou não substituída, R3 e R4 ou R5 e R6 podem ser tomados em conjunto como uma cetona; desde que ambos os grupos R de um carbono no anel não sejam OH.

Em concretizações preferidas: onde R4, R2, R3, R4, R5 ou R6 são uma combinação de substituição OH e F não mais do que 3 de

Ri-6 são substituídos e os restantes são H. Onde R4, R2, R3, R4, R5 ou R6 são uma combinação de Cl e substituição OH não mais do que 3 de R2_6 são substituídos e os restantes são H. Onde dois de Ri, r2, R3, r4, R5 ou R6 são OH e dois dos restantes grupos R são F num carbono os restantes são H. Onde dois de Ri, R2, R3, R4, R5 ou R6 são Cl, os restantes são H. Onde dois de Ri, R2, R3, R4, R5 ou R6 são Cl (não tendo origem no mesmo carbono) e um terceiro grupo R é OH, os restantes são H. Onde um de Ri, R2, R3, R4, R5 ou R6 é alquilo e os restantes são Η; o grupo alquilo terá um comprimento linear não superior a 3 carbonos. Onde dois de Ri, R2, R3, R4, Rs ou Rô são SH, os restantes são H. Onde um de R4, R2, R3, R4, R5 ou R6 é HNR7, os restantes são H.

Em concretizações mais preferidas: Onde dois de R4, R2, r3, R4, R5 ou R6 são F, os restantes são H. Onde dois de Ri, R2, r3, R4, R5 ou R6 são OH, os restantes são H. Onde dois de R4, R2, R3, R4, R5 ou R6 são OH e um terceiro grupo R é F, os restantes são H. Onde dois de Ri, R2, R3, R4, R5 ou Rô são OH e um terceiro grupo R é Cl, os restantes são H. Onde dois de R4, R2, R3, R4, R5 ou R6 são F, e um terceiro grupo R é OH, os restantes são H. Onde um de R4, R2, R3, R4, R5 ou R6 é Br, os restantes são H. Onde um Ri, R2, R3, R4, R5 ou R6 é Br e um 46 ΕΡ 1 589 031 /PT segundo grupo R é OH (não tendo origem no mesmo carbono), os restantes são H. Onde um de Ri, R2, R3, R4, Rs ou R6 é SH, os restantes são H. Onde um de Ri, R2, R3, R4, Rs ou Rè é SH e uns segundos grupos R é OH (não tendo origem no mesmo carbono), os restantes são H.

Em concretizações mais preferidas: Onde um de Ri, R2, R3, R4, R5 ou R6 é F, os restantes são H. Onde um de Ri, R2, R3, R4, R5 ou R6 é Cl, os restantes são H. Onde um de Ri, R2, R3, R4, Rs ou R6 é F e um segundo grupo R é OH (não tendo origem no mesmo carbono), os restantes são H. Onde um de Ri, R2, R3, R4, Rs ou R6 é Cl e um segundo grupo R é OH (não tendo origem no mesmo carbono), os restantes são H. Onde um de Ri, R2, R3, R4, R5 ou R6 é alquilo e os restantes são H; 0 grupo alquilo não conterá mais do que 4 carbonos e tem um comprimento linear não superior a 3 carbonos. Onde um de Ri, R2, R3, R4, Rs ou R6 é alquilo e um segundo grupo R é OH (não tendo origem no mesmo carbono), os restantes são H; e o grupo alquilo não conterá mais do que 4 carbonos e tem um comprimento linear não superior a 3 carbonos.

Um outro aspecto do invento compreende alimentar unidades de iniciação de fórmula R2Ri

onde Ri e R2, podem ser iguais ou diferentes e podem ser, independentemente, F, Cl, OH, SH, H, CN, OR7, C(0)R7, ou NHR7 onde R7 é um alquilo C1-C4, Ri e R2 também podem ser tomados em conjunto para formar uma cetona, um grupo espirociclopropilo ou com —OCH2—, —CH20—, -SCH2- ou -CH2S-; além disso R3, e R4 podem ser iguais ou diferentes e podem ser, independentemente, F, Cl, Br, OR7, H ou CN; desde que ambos os grupos R de um carbono no anel não sejam OH.

Em concretizações preferidas: Onde um de Ri, R2, R3 e R4 é F, os restantes são H. Onde um de Ri, R2, R3 e R4 é Cl, os restantes são H. Onde um de Ri, R2, R3 e R4 é F e um segundo grupo R é OH (não tendo origem no mesmo carbono), os restantes são H. Onde um de Ri, R2, R3 e R4 é Cl e um segundo grupo R é OH (não tendo origem no mesmo carbono), os restantes são H. Onde um de Ri, R2, R3 e R4 é SH, os restantes são H. Onde um de 47

ΕΡ 1 589 031 /PT

Ri, R2, R3 e R4 é alquilo, os restantes são H; e o grupo alquilo não conterá mais do que 4 carbonos e tem um comprimento linear não superior a 3 carbonos. Onde um de Ri, R2, R3 e R4 é alquilo e um segundo grupos R é OH (não tendo origem no mesmo carbono), os restantes são H; e o grupo alquilo não conterá mais do que 4 carbonos e tem um comprimento linear não superior a 3 carbonos. Onde dois de Ri, R2, R3 e R4 são F, os restantes são H.

Um aspecto adicional do invento compreende alimentar unidades de iniciação de fórmula

onde X = ligação ou CH2;e Ri, R2, R3, R4 ou R5 podem ser iguais ou diferentes e podem ser, independentemente, Cl, F, OH, SH, H, alquilo, CN, Br, R7, OR7, C(0)R7 ou HNR7 onde R7 é um alquilo C1-C4, Ri e R3, R2 e R4, podem ser tomados em conjunto como uma cetona ou ligados quer como uma ligação metileno substituída ou não substituída, uma ligação éter, uma ligação tia ou uma ligação amino onde Ri e R2 ou R3 e R4 são ligados como um grupo espirociclopropilo ou com -OCH2- ou -CH20- ou -SCH2- ou -CH2S-, R5 pode ser F, CL, OR7, H ou CN; desde que não mais do que dois de Ri, R2, r3, R4 ou R5 sejam SH e que ambos os grupos R ligados a um carbono são sejam OH.

Em concretizações preferidas: onde Ri, R2, R3, R4 ou R5 são uma combinação de F e OH não mais do que 3 de Ri, R2, R3, R4 ou R5 são substituídos e os restantes são H. Onde Ri, R2, R3, R4 ou R5 são uma combinação de Cl e OH não mais do que 3 de R4-5 são substituídos e os restantes são H. Onde R4, R2, R3, R4 ou R5 são uma combinação de dois são OH (não no mesmo carbono) e dois são F num carbono os restantes são H. Onde dois de R4, R2, R3, R4 ou R5 são Cl, os restantes são H. Onde dois de R4, R2, R3, R4 ou R5 são Cl (não tendo origem no mesmo carbono) e um terceiro grupo R é OH, os restantes são H. Onde um de R4, R2, R3, R4 ou R5 é alquilo, os restantes são H; e o grupo alquilo terá um comprimento linear não superior a 3 carbonos. Onde dois de R4, R2, R3, R4 ou R5 são SH, os restantes são H. Onde um de R4, R2, R3, R4 ou R5 é NHR7, os restantes são H. Onde um de Ri, R2, R3, R4 ou R5 é SH, os restantes são H. 48

ΕΡ 1 589 031 /PT

Em concretizações muitíssimo preferidas: onde um de Ri, r2, R3, R4 ou Rs é OH, os restantes são H. Onde um de Ri, R2, R3, R4 ou R5 é F, os restantes são H. Onde um de Ri, R2, R3, R4 ou R5 é Cl, os restantes são H. Onde um de Ri, R2, R3, R4 ou R5 é F e um segundo grupo R é OH (não tendo origem no mesmo carbono), os restantes são H. Onde um de Ri, R2f R3, R4 ou R5 é Cl e um segundo grupo R é OH ( não tendo origem no mesmo carbono), os restantes são H. Onde um de Ri, R2/ r3, R4 ou R5 é SH e um segundo grupo R é OH ( não tendo origem no mesmo carbono), os restantes são H. Onde um de Ri, R2r R3/· R4 ou R5 é alquilo, os restantes são H; e o grupo alquilo não conterá mais do que 4 carbonos e tem um comprimento linear não superior a 3 carbonos. Onde um de R4, R2, R3, R4 ou R5 é alquilo e um segundo grupo R é OH (não tendo origem no mesmo carbono), os restantes são H; e o grupo alquilo não conterá mais do que 4 carbonos e tem um comprimento linear não superior a 3 carbonos. Onde dois de Ri, R2, R3, R4 ou R5 são F, os restantes são H. Onde dois de Rlr R2, R3, R4 ou R5 são OH, os restantes são H. Onde dois de R4, R2, R3, R4 ou R5 são OH e um terceiro grupo R é F, os restantes são H. Onde dois de R4, R2, R3, R4 ou R5 são OH e um terceiro grupo R é Cl, os restantes são H. Onde dois de R4, R2, R3, R4 ou R5 são F e um terceiro grupo R é OH, os restantes são H.

onde Ri, R2, R3 e R4 podem ser iguais ou diferentes e podem ser, independentemente, Cl, F, OH, SH, H, alquilo, CN, Br, R7, OR7, C(0)R7 ou HNR7 onde R7 é um alquilo C1-C4, r4 e R2 ou R3 e R4 podem ser tomados em conjunto para formar uma cetona, desde que dois grupos R ligados ao mesmo carbono não sejam ambos OH.

Em concretizações preferidas: Onde um de Ri, R2, R3 ou R4 é F, os restantes são H. Onde um de R4, R2, R3 ou R4 é Cl, os restantes são H. Onde um de R4, R2, R3 ou R4 é Br, os restantes são H. Onde um de R4, R2, R3 ou R4 é OH, os restantes são H. Onde um de R4, R2, R3 ou R4 é F e um segundo grupo R é OH (não tendo origem no mesmo carbono), os restantes são H. Onde um de Ri, R2, R3 ou R4 é Cl e um segundo grupo R é OH (não tendo 49 ΕΡ 1 589 031 /PT origem no mesmo carbono), os restantes são H. Onde um de Ri, r2, R3 ou R4 é SH, os restantes são H. Onde um de Ri, R2, R3 ou R4 é SH e um segundo grupo R é OH (não tendo origem no mesmo carbono), os restantes são H. Onde um de Ri, R2, R3 ou R4 é alquilo, os restantes são H; e o grupo alquilo não conterá mais do que 4 carbonos e tem um comprimento linear não superior a 3 carbonos. Onde um de Ri, R2, R3 ou R4 é alquilo e um segundo grupo R é OH (não tendo origem no mesmo carbono), os restantes são H; e o grupo alquilo não conterá mais do que 4 carbonos e tem um comprimento linear não superior a 3 carbonos. Onde dois de Ri, R2, R3 ou R4 são F, os restantes são H. Onde dois de R4, R2, R3 ou R4 são OH, os restantes são H. Onde dois de R4, R2, R3 ou R4 são OH e um terceiro grupo R é F, os restantes são H. Onde dois de R4, R2, R3 ou R4 são OH e um terceiro grupo R é Cl, os restantes são H. Onde dois de R4, R2, R3 ou R4 são F e um terceiro grupo R é OH, os restantes são H.

Numa concretização preferida, 0 presente invento proporciona um método para a incorporação eficiente de: ácido 2-norbornanocarboxilico; ácido 2-(cis/trans)-hidroxiciclo-hexanocarboxilico; ácido 3-(cis/trans)-hidroxiciclo-hexanocarboxilico; ácido 4-(cis/trans)-hidroxiciclo-hexanocarboxilico; ácido 2-(cis/trans)-metilciclo-hexanocarboxílico; ácido 4-(cis/trans)-metilciclo-hexanocarboxílico; ácido 3-(cis/trans)-metoxiciclo-hexanocarboxilico; ácido 4-(cis/trans)-metoxiciclo- hexanocarboxílico; ácido 4-oxociclo-hexanocarboxílico; ácido etil2-oxociclo-hexanocarboxílico; ácido 4-trans-n-pentilciclo-hexanocarboxílico; ácido 2-trans-aminociclo-hexanocarboxilico; ácido 4-cis-aminociclo-hexanocarboxilico; ácido 4-(cis/trans)-aminometilciclo-hexanocarboxilico; ácido ciclopentanocarboxílico; ácido ciclobutanocarboxilico; ácido 1-metilciclo- hexanocarboxilico; ácido 3-trans-hidroxi-4-cis-fluorociclo- hexanocarboxilico hexanocarboxilico; hexanocarboxilico hexanocarboxilico; hexanocarboxilico hexanocarboxilico; hexanocarboxilico ácido e 4-trans-hidroxi-3-cís-fluorociclo-ácido 3-cis-hidroxi-4-trans-íluorociclo- e ácido 4-cís-hidroxi-3-trans-fluorociclo-ácido 3-cis-hidroxi-4-trans-clorociclo- e ácido 4-cí s-hidroxi-3-traris-clorociclo-ácido 3-trans-hidroxi-4-cís-clorociclo-e ácido 4-trans-hidroxi-3-cis-clorociclo-hexanocarboxilico; ácido 3-trans-ciclo-hexenooxidocarboxilico; ácido 3-cís-ciclo-hexenooxidocarboxilico; ácido 3,4-cís-di- 50 ΕΡ 1 589 031 /PT hidroxiciclo-hexanocarboxílico e ácido 3,4-trans-di-hidroxiciclo-hexanocarboxílico; ácido ciclo-hexanoacético; ácido ciclo-hexanopropiónico ou ácido 4-cis/trans-terc-butilciclo-hexanocarboxílico ou seus sais ou ésteres simples em análogos de ligandos de FKBP por uma estirpe com rapK ou um homólogo de rapK delecionados ou inactivados. Numa concretização mais preferida, o presente invento proporciona um método para a incorporação eficiente de: ácido 3-(cis/trans)-hidroxiciclo-hexanocarboxílico; ácido 4-(cis/trans)-hidroxiciclo-hexanocarboxílico; ácido 3-(cis/trans)-metoxiciclo-hexanocarboxílico; ácido 4-(cis/trans)-metoxiciclo-hexano carboxílico; ácido 4-oxociclo-hexanocarboxílico; ácido ciclobutanocarboxílico; ácido 3- trans-hidroxi-4-cis-fluorociclo-hexanocarboxílico e ácido 4- trans-hidroxi-3-cis-fluorociclo-hexanocarboxílico; ácido 3- cís-hidroxi-4-trans-fluorociclo-hexanocarboxílico e ácido 4- cís-hidroxi-3-trans-fluorociclo-hexanocarboxílico; ácido 3- cís-hidroxi-4-trans-clorociclo-hexanocarboxílico e ácido 4- cís-hidroxi-3-trans-clorociclo-hexanocarboxílico; ácido 3- trans-hidroxi-4-cís-clorociclo-hexanocarboxílico e ácido 4- trans-hidroxi-3-cis-clorociclo-hexanocarboxílico; ácido 3-trans-ciclo-hexenooxidocarboxílico; ácido 3-cís-ciclo-hexenooxidocarboxílico; ácido 3,4-cís-di-hidroxiciclo-hexanocarboxílico e ácido 3,4-trans-di-hidroxiciclo-hexanocarboxílico; ácido ciclo-hexanopropiónico; ácido 4-cís/trans-terc-butilciclo-hexanocarboxílico ou seus sais ou ésteres simples em análogos de ligandos de FKBP por uma estirpe com rapK ou um homólogo de rapK delecionados ou inactivados.

Numa concretização específica do presente invento, as unidades de iniciação alimentadas não são: ácido ciclo-hexanocarboxílico, ácido 3-cís,4-trans-di-hidroxiciclo-hexanocarboxílico, ácido 1-ciclo-hexenocarboxílico, ácido 3- ciclo-hexenocarboxílico, ácido ciclo-heptanocarboxílico, ácido 3-(cis/trans)-metilciclo-hexanocarboxílico, ácido 4- (cis/trans)-metilciclo-hexanocarboxílico, ácido 1-ciclo-heptenocarboxílico ou ácido 5-cís-hidroxil-3-ciclo-hexenocarboxílico.

As estirpes para utilização nas concretizações descritas acima são seleccionadas de entre o grupo compreendendo: 51

ΕΡ 1 589 031 /PT

Streptomyces hygroscopicus subsp. hygroscopicus NRRL 5491, Actinoplanes sp. N902-109 FERM BP-3832, Streptomyces sp. AA6554, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus MA 6475 ATCC 14891, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus MA 6678 ATCC 55087, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus MA 6674, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus ATCC 55276, Streptomyces hygroscopicus subsp. ascomyceticus ATCC 14891, Streptomyces tsukubaensis No.9993 FERM BP-927, Streptomyces hygroscopicus subsp. yakushimaensis, Streptomyces sp. DSM 4137, Streptomyces sp. DSM 7348, Micromonospora n.sp. A92-306401 DSM 8429, Streptomyces sp. MA 6858 ATCC 55098, Streptomyces sp. MA 6848. Numa concretização preferida, a referida estirpe é seleccionada de entre o grupo consistindo em: Streptomyces hygroscopicus subsp. hygroscopicus NRRL 5491, Actinoplanes sp. N902-109 FERM BP-3832, Streptomyces sp. AA6554, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus MA 6475 ATCC 14891, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus MA 6678 ATCC 55087, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus MA 6674, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus ATCC 55276, Streptomyces hygroscopicus subsp. ascomyceticus ATCC 14891, Streptomyces tsukubaensis No.9993 FERM BP-927, Streptomyces hygroscopicus subsp. yakushimaensis, Streptomyces sp. DSM 4137, Streptomyces sp. DSM 7348, Micromonospora n.sp. A92-306401 DSM 8429 ou Streptomyces sp. MA 6858 ATCC 55098. Numa concretização muitíssimo preferida, a estirpe é o produtor de rapamicina S. hygroscopicus subsp. hygroscopicus.

Nos métodos para a incorporação eficiente de ácidos carboxilicos alimentados descrita acima os compostos produzidos são análogos dos ligandos de FKBP como se descreve aqui, por exemplo mas sem limitação: rapamicina, FK506, FK520, FK523, FK525, antascomicina, meridamicina e tsukubamicina.

Numa concretização preferida, os compostos produzidos são análogos de rapamicina, FK506 ou FK520. Numa concretização muitíssimo preferida, os compostos produzidos são análogos de rapamicina; estes compostos correspondem à Fórmula II ou Fórmula III como se descreve abaixo.

Adicionalmente, os métodos descritos acima podem ser utilizados para gerar novos análogos de FK506 e FK520 que correspondem à Fórmula I abaixo: 52

ΕΡ 1 589 031 /PT

Fórmula I

r2 = H, alquilo, halo, hidroxilo, tiol r3 = H, alquilo, halo, hidroxilo, tiol r4 = H, alquilo, halo, hidroxilo, tiol R.5 = OMe, Me ou H R6 = OMe, Me ou H R7 = CH2CH3 ou ch2ch=ch2 z = ceto ou CH2 X=X' =ligação; X=ligação e X'= CH2, S, O ou X= CH2, S, O, unidade ciclopropilo fundida e X'=ligação

Numa concretização preferida,

Ri =

onde R8 = OH e Rg= H, OH, halo, alquilo ou tiol. Numa concretização mais preferida,

onde R8= OH e R: halo. 53

ΕΡ 1 589 031 /PT FK520 =

onde R8 R4 = Η, X = CH2, X' = = 4-trans-OH, R9 = 3-cis-OCH3, e R2 = R3 = ligação, Z = ceto, R5 = R6 = OCH3 e R7 = ch2ch3 FK505 =

onde R8 R4 = Η, X = CH2, X' = 4-trans-OH, R9 = 3-cis-OCH3, e R2 = R3 = ligação, Z = ceto, R5 = Rê = OCH3 e R7 = CH2CH=CH2

Assim, por exemplo, a estirpe recombinante S. hygroscopicus MG2-10 pode ser cultivada na presença de ácido ciclo-hexanocarboxilico para produzir 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-39-desmetoxi-rapamicina (Exemplo 12). Pode ser observado por um perito na técnica que também podem ser delecionados ou inactivados outros homólogos de rapK noutros "clusters" biossintéticos que codificam ligandos de FKBP, incluindo, mas não se lhes limitando, FK506, FK520, FK523, FK525, meridamicina, tsukubamicina, antascomicina e 'hyg', permitindo uma alimentação eficiente dos ácidos carboxilicos da unidade de iniciação conduzindo à produção de novos análogos.

Noutro aspecto, estirpes de S. hygroscopicus do invento (incluindo rapL ou homólogos de rapL ou não incluindo rapL ou homólogos de rapL e/ou incluindo rapK ou homólogos de rapL ou não incluindo rapK ou homólogos de rapL) podem ser alimentadas com análogos de ácido L-pipecólico, como se descreveu acima, em combinação com análogos da unidade de iniciação natural ácido 4,5-di-hidroxiciclo-hex-l-enocarboxílico, como se descreveu acima, para produzir análogos de rapamicina nos quais tanto a unidade de iniciação como o resíduo de pipecolilo foram substituídos. Esta abordagem é exemplificada nos Exemplos 10, 11 e 12. O presente invento proporciona um processo para produzir análogos de ligandos de FKBP divergindo na extensão da modificação pós-PKS e/ou por o resíduo de ácido pipecólico ter sido substituído, e opcionalmente o resíduo iniciador ácido 4,5-di-hidroxiciclo-hex-l-enocarboxílico ter sido substituído, este processo compreende o passo de delecionar ou inactivar um 54

ΕΡ 1 589 031 /PT ou mais genes na célula hospedeira de microorganismo envolvida na produção do composto precursor, ácido L-pipecólico e/ou ácido 4,5-di-hidroxiciclohex-l-enocarboxílico, necessário para a biossíntese do molde de policétido rapamicina/NRPS e/ou na sua subsequente modificação pós-PKS, para deste modo suprimir a produção do produto natural. O processo compreende além disso transformar as células hospedeiras de microorganismo com ácido nucleico que codifica genes modificadores de policétido para restaurar a produção de policétido, cultivar as células hospedeiras transformadas sob condições adequadas para produção de policétido e opcionalmente isolar os análogos de rapamicina produzidos. O presente invento proporciona um processo para a produção de análogos de ligandos de FKBP incluindo, mas não se lhes limitando, FK506, FK520, FK523, FK525, tsukubamicina, antascomicina, meridamicina e 'hyg', divergindo na extensão de modificação pós-PKS e/ou por o resíduo de aminoácido ter sido substituído, e opcionalmente a unidade de iniciação ter sido substituída. Este processo compreende o passo de delecionar ou inactivar um ou mais genes na célula hospedeira de microorganismo envolvida na produção do resíduo de aminoácido do precursor e/ou unidade de iniciação, necessário para a biossíntese do molde de policétido/NRPS e/ou na sua subsequente modificação pós-PKS, para deste modo suprimir a produção do produto natural. O processo compreende além disso transformar as células hospedeiras de microorganismo com ácido nucleico que codifica genes modificadores de policétido para restaurar a produção de policétido, cultivar as células hospedeiras transformadas sob condições adequadas para produção de policétido e opcionalmente isolar os análogos de policétido produzidos.

Também proporcionamos novos análogos de ligandos de FKBP: 31-desmetoxi-FK520, 31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-trans- hidroxi-FK520, 31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-cis-hidroxi- FK520, 31-desmetoxi-31-trans-hidroxi-32-trans-hidroxi-FK52D, 31-0-desmetil-32-des-hidroxi-FK520, 31-O-desmetil-FK520, 31-desmetoxi-31-metil-FK520, 31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32- metil-FK520, 31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32-fluoro-FK520, 31-desmetoxi-31-fluoro-FK520, 31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32-cloro-FK520, 31-desmetoxi-31-cloro-FK520, 31-0-desmetil-32- 55 ΕΡ 1 589 031 /PT des-hidroxi-32-terc-butil-FK520, 29-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-29-(hidroxi-ciclo-heptil)-FK520, 29-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-29-(hidroxi-norbornil)-FK520, 9-desoxo- 31- desmetoxi-FK520, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-cís-hidroxi-32-trans-hidroxi-FK520, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-cís-hidroxi-32-cis-hidroxi-FK520, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-trans-hidroxi-32-trans-hidroxi-FK520, 9-desoxo-31-0-desmetil-32-des-hidroxi-FK520, 9-desoxo-31-O-desmetil-FK520, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-metil-FK520, 9-desoxo-31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32-metil-FK520, 9-desoxo-31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32-fluoro-FK520, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-fluoro-FK520, 9-desoxo-31-0-desmetil- 32- des-hidroxi-32-cloro-FK520, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-cloro- FK520, 9-desoxo-31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32-terc-butil-FK520, 9-desoxo-29-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-29- (hidroxi-ciclo-heptil)-FK520, 9-desoxo-29-des(3-metoxi-4- hidroxi-ciclo-hexil)-29-(hidroxi-norbornil)-FK520, 30- desmetoxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31- trans-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-des-hidroxi- prolil-FK520, 30-0-desmetil-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-metil-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-metil- prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-fluoro-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-fluoro-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-cloro-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-cloro- prolil-FK520, 30-desmetil-31-des-hidroxi-31-terc-butil-prolil-FK520, 28-des(3-metoxi-4-hidroxiciclo-hexil)-28-(hidroxi- ciclo-heptil) -FK520, 28-des(3-metoxi-4-hidroxiciclo-hexil)-28-(hidroxi-norbornil)-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-31-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-tra.ns-hidroxi-prolil-FK520,-8-desoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-trans- hidroxi-31-trans-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-O-desmetil- 31- des-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-O-desmetil-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-metil-prolil-FK520, 8-desoxo-30-0-desmetil-31-des-hidroxi-31-metil-prolil-FK520, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-fluoro-prolil-FK520, 8-desoxo- 30- desmetoxi-30-fluoro-prolil-FK520, 8-desoxo-30-O-desmetil- 31- des-hidroxi-31-cloro-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi- 30- cloro-prolil-FK520, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi- 31- terc-butil-prolil-FK520, 8-desoxo-28-des(3-metoxi-4- hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-ciclo-heptil)-prolil-FK520, 56

ΕΡ 1 589 031 /PT 8-desοχο-28-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-norbornil)-prolil-FK520, 30-desmetoxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-tra.ns-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trar!s-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-des-hidroxi-3- hidroxi-prolil-FK520, 30-0-desmetil-3-hidroxi-prolil-FK520, 30- desmetoxi-30-metil-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil- 31- des-hidroxi-31-metil-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil- 31-des-hidroxi-31-fluoro-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-fluoro-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-des- hidroxi-31-cloro-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30- cloro-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-terc-butil-3-hidroxi-prolil-FK520, 28-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil-28-(hidroxi-ciclo-heptil)-3-hidroxi-prolil-FK520, 28-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-norbornil)-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-31-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-traiis-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi- 30- cís-hidroxi-31-cís-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-tra.ns-hidroxi-31-tra.ns-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-0-desmetil-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-metil-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-metil-31-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-fluoro- 3- hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-fluoro-3- hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi- 31- cloro-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-30- cloro-3-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-O- desmetil-31-des-hidroxi-31-terc-butil-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-28-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-ciclo-heptil) -3-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-28-des(3- metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-norbornil) -3-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cís-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-traiis-hidroxi-31-trans-hidroxi- 4- hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-des-hidroxi-4- hidroxi-prolil-FK520, 30-0-desmetil-4-hidroxi-prolil-FK520, 30- desmetoxi-30-metil-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil- 31- des-hidroxi-31-metil-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil- 57

ΕΡ 1 589 031 /PT 31-des-hidroxi-31-fluoro-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-fluoro-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-des- hidroxi-31-cloro-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30- cloro-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-terc-butil-4-hidroxi-prolil-FK520, 28-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-ciclo-heptil)-4-hidroxi-prolil-FK520, 28-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-norbornil)-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-31-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi- 30- cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-tra.ns-hidroxi-31-tra.ns-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-O-desmetil-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-metil-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-metil-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-fluoro-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-fluoro-4- hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi- 31- cloro-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-30- cloro-3-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-O- desmetil-31-des-hidroxi-31-terc-butil-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-28-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-ciclo-heptil) -4-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-28-des(3- metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-norbornil)-4-hidroxi-prolil-FK520, 31-desmetoxi-trans-3-biciclo [3.1.0.]FK520, 31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-trans-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-cis-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-desmetoxi-31- trans-hidroxi-32-trans-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31- 0-desmetil-32-des-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31- O-desmetil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-desmetoxi 31-metil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-0-desmetil-32-des- hidroxi-32-metil-trans-3-biciclo[3.1.0.] FK520, 31-O-desmetil- 32- des-hidroxi-32-fluoro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-desmetoxi-31-fluoro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-0- desmetil-32-des-hidroxi-32-cloro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-desmetoxi-31-cloro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-0- desmetil-32-des-hidroxi-32-terc-butil-trans-3-biciclo [3.1.0.]FK520, 29-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-29- (hidroxi-ciclo-heptil)-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 29-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-29-(hidroxi-norbornil)-trans-3- 58

ΕΡ 1 589 031 /PT biciclo[3.1.0.]FK520, 9-desoxo-31-desmetoxi-trans-3- biciclo[3.1.0.]FK520, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-cís-hidroxi-32-trans-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-desoxo-31- desmetoxi-31-cís-hidroxi-32-cis-hidroxi-trans-3-biciclo [3.1.0.] FK520, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-trans-hidroxi-32- traíis-hidroxi-traíis-3-biciclo [3.1.0.] FK520, 9-desoxo-31-0- desmetil-32-des-hidroxi-tra.ns-3-biciclo [3.1.0.] FK520, 9- desoxo-31-0-desmetil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-metil-traíis-3-biciclo [3.1.0.] FK520, 9-desoxo- 31- 0-desmetil-32-des-hidroxi-32-metil-trar!s-3- biciclo[3.1.0.]FK520, 9-desoxo-31-0-desmetil-32-des-hidroxi- 32- fluoro-traas-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-desoxo-31-desmetoxi- 31-fluoro-traas-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-desoxo-31-0- desmetil-32-des-hidroxi-32-cloro-traas-3-biciclo[3.1.0.]FK520. 9-desoxo-31-desmetoxi-31-cloro-trar!s-3-biciclo [3.1.0.] FK520, 9-desoxo-31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32-terc-butil-traris-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-desoxo-29-des(3-metoxi-4-hidroxi- ciclo-hexil)-29-(hidroxi-ciclo-heptil)-trans-3- biciclo[3.1.0.]FK520, 9-desoxo-29-des(3-metoxi-4-hidroxi- ciclo-hexil)-29-(hidroxi-norbornil)-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520.

Também proporcionamos os seguintes análogos de FK520: 31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-trans-hidroxi-PK520, 31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-cis-hidroxi-FK520, 31-desmetoxi-31-trans-hidroxi-32-trans-hidroxi-FK520, 31-desmetoxi-31-metil-FK520, 31-desmetoxi-31-fluoro-FK520, 31-desmetoxi-31-cloro-FK520, 31-O-desmetil-32-des-hidroxi-32-terc-butil-FK520, 29-des(3- metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-29-(hidroxi-ciclo-heptil)-FK520, 29- des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-29-(hidroxi-norbornil)- FK520, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-trans-hidroxi-FK520, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-cis-hidroxi-FK520, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-trans-hidroxi-32-trans- hidroxi-FK520, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-metil-FK520, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-fluoro-FK520, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-cloro-FK520, 9-desoxo-31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32-terc-butil-FK520, 9-desoxo-29-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-29- (hidroxi-ciclo-heptil)-FK520, 9-desoxo-29-des(3-metoxi-4- hidroxi-ciclo-hexil)-29-(hidroxi-norbornil)-FK520, 30-desmetoxi- 30- cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30- cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30- trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30- 59

ΕΡ 1 589 031 /PT metil-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-fluoro-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-cloro-prolil-FK520, 30-desmetil-31-des- hidroxi-31-terc-butil-prolil-FK520, 28-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-ciclo-heptil)-FK520, 28-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-norbornil)-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-31-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-tra.ns-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30- desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-0-desmetil-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-metil-prolil-FK520, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-metil-prolil-FK520, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-fluoro-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-fluoro-prolil-FK520, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-cloro-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-cloro-prolil- FK520, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-terc-butil-prolil-FK520, 8-desoxo-28-des(3-metoxi-4-hidroxiciclo-hexil)-28-(hidroxi-ciclo-heptil)-prolil-FK520, 8-desoxo-28-des(3- metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-norbornil)-prolil-FK520, 30-desmetoxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-0-desmetil-31-des-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-0- desmetil-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-metil-3- hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-metil-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-fluoro-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-fluoro-3-hidroxi- prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-cloro-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-cloro-3-hidroxi-prolil-FK520, 30- O-desmetil-31-des-hidroxi-31-terc-butil-3-hidroxi-prolil- FK520, 28-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi- ciclo-heptil) -3-hidroxi-prolil-FK520, 28-des(3-metoxi-4- hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-norbornil)-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-31-hidroxi-3-hidroxi-prolil- FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-cís-hidroxi- 31- cis-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-0-desmetil-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30- 60

ΕΡ 1 589 031 /PT desmetoxi-30-metil-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-O- desmetil-31-des-hidroxi-31-metil-3-hidroxi-prolil-FK520,8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-fluoro-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-fluoro-3-hidroxi- prolil-FK520, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-cloro-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-cloro-3- hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-terc-butil-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-28- des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-ciclo-heptil)- 3- hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-28-des(3-metoxi-4-hidroxi- ciclo-hexil)-28-(hidroxi-norbornil)-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-cis- hidroxi-31-trans-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-3 0 -trans-hidroxi-31-trar!S-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-0-desmetil-31-des-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil- 4- hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-metil-4-hidroxi- prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-metil-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-fluoro-4- hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-fluoro-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-cloro-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-cloro-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-0-desmetil-31-des-hidroxi-31-terc-butil-4-hidroxi-prolil-FK520, 28-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-ciclo-heptil) -4-hidroxi-prolil-FK520, 28-des(3-metoxi-4-hidroxi- ciclo-hexil)-28-(hidroxi-norbornil)-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-31-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-cís-hidroxi-31-trans-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-cís-hidroxi-3Ιοί s-hidroxi- 4-hidroxi -prol H-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-O-desmetil-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-30- metil-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-metil-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-O- desmetil-31-des-hidroxi-31-fluoro-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-fluoro-4-hidroxi-prolil-FK520, 8- desoxo-3O-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-cloro-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-cloro-3-hidroxi-4-hidroxi- prolil-FK520, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-terc-butil-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-28-des(3-metoxi-4- hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-ciclo-heptil)-4-hidroxi- 61

ΕΡ 1 589 031 /PT prolil-FK520, 8-desoxo-28-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-norbornil)-4-hidroxi-prolil-FK520, 31-desmetoxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-trans-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-cis-hidroxi-traiis-3-biciclo [3.1.0.] FK520, 31- desmetoxi-31-trans-hidroxi-32-tra.ns-hidroxi-tra.ns-3-biciclo [3.1.0.]FK520, 31-0-desmetil-32-des-hidroxi-trans-3-biciclo [3.1.0.]FK520, 31-0-desmetil-trans-3-biciclo[3.1.0.] FK520, 31-desmetoxi- 31- metil-trans-3-biciclo [3.1.0.] FK520, 31-0-desmetil-32-des- hidroxi-32-metil-trans-3-biciclo [3.1.0.] FK520, 31-O-desmetil- 32- des-hidroxi-32-fluoro-traas-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31- desmetoxi-31-fluoro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-0-desmetil-32 -des-hidroxi-32-cloro-tra.ns-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-desmetoxi-31-cloro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32-terc-butil-tra.ns-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 29-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-29-(hidroxi-ciclo-heptil)-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 29- des (3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-29-(hidroxi-norbornil)-trans-3-biciclo[3.1.0.] FK520, 9-desoxo-31-desmetoxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-trans-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-desoxo-31- desmetoxi-31-cís-hidroxi-32-cis-hidroxi-traris-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-trar!s-hidroxi-32-trans-hidroxi-trar!s-3-biciclo [3.1.0.]FK520, 9-desoxo-31-0-desmetil-32-des-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-desoxo-31-0-desmetil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-metil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-desoxo-31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32-metil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-desoxo-31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32-fluoro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-fluoro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-desoxo-31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32-cloro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-cloro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-desoxo-31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32-terc-butil-trans-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-desoxo-29-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-29-(hidroxi-ciclo-heptil)-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-desoxo-29-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-29-(hidroxi-norbornil)-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520.

Também proporcionamos os seguintes novos análogos de FK520: 31-desmetoxi-31-metil-FK520, 31-desmetoxi-31-fluoro- FK520, 31-desmetoxi-31-cloro-FK520, 31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32-terc-butil-FK520, 29-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-29-(hidroxi-ciclo-heptil)-FK520, 29-des(3-metoxi-4- 62

ΕΡ 1 589 031 /PT hidroxi-ciclo-hexil)-29-(hidroxi-norbornil)-FK520, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-metil-FK520, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-fluoro-FK520, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-cloro-FK520, 9-desoxo-31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32-terc-butil-FK520, 9-desoxo-29- des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-29-(hidroxi-ciclo-heptil)-FK520, 9-desoxo-29-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-29- (hidroxi-norbornil)-FK520, 30-desmetoxi-30-metil-prolil-FK520, 30- desmetoxi-30-fluoro-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-cloro- prolil-FK520, 30-desmetil-31-des-hidroxi-31-terc-butil-prolil-FK520, 28-des(3-metoxi-4-hidroxiciclo-hexil)-28-(hidroxi- ciclo-heptil) -FK520, 28-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-norbornil)-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-31- hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-cís-hidroxi-31-trans-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-cis- hidroxi-31-cís-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-O-desmetil-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-metil-prolil-FK520, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-metil-prolil-FK520, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-fluoro-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-fluoro-prolil-FK520, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-cloro-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-cloro-prolil-FK520, B-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-terc-butil-prolil-FK520, 8-desoxo-28-des(3- metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-ciclo-heptil)-prolil-FK520, 8-desoxo-28-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-norbornil) prolil-FK520, 30-desmetoxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis- hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-trans-hidroxi- 31- trans-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-des- hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-3-hidroxi- prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-metil-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-metil-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-fluoro-3-hidroxi-prolil-FK520, 30- desmetoxi-30-fluoro-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil- 31- des-hidroxi-31-cloro-3-hidroxi-prolyhFK520, 30-desmetoxi- 30- cloro-3-hidroxi-prolil-FK520 30-O-desmetil-31-des-hidroxi- 31- terc-butil-3-hidroxi-prolil-FK520, 28-des(3-metoxi-4- hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-ciclo-heptil)-3-hidroxi-prolil-FK520, 28-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-28- (hidroxi-norbornil)-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30- 63

ΕΡ 1 589 031 /PT desmetoxi-31-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30- desmetoxi-30-cís-hidroxi-31-tra.ns-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-cís-hidroxi-31-cis-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-tra:is-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-O- desmetil-31-des-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-O-desmetil-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-30- metil-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-metil-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-O- desmetil-31-des-hidroxi-31-fluoro-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-fluoro-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-cloro-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-cloro-3-hidroxi-3- hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-terc-butil-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-28-des(3- metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-ciclo-heptil)-3-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-28-des(3-metoxi-4-hidroxiciclo-hexil)-28- (hidroxi-norbornil)-3-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-tra.ns-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-cís-hidroxi-31-cís- hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-traas-hidroxi-31-traas-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-des-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-4-hidroxi- prolil-FK520, 30-desmetoxi-30-metil-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-metil-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-fluoro-4-hidroxi-prolil-FK520, 30- desmetoxi-30-fluoro-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil- 31- des-hidroxi-31-cloro-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-desmetoxi- 30- cloro-4-hidroxi-prolil-FK520, 30-O-desmetil-31-des-hidroxi- 31- terc-butil-4-hidroxi-prolil-FK520, 28-des(3-metoxi-4- hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-ciclo-heptil)-4-hidroxi-prolil-FK520, 28-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-28- (hidroxi-norbornil)-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30- desmetoxi-31-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30- desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trar!s-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-tra.ns-hidroxi-31-traas-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-O- desmetil-31-des-hidroxi-4-hidroxi-propyl-FK520, 8-desoxo-30-O-desmetil-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-30- metil-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-metil-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-O- 64

ΕΡ 1 589 031 /PT desmetil-31-des-hidroxi-31-fluoro-4-hidroxi-prolil-FK520, 8- desoxo-30-desmetoxi-30-fluoro-4-hidroxi-prolil-FK520, 8- desoxo-30-0-desmetil-31-des-hidroxi-31-cloro-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-cloro-3-hidroxi4-hidroxi- prolil-FK520, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-terc-butil-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-28-des(3-metoxi-4- hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-ciclo-heptil)-4-hidroxi-prolil-FK520, 8-desoxo-28-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)- 28- (hidroxi-norbornil)-4-hidroxi-prolil-FK520, 31-desmetoxi- tra.ns-3-biciclo [3.1.0.] FK520, 31-desmetoxi-31-cís-hidroxi-32-tra.ns-hidroxi-tra.ns-3-biciclo [3.1.0.] FK520, 31-desmetoxi-31-cís-hidroxi-32-cis-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-desmetoxi-31-trans-hiároxi-32-trans-hiároxi-trans-3-1oiciclo [3.1.0.] FK520, 31-0- desmetil-32-des-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-O-desmetil-trans-3-biciclo[3.1.0,]FK520, 31-desmetoxi-31-metil-tra.ns-3- biciclo [3.1.0. ]FK520, 31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32-metil- traas-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32-fluoro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-desmetoxi-31-fluoro-traas-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32-cloro-trans-3-biciclo [3.1.0.] FK520, 31-desmetoxi-31-cloro- traas-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32-terc-butil-traas-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 29-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-29-(hidroxi-ciclo-heptil)-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 29-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)- 29- (hidroxi-norbornil)-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-desoxo- 31- desmetoxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-desoxo-31-desmetoxi-31- cis-hidroxi-32-trans-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9- de s oxo-31-de smetoxi-31-cís-hidroxi-32-cís-hidroxi-tra.ns-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-trans-hidroxi- 32- trans-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-desoxo-31-0- desmetil-32-des-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-desoxo-31-0- desmetil-trans-3-biciclo[3.1.0]FK520, 9-desoxo-31-desmetoxi- 31- metil-trai!s-3-biciclo [3.1.0.] FK520,9-desoxo-31-0-desmetil- 32- des-hidroxi-32-metil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-desoxo-31-0- desmetil-32-des-hidroxi-32-fluoro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9- desoxo-31-desmetoxi-31-fluoro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-desoxo-31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32-cloro-trar!s-3-biciclo [3.1.0.]FK520, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-cloro-trans-3- biciclo[3.1.0.]FK520, 9-desoxo-31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32-terc-butil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520, 9-desoxo-29-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-29-(hidroxi-ciclo-heptil)-trans- 65

ΕΡ 1 589 031 /PT 3- biciclo[3.1.0.]FK520, 9-desoxo-29-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-29-(hidroxi-norbornil)-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK520.

Também proporcionamos os seguintes análogos de FK506: 31-desmetoxi-FK506, 31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-trans-hidroxi-FK506, 31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-cis-hidroxi-FK506, 31-desmetoxi-31-trans-hidroxi-32-trar!S-hidroxi-FK506, 31-0- desmetil-32-des-hidroxi-FK506, 31-O-desmetil-FK506, 31-desmetoxi-31-metil-FK506, 31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32- metil-FK506, 31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32-fluoro-FK506, 31-desmetoxi-31-fluoro-FK506, 31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32-cloro-FK506, 31-desmetoxi-31-cloro-FK506, 31-0-desmetil-32- des-hidroxi-32-terc-butil-FK506, 29-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-29-(hidroxi-ciclo-heptil)-FK506, 29-des(3-metoxi- 4- hidroxi-ciclo-hexil)-29-(hidroxi-norbornil)-FK506, 9-desoxo- 31- desmetoxi-FK506, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-trans-hidroxi-FK506, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-cís-hidroxi-FK506, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-trans-hidroxi-32-trans-hidroxi-FK506, 9-desoxo-31-0-desmetil-32-des-hidroxi-FK506, 9-desoxo-31-O-desmetil-FK506, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-metil-FK506, 9-desoxo-31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32-metil-FK506, 9-desoxo-31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32-fluoro-FK506, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-fluoro-FK506, 9-desoxo-31-0-desmetil- 32- des-hidroxi-32-cloro-FK506, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-cloro- FK506, 9-desoxo-31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32-terc-butil-FK506, 9-desoxo-29-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-29- (hidroxi-ciclo-heptil)-FK506, 9-desoxo-29-des(3-metoxi-4- hidroxi-ciclo-hexil)-29-(hidroxi-norbornil)-FK506, 30- desmetoxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-cís-hidroxi-31-trans-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis- hidroxi-prolil-FK5 06, 30-desmetoxi-30-trar!s-hidroxi-31-trans-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-des-hidroxi-prolil- FK506, 30-0-desmetil-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-metil-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-metil-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-fluoro-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-fluoro-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-des- hidroxi-31-cloro-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-cloro-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-terc-butil-prolil- FK506, 28-des(3-metoxi-4-hidroxiciclo-hexil)-28-(hidroxi- ciclo-heptil ) -FK506, 28-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)28-(hidroxi-norbornil)-FK506, 8-desoxo-30-desmetoxi-31-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans- 66

ΕΡ 1 589 031 /PT hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-tra.ns- hidroxi-31-traiis-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-O-desmetil-prolil-FK506, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-metil-prolil-FK506, 8-desoxo-30-0-desmetil-31-des-hidroxi-31-metil-prolil-FK506, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-fluoro-prolil-FK506, 8-desoxo- 30- desmetoxi-30-fluoro-prolil-FK506, 8-desoxo-30-O-desmetil- 31- des-hidroxi-31-cloro-prolil-FK506, 8-desoxo-30-desmetoxi- 30- cloro-prolil-FK506, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi- 31- terc-butil-prolil-FK506, 8-desoxo-28-des(3-metoxi-4- hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-ciclo-heptil)-prolil-FK506, 8-desoxo-28-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-norbornil)-prolil-FK506, 30-desmetoxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-cí s-hidroxi-31-traris-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-cís-hidroxi-31-cis-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trar!s-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-des-hidroxi-3- hidroxi-prolil-FK506, 30-0-desmetil-3-hidroxi-prolil-FK506, 30- desmetoxi-30-metil-3-hidroxi-prolil-FK5 06, 30-O-desmetil- 31- des-hidroxi-31-metil-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil- 31-des-hidroxi-31-fluoro-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-fluoro-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-des- hidroxi-31-cloro-3 hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-cloro-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-terc-butil-3-hidroxi-prolil-FK506, 28-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-ciclo-heptil)-3-hidroxi-prolil-FK506, 28-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-norbornil)-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-desmetoxi-31-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-cís-hidroxi-31-cis-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506,8-desoxo- 30- desmetoxi-30-traas-hidroxi-31-trar!s-hidroxi-3-hidroxi- prolil-FK506, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-0-desmetil-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-metil-3-hidroxi-prolil-FK506, 8- desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-metil-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-fluoro-3- hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-fluoro-3- hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi- 31- cloro-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-desmetoxi-30- cloro-3-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-O- 67

ΕΡ 1 589 031 /PT desmetil-31-des-hidroxi-31-terc-butil-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-28-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-ciclo-heptil)-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-28-des(3- metoxi-4-hidroxiciclo-hexil)-28-(hidroxi-norbornil)-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 30- desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-des-hidroxi-4- hidroxi-prolil-FK506, 30-0-desmetil-4-hidroxi-prolil-FK506, 30- desmetoxi-30-metil-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil- 31- des-hidroxi-31-metil-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil- 31- des-hidroxi-31-fluoro-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi- 30-fluoro-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-des- hidroxi-31-cloro-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30- cloro-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-terc-butil-4-hidroxi-prolil-FK506, 28-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-ciclo-heptil)-4-hidroxi-prolil-FK506, 28-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-norbornil)-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-desmetoxi-31-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-0-desmetil-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-metil-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-O- desmetil-31-des-hidroxi-31-metil-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-fluoro-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-fluoro-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-cloro-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-cloro-3-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-terc-butil-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-28-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-ciclo-heptil)-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-28-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-norbornil)-4-hidroxi-prolil-FK506, 31-desmetoxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31- desmetoxi-31-cís-hidroxi-32-trans-hidroxi-traris-3-biciclo [3.1.0.]FK506, 31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-cís-hidroxi- trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-desmetoxi-31-trans-hidroxi- 32- trans-hidroxi-traris-3-biciclo [3.1.0.] FK506, 31-O-desmetil-32-des-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-O-desmetil- 68

ΕΡ 1 589 031 /PT trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-desmetoxi-31-metil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32-metil-traas-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32-fluoro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506.31-desmetoxi-31-fluoro-traas-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32-cloro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-desmetoxi-31-cloro- trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32-terc-butil-traas-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 29-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-29-(hidroxi-ciclo-heptil)-tra.ns-3-biciclo [3.1.0.]FK506, 29-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-29- (hidroxi-norbornil)-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-desoxo-31-desmetoxi-traas-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-desoxo-31-desmetoxi- 31- cis-hidroxi-32-traris-hidroxi-traas-3-biciclo [3.1.0.] FK506, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-cls-hidroxi-32-cís-hidroxi-traas-3-biciclo [3.1.0.] FK506, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-trai!s-hidroxi- 32- traas-hidroxi-traris-3-biciclo [3.1.0.] FK506, 9-desoxo-31-0- desmetil-32-des-hidroxi-traíis-3-biciclo [3.1.0.] FK506, 9- desoxo-31-0-desmetil-traris-3-biciclo [3.1.0.] FK506, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-metil-traas-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-desoxo- 31- 0-desmetil-32-des-hidroxi-32-metil-trar!s-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-desoxo-31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32-fluoro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-fluoro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-desoxo-31-0-desmetil-32-des-hidroxi- 32- cloro-traas-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-desoxo-31-desmetoxi- 31- cloro-traas-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-desoxo-31-0-desmetil- 32- des-hidroxi-32-terc-butil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9- desoxo-29-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-29-(hidroxi-ciclo-heptil) -traas-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-desoxo-29-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-29-(hidroxi-norbornil)-trans-3-biciclo[3.9.0.]FK506.

Também proporcionamos os seguintes análogos de FK506: 31-desmetoxi-31-cls-hidroxi-32-trans-hidroxi-FK506, 31-desmetoxi-31-cís-hidroxi-32-cís-hidroxi-FK506, 31-desmetoxi-31-traas-hidroxi-32-trans-hidroxi-FK506, 31-desmetoxi-31-metil-FK506, 31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32-terc-butil-FK506, 29-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-29-(hidroxi-ciclo-heptil)-FK506, 29-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-29-(hidroxi-norbornil)-FK506, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-cís-hidroxi-32-trans-hidroxi- FK506, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-cís-hidroxi-32-cls-hidroxi- FK506, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-trans-hidroxi-32-trar!S-hidroxi-FK5 06, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-metil-FK506, 9-desoxo-31-0-desmetil- 69

ΕΡ 1 589 031 /PT 32-des-hidroxi-32-terc-butil-FK506, 9-desoxo-29-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-29-(hidroxi-ciclo-heptil)-FK506, 9-desoxo-29-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-29-(hidroxi-norbornil)-FK506, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-prolil- FK506, 30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-metil-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-terc-butil-prolil-FK506, 28-des(3-metoxi-4- hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-ciclo-heptil)-FK506, 28- des (3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-norbornil)-FK506, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis- hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-metil-prolil-FK506, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-terc-butil-prolil-FK506, 8-desoxo-28-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-ciclo-heptil)-prolil-FK506, 8-desoxo-28-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-norbornil)-prolil-FK506, 30-desmetoxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 30- desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-des-hidroxi-3- hidroxi-prolil-FK506, 30-0-desmetil-3-hidroxi-prolil-FK506, 30- desmetoxi-30-metil-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil- 31- des-hidroxi-31-metil-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil- 31-des-hidroxi-31-fluoro-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-fluoro-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-des- hidroxi-31-cloro-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30- cloro-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-terc-butil-3-hidroxi-prolil-FK506, 28-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-ciclo-heptil)-3-hidroxi-prolil-FK506, 28-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-norbornil)-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-desmetoxi-31-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-cís-hidroxi-31-trans-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-cís-hidroxi-31-cís-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-O-desmetil-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-meti1-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-metil-3-hidroxi-prolil-FK506, 70

ΕΡ 1 589 031 /PT 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-fluoro-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-fluoro-3-hidroxi- prolil-FK506, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-cloro-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-cloro-3- hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-terc-butil-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-28-des(3- metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-ciclo-heptil)-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-28-des(3-metoxi-4-hidroxiciclo-hexil)-28-(hidroxi-norbornil)-3-hidroxi-prolil-FK506, 30- desmetoxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-cís-hidroxi-31-trans-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-traiis-hidroxi-31-trai!S-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-des-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-metil-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-0-desmetil-31-des-hidroxi-31-metil-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-fluoro-4-hidroxi- prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-fluoro-4-hidroxi-prolil-FK506, 3DO-desmetil-31-des-hidroxi-31-cloro-4-hidroxi-prolil-FK506, 30- desmetoxi-30-cloro-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil- 31- des-hidroxi-31-terc-butil-4-hidroxi-prolil-FK506, 28-des(3- metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-ciclo-heptil)-4-hidroxi-prolil-FK506, 28-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-norbornil)-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-desmetoxi-31-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30- desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-O- desmetil-31-des-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-O-desmetil-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-desmetoxi-30- metil-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-metil-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-O- desmetil-31-des-hidroxi-31-fluoro-4-hidroxi-prolil-FK506, 8- desoxo-30-desmetoxi-30-fluoro-4-hidroxi-prolil-FK506, 8- desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-cloro-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-cloro-3-hidroxi-4-hidroxi- prolil-FK506, 8-desoxo-30-0-desmetil-31-des-hidroxi-31-terc-butil-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-28-des(3-metoxi-4- hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-ciclo-heptil)-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-28-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-norbornil)-4-hidroxi-prolil-FK506, 31-desmetoxi- 71

ΕΡ 1 589 031 /PT trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-desmetoxi-31-cís-hidroxi-32-trans-hidroxi-tra.ns-3-biciclo [3.1.0.] FK506, 31-desmetoxi-31-cís-hidroxi-32-cís-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31- desmetoxi-31-trans-hidroxi-32-trans-hidroxi-tra.ns-3-biciclo [3.1.0.] FK506, 31-0-desmetil-32-des-hidroxi-trai!s-3-biciclo [3.1.0.]FK506, 31-0-desmetil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-desmetoxi-31-metil-traiis-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32-metil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32-fluoro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-desmetoxi-31-fluoro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32-cloro-traas-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-desmetoxi-31-cloro-trai!s-3-biciclo [3.1.0.] FK506, 31-0- desmetil-32-des-hidroxi-32-terc-butil-trai!s-3-biciclo[3.1.0.] FK506 . 29-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-29-(hidroxi-ciclo-heptil)-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 29-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-29-(hidroxi-norbornil)-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-desoxo-31-desmetoxi-trar!s-3-biciclo [3.1.0.] FK506, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-traiis-hidroxi-traiis-3-biciclo [3.1.0.]FK506, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-cis-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-traas-hidroxi-32-traris-hidroxi-trar!s-3-biciclo [3.1.0.] FK506, 9- desoxo-31-0-desmetil-32-des-hidroxi-trai!s-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9- desoxo-31-0-desmetil-traris-3-biciclo [3.1.0.] FK506, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-metil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-desoxo- 31- 0-desmetil-32-des-hidroxi-32-metil-traiis-3-biciclo [3.1.0.]FK506, 9-desoxo-31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32- fluoro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-fluoro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-desoxo-31-0-desmetil- 32- des-hidroxi-32-cloro-traris-3-biciclo [3.1.0.] FK506, 9- desoxo-31-desmetoxi-31-cloro-traas-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9- desoxo-31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32-terc-butil-trar!s-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-desoxo-29-des(3-metoxi-4-hidroxi- ciclo-hexil)-29-(hidroxi-ciclo-heptil)-trans-3-biciclo [3.1.0.]FK506. 9-desoxo-29-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo- hexil)-29-(hidroxi-norbornil)-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506.

Também proporcionamos os seguintes análogos de FK506: 31-desmetoxi-31-metil-FK506, 31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32- terc-butil-FK506, 29-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-29-(hidroxi-ciclo-heptil)-FK506, 29-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-29-(hidroxi-norbornil)-FK506, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-metil-FK506, 9-desoxo-31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32-terc- 72

ΕΡ 1 589 031 /PT butil-FK506. 9-desοχο-29-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)- 29- (hidroxi-ciclo-heptil)-FK506, 9-desoxo-29-des(3-metoxi-4- hidroxi-ciclo-hexil)-29-(hidroxi-norbornil)-FK506, 30- desmetoxi-30-metil-prolil-FK506, 3O-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-terc-butil-prolil-FK506, 28-des(3-metoxi-4-hidroxiciclo-hexil)-28-(hidroxi-ciclo-heptil)-FK506, 28-des(3-metoxi-4- hidroxiciclo-hexil)-28-(hidroxi-norbornil)-FK506, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-metil-prolil-FK506, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-terc-butil-prolil-FK506, 8-desoxo-28-des(3- metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-ciclo-heptil)-prolil-FK506, 8-desoxo-28-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-norbornil)-prolil-FK506, 30-desmetoxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis- hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK5 06, 30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-3-hidroxi-prolÍ1-FK506, 30-O-desmetil-31-des-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK5 06, 30-O-desmetil-3-hidroxi- prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-metil-3-hidroxi-prolil-FK506, 30- O-desmetil-31-des-hidroxi-31-metil-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-fluoro-3-hidroxi-prolil-FK506, 30- desmetoxi-30-fluoro-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-0-desmetil- 31- des-hidroxi-31-cloro-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi- 30- cloro-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-des-hidroxi- 31- terc-butil-3-hidroxi-prolil-FK506, 28-des(3-metoxi-4- hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-ciclo-heptil)-3-hidroxi-prolil-FK506, 28-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-28- (hidroxi-norbornil)-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30- desmetoxi-31-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30- desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-O- desmetil-31-des-hidroxi-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-O-desmetil-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-desmetoxi-30- metil-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des- hidroxi-31-metil-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-O- desmetil-31-des-hidroxi-31-fluoro-3-hidroxi-prolil-FK506, 8- desoxo-30-desmetoxi-30-fluoro-3-hidroxi-prolil-FK506, 8- desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-cloro-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-cloro-3-hidroxi-3-hidroxi- prolil-FK506, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-terc-butil-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-28-des(3-metoxi-4- 73

ΕΡ 1 589 031 /PT hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-ciclo-heptil)-3-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-28-des(3-metoxi-4-hidroxiciclo-hexil)-28-(hidroxi-norbornil)-3-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-tra.ns-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-trans-hidroxi-31-tra.ns-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-0- desmetil-31-des-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-metil-4-hidroxi- prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-metil-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-fluoro-4- hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-fluoro-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-cloro-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-desmetoxi-30-cloro-4-hidroxi-prolil-FK506, 30-0-desmetil-31-des-hidroxi-31-terc-butil-4-hidroxi-prolil-FK506, 28-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-ciclo-heptil) -4-hidroxi-prolil-FK506, 28-des(3-metoxi-4-hidroxi- ciclo-hexil)-28-(hidroxi-norbornil)-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-desmetoxi-31-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 8- desoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-trans-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-cis-hidroxi-31-cis- hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-desmetoxi-30- trans-hidroxi-31-trans-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 8- desoxo-30-0-desmetil-31-des-hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-0-desmetil-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30- desmetoxi-30-metil-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-O- desmetil-31-des-hidroxi-31-metil-4-hidroxi-prolil-FK506, 8- desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-fluoro-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-fluoro-4-hidroxi- prolil-FK506, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-cloro-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-desmetoxi-30-cloro-3- hidroxi-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-30-O-desmetil-31-des-hidroxi-31-terc-butil-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-28- des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-ciclo-heptil)-4-hidroxi-prolil-FK506, 8-desoxo-28-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-28-(hidroxi-norbornil)-4-hidroxi-prolil-FK506, 31-desmetoxi-trans-3-biciclo[3.1.0]FK506, 31-desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-trans-hidroxi-trans-3-biciclo[3.10]FK506, 31- desmetoxi-31-cis-hidroxi-32-cis-hidroxi-trans-3-biciclo [3.1.0.]FK506, 31-desmetoxi-31-trans-hidroxi-32-trans-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-0-desmetil-32-des-hidroxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-0-desmetil-trans-3-biciclo 74

ΕΡ 1 589 031 /PT

[3.1.0.] FK506, 31-desmetoxi-31-metil-tra.ns-3-biciclo [3.1.0.] FK506, 31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32-metil-traíis-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32-fluoro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-desmetoxi-31-fluoro-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32-cloro-traíis-3-biciclo [3.1.0.] FK506, 31-desmetoxi-31-cloro-traiis-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32-terc-butil-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 29-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-29-(hidroxi-ciclo-heptil)-traíis-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 29-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo-hexil)-29-(hidroxi-norbornil)-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-desoxo-31-desmetoxi-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-cís-hidroxi-32-traas-hidroxi-traas-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-desoxo-31- desmetoxi-31-cís-hidroxi-32-cís-hidroxi-traas-3-biciclo [3.1.0.] PK506, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-trai!s-hidroxi-32- traas-hidroxi-traas-3-biciclo[3.1.0.] FK506, 9-desoxo-31-0- desmetil-32-des-hidroxi-traíis-3-biciclo [3.1.0.] FK506, 9- desoxo-31-0-desmetil-trai!s-3-biciclo [3.1.0.] FK506, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-metil-trar!s-3-biciclo [3.1.0.] FK506,9-desoxo- 31- 0-desmetil-32-des-hidroxi-32-metil-trar!s-3-biciclo [3.1.0.]FK506, 9-desoxo-31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32- fluoro-traas-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-desoxo-31-desmetoxi-31-fluoro-traas-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-desoxo-31-0-desmetil- 32- des-hidroxi-32-cloro-traas-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9- desoxo-31-desmetoxi-31-cloro-traiis-3-biciclo [3.1.0.] FK506, 9- desoxo-31-0-desmetil-32-des-hidroxi-32-terc-butil-trai!s-3-biciclo[3.1.0.]FK506, 9-desoxo-29-des(3-metoxi-4-hidroxi- ciclo-hexil)-29-(hidroxi-ciclo-heptil)-traas-3-biciclo [3.1.0.]FK506. 9-desoxo-29-des(3-metoxi-4-hidroxi-ciclo- hexil)-29-(hidroxi-norbornil)-trans-3-biciclo[3.1.0.]FK506.

Também proporcionamos: A: Compostos de fórmula:

onde: x = ligação ou CHRn, ou -CHR6-X-CHR5- é 75

ΕΡ 1 589 031 /PT

A B . C XX XX XX" χχ RI = OH, och3 R2 = H, OH, OCH3 R3 = H, OH, CH3, R4 = H, OH, CH3, R5 = H, OH R6 = H, OH R7 = H R8 = H, ceto R9 = H, ceto RIO = H Rll = H R13 = H RI 4 = H RI 6 = OH, OCH3 Rl 7 = H, OH, Cl, Y = ligação, CH2 com a condição de que os compostos não incluem os seguintes: i) onde Ri = och3 em combinação com R2 = H, Ris = C, Rl6 = cís-3-ΟΗ, Rl 7 = trans-4-ΟΗ, Rs = H, Rê = 5C II 5C r R8 = co II 5C Rio = 5C π II 5C x = CHRn f ii) onde Ri = OH em combinação com R2 = och3, O II LO P? Rl6 = cís-3-ΟΗ, Rl? = trans-4-ΟΗ, Cn II 5C Re = II 5C CO R9 = ceto, Rio = H Rn = H, x = CHRn; iii) onde Ri = OH em . combinação com R2 = = OH, o II LO R16 = cis-3-OCH3, Ri η— --trans-4-OH, Cn II 5C r6= 5C II 5C CO CO =ceto, Rio = H, Rn = H, x = CHRn; 76 76 Rg, Rg

ΕΡ 1 589 031 /PT iv) onde Ri = OH em combinação com R2 = H, Ris = C, Ri6 = 3-OCH3, Ri7 = trans-4-ΟΗ, Rs = H, R6 = H, R7 = H, R8 ceto, Rio = H, Rn = H, x = CHRn; v) onde Ri = OCH3 em combinação com R2 = H, Rn = C, CÍS-3-OH, Rn = trans-4-ΟΗ, R5 = H, R6 = H, R7 = H, = ceto, Rio = H, Rn = H, x = CHRn; vi) onde Ri = OCH3 em combinação com R2 = H, R25 = C, cí s-3-OCH3, Ri 7 = trans-4-ΟΗ, R5 = H, R6 = H, R7 = H, H, Rg = H, Rn = H, Rn = H, x = CHRn; vii) excepto onde Ri = OCH3 em combinação com R2 = OH, C, Rn = cís-3-OCH3, Ri 7 = trans-4-ΟΗ, R5 = H, R6 = = H, R8 = H, Rg = H, Rio = H, Rn = H, x = CHRn; viii) onde Ri = OCH3 em combinação com R2 = OCH3, R15 = C = cí s-3-OCH3, Rn = trans-4-ΟΗ, R5 = H, R6 = H, R7 R8 = H, Rg = H, Rn = H, Rn = H, x = CHRn; ix) onde Ri = OH em combinação com R2 = OCH3, Rn = C, eis-3-OCH3, R17 = trans-4-ΟΗ, R5 = H, R6 = H, R7 R8, Rg = ceto, Rn = H, Rn = H, x = CHRn;

Cis-, R9 = Rl6 = Rs, R9 Rl6 = Rs = R15 = H, R7 '/ Rl6 = H, Rl6 = = H, Rl6 = / R8, Rl6 = 0 Rs, Rl6 = Rg = Rl6 = H, Rg Rl6 = H, R8 Rl6 = = H, onde Ri = och3 em combinação com R2 II 0 Rl5 = cis-3-OCH3 , Rl7: = trans-4-ΟΗ, Rs = H, Rê = H, R? Rg = ceto, Rio = II 5C 3? II 5C X = CHRn; onde Ri = och3 em combinação com R2 = H, Ris = cís-3-OCH3, Rn = trans-4-ΟΗ, On II 5C Re = H, r7 Rg = ceto, Rio = = H, Rn = H, x = CHRn; xii) onde Ri = OCH3 em combinação com R2 = och3, Rl5 = C, cís-3-ΟΗ, Rn = trans-4-ΟΗ, R5 = H, R6 = H, r7 H, Rs ceto, Rn = H, Rn = H, x = CHRn; xiii) onde Ri = OCH3 em combinação com R2 = = H, Rl5 = c, cis-3-OCH3, Ri 7 = trans-4-ΟΗ, R5 = H, Re = H, r7 = = H, Rg = H, Rio = H, x = ligação; xiv) onde Ri = OCH3 em combinação com R2 = och3, Ris = C, cí s-3-OCH3, Ri 7 = trans-4-ΟΗ, R5 = H, Rê = H, R7 = 11 5C 30 II 5C O II H, x = ligação; XV) onde Ri = OCH3 em combinação com R2 = : OH, Ris = C, cí s-3-OCH3, Ri 7 = trans-4-ΟΗ, R5 = H r Rô = H, r7 Rg,Rg = ceto, Rio = = H, x = ligação; 77

ΕΡ 1 589 031 /PT xvi) xvii) xviii xix) onde Ri = 0CH3 em combinação com R2 = H, r15 = c, Rn = cis-3-OCH3, Ri7 = trans-4-ΟΗ, R5 = H, R6 = H, R7 = H, R8,R9 = ceto, Rio = H, x = ligação; onde Ri = OCH3 em combinação com R2 = OCH3, r15 = c, R16 = H, R17 = OH, R5 = H, R6 = H, R7 = H, R8,R9 = ceto, Rio = H, Rn = H, x = CHRn; 1" R13A.R14 onde -CHR6-x-CHR5- é :e Rn = H, R13 = h, Rí4 = H, em combinação com Ri = 0CH3, R2 = OCH3, r15 = c, Rn = cis-3-OCH3, Rn= trans-4-0H, R7 = H, R8, r9 = ceto, R10 = H;

onde Rn = G, R16 = cis-3-OCH3, R17 = trans-4-ΟΗ, y = ligação, em combinação com r4 = 0CH3, r2 = h, R5 = H, r6 = OH, R7 = H, Rn = H, x = ligação, R8, R9 = ceto, Rxo = H XX) onde Rn = G, R3 = H, R4 = trans-OH, y = ligação, em combinação com Ri = 0CH3, R2 = OCH3, R5 = h, R6 = H, R7 = xxi)

II 5C , x = CHRn, Rs, Rg = ceto, R10 = H onde R15 = G, R3 = H, r4 = OH, y = CH2 em combinação com Ri = OCH3, r2 = 0CH3; Rs = H, Rê = H, R7 = H, Rn = H, x = CHRn, R8, r9 = ceto, Rio =H xxii) xxiii xxiv)

onde R15 - G, R3 = cis-OH, R4 = H, y = ligação, em combinação com R4 = OCH3, R2 = OCH3, R5 = h, R6 = H, R7 = H, Rn = H, x = CHRn, Re, Rg = ceto, Ri0 = H onde Ri 5 = G, R3 = CH3, R4 = OH, y = ligação, em combinação com R4 = OCH3, r2 = OCH3, r5 = h, R6 = H, R7 = H, Rn = H, x = CHRn, Rs, Rg = ceto, R10 = H onde R15 = G, R3 = H, R4 = OH, y = CH2, em combinação com Ri = OH, R2 = OH, R5 = H, R6 = H, R7 = H, Rn = H, x = CHRn, R8=R9 = H, Rio = H XXV)

onde R15 = G, R3 = H, R4 = OH, y = CH2, em combinação com Ri = OCH3, R2 = OCH3, R5 = H, R8 = H, R7 = H, Rn = H, x = CHRn, R8=R9 = H, Rio = H

onde R15 = G, R3 = H, R4 = OH, y = CH2, em combinação com Ri = OH, R2 = OCH3, Rs = H, R6 = H, R7 = H, Rn = Η, X = CHRn, R8=R9 = H, R4q = H xxvi)

78 ΕΡ 1 589 031 /PT

xxvii) onde Ris = G, R3 = H, R4 = OH, y = CH2, com Ri = OH, r2 = H, Rs = H, R6 = H, R? = CHRn, R8 =r9 = H, Rio = H , xxviii) onde R; L5 = G, r3 = H, Rz II 0 5C Y = CN H O 11 com Ri = OH, r2 = OCH3, Rs = H, R6 = H, R7 = CHRn, Re, R9 = ceto , R 10 = H xxix) onde Rn = = G, r3 = H, r4 = O II CH 2, em Ri = OCH3, R2 = H, R5 = H, R6 = H, R7 = CHRn, R8,R9 = ceto, Rio = H em combinação 1, Rn = H, x = em combinação = H, Rn = H, x combinação com :, Rn = H, x = B. Compostos de acordo com a fórmula abaixo

onde Ri = OH, OCH3 r2 = H, OH, OCH3 r3 = H, OH, CH3, R4 = H, OH Rs = H Rg = H, OH R? = H r8 = H, ceto r9 = H, ceto Rio = = H x = ligação, CH2 R I 11 R13/\ nR'4' / Rn = \ = H Rn = = H Rl4 = = H OCH3 ou -CHR6-x-CHR5- y = ligação, CH2 é 79

ΕΡ 1 589 031 /PT com a condição de que os compostos não incluem os seguintes:

i) onde R3 = H, R4 = trans-OH, y = ligação, em combinação com Ri = OCH3, r2 = OCH3, r5 = h, r6 = h, r7 = h, x = ch2, R8,R9 = ceto, Rio =H

ii) onde R3 = H, R4 = OH, y = CH2 em combinação com R2 = OCH3, R2 = OCH3, R5 = H, R6 = H, R7 = H, x = CH2, R8,R9 = ceto, Rio = H

iii) onde R3 = cís-OH, R4 = H, y = ligação, em combinação com Ri = OCH3, R2 = OCH3, R5 = H, R6 = H, R7 = H, x = CH2, R8,R9 = ceto, Rio = H iv) onde R3 = CH3, R4 = OH, y = ligação, em combinação com

Ri = OCH 3 r R-2 = OCH3, R5 = H, R, 0 H, R7 = H, x = ch2, R8,R9 = ceto, Rio = H V) onde R3 = H, R4 = OH, y = CH2, em combinação com Ri = OH, r2 = Rio = H OH, Rs = H, R6 = H, R7 = H X 11 0 5C t\J CO II 1X3 = H, Vi) onde R3 = H, r4 = OH, y = CH2, em combinação com Ri = och3, r2 = OCH3, Rs = H, R6 = H, R? = H, x = CH2, R8= =R9 = H, Rio = H vii) onde R3 = H, r4 = OH, y = CH2, em combinação com Ri =

OH, R2 = OCH3, R5 = H, R6 = H, R7 = H, x = CH2, R8=R9 = H, Rio = H viii) onde R3 11 5C = OH, y = CH2, em combinação com Ri = OH, R2 = Rio = H; H, Rs = H, R6 = H, II 5C x = ch2, r8=r9 = H, ix) onde R3 = H, R4 = OH, y = CH2, em combinação com Ri = OH, R2 = OCH3, R5 = H, R6 = H, R7 = H, x = CH2, R8 , r9 =

ceto, Rio = H X) onde R3 = H, r4 = OH, y = = CH2, em combinação com Rx = OCH3, r2 = = H, Rs = H, Rê = = H, R7 = Η, X = CH2, R8,R9 = ceto, Rio = H xi) onde R3 = OCH 3 r R-4 = OH / y = ligação, em combinação com Ri = OCH3, r2 = H, Rs = H, R8 = OH, R7 = H, x = ligação, R8,R9 = ceto, Rio = H 80

ΕΡ 1 589 031 /PT l"

RivVRu xii) onde -CHR6-x-chr5- é e Rn = h, r13 = H, rí4 = h, em combinação com Rx = OCH3, R2 = OCH3, R3 = OCH3, R4 = OH,

R7 = H, R8,R9 = ceto, Rio = H xiii) onde Ri = OCH3 em combinação com R2 = H, R3 = OCH3, R4 = OH, R5 = H, R6 = H, R7 = H, R8 = H, Rg = H, R10 = H, x = ligação, y = ligação xiv) onde Ri = OCH3 em combinação com R2 = OCH3, R3 = OCH3, R4 = OH, R5 = H, R6 = H, R7 = H, R8 = H, Rg = H, R10 = H, x = ligação, y = ligação xv) onde Ri = OCH3 em combinação com R2 = OH, R3 = OCH3, R4 = OH, R5 = H, R6 = H, R7 = H, R8, Rg = ceto, R10 = H, x = ligação, y = ligação xvi) onde Ri = OCH3 em combinação com r2 = h, R3 = OCH3, R4 = OH, R5 = H, R8 = H, R7 = H, R8,R9 = ceto, R10 = H, x = ligação, y = ligação

xvii) onde Ri = OCH3, R2 = H, R3 = OH, R4 = OH, R8 = H, Rg = H

xviii) onde Ri = OCH3, R2 = H, R3 = OCH3, R4 = OH, R8 = H, Rg = H xix) onde Rx = OCH3, R2 = H, R3 = OH, R4 = OH, R8,Rg = ceto xx) onde Ri = OH, R2 = OH, R3 = OCH3, R4 = OH, R8,R9 = ceto xxi) onde Ri = OCH3, R2 = OCH3, R3 = OH, R4 = OH, R8,R9 = ceto xxii) onde Ri = OCH3, R2 = OH, R3 = OCH3, R4 = OH, R8,R9 = ceto

xxiii) onde Ri = OCH3, R2 = OCH3, R3 = OCH3, R4 = OH, R8 = H, Rg = H C. Um composto seleccionado de entre o grupo consistindo em: 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-39-0-desmetil-rapamicina (pré-rapamicina), 9-desoxo-16-0-desmetil-27-0-desmetil-39-0-desmetil-rapamicina, 16-0-desmetil-27-desmetoxi-39-0-desmetil-rapamicina, 9-desoxo-16-0-desmetil-39-0-desmetil-rapamicina, 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-rapamicina, 16-O-desmetil-27-0-desmetil-39-0-desmetil-rapamicina, 9-desoxo-27-0- desmetil-39-O-desmetil-rapamicina, 9-desoxo-16-0-desmetil-27-O-desmetil-rapamicina, 27-0-desmetil-39-0-desmetil-rapamicina, 9-desoxo-16-0-desmetil-rapamicina 9-desoxo-39-0-desmetil- rapamicina, 8-desoxo-15-0-desmetil-26-desmetoxi-38-0-desmetil-prolilrapamicina (pré-prolilrapamicina), 8-desoxo-15-0- desmetil-26-0-desmetil-38-0-desmetil-prolilrapamicina, 15-0- 81

ΕΡ 1 589 031 /PT desmetil-26-desmetoxi-38-0-desmetil-prolilrapamicina, 8- desoxo-26-desmetoxi-38-0-desmetil-prolilrapamicina, 8-desoxo-15-0-desmetil-38-0-desmetil-prolilrapamicina, 8-desoxo-15-0-desmetil-26-desmetoxi-prolilrapamicina, 15-0-desmetil-26-0-desmetil-38-O-desmetil-prolilrapamicina, 8-desoxo-26-0- desmetil-38-O-desmetil-prolilrapamicina, 8-desoxo-15-0- desmetil-26-O-desmetil-prolilrapamicina, 15-0-desmetil-38-0-desmetil-prolilrapamicina, 15-0-desmetil-26-0-desmetil- prolilrapamicina, 15-0-desmetil-26-desmetoxi-prolilrapamicina, 26-desmetoxi-38-0-desmetil-prolilrapamicina, 26-0-desmetil-38-O-desmetil-prolilrapamicina, 8-desoxo-15-0-desmetil- prolilrapamicina, 8-desoxo-26-0-desmetil-prolilrapamicina, 8-desoxo-38-O-desmetil-prolilrapamicina, 15-O-desmetil- prolilrapamicina, 38-O-desmetil-prolilrapamicina, 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-39-desmetoxi-rapamicina, 9-desoxo-16-0-desmetil-27-0-desmetil-39-desmetoxi-rapamicina, 16-0- desmetil-27-desmetoxi-39-desmetoxi-rapamicina, 9-desoxo-27-desmetoxi-39-desmetoxi-rapamicina, 9-desoxo-16-0-desmetil-39-desmetoxi-rapamicina, 16-0-desmetil-27-0-desmetil-39- desmetoxi-rapamicina, 9-desoxo-27-0-desmetil-39-desmetoxi- rapamicina, 16-0-desmetil-39-desmetoxi-rapamicina, 27- desmetoxi-39-desmetoxi-rapamicina, 27-0-desmetil-39-desmetoxi-rapamicina, 9-desoxo-39-desmetoxi-rapamicina, 8-desoxo-15-0-desmetil-26-desmetoxi-38-desmetoxi-prolilrapamicina, 8-desoxo-15-0-desmetil-26-0-desmetil-38-desmetoxi-prolilrapamicina, 15-0-desmetil-26-desmetoxi-38-desmetoxi-prolilrapamicina, 8- desoxo-26-desmetoxi-38-desmetoxi-prolilrapamicina 8-desoxo-15-O-desmetil-38-desmetoxi-prolilrapamicina, 15-0-desmetil-26-0-desmetil-38-desmetoxi-prolilrapamicina, 8-desoxo-26-0- desmetil-38-desmetoxi-prolilrapamicina, 15-0-desmetil-38- desmetoxi-prolilrapamicina, 26-desmetoxi-38-desmetoxi- prolilrapamicina, 26-0-desmetil-38-desmetoxi-prolilrapamicina, 8-desoxo-38-desmetoxi-prolilrapamicina, 38-desmetoxi- prolilrapamicina, 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36- des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(hidroxiciclo-hexenil)rapamicina,9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(di-hidroxi ciclo-hexil)rapamicina,9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(hidroxinorbornil)rapamicina,9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(3-metil-4-hidroxiciclo-hexil)rapamicina, 9-desoxo-16-0-

ΕΡ 1 589 031 /PT 82 desmetil-27-desmetoxi-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(4-metil hidroxiciclo-hexil) rapamicina,9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil) -36-(3-fluoro-4-hidroxiciclo-hexil)rapamicina, 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(3-hidroxi-4-fluorociclo-hexil)rapamicina, 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(3-cloro-4-hidroxiciclo-hexil)rapamicina, 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(3-hidroxi-4-clorociclo-hexil)rapamicina, 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(3-cis-4-cis-di-hidroxiciclo-hexil)rapamicina, 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(3-trans-9-trans-di-hidroxiciclo-hexil)rapamicina, 9-desoxo-16-0-desmetil-27-0-desmetil-39-0-desmetilrapamicina, 9-desoxo-16-0-desmetil-270-desmetil-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(hidroxiciclo-hexenil)rapamicina, 9-desoxo-16-0-desmetil-27-0-desmetil-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(hidroxinorbornil)rapamicina, 9-desoxo-16-0-desmetil-27-0-desmetil-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(4-metil hidroxiciclo-hexil)rapamicina.

Numa concretização especifica, o presente invento descreve métodos para produzir e opcionalmente isolar os compostos que se seguem (Figura 10, Figura 11, Figura 12, Figura 13, e Figuras 14, 15, 16 e Figura 17):

Quadro II

Composto n2: Nome: 1. 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-39-0-desmetil-rapamicina (pré-rapamicina) 2. 9-desoxo-16-0-desmetil-27-0-desmetil-39-0-desmetil- rapamicina 3. 16-0-desmetil-27-desmetoxi-39-0-desmetil-rapamicina 4. 9-desoxo-27-desmetoxi-39-0-desmetil-rapamicina 5. 9-desoxo-16-0-desmetil-39-0-desmetil-rapamicina 6. 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-rapamicina 7. 16-0-desmetil-27-0-desmetil-39-0-desmetil- rapamicina 83

ΕΡ 1 589 031 /PT

Composto η2: Nome: 8. 9-desoxo-27-0-desmetil-39-0-desmetil-rapamicina 9. 9-desoxo-16-0-desmetil-27-0-desmetil-rapamicina 10. 16-0-desmetil-39-0-desmetil-rapamicina 11. 16-0-desmetil-27-0-desmetil-rapamicina 12. 16-0-desmetil-27-desmetoxi-rapamicina 13. 27-desmetoxi-39-0-desmetil-rapamicina 14. 27-0-desmetil-39-0-desmetil-rapamicina 15. 9-desoxo-16-0-desmetil-rapamicina 16. 9-desoxo-27-desmetoxi-rapamicina 17. 9-desoxo-27-0-desmetil-rapamicina 18. 9-desoxo-39-0-desmetil-rapamicina 19. 9-desoxo-rapamicina 20. 16-O-desmetil-rapamicina 21. 27-O-desmetil-rapamicina 22. 27-desmetoxi-rapamicina 23. 39-O-desmetil-rapamicina 24. 8-desoxo-15-0-desmetil-26-desmetoxi-38-0-desmetil-prolilrapamicina (pré-prolilrapamicina) 25. 8-desoxo-15-0-desmetil-26-0-desmetil-38-0-desmetil- prolilrapamicina 26 . 15-0-desmetil-26-desmetoxi-38-0-desmetilprolil- rapamicina 27. 8-desoxo-26-desmetox±-38-0-desmetil- prolilrapamicina 28. 8-desoxo-15-0-desmetil-38-0-desmetil- prolilrapamicina 29. 8-desoxo-15-0-desmetil-26-desmetoxi- prolilrapamicina 30. 15-0-desmetil-26-0-desmetil-38-0-desmetil-prolil- rapamicina 31. 8-desoxo-26-0-desmetil-38-0-desmetil- prolilrapamicina 32. 8-desoxo-15-0-desmetil-26-0-desmetil- 84

ΕΡ 1 589 031 /PT

Composto na : Nome: prolilrapamici-na 33. 15-0-desmetil-38-0-desmetil-prolilrapamicina 34. 15-0-desmetil-26-0-desmetil-prolilrapamicina 35. 15-0-desmetil-26-desmetoxi-prolilrapamicina 36. 26-desmetoxi-38-0-desmetil-prolilrapamicina 37. 26-0-desmetil-38-0-desmetil-prolilrapamicina 38. 8-desoxo-15-0-desmetil-prolilrapamicina 39. 8-desoxo-26-desmetoxi-prolilrapamicina 40. 8-desoxo-26-0-desmetil-prolilrapamicina 41. 8-desoxo-38-0-desmetil-prolilrapamicina 42. 8-desoxo-prolilrapamicina 43. 15-O-desmetil-prolilrapamicina 44. 26-O-desmetil-prolilrapamicina 45. 26-desmetoxi-prolilrapamicina 46 . 38-O-desmetil-prolilrapamicina 47. 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-39-desmetoxi- rapamicina 48. 9-desoxo-16-0-desmetil-27-0-desmetil-39-desmetoxi- rapamicina 49 . 16-0-desmetil-27-desmetoxi-39-desmetoxi-rapamicina 50. 9-desoxo-27-desmetoxi-39-desmetoxi-rapamicina 51. 9-desoxo-16-0-desmetil-39-desmetoxi-rapamicina 52. 16-0-desmetil-27-0-desmetil-39-desmetoxi-rapamicina 53. 9-desoxo-27-0-desmetil-39-desmetoxi-rapamicina 54. 16-0-desmetil-39-desmetoxi-rapamicina 55. 27-desmetoxi-39-desmetoxi-rapamicina 56 . 27-0-desmetil-39-desmetoxi-rapamicina 57. 9-desoxo-39-desmetoxi-rapamicina 58. 39-O-desmetoxi-rapamicina 59. 8-desoxo-15-0-desmetil-26-desmetoxi-38-desmetoxi- prolilrapamicina 60. 8-desoxo-15-0-desmetil-26-0-desmetil-38-desmetoxi- 85

ΕΡ 1 589 031 /PT

Composto η®: Nome: prolilrapamicina 61. 15-0-desmetil-26-desmetoxi-38-desmetoxi-prolil- rapamicina 62. 8-desoxo-26-desmetoxi-38-desmetoxi-prolilrapamicina 63. 8-desoxo-15-0-desmetil-38-desmetoxi- prolilrapamicina 64. 15-0-desmetil-26-0-desmetil-38-desmetoxi-prolil- rapamicina 65. 8-desoxo-26-0-desmetil-38-desmetoxi- prolilrapamicina 66. 15-0-desmetil-38-desmetoxi-prolilrapamicina 67. 26-desmetoxi-38-desmetoxi-prolilrapamicina 68. 26-0-desmetil-38-desmetoxi-prolilrapamicina 69. 8-desoxo-38-desmetoxi-prolilrapamicina 70. 38-desmetoxi-prolilrapamicina 71 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(hidroxiciclo-hexenil)rapamicina 72 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(di-hidroxi ciclo-hexil)rapamicina 73 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(hidroxi-norbornil)rapamicina 74 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(3-metil-4-hidroxiciclo-hexil)rapamicina 75 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(4-metil-hidroxiciclo-hexil)rapamicina 76 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(3-fluoro-4-hidroxiciclo-hexil)rapamicina 77 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(3-hidroxi-4-fluorociclo-hexil)rapamicina 86

ΕΡ 1 589 031 /PT

Composto n2: Nome: 78 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(3-cloro-4-hidroxiciclo-hexil)rapamicina 79 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(3-hidroxi-4-clorociclo-hexil)rapamicina 80 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(3-cis-4-cis-di-hidroxiciclo-hexil)rapamicina 81 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(3-trans-4-trans-di-hidroxiciclo-hexil)rapamicina 82 9-desoxo-16-0-desmetil-27-0-desmetil-39-0-desmetil- rapamicina 83 9-desoxo-16-0-desmetil-270-desmetil-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(hidroxiciclo-hexenil)rapamicina 84 9-desoxo-16-0-desmetil-27-0-desmetil-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(hidroxinorbornil)rapamicina 85 9-desoxo-16-0-desmetil-27-0-desmetil-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(4-metil hidroxiciclo-hexil)rapamicina 86 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(hidroxiciclo-heptil)rapamicina 87 9-desoxo-16-0-desmetil-27-0-desmetil-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(hidroxiciclo-heptil)rapamicina

Também proporcionamos os seguintes novos análogos de rapamicina:

Quadro III

Composto n2: Nome: 1. 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxil-27-desmetoxil-rapamicina (pré-rapamicina) 87

ΕΡ 1 589 031 /PT

Composto na: Nome: 2. 9-desoxo-16-0-desmetil-27-0-desmetil-39-0-desmetil- rapamicina 3. 16-0-desmetil-27-desmetoxi-39-0-desmetil-rapamicina 5. 9-desoxo-16-0-desmetil-39-0-desmetil-rapamicina 6 . 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-rapamicina 7. 16-0-desmetil-27-0-desmetil-39-0-desmetil- rapamicina 8. 9-desoxo-27-0-desmetil-39-0-desmetil-rapamicina 9. 9-desoxo-16-0-desmetil-27-0-desmetil-rapamicina 14. 27-0-desmetil-39-0-desmetil-rapamicina 15. 9-desoxo-16-0-desmetil-rapamicina 18. 9-desoxo-39-0-desmetil-rapamicina 24 . 8-desoxo-15-0-desmetil-26-desmetoxi-38-0-desmetil-prolilrapamicina (pré-prolilrapamicina) 25. 8-desoxo-15-0-desmetil-26-0-desmetil-38-0-desmetil- prolilrapamicina 26. 15-0-desmetil-26-desmetoxi-38-0-desmetil-prolil- rapamicina 27. 8-desoxo-26-desmetoxi-38-0-desmetil- prolilrapamicina 28. 8-desoxo-15-0-desmetil-38-0-desmetil-prolilrapami- cina 29. 8-desoxo-15-0-desmetil-26-desmetoxi- prolilrapamicina O 00 15-0-desmetil-26-0-desmetil-38-0-desmetil-prolil- rapamicina 31. 8-desoxo-26-0-desmetil-38-0-desmetil- prolilrapamici-na 32. 8-desoxo-15-0-desmetil-26-0-desmetil- prolilrapamici-na 33. 15-0-desmetil-38-0-desmetil-prolilrapamicina 34. 15-0-desmetil-26-0-desmetil-prolilrapamicina 35. 15-0-desmetil-26-desmetoxi-prolilrapamicina 36. 26-desmetoxi-38-0-desmetil-prolilrapamicina 88

ΕΡ 1 589 031 /PT

Composto η2: Nome: 37. 26-0-desmetil-38-0-desmetil-prolilrapamicina 38. 8-desoxo-15-0-desmetil-prolilrapamicina 40. 8-desoxo-26-0-desmetil-prolilrapamicina 41. 8-desoxo-38-0-desmetil-prolilrapamicina 43. 15-O-desmetil-prolilrapamicina 46 . 38-O-desmetil-prolilrapamicina 47. 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-39-desmetoxi- rapamicina 48. 9-desoxo-16-0-desmetil-27-0-desmetil-39-desmetoxi- rapamicina 49 . 16-0-desmetil-27-desmetoxi-39-desmetoxi-rapamicina 50. 9-desoxo-27-desmetoxi-39-desmetoxi-rapamicina 51. 9-desoxo-16-0-desmetil-39-desmetoxi-rapamicina 52. 16-0-desmetil-27-0-desmetil-39-desmetoxi-rapamicina 53. 9-desoxo-27-0-desmetil-39-desmetoxi-rapamicina 54 16-0-desmetil-39-desmetoxi-rapamicina 55. 27-desmetoxi-39-desmetoxi-rapamicina 56 . 27-0-desmetil-39-desmetoxi-rapamicina 57. 9-desoxo-39-desmetoxi-rapamicina 59. 8-desoxo-15-0-desmetil-26-desmetoxi-38-desmetoxi- prolilrapamicina 60. 8-desoxo-15-0-desmetil-26-0-desmetil-38-desmetoxi- prolilrapamicina 61. 15-0-desmetil-26-desmetoxi-38-desmetoxi-prolil- rapamicina 62. 8-desoxo-26-desmetoxi-38-desmetoxi-prolilrapamicina 63. 8-desoxo-15-0-desmetil-38-desmetoxi- prolilrapamicina 6 4 . 15-0-desmetil-26-0-desmetil-38-desmetoxi-prolil- rapamicina 65. 8-desoxo-26-0-desmetil-38-desmetoxi- prolilrapamicina 66 . 15-0-desmetil-38-desmetoxi-prolilrapamicina 89

ΕΡ 1 589 031 /PT

Composto n2: Nome: 67. 26-desmetoxi-38-desmetoxi-prolilrapamicina co 26-0-desmetil-38-desmetoxi-prolilrapamicina 69. 8-desoxo-38-desmetoxi-prolilrapamicina 70. 38-desmetoxi-prolilrapamicina 71 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36-des(3-cisme toxi-4-tran s-hidroxi ciclo-hexil ) -36-(hidroxiciclo-hexenil)rapamicina 72 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(di-hidroxi ciclo-hexil)rapamicina 73 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(hidroxinorbornil)rapamicina 74 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(3-metil-4-hidroxiciclo-hexil)rapamicina 75 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(4-metil hidroxiciclo-hexil)rapamicina 76 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(3-fluoro-4-hidroxiciclo-hexil)rapamicina 77 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(3-hidroxi-4-fluorociclo-hexil)rapamicina 78 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(3-cloro-4-hidroxiciclo-hexil)rapamicina 79 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(3-hidroxi-4-clorociclo-hexil)rapamicina 80 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(3-cís-4-cís-di-hidroxiciclo-hexil)rapamicina 81 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(3-trans-4-trans-di-hidroxiciclo-hexil)rapamicina 90

ΕΡ 1 589 031 /PT

Composto n2: Nome: 82 9-desoxo-16-0-desmetil-27-0-desmetil-39-0-desmetil- rapamicina 83 9-desoxo-16-0-desmetil-270-desmetil-36-des(3-cisme toxi-4-tran s-hidroxi ciclo-hexil ) -36-(hidroxiciclo-hexenil)rapamicina 84 9-desoxo-16-0-desmetil-27-0-desmetil-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(hidroxi-norbornil)rapamicina 85 9-desoxo-16-0-desmetil-27-0-desmetil-36-des(3-cis-metoxi-4-trans-hidroxiciclo-hexil)-36-(4-metil-hidroxiciclo-hexil)rapamicina

Também proporcionamos novos análogos de rapamicina de

Fórmula II

onde x = ligação ou CHRn, ou -CHR6-x-CHR5- é 91 ΕΡ 1 589 031 /PT R-13 CHRji M4 / \ γ = ligação ou CHRi2

Ri= OH, och3 & II 33 OH, OCH3 R3= H, OH, OCH3, resíduo alquil -, halo-, amino-, tiol 33 II tá OH, OCH3 , resíduo alquil -, halo-, amino-, tiol 33 II LO tá resíduo alquil-, halo-, hidroxi- r6= h, resíduo alquil-, halo-, hidroxi- & II 3C resíduo alquil-, halo-, hidroxi- CO V LD II =0 ou H r H Rio= H, resíduo alquil-, halo-, hidroxi- Rn= H, resíduo alquil-, halo-, hidroxi- Rl2= H, resíduo alquil-, halo-, hidroxi- 33 II CO tá resíduo alquil-, halo-, hidroxi- 33* II tá resíduo alquil-, halo-, hidroxi

Também proporcionamos novos análogos de rapamicina de

Fórmula III

onde: x = ligação ou CHRn, ou -CHR6-x-CHR5- é

92 ΕΡ 1 589 031 /PT r2= h, oh, och3

r5= h, resíduo alquil-, halo-, hidroxi-R6= H, resíduo alquil-, halo-, hidroxi-R7= H, resíduo alquil-, halo-; hidroxi-R8,R9= =0 ou Η, H

Rio= H, resíduo alquil-, halo-, hidroxi-Ru= H, resíduo alquil-, halo-, hidroxi-Ri2= H, resíduo alquil-, halo-, hidroxi-Ri3= H, resíduo alquil-, halo-, hidroxi-Ri4= H, resíduo alquil-, halo-, hidroxi-

Rie= OH

Ri7= H, OH, halo-, tiol-, alquil-

Os novos análogos de rapamicina são úteis directamente, e como moldes para semi-síntese ou bioconversão adicional para produzir compostos úteis, como imunossupressores, agentes antifúngicos, agentes anticancro, agentes neuro-regenerativos ou agentes para o tratamento de psoríase, artrite reumatóide, fibrose e outras doenças hiperproliferativas.

Portanto também revelamos a utilização dos análogos de ligandos de FKBP gerados no fabrico de um medicamento para o tratamento de cancro, o tratamento de infecções fúngicas, o tratamento de doenças auto-imunes, inflamatórias, proliferativas e hiperproliferativas ou a manutenção de imunossupressão.

Um perito na técnica, por experimentação de rotina, seria capaz de determinar a capacidade destes compostos para inibir o crescimento fúngico(e.g. Baker, H., et al., 1978; método de Referência NCCLS para teste de susceptibilidade antifúngica de diluição de caldo para leveduras: Standard aprovado M27-A, 17(9). 1997), e por exemplo, mas não se lhes limitando, usando os métodos descritos no Exemplo 19. Adicionalmente, um perito na técnica, por experimentação de rotina, seria capaz de determinar a capacidade destes compostos para inibir o crescimento celular tumoral, por exemplo, usando os métodos descritos no Exemplo 19 mas não se lhes limitando, (ver também 93

ΕΡ 1 589 031 /PT

Dudkin, L, et al., 2001; Yu et al. 2001). Os compostos revelados acima são úteis para induzir imunossupressão e portanto relacionam-se com métodos para induzir terapeuticamente ou profilaticamente uma supressão do sistema imunitário do ser humano ou do animal para o tratamento ou prevenção da rejeição de órgãos ou tecidos transplantados, o tratamento de doenças auto-imunes, inflamatórias, proliferativas e hiperproliferativas (exemplos incluem mas não estão inclusivamente limitados a doenças auto-imunes, diabetes do tipo I, rejeição aguda ou crónica de um transplante de órgãos ou tecidos, asma, tumores ou desordens hiperprolificas, psoríase, eczema, artrite reumatóide, fibrose, alergias e alergias relacionadas com alimentos). Estes ensaios são bem conhecidos dos peritos na técnica, por exemplo mas sem limitação: Immunosuppressant activity - Warner, LM., et al., 1992, Kahan et al. (1991) & Kahan & Camardo, 2001); Allografts Fishbein, T.M., et al., 2002, Kirchner et al. 2000;

Autoimmune/Inflammatory/Asthma - Carlson, R.P. et al., 1993, Powell, N. et al., 2001; Diabetes I - Rabinovitch, A. et al., 2002; Psoriasis - Reitamo, S. et al., 2001; Rheumatoid arthritis - Foey, A., et al., 2002; Fibrosis - Zhu, J. et al., 1999, Jain, S., et al., 2001, Gregory et al. 1993 A capacidade dos compostos revelados acima para induzir imunossupressão pode ser demonstrada em testes Standard utilizados para este fim, por exemplo, mas não se lhes limitando, usando os métodos descritos no exemplo 19. Os compostos são úteis relativamente a mecanismos antifibróticos, neuro-regenerativos e anti-angiogénicos, um perito na técnica seria capaz, por experimentação de rotina, de determinar a capacidade destes compostos para prevenir a angiogénese (e.g. Guba, M.,et al., 2002,). Um perito na técnica seria capaz, por experimentação de rotina, de determinar a utilidade destes compostos em "stents" (e.g. Morice, M.C., et al., 2002).

Adicionalmente, um perito na técnica seria capaz, por experimentação de rotina, de determinar a capacidade neuro- regenerativa destes compostos (e.g. Myckatyn, T.M., et al., 2002, Steiner et al. 1997) 94

ΕΡ 1 589 031 /PT

Breve < Figura Figura Figura Figura Figura Figura Figura Figura Figura Figura Figura Figura Figura Figura Figura Figura Figura Figura iescrição das Figuras 1 Estrutura de rapamicina, as secções à esquerda da linha representam o domínio de ligação e as secções à direita indicam o domínio efector. 2 Estrutura de rapamicina (A), FK-506 (B), fk-520 (C) e meridamicina (D) 3 Mapa de plasmídeo de pMG55, um vector de recombinação dupla com selecção positiva de RpsL e oriT para conjugação. 4 Diagrama de fluxos demonstrando a estratégia de clonagem para o isolamento de pMAG144-16 para criar MG2-10. 5 Sinopse das cassetes de genes 6 Estrutura de 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-39-O-desmetilrapamicina 7 Estrutura de 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-39-O-desmetilprolilrapamicina 8 Estrutura de 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-39-desmetoxirapamicina 9 Estrutura de 16-0-desmetil-27-desmetoxirapamicina 10 Estruturas dos compostos 1, 2, 4, 5, 6 CG 15, 16, 17, 18 e 19 11 Estruturas dos compostos 3, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 20, 21, 22 e 23 12 Estruturas dos compostos 24, 25, 27, 28, 29, 31, 32, 38, 39, 40, 41 e 42 13 Estruturas dos compostos 26, 30, 33, 34, 35, 36, 37, 43, 44, 45, e 46 14 Estruturas dos compostos 47, 48, 50, 51, 53 e 57 15 Estruturas dos compostos 49, 52, 54, 55, 56, e 58 16 Estrutura dos compostos 61, 64, 66, 67, 68, e 70 17 Estrutura dos compostos 59, 60, 62, 63, 65, e 69 18 Coerência HMBC da ligação múltipla heteronuclear de pré-rapamicina 95

ΕΡ 1 589 031 /PT

Figura 19 Coerência HMBC do quantum múltiplo heteronuclear de pré-rapamicina

Figura 20 Espectroscopia de correlação de pré-rapamicina (COSY) indicada por setas a cheio, espectroscopia de correlação total de pré-rapamicina (TOCSY) indicada por setas a tracejado. rapN, a no topo (acc no: por baixo

Figura 21 Correcções na sequência de ADN de sequência correcta é apresentada (SEQ ID NO:l) e a sequência publicada X86780, nt 91764-92978) é apresentada (SEQ ID NO:2).

Figura 22 Correcções na sequência de aminoácidos de RapN, a sequência correcta é apresentada no topo (SEQ ID NO:3) e a sequência publicada (acc no: X86780) é apresentada por baixo (SEQ ID NO:4).

Figura 23 Correcções na sequência de ADN de rapM, a sequência correcta é apresentada no topo (SEQ ID NO:5) e a sequência publicada (acc no: X86780, nt 92992-93945 complemento) é apresentada por baixo (SEQ ID NO:6).

Figura 24 Correcções na sequência de aminoácidos de RapM, a sequência correcta é apresentada no topo (SEQ ID NO: 7) e a sequência publicada (acc no: X86780) é apresentada por baixo (SEQ ID NO:8).

Figura 25 Correcções na sequência de ADN de rapL, a sequência correcta é apresentada no topo (SEQ ID NO:9), a sequência publicada (acc no: X86780, nt 94047-95078 complemento) é apresentada no fundo(SEQ ID NO:10).

Figura 26 Correcções na sequência de aminoácidos de RapL, a sequência correcta é apresentada no topo (SEQ ID NO:ll) e a sequência publicada (acc no: X86780) é apresentada por baixo (SEQ ID NO:12)

Figura 27 Correcções na sequência de ADN de rapK, a sequência correcta é apresentada no topo (SEQ ID NO:13) e a sequência publicada (acc no: X86780, nt 95430-96434) é apresentada no fundo (SEQ ID NO:14). 96

ΕΡ 1 589 031 /PT

Figura 28 Correcções na sequência de aminoácidos de RapK, a sequência correcta é apresentada no topo (SEQ ID NO:15) e a sequência publicada (acc no: X86780) é apresentada por baixo (SEQ ID ΝΟ:1β).

Figura 29 Correcções na sequência de adn de rapJ, a sequência correcta é apresentada no topo (SEQ ID NO:17) e a sequência publicada (acc no: X86780, nt 96465-97625) é apresentada no fundo (SEQ ID NO:18).

Figura 30 Correcções na sequência de aminoácidos de RapJ, a sequência correcta é apresentada no topo (SEQ ID NO:19) e a sequência publicada (acc no: X86780) é apresentada por baixo (SEQ ID NO:20).

Figura 31 Correcções na sequência de ADN de rapl, a sequência correcta é apresentada no topo (SEQ ID NO:21) e a sequência publicada (acc no: X86780, nt 97622-98404) é apresentada no fundo (SEQ ID NO:22).

Figura 32 Correcções na sequência de aminoácidos de Rapl, a sequência correcta é apresentada no topo (SEQ ID NO:23) e a sequência publicada (acc no: X86780) é apresentada por baixo (SEQ ID NO:24).

Figura 33 Correcções na sequência de ADN de rapQ, a sequência correcta é apresentada no topo (SEQ ID NO:25) e a sequência publicada (acc no: X86780, nt 90798-91433) é apresentada no fundo (SEQ ID NO:26).

Figura 34 Correcções na sequência de aminoácidos de RapQ, a sequência correcta é apresentada no topo (SEQ ID NO:27) e a sequência publicada (acc no: X86780) é apresentada por baixo (SEQ ID NO:28).

Figura 35 Diagrama de fluxos demonstrando a estratégia de clonagem para o isolamento de pMG278-l para criar MG 3 .

Figura 36 Diagrama de fluxos demonstrando a estratégia de clonagem para o isolamento de pMG267-l para criar MG 4 . 97

ΕΡ 1 589 031 /PT

Materiais e Métodos

Materiais

Todas as enzimas biológicas moleculares e reagentes são de fontes comerciais. O ácido pipecólico D/L foi obtido em Sigma.

Materiais iniciadores 0 Quadro iv resume as fontes dos ácidos usadas nas experiências de alimentação descritas na secção dos Exemplos. Para os compostos que foram comprados são apresentados detalhes da fonte. Para os ácidos iniciadores que foram sintetizados internamente é apresentado um resumo do método sintético. Um perito na técnica reconhecerá que são de rotina variações aos métodos descritos e que estas estão no âmbito do presente invento.

Quadro IV Ácido Companhia Número do lote Síntese Ácido ciclo-hexanocarboxilico Aldrich 10,183-4 Ácido 3-cis,4-trans-di-hidroxi-ciclo-hexano-carboxílico interna pelo método da tese de doutoramento de Lowden Ácido 1-ciclo-hexeno-carboxílico Aldrich 32,836-7 Ácido 3-ciclo-hexeno-carboxilico Aldrich 45,375-7 Ácido ciclo-heptanocarboxilico Aldrich C9,850-0 Carboxilato de meti1-2-norbornano Aldrich S40,932-4 Ácido 2-(cis/trans)-hidroxiciclo-hexanocarboxílico U. Nottingham Sin por Dr R Goss Ácido 3- (cis/trans)-hidroxi-ciclo-hexano-carboxilico U. Nottingham Sin por Dr R Goss 98

ΕΡ 1 589 031 /PT Ácido Companhia Número do lote Síntese Ácido 4-(eis/trans)-hidroxi-ciclo-hexano-carboxílico u. Nottingham Sin por Dr R Goss Ácido 2-{eis/trans)-metilciclo-hexanocarboxílico Aldrich 33,060-4 Ácido 3-(eis/trans)-metilciclo-hexanocarboxilico Aldrich 33,061-2 Ácido 4-(eis/trans)-metilciclo-hexanocarboxilico Aldrich 33,062-0 Ácido 3-(eis/trans)-metoxiciclo-hexanocarboxilico Aldrich 33,283-6 Ácido 4-(eis/trans)-metoxi ciclo-hexanocarboxilico Aldrich 33,284-4 Etilearboxilato de 4-ciclo-hexanona Aldrich 32,062-5 Etilearboxilato de 2-ciclo-hexanona Aldrich 16,699-5 Ácido 4-traas-n-pentil-ciclo- hexanocarboxilico Aldrich 26,160-2 Ácido 2-tra.ns-aminociclo-hexano- carboxilico Aldrich A7331 Ácido 4-cís-aminociclo-hexano-carboxilico Aldrich 40,485-3 Ácido 4-(eis/trans)-(amino-metil)-ciclo-hexanocarbo-xilico Aldrich S42,955-4 Ácido ciclopentanocarboxilico Aldrich Cll,200-3 99

ΕΡ 1 589 031 /PT

Ácido Companhia Número do lote Síntese Ácido ciclobutanocarboxílico Aldrich C9,560-9 Ácido 1-metileiclo-hexano-carboxilico Aldrich 14,282-4 Mistura de ácido 3-trans-hidroxi-4-cís-fluorociclo-hexanocarboxilico e de ácido 4-trans-hidroxi-3-cís-fluorociclo-hexano-carboxílico ou mistura de ácido 3-cis-hidroxi-4-traus-fluorociclo-hexano-carboxílico e de ácido 4-cís-hidroxi-3-traas-fluoro-ciclo-hexano-carboxilico internamente, Método B Mistura de ácido 3-cis-hidroxi-4-traas-cloro-ciclo-hexanocarboxílico e de ácido 4-cís-hidroxi-3-trans-clorociclo-hexano-carboxilico internamente, Método C Mistura de ácido 3-trans-hidroxi-4-cís-clorociclo-hexanocarboxílico e de ácido 4-trans-hidroxi-3-cís-clorociclo-hexano-carboxilico internamente, Método C Ácido 3-traas-ciclo-hexeno- oxidocarboxílico internamente, Método A Ácido 3-cís-ciclo-hexeno-oxido-carboxilico internamente, Método A Mistura de ácido 3,4-cís-di-hidroxiciclo-hexano-carboxilico e de ácido 3,4-trans-di-hidroxi-ciclo-hexanocarboxílico internamente, Método D 100

ΕΡ 1 589 031 /PT Ácido Companhia Número do lote Síntese Ácido ciclo-hexanoacético Aldrich CIO,450-7 Ácido ciclo-hexanopropiónico Aldrich 16,147 Ácido 4-cis/trans-terc-butilciclo- hexanocarboxílico Aldrich 37,493-8 Síntese de ácido 3-cis, 4-trans-di-hidroxiciclo-hexano-carboxílico

Ácido 3-cis,4-trans-di-hidroxiciclo-hexanocarboxílico racémico foi facilmente conseguido a partir de ácido 3-ciclo-hexenocarboxílico racémico disponível comercialmente. Este ácido foi epoxidado através de tratamento com ácido meta-cloroperbenzóico e convertido na lactona in situ pela adição de base (trietilamina), assim estabelecendo as estereoquímicas relativas. Esta lactona foi depois hidrolisada por acção de hidróxido de potássio aquoso, e o produto final purificado em resina de permuta iónica, (ver Tese de pas Lowden 1997, Corey, E. J. e Huang, H., 1989). Método A:

Os epóxidos A e B foram sintetizados por passos Standard. O ácido ciclo-hex-3-enocarboxílico foi protegido com 2-trimetilsililetanol seguindo activação com isobutilcloroformato e trietilamina. O éster resultante foi tratado com ácido meta-cloroperbenzóico e a mistura racémica resultante de diastereómeros foi separada em sílica de fase normal. Os epóxidos foram ou feitos reagir em (ver abaixo) ou desprotegidos directamente pelo tratamento de ácido 101 ΕΡ 1 589 031 /PT trifluoroacético, para libertar os correspondentes ácidos livres. Método B:

Um epóxido protegido foi tratado com HF-piridina anidro para efectuar a abertura do anel para produzir um par de regiómeros racémico, contendo F e OH num arranjo trans (como anteriormente demonstrado para óxido de ciclo-hexeno) . Os ésteres foram depois desprotegidos com ácido trifluoroacético para libertar os ácidos livres, (ver Welch, j. T. e Seper, K., W., 1988) Método C:

Um epóxido protegido foi tratado com ácido clorídrico concentrado suspenso em solvente orgânico para efectuar a abertura do anel para produzir um par de regiómeros racémico, contendo Cl e OH num arranjo trans (como anteriormente demonstrado para óxido de ciclo-hexeno). Os ésteres foram depois desprotegidos com ácido trifluoroacético para libertar os ácidos livres, (ver Chini, M., Crotti, P., et al., 1992) Método D:

Foram gerados ácidos cis-di-hidroxilciclocarboxílicos por tratamento de epóxidos protegidos com uma quantidade catalítica de tetraóxido de ósmio, conjuntamente com um co-oxidante. Os ésteres foram depois desprotegidos com ácido trifluoroacético para libertar os ácidos livres. 102

ΕΡ 1 589 031 /PT

Estirpes bacterianas e condições de crescimento A Escherichia coli DH10B (GibcoBRL) foi feita crescer em meio 2xTY como descrito por Sambrook et al. (1989) e a E. coli ET12567(pUB307) como descrito em MacNeil et al. (1992) e a E. coli ET12567(pUZ8002) como descrito em Paget et al. (1999) em meio 2xTY com canamicina (25 yg/ml). Os vectores pUC18 e Litmus28 foram obtidos de New England Biolabs. O vector PSET152 é descrito em Bierman et al., (1992a). Os transformantes de E. coli foram seleccionados com 100 pg/ml ampicilina ou 50 pg/ml apramicina. O produtor de rapamicina S. hygroscopicus ATCC29253 e os seus derivados foram mantidos em placas de ágar de meio 1 (ver abaixo) a 26°C, e cultivados em TSBGM (Caldo de Soja Triptica com 1,0 % de glucose e MES100 mM, pH 6,0) como descrito em (Khaw et al., 1998), suplementados com 100 pg/ml de apramicina quando necessário.

As culturas liquidas foram feitas crescer a 25°C em balões Erlenmeyer com tubuladura lateral com agitação a 300 rpm. O mutante resistente a estreptomicina S. hygroscopicus MG1C foi seleccionado usando procedimentos Standard e mantido em meio 1 com estreptomicina (50pg/ml). Métodos de alimentação:

Foram preparados lotes de esporos de todas as estirpes após crescimento em meio 1, preservados em glicerol 20% p/v: lactose 10% p/v em água destilada e armazenados a -80 °C. Foram preparadas culturas vegetativas inoculando 100μ1 de lote congelado em 50ml de meio 6 num balão de 250ml. A cultura foi incubada durante 36 a 48 horas a 28 °C, 250rpm.

Procedimento de alimentação: As culturas vegetativas foram inoculadas a 0,5 ml em 7ml de meio 7 em tubos de 50ml. O cultivo foi realizado durante 7 dias, 26°C, 250rpm. A alimentação/adição dos ácidos carboxilicos seleccionados ("iniciadores não naturais" ou "iniciadores naturais") foram 103 ΕΡ 1 589 031 /PT realizados a 24 e 48 horas após inoculação e foram alimentados a 1 mM ou 3mM.

Meio 1: Meio A-modificado

Componente Fonte Catálogo # g/i Macerado de milho em pó Sigma C-8160 2,5 g Extracto de levedura Dif oc 0127-17 3 g Carbonato de cálcio Sigma C5929 3 g Sulfato de ferro Sigma F8633 0,3 g BACTO Agar 20 g Amido de trigo Sigma S2760 10 g Água até 1 L Os meios foram em seguida 121°C, 15 min. esterilizados por autoclavagem a Meio 2 (Box et ai., 1995) Componente g/L Peptona de soja-SL (Marcor) 10 Glucose (Sigma G-7021) 20 Fermento de padeiro 5 NaCl (Sigma) 2 Elementos Vestigiais ZnS04.7H20 0, 05 MgS04. 7H20 0, 125 MnS04. 4H20 0, 01 FeS04. 7H20 0, 02 Ajustar pH a 7,0 Meio 3 (Wilkinson et ai., 2000) Componente g/L Dextrose (Sigma) 15 Glicerol (BDH-Merck) 15 Peptona de soja (Marcor-SL) 15 NaCl (Fisher) 3 CaC03 (Sigma) 1 104

ΕΡ 1 589 031 /PT

Meio 4 (Patente U.S. No. 3, 993, 749)

Componente g/L Farinha de soja (Arkasoy 50) 30 Glucose (Sigma G-7021) 20 Sulfato de amónio 15 KH2P04 (Sigma) 5 Elementos Vestigiais ZnS04.7H20 0, 05 MgS04. 7H20 0,125 MnS04. 4H20 0,01 FeS04. 7H20 0, 02 Ajustar o pH a 6,0

Meio 5 (Box et al., 1995) Componente g/L Farinha de soja (Arkasoy 50) 20 Glucose (Sigma G-7021) 20 Fermento de padeiro 6 K2HP04 (Sigma) 2,5 KH2P04 (Sigma) 2,5 NaCl (Sigma) 5 Glicerol (BDH) 30 Óleo de soja 10 Elementos Vestigiais ZnS04.7H20 0,05 MgS04. 7H20 0,125 MnS04. 4H20 0,01 FeS04. 7H20 0,02 Ajustar pH a 6,4 Meio 6: meio de sementeira RapV7 Componente Por L Farinha de soja (Nutrisoy) 5g Dextrina (White, Prolab) 35g 105

ΕΡ 1 589 031 /PT

Componente Por L Sólidos de Macerado de Milho (Sigma) 4g Glucose lOg (nh4)2so4 2g Ácido láctico(80%) 1, 6ml CaC03(Sigma) 7g Ajustar pH a 7,5 com NaOH 1M. Meio 7: meio MD6 (Meio de fermentação) Componente Por L Farinha de soja(Nutrisoy) 30g Amido de milho (Sigma) 30g Dextrina (White, Prolab) 19g Frutose 20g Levedura (Allinson) 3g Sólidos de Macerado de Milho (Sigma) lg L-Lisina 2,5g kh2po4 2,5g k2hpo4 2,5g (nh4)2so4 lOg NaCl 5g CaC03 (Caltec) lOg MnCL2x4H20 lOmg MgS04x7H20 2,5mg FeS04x7H20 120mg ZnS04x7H20 50mg MES (Mono-hidrato de ácido sulfúrico) 2-morfolinoetano- 21,2g 0 pH é corrigido a 6,0 com NaOH 1M

Antes da esterilização são adicionados 0,4ml de a-amilase Sigma (BAN 250) a 1L de meio. O meio é esterilizado durante 20min a 121°C. 106

ΕΡ 1 589 031 /PT

Meio 8: meio MD3 (meio de fermentação)

Componente Por L Farinha de soja(Nutrisoy) 31,25 g Dextrina Branca(Prolab) 18,75 g KH2P04 5g (NH4)2S04 1,25 g MnCl2.4H20 10 mg MgS04.7H20 2,5 mg FeS04.7H20 120 mg ZnS04.7H20 50 mg SAG 417 1,2 mL pH até 6,4 com NaOH L-lisina 0,625 g Glucose (40 % p/v) 50 mL

Descrição de Estirpes

Todas as estirpes partilhavam a morfologia do tipo selvagem, com micélios vegetativos creme, hifas aéreas brancas, desenvolvendo esporos cinzentos tornando-se pretos e caracteristicamente higroscópicas.

Preferivelmente os esporos para utilização na geração das estirpes recombinantes como se descrevem aqui tinham uma cor cinzenta escura, como definido em Fan 4, 202 c a B, mais preferivelmente eles são definidos como em Fan 4, 202 B (Royal Horticultural Society Colour Chart 2001, disponível em The Royal Horticultural Society, 80 Vincent Square, Londres, SW1P 2PE) .

Manipulação e sequenciação de ADN

Foram realizados procedimentos de manipulações de ADN, PCR e electroporação como descrito em Sambrook et al. (1989). Foram realizadas hibridações Southern com sondas marcadas com digoxigenina usando o kit de marcação DIG ADN como descrito pelo fabricante (Boehringer Mannheim). A sequenciação de ADN 107

ΕΡ 1 589 031 /PT foi realizada como descrito anteriormente (Gaisser et al., 2000) .

Fermentação de estirpes higroscópicas de Streptomyces.

Estirpes higroscópicas de Streptomyces foram cultivadas a partir de um lote de esporos congelado em crioconservante (20% glicerol; 10% lactose p/v em água destilada) em Meio 1 (ver Materiais e Métodos) e os esporos foram recolhidos após 10-20 dias crescimento a 29°C. Alternativamente, os esporos dos lotes de trabalho congelados foram inoculados directamente em meio de pré-cultura. Uma pré-cultura primária foi inoculada com os esporos recolhidos e cultivada em balões Erlenmeyer de 250 ml contendo 50 ml de Meio 6 (ver Materiais e Métodos), agitada a 250 rpm com uma amplitude de duas polegadas, a 30°C, durante dois dias. A pré-cultura primária foi usada para

inocular pré-culturas secundárias de Meio 6 (ver Materiais e Métodos), a 10% v/v, que foi agitada a 300 rpm com uma amplitude de uma polegada, a 28°C, durante mais 24h. As pré-culturas secundárias foram usadas para inocular, a 10% v/v, Meio 8 de produção (ver Materiais e Métodos) contendo 0,01% v/v de anti-espumante SAG 417 e deixadas fermentar num biorreactor agitado durante cinco a sete dias a 26°C. O arejamento foi fixado a 0,75 vvm, a sobrepressão a 0,5 bar e a velocidade de ponta da turbina foi controlada entre 0,98 ms_1 e 2,67 ms-1. Adicionou-se SAG 417 adicional a pedido. O pH foi controlado a 6 - 7 com amónio (10% v/v) ou ácido sulfúrico (1 M) e alimentou-se por gotejamento solução de glucose (40% p/v) no inicio da necessidade de amónio. Método de Extracção e Análise por Cromatoqrafia Líquida de

Alta Resolução (HPLC) (A) A centrifugação foi realizada em 50 ml do caldo de fermentação e o sobrenadante e o micélio foram extractados separadamente como se segue. Os micélios foram lavados com H20 e extractados com 50 ml de metanol durante 16 horas a 4°C. O residuo celular foi removido por centrifugação, o metanol evaporado até à secura depois dissolvido em 200 μΐ metanol. O sobrenadante do caldo de fermentação foi extractado duas vezes com um volume igual de acetato de etilo. A camada orgânica foi seca sobre Na2S04, evaporada até à secura e 108

ΕΡ 1 589 031 /PT depois dissolvida em 200 μΐ de metanol. A análise por HPLC foi realizada num cromatógrafo liquido Hewlett Packard HP1100 com detector comprimento de onda variável ou num instrumento Finnigan MAT LCQ (Finnigan, CA) . Foram obtidos espectros de alta resolução num espectrómetro de massa de Ressonância Ciclotrónica de Iões com Transformada de Fourier (FT-ICR) Bruker BioApex II 4.7 T (Bruker, Bremen, FRG).

Para análise por rmn, o caldo bacteriano foi centrifugado, o sobrenadante extractado com três volumes iguais de acetato de etilo e os micélios extractados com metanol como se descreveu acima. Os extractos foram combinados, secos (Na2S04) e evaporados sob pressão reduzida para dar um sólido branco.

Os espectros de RMN de protão (XH, DQF-COSY, TOCSY, HMQC, HMBC, NOESY) foram registados num espectrómetro Bruker Advance DRX500 que operou a 500 MHz a 27 °C, com excepção do exemplo 6, onde o espectrómetro Bruker Advance DRX500 foi operado a 500 MHz a 10°C. Os desvios químicos são descritos em partes por milhão (ppm) na escala δ e são referidos a CHCI3 a δΗ 7,26 (XH) e CHCI3 a 5C 77,0 (13C) . Os valores J são apresentados em Hertz (Hz).

Protocolos de extracção, isolamento e análise (B).

Protocolo de extracção e purificação: O caldo de fermentação foi clarificado por centrifugação para proporcionar sobrenadante e células. O sobrenadante foi aplicado numa coluna (16 χ 15 cm) de resina Diaion® HP20 (Supelco), lavado com água seguida de 75% MeOH/H20 e depois eluido com MeOH. As células foram misturadas para homogeneidade com um volume igual de acetona. Após pelo menos 30 minutos, a lama de acetona foi clarificada por centrifugação e o sobrenadante decantado. As células peletizadas foram similarmente extractadas duas vezes mais com acetona. O extracto de acetona foi combinado com o MeOH da coluna HP20 e o solvente foi removido in vacuo para dar um concentrado aquoso. O concentrado aquoso (tipicamente 1-2 L) foi extractado com EtOAc (3 χ 1-2 L) e o solvente removido in vacuo para dar um extracto em bruto oleoso (tipicamente 20 g). 109

ΕΡ 1 589 031 /PT Ο resíduo oleoso foi dissolvido num volume mínimo de EtOAc e seco em sílica. A sílica revestida foi aplicada a uma coluna de sílica (400g, 36 χ 6 cm) que foi eluída sequencialmente com misturas de acetona/hexano variando entre inicialmente 25% de acetona a 100% de acetona. As fracções contendo análogos de rapamicina foram identificadas por HPLC (280 nm) usando as condições descritas:

As fracções contendo análogo rapamicina foram combinadas e o solvente foi removido in vacuo. O resíduo foi ainda cromatografado em Sephadex LH20, eluindo com 10:10:1 clorofórmio/heptano/etanol. Os análogos de rapamicina semipurifiçados foram purificados por cromatografia líquida de alta resolução fase inversa(Cl8) usando um Gilson HPLC, eluindo uma coluna Phenomenex 21,2 χ 250 mm Luna 5 pm C18 BDS a 21 mL/min, eluição isocrática com misturas CH3CN/H2O 50% a 70% dependendo da polaridade do análogo de rapamicina.

Análise dos caldos de cultura.

Uma alíquota do caldo completo(1 mL) foi agitada com CH3CN (1 mL) durante 30 minutos. A mistura foi clarificada por centrifugação e o sobrenadante analisado por HPLC com detecção de sistemas de díodo. O sistema de HPLC compreendia um Agilent HP1100 equipado com uma coluna BDS HYPERSIL C18 3 pm 4,6 χ 150 mm (ThermoHypersil-Keystone) aquecida a 40°C. O gradiente de eluição foi de 55% fase móvel B a 95% fase móvel B ao longo de 10 minutos seguida de uma paragem isocrática a 95% fase móvel B durante 2 minutos com um caudal de 1 mL/min. A fase móvel era 10% de acetonitrilo:90% de água, contendo acetato de amónio 10 mM e 0,1% de ácido trifluoroacético, a fase móvel B era 90% de acetonitrilo:10% de água, contendo acetato de amónio 10 mM e 0,1% ácido trifluoroacético. Foram identificados análogos de rapamicina pela presença do trieno de rapamicina trieno característico, centrado em 278 nm. Os análogos FK506 e FK520 são identificados por análise LC-MS.

Análise por LCMS O sistema HPLC descrito acima foi acoplado a um espectrómetro de massa de electrovaporização (electrospray) Bruker Daltonics Esquire3000. A mesma coluna e esquema de 110 ΕΡ 1 589 031 /PT eluição com gradiente foram usados como se descreveu acima. A fase móvel A era água, a fase móvel B era acetonitrilo. Foi usada comutação positiva-negativa numa gama de varrimento de 500 a 1000 Dalton.

Exemplo 1

Conjugação de S. hygroscopicus O plasmideo a ser conjugado em S. hygroscopicus foi transformado por electroporação na estirpe E. coli dam~ dcm~ ET12567 contendo ou pUB307 como descrito em MacNeil et al. (1992) ou pUZ8002 como descrito em Paget et al. (1999). A pré-cultura foi usada (cultura durante a noite, 30°C) para inocular 2xTY fresco (com 50 yg/ml apramicina e 25 yg/ml canamicina) a uma diluição de 1/25 e feita crescer com agitação a 37°C a uma densidade óptica a 595 nm de 0,25-0,6. As células deste caldo foram lavadas duas vezes com 2xTY, depois ressuspensas com 0,5 ml de 2xTY por 25 ml de cultura original. A qualidade do lote de esporos usada é critica para o sucesso deste método. Neste contexto, a idade dos esporos quando recolhidos e a utilização de meio 1 são cruciais para o isolamento da suspensão de esporos de elevada qualidade. Para isolar suspensões de esporos de elevada qualidade de S. hygroscopicus, espalharam-se em placas pré-secas de meio 1 ágar (ver Secção de Materiais e Métodos) esporos ou micélios de S. hygroscopicus usando técnicas microbiológicas Standard seguida de incubação a 26°-28°C durante 14-21 dias. Foram recolhidos esporos por adição de 1-2 ml de 20 % p/v glicerol ou água estéril por técnicas Standard. Uma aliquota de 200 μΐ da suspensão de esporos de S. hygroscopicus foi lavada em 500 μΐ de 2xTY, ressuspensa em 500 μΐ de 2xTY, sujeita a choque térmico a 50°C durante 10 minutos, em seguida arrefecida em gelo. Uma aliquota de 0,5 ml da suspensão E. coli foi misturada com os esporos submetidos a choque térmico e esta mistura foi colocada numa placa em placas de ágar de meio 1. Estas placas foram incubadas a 26°-28°C durante 16 horas antes de se sobrepor 1 mg de ácido nalidíxico e 1 mg de apramicina por placa. Colónias exconjugantes surgem usualmente após 3-7 dias. 111

ΕΡ 1 589 031 /PT

Utilização em S.hygroscopicus MG2-10 de um vector de integração alternativo, pRT801 A conjugação foi também realizada usando o vector de integração pRT801 à base de ΦΒΤ1 em S.hygroscopicus MG2-10 como se descreveu acima. Os exconjugantes cobriram meio 1 contendo 50pg/ml de apramicina e 50pg/ml de ácido nalidíxico, e mostrou ser resistente a apramicina.

Exemplo 2

Isolamento do mutante MG2-10 de S. hygroscopicus portador de uma deleção cromossómica rapQONMLKJI (Figura 4).

Foi construído um mutante (MG2-10) de S. hygroscopicus no qual os genes modificadores de rapamicina rapQ, rapO/N, rapM, raPL, rapK, rapJ e rapl foram delecionados como se descreve abaixo.

Isolamento do mutante resistente a estreptomicina MG1C:

Micélios NRRL5491 de S.hygroscopicus foram espalhados em placas de meio 1 contendo 50mg/ml de estreptomicina. Três colónias foram isoladas e marcadas com MG1A, MG1B e MG1C.

Estas foram conjugadas como no Exemplo 1 com o plasmídeo pMG49, um derivado de pSETl52 contendo o gene rpsL de S.lividans TK24. Exconjugantes de cada destas conjugações foram cobertos sobre uma placa de meio 1 contendo 50mg/ml de apramicina e 50mg/ml de ácido nalidíxico, para confirmar a presença do plasmídeo pMG49. Foram então feitos riscados com elas, em conjunto com as estirpes originais MG1A, MG1B e MG1C, tanto numa placa de meio 1 não contendo antibiótico como numa placa de meio 1 contendo 50mg/ml de estreptomicina. Observou-se crescimento em todos os casos excepto nos riscados de MG1A [pMG49], MGlB [pMG49] e MG1C [pMG49] em estreptomicina, indicando que o w.t. gene rpsL de S.lividans TK24 conferiu sensibilidade dominante a estreptomicina nestas estirpes. A produção de pré-rapamicina foi medida em MG1A, MGlB e MG1C e o melhor produtor, MG1C, foi mantido para posterior manipulação. 112

ΕΡ 1 589 031 /PT

Conjugação de S. hygroscopicus MG1C

Foram realizadas conjugações como se descreve no Exemplo 1 usando o S. hygroscopicus MGlC resistente a estreptomicina e as construções derivadas de vector pMG55.

Construção de vector conjugativo de recombinação dupla pMG55 (Figura 3)

Os iniciadores MAG47 5'-GCAAGCTTGGTACCGACACGCTCGCCGAACAGG-3' (SEQ ID NO:29) e MAG48 5'-GCGCATGCCCTAGGGTGTACATTACTTCTCC-3' (SEQ ID NO:30) foram usados para amplificar o gene rpsL de S.lividans usando o plasmideo pRPSL21 (Shima et al., 1996) como molde. O fragmento PCR foi digerido com Sphl e Hindlll, isolado e ligado com o fragmento de 3,2 kb de pSETl52 (Bierman et al., 1992b), que tinha sido digerido com Sphl e HindiII. Após transformação em E. coli DH10B, foi isolado o plasmideo pMG55. Este plasmideo foi confirmado por sequenciação. O plasmideo pMG55 contém o gene rpsL para permitir a selecção dos recombinantes duplos (Hosted e Baltz, 1997) .

Isolamento do mutante MG2-10 S. hygroscopicus portador de uma deleção cromossómica rapQONMLKJI (Figura 4)

Os iniciadores MAG23 5'-TATCTAGACTTCGCACGTGCCTGGGACA-3' (SEQ ID NO:31) e MAG24 5'-AGAAGCTTACCCAATTCCAACATCACCT-3' (SEQ ID NO:32) foram usados para amplificar a região esquerda de homologia (de nt 89298 a nt 90798 no "cluster" de rapamicina como descrito em Schwecke et al.(Schwecke et al., 1995) usando ADN genómico preparado a partir de S. hygroscopicus NRRL5491 como molde. O produto de PCR de 1,5 kb foi digerido com Xbal e Hindlll e ligado num corte de pUCl8 com Xbal e Hindlll. Após transformação em E. coli DH10B, o plasmideo pMAG127-8 foi isolado. Os iniciadores MAG25 5'-GGAAGCTTTGACCACACGCCGCCCGTTC-3' (SEQ ID NO:33) e MAG26 5'-ATGCATGCCCGCCGCAACCCGCTGGCCT-3' (SEQ ID NO:34) foram usados para amplificar a região direita de homologia (de nt 98404 a nt 99904 no "cluster" de rapamicina como descrito em Schwecke et al. (1995)) usando ADN genómico preparado a partir de S. hygroscopicus NRRL5491 como molde. O produto de 1,5 kb de PCR foi digerido com Hindlll e Sphl e ligado num corte de pUC18 com Hindlll e Sphl. Após transformação em E. coli DH10B, 113

ΕΡ 1 589 031 /PT ο plasmídeo pMAG128-2 foi isolado (Figura 4). Ambos os plasmideos foram analisados por análise sequencial. 0 plasmídeo pMAG127-8 foi digerido com Sphl e HindiII, o plasmídeo pMAGl28-2 foi digerido com Xbal e Hindlll e os fragmentos de 1,5 kb foram isolados a partir de ambos os plasmideos. Estes fragmentos foram ligados num corte de pUC18 com Sphl e Xbal e usado para transformar E. coli DH10B. O plasmídeo pMAG131-l foi isolado. Este plasmídeo foi digerido com Sphl e Xbal, o fragmento de 3 kb foi isolado e ligado em pMG55 cortado com Sphl e Avrll e o ADN foi usado para transformar E. coli DH10B. O plasmídeo pMAG144-16 foi isolado e usada para conjugar S. hygroscopicus MG1C. Foi isolada uma colónia de S. hygroscopicus resistente a apramicina, feita crescer 24 horas em TSBGM com agitação a 26°C, e espalhada em placas de ágar de meio 1 contendo 50 pg/l estreptomicina. Foram isoladas e colónias resistentes a estreptomicina que mostraram ser sensíveis a apramicina. A deleção cromossómica 7606 nt da região rapQONMLKJI do "cluster" de rapamicina foi verificada no mutante MG2-10 usando o produto PCR de 1,5 kb de MAG23 e MAG24 para sondar ADN cromossómico digerido com EcoRI-e BamRI-. A análise do S. hygroscopicus do tipo selvagem apresentou as esperadas bandas de HcoRI de 5,8 kb e BamRI de 5,9 kb após hibridação. Quando o ADN cromossómico de MG2-10 foi tratado similarmente, foram detectadas bandas HcoRl de 9,6 kb e BamRI de 7,6 kb, indicando que o rapQONMLKJI tinha sido removido.

Exemplo 3

Expressão de rapK no mutante MG2-10 de S. hygroscopicus que tem a deleção cromossómica de rapQONMLKJI (Figura 4)

Construção do vector de eiqpressão pSGsetl O vector pCJR336 (Bierman et al.r 1992a) derivado de pSETl52 (gentilmente cedido por Christine Martin e Corinne Squire) foi criado por clonagem do dímero iniciador de CR347 5'-TAAACTAGTCCATCTGAGAGTTTCATATGGCCCTATTCTGCCCAGCCGCTCTAG AAAT-3' (SEQ ID NO:35) e CR348 5'-

ATTTCTAGAGCGGCTGGGCAGAATAGGGCCATATGAAACTCTCAGATGGACTAG TTTA-3' (SEQ ID NO:36) em pSETl52 digerido com Pvull usando técnicas biológicas moleculares Standard, introduzindo assim sítios para as enzimas de restrição Spel, Ndel, e Xbal em pSET152. A 114

ΕΡ 1 589 031 /PT orientação do inserto foi confirmada por sequenciação. O plasmideo pCJR336 foi digerido usando as enzimas de restrição Ndel/SpeI e o vector pSG142 (Gaisser et al., 2000) foi digerido identicamente. As bandas de ADN resultantes de cerca de 5,4 kb para pCJR336 e 1,2 kb para pSG142 foram isoladas seguindo-se uma ligação que foi usada para transformar E. coli DH10B. A construção de vector contendo a região reguladora actII-ORF4 foi isolado e digerido usando a enzima de restrição Xbal seguida de um tratamento com fosfatase alcalina de acordo com protocolos Standard. O ADN isolado foi ligado com um fragmento de cerca de 200 bp de plasmideo pEXoleG2cas (derivado pSG142 contendo o fragmento Ndel/BglII de ca. l,2kb de pSGcas01eG2 (W001/79520) digerido com as enzimas de restrição Xbal e MieI. O vector pSGsetl foi isolado e a correcta orientação do inserto foi verificada usando digeridos de restrição e análise sequencial. O plasmideo pSGsetl contém o regulador actll-ORF4, o promotor pacti e a sequência de codificação 6xHis-tag bem como a região de terminação transcricional lambda to (originada do plasmideo pQE-16) e ela pode integrar sitio-especificamente no sitio de ligação <t>C31.

Clonagem de rapK O gene rapK foi amplificado por PCR usando os iniciadores BIOSG8 5'-GGGCATATGAGGCAATTGACTCCGCCGGTCACGGCACCGTACTGCC-3' (SEQ ID NO:37) e BIOSG9 5'-GGGGTCTAGAGGTCACGCCACCACACCCTCGATCTCGACC -3' (SEQ ID NO:38), que introduziram um sitio Ndel na extremidade 5' e um sitio Xbal na extremidade 3' de rapK. O plasmideo pRl9 (Schwecke et al., 1995) foi usado como molde. Após tratamento com polinucleótido cinase de T4 usando técnicas Standard, o produto de PCR foi ligado com corte de pUC18 com Smal e usado para transformar E. coli DH10B. A sequência de ADN de rapK no plasmideo isolado pUCrapK foi verificada por análise sequencial. As diferenças na sequência de ADN quando comparada com a sequência publicada (acc. no. X86780) são apresentadas na Figura 27. As alterações resultantes em RapK são apresentadas na Figura 28.

Isolamento de pSGsetrapK O plasmideo pUCrapK foi digerido com Ndel e Xbal e os fragmentos do inserto foram isolados e ligados em pSGsetl identicamente digerido. A ligação foi usada para transformar E. coli DH10B usando procedimentos Standard e os 115

ΕΡ 1 589 031 /PT transformantes foram analisados. O plasmídeo pSGsetrapK foi isolado e a construção foi analisada usando digeridos de restrição e análise sequencial.

Exemplo 4

Identificação de 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-39-0-desmetil-rapamicina (pré-rapamicina, Figura 6) A 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-39-0-desmetil- rapamicina (pré-rapamicina) foi obtida conjugando a estirpe MG2-10 S. hygroscopicus como se descreve no Exemplo 1 com pSGsetrapK e isolando os produtos produzidos na fermentação. Isto demonstrou que é possível complementar a deleção de rapK na estirpe MG2-10 e que, se a estirpe é alimentada com ácido pipecólico, é produzida pré-rapamicina, um análogo ao qual faltam as modificações pós-PKS. O plasmideo pSGsetrapK foi conjugado em S. Hygroscopicus MG2-10 e a estirpe feita crescer em TSBGM alimentado com 2mg/l de ácido pipecólico a 25°C com agitação. Os micélios foram extractados com metanol e o caldo de cultura foi extractado com acetato de etilo como se descreveu anteriormente. A análise do caldo de cultura do mutante MG2-10[pSGsetrapK] de S. hygroscopicus alimentado com ácido pipecólico por HPLC com detecção por UV a 280nm revelou a presença de dois picos principais com tempos de retenção de 4,0 e 5,1 minutos. A espectroscopia de massa por electropulverização destes picos revelou que ambos continham iões correspondentes a um composto com um PM de 841,5. Nenhum destes picos foi observado nas extracções de cultura da estirpe NRRL 5491 de S. hygroscopicus ou na estirpe mutante MG2-10 sem o plasmideo de expressão pSGsetrapK de rapK. A análise EM/EM do ião com m/z de 864 (correspondente ao aducto de sódio da pré-rapamicina) revelou que se fragmentou num ião com m/z de 735 correspondente a uma perda de m/z 129 (ácido pipecólico), ou num ião com m/z de 556 correspondente a uma perda de m/z 308 (C28-C42 de pré-rapamicina). Este ião fragmentou-se ele próprio ainda num ião com m/z 306, correspondente a uma perda de m/z 250 (Cl 4 a C27 de pré- rapamicina) . Este padrão de fragmentação foi idêntico ao 116

ΕΡ 1 589 031 /PT padrão observado para a rapamicina mas com a segunda perda de m/z (-308) reduzida em 14, correspondendo à ausência do grupo O-metilo em C39, a terceira perda de m/z (-250) reduzida em 44, correspondendo à ausência dos grupos metoxi em C27 e 0-metilo em C16 e o ião final (306) possuindo uma massa reduzida em 14 correspondendo à ausência do grupo cetona em C9. Isto constitui evidência de que o composto com PM 841,5 representa 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-39-0-desmetil-rapamicina (pré-rapamicina).

Exemplo 5.

Preparação de cassetes de genes para expressão em S. hygroscopicus MG2-10

Foram construídas, como se descreve abaixo, cassetes de genes capazes de dirigir a expressão de uma variedade de genes modificadores de rapamicina e de combinações de genes modificadores.

Clonagem de rapN/O

Os genes contíguos rapN e rapO, daqui em diante designados por rapN/Ο foram amplifiçados por PCR usando os iniciadores BI0SG2 5'-GGGCATATGTCGACGACCGATCAGGGTGAGACCGGAAAGGCCTG-3' (SEQ ID NO:39) e BI0SG3 5'-GGGGTCTAGAGGTCAGTCCTGGGGTTCGAGAAGCTCGCCGGTCTCCTT-3' (SEQ ID NO:40), que introduziram um sítio Ndel na extremidade 5' e um sítio Xbal na extremidade 3' de rapN/Ο. 0 plasmídeo pRl9 (Schwecke et al., 1995) foi usado como molde. Após tratamento com polinucleótido cinase de T4 usando técnicas Standard o produto da PCR foi ligado em corte de pUC18 com Smal e usado para transformar E. coli DH10B. A sequência de ADN de rapN/Ο no plasmídeo isolado pUCrapN/O foi verificada por análise sequencial. As diferenças na sequência de ADN quando comparada com a sequência publicada (acc. no. X86780) são apresentadas na Fig 21. As alterações resultantes em RapN são apresentadas na Fig 22.

Clonagem de rapM O gene rapM foi amplificado por PCR usando os iniciadores BIOSG4 5'-GGGCATATGATCCAACCCGACGTCGTGACCGCCTTCACAGCGG-3' 117

ΕΡ 1 589 031 /PT (SEQ ID NO:41) e BIOSG5 5'- GGGGTCTAGAGGTCACACGCGGACGGCGATCTGGTGCCGATAGG-3' (SEQ ID NO:42), que introduziram um sitio Ndel na extremidade 5' e um sítio Xbal na extremidade 3' de rapM. O plasmídeo pRl9 (Schwecke et ai, 1995) foi usado como molde. Após tratamento com polinucleótido cinase de T4 usando técnicas Standard o produto da PCR foi ligado em corte de pUC18 com Smal e usado para transformar E. coli DH10B. A sequência de ADN de rapM no plasmídeo isolado pUCrapM foi verificada por análise sequencial. As diferenças na sequência de ADN quando comparada com a sequência publicada (acc. no. X86780) são apresentadas na Fig 23. As alterações resultantes em RapM são apresentadas na Fig 24.

Clonagem de rapL O gene rapL foi amplificado por PCR usando os iniciadores BIOSG6 5'-GGGCATATGCAGACCAAGGTTCTGTGCCAGCGTGACATCAAG-3' (SEQ ID NO:43) e BIOSG7 5'-GGGGTCTAGAGGTCACTACAGCGAGTACGGATCGAGGACGTC.CTCGGGCG-3' (SEQ ID NO:44), que introduziram um sítio Ndel na extremidade 5' e um sítio Xbal na extremidade 3' de rapL. O plasmídeo pRl9 (Schwecke et al., 1995) foi usado como molde. Após tratamento com polinucleótido cinase de T4 usando técnicas Standard, o produto da PCR foi ligado em corte de pUC18 com Smal e usado para transformar E. coli DH10B. A sequência de ADN de rapL no plasmídeo isolado pUCrapL foi verificada por análise sequencial. As diferenças na sequência de ADN quando comparada com a sequência publicada (acc. no. X86780) são apresentadas na Fig 25. As alterações resultantes em RapL são apresentadas na Fig 26.

Clonagem de rapLhis O gene rapL foi amplificado por PCR usando os iniciadores BIOSG6 5'-GGGCATATGCAGACCAAGGTTCTGTGCCAGCGTGACATCAAG-3' (SEQ ID NO:43) e BIOSG45 5'-GGAGATCTCAGCGAGTACGGATCGAGGACGTCCTCGGGCG-3' (SEQ ID NO:45), que introduziram um sítio Ndel na extremidade 5' e um sítio Bglii na extremidade 3' de rapL. O plasmídeo pRl9 (Schwecke et al., 1995) foi usado como molde. Após tratamento com polinucleótido cinase de T4 usando técnicas Standard, o produto da PCR foi ligado em corte de pUCl9 com Smal e usado para transformar E. coli DH10B. A sequência de 118

ΕΡ 1 589 031 /PT ADN de rapL no plasmídeo isolado pUC19rapLhiS foi verificada por análise sequencial.

Clonagem de rapK O gene rapK foi amplificado por FCR usando os iniciadores BIOSG8 5'-GGGCATATGAGGCAATTGACTCCGCCGGTCACGGCACCGTACTGCC-3' (SEQ ID NO:37) e BIOSG9 5'-GGGGTCTAGAGGTCACGCCACCACACCCTCGATCTCGACC-3' (SEQ ID NO:38), que introduziram um sitio Ndel na extremidade 5' e um sitio Xbal na extremidade 3' de rapK. O plasmideo-pRl9 (Schwecke et al., 1995) foi usado como molde. Após tratamento com polinucleótido cinase de T4 usando técnicas Standard, o produto da PCR foi ligado com corte de pUC18 com Smal e usado para transformar E. coli DH10B. A sequência de ADN de rapK no plasmideo isolado pUCrapK foi verificada por análise sequencial. As diferenças na sequência de ADN quando comparada com a sequência publicada (acc. no. X86780) são apresentadas na Fig 27. As alterações resultantes em RapK são apresentadas Fig 28.

Isolamento de pSGsetrpaN/O, pSGsetrapJ, pSGsetrapM, pSGsetrapQ, pSGsetrapI, pSGsetrapK, e pSGsetrapL

Os plasmideos pUCrapN/O, pUCrapJ, pUCrapM, pUCrapl, pUCrapL, pUCrapK e pAHL42 foram digeridos com Ndel e Xbal e os fragmentos de inserto, variando em tamanho entre cerca de 1,3 kb a 0,7 kb, foram isolados e ligados em pSGsetl identicamente digerido. As ligações foram usadas para transformar E. coli DH10B usando procedimentos Standard e os transformantes foram analisados. Os plasmideos pSGsetrapN/O, pSGsetrapJ, pSGsetrapM, pSGsetrapQ, pSGsetrapI, pSGsetrapK, e pSGsetrapL foram isolados e as construções foram analisadas usando digeridos de restrição e análise sequencial.

Clonagem de rapJ O gene rapJ foi amplificado por PCR usando os iniciadores BIOSG10 5'-GGGCATATGAGCACCGAAGCTCAGCAAGAGAGCACGCCCACCGCACGCT-3' (SEQ ID NO:46) e BIOSG11 5'-GGGGTCTAGAGGTCACTCCGCTCCCCAGGTGACCCGGAGCTCGGC-3' (SEQ ID NO:47), que introduziram um sítio Ndel na extremidade 5' e um sítio Xbal na extremidade 3' de rapJ. O plasmídeo pRl9 (Schwecke et al., 1995) foi usado como molde. Após tratamento 119

ΕΡ 1 589 031 /PT com polinucleótido cinase de T4 usando técnicas Standard, o produto da PCR foi ligado com corte de pUC18 com Smal e usado para transformar E. coli DH10B. A sequência de ADN de rapJ no plasmideo isolado pUCrapJ foi verificada por análise sequencial. As diferenças na sequência de ADN quando comparada com a sequência publicada (acc. no. X86780) são apresentadas na Fig 29. As alterações resultantes em RapJ são apresentadas na Fig 30.

Clonagem de rapl O gene rapl foi amplificado por PCR usando os iniciadores BIOSG12 5'-GGGCATATGAGCGCGTCCGTGCAGACCATCAAGCTGCC-3' (SEQ ID NO:48) e BIOSG13 5'-GGGGTCTAGAGGTCAGGCGTCCCCGCGGCGGGCGACGACCT-3' (SEQ ID NO:49), que introduziram um sitio Ndel na extremidade 5' e um sitio Xbal na extremidade 3' de rapl. O plasmideo pAHL2 (gentilmente cedido por Huai-Lo Lee) é derivado de pUCl8 contendo o gene rapl e foi usado como molde. Após tratamento com polinucleótido cinase de T4 usando técnicas Standard, o produto da PCR foi ligado com corte de pUC18 com Smal e usado para transformar E. coli DH10B. A sequência de ADN de rapl no plasmideo isolado pUCrapI foi verificada por análise sequencial. As diferenças na sequência de ADN quando comparada com a sequência publicada (acc. no. X86780) são apresentadas na Fig 31. As alterações resultantes em Rapl são apresentadas na Fig 32.

Clonagem de rapQ O gene rapQ foi amplificado por PCR usando os iniciadores AHL21 5'-CATATGTTGGAATTGGGTACCCGCCTG-3' (SEQ ID NO:50) e AHL22 5'-TCTAGACGCTCACGCCTCCAGGGTG-3' (SEQ ID NO:51), que introduziram um sitio Ndel na extremidade 5' e um sitio Xbal na extremidade 3' de rapQ. O plasmideo pRl9 (Schwecke et ai., 1995) foi usado como molde. Após tratamento com polinucleótido cinase de T4 usando técnicas Standard o produto da PCR foi ligado com corte de pUCl8 com Smal e usado para transformar E. coli DH10B. A sequência de ADN de rapQ no plasmideo isolado pAHL42 foi verificada por análise sequencial. As diferenças na sequência de ADN quando comparada com a sequência publicada (acc. no. X86780) são apresentadas na Fig 33. As alterações resultantes em RapQ são apresentadas na Fig 34. 120

ΕΡ 1 589 031 /PT

Isolamento de pUC18eryBVcas O gene eryBV foi amplificado por PCR usando os iniciadores cas01eG21 (W001/79520) e 7966 5'- GGGGAATTCAGATCTGGTCTAGAGGTCAGCCGGCGTGGCGGCGCGTGAGTTCCTCCAGTCGC GGGACGATCT -3' (SEQ ID NO:52) e pSG142 (Gaisser et al., 2000) como molde. O fragmento PCR foi clonado usando procedimentos Standard e o plasmideo pUCl8eryBVcas foi isolado com um sitio Ndel sobrepondo-se ao códão de partida de eryBV e um sitio Xbal e Bg/II a seguir ao códão de paragem. A construção foi analisada por análise seguencial.

Isolamento do vector pSGLitl

O gene eryBV foi amplificado por PCR usando os iniciadores BIOSG1 5'-GGGTCTAGATCCGGACGAACGCATCGATTAATTAAGGAGGACACATA-3' (SEQ ID NO:53) e 7966 5'-GGGGAATTCAGATCTGGTCTAGAGGTCAGCCGGCGTGGCGGCGCGTGAGT TCCTCCAGTCGCGGGACGATCT-3' (SEQ IDNO:52), gue introduziram um sitio Xbal sensivel a metilação Dam na extremidade 5' e um sitio Xbal e um sitio BglII na extremidade 3' de eryBV. O plasmideo pUCl8eryBVcas foi usado como molde. Após tratamento com polinucleótido cinase de T4 usando técnicas Standard, o produto da PCR foi ligado com corte de pUC18 com Smal e usado para transformar E. coli DH10B. A construção foi depois digerida usando Bamhl/BglII e foi isolada uma banda de ADN de cerca de 1,3 kb a partir de um gel de agarose seguida da ligação com ADN de vector Litmus 28 digerido com BamRI/BglII usando procedimentos Standard. O vector pSGLitl foi isolado e a sequência de ADN do inserto foi verificada por análise sequencial.

Isolamento de pSGsetrpaN/O, pSGsetrapJ, pSGsetrapM,

pSGsetrapQ, pSGsetrapI, pSGsetrapK, e pSGsetrapL

Os plasmideos pUCrapN/O, pUCrapJ, pUCrapM, pUCrapI, pUCrapL, puCrapK e pAHL42 foram digeridos com Ndel e xbal e os fragmentos do inserto variando em tamanho entre cerca de 1,3 kb a 0,7 kb foram isolados e ligados em pSGsetl identicamente digerido. As ligações foram usadas para transformar E. coli DH10B usando procedimentos Standard e os transformantes foram analisados. Os plasmideos pSGsetrapN/O, pSGsetrapJ, 121

ΕΡ 1 589 031 /PT pSGsetrapM, pSGsetrapQ, pSGsetrapI, pSGsetrapK, e pSGsetrapL foram isolados e as construções foram analisadas usando digeridos de restrição e análise sequencial.

Isolamento de pSGLitrapN/O, pSGLitrapJ, pSGLitrapM, pSGLitrapQ, pSGLitrapl, pSGLitrapK, pSGLitrapL e pSGUtrapLhis

Os plasmideos pSGsetrpaN/O, pSGsetrapJ, pSGsetrapM, pSGsetrapQ, pSGsetrapI, pSGsetrapK, pSGsetrapL, e pUC19rapLhiS foram digeridos usando enzimas de restrição Ndel/BglII e foram isoladas as bandas variando entre cerca de 0,7 a 1,3 kb, seguindo-se ligações com pSGLitl digerido com Ndel/BglII. As ligações foram usadas para transformar E. coli ET12567 e os transformantes foram analisados. Foram isolados os plasmideos pSGLitrapN/O, pSGLitrapJ, pSGLitrapM, pSGLitrapQ, pSGLitrapl, pSGLitrapK, pSGLitrapL e pSGLitrapLhis.

Isolamento dos plasmideos pSGsetrapKI, pSGsetrapKM, pSGsetrapKN/O, pSGsetrapKL, pSGsetrapKQ e pSGrapKJ

Os plasmideos pSGLitrapN/O, pSGLitrapJ, pSGLitrapM, pSGUtrapQ, pSGLitrapl, e pSGLitrapL foram digeridos usando Xbal e foram isolados fragmentos variando entre cerca de 0,8 e 1.3 kb seguindo-se ligações com pSGsetrapK digerido com Xbal e tratamento com fosfatase alcalina usando técnicas biológicas moleculares Standard. As ligações foram usadas para transformar E. coli DH10B e os transformantes foram analisados. Os plasmideos pSGsetrapKI, pSGsetrapKM, pSGsetrapKN/Ο, pSGsetrapKL, pSGsetrapKQ e pSGrapKJ foram isolados e a orientação do inserto foi verificada por análise do digerido de restrição. Para a adição de rapLhis estas construções foram, cada uma, digeridas com BglII/Xbal seguindo-se digestão parcial com BglII como apropriado e os fragmentos do vector isolado foram ligados com o fragmento Xbal/Bglll de ~lkb de pSGLitrapLhis.

Isolamento de plasmideos pSGsetrapKIJ, pSGsetrapKIM e pSGsetrapKIQ

Os plasmideos pSGLitrapJ, pSGLitrapM, e pSGLitrapQ foram digeridos usando Xbal e os fragmentos variando entre cerca de 0,8 e 1,3 foram isolados seguindo-se ligações com pSGsetrapKI 122

ΕΡ 1 589 031 /PT digerido com Xbal e tratamento com fosfatase alcalina usando técnicas biológicas moleculares Standard. As ligações foram usadas para transformar E. coli DH10B e os transformantes foram analisados. Os plasmideos pSGsetrapKij, pSGsetrapKiM, e pSGrapKIQ foram isoladas e a orientação do inserto foi verificada por análise do digerido de restrição. Para a adição de rapLhis estas construções foram, cada uma, digeridas com BglII/Xbal seguida de digestão parcial com BglII como apropriado e os fragmentos do vector isolado foram ligados com o fragmento Xbal/BglII de ~lkb de pSGLitrapLhls.

Isolamento dos plasmideos pSGsetrapKN/01, pSGsetrapKN/OQ, pSGsetrapKN/OM e pSGsetrapKN/OJ.

Os plasmideos pSGLitrapI, pSGLitrapM, pSGLitrapJ, e pSGLitrapQ foram digeridos usando Xbal e os fragmentos variando entre cerca de 0,8 e 1,3 foram isolados seguindo-se ligações com pSGsetrapKN/Ο digerido com Xbal e tratamento com fosfatase alcalina usando técnicas biológicas moleculares Standard. As ligações foram usadas para transformar E. coli DH10B e os transformantes foram analisados. Os plasmideos pSGsetrapKN/ΟΙ, pSGsetrapKN/OQ, pSGsetrapKN/OM e pSGrapKN/OJ foram isoladas e a orientação do inserto foi verificada por análise do digerido de restrição. Para a adição de rapLhiS estas construções foram, cada uma, digeridas com BglII/Xbal seguida de digestão parcial com BglII como apropriado e os fragmentos do vector isolado foram ligados com o fragmento Xbal/BglII de ~lkb de pSGLitrapLhls.

Isolamento dos plasmideos pSGsetrapKJM e pSGsetrapKJQ

Os plasmideos pSGLitrapM e pSGLitrapQ foram digeridos usando Xbal e os fragmentos variando entre cerca de 0,8 e 1,1 foram isolados seguindo-se ligação com pSGsetrapKJ digerido com Xbal e tratamento com fosfatase alcalina usando técnicas biológicas moleculares Standard. As ligações foram usadas para transformar E. coli DH10B e os transformantes foram analisados. Os plasmideos pSGsetrapKJM e pSGrapKJQ foram isolados e a orientação do inserto foi verificada por análise do digerido de restrição. Para a adição de rapLhis estas construções foram, cada uma, digeridas com BglII/Xbal seguida de digestão parcial com BglII como apropriado e os fragmentos 123 ΕΡ 1 589 031 /PT do vector isolado foram ligados com o fragmento Xbal/Bglll de ~lkb de pSGLitrapLhis.

Usando a mesma estratégia delineada acima, foram isoladas as seguintes casse

pSGsetrapKIJM

pSGsetrapKIJQ

pSGsetrapKlJN/O

pSGsetrapKIMN/O

pSGsetrapKlQN/O

pSGsetrapKN/OMQ de genes : pSGsetrapKN/OJI pSGsetrapKJMN/O pSGsetrapKJQN/O pSGsetrapKIJN/OM pSGsetrapKIJN/OQ pSGsetrapKIMN/OQ pSGsetrapKIQN/OM pSGsetrapKJMN/OQ pSGsetrapKIJN/OMQ pSGsetrapN/OQ pSGsetrapKIJMN/OQ

Na Figura 5 é apresentada uma sinopse.

Para a adição de rapLhis estas construções de cassete foram, cada uma, digeridas com BglII/Xbal ou com Xbal seguida de digestão parcial com BglII como apropriado e os fragmentos do vector isolado foram ligados com o fragmento Xbal/Bglll de cerca de 1 kb de pSGLitrapLhis.

Exemplo 6

Isolamento de 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-39-0-desmetil-rapamicina (pré-rapamicina, Figura 6) A 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-39-0-desmetil-rapamicina (pré-rapamicina) foi obtida conjugando a estirpe MG2-10 de S. hygroscopicus com pSGsetrapKL e isolando os produtos gerados como se descreve abaixo. Isto demonstrou que é possível complementar a deleção de rapK e rapL na estirpe MG2-10 e que é produzida pré-rapamicina, um análogo ao qual falta a modificação pós-PKS. A alimentação de ácido pipecólico não é necessária quando o rapL é complementado, confirmando que o rapL desempenha um papel no proporcionar de ácido pipecólico na produção de rapamicina. A S. hygroscopicus MG2-10[pSGsetrapKL] foi cultivada a partir de um lote de esporos de trabalho congelado em crioconservante(20% de glicerol, 10% de lactose p/v em água destilada) em meio 1 (ver Materiais e Métodos) e foram recolhidos esporos após 14 dias crescimento a 29°C. A pré-cultura primária foi inoculada com os esporos recolhidos e 124

ΕΡ 1 589 031 /PT cultivada em dois 250 ml balões de Erlenmeyer contendo 50 ml de Meio 3 (ver Materiais e Métodos), agitada a 250 rpm com uma amplitude de duas polegadas, a 30°C, durante dois dias. A pré-cultura primária foi usada para inocular duas pré-culturas secundárias de Meio 2 (ver Materiais e Métodos) e Meio 3, a 10% v/v, que foi agitada a 300 rpm com uma amplitude de uma polegada, a 25°C, por mais 24h. Foram preparados quatro litros de Meio 4 (ver Materiais e Métodos) e Meio 5 (ver Materiais e Métodos) contendo anti-espumante Pluronic L101 0,01% v/v (BASF) . O Meio de Produção 4 foi inoculado com a pré-cultura secundária em Meio 2 e o Meio de Produção 5 foi inoculado com uma pré-cultura secundária em Meio 3 a 10% v/v e deixado fermentar num biorreactor agitado de 7 L durante cinco a sete dias a 25°C. O arejamento foi fixado a 0,75 vvm e velocidade de ponta da turbina foi controlada entre 0,98 ms_1 e 2,67 ms-1. Foi adicionado Pluronic L101 adicional a pedido.

Para confirmar a estrutura de 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-39-O-desmetil-rapamicina (pré-rapamicina), foram extractados caldos de Meio 4 e Meio 5 com acetato de etilo e reduzidos a um extracto em bruto por evaporação. Os extractos foram desengordurados por partição com hexano:metanol:água e "flashed" através de um cartucho de sílica de 70 g iniciando com hexano e terminando com acetona. As fracções de pré-rapamicina de cada fermentação foram reunidas e "flashed" através de um cartucho C18 iniciando com água e terminando com metanol. A pré-rapamicina (8,5 mg) foi isolada após cromatografia em Sephadex LH2o usando heptano:clorofórmio:etanol como fase móvel. Este composto foi analisado e a estrutura totalmente confirmada por RMN (Figura 18-20) . Os dados de ΧΗ e 13C RMN são apresentados no Quadro V abaixo.

Quadro V: dados de ΧΗ e 13C RMN para pré-rapamicina Posição δΗ multiplicidade acomplamento õc 1 171, 8 2 5, 49 52, 7 3a 1, 76 25,9 3b 2,21 4a 1,21 20,9 4b 1, 75 125

ΕΡ 1 589 031 /PT

Posição δΗ multiplicidade acomplamento 5c 5a 1, 47 25, 0 5b 1, 74 6a 3,27 45, 1 6b 3, 87 d, lg 12, 8 8 171, 6 9a 2, 46 d 12, 8 41, 4 9b 3,23 d 12, 8 10 98, 9 11 1, 60 38, 1 12a 1,52 27, 6 12b 1,65 + 13a 1,38 31, 6 13b 1,53 14 4, 00 71, 5 15a 1, 48 40, 6 15b 1, 70 16 3, 95 d lg, 8,1 75, 5 17 139, 2 18 6,39 122, 6 19 6,33 128, 1 20 6,17 dd 14,3, 10,7 131, 4 21 6,04 130, 9 22 5,26 138, 1 23 2,21 37, 2 24a 1,26 39, 8 24b 1, 64 25 2,30 45, 8 26 215, 3 27a 2, 42 dd 15,1,4,7 44, 8 27b 2, 89 dd 15,1,5,8 28 4,32 dd 5,5, 4,9 71, 4 29 138, 6 30 5,26 123, 7 31 3,20 45, 5 32 208, 2 126

ΕΡ 1 589 031 /PT

Posição δΗ multiplicidade acomplamento 5c 33a 2,58 dd 18,1, 4,3 41,5 33b 2, 78 dd 18,1,9,6 34 5,18 76,0 35 1, 72 31, 9 36a 1, 00 37,3 36b 1, 07 37 1,30 33,1 38a Ax. CM CO O ddd 11,9, 11,9, 38,2 11,9 38b Eq. 1,83 39 3,24 74, 9 40 3,25 75, 9 41a 1,28 31, 5 41b 1,94 42a 0,98 32,2 42b 1, 61 43 0,98 d 6,6 16, 5 44 1,61 s 14,1 45 1,04 d 6,8 21,3 46 0,95 d 6,8 15,2 47 1,66 d 0,9 14,1 48 0,99 d 6,8 15, 7 49 0,89 d 6,6 17, 4 + Tentativa de atribuição

Exemplo 7

Isolamento de 8-desoxo-15-0-desmetil-26-desmetoxi-38-0-desmetil-prolilrapamicina (pré-prolilrapamicina, Figura 7) A alimentação de S. hygroscopicus MG2-10[pSEGrapK] com prolina ácido resultou em produção de pré-prolilrapamicina como se descreve abaixo. Isto demonstrou que na ausência de rapL são incorporados análogos de ácido pipecólico alternativos. 127

ΕΡ 1 589 031 /PT A S. hygroscopicus MG2-10[pSGsetrapK] foi feita crescer em TSBGM alimentado com lmg/1 prolina a 25°C com agitação. Os micélios foram extractados com metanol e o caldo de cultura foi extractado com acetato de etilo como se descreveu anteriormente. A análise do caldo de cultura do mutante MG2-10[pSGsetrapK] de S. hygroscopicus alimentado com prolina por HPLC com detecção UV a 280nm revelou a presença de dois picos principais com tempos de retenção de 4,5 e 4,6 minutos. A espectroscopia de massa por electropulverização destes picos revelou que ambos continham iões correspondendo a um composto com um PM de 827,5. Nenhum destes picos foi observado nas culturas de S. hygroscopicus NRRL 5491, S. hygroscopicus MG1C ou S. hygroscopicus MG2-10 sem o plasmideo de expressão de rapK pSGsetrapK. A análise de EM/EM do ião com m/z de 850 (correspondente ao aducto de sódio da pré-prolilrapamicina) revelou que se fragmentou num ião com m/z de 735 correspondendo à perda de m/z 115 (prolina), ou num ião com m/z de 542 correspondendo à perda de m/z 308 (C27-C41 de pré-prolilrapamicina) . Este ião fragmentou-se ele próprio ainda num ião com m/z 292, correspondendo à perda de m/z 250 (C13 a C26 de pré-prolilrapamicina) . Este padrão de fragmentação foi idêntico ao padrão observado para a rapamicina mas com a primeira perda de m/z (-115) reduzida em 14 correspondendo à alteração do aminoácido de ácido pipecólico para prolina, a segunda perda de m/z (-308) reduzida em 14, correspondendo à ausência do grupo O-metilo em C38, a terceira perda de m/z (-250) reduzida em 44, correspondendo à ausência do grupos metoxi em C26 e O-metilo em C15 e o ião final (306) possuindo uma massa reduzida em 14 correspondendo à ausência do grupo cetona em C8 e a alteração de ácido pipecólico para prolina. Isto constitui evidência de que composto com PM de 827,5 representa 8-desoxo-15-0-desmetil-26-desmetoxi-38-0-desmetil-prolilrapamicina (pré-prolilrapamicina).

Exemplo 8

Isolamento de 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-39-desmetoxi-rapamicina (39-des-hidroxi pré-rapamicina, Figura 8) A alimentação de S. hygroscopicus MG2-10[pSGsetrapK] com ácido pipecólico e ácido ciclo-hexanocarboxilico resultou na produção de dois compostos principais, pré-rapamicina que corresponde à incorporação da unidade de iniciação natural e 128 ΕΡ 1 589 031 /PT de 39-des-hidroxipré-rapamicina, que corresponde à incorporação da unidade de iniciação alimentada. A s. hygroscopicus MG2-10[pSGsetrapK] foi feita crescer em TSBGM alimentado com ácido pipecólico 2mg/l e ácido ciclo-hexanocarboxilico lmM a 25°C com agitação. O caldo de cultura foi extractado com acetato de etilo como se descreveu anteriormente. A análise do caldo de cultura do mutante MG2-10[pSGsetrapK] de S. hygroscopicus alimentado com ácido ciclo-hexanocarboxilico por HPLC com Detecção UV a 280nm revelou a presença de um novo pico principal com um tempo de retenção de 5,8 minutos. A espectroscopia de massa por electropulverização deste pico revelou que ele continha iões correspondendo a um composto com um PM de 825,5. Este pico não foi observado nas culturas de S. hygroscopicus NRRL5491, S. hygroscopicus MGlC ou S. hygroscopicus MG2-10 sem o plasmídeo de expressão de rapK pSGsetrapK. A análise EM/EM do ião com m/z de 848 (correspondente ao aducto de sódio da 39-des-hidroxi-pré-rapamicina) revelou que se fragmentou num ião com m/z de 719 correspondendo à perda de m/z 129 (ácido pipecólico), ou num ião com m/z de 556 correspondendo à perda de m/z 292 (C28-C42 de 39-des-hidroxi pré-rapamicina). Este ião fragmentou-se ele próprio ainda num ião com m/z 306, correspondendo à perda de m/z 250 (C14 a C27 de 39-des-hidroxi-pré-rapamicina) . Este padrão de fragmentação foi idêntico ao padrão observado para a pré-rapamicina mas com a segunda perda de m/z (-292) reduzida em 16, correspondendo à ausência do grupo hidroxi em C39. Isto constitui evidência de que composto com PM 825,5 representa 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-39-desmetoxi-rapamicina (39-des-hidroxi-pré-rapamicina) .

Exemplo 9

Isolamento de 16-0-desmetil-27-desmetoxi-rapamicina (Figura 9) A estirpe MG2-10 de S hygroscopicus foi conjugada com pSGsetrapKIJ como se descreve no Exemplo 1. A alimentação desta estirpe com ácido pipecólico e o isolamento dos produtos produzidos na fermentação resultou na produção de 16-0-desmetil-27-desmetoxi-rapamicina. 129

ΕΡ 1 589 031 /PT Ο plasmídeo pSGsetrapKlJ (Figura 5) foi conjugado em S. hygroscopicus MG2-10 e a estirpe feita crescer em TSB GM alimentado com 2mg/l de ácido pipecólico a 25°C com agitação. Os micélios foram extractados com metanol e o caldo de cultura extractado com acetato de etilo como se descreveu anteriormente. A análise dos extractos do mutante MG2-10[pSGsetrapKIJ] de S. hygroscopicus por espectroscopia de massa por electropulverização revelou um novo pico principal com um tempo de retenção de 4,3 minutos que continha iões correspondendo a um composto com um PM de 869. Este pico não foi observado nas culturas de S. hygroscopicus NRRL 5491, S. hygroscopicus MG1C S. hygroscopicus MG2-10 com ou sem o plasmídeo de expressão de rapK pSGsetrapK. A análise EM/EM do ião com m/z de 892 (correspondente ao aducto de sódio da 16-0-desmetil-27-desmetoxi-rapamicina) revelou que se fragmentou num ião com m/z de 763 correspondendo à perda de m/z 129 (ácido pipecólico), ou num ião com m/z de 570 correspondendo à perda de m/z 322 (C28-C42 de 16-O-desmetil-27-desmetoxi-rapamicina). Este ião fragmentou-se ele próprio ainda num ião com m/z 320, correspondendo à perda de m/z 250 (Cl 4 a C27 de 16-0-desmetil-27-desmetoxi-rapamicina). Este padrão de fragmentação foi idêntico ao padrão observado para a rapamicina mas com a terceira perda de m/z (-250) reduzida em 44, correspondendo à ausência dos grupos metilo em C16 e metoxi em C27. Isto constitui evidência de que composto com PM 869 era 16-0-desmetil-27-desmetoxi-rapamicina.

Exemplo 10

Arranjo de Alimentação O S. hygroscopicus MG2-10[pSGsetrapKI] foi usado para realizar um arranjo de alimentação. Foram preparadas culturas vegetativas primárias inoculando meio com lote de esporos como descrito em Materiais e Métodos. O meio TSB GM foi inoculado a 10% v/v usando métodos descritos na secção de Materiais e Métodos. Os compostos que se seguem foram adicionados como se indica no Quadro VI abaixo 130

ΕΡ 1 589 031 /PT

Quadro VI:

Ácido ciclo-hexano-carboxílico (lmM) Ácido ciclo-hex-l-eno-carboxílico (lmM) Ácido ciclo-heptano-carboxílico (lmM) L-lisina (25,3 mM) X X X 1-prolina (44,7 mM) X X X Acido DL-pipecolínico (39,8 mM) X X X trans-4-hidroxi-prolina (13mM) X X X cis-4-hidroxi-prolina (0,2mM) X X X

As culturas foram incubadas, extractadas e medidas usando técnicas descritas na secção Material e Método. O Quadro VII apresenta os resultados da análise mostrando o ião (m/z) observado para cada combinação de iniciador ácido carboxílico e aminoácido:

Quadro VII Ácido ciclo-hexano- carboxílico Ácido ciclo-hex-l-eno- carboxílico Ácido ciclo-heptano- carboxílico L-lisina 848,5 848, 5 862,4 L-prolina 834,5 834,5 848,5 Ácido DL-pipecolínico 848,5 848,5 862,4 trans-4-hidroxi- prolina 850,5 850,5 864,5 cis-4-hidroxi- prolina 850, 5 n.a. 864, 5

Estes dados demonstram incorporação dos compostos alimentados. Exemplo 11

Complementação de S. hygroscopicus MG2-10 com fkbO

Para avaliar se genes homólogos de rapK tais como fkbO em S.hygroscopicus var. ascomyceticus e S.tsukubaensis, e orf5 no 131

ΕΡ 1 589 031 /PT "cluster" 'hyg' parcialmente sequenciado (Ruan et al., 1997) desempenham funções similares, foram realizados ensaios de complementação usando fkbO como se descreve abaixo.

Isolamento de pMG169-l O gene fkbO de Strepomyces hygroscopicus var. ascomyceticus (ATCC 14891), um produtor de FK520, foi amplificado por PCR usando os iniciadores fkbof 5'- GGGCATATGACCGATGCCGGACGCCA 3' (SEQ ID NO:54) e fkbor 5' GGGGTCTAGATCACGCCACCATGCCTTCGA 3' (SEQ ID NO:55), introduzindo um sitio Ndel na extremidade 5' e um sitio Xbal na extremidade 3' de fkbO. Foi usado como molde ADN genómico isolado a partir de S.hygroscopicus var. ascomyceticus (ATCC 14891). O produto amplificado por PCR foi sujeito a digestão com Ndel e Xbal e ligado com corte Ndel-Xbal pSGsetl. A ligação foi usada para transformar E.coli DH108 e os transformantes foram analisados usando métodos descritos na secção de Materiais e Métodos. O plasmideo pMG169-l foi isolado e analisado por digestão de restrição e o S.hygroscopicus MG2-10 foi transformado usando métodos descritos na secção de Materiais e Métodos.

Complementação heteróloga de rapK por fkbO

Foi feito crescer S.hygroscopicus MG2-10[pMG169-l] em TSBGM alimentado com 2mg/l ácido pipecólico a 25°C com agitação. O caldo de cultura e micélios foram extractados usando métodos descritos na secção de Materiais e Métodos (Método A) . A análise do extracto com detecção UV a 280nm revelou a presença de dois picos principais com tempos de retenção de 4,5 e 4,6 minutos. A espectroscopia de massa por electropulverização destes picos revelou que ambos continham iões com um PM de 827,5 correspondendo a dois isómeros de pré-rapamicina (Exemplo 7).

Exemplo 12

Produção eficiente de 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-39-desmetoxi-rapamicina (39-des-hidroxi-pré-rapamicina, Figura 8) na ausência de competição por unidade de iniciação endógena por alimentação a um mutante knockout de rapK A capacidade de estirpes de S. hygroscopicus MG2-10 e MG2-10[pSGsetrapK] incorporarem uma diferente unidade de 132

ΕΡ 1 589 031 /PT iniciação, ácido ciclo-hexanocarboxílico, foi comparada como se descreve abaixo. Quando alimentados ácido ciclo- hexanocarboxílico e ácido pipecólico MG2-10 produziram apenas um composto (39-des-hidroxi-pré-rapamicina) correspondendo apenas à incorporação da unidade de iniciação alimentada, enquanto que MG2-10[pSGsetrapK] produziu dois compostos numa razão de 1:1, 39-des-hidroxi-pré-rapamicina e pré-rapamicina. Isto demonstrou que o rapK é necessário para a incorporação da unidade de iniciação endógena natural e que uma estirpe rapK knock-out não tinha competição da unidade de iniciação endógena com a unidade de iniciação alimentada. O S. hygroscopicus MG2-10 foi feito crescer em TSBGM alimentado com 2 mg/L de ácido pipecólico e ácido ciclo-hexanocarboxílico 1 mM a 25°C com agitação. O caldo de cultura foi extractado com acetato de etilo como se descreveu anteriormente. A análise dos extractos por HPLC com detecção UV a 280 nm revelou a presença de um novo pico principal com um tempo de retenção de 5,8 min. Contudo, S. hygroscopicus MG2-10[pSGsetrapK] (Exemplo 4), produziu pré-rapamicina (Figura 6) além da 39-des-hidroxi-pré-rapamicina numa razão de —1:1 quando alimentado com ácido ciclo-hexanocarboxílico (Exemplo 8, Figura 8). Surpreendentemente, a alimentação de ácido ciclo-hexanocarboxílico a S. hygroscopicus MG2-10 teve como resultado um só produto, 39-des-hidroxi-pré-rapamicina. O iniciador endógeno, ácido 4,5-di-hidroxiciclo-hex-l-enocarboxílico, não foi incorporado na ausência de rapK. Não houve portanto competição entre a incorporação do carboxílico ácido alimentado e o iniciador endógeno.

Exemplo 13

Elucidação da função de RapM

Foram feitas crescer em TSBGM culturas de Streptomyces lividans TK24, S. lividans TK24[pSGsetrapM] e S. lividans TK24[pSGsetrapQ] com agitação a 30°C e alimentadas com 20 pg/ml de pré-rapamicina. Não se alimentaram os controlos. Após mais 5 dias de incubação, as culturas foram extractados com acetato de etilo e levadas à secura. A reconstituição e análise por LC-EM não identificaram produção de análogos de rapamicina nos controlos não alimentados. Foram identificadas 133

ΕΡ 1 589 031 /PT dois picos principais no extracto de S. lividans TK24[pSGsetrapM] alimentado com pré-rapamicina, um a 2,5 min e um a 7,9 min. A espectroscopia de massa por electropulverização destes picos revelou que ambos continham iões correspondendo a um composto com um PM de 855,6, consistentes com 9-desoxo-16-0-metil-27-desmetoxi-39-0-desmetil-rapamicina (16-O-metil-pré-rapamicina). Foram comummente observados dois isómeros quando os extractos foram analisados por lc-em na ausência de tfa. Não foram identificados novos picos nos extractos de S. lividans TK24 ou de S. lividans TK24[pSGsetrapQ]. Pré-rapamicina não modificada foi claramente evidente. O RapM foi claramente responsável por metilação no hidroxilo em C16, o RapQ não foi específico para este sítio.

Exemplo 14

Elucidação da função de RapJ

Foram feitas crescer em TSBGM culturas de S. lividans TK24, S. lividans TK24[pSGsetrapK], S. lividans TK24[pSGsetrapJ] e S. lividans TK24[pSGsetrapKJ] com agitação a 30°C e alimentadas com 40 pg/ml de pré-rapamicina. Não se alimentaram os controlos. Após mais 5 dias de incubação, as culturas foram extractadas com acetato de etilo e levadas à secura. A reconstituição e análise por LC-EM não identificaram produção de análogos de rapamicina nos controlos não alimentados. Um novo pico principal a 4,9 min foi identificado nos extractos de S. lividans TK24[pSGsetrapKJ] e S. lividans TK24[pSGsetrapJ] alimentados com pré-rapamicina. A espectroscopia de massa por electropulverização deste pico revelou que ele continha iões correspondendo a um composto com um PM de 855,5, consistente com 16-0-desmetil-27-desmetoxi-39-O-desmetil-rapamicina (oxo-pré-rapamicina em C9) . Nos extractos de S. lividans TK24 e S. lividans TK24[pSGsetrapK] alimentados com pré-rapamicina, não foram identificadas novos picos. Pré-rapamicina não modificada foi claramente evidente.

Devido às homologia de RapJ com FkbD do "cluster"FK506 e FK520, Foi postulado que RapJ oxida pré-rapamicina em C9 em 9-hidroxi-16-0-desmetil-2 7-desmetoxi-39-0-desmetil-rapamicina (OH-pré-rapamicina em C9) . Foi postulado que RapK é 134

ΕΡ 1 589 031 /PT responsável por mais uma conversão na cetona. Surpreendentemente, na presença de RapJ, mas na ausência de RapK, formou-se 16-0-desmetil-27-desmetoxi-39-0-desmetil-rapamicina (ceto-pré-rapamicina em C9) . RapJ tem claramente uma função oxidante em C9, foi observada conversão completa na cetona. RapK não tem uma função oxidante em C9.

Exemplo 15

Os plasmídeos contendo as seguintes combinações de genes modificadores de rapamicina foram construídos como se descreve abaixo: pMG260 (rapl, rapJ, rapN, rapO, e rapL), pMG261 (rapl, rapJ, rapN, rapO, rapM e rapL), pMG262 (rapl, rapJ, rapN, rapO, rapM, rapQ e rapL) pMG236 (rapN, rapO, rapQ e rapL) e pMG238 (rapJ e rapL).

Isolamento dos plasmídeos pMG236 e pMG238

Os plasmídeos pSGsetrapNOQ e pSGsetrapJ foram digeridos usando BglII/Xbal e os fragmentos do vector isolado foram ligados com o fragmento Xbal/BglII de lkb de pSGLitrapLhiS· Foram isolados os plasmídeos pMG236 (expressando rapN, rapO, rapQ e rapL) e pMG238 (expressando rapJ e rapL), respectivamente.

Isolamento dos plasmídeos pMG260, pMG261 e pMG262

Os plasmídeos pSGSetrapKIJNOL, pSGSetrapKIJMNOL, e pSGSetrapKIJMNOQL foram digeridos usando BglII e os fragmentos de inserto isolados (contendo o "cluster" de genes de rapamicina do sítio BglII em rapl ao sítio BglII depois de rapL) foram ligados com o fragmento contendo o vector de pSGSetrapI digerido com BglII. Foram isolados os plasmídeos pMG260 (expressando rapl, rapJ, rapN, rapO, e rapL), pMG261 (expressando rapl, rapJ, rapN, rapO, rapM e rapL), e pMG262 (expressando rapl, rapJ, rapN, rapO, rapM, rapQ e rapL).

Exemplo 16

Um mutante (MG3) de S.hygroscopicus com a deleção cromossómica de rapK foi construído como se descreve abaixo. A complementação heteróloga de rapK com fkbO pode então ser 135

ΕΡ 1 589 031 /PT realizada como se descreveu e resultará na restauração da produção de rapamicina demonstrando que fkbO é capaz de complementar a função de rapK em S. hygroscopicus.

Isolamento do mutante MG3 de S. hygroscopicus com a deleção cromossómica de rapK

Os iniciadores RAPKF1 5'-CAAAGCTTCCTGGCGCGGTTCGGCCGGCA-3' (SEQ ID NO:56) e RAPKF2 5'-TGGCATGCCCTTCCCCGCCGTTCCCTGGC-3' (SEQ ID NO:57) foram usados para amplificar a região esquerda de homologia fora do gene rapK (de nt94403 a nt95429 no "cluster" de rapamicina como descrito em Schwecke et ai., 1995) usando ADN genómico preparado a partir de S. hygroscopicus NRRL5491 como molde. O produto de PCR de lkb foi fosforilado usando polinucleótido cinase de T4 e ligado em corte de pUC18 com Smal desfosforilado. Após transformação em E.coli DHlOB, o plasmídeo pMG233-7 foi isolado. Os iniciadores RAPKRl 5'-TGGCATGCCCCCGCCGAGCTGACCTGGAA-3' (SEQ ID NO:58) e RAPKR2 5'-GTTCTAGAGCTTACGCGTGATGTCGAACG-3' (SEQ ID NO:59) foram usados para amplificar a região direita de homologia fora do gene rapK (de nt96435 a nt97428 no "cluster" de rapamicina como descrito em Schwecke et ai., 1995) usando ADN genómico preparado a partir de S. hygroscopicus NRRL5491 como molde. 0 produto de PCR de lkb foi fosforilado usando polinucleótido cinase de T4 e ligado ao corte de Smal com pUC18 desfosforilado. Após transformação em E. coli DHlOB, o plasmídeo pMG257-7 foi isolado. Ambos os plasmideos foram analisados por análise sequencial. O plasmídeo pMG233-7 foi digerido com Sphl/Xbal e o fragmento de 3,7kb foi isolado, pMG257-7 foi digerido com Sphl/ Xbal e o fragmento de lkb isolado. Estes fragmentos foram ligados e usados para transformar E.coli DHlOB. O plasmídeo pMG268-12 foi isolado. Este plasmídeo foi digerido com HindIII/Xbal e o fragmento de 2kb isolado e ligado ao corte de pMG55 com HindIII/Xbal e o ADN foi usado para transformar E.coli DHlOB. O plasmídeo pMG278-l foi isolado e usado para conjugar S.hygroscopicus MGlC . E isolada uma colónia resistente a apramicina, e é feita crescer 24 horas em TSBGM com agitação a 30°C e espalhada em placas de ágar de meio 1 contendo 50ug/l de estreptomicina. As colónias resistentes a apramicina são isoladas e mostram ser 136

ΕΡ 1 589 031 /PT sensíveis a apramicina. A deleção cromossómica 1004nt de rapK pode ser verificada no mutante MG3 por transferência Southern. Na Figura 35 apresenta-se uma sinopse. S.hygroscopicus MG3 é feita crescer em TSBGM a 26°C com agitação. O caldo de cultura e micélios são extractados usando métodos como descrito na Secção de Materiais e Métodos. A análise do extracto com detecção UV não revela a presença de picos com as características de rapamicina trieno.

Expressão de fkbO no mutante MG3 de S. hygroscopicus com a deleção cromossómica de rapK O plasmídeo pMG169-l (descrito no exemplo 11) é transformado em mutante MG3 de S.hygroscopicus usando métodos como descrito na Secção de Materiais e Métodos.

Complementação heteróloga de rapK por fkbO S.hygroscopicus MG3pMG169-l é feito crescer em TSBGM a 26°C com agitação. 0 caldo de cultura e micélios são extractados usando métodos como os descritos na Secção de Materiais e Métodos. A análise do extracto com detecção UV a 280nm revela a presença de dois novos picos principais. A espectroscopia de massa por electropulverização destes picos revela que estes contêm iões com um PM de 913 correspondente a rapamicina.

Exemplo 17

Isolamento e complementação heteróloga do mutante MG4 S.hygroscopicus var ascomyceticus com a deleção cromossómica de fkbO

Isolamento do mutante MG4 de S.hygroscopicus var ascomyceticus com a deleção cromossómica de fkbO

Os iniciadores FK0F1 5'-GCTCTAGAGCCCGCGGCTCGCCGGACACG-3' (SEQ ID NO:60) e FKOF2 5'-CCCCTGCAGGCGTCCGGCATCGGTCATCAG-3' (SEQ ID NO:61) foram usados para amplificar a região esquerda de homologia (de nt45750 a nt46751 no "cluster" de ascomicina como descrito em Wu et al., 2000) usando ADN genómico 137

ΕΡ 1 589 031 /PT preparado a partir de S.hygroscopicus var ascomyceticus ATCC14891 como molde. O produto de PCR de lkb foi fosforilado usando polinucleótido cinase de T4 e ligado ao corte de pUCl8 com Smal desfosforilado. Após transformação em E. coli. DH10B, o plasmideo pMG258-4 foi isolado. Os iniciadores FKORl 5'-CGCCTGCAGGGATACGGTCCGCCGGGTCTGC-3' (SEQ ID NO:62) e FKOR2 5'-CCAAGCTTGTACGGTTCGCCACGGGCGTGC-3' (SEQ ID NO:63) foram usados para amplificar a região direita de homologia (de nt47785 a nt48781 no "cluster" de rapamicina como descrito em Wu et al., 2000) usando ADN genómico preparado a partir de S.hygroscopicus var ascomyceticus ATCC14891 como molde. O produto de PCR de lkb foi fosforilado usando polinucleótido cinase de T4 e ligado ao corte de pUC18 com Smal desfosforilado. Após transformação em E.coli DH10B, o plasmideo pMG259-5 foi isolado. Ambos os plasmideos foram analisados por análise sequencial. O plasmideo pMG258-4 foi digerido com Sbfl/HindIII e o fragmento de 3,7kb foi isolado, pMG259-5 foi digerido com Sbfl/HindIII e o fragmento de lkb isolado. Estes fragmentos foram ligados e usados para transformar E.coli DH10B. O plasmideo pMG265-l foi isolado. Este plasmideo foi digerido com HindIII/EcoRI e o fragmento de 2kb isolado e ligado ao corte de pMG55 com HindIII/EcoRI e o ADN foi usado para transformar E.coli DH10B. O plasmideo pMG267-l foi isolado e usado para conjugar S.hygroscopicus var ascomyceticus ATCC14891.

Uma colónia resistente a apramicina é isolada e é feita crescer 24 horas em TSBGM com agitação a 30°C e espalhada em placas de ágar de meio 1 contendo 50ug/l estreptomicina. As colónias resistentes a apramicina são isoladas e mostram ser sensiveis a apramicina. A deleção cromossómica 1034nt de fkbO pode ser verificada no mutante MG4 por transferência Southern. Na Figura 36 apresenta-se uma sinopse.

Expressão de RapK no mutante MG4 S.hygroscopicus var ascomyceticus com a deleção cromossómica de fkbO O plasmideo pSGsetRapK é transformado em mutante MG4 de S.hygroscopicus como se descreve na Secção de Materiais e Métodos. 138

ΕΡ 1 589 031 /PT

Complementação heteróloga de fkbO por rapK S.hygroscopicus var ascomyceticus MG4 pSGSetRapK é feita crescer em TSBGM a 26°C com agitação. O caldo de cultura e micélios são extractados usando métodos como se descreve na Secção de Materiais e Métodos. O extracto é analisado por LC-EM para revelar a presença de novo pico principal e para revelar que este contém iões que correspondem a FK520 (ascomicina).

Exemplo 18 É óbvio para os peritos na técnica que outros "clusters" biossintéticos que codificam ligandos de FKBP por exemplo, FK506, podem ser modificados de modo que o homólogo rapK seja delecionado ou inactivado usando os métodos como se descreve aqui. Em FK506, por exemplo; isto pode ser feito por amplificação de produtos de PCR contra as regiões de cada lado do gene fkbO (número de acesso de sequência AF082099, AF082100), ligando estas num vector tal como pMG55, transformando a estirpe produtora de FK506, seleccionando para o cruzamento duplo e confirmando a remoção do gene fkbO gene por transferência Southern.

Exemplo 19

Incorporação de unidades de iniciação não naturais pela estirpe de deleção rapK, S. hygroscopicus MG2-10, em análogos de rapamicina na ausência de competição por unidade de iniciação natural endógena.

Como se demonstrou nos Exemplos 10 e 12, a rapamicina PKS tem um elevado grau de flexibilidade para unidades de iniciação não naturais e na ausência de rapK, o sistema está isento de competição pelo iniciador natural. Neste exemplo, o grau de flexibilidade é ainda demonstrado. S. hygroscopicus MG2-10 foi feito crescer, alimentado e extractado de acordo com os métodos de alimentação, extracção e análise delineados em Materiais e Métodos (Método B). A gama de ácidos carboxilicos alimentados, conjuntamente com os compostos gerados são listados abaixo. Surpreendentemente, 139

ΕΡ 1 589 031 /PT todos os ácidos carboxílicos listados foram incorporados, como se determinou observando as caracteristicas cromóforas por UV a 278 nm e espectrometria de massa por electropulverização, e resultaram na produção de análogos de rapamicina.

Os análogos de rapamicina gerados correspondem à Fórmula abaixo como se descreve no Quadro VIII:

r16=oh

Ri7=H,OH,halo,tiol, alquilo Y=ligação,CH2

ABC

Xu*” Xrr*

D E F

Quadro VIII

Unidade de iniciação de ácido carboxílico alimentada. M-H [M+K] Composto gerado Ácido ciclo-hexanocarboxílico 824,7 864, 6 Ris = E, Ri6 = 4-OH, y = ligação, em combinação com Ri = OH, r2 = H, R5 = H, R6 = H, R7 = H, Rg = H, Rg = H, Rio= H, x = CH2 Ácido 3-cis, 4-trans-di-hidroxi-ciclo-hexanocarboxilico 840,5 880,4 Ris = C, Ri6 = 3-cis-OH, R17 = 4-trans-OH, em combinação com Rx = OH, R2 = H, R5 = H, R6 = H, R7 = H, R8 = H, Rg = H, Rio = H, x = CH2 140

ΕΡ 1 589 031 /PT

Unidade de iniciação de ácido carboxílico alimentada. M-H [M+K] Composto gerado Ácido 1-ciclo-hexenocarboxílico 824,4 864,3 Ris = E, Ri6 = 3-OH, y = ligação, em combinação com Ri = OH, R2 = H, R5 = H, Rê = H, R7 = H, Rg — H, Rg = H, Rio = Η, x = CH2 Ácido 3-ciclo-hexenocarboxílico Ácido carboxílico 840,5 880, 4 Rl5 = C, Rie = OH, R17 = OH, em combinação com Ri = OH, R2 = H, R5 = H, R6 = H, R7 = H, Rs = H, Rg = H, Rio = H, x = CH2 822,4 862,3 R15 = A, Ri6 = OH, R17 = H, em combinação com Rx = OH, R2 = H, R5 = H, R6 = H, R7 = H, R8 = H, Rg = H, Rio = H, x = CH2 Ácido ciclo-heptanocarboxílico 838,4 878,3 Ris = E, Ri6 = OH, y = CH2, em combinação com Rx = OH, R2 = H, R5 = H, R6 = H, R7 = H, Rs = H, Rg = H, Rio = H, x = CH2 Carboxilato de metil2-norbornano 836,2 876,2 R15 = B, R16 = OH, R17 = H, em combinação com Ri = OH, R2 = H, R5 = H, R6 = H, R7 = H, R8 = H, Rg = H, Rio = H, x = CH2 Ácido 3-hidroxiciclo-hexano- carboxílico 824, 7 864,6 Ris = E, Ri6 = 3-OH, y = ligação, em combinação com Ri = OH, R2 = H, R5 = H, Rê = H, R7 = H, R8 = H, Rg = H, Rio = H, x = CH2 Ácido 4-hidroxiciclo-hexano- carboxílico 824,6 864,6 R15 = E, Ri6 = 4-OH, y = ligação, em combinação com Ri = OH, R2 = h, R5 = H, R6 = H, R7 = H, R8 = H, Rg = H, Rio = H, x = CH2 141

ΕΡ 1 589 031 /PT

Unidade de iniciação de ácido carboxílico alimentada. M-H [M+K] Composto gerado Ácido 3-metilciclo-hexano- carboxílico 838,4 878,3 Ris = F, Ri? = OH, em combinação com Rx = OH, R2 = H, R5 = H, R6 = H, R7 = H, R8 = H, R9 = H, R10 = H, x = CH2 Ácido 4-metilciclo-hexano- carboxílico 838,4 878,3 Ris = D, R17 = OH, em combinação com Rx = OH, R2 = H, R5 = H, R6 = H, R7 = H, R8 = H, R9 = H, Rio = H, x = CH2 Ácido 3-cís/trans)metoxiciclo-hexanocarboxilico 824,3 864,2 R15 = E, Ri6 = 3-OH, y = ligação, em combinação com Ri = OH, R2 = H, R5 = H, R6 = H, R7 = H, R8 = H, R9 = H, Rio = H, x = CH2 Ácido 4-(eis/trans)metoxiciclo-hexano-carboxilico 824,2 864,2 R15 = E, Ri8 = 4-OH, y = ligação, em combinação com Ri = OH, R2 = H, R5 = H, R6 = H, R7 = H, R8 = H, R9 = H, Rio = H, x= CH2 Etilcarboxilato de 4-ciclo-hexanona 824,3 864,2 Ris = E, Riê = 4-OH, y = ligação, em combinação com Ri = OH, R2 = h, R5 = H, R6 = H, R7 = H, R8 = H, R9 = H, Rio = H, x = CH2 Ácido 3-fluoro-4-hidroxi ciclo-hexanocarboxílico e ácido 4-fluoro-3-hidroxi-ciclo-hexanocarboxílico 843, 0 882,0 Ris = C, Ri6 = OH, Ri7 = F, em combinação com Rx = OH, R2 = H, R5 = H, R6 = H, R7 = H, R8 = H, R9 = H, Rio = H, x = CH2 Ácido 3-ciclo-hexanooxido- carboxilico 841,0 880,8 Ris = C, Ri6 = 3-cis-OH, Ri7 = 4-trans-OH, em combinação com Rx = OH, R2 = H, R5 = H, R6 = H, R7 = H, R8 = H, R9 = H, R10 = H, x = CH2 142

ΕΡ 1 589 031 /PT

Unidade de iniciação de ácido carboxílico alimentada. M-H [M+K] Composto gerado Ácido 3,4-cís-di-hidroxi-ciclo-hexanocarboxilico 841,2 881,1 Ris = C, Ri6 = 3-cís-OH, Ri7 = 4-cís-OH, em combinação com Rx = OH, R2 = H, R5 = H, R6 = H, R7 = H, Rg = H, Rg = H, R10 = H, x = CH2 841,2 881,1 Ris = C, Ri6 = 3-trans-OH, Ri7 = 4-trans-OH, em combinação com Rx = OH, R2 = H, R5 = H, R6 = H, R7 = H, Rg = H, Rg = H, Rxo = H, x = CH2 Ácido 3-cloro-4-hidroxi ciclo-hexanocarboxilico e ácido 4-cloro-3-hidroxi-ciclo-hexanocarboxílico (e o par de diastereómeros oposto) 858,8 898, 8 8-15 = C, RX6 = OH, RX7 = Cl, em combinação com Rx = OH, R2 = h, r5 = H, r6 = H, R7= H, Rg = H, Rg = H, RX0 = H, x = CH2 Ácido ciclo-hexilpropiónico 825,0 864, 9 RX5 = C, RX6 = 3-cís-OH, R17 = 4-trans-OH, em combinação com Rx = OH, R2 = H, R5 = H, R6 = H, R7 = H, Rg = H, Rg = H, Rxo= H, x = CH2 TBC

Exemplo 20

Incorporação de unidades de iniciação não naturais pela estirpe de deleção de rapK, S. hygroscopicus MG2-10 [pSGsetrapN/OQLhis], em análogos de rapamicina na ausência de competição por unidade de iniciação natural endógena.

Como se demonstrou nos Exemplos 10, 12 e 19, a rapamicina PKS tem um elevado grau de flexibilidade para unidades de iniciação não naturais e na ausência de rapK, o sistema está isento da competição do iniciador natural. Neste exemplo, o grau de flexibilidade é adicionalmente demonstrado. 143

ΕΡ 1 589 031 /PT S. hygroscopicus MG2-10 [pSGsetrapN/OQLhiS] foi feito crescer, alimentado e extractado de acordo com os métodos de alimentação, extracção e análise delineados em Materiais e Métodos (Método B). A gama de ácidos carboxílicos alimentados conjuntamente com os compostos gerados são listados abaixo. Surpreendentemente, todos os ácidos carboxílicos listados foram incorporados como foi determinado observando as caracteristicas cromóforas de UV a 278 nm e espectrometria de massa por electropulverização e resultaram na produção de análogos de rapamicina.

[0228] Os análogos de rapamicina gerados corresponderam à Fórmula abaixo como se descreve no Quadro IX:

r16=oh R17=H,OH,halo,tiol, alquilo Y=ligação,CH2

A B C

D E F 144

ΕΡ 1 589 031 /PT

Quadro IX

Unidade de iniciação de ácido carboxílico alimentada. M-H [M+K] Composto gerado Ácido ciclo-hexano- carboxílico 840, 4 880,4 Ris = E, R16 = 4-OH, y = ligação, em combinação com Ri = OH, R2 = OH, R5 = H, R6 = H, R7 = H, Rg = H, Rg = H, Rio = H, x = CH2 Ácido 3-eis,4-trans-di- hidroxiciclo-hexano- carboxilico 840, 4 880,4 Ris = C, Ri6 = 3-cis-OH, Riv = 4-trans-OH, em combinação com Ri = OH, R2 = H, R5 = H, R6 = H, R7 = H, R8 = H, R9 — H, Rio = H, x = CH2 856,4 896,4 R15 = C, Ri6 = 3-cis-OH, R17 = 4-trans-OH, em combinação com Ri = OH, R2 = OH, R5 = H, R6 = H, R7 = H, Rg = H, Rg = H, Rio = H, x = CH2 Ácido 1-ciclo-hexeno- carboxilico 824,4 864,4 R15 = E, Ri 6 = 3-OH, y = ligação, em combinação com Ri = OH, R2 = H, R5 = H, R6 = H, R7 = H, Rg = H, Rg = H, Rio = H, x = CH2 840, 4 880,4 Ris = E, Ri6 = 3-OH, y = ligação, em combinação com Ri = OH, R2 = OH, R5 = H, Rg = H, R7 = H, Rg = H, Rg = H, Rio = H, x = CH2 Ácido 3-ciclo-hexeno- carboxílico 840, 4 880,4 Ris = C, Ri6 = OH, R17 = OH, em combinação com Ri = OH, R2 = H, R5 = H, R6 = H, R7 = H, Rg = H, Rg = H, Rio = H, x = ch2 822,4 862, 4 Ris = A, Ri6 = OH, Ri7 = Η, em combinação com Ri = OH, R2 = H, R5 = H, Rg = H, R7 = H, Rg = H, Rg = H, Rio = Η, X = CH2

145 ΕΡ 1 589 031 /PT

Unidade de iniciação de ácido carboxílico alimentada.

M-H

[M+K]

Composto gerado 840, 4 880,4

Acido ciclo-heptano- carboxílico 854, 4 894,4

Ris = A, Rl6 = = OH, Rx7 = H, em combinação com Rx = OH, R2 = OH, Rs = H, Re — ÍE II ÍE Rs = H, R9 = H, R L0 = H, X = ch2 Rl5 = E, Rl6 = OH , Y = CH2, em combinação com Rx = OH, R2 = OH, R5 = H, R6 = H, R7 = H, Rg = H, Rg = H, Rio = H, x = CH2

Acido meti1-2-norbornano-carboxílico 852, 4 892,4

Ris - B, Ri6 - OH, R17 = H, em combinação com Ri = OH, R2 = OH, R5 = H, R6 = H, R7 = H, Rg = H, Rg = H, Rio H, X = CH2

Acido 3-hidroxiciclo-hexano- carboxilico 824, 4 864, 4

Ris = E, Ri6 = 3-OH, y = ligação, em combinação com Ri = OH, R2 = h, Rs = H, R6 = H, R7 = Rg = H, R9 = H, Rio = H, x = CH2

Acido 4-hidroxiciclo-hexano- carboxílico 840, 4 880,4 824, 4 864,4 R15 - E, Ri 6 = 4-OH, y = ligação, em combinação com Ri = = OH, R2 = H, Rs = H, Re = H, r7 = H, Rs = H, r9 = H, Rio = H, x = ch2 Ris = E , R L6 = 4-OH, y = ligação, em combinação com Ri = OH, r2 = OH t Rs H, R6 = H , R7 = H, Rs = H, R9 = H, Rio = H, x = ch2

Acido 4-metilciclo-hexano- carboxílico 838, 4 878,4

Ris = D, r17 = OH, em combinação com Rx = OH, R2 = H, Rs = H, R6 = H, R7 = H, Rg = H, Rg = H, R10 = Η, X = CH2 854, 4 894,4 rX5 = D, R17 = OH, em combinação com Rx = OH, R2 = OH, Rs = H, R6 = H, R7 = H, Rg = H, Rg = H, Rio = H, X = CH2 146

ΕΡ 1 589 031 /PT

Exemplo 20

Incorporação de unidades de iniciação não naturais pela estirpe de deleção de rapK, S. hygroscopicus MG3, em análogos de rapamicina na ausência de unidade de competição de iniciação endógena natural.

Como se demonstrou nos Exemplos 10,12 e 19, a rapamicina PKS tem um elevado grau de flexibilidade para unidades de iniciação não naturais e, na ausência de rapK, o sistema está isento da competição do iniciador natural. Neste exemplo, o grau de flexibilidade é adicionalmente demonstrado. S. hygroscopicus MG3 feito crescer, alimentado e extractado de acordo com os métodos de alimentação, extracção e análise delineados em Materiais e Métodos (Método B). A gama de ácidos carboxilicos alimentados que podem ser alimentados é listada abaixo. A incorporação dos ácidos carboxilicos listados e a produção de análogos de rapamicina é determinada observando as caracteristicas cromóforas de UV a 278 nm e a espectrometria de massa por electropulverização.

As unidades de iniciação de ácido carboxílico que podem ser alimentadas incluem ácido ciclo-hexanocarboxílico, 3-cis, ácido 4-trans-di-hidroxiciclo-hexanocarboxílico, ácido 1-ciclo-hexenocarboxílico, ácido 3-ciclo-hexenocarboxílico, ácido ciclo-heptanocarboxílico, carboxilato de metil-2-norbornano, ácido 3-hidroxiciclo-hexanocarboxílico, ácido 4-hidroxiciclo-hexanocarboxílico, ácido 3-metilciclo-hexanocarboxílico, ácido 4-metilciclo-hexanocarboxílico, ácido 3- (cis/trans)metoxiciclo-hexanocarboxilico, ácido 4-(cis/trans)metoxiciclo-hexanocarboxílico, carboxilato de etil- 4- ciclo-hexanona, ácido 3-fluoro-4-hidroxicarboxilico e ácido 4-fluoro-3-hidroxicarboxílico, ácido 3-ciclo-hexanooxido-carboxilico, ácido 3,4-cis-di-hidroxiciclo-hexanocarboxilico, ácido 3-cloro-4-hidroxicarboxílico e ácido 4-cloro-3-hidroxicarboxílico (e o par de diastereómeros oposto), ácido ciclo-hexilpropiónico e ácido 4-terc-butilciclo-hexanocarboxílico 147

ΕΡ 1 589 031 /PT

Exemplo 21 incorporação de unidades de iniciação não naturais pela estirpe de deleção de fkbO, S. hygroscopicus var. ascomyceticus MG4, em análogos de FK520 na ausência de competição por unidade de iniciação endógena natural.

Como se demonstrou nos Exemplos 10, 12, 19 e 20, a rapamicina pks tem um elevado grau de flexibilidade para unidades de iniciação não naturais. Na ausência de fkbO, o sistema FK520 está isento da competição do iniciador natural. Neste exemplo, o grau de flexibilidade do FK520 PKS é investigado, isento da competição do iniciador natural. S. hygroscopicus var. ascomyceticus MG4 é feito crescer, alimentado e extractado de acordo com os métodos de alimentação, extracção e análise delineados em Materiais e Métodos (Método B) . Exemplos da gama de ácidos carboxílicos que podem ser alimentados são apresentados no Quadro IV. A incorporação dos ácidos carboxílicos listados e a produção de FK520 análogos é determinada por espectrometria de massa por electropulverização.

Exemplo 22

Incorporação de ácidos iniciadores não naturais em análogos FK506 por um mutante de deleção fkbO de S. tsukubaensis na ausência de competição do iniciador natural.

Um mutante de deleção fkbO de S. tsukubaensis é feito crescer e alimentado de acordo com os métodos de alimentação delineados em Materiais e Métodos. É alimentado um subconjunto dos ácidos carboxílicos listados no Quadro IV em Materiais e Métodos. A análise é realizada como se descreve no Método (B) de Materiais e Métodos.

Exemplo 23

Isolamento de produto da fermentação de S. hygroscopicus MG2-10 [pSGsetrapKILh] 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-rapamicina foi obtida conjugando a estirpe MG2-10 de S. hygroscopicus com pSGsetrapKlLh e isolando os produtos de fermentação gerados 148

ΕΡ 1 589 031 /PT como se descreve abaixo. Isto demonstrou que é possível complementar a deleção de rapK, rapl e rapL na estirpe MG2-10 e que a 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-rapamicina é produzida, um análogo ao qual faltam as modificações pós-PKS. A alimentação de ácido pipecólico não é necessária quando a rapL é complementada, confirmando que a rapL desempenha um papel no proporcionar de ácido pipecólico na produção de rapamicina. S. hygroscopicus MG2-10 [pSGsetKILhls] foi fermentado (ver Materiais e Métodos), extractado e isolado usando o método (B) como delineado em Materiais e Métodos. O sistema solvente isocrático usado para HPLC preparativa foi CH3CN/H20 a 60%. A 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxirapamicina (Composto 6) tem as seguintes características:

Rendimento isolado: 22 mg Peso molecular: 856 Fórmula molecular: C49H77NO11 UV (por detecção de foto-díodos durante análise por HPLC): 268 nm, 278 nm, 288 nm EM por electropulverização: m/z para MNa+ = 878, m/z para M-H = 854 O Quadro X abaixo resume os dados de 1H e 13C RMN para 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-rapamicina em CDCI3.

Quadro Protão X 1 δΗ multiplicidade acomplamento Õc 1 169,0171,5 2 4,37 5,40 55,6 52,5 3a 1,51 1, 75a 26,5 26,3 3b 2,40 2,19 4a 20,9 4b 5a 1,30 1,48 25,1 5b 1,68 1,72 6a 4, 45 3,26 39,0 44,4 6b 2,16 3,83 8 171, 7172,4 9a 2, 41 2,54 38, 7 40,2 9b 2,67 2,89 149

ΕΡ 1 589 031 /PT

Protão δΗ multiplicidade acomplamento õc 10 10- OH 6,62 5,34 S,lg 98, 4 99,7 11 1,37 1,51 38, 7 38,7 12a 1,67 1,62 27, 3 27,6 12b 1, 48 1,48 13a 1,29 1,32 13b 14 4,21 3,87 71,3 69,6 15a 1, 47b 1,50 15b 1,66 1,65 16 4,21 4,06 dd 6,1, 6,1 76,0 75,6 17 141, 6 138,4 18 6,08 6,22 d d 11,2 11,2 122,5125,0 19 6,38 6,31 dd dd 14,0, 11,2 14,7, 128, 6 127,7 11,2 20 6,01 6,17 dd 14,5, 131,1132,2 10,5 21 6,04 6,04 130,3130,3 22 5,18 5,30 dd dd 14,1, 9,1 14,9, 139, 4 139,1 9,3 23 2,11 2,15 39,5 37,3 24a 1,34 1,35 40,3 40,3 24b 1,68 1,67 25 2, 43 2,44 45,5 46,3 26 215,2 216,1 27a 2,53 2,60 46, 7 47,9 27b 2, 65 2,43 28 4,33 4,39 dd 7,9, 3,2 71,7 71,9 29 139, 6 139,6 30 5,36 5,45 d 9, 9 123, 7 125,4 31 3,24 3,37 46,4 45,6 32 209, 0 209,1 33a 2, 63 2,63 39,4 39,4 33b 2, 95 2,95 34 5,13 5,38 76,0 74,2 150

ΕΡ 1 589 031 /PT

Protão δΗ multiplicidade acomplamento 5C 35 36a 36b 1,93 1,04 1,17 1,98b 1,03 1,16 32, 7 37,8 32, 7 39,8 37 1,34 1,38 33,2 33,2 38a ax. 0, 61 0,73 ddd ddd 11,9, 11,9, 33, 9 34,5 11,9, 11, 9 11,9, 11, 9 38b eq, 2,04 2,09 39 2,90 2,91 84,5 84,4 40 3,37 3,37 73,8 73, 8 41a 1,31 1,31 31,2 31,2 41b 1,97 1,97 42a 0,97 0,97 31, 7 31, 7 42b 43 0,93 0,93 d d 6,5 6,5 16,8C 16,9C 44 1, 78 1,63 s s 15,6 12, 7 45 0,98 1,00 21, 7 21, 7 46 1, 00 1,02 16, 7 19,1 47 1,58 1,48 s s 13,1 11, 7 48 1,07 1,00 d 6,9 16,2 14, 6 49 0, 89 0,89 d d 6,8 6,8 14,6d 15,2d 50 3,37 3,37 s s 56, 5 56,5 a: pode ser atribuída em vez deste a H4a b: atribuição tentada c: a atribuição pode ser interpermutada d: a atribuição pode ser interpermutada O composto 6 existe como uma mistura 1:1 de confórmeros em CDC13. Os dados acima são para ambos os confórmeros. Onde foi traçada uma linha tracejada ao longo do quadro não foi possível determinar a conexão entre sistemas de spin, e assim não é possível a atribuição de dados a um confórmero particular. 151

ΕΡ 1 589 031 /PT

Exemplo 24

Isolamento de produto da fermentação de S. hygroscopicus MG2-10 [pSGsetrapKIMLh ]

Foi obtida 9-desoxo-27-desmetoxi-rapamicina conjugando estirpe MG2-10 de S. hygroscopicus com pSGsetKlMLhis como se descreve no Exemplo 1 e isolando os produtos produzidos na fermentação. Isto demonstrou que era possível complementar a deleção de rapK, rapl, rapM e rapL na estirpe MG2-10 com a produção do análogo de rapamicina a que falta alguma modificação pós-PKS. S. hygroscopicus MG2-10 [pSGsetKlMLhiS] foi fermentado (ver Materiais e Métodos), extractado e isolado usando o método (B) como delineado em Materiais e Métodos. O sistema solvente isocrático usado para HPLC preparativa foi CH3CN/H20 a 75%. A 9-desoxo-27-desmetoxi-rapamicina (Composto 16) tem as seguintes características:

Rendimento isolado: 24 mg Peso molecular 870 Fórmula molecular: C50H79NO11 UV (por detecção de foto-díodos durante análise por HPLC): 268 nm, 278 nm, 288 nm EM por electropulverização: m/z para MNa+ = 892, m/z para M-H = 868 O Quadro XI abaixo resume os dados de 3Η e 13C RMN para 9-desoxo-27-desmetoxi-rapamicina em CDC13.

Quadro XI Posição δΗ multiplicidade acomplamento 5c 1 171,0 2 5,37 m 52,0 3a 1, 73 m 26,8 3b 2, 22 m 4a 1, 39 m 20,5 4b 1, 73 m 5a 1,56 m 25,1 5b 1, 77 m 152

ΕΡ 1 589 031 /PT

Posição δΗ multiplicidade acomplamento 5c 6a 3, 34 m 43,5 6b 3, 85 d, lg 12,9 8 173, 4 9a 2, 43 d 14, 4 38,8 9b 2, 74 d 14, 4 10 98, 0 10- OH 6,02 s 11 1, 43 m 39,1 12a 1, 44 m 27,5 12b 1, 58 m 13a 1, 28 m 32,2 13b 1, 45 m 14 3, 61 m 65,8 15a 1,55, m 38,6 15b 1, 64 m 16 3, 70 dd 10,8,4,7 84,5 17 134, 8 18 5, 98 d 9,2 130, 8 19 6,34 m 126,9 20 6,32 m 133,1 21 6,11 dd 15,3, 9,0 130, 6 22 5, 46 dd 15,2,8,6 139,3 23 2, 22 m 35,7 24a 1, 28 m 40,2 24b 1, 49 m 25 2, 58 m 44,8 26 215, 0 27a 2, 65 m 46,2 27b 2, 65 m 28 4, 37 m 73,1 29 139, 8 30 5, 32 d 9, 9 124,5 153

ΕΡ 1 589 031 /PT

Posição δΗ multiplicidade acomplamento 5c 31 3, 38 m 46,3 32 208,9 33a 2, 59 m 41,4 33b 2, 59 m 34 5, 04 ddd 5,2, 5,2, 5,2 75,7 35 1, 97 m 33,4 36a 1, 11 m 38,6 36b 1, 26 m 37 1,41 I m 33,1 38a ax. 0, 69 ddd 12,3, 12,3, 12,3 34,1 38b eq. 2, 11 m 39 2, 93 m 84,4 40 3, 37 m 73,9 41a 1,32 m 31,2 41b 1, 97 m 42a 1, 00 m 31,6 42b 1, 68 m 43 0, 88 d 6,4 16,9 44 3,10 s 55,6 45 1, 59 s 9,9 4 6 1, 02 d 7,2 20,5 47 1, 03 d 7,1 15,7 48 1,67 s 12,2 49 1, 12 d 6,8 16,3 50 0, 92 d 6,8 15,8 51 3, 39 s 56,5

Exemplo 25

Isolamento de produto da fermentação de S. hygroscopicus MG2-10[pSGsetKIN/OLh]

Foi obtida 9-desoxo-16-0-desmetil-27-0-desmetil- rapamicina conjugando a estirpe MG2-10 de S. hygroscopicus com 154

ΕΡ 1 589 031 /PT pSGsetKlN/OLhis como se descreve no Exemplo 1 e isolando os produtos produzidos na fermentação. Isto demonstrou que era possível complementar a deleção de rapK, rapl, rapN/O e rapL na estirpe MG2-10 com a produção do análogo de rapamicina a que falta alguma modificação pós-PKS. S. hygroscopicus MG2-10 [pSGsetKIN/OLhiS] foi fermentado (ver Materiais e Métodos), extractado e isolado usando o método (B) como delineado em Materiais e Métodos. O sistema solvente isocrático usado para HPLC preparativa foi CH3CN/H20 a 60%. A 9-desoxo-16-0-desmetil-27-0-desmetilrapamicina (Composto 9) tem as seguintes características:

Rendimento isolado: 77 mg Peso molecular: 872 Fórmula molecular: C49H77NO12 UV (por detecção de foto-diodos durante análise por HPLC): 268 nm, 278 nm, 288 nm EM por electropulverização: m/z para MNa+ = 894, m/z para m-h = 870 O Quadro XII abaixo resume os dados de 1R e 13C RMN para 9-desoxo-16-0-desmetil-27-0-desmetil-rapamicina em CDC13.

Quadro XII Posição δΗ multiplicidade acomplamento 5C 1 172,1 2 5, 55 m 52,8 3 cL 1, 74 m 26,0 3b 2, 21 m 4a co \—1 I-1 m 21,1 4b 1, 73 m 5a 1, 44 m 25,2 5b 1, 73 m 6a 3,28 m 45,7 6b 3, 87 m 8 171,6 9a 2, 41 d 12,5 42,3 9b 3, 34 d 12,5 155

ΕΡ 1 589 031 /PT

Posição δΗ multiplicidade acomplamento 5c 10 99,2 10- OH 4, 15 m 11 1, 61 m 38,3 12a 1, 50 m 27, 9 12b 1, 61 m 13a 1, 36 m 31,5 13b 1, 52 m 14 3, 99 m 72,5 15a 1, 45 m 40,9 15b 1, 70 m 16 3, 86 m 75,3 17 140,0 18 6,44 d 11, 4 121,9 19 6,33 dd 14,4, 11,4 128,6 20 6,20 dd 14,8, 10,6 131,2 21 6,02 dd 14,9, 10,6 131,2 22 5, 25 m 137, 4 23 2, 26 m 35,3 24a 1, 21 m 41,1 24b 1, 21 m 25 2, 37 m 40,9 26 212,8 27 4, 55 d 2,3 74,9 28 4, 20 77,3 29 135,8 30 5, 25 m 124,9 31 3, 29 m 44,9 32 208,0 33a 2, 53 dd 18,2, 4,0 42, 2 33b 2, 81 dd 18,2, 10,6, 34 5, 28 ddd 4,0, 4,0 75, 8 35 1, 71 m 31,2 EP 1 589 031 Posição /PT δΗ 156 multiplicidade acomplamento 5C 36a 0, 92 m 36,9 36b 1, 04 m 37 1,23 m 32,6 38a ax. 0,28 ddd 11,9, 11,9, 34,2 11,9 38b eq. 1, 88 m 39 2, 85 84,8 40 3,29 m 74,1 41a 1,26 m 31,3 41b 1, 92 m 42a 0, 88 m 32,3 42b 1,57 m 43 0, 98 d 6,2 16,6 44 1,59 s 14,6 45 1, 01 d 6,4 21,4 46 0, 89 d 6,4 12,0 47 1, 90 s 15,7 48 0, 92 d 6,4 15,6 49 0, 84 d 6,8 17,6 50 3, 37 s 57,5 Exemplo 26

Isolamento de produto da fermentação de S. hygroscopicus MG2-10 [pSGsetKJLh]

Foi obtida 16-0-desmetil-27-desmetoxi-39-0-desmetil-rapamicina conjugando a estirpe MG2-10 de S. hygroscopicus com pSGsetKJlhis como se descreve no Exemplo 1 e isolando os produtos produzidos na fermentação. Isto demonstrou que era possivel complementar a deleção de rapK, rapJ e rapL na estirpe MG2-10 com a produção do análogo de rapamicina a que falta alguma modificação pós-PKS . S. hygroscopicus MG2-10 [pSGsetKJLhis] foi fermentado (ver Materiais e Métodos), extractado e isolado usando o método 157

ΕΡ 1 589 031 /PT (Β) como delineado em Materiais e Métodos. O sistema solvente isocrático usado para HPLC preparativa foi CH3CN/H2O a 55%. A 16-O-desmetil-27-desmetoxi-39-O-desmetil-rapamicina (Composto 3) tem as seguintes caracteristicas:

Rendimento isolado: 176 mg (mistura de 2 isómeros interconvertiveis)

Peso molecular: 856 Fórmula molecular: C48H73NO12 UV (por detecção de foto-diodos durante análise por HPLC): 268 nm, 278 nm, 288 nm EM por electropulverização: m/z para MNa+ = 878, m/z para M-H = 854

Fragmentação por EM: O aducto sodiado (m/z 878) foi fragmentado para proporcionar três fragmentos: C8-C42, m/z MNa+ 749; C1-C27, m/z MNa+ 570; C28-C42+C1-C14, m/z MNa+ 628. Os iões 628 e 570 do fragmento foram ainda fragmentados para dar o mesmo fragmento: C1-C14, m/z MNa+ 320. A massa deste fragmento C1-C14 é 14 unidades de massa superior ao fragmento equivalente da fragmentação do aducto sodiado de 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-39-0-desmetil rapamicina (Composto 1) consistente com oxidação em C9.

Exemplo 27

Isolamento de produto da fermentação de S. hygroscoplcus MG2-10[pSGsetKMNOLh]

Foi obtida 9-desoxo-27-0-desmetil-39-0-desmetil- rapamicina conjugando a estirpe MG2-10 de S. hygroscopicus com pSGsetKMN/OLhis como se descreve no Exemplo 1 e isolando os produtos produzidos na fermentação. Isto demonstrou que era possível complementar a deleção de rapK, rapM, rapN/O e rapL na estirpe MG2-10 com a produção do análogo de rapamicina a que falta alguma modificação pós-PKS. S. hygroscopicus MG2-10 [pSGsetKMN/OLhls] foi fermentado (ver Materiais e Métodos), extractado e isolado usando o método (B) como delineado em Materiais e Métodos. O sistema solvente isocrático usado para HPLC preparativa foi CH3CN/H2O a 60%. A 9-desoxo-27-0-desmetil-39-0-desmetil rapamicina (Composto 8) tem as seguintes caracteristicas: Rendimento isolado: 6 mg 158

ΕΡ 1 589 031 /PT

Peso molecular: 872 Fórmula molecular: C49H77NO12 UV (por detecção de foto-díodos durante análise por HPLC): 268 nm, 278 nm, 288 nm EM por electropulverização: m/z para MNa+ = 894, m/z para M-H = 870

Fragmentação por EM: O aducto sodiado (m/z 894) foi fragmentado para proporcionar três fragmentos: C8-C42, m/z MNa+ 765; C1-C27, m/z MNa+ 586; C2B-C42+C1-C14, m/z MNa+ 614. Os iões 614 e 586 do fragmento foram ainda fragmentados para dar o mesmo fragmento: C1-C14, m/z MNa+ 306. O C1-C14 é idêntico ao obtido da fragmentação do aducto sodiado de 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-39-0-desmetil-rapamicina; o composto é 9-desoxo. O fragmento C1-C27 é 30 unidades de massa superior ao fragmento equivalente de 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-39-0-desmetil-rapamicina, consistente com uma hidroxilação e uma metilação; RapM metila o grupo hidroxi em C-16 (ver Exemplo 22 para pSGsetKILhls conjuntamente com o pSGsetKlMLhis do Exemplo 23) e RapN em combinação com RapO hidroxila C27 de modo que os dados são consistentes com facto de o composto ser 9-desoxo-27-0-desmetil-39-0-desmetil-rapamicina (Composto 8).

Exemplo 28

Isolamento de produto da fermentação de S. hygroscopicus MG2-10 [pSGsetKIJLh]

Foi obtida 16-0-desmetil-27-desmetoxi-rapamicina conjugando a estirpe MG2-10 de S. hygroscopicus com pSGsetKI JLhis como se descreve no Exemplo 1 e isolando os produtos produzidos na fermentação. Isto demonstrou que era possível complementar a deleção de rapK, rapl, rapJ e rapL na estirpe MG2-10 com a produção do análogo de rapamicina a que falta alguma modificação pós-PKS . S. hygroscopicus MG2-10 [pSGsetKIJLhiS] foi fermentado (ver Materiais e Métodos), extractado e isolado usando o método (B) como delineado em Materiais e Métodos. O sistema solvente isocrático usado para HPLC preparativa foi CH3CN/H2O a 60%. A 16-0-desmetil-27-desmetoxi-rapamicina (Composto 12) tem as seguintes características: 159

ΕΡ 1 589 031 /PT

Rendimento isolado: 11 mg Peso molecular: 870 Fórmula molecular: C49H75NO12 UV (por detecção de foto-diodos durante Análise por HPLC): 268 nm, 278 nm, 288 nm EM por electropulverização: m/z para MNa+ = 892, m/z para M-H = 868

Exemplo 29

Isolamento de produto da fermentação de S. hygroscopicus MG2-10 [pSGsetKLhis]

Foi obtida 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-39-0-desmetil-rapamicina conjugando a estirpe MG2-10 de S. hygroscopicus com pSGsetKLhis como se descreve no Exemplo 1 e isolando os produtos produzidos na fermentação. Isto demonstrou que era possivel complementar a deleção de rapK e rapL na estirpe MG2-10 com a produção do análogo de rapamicina a que falta modificação pós-PKS (pré-rapamicina). S. hygroscopicus MG2-10 [pSGsetKLhis] foi fermentado, extractado e isolado usando os métodos delineados em Materiais e Métodos. O sistema solvente isocrático usado para HPLC preparativa foi CH3CN/H2O a 60%. A 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-39-0-desmetil rapamicina (Composto 1) tem as seguintes caracteristicas: Rendimento isolado: 24 mg Peso molecular 842 Fórmula molecular: C48H75NO11 UV (por detecção de foto-diodos durante análise por HPLC): 268 nm, 278 nm, 288 nm EM por electropulverização: m/z para MNa+ = 864, m/z para M-H = 840

Fragmentação por EM: O aducto sodiado (m/z 864,5) foi fragmentado para proporcionar quatro fragmentos: C8-C42, m/z MNa+ 735; C1-C27, m/z MNa+ 556; C28-C42+C1-C14, m/z MNa+ 614, C1-C14, m/z MNa+ 306. Os m/z esperados para estes fragmentos foram determinados por comparação com a fragmentação reportada 160

ΕΡ 1 589 031 /PT para a rapamicina (J. A Reather, Ph.D. Dissertation,

Universidade de Cambridge, 2000) . Estes fragmentos têm o mesmo m/z que o m/z previsto para a fragmentação de 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-39-0-desmetil-rapamicina.

Exemplo 30

Isolamento de produto da fermentação de S. hygroscopicus MG2-10 alimentado com ácido ciclo-hexanocarboxílico

Obtém-se 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-39- desmetoxi-rapamicina por alimentação de ácido ciclo- hexanocarboxilico a S. hygroscopicus MG2-10 e isolamento dos produtos produzidos na fermentação. A mutassíntese resultante demonstrou que era possível complementar quimicamente a deleção de rapK na estirpe MG2-10 na ausência de iniciador natural endógeno, com a produção resultante do análogo de rapamicina a que falta modificação pós-PKS. S. hygroscopicus MG2-10 foi fermentado (ver Materiais e Métodos), alimentado (ver Materiais e Métodos), extractado e isolado usando o método (B) como delineado nos Materiais e Métodos. O sistema solvente isocrático usado para HPLC preparativa foi CH3CN/H2O a 60%. A 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-39-desmetoxi- rapamicina (Composto 47) tem as seguintes características: Rendimento isolado: 12 mg Peso molecular: 826 Fórmula molecular: C48H75NO10 UV (por detecção de foto-diodos durante análise por HPLC): 268 nm, 278 nm, 288 nm EM por electropulverização: m/z para MNa+ = 848,5, m/z para ΜΗ = 825

Fragmentação por EM: O aducto sodiado (m/z 848,5) foi fragmentado para proporcionar quatro fragmentos: C8-C42, m/z MNa+ 719; C1-C27, m/z MNa+ 556; C28-C42+C1-C14, m/z MNa+ 598, C1-C14, m/z MNa+ 306. Estes dados ilustram que a diferença entre o Composto 47 e a 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-39-O-desmetil-rapamicina (Composto 1) está localizada na 161

ΕΡ 1 589 031 /PT região de C28-C42. Este fragmento é 16 unidades de massa inferior para o Composto 47 do que é para o Composto 1, consistente com o facto de o Composto 47 ser 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-39-desmetoxi-rapamicina.

Exemplo 31

Isolamento de produto da fermentação de S. hygroscopicus MG2-10 [pSGsetKNOLh ]

Obtém-se 9-desoxo-16-0-desmetil-27-0-desmetil-39-0- desmetil-rapamicina conjugando a estirpe MG2-10 de S. hygroscopicus com pSGsetKN/OLhis como se descreve no Exemplo 1 e isolando os produtos produzidos na fermentação. Isto demonstrou que é possível complementar a deleção de rapK, rapN/O e rapL na estirpe MG2-10 com a produção do análogo de rapamicina a que falta alguma modificação pós-PKS . S. hygroscopicus MG2-10 [pSGsetKN/OLhiS] é fermentado (ver Materiais e Métodos), extractado e isolado usando o método (B) como delineado em Materiais e Métodos. 0 sistema solvente isocrático usado para HPLC preparativa é CH3CN/H2O a 60%. A 9-desoxo-16-0-desmetil-27-0-desmetil-39-0-desmetil rapamicina (Composto 2) tem as seguintes características:

Peso molecular: 858 Fórmula molecular: C48H75NO12 UV (por detecção de foto-díodos durante análise por HPLC): 268 nm, 278 nm, 288 nm EM por electropulverização: m/z para MK+ = 896, m/z para M-H = 856

Exemplo 32

Identificação do produto da fermentação de S. hygroscopicus MG2-10[pSGsetKJNOLh]

Foi obtida 16-0-desmetil-27-0-desmetil-39-0-desmetil-rapamicina conjugando a estirpe MG2-10 de S. hygroscopicus com pSGsetKJN/OLhis como se descreve no Exemplo 1 e analisando os 162

ΕΡ 1 589 031 /PT produtos produzidos na fermentação. Isto demonstrou que era possível complementar a deleção de rapK, rapJ, rapN/O e rapL na estirpe MG2-10 com a produção do análogo de rapamicina a que falta alguma modificação pós-PKS. O caldo de fermentação (1 mL) foi tratado como descrito no Método (B) de extracção, isolamento e análise em Materiais e Métodos. O cromatograma de HPLC (280 nm) continha um pico que tinha o característico rapamicina trieno (268 nm, 278 nm, 288 nm) . Este pico não foi observado no cromatograma da amostra de controlo extractada de S. hygroscopicus MG2-10 na ausência da cassete. LC-EM(ver Materiais e Métodos, Método B) do pico do novo análogo de rapamicina deu m/z dos iões de 895 (MNa+) e 871 (M-H). Estes iões confirmam que o peso molecular dos novos análogos de rapamicina é 872, 30 unidades de massa superior ao da 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-39-0-desmetil-rapamicina (Composto 1), consistente com oxidação em C9 (rapJ) e hidroxilação em C27 (rapN/O). Estes dados são consistentes com o facto de o composto ser 16-0-desmetil-27-0-desmetil-39-O-desmetil rapamicina (Composto 7).

Exemplo 33 isolamento de produto da fermentação de S. hygroscopicus MG2-10[pSGsetKJNOLh]

Obtém-se 16-0-desmetil-27-0-desmetil-39-0-desmetil- rapamicina conjugando a estirpe MG2-10 de S. hygroscopicus com pSGsetKJN/OLhis como se descreve no Exemplo 1 e isolando os produtos produzidos na fermentação. Isto demonstrou que é possível complementar a deleção de rapK, rapJ, rapN/O e rapL na estirpe MG2-10 com a produção do análogo de rapamicina a que falta alguma modificação pós-PKS. S. hygroscopicus MG2-10 [pSGsetKJN/OLhis] é fermentado (ver Materiais e Métodos), extractado e isolado usando o método (B) como delineado em Materiais e Métodos. O sistema solvente isocrático usado para HPLC preparativa é CH3CN/H20 a 60%. 163

ΕΡ 1 589 031 /PT A 16-0-Desmetil-27-0-desmetil-39-0-desmetil-rapamicina (Composto 7) tem as seguintes características:

Peso molecular: 872 Fórmula molecular: C48H73NO13 UV (por detecção de foto-díodos durante análise por HPLC): 268 nm, 278 nm, 288 nm EM por electropulverização: m/z para MNa+ = 895, m/z para M-H = 871

Exemplo 34

Identificação do produto da fermentação de S. hygroscopicus MG2-10 [pSGsetKIJNOQLh]

Foi obtida 16-O-desmetil-rapamicina conjugando a estirpe MG2-10 S. hygroscopicus com pSGsetKIJN/OQLhis como se descreve no Exemplo 1 e analisando os produtos produzidos na fermentação. Isto demonstrou que era possível complementar a deleção de rapK, rapi, rapJ, rapN/O, rapQ e rapL na estirpe MG2-10 com a produção do análogo de rapamicina a que falta metilação em C16-OH. Acresce que, isto identifica claramente RapQ como a O-metiltransferase dependente de SAM responsável por metilação de C27-OH. S. hygroscopicus MG2-10 [pSGsetKIJN/OQLhis] foi fermentado (ver Materiais e Métodos), extractado e analisado usando o método (B) como delineado em Materiais e Métodos. O caldo de fermentação (1 mL) foi tratado como descrito em Materiais e Métodos. O cromatograma de HPLC (280 nm) continha um pico que tinha o característico rapamicina trieno (268 nm, 278 nm, 288 nm) . Este pico não foi observado no cromatograma da amostra de controlo extractada de S. hygroscopicus MG2-10 na ausência da cassete. LC-EM (ver Materiais e Métodos) do pico do novo análogo de rapamicina deu iões m/z 923 (MNa+) e 899 (M-H). Estes iões confirmam que o peso molecular do novo análogo de rapamicina é 900, 14 unidades de massa inferior ao da rapamicina. Tinha já sido estabelecido que o único gene pós-PKS não incluído na cassete, rapM, actua metilando C16-OH, pelo que o novo análogo de rapamicina é 16-O-desmetil-rapamicina (Composto 20) e rapQ mostra ser funcional e actuar O-metilando em C27. 164

ΕΡ 1 589 031 /PT

Exemplo 35

Bioensaio de análogos de rapamicina : (1)= 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-39-0-desmetil-rapamicina (pré-rapamicina) (6)= 9-desoxo-16-0-desmetil-27-desmetoxi-rapamicina (16)= 9-desoxo-27-desmetoxi-rapamicina, (3)= 16-0-desmetil-27-desmetoxi-39-0-desmetil-rapamicina (9)= 9-desoxo-16-0desmetil-27-0-desmetil-rapamicina (8)= 9-desoxo-2 7-0-desmetil-39-0-desmetil-rapamicina.

Linhas de células de cancro: A inibição do crescimento de linhas de células de tumor humanas aderentes de malignidades sólidas HT29 (cólon) e MCF-7 (mama) foi testada in vitro usando um ensaio com MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio) usando placas de microtitulação (Sieuwerts, A.M., et al.r 1995). Todas as linhas de células foram obtidas da ATCC (American Type Culture Collection) ou da ECACC (European Collection of Cell Cultures) . Todas as linhas de células foram feitas crescer a partir de lotes congelados e passadas pelo menos uma vez antes da utilização em RPMI 1640. As células foram recolhidas de culturas sub-confluentes usando tripsinização minima. As células foram diluidas até à densidade apropriada para cada linha de células (dependendo do tempo de duplicação celular) em RPMI 1640, e semeadas em 60 poços da placa de 96 poços num volume de 100 μΐ por poço (i.e. os poços exteriores da placa não foram usados). As placas foram incubadas a 37°C durante a noite. Após esta incubação, foram adicionadas diluições de escala log de substâncias de referência e de teste a 900 μΐ por poço, foram usados 6 replicados para testar todos os compostos de teste, compostos de referência e meios de controlo. As placas foram incubadas durante mais 72 h antes da análise. MTT (5 mg/ml) foi adicionado a cada poço e as placas foram reincubadas durante 3-4 h. O MTT não reagido foi removido dos poços e os cristais de formazano formados a partir de MTT foram dissolvidos em DMSO e a absorvância caracteristica foi lida a 570 nm. A concentração (nM) de cada composto de teste e do composto de referência, que resultou numa inibição máxima de 50% (lC5o), foi calculada para cada 165 ΕΡ 1 589 031 /PT linha de células e referenciada juntamente com a percentagem máxima de inibição observada (lm), ver Quadro XIII. Para referência, a rapamicina tem uma IC50 de 200nM e uma Im de 40% na linha de células ht-29 e uma IC50 de 0,03nM e uma im de 56% na linha de células MCF-7.

Quadro XIII

Ensaio 1 IC50 Im 6 IC50 Im V0 _J 0 LO 0 H Im 3 IC50 Im 9 IC50 Im 00 LO O H Im HT29 50,1 38 25 38 15, 8 25 63,1 37 12,6 35 63 30 rICso MCF-7 3,2 38 126 48 2 32 20 38 17,8 40 20 38 rICso

Reacção Mista de Linfócito (MLR):

Desenvolvida originalmente para avaliar a compatibilidade de tecidos antes de alotransplantes, a MLR oferece um modelo estabelecido para a reacção imune ín vitro (SOULILLOU, J.P., et al. (1975); T. Meo. "Immunological Methods", L. Lefkovits e B. Pernis, Eds., Academic Press, N.Y. pp. 227-239 (1979). A MLR foi realizada misturando linfócitos esplénicos isolados a partir de ratinhos C57BU6 (5xl05 células) com linfócitos esplénicos inibidos de ratinhos CBA (2,5xl05 células). Os linfócitos inibidos de CBA induziram uma resposta proliferativa em linfócitos de C57BU6 e esta foi determinada por incorporação de [3H] timidina em ADN como medida da proliferação de linfócitos esplénicos isolados a partir de ratinhos C57BL/6. O efeito anti-proliferativo foi ensaiado relativamente à presença de diluições de escala log de compostos de referência, compostos de teste e meios de controlo durante um período de 72 h a 37 °C. A concentração de cada composto de teste e composto de referência, que inibiu a proliferação de linfócitos em 50% (IC50), quando comparada com o controlo de proliferação, foi calculada para cada linha de células e referenciada como uma razão da concentração de rapamicina necessária para inibir a proliferação de linfócitos em 50% (rICso), ver Quadro XIV. 166

ΕΡ 1 589 031 /PT

Quadro XIV

Ensaio 1 6 16 3 9 8 MLR rIC50 9,4 CO co >14, 7 7,9 6,5 4,1

Ensaio Antifúngica:

As actividades comparativas antifúngicas de compostos de referência e de teste foram determinadas contra fungos patogénicos Candida albicans DSM 5816, Candida albicans DSM 1386 e Candida glabrata DSM 11226. Isto foi conseguido usando uma adaptação para placa de microtitulação do "NCCLS Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing for Yeasts": Standard aprovado (M27-A, vol. 17 No. 9. (1997)). As estirpes de levedura foram inoculadas (104 cfu/ml) em meios RPMI 1640 contendo MOPS 0,165 mM, pH 7. O crescimento foi determinado na presença de diluições em escala log de compostos de referência, compostos de teste e meios de controlo após incubação com agitação a 37 °C, 24 h. A concentração inibitória mínima (MIC) e a actividade fungicida mínima (MFC) foram determinadas para compostos de teste e expressos como uma razão de uma concentração inibitória mínima de rapamicina (rMIC respectivamente), ver Quadro XV.

Quadro XV

Ensaio 1 6 16 3 9 8 C. albicans DSM 5816 1 1 1 1 1 1 rMIC C. albicans DSM 1386 5 5 5 1 1 1 rMIC C. glabrata DSM 11226 5 5 5 1 1 1

rMIC

Referências

Alarcon, C.M., Heitman, J., and Cardenas, M.E. (1999) Protein kinase activity and Identification of a toxic effector domain of the target of rapamycin TOR proteins in yeast. Molecular Biology of the Cell 10: 2531-2546. 167

ΕΡ 1 589 031 /PT

Aparicio, J.F., Molnár, I., Schwecke, T., Kõnig, A., Haydock, S.F., Khaw, L.E., Staunton, J., and Leadlay, P.F. (1996) Organization of the biosynthetic gene cluster for rapamycin in Streptomyces hygroscopicus: analysis of the enzymatic domains in the modular polyketide synthase. Gene 169: 9-16.

Baker, H., Sidorowicz, A., Sehgal, S.N., and Vézina, C. (1978) Rapamycin (AY-22,989), a new antifungal antibiotic. III. In vitro and in vivo evaluation. Journal of Antibiotics 31: 539-545.

Bierman, M., Logan, R., 0'Brien, K., Seno, E.T., Nagaraja Rao, R., and Schoner, B.E. (1992) Plasmid cloning vectors for the conjugal transfer of DNA from Escherichia coli to Streptomyces spp. Gene 116: 43-49.

Blanc, V., Lagneaux, D., Didier, P., Gil, P., Lacroix, P., and Crouzet, J. (1995) Cloning and analysis of structural genes from Streptomyces pristinaespiralis encoding enzymes involved in the conversion of pristinamycin IIB to pristinamycin IIA (PIIA): PIIA synthase and NADH:riboflavin 5'-phosphate oxidoreductase. Journal of Bacteriology 177: 5206-5214.

Blanc, V., Gil, P., Bamas-Jacques, N., Lorenzon, S., Zagorec, M., Schleuniger, j., Bisch, D., Blanche, F., Debussche, L., Crouzet, J., and Thibaut, D. (1997) Identification and analysis of genes from Streptomyces pristinaespiralis encoding enzymes involved in the biosynthesis of the 4-dimethylamino-L-phenylalanine precursor of pristinamycin I. Molecular Microbiology 23: 191-202.

Box, S.J., Shelley, P.R., Tyler, J.W., Verrall, M.S., Warr, S.R.C., Badger, A.M., Levy, M.A., and Banks, R.M. (1995) 27-O-Demethylrapamycin, an immunosuppressant compound produced by a new strain of Streptomyces hygroscopicus. Journal of Antibiotics 48:1347-1349.

Brown, E.J., Albers, M.W., Shin, T.B., Ichikawa, K., Keith, C.T., Lane, W.S., and Schreiber, S.L (1994) A mammalian protein targeted by Gl-arresting rapamycin-receptor complex. Nature 369: 756-758. 168

ΕΡ 1 589 031 /PT

Brunn, G.J., Williams, J., Sabers, C., Wiederrecht, G., Lawrence, J.C., and Abraham, R.T. (1996) Direct inhibition of the signaling functions of the mammalian target of rapamycin by the phosphoinositide 3-kinase inhibitors, wortmannin and LY294002. EMBO Journal 15: 5256-5267.

Cao, W., Mohacsi, P., Shorthouse, R., Pratt, R. and Morris, R.E. (1995). Effects of rapamycin on growth factor-stimulated vascular smooth muscle cell DNA synthesis. Inhibition of basic fibroblast growth factor and platelet-derived growth factor action and antagonism of rapamycin by FK506. Transplantation 59(3): 390-395.

Carlson, R.P., Hartman, DA., Tomchek, L.A., Walter, T.L., Lugay, J.R., Calhoun, W., Sehgal, S.N., Chang, J.Y. (1993). Rapamycin, a potential disease-modifying antiarthritic drug. J. Pharmacol. Exp. Ther. 266(2):1125-38.

Chambraud, B., Radanyi, C., Camonis, J.H., Shazand, K., Rajkowski, K., and Baulieu, E.E. (1996) FAP48, a new protein that forms specific complexes both immunophilins FKBP59 and FKBP12. Prevention by the immunosuppressant drugs FK506 and rapamycin. Journal of Biological Chemistry 271: 32923-32929.

Chang, J.Y., Sehgal, S.N., and Bansbach, C.C. (1991) FK506 and rapamycin: novel pharmacological probes of the immune response. Trends in Pharmacological Sciences 12: 218-223.

Chen, J., Zheng, X.F., Brown, E.J., and Schreiber, S.L (1995) Identification of an 11-kDa FKBPl2-rapamycin-binding domain within the 289-kDa FKBP12-rapamycin-associated protein and characterization of a criticai serine residue. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 92: 4947-4951.

Chini, M., Crotti, P., Gardelli, C., and Macchia, F., (1992), Tetrahedron, 48, 3805-3812

Choi, J.W., Chen, J., Schreiber, S.L., and Clardy, J. (1996) Structure of the FKBP12-rapamycin complex interacting with the binding domain of human FRAP. Science 273: 239-242.

Chung, L., Liu, L, Patel, S., Carney, J.R., and Reeves, C.D. (2001) Deletion of rapQNML from the rapamycin gene 169

ΕΡ 1 589 031 /PT cluster of Streptomyces hygroscopicus gives production of the 16-0-desmethyl-27-desmethox analog. Journal of Antibiotics 54: 250-256.

Corey, E. J. and Huang, H., (1989) Tetrahedron Lett., 30, 5235-5238

DiLella, A.G., and Craig, R.J. (1991) Exon organization of the human FKBP-12 gene: correlation with structural and functional protein domains. Biochemistry 30: 8512-8517.

Du, L.C., Sánchez, C., Chen, M., Edwards, D.J., and

Shen, B. (2000) The biosynthetic gene cluster for the antitumor drug bleomycin from Streptomyces verticillus ATCC15003 supporting functional interactions between nonribosomal peptide synthetases and a polyketide synthase. Chemistry & Biology 7: 623-642.

Dudkin, L., Dilling, M.B., Cheshire, P.J., Harwood, F.C., Hollingshead, M., Arbuck, S.G., Travis, R., Sausville, E.A., Houghton, P.J. (2001). Biochemical correlates of mTOR inhibition by the rapamycin ester CCI-779 and tumor growth inhibition. Clin. Câncer Res. 7(6):1758-64

Fehr, T., Sanglier, J-J., Schuler, W., Gschwind, L.,

Ponelle, M., Schilling, W., Wioland, C. (1996). Antascomicinc A, B, C, D and E: Novel FKBP12 binding compounds from a Micromonospora strain. J. Antibiot. 49(3): 230-233.

Ferrari, S., Pearson, R.B., Siegmann, M., Kozma, S.C., and Thomas, G. (1993) The immunosuppressant rapamycin induces inactivation of P70s6k through dephosphorylation of a novel set of sites. Journal of Biological Chemistry 268: 16091- 16094.

Findlay J.A, and Radies, L. (1980) Canadian Journal of Chemistry 58:579.

Fishbein, T.M., Florman, S., Gondolesi, G., Schiano, T., LeLeiko, N., Tschemia, A., Kaufman, S. (2002). Intestinal transplantation before and after the introduction of sirolimus. Transplantation. 73(10):1538-42.

Foey, A., Green, P., Foxwell, B., Feldmann, M., Brennan, F. (2002). Cytokine-stimulated T cells induce macrophage IL-10 170

ΕΡ 1 589 031 /PT production dependent on phosphatidylinositol 3-kinase and p70S6K: implications for rheumatoid arthritis. Arthritis Res. 4(1):64-70. Epub 2001 Oct 10.

Gaisser, S., Reather, J., Wirtz, G., Kellenberger, L., Staunton, J., and Leadlay, P.F. (2000) A defined system for hybrid macrolide biosynthesis in Saccharopolyspora erythraea. Molecular Microbiology 36: 391-401.

Gaisser, S., Lill, R., Staunton, J., Mendez, C., Salas, J., Leadlay, PF. (2002) Parallel pathways for oxidation of 14-membered polyketide macrolactones in Saccharopolyspora erythraea. Mol Microbiol 44:771-81.

Galat, A. (2000) Sequence diversification of the FK506-binding proteins in several different genomes. European

Journal of Biochemistry 267: 4945-4959.

Gregory, C.R., Huie, P., Billingham, M.E. and Morris, R. E. (1993). Rapamycin inhibits arterial intimai thickening caused by both alloimmune and mechanical injury. Its effect on cellular, growth factor and cytokine response in injured vessels. Transplantation 55(6):1409-1418.

Gregory ma, Till R, Smith, MCM. (in Press) Integration site for Streptomyces phage ΦΒΤ1 and the development of site-specific integrating vectors. J Bacteriol.

Guba, M., von Breitenbuch, P., Steinbauer, M., Koehl, G., Flegel, S., Hornung, M., Bruns, C.J., Zuelke, C., Farkas, S. , Anthuber, M., Jauch, K.W., and Geissler, E.K. (2002) Rapamycin inhibits primary and metastatic tumor growth by antiangiogenesis: involvement of vascular endothelial growth factor. Nature Medicine 8: 128-135.

Hamilton, G.S., and Steiner, J.P. (1998) Immunophilins: Beyond immunosuppression. Journal of Medicinal Chemistry 41: 5119-5143.

Hara, K., Yonezawa, K., Kozlowski, M.T., Sugimoto, T., Andrabi, K., Weng, Q.P., Kasuga, M., Nishimoto, I., and Avruch, J. (1997) Regulation of eIF-4E BPl phosphorylation by mTOR. Journal of Biological Chemistry 272: 26457-26463. 171

ΕΡ 1 589 031 /PT

Hardwick, J.S., Kuruvilla, F.G., Tong, J.K, Shamji, A.F., and Schreiber, S.L (1999) Rapamycin-modulated transcription defines the subset of nutrient-sensitive signaling pathways directly controlled by the Tor proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 96: 14866-14870.

Hatanaka, Η., Kino, T., Miyata, S., Inamura, N., Kuroda, A., Goto, T., Tanaka, H., Okuhara, M. (1988). FR-900520 and FR-900523, novel immunosuppressants isolated from a Streptomyces. II. Fermentation, isolation and physicochemical and biological characteristics.J. Antibiot. (Tokyo). 41(11):1592-601.

Hatanaka H, Kino T, Asano M, Goto T, Tanaka H, Okuhara M. (1989) . FK-506 related compounds produced by Streptomyces tsukubaensis No. 9993. J. Antibiot. (Tokyo). 42(4):620-2.

Hendrickson, B.A, Zhang, W., Craig, RJ., Jin, Y.J., Bierer, B.E., Burakoff, S., and DiLella, A.G. (1993) Structural organization of the genes encoding human and murine FK506-binding protein (FKBP)13 and comparison to FKBP1. Gene 134: 271-275.

Hentges, K.E., Sirry, B., Gingeras, A.C., Sarbassov, D., Sonenberg, N., Sabatini, D., and Peterson, A.S. (2001) FRAP/mTOR is required for proliferation and patterning during embryonic development in the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98: 13796-13801.

Hopwood, D. A. (1997) Genetic contributions to understanding polyketide synthases. Chemical Reviews 97: 2465-2497.

Hosted, T.J., and Baltz, R.H. (1997) Use of rpsL for dominance selection and gene replacement in Streptomyces roseosporus. Journal of Bacteriology 179: 180-186.

Hung, D.T.,-and Schreiber, S.L. (1992) cDNA cloning of a human 25 kDa FK506 and rapamycin binding protein. Biochemical and Biophysical Research Communications 184: 733-738. 172

ΕΡ 1 589 031 /PT

Hung, D.T., Jamison, T.F., and Schreiber, S.L. (1996) Understanding and controlling the cell cycle with natural Products. Chemistry & Biology 3: 623-639.

Jain, S., Bicknell, G.R., Whiting, P.H., Nicholson, M.L. (2001) . Rapamycin reduces expression of fibrosis-associated genes in an experimental model of renal ischaemia reperfusion injury. Transplant Proc. 33(1-2):556-8.

Jin, Y.J., Burakoff, S.J., and Bierer, B.E. (1992) Molecular cloning of a 25-kDa high affinity rapamycin binding protein, FKBP25. Journal of Biological Chemistry 267:10942-10945.

Kahan, B.D., Chang, J.Y., and Sehgal, S.N. (1991) Preclinical evaluation of a new potent immunosuppressive agent, rapamycin. Transplantation 52: 185-191.

Kahan, B.D., and Camardo, J.S. (2001) Rapamycin: Clinicai results and future opportunities. Transplantation 72:1181-1193.

Kallen, J. A., Sedrani, R., and Cottens S. (1996) X-ray crystal structure of 28-O-methylrapamycin complexed with FKBP12: is the cyclohexyl moiety part of the effector domain of rapamycin? Journal of the American Chemical Society 118: 5857-5861.

Kawasome, H., Papst, P., Webb, S., Keller, G.M., Johnson, G.L., Gelfand, E.W., and Terada, N. (1998) Targeted disruption of p70s6k defines its role in protein synthesis and rapamycin sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 95: 5033-5038.

Khaw, C.E., Bõhm, G.A., Metcalfe, S., Staunton, J., and Leadlay, P.F. (1998) Mutational biosynthesis of novel rapamycins by a strain of Streptomyces hygroscopicus NRRL 5491 disrupted in rapL, encoding a putative lysine cyclodeaminase. Journal of Bacteriology 180: 809-814.

Kieser, T., Bibb, M.J., Buttner, M.J., Chater, K.F., and Hopwood, D.A. (2000) Practical Streptomyces Genetics, John Innes Foundation, Norwich. 173

ΕΡ 1 589 031 /PT

Kirby, B., and Griffiths, C.E.M. (2001) Psoriasis: the future. British Journal of Dermatology 144:37-43.

Kirchner, G.I., Winkler, M., Mueller L., Vidal, C., Jacobsen, W., Franzke, A., Wagner, S., Blick, S., Manns M.P., and Sewing K.-F.(2000) Pharmacokinetics of SDZ RAD and cyclosporin including their metabolites in seven kidney graft patients after the first dose of SDZ RAD. British Journal of Clinicai Pharmacology 50:449-454. Kõnig, A., Schwecke, T., Moinar, I., Bõhm, G., Lowden, P.A.S., Staunton, J., and Leadlay, P.F. (1997) The pipecolate-incorporating enzyme for the biosynthesis of the immunosuppressant rapamycin. Nucleotide sequence analysis, disruption and heterologus expression of rapP from

Streptomyces hygroscopicus. European Journal of Biochemistry 247: 526-534.

Kunz, J., Loeschmann, A., Deuter-Reinhard, M., and Hall, M.N. (2000) FAPl, a homologue of human transcription factor NF-Xl, competes with rapamycin for binding to FKBP12 in yeast. Molecular Microbiology 37: 1480-1493.

Kuo, C.J., Chung, J.K., Fiorentino, D.F., Flanagan, W.M., Blenis, J., and Crabtree, G.R. (1992) Rapamycin selectively inhibits interleukin-2 activation of p70 S6 kinase. Nature 358: 70-73.

Lee, M.H. Pascopella, L, Jacobs, W.R., Jr and Hatfull, G.F (1991). Site specific integration of mycobacteriophage L5: integration-proficient vectors for Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium tuberculosis and Bacille Calmette-Guerin: Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 88:3111-3115.

Lee MH, Pascopella L, Jacobs WR Jr, Hatfull GF. (1991),

Site-specfic integration of mycobacteriophage L5: integration-proficient vectors for Mycobacterium smegmatis, Mycobacterium tuberculosis, and bacille Calmette-Guerin. Proc Natl Acad Sei USA.; 88:3111-5.

Liang, J., Choi, J., and Clardy, J. (1999) Refined structure of the FKBPl2-rapamycin-FRB ternary complex at 2.2 Á resolution. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography 55: 736-744. 174

ΕΡ 1 589 031 /PT

Lomovskaya, N., Fonstein, L., Ruan, X., Stassi, D.,

Katz, L., and Hutchinson, C.R. (1997) Gene disruption and replacement in the rapamycin-producing Streptomyces hygroscopicus strain ATCC 29253. Microbiology-Uk 143: 875-883.

Lowden, P.A.S., Bõhm, G., Staunton, J., and Leadlay, P.F. (1996) The nature of the starter unit for the rapamycin polyketide sythase. Angewandte Chemie 35: 2249-2251.

Lowden, P. A. S., (1997) Ph.D. Dissertation, University of Cambridge. "Studies on the biosynthesis of rapamycin".

Lowden, P.A.S., Wilkinson, B., Bõhm, G.A., Handa, S.,

Floss, H.G., Leadlay, P.F., and Staunton, J. (2001) Origin and true nature of the starter unit for the rapamycin polyketide synthase. Angewandte Chemie-International Edition 40: 777-779.

Luengo, J.L, Yamashita, .D.S., Dunnington, D., Beck, A.K., Rozamus, L.W., Yen, H.K., Bossard, M.J., Levy, M.A.,

Hand, A., Newmantarr, T., Badger, A., Faucette, L, Johnson, R.K., Dalessio, K., Porter, T., Shu, A.Y.L, Heys, R., Choi, J.W., Kongsaeree, P., Clardy, J., and Holt, D.A. (1995)

Structure-Activity Studies of Rapamycin Analogs - Evidence That the C-7 Methoxy Group is Part of the Effector Domain and Positioned at the Fkbpl2-Frap Interface. Chemistry & Biology 2: 471-481.

Lyons, W.E., George, E.B., Dawson, T.M., Steiner, J.P., and Snyder, S.H. (1994) Immunosuppressant FK506 promotes neurite outgrowth in cultures of PC12 cells and sensory ganglia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 91:3191-3195.

MacNeil, D.J., Gewain, KM., Ruby, C.L, Dezeny, G.,

Gibbons, P.H., and MacNeil, T. (1992) Analysis of Streptomyces avermitilis genes required for avermectin biosynthesis utilizing a novel integration vector. Gene 111:61-68.

Marahiel, M.A., Stachelhaus, T., and Mootz, h.d. (1997) Modular peptide synthetases involved in nonribosomal peptide synthesis. Chemical Reviews 97: 2651-2673.

Matsuura, M., Noguchi, T., Yamaguchi, D., Aida, T.,

Asayama, M., Takahashi, H. and Shirai, M. (1996). The sre gene 175

ΕΡ 1 589 031 /PT (ORF469) encodes a site-specific recombinase responsible for integration of the R4 phage genome. J Bact. 178(11):3374-3376.

McAlpine, J. B,.Swanson S. J., Jackson, M., Whittem, D.N. (1991). Revised NMR assignments for rapamycin. Journal of Antibiotics 44: 688-690.

Meo, T. in "Immunological Methods", L Lefkovits and B. Pernis, Eds., Academic Press, N.Y. pp. 227-239 (1979).

Molnár, I., Aparicio, J.F., Haydock, S.F., Khaw, LE., Schwecke, T., Kõnig, A., Staunton, J., and Leadlay, P.F. (1996) Organisation of the biosynthetic gene cluster for rapamycin in Streptomyces hygroscopicus: analysis of genes flanking the polyketide synthase. Gene 169: 1-7.

Morice, M.C., Serruys, P.W., Sousa, J.E., Fajadet, J., Ban Hayashi, E., Perin, M., Colombo, A., Schuler, G., Barragan, P., Guagliumi, G., Moinar, F., Falotico, R. (2002). RAVEL Study Group. Randomized Study with the Sirolimus-Coated Bx Velocity Balloon-Expandable Stent in the Treatment of Patients with de Novo Native Coronary Artery Lesions. A randomized comparison of a sirolimus-eluting stent with a Standard stent for coronary revascularization. N. Eng.l J. Med. 346(23):1773-80.

Motamedi, H., Shafiee, A., Cai, S.J., Streicher, S.L, Arisen. B.H., and Miller, R.R. (1996) Characterization of methyltransferase and hydroxylase genes involved in the biosynthesis of the immunosuppressants FK506 and FK520. Journal of Bacteriology 178: 5243-5248.

Motamedi, H., Cai, S.J., Shafiee, A., and Elliston, K.O. (1997) Structural organization of a multifunctional polyketide synthase involved in the biosynthesis of the macrolide immunosuppressant FK506. European Journal of Biochemistry 244: 74-80.

Motamedi, H., and Shafiee, A. (1998) The biosynthetic gene cluster for the macrolactone ring of the immunosuppressant FK506. European Journal of Biochemistry 256: 528-534.

Myckatyn, T.M., Ellis, R.A., Grand, A.G., Sen, S.K., Lowe, J.B. 3rd, Hunter, D.A., Mackinnon, S.E. (2002). The 176

ΕΡ 1 589 031 /PT effects of rapamycin in murine peripheral nerve isografts and allografts. Plast. Reconstr. Surg. 109(7):2405-17.

Navé, B.T., Ouwens, D.M., Withers, D.J., Alessi, D.R., and Sheperd, P.R. (1999) Mammalian target of rapamycin is a direct target for protein kinase B: Identification of a convergence point for opposing effects of insulin and amino-acid deficiency on protein translation. Biochemical Journal 344:427-431.

Navia, M.A. (1996) Protein-drug complexes important for immunoregulation and organ transplantation. Current Opinion in Structural Biology 6: 838-847. NCCLS Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing for Yeasts: Approved Standard M27-A, vol. 17 No. 9. (1997).

Nishida, H., Sakakibara, T., Aoki, F., Saito, T., Ichikawa, K., Inagaki, T., Kojima, Y., Yamauchi, Y., Huang, L.H., Guadliana, M.A., Kaneko, T., and Kojima, N. (1995) Generation of novel rapamycin structures by microbial manipulations. Journal of Antibiotics 48: 657-666.

Nielsen, J.B., Hsu, M.J., Byme, K.M., and Kaplan, L. (1991) Biosynthesis of the immunosuppressant immunomycin: the enzymology of pipecolate incorporation. Biochemistry 30: 5789- 5796 .

Paget, M.S.B., Chamberlin, L, Atrih, A., Foster, S.J., and Buttner, M.J. (1999) Evidence that the extracytoplasmic function sigma factor oE is required for normal cell wall structure in Streptomyces coelicolor A3(2). Journal of Bacteriology. 181: 204-211)

Paiva, N.L., Demain, A.L., and Roberts, m.f. (1991) Incorporation of acetate, propionate, and methionine into rapamycin By Streptomyces hygroscopicus. Journal of Natural Products 54: 167-177.

Paiva, N.L, Demain, A.L, and Roberts, M.F. (1993) The immediate precursor of the nitrogen-containing ring of rapamycin is free pipecolic acid. Enzyme and Microbial Technology 15: 581-585. 177

ΕΡ 1 589 031 /PT

Patterson, C.E., Schaub, T., Coleman, E.J., and Davies E.C. (2000) Developmental regulation of FKBP65. An ER-localized extracellular matrix binding-protein. Molecular Biology of the Cell 11:3925-3935.

Pfeifer, B.A., Admiraal, S.J., Gramajo, H., Cane, D.E., and Khosla, C. (2001) Biosynthesis of complex polyketides in a metabolically engineered strain of E. coli. Science 291: 1790-1792 .

Powell, N., Till, S., Bungre, J., Corrigan, C. (2001). The immunomodulatory drugs cyclosporin A, mycophenolate mofetil, and sirolimus (rapamycin) inhibit allergen-induced proliferation and IL-5 production by PBMCs from atopic asthmatic patients. J. Allergy Clin. Immunol. 108(6):915-7

Rabinovitch, A., Suarez-Pinzon, W.L., Shapiro, A.M., Rajotte, R.V., Power, R. (2002). Combination therapy with sirolimus and interleukin-2 prevents spontaneous and recurrent autoimmune diabetes in NOD mice.Diabetes . 51(3):638-45.

Raught, B., Gingras, A.C., and Sonenberg, N. (2001) The target of rapamycin (TOR) proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98: 7037-7044.

Rawlings, B.J. (2001) Type I polyketide biosynthesis in bactéria (Part A). Natural Product Reports 18: 190-227.

Reather, J. A., (2000), Ph.D. Dissertation, University of Cambridge. "Late steps in the biosynthesis of macrocyclic lactones".

Reitamo, S., Spuls, P., Sassolas, B., Lahfa, M., Claudy, A., Griffiths, C.E.; Sirolimus European Psoriasis Study Group. (2001) . Efficacy of sirolimus (rapamycin) administered concomitantly with a subtherapeutic dose of cyclosporin in the treatment of severe psoriasis: a randomized controlled trial. Br. J. Dermatol. 145(3):438-45.

Rosen, M.K., and Schreiber, S.L (1992) Natural products as probes of cellular function: studies of immunophilins. Angewandte Chemie-International Edition in English 31: 384- 400. 178

ΕΡ 1 589 031 /PT

Roymans, D., and Slegers, H. (2001) Phosphaditidylinositol 3-kinases in tumor progression. European Journal of Biochemistry 268:487-498.

Ruan, X.A., Stass, D., Lax, S.A., and Katz, L. (1997) A second type-I PKS gene cluster isolated from Streptomyces hygroscopicus ATCC 29253, a rapamycin-producing strain. Gene 203: 1-9.

Salituro, G.M., Zink, D.L., Dahl, A., Nielsen, J., Wu, E., Huang, L., Kastner C., Dumont, F. (1995) Meridamycin: a novel nonimmunosuppressive FKBP12 ligand from Streptomyces hygroscopicus. Tetrahydron letters 36: 997-1000.

Schwarzer, D., and Marahiel, M.A. (2001) Multimodular biocatalysts for natural product assembly. Naturwissenschaften 88: 93-101.

Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y.

Schreiber, S.L., and Crabtree, G.R. (1992) The mechanism of action of cyclosporine A and FK506. Immunology Today 13: 136-142.

Schwecke, T., Aparicio, J.F., Molnár, I., Kõnig, A., Khaw, L.E., Haydock, S.F., Oliynyk, M., Caffrey, P., Cortês, J., Lester, J.B., Bohm, G.A., Staunton, J., and Leadlay, P.F. (1995) The biosynthetic gene cluster for the polyketide immunosuppressant rapamycin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 92: 7839-7843.

Sedrani, R., Cottens, S., Kallen, J., and Schuler, W. (1998) Chemical modifications of rapamycin: the discovery of SDZ RAD. Transplantation Proceedings 30: 2192-2194.

Sehgal, S.N., Baker, H., and Vézina, C. (1975) Rapamycin (AY-22,989), a new antifungal antibiotic II. Fermentation, isolation and characterization. The Journal of Antibiotics 28: 727-733. 179

ΕΡ 1 589 031 /PT

Shepherd, P.R , Withers, D.J., and Siddle K. (1998) Phosphoinositide 3-kinase: the key switch mechanism in insulin signalling. Biochemical Journal 333: 471-490.

Shima, J., Hesketh, A., Okamoto, S., Kawamoto, S., and Ochi, K. (1996) Induction of actinorhodin production by rpsL (encoding ribosomal protein S12) mutations that confer streptomycin resistance in Streptomyces lividans and Streptomyces coelicolorA3(2). Journal of Bacteriology 178: 7276-7284.

Sigal, N.H., and Dumont, F.J. (1992) Cyclosporine A, FK-506, and rapamycin: pharmacological probes of lymphocyte signal transduction. Annual Review of Immunology 10: 519-560.

Sieuwerts, A.M., Klijn, J.G., Peters, H.A., Foekens, J.A. (1995). The MTT tetrazolium salt assay scrutinized: how to use this assay reliably to measure metabolic activity of cell cultures in vitro for the assessment of growth characteristics, IC50-values and cell survival. Eur. J Clin. Chem. Clin. Biochem. 33(11):813-23.

Smovkina, T., Mazodier, P., Boccard, F., Thompson, C.J. and Guerineau, M. (1990) Contstruction of a series of pSAM2-based integrative vectors for use in actinomycetes. Gene 94: 53-59. SOULILLOU, J.P., CARPENTER, C.B., LUNDIN, A.P. and STROM, T.B. (1975) Augmentation of proliferation and in vitro production of cytotoxic cells by 2-ME in the rat. J Immunol. 115(6):1566-71.

Staunton, J., and Weissman, K.J. (2001) Polyketide biosynthesis: a millennium review. Natural Product Reports 18: 380-416.

Steiner, J.P., Hamilton, G.S., Ross, D. T., Valentine, H.L., Guo, H., Connolly, MA., Liang, S., Ramsey, C., Li, J.-H.J., Huang, W., Howorth, P., Soni, R., Fuller, M., Sauer, H., Nowotnik, A.C., and Suzdak, P.D. (1997) Neutrophic immunophilin ligands stimulate structural and functional recovery in neurodegenerative animal models. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 94:2019-2024. 180

ΕΡ 1 589 031 /PT

Tang, S.J., Reis, G., Kang, H., Gingras, A.-C., Sonenberg, N., and Schuman, E.M. (2002) A rapamycin-sensitive signaling pathway contributes to long-term synaptic plasticity in the hippocampus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 1:467-472.

Van Duyne, G.D., Standaert, R.F., Karplus, P.A., Schreiber, S.L., and Clardy, J. (1993) Atomic structures of the human immunophilin FKBP-12 complexes with FK506 and rapamycin. Journal of Molecular Biology 229: 105-124.

Van Mellaert, L., Mei, L, Lammertyn, E., Schacht, S., and Anné, J. (1998) Site-specific integration of bacteriophage VWB genome into Streptomyces venezuelae and construction of a VWB-based integrative vector. Microbiology 144:3351-3358. Vézina, C., Kudelski, A., and Sehgal, S.N. (1975) Rapamycin (AY-22,989), a new antifungal antibiotic. I. Taxonomy of the producing streptomycete and isolation of the active principie. The Journal of Antibiotics 28: 721-726.

Vilella-Bach, M., Nuzzi, P., Fang, Y.M., and Chen, j. (1999) The FKBPl2-rapamycin-binding domain is required for FKBPl2-rapamycin-associated protein kinase activity.and G1 progression. Journal of Biological Chemistry 274: 4266-4272.

Waller, J.R., and Nicholson, M.L. (2001) Molecular mechanisms of renal allograft fibrosis. British Journal of Surgery 88:1429-1441.

Warner, L.M., Adams, L.M., Chang, J.Y., Sehgal, S.N. (1992) . A modification of the in vivo mixed lymphocyte reaction and rapamycin's effect in this model. Clin. Immunol. Immunopathol. 64(3):242-7.

Weber, T., and Marahiel, M.A. (2001) Exploring the domain structure of modular nonribosomal peptide synthetases. Structure 9: R3-R9

Welch, J. T. and Seper, K., W., (1988), J. Org. Chem., 53, 2991-2999

Wilkinson, B., Foster, G., Rudd, B.A.M., Taylor, N.L., Blackaby, A.P., Sidebottom, P.J., Cooper, D.J., Dawson, M.J., Buss, A.D., Gaisser, S., Bõhm, I.U., Rowe, C.J., Cortês, J., 181

ΕΡ 1 589 031 /PT

Leadlay, P.F. and Staunton, j. (2000). Novel octaketide macrolides related to 6-deoxoerythronolide B provide evidence for iterative operation of the erythromycin polyketide synthase. Chemistry & Biology 7: 111-117.

Wong, G.K., Griffith, S., Kojima, I., and Demain, A.L. (1998) Antifungal activities of rapamycin and its derivatives, prolylrapamycin, 32-desmethylrapamycin, and 32- desmethoxyrapamycin. Journal of Antibiotics 51: 487-491.

Wu, K., Chung, L., Revill, W.P., Katz, L, and Reeves, C.D. (2000) The FK520 gene cluster of Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus (ATCC 14891) contains genes for biosynthesis of unusual polyketide extender units. Gene 251: 81-90.

Yern, A.W., Tomasselli, A.G., Heinrikson, R.L., Zurcher-Neely, H., Ruff, V.A., Johnson, RA., and Deibel, M.R. (1992) The Hsp56 component of steroid receptor complexes binds to immobilized FK506 and shows homology to FKBP-12 and FKBP-13. Journal of Biological Chemistry 267: 2868-2871.

Yu, K., Toral-Barza, L., Discafani, C., Zhang, W.G., Skotnicki, J., Frost, P., Gibbons, J.J. (2001) mTOR, a novel target in breast câncer: the effect of CC1-779, an mTOR inhibitor, in preclinical models of breast câncer. Endocrine-Related Câncer 8:249-258.

Zhu, J., Wu J., Frizell, E., Liu, S.L., Bashey, R., Rubin, R., Norton, P., Zern, M.A. (1999). Rapamycin inhibits hepatic stellate cell proliferation in vitro and limits fibrogenesis in an in vivo model of liver fibrosis. Gastroenterology. 117(5) :1198-204. 182

ΕΡ 1 589 031 /PT

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Biotica Technology Ltd Matthew A Gregory,

Sabine Gaisser,

Hrvoje Petkovic,

Steven Moss, <120> Produção de Policetidos e Outros Produtos Naturais <130> BITBY/P3-0717.E.Pdivl <140> 05075774.9 < 141> 2005-04-04 <150> GB0216509.0 <151> 2002-07-16 <150> GB0224922.5 <151> 2002-10-25 < 160> 63 < 170> Patentln versão 3.1 < 210 > 1 <211> 646

< 212 > ADN <213> Streptomyces hygroscopícus < 4 0 0 > 1 gcgacccgag cagatcgttg gtgtcctgct tgcggcgttc cgcgatcagc tcggagaggt 60 agaggtagag cgactggccg gccgccatca cgacttcctg tgagtaggcg ccgttcgaga 120 gcatctggtc cgaccaggtc cggaacttgg tctggtcctc gatcggcacg cccagcagct 180 cacagatcat gatgatcggc agaggcaggg cgaagtcctc catcagatcg gcgggggcgc 240 ccttggccag cattttgtcg atcagatcgt cggcgacctc ctgggtgcgc ggacgcaggg 300 cctccatccg gcggctggtc agcgccttgg tcgccaaccg gcgcagccgg gtgtgttccg 360 gagggtccat cagcatgatg acgggctggt cctggatcgc cgggaggacc cggggcacgt 420 ccttgccgag cgtcgcgctg cggctgaacc gcgggtccac gaacaccttg gcgacgtcct 480 cccagctggt ggccagccag gtctccccgc cgtacggcat caggacccgg ccgagctcac 540 cggcgtcccg cágccggttg tactcggggt ggatctcgag tcgctccatt tcggcgaaag 600 gataagggca ggcctttccg gtctcaccct gatcggtcgt cgacat 646

<210> 2 <211> 646 <212> ADN <213> Streptomyces hygroscopícus < 4 0 0 > 2 gcgacccgag cagatcgttg gtgtcctgct tgcgacgttc cgcgatcagc tcggagaggt 60 183

ΕΡ 1 589 031 /PT agaggtagag cgaotggccg gccgccatoa cgacttcctg tgagtaggcg ccgttcgaga 120 gcatctggtc cgaccaggtc cggaacttgg tctggtcctc gatcggcacg cccagcagct 180 cacagatcat gatgatcggc agaggcaggg cgaagtcctc catcagatcg gcgggggcgo 240 ccttggccag cattttgtcg atcagatcgt cggcgacctc ctgggtgcgc ggacgcaggg 300 cctccatccg gcggctggtc agcgccttgg tcgccacccg gcgcagccgg gtgtgttccg 360 gagggtccat cagcatgatg acgggctggt cctggatcgc cgggaggacc cggggcacgt 420 ccttgccgag cgtcgcgctg cggctgaacc gcgggtccac gaacaccttg gcgacgtcct 480 cccagctggc ggccagccag gcctcccggc cgtccaacat caggacccgg ccgagctcac 540 cggcgtcccg cagccggttg tactcggggt ggatctcgag tcgctccatt tcggcgaaag 600 gataagggca ggcctttccg gtctcaccct gatcggtcgt cgacat 646 <210> 3 <211> 404 <212> PRT <213> Streptomyces ^ hygroscopicus <400> 3 Met Ser Thr Thr Asp Gin Gly Glu Thr Gly Lys Ala Cys Pro Tyr Pro 1 5 10 15 Phe Ala Glu Met Glu Arg Leu Glu ile His Pro Glu Tyr Asn Arg Leu 20 25 30 Arg Asp Ala Gly Glu Leu Gly Arg Vai Leu Met Pro Tyr Gly Gly Glu 35 40 45 Thr Trp Leu Ala Thr Ser Trp Glu Asp Vai Ala Lys Vai Phe Vai Asp 50 55 60 Pro Arg Phe Ser Arg Ser Ala Thr Leu Gly Lys Asp Vai Pro Arg Vai 65 70 75 80 Leu Pro . Ala lie Gin Asp Gin Pro Vai Ile Met Leu Met Asp Pro Pro 85 90 95

Glu His Thr Arg Leu Arg Arg Leu Ala Thr Lys Ala Leu Thr Ser Arg 100 105 110

Arg Met Glu Ala Leu Arg Pro Arg Thr Gin Glu Vai Ala Asp Asp Leu 115 120 125 184

ΕΡ 1 589 031 /PT

Ile Asp Lys Met Leu Ala Lys Gly Ala Pro Ala Asp Leu Met Glu Asp 130 135 140

Phe Ala Leu Pro Leu Pro Ile Ile Met Ile Cys Glu Leu Leu Gly Vai 145 150 155 160

Pro Ile Glu Asp Gin Thr Lys Phe Arg Thr Trp Ser Asp Gin Met Leu 165 170 175

Ser Asn Gly Àla Tyr Ser Gin Glu Vai Vai Met Ala Ala Gly Gin Ser 1B0 185 190

Leu Tyr Leu Tyr Leu Ser Glu Leu Ile Ala Glu Arg Arg Lys Gin Asp 195 200 205

Thr Asn Asp Leu Leu Gly Ser Leu Vai Arg Ala Arg Asp Lys Asp Asp 210 215 220

Arg Leu Ser Glu Thr Glu Leu Vai Gly Phe Ala Vai Thr Leu Leu Ile 225 230 235 240

Ala Gly Tyr Glu Thr Thr Ala Asn Ala Ile Gly Asn Ser Vai Tyr Thr 245 250 255

Leu Leu Thr His Pro Glu Lys Leu Ala Glu Leu Arg Lys Asp Leu Ser 260 265 270

Leu Ile Pro Lys Ala Vai Asp Glu Leu Leu Arg Ile Ile Pro Ile Ala 275 280 285

Lys Gin Ala Ser Trp Vai Arg Met 290 295

Ala Vai Glu Asp Vai Glu Leu Ser 300

Gly Thr lie Vai Lys Ala Gly Glu 305 310

Ala Vai Ala Ile Gin Thr His Ser 315 320

Ala Asn Thr Asp Pro Lys Vai Tyr 325

Asp His Pro Glu Glu Ile Asp Phe 330 335

His Arg Thr Ser Asn Pro His Met 340

Ser Leu Gly His Gly Ala His His 345 350

Cys Met Gly Ala Gin Leu Vai Arg 355 360

Vai Glu Met Gin Thr Ala Leu Gly 365

Ser Leu Ile Ser Arg Ile Pro Ala

Leu Arg Phe Ala Vai Pro Glu Pro 380 370 375

Arg Ile Lys Phe Leu Arg Gly Arg 385 390

Leu Vai Pro Ser Leu Glu Ala Leu 395 400

Pro Leu Thr Trp 185

ΕΡ 1 589 031 /PT <210> 4 <211> 404

< 212 > PRT <213> Streptomyces hygroscopicus < 4 0 0 > 4

Met Ser Thr Thr Asp Gin Gly Glu Thr Gly Lys Ala Cys Pro Tyr Pro 15 10 15

Phe Ala Glu Met Glu Arg Leu Glu Ile His Pro Glu Tyr Asn Arg Leu 20 25 30

Arg Asp Ala Gly Glu Leu Gly Arg Vai Leu Met Leu Asp Gly Arg Glu 35 40 45

Ala Trp Leu Ala Ala Ser Trp Glu Asp Vai Ala Lys Vai Phe Vai Asp 50 55 60

Pro Arg Phe Ser Arg Ser Ala Thr Leu Gly Lys Asp Vai Pro Arg Vai 65 70 75 80

Leu Pro Ala Ile Gin Asp Gin Pro Vai Ile Met Leu Met Asp Pro Pro 85 90 95

Glu His Thr Arg Leu Arg Arg Vai Ala Thr Lys Ala Leu Thr Ser Arg 100 105 110

Arg Met Glu Ala Leu Arg Pro Arg Thr Gin Glu Vai Ala Asp Asp Leu 115 120 125

Ile Asp Lys Met Leu Ala Lys Gly Ala Fro Ala Asp Leu Met Glu Asp 130 135 140

Phe Ala Leu Pro Leu Pro Ile Ile Met Ile Cys Glu Leu Leu Gly Vai 145 150 155 160

Pro Ile Glu Asp Gin Thr Lys Phe Arg Thr Trp Ser Asp Gin Met Leu 165 170 175 186

ΕΡ 1 589 031 /PT

Ser Asn Gly Ala Tyr Ser Gin Glu Vai Vai Met Ala Ala Gly Gin Ser 180 185 190

Leu Tyr Leu Tyr Leu Ser Glu Leu Ile Ala Glu Arg Arg Lys Gin Asp 195 200 205

Thr Asn Asp Leu Leu Gly Ser Leu Vai Arg Ala Arg Asp Lys Asp Asp 210 215 220

Arg Leu Ser Glu Thr Glu Leu Vai Gly Phe Ala Vai Thr Leu Leu Ile 225 230 235 240

Ala Gly Tyr Glu Thr Thr Ala Asn Ala Ile Gly Asn Ser Vai Tyr Thr 245 250 255

Leu Leu Thr His Pro Glu Lys Leu Ala Glu Leu Arg Lys Asp Leu Ser 260 265 270

Leu Ile Pro Lys Ala Vai Asp Glu Leu Leu Arg Ile Ile Pro Ile Ala 275 280 285

Lys Gin Ala Ser Trp Vai Arg Met Ala Vai Glu Asp Vai Glu Leu Ser 290 295 300

Gly Thr Ile Vai Lys Ala Gly Glu Ala Vai Ala Ile Gin Thr His Ser 305 310 315 320

Ala Asn Thr Asp Pro Lys Vai Tyr Asp His Pro Glu Glu Ile Asp Phe 325 . 330 335

His Arg Thr Ser Asn Pro His Met Ser Leu Gly His Gly Ala His His 340 345 350

Cys Met Gly Ala Gin Leu Vai Arg Vai Glu Met Gin Thr Ala Leu Gly 355 360 365

Ser Leu Ile Ser Arg Ile Pro Ala Leu Arg Phe Ala Vai Pro Glu Pro 370 375 380

Arg Ile Lys Phe Leu Arg Gly Arg Leu Vai Pro Ser Leu Glu Ala Leu 385 390 395 400

Pro Leu Thr Trp

<210> 5 <211> 758 <212> ADN <213> Streptomyces hygroscopicus 187

ΕΡ 1 589 031 /PT <400> 5 cggaggtgac tgtccggggc catccgccgg cgcaccgcgg cacggacttg atcggagatg 60 tcgtgatcgc tgacccactt cagttcgggt atttccgttg tgatccgacg catcgcctca 120 aggcgctgcc gcgtgaacac gtcgatgtgc gaaagggcgc cacccgggçg cagcacgcgc 180 gcggcotccc gcaggaaacg tcccagattg gggtaggtgt gcgagctctc gatgttgacg 240 agcacatcca ccgaggagtc ctcgaagggc agttcctcgg cgtcgccctg gacgaaccgc 300 agggtatcgc cgcgggacag cgtggcggtg gcgctggcga tcgccttcgg cgccaggtcc 360 agcccggtca tccgggcggt ggggacgagg cgggacagga agttgagcoc ctcccccatt 420 ccgcagccga cctccaggac cgtccggccg tcgcagctct ccaagccctt cggaaggtcg 480 cgcagggcca ggtagtagag ctgctcgctg aatccgtcgg tgccgtactc ggtgaatccg 540 ggcagcctgg cctcgatctc ggcgacgaac tcggaatcgt gcacacccca gttccacagc 600 tggccctttg ccgacatgct ggcggcgagg tcgtagatgg aggagctggc ggacttgaag 660 gtggcggcct tcgtctccgc ctgcggggtg ccggattcgt cgagattgat gtcggcgaca 720 ccgctggtga aggcggtcac gacgtcgggt tggatcat 758 <210> 6 <211> 755

<212> ADN <213> Streptomyces hygroscopicus <400> 6 cggaggtgac tgtccggggg catccgccgg cgcaccgcgg cacggacttg atcggagatg 60 tcgtgatcgc tgacccactt cagttcgggt atttccgttg tgatccgacg catcgcctca 120 aggcgctgcc gcgtgaacac gtcgatgtgc gaaagggcgc caccccggcg cagcgcgcgc 180 gcggcctccc gcaggaaacg tcccagattg gggtaggtgt gcgagctctc gatgttgacg 240 agcacatcca ccgaggagtc ctcgaagggc agttcctcgg cgtcgccctg gacgaaccgc 300 agggtatcgc cgcgggacag cgtggcggtg gcgctggcga tcgccttcgg cgccaggtcc 360 agcccggtca tccgggcggt ggggacgagg cgggacagga agttgagccc ctcccccatt 420 ccgcagccga cctccaggac cgtccggccg tcgcagctct ccaagccctt cggaaggtcg 480 cgcagggcca ggtagtagag ctgctcgctg aatccgtcgg tgccgtactc ggtgaatccg 540 ggcagcctgg cctcgatctc ggcgacgaac tcggaatcgt gcacacccca gttccacagc 600 tggccctttg ccgacatgct ggcggcgagg tcgtagatgg aggagctggc ggacttgaag 660 gtggcggcct tcgtctccgc ctgcggggtg ccgggttcgt cgagattgat gtcgcgaacc 720 gctgtgaagg cggtcacgac gtcgggttgg atcat 755 < 210 > 7 <211> 318

< 212 > PRT <213> Streptomyces hygroscopicus 188

ΕΡ 1 589 031 /PT <400> 7

Met Ile Gin Pro Asp Vai Vai Thr Ala Phe Thr Ser Gly Vai Ala Asp 15 10 15

Ile Asn Leu Asp Glu Ser Gly Thr Pro Gin Ala Glu Thr Lys Ala Ala 20 25 30

Thr Phe Lys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Tyr Asp Leu Ala Ala Ser Met 35 40 45

Ser Ala Lys Gly Gin Leu Trp Asn Trp Gly Vai His Asp Ser Glu Phe 50 55 60

Vai Ala Glu Ile Glu Ala Arg Leu Pro Gly Phe Thr Glu Tyr Gly Thr 65 70 75 80

Asp Gly Phe Ser Glu Gin Leu Tyr Tyr Leu Ala Leu Arg Asp Leu Pro 85 90 95

Lys Gly Leu Glu Ser Cys Asp Gly Arg Thr Vai Leu Glu Vai Gly Cys 100 105 110

Gly Met Gly Glu Gly Leu Asn Phe Leu Ser Arg Leu Vai Pro Thr Ala 115 120 125

Arg Met Thr Gly Leu Asp Leu Ala Pro Lys Ala Ile Ala Ser Ala Thr 130 135 140

Ala Thr Leu Ser Arg Gly Asp Thr Leu Arg Phe Vai Gin Gly Asp Ala 145 150 155 160

Glu Glu Leu Pro Phe Glu Asp Ser Ser Vai Asp Vai Leu Vai Asn Ile 165 170 175

Glu Ser Ser His Thr Tyr Pro Asn Leu Gly Arg Phe Leu Arg Glu Ala 180 185 190

Ala Arg Vai Leu Arg Pro Gly Gly Ala Leu Ser His Ile Asp Vai Phe 189

ΕΡ 1 589 031 /PT 195 200 205

Thr Arg Gin Arg Leu Glu Ala Met Arg Arg Ile Thr Thr Glu Ile Pro 210 215 220

Glu Leu Lys Trp Vai Ser Asp His Asp Ile Ser Asp Gin Vai Arg Ala 225 230 235 240

Ala Vai Arg Arg Arg Met Ala Pro Asp Ser His Leu Arg Ser Thr Leu 245 250 255

Asn Lys Gin Arg Met Asn Arg Leu Ala Arg Thr Leu Ala Leu His Ser 260 265 270

Gin Ile Thr Vai Phe Gly Gly Thr Phe Ala Asp Tyr Gin Pro Pro Ala 275 280 285

Ser Vai Lys Met Leu Ser Arg Leu Gly Leu Vai Pro Pro Met Asp Ser 290 295 300

Leu Pro Met Glu Thr Tyr Arg His Gin Ile Ala Vai Arg Vai 305 310 315

<210> 8 <211> 317 < 212 > PRT <213> Streptomyces hygroscopicus <400> 8

Met Ile Gin Pro Asp Vai Vai Thr Ala Phe Thr Ala Vai Arg Asp Ile 15 10 15

Asn Leu Asp·Glu Pro Gly Thr Pro Gin Ala Glu Thr Lys Ala Ala Thr 20 25 30

Phe Lys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Tyr Asp Leu Ala Ala Ser Met Ser 35 40 45

Ala Lys Gly Gin Leu Trp Asn Trp Gly Vai His Asp Ser Glu Phe Vai 50 55 60

Ala Glu Ile Glu Ala Arg Leu Pro Gly Phe Thr Glu Tyr Gly Thr Asp 65 70 75 80

Gly Phe Ser Glu Gin Leu Tyr Tyr Leu Ala Leu Arg Asp Leu Pro Lys 85 90 95 190

ΕΡ 1 589 031 /PT

Gly Leu Glu Ser Cys Asp Gly Arg Thr Vai Leu Glu Vai Gly Cys Gly 100 105 HO

Met Gly Glu Gly Leu Asn phe Leu Ser Arg Leu Vai Pro Thr Ala Arg 115 120 125

Met Thr Gly Leu Asp Leu Ala Pro Lys Ala Ile Ala Ser Ala Thr Ala 130 135 140

Thr Leu Ser Arg Gly Asp Thr Leu Arg Phe Vai Gin Gly Asp Ala Glu 145 150 155 160

Glu Leu Pro Phe Glu Asp Ser Ser Vál Asp Vai Leu Vai Asn Ile Glu 165 " 170 175

Ser Ser His Thr Tyr Pro Asn Leu Gly Arg Phe Leu Arg Glu Ala Ala 180 185 190

Arg Ala Leu Arg Arg Gly Gly Ala Leu Ser His Ile Asp Vai Phe Thr 195 200 205.

Arg Gin Arg Leu Glu Ala Met Arg Arg Ile Thr Thr Glu Ile Pro Glu 210 215 220

Leu Lys Trp Vai Ser Asp His Asp Ile Ser Asp Gin Vai Arg Ala Ala 225 230 235 240

Vai Arg Arg Arg Met Pro Pro Asp Ser His Leu Arg Ser Thr Leu Asn 245 250 255

Lys Gin Arg Met Asn Arg Leu Ala Arg Thr Leu Ala Leu His Ser Gin 260 265 270

Ile Thr Vai Phe Gly Gly Thr Phe Ala Asp Tyr Gin Pro Pro Ala Ser 275 280 285

Vai Lys Met Leu Ser Arg Leu Gly Leu Vai Pro Pro Met Asp Ser Leu 290 295 300

Pro Met Glu Thr Tyr Arg His Gin Ile Ala Vai Arg Vai 305 310 315

<210> 9 <211> 300 <212> ADN <213> Streptomyces hygroscopicus 191 ΕΡ 1 589 031 /PT < 4 0 0 > 9 gatcagggcg agggtggtgc tccccggccg ggcgagcagc cgggtggcga cggccgcgac 60 cgcgccggtc cgcatggcgg tgatggtggc cgcgtcggcg agcgcgacca tgcttccgct 120 gtcgtcgtcg agccgcgaca cggtcccgac gatggtgggc aggttgaagc gctcgaagtt 180 ctgcggactg tagctgaccg tcttcatcgt cacaccgatg cccgacgcgc ggtgcggcat 240 gaactcgatg acgcccggaa cgtcgccgcc gcgggcaaag ccggtacgcg gtggcggctc 300

< 210 > 10 <211> 300 <212> ADN <213> Streptomyces hygroscopícus < 4 0 0 > 10 gatcagggcg agggtggtgc tccccggccg ggcgagcagc cgggtggtga cggacgcgac 60 cgcgccggtc cgcatcgcgg tgatggtggc cgcgtcggcg agcgcgacca tgcttccgct 120 gtcgtcgccg agccgcgaca cggtccccac gatggtgggc aggttgaagc gctcgaagtt 180 ctccggactg tagctgaccg tcttcátcga gcacccgatg cccgacgcgc ggtgcggcat 240 gaactcgatg acgcccggaa cgtcgccgcc gcgggcaaag ccgggacgcg gtggcggctc 300 <210> 11 <211> 343

<212> PRT <213> Streptomyces hygroscopícus < 4 0 0 > 11

Met Gin Thr Lys Vai Leu Cys Gin Arg Asp Ile Lys Arg Ile Leu Ser 15 10 15

Vai Vai Gly Arg Asp Vai Met Met Asp Arg Leu Ile Ser Glu Vai His 20 25 30

Ala Gly Phe Ala Arg Leu Gly Arg Gly Glu Thr Asp Glu Pro Pro Pro 35 40 45

Arg Thr Gly Phe Ala Arg Gly Gly Asp Vai Pro Gly Vai Ile Glu Phe 50 55 60

Met Pro His Arg Ala Ser Gly Ile Gly Vai Thr Met Lys Thr Vai Ser 65 70 75 80

Tyr Ser Pro Gin Asn Phe Glu Arg Phe Asn Leu Pro Thr Ile Vai Gly 85 90 95 192

ΕΡ 1 589 031 /PT

Thr Vai Ser Arg Leu Asp Asp Asp Ser Gly Ser Met Vai Ala Leu Ala 100 105 110

Asp Ala Ala Thr Ile Thr Ala Met Arg Thr Gly Ala Vai Ala Ala Vai 115 120 125

Ala Thr Arg Leu Leu Ala Arg Pro Gly Ser Thr Thr Leu Ala Leu Ile 130 135 140

Gly Ala Gly Ala Gin Ala Vai Thr Gin Ala His Ala Leu Ser Arg Vai 145 150 155 160

Leu Pro Leu Glu Arg Ile Leu Ile Ser Asp Ile Lys Ala Glu His Ala 165 170 175

Glu Ser Phe Ala Gly Arg Vai Ala Phe Leu Glu Leu Pro Vai Glu Vai 180 185 190

Thr Asp Ala Ala Thr Ala Met Ala Thr Ala Asp Vai Leu Cys Thr Vai 195 . 200 205

Thr Ser Vai Pro Vai Gly Gly Gly Pro Vai Vai Pro Ala Glu Pro Arg 210 215 220

Gin Ala His Leu His Vai Asn Gly Ile Gly Ala Asp Glu Gin Gly Lys 225 230 235 240

Thr Glu Leu Pro Lys Ala Leu Leu Asp Asp Ala Phe Ile Cys Vai Asp 245 250 255

His Pro Gly Gin Ala Arg Ala Glu Gly Glu Phe Gin Gin Leu Pro Asp 260 265 270

Arg Glu Leu Gly Pro, Ser Leu Ala Asp Leu Cys Ala Ala Pro Glu Ile 275 280 285

Ala Ala Pro His Pro Glu Arg Leu Ser Vai Phe Asp Ser Thr Gly Ser 290 295 300

Ala Phe Ala Asp His Ile Ala Leu Asp Vai Leu Leu Gly Phe Ala Asp 305 310 315 320

Glu Leu Gly Leu Gly His Lys Met Ser Ile Glu Ser Thr Pro Glu Asp 325 330 335

Vai Leu Asp Pro Tyr Ser Leu 340

<210> 12 <211> 343 <212> PRT <213> Streptomyces hygroscopicus 193

ΕΡ 1 589 031 /PT <400> 12

Met Gin Thr Lys Vai Leu Cys Gin Arg Asp Ile Lys Arg Ile Leu Ser 1 5 10 15

Vai Vai Gly Arg Asp Vai Met Met Asp Arg Leu Ile Ser Glu Vai His 20 25 30

Ala Gly Phe Ala Arg Leu Gly Arg Gly Glu Thr Asp Glu Pro Pro Pro 35 40 45

Arg Pro Gly Phe Ala Arg Gly Gly Asp Vai Pro Gly Vai Ile Glu Phe 50 55 60

Met Pro His Arg Ala Ser Gly Ile Gly Cys Ser Met Lys Thr Vai Ser 65 70 75 80

Tyr Ser Pro Glu Asn Phe Glu Arg Phe Asn Leu Pro Thr Ile Vai Gly 85 90 95

Thr Vai Ser Arg Leu Gly Asp Asp Ser Gly Ser Met Vai Ala Leu Ala 100 105 110

Asp Ala Ala Thr Ile Thr Ala Met Arg Thr Gly Ala Vai Ala Ser Vai 115 120 125

Thr Thr Arg Leu Leu Ala Arg Pro Gly Ser Thr Thr Leu Ala Leu Ile 130 135 140

Gly Ala Gly Ala Gin Ala Vai Thr Gin Ala His Ala Leu Ser Arg Vai 145 150 155 160

Leu Pro Leu Glu Arg Ile Leu Ile Ser .Asp Ile Lys Ala Glu His Ala 165 170 175

Glu Ser Phe Ala Gly Arg Vai Ala Phe Leu Glu Leu Pro Vai Glu Vai 180 185 190

Thr Asp Ala Ala Thr Ala Met Ala Thr Ala Asp Vai Leu Cys Thr Vai 195 200 205 194

ΕΡ 1 589 031 /PT

Thr Ser Vai Pro Vai Gly Gly Gly Pro Vai Vai Pro Ala Glu Pro Arg 210 215 220

Gin Ala His Leu His Vai Asn Gly Ile Gly Ala Asp Glu Gin Gly Lys 225 230 235 240

Thr Glu Leu Pro Lys Ala Leu Leu Asp Asp Ala Phe Ile Cys Vai Asp 245 250 255

His Pro Gly Gin Ala Arg Ala Glu Gly Glu Phe Gin Gin Leu Pro Asp 260 265 270

Arg Glu Leu Gly Pro Ser Leu Ala Asp Leu Cys Ala Ala Pro Glu Ile 275 280 285

Ala Ala Pro His Pro Glu Arg Leu Ser Vai Phe Asp Ser Thr Gly Ser 290 295 300

Ala Phe Ala Asp His Ile Ala Leu Asp Vai Leu Leu Gly Phe Ala Asp 305 310 315 320

Glu Leu Gly Leu Gly His Lys Met Ser Ile Glu Ser Thr Pro Glu Asp 325 330 335

Vai Leu Asp Pro Tyr Ser Leu 340

<210> 13 <211> 550 <212> ADN <213> Streptomyces hygroscopicus < 4 0 0 > 13 gcacgcggag gggccgaagg agtcgggcag ccatgatggc gtcgcctggg ctcggacacc 60 tgactacctc ttcggtgtcg cgcgggtgcc cgagggcggc cggtacgcgg ccggcaccgc 120 ggccgtctac accggaatct tcgacctgat cgggacgctg gggtacccca gtctggcccg 180 cacctggaac tacgtcagcg gaatcaacac gccgaacgcc gatggcctcg aggtctaecg 240 ggacttctgt gtgggccgcg ccgaggcgct ggacgcccgt gggatcgacc cggcgaccat 300 gccggcggcg accggcatcg gcgcccacgg cggcggcatc acgtgctact tcatcgccgc 360 acgcgccggt gaccgggtca acatggagaa cccggccgtg ctcacggctc accgctaccc 420 gcageggtac ggcccccgcc cgccggtctt ctcccgggcc acctggctct cgccgccggg 480 ggcggacgac ggccggctct tcgtctccgc gaccgccggc atcgtcggtc acgagacggt 540 gcaccacggc 550

<210> 14 <211> 541 <212> ADN <213> Streptomyces hygroscopicus 195 ΕΡ 1 589 031 /PT < 4 0 0 > 14 gcacgcggag gggccgaagg agtcgtcgag gcatgatggc gtcgcctggg ctcggacacc 60 tgactacctc ttcggtgtcg cgcgggtgcc cgagggcggc cggtacgcgg ccggcaccgc 120 ggccgtctac accggaatct tcgacctgat cgggacgctg gggtacccca gtctggcccg 180 cacctggaac tacgtcagcg gaatcaacac gccgaacgcc gatggcctcg aggtctaccg 240 ggacttctgt gtgggccgcg ccgaggcgct ggacgcccgt gggatcgacc cggcgaccat 300 gccggcggcg accggcatcg gcgcccacgg cgcgcgcatc acgtgctact tcatcgccgc 360 acgcgccggt gaccgggtca acatggagaa cccggccgtg ctcacggctc accgctaccc 420 gcagcggtac ggcccccgcc cgccggtctt ctccggccac ctggctctcg ccgccggggg 480 cggacggctc ttcgtctccg cgaccgccgg catcgtcggt caggagacgg tgcaccacgg 540 c 541

<210> 15 <211> 337 <212> PRT <213> Streptomyces hygroscopícus < 4 0 0 > 15

Val Arg Gin Leu Thr Pro Pro Vai Thr Ala Pro Tyr Cys Arg Phe Glu 15 10 15

Lys Leu Gly Ala Ser Asp Leu Asp Gly Asp Glu Thr Leu Leu Gly Val 20 25 30

Ile Glu His Arg Thr Gly His Thr Gly Val Ser Leu Ala Glu Gly Cys 35 40 45

Pro Arg Thr Ala Val His Thr Thr Thr Arg Glu Asp Glu Ser Phe Ala 50 55 60

Glu Ala Trp His Ala Glu Gly Pro Lys Glu Ser Gly Ser His Asp Gly 65 70 75 80

Val Ala Trp Ala Arg Thr Pro Asp Tyr Leu Phe Gly Val Ala Arg Val 85 90 95 196

ΕΡ 1 589 031 /PT

Pro Glu Gly Gly Arg Tyr Ala Ala Gly Thr Ala Ala Vai Tyr Thr Gly 100 105 110

Ile Phe Asp Leu Ile Gly Thr Leu Gly Tyr Pro Ser Leu Ala Arg Thr 115 120 125

Trp Asn Tyr Vai Ser Gly Ile Asn Thr Pro Asn Ala Asp Gly Leu Glu 130 135 140

Vai Tyr Arg Asp Phe Cys Vai Gly Arg' Ala Glu Ala Leu Asp Ala Arg 145 150 155 160

Gly Ile Asp Pro Ala Thr Met Pro Ala Ala Thr Gly Ile Gly Ala His 165 170 175

Gly Gly Gly Ile Thr Cys Tyr Phe Ile Ala Ala Arg Ala Gly Asp Arg 180 185 190

Vai Asn Met Glu Asn Pro Ala Vai Leu Thr Ala His Arg Tyr Pro Gin 195 200 205

Arg Tyr Gly Pro Arg Pro Pro Vai Phe Ser Arg Ala Thr Trp Leu Ser 210 215 220

Pro Pro Gly Ala Asp Asp Gly Arg Leu Phe Vai Ser Ala Thr Ala Gly 225 230 235 240

Ile Vai Gly His Glu Thr Vai His His Gly Asp Vai Ala Ala Gin Cys 245 250 255

Glu Vai Ser Leu Glu Asn Ile Ala Arg Vai Ile Gly Ala Glu Asn Leu 260 265 270

Gly Arg His Gly Leu Arg Arg Gly Tyr Ala Leu Ala Asp Vai Asp His 275 280 285

Leu Lys Vai Tyr Vai Arg His Arg Glu Asp Ile Ser Thr Vai Arg Arg 290 295 300

Ile Cys Ala Glu Arg Leu Ser Arg Glu Ala Thr Vai Ala Vai Leu His 30S 310 315 320

Thr Asp Ile Ala Arg Thr Asp Leu Leu Vai Glu Ile Glu Gly Vai Vai 325 330 335

Ala

<210> 16 <211> 334 <212> PRT <213> Streptomyces hygroscopicus 197

ΕΡ 1 589 031 /PT < 4 0 0 > 16

Vai Arg Gin Leu Thr Pro Pro Vai Thr Ala Pro Tyr Cys Arg Phe Glu 15 10 15

Lys Leu Gly Ala Ser Asp Leu Asp Gly Asp Glu Thr Leu Leu Gly Vai 20 25 30

Ile Glu His Arg Thr Gly His Thr Gly Vai Ser Leu Ala Glu Gly Cys 35 40 45

Pro Arg Thr Ala Vai His Thr Thr Thr Arg Glu Asp Glu Ser Phe Ala 50 55 60

Glu Ala Trp His Ala Glu Gly Pro Lys Glu Ser Ser Arg His Asp Gly 65 70 75 80

Vai Ala Trp Ala Arg Thr Pro Asp Tyr Leu Phe Gly Vai Ala Arg Vai 85 90 95

Pro Glu Gly Gly Arg Tyr Ala Ala Gly Thr Ala Ala Vai Tyr Thr Gly 100 105 110

Ile Phe Asp Leu Ile Gly Thr Leu Gly Tyr Pro Ser Leu Ala Arg Thr 115 120 125

Trp Asn Tyr Vai Ser Gly Ile Asn Thr Pro Asn Ala Asp Gly Leu Glu 130 135 140

Vai Tyr Arg Asp Phe Cys Vai Gly Arg Ala Glu Ala Leu Asp Ala Arg 145 150 155 160

Gly Ile Asp Pro Ala Thr Met Pro Ala Ala Thr Gly Ile Gly Ala His 165 170 175

Gly Ala Arg Ile Thr Cys Tyr Phe Ile Ala Ala Arg Ala Gly Asp Arg 180 185 190

Vai Asn Met Glu Asn Pro Ala Vai Leu Thr Ala His Arg Tyr Pro Gin 195 200 205 198

ΕΡ 1 589 031 /PT

Arg Tyr Gly Pro Arg Pro Pro Vai Phe Ser Gly His Leu Ala Leu Ala 210 215 220

Ala Gly Gly Gly Arg Leu Phe Vai Ser Ala Thr Ala Gly Ile Vai Gly 225 230 235 240

Gin Glu Thr Vai His His Gly Asp Vai Ala Ala Gin Cys Glu Vai Ser 245 250 255

Leu Glu Asn Ile Ala Arg Vai Ile Gly Ala Glu Asn Leu Gly Arg His 260 265 270

Gly Leu Arg Arg Gly Tyr Ala Leu Ala Asp Vai Asp His Leu Lys Vai 275 280 285

Tyr Vai Arg His Arg Glu Asp Ile Ser Thr Vai Arg Arg Ile Cys Ala 290 295 300

Glu Arg Leu Ser Arg Glu Ala Thr Vai Ala Vai Leu His Thr Asp Ile 305 310 315 320

Ala Arg Thr Asp Leu Leu Vai Glu Ile Glu Gly Vai Vai Ala 325 330 <210> 17 <211> 767

< 212 > ADN <213> Streptomyces hygroscopícus < 4 0 0 > 17 agcgcctggc gtccctggcc atccacgacc tctacggcct gaatgaggag gaggggcccg 60 tactcgaggg ccagatgcgg gccatggagg gcggcaccga catggagagc atcaagaggc 120 tgaccgacga attcttcggt caçgtcctgg cgctggtgcg tgccaagcgg gagcaggcgg 180 gcgacaggct tctgcaccgg ctggccgagt ccggcgagga cgagatcctg ctcagcgacg 240 aggaggegac cggggtgttc gccactctgc tgttcgccgg gcacgactcg atgcagcaga 300 tggtcggcta ctgtctgtac gegctgctct cccatcccga gcagcgggcg gcgctgcggg 360 agaacccgga cctgatcgac ggcgcggtcg aggagctgct gcgcttcctg ccgctcaacc 420 agctcggcgt gccgcgggtc tgtgtcgagg acgtcgagct gcacggccag accatcagcg 480 ccggcgacaa cgtgatcccg ctctactcga cggccaaccg cgaccccggc gtcttcgccg 540 accccgacac gttcgacatc acgcgtaagc ccgaacacaa cttcgctttc gggtacggca 600 tccacaagtg cccggggcag cacctogccc gcgtgttgat caaggtcgcc acgctgcgcc 660 tgttcgagcg cttcccggat gtgcgactgg cgggcgacgt gccgatgaac gagggtctgg 720 gcctgttcag cccggccgag ctccgggtca cctggggagc ggagtga 767

<210> 18 <211> 761 <212> ADN <213> Streptomyces hygroscopícus 199 ΕΡ 1 589 031 /PT < 4 0 0 > 18 agcgcctggc gtccctggcc atccacgacc tctacggcct gaatgaggag gggcccgtac 60 tcgagggcca gatgcgggcc atggagggcg gcaccgacat ggagagcatc aagaggctga 120 ccgacgaatt cggtcacgtc ctggcgctgg tgcgtgccaa gcgggacgag gcgggcgaca 180 ggcttctgca ccggctggcc gagtccggcg aggacgagat cctgctcagc gacgaggagg 240 cgaccggggt gttcgccact ctgctgttcg ctcgatgcag cagatggtcg 300 gctacagtct gtacgcgctg ctctcccatc ccgagcagcg ggcggcgctg cgggagaacc 360 cggacctgat cgacggcgcg gtcgaggagc tgctçcgctt cctgccgctc aaccagctcg 420 gcgtgccgcg ggtctgtgtc gaggacgtcg agctgcacgg ccagaccatc agcgccggcg 480 acaacgtgat cccgctctac tcgacggcca accgcgaccc cggcgtcttc gccgaccccg 540 acacgttcga catcacgcgt aagcccgaac acaacttcgc tttcgggtac ggcatccacg 600 gctgcccggg gcagcacctc gcccgcgtgt tgatcaaggt cgccaccgtg cgcctgttcg 660 agcgcttccc ggatgtgcga ctggcgggcg acgtgccgat gaacgagggt ctgggcctgt 720 tcagcccggc cgagctccgg gtcacctggg gagcggagtg a 761 < 210 > 19 <211> 388

< 212 > PRT <213> Streptomyces hygroscopicus < 4 0 0 > 19

Met Ser Thr Glu Ala Gin Gin Glu Ser Thr Pro Thr Ala Arg Cys Pro 15 10 15

Phe Ser Ile Gin Asp Gly His Arg Thr Ile Leu Glu Thr Gly Thr Vai 20 25 30

Gly Ala His Glu Leu Phe Gly Vai Lys Gin Trp Leu Vai Ala Ala Ala 35 40 45

Glu Asp Vai Lys Leu Vai Thr Asn Asp Pro Arg Phe Ser Ser Ala Ala 50 55 60 200

ΕΡ 1 589 031 /PT

Pro Ser Gly Ile Leu Gly Asp Arg Arg Pro Gly Trp Phe Ser Gly Met 65 70 75 80

Asp Ser Pro Glu His Asn Arg Tyr Arg Gin Lys Ile Ala Arg Asp Phe 85 90 95

Thr Leu Arg Ala Ala Arg Lys Gin Glu Glu Phe Ile Vai Arg Ala Ala 100 105 110

Asp Ser Cys Leu Asp Asp Ile Glu Ala Ser Gly Pro Gly Thr Asp Leu 115 120 125

Vai Pro Gly Tyr Ala Lys Arg Leu Ala Ser Leu Ala Ile His Asp Leu 130 135 14 0

Tyr Gly Leu Asn Glu Glu Glu Gly Pro Vai Leu Glu Gly Gin Met Arg 145 150 155 160

Ala Met Glu Gly Gly Thr Asp Met Glu Ser Ile Lys Arg Leu Thr Asp 165 170 175

Glu Phe Phe Gly His Vai Leu Ala Leu Vai Arg Ala Lys Arg Glu Gin 180 185 190

Ala Gly Asp Arg Leu Leu His Arg Leu Ala Glu Ser Gly Glu Asp Glu 195 200 205

Ile Leu Leu Ser Asp Glu Glu Ala Thr Gly Vai Phe Ala Thr Leu Leu 210 215 220

Phe Ala Gly His Asp Ser Met Gin Gin Met Vai Gly Tyr Cys Leu Tyr 225 230 235 240

Ala Leu Leu Ser His Pro Glu Gin Arg Ala Ala Leu Arg Glu Asn Pro 245 250 255

Asp Leu Ile Asp Gly Ala Vai Glu Glu Leu Leu Arg Phe Leu Pro Leu 260 265 270

Asn Gin Leu Gly Vai Pro Arg Vai Cys Vai Glu Asp Vai Glu Leu His 275 280 285

Gly Gin Thr Ile Ser Ala Gly Asp Asn Vai Ile Pro Leu Tyr Ser Thr 290 295 300

Ala Asn Arg Asp Pro Gly Vai Phe Ala Asp Pro Asp Thr Phe Asp Ile 201

ΕΡ 1 589 031 /PT 305 310 315 320

Thr Arg Lys Pro Glu His Asn Phe Ala Phe Gly Tyr Gly Ile His Lys 325 330 335

Cys Pro Gly Gin His Leu Ala Arg Vai Leu Ile Lys Vai Ala Thr Leu 340 345 350

Arg Leu Phe Glu Arg Phe Pro Asp Vai Arg Leu Ala Gly Asp Vai Pro 355 360 365

Met Asn Glu Gly Leu Gly Leu Phe Ser Pro Ala Glu Leu Arg Vai Thr 370 375 380

Trp Gly Ala Glu 385

<210> 20 <211> 386 <212> PRT <213> Streptomyces hygroscopícus <400> 20

Met Ser Thr Glu Ala Gin Gin Glu Ser Thr Pro Thr Ala Arg Cys Pro 15 10 15

Phe Ser Ile Gin Asp Gly His Arg Thr Ile Leu Glu Thr Gly Thr Vai 20 25 30

Gly Ala His Glu Leu Phe Gly Vai Lys Gin Trp Leu Vai Ala Ala Ala 35 40 45

Glu Asp Vai Lys Leu Vai Thr Asn Asp Pro Arg Phe Ser Ser Ala Ala 50 55 60

Pro Ser Gly Ile Leu Gly Asp Arg Arg Pro Gly Trp Phe Ser Gly Met 65 70 75 80

Asp Ser Pro Glu His Asn Arg Tyr Arg Gin Lys Ile Ala Arg Asp Phe 85 90 95

Thr Leu Arg Ala Ala Arg Lys Gin Glu Glu Phe Ile Vai Arg Ala Ala 100 105 110

Asp Ser Cys Leu Asp Asp Ile Glu Ala Ser Gly Pro Gly Thr Asp Leu 115 120 125 202

ΕΡ 1 589 031 /PT

Vai Pro Gly Tyr Ala Lys Arg Leu Ala Ser Leu Ala Ile His Asp Leu 130 135 140

Tyr Gly Leu Asn Glu Glu Gly Pro Vai Leu Glu Gly Gin Met Arg Ala 145 150 155 160

Met Glu Gly Gly Thr Asp Met Glu Ser Ile Lys Arg Leu Thr Asp Glu 165 170. ,175

Phe Gly His Vai Leu Ala Leu Vai Arg Ala Lys Arg Asp Glu Ala Gly 180 185 190

Asp Arg Leu Leu His Arg Leu Ala Glu Ser Gly Glu Asp Glu Ile Leu 195 200 205

Leu Ser Asp Glu Glu Ala Thr Gly Vai Phe Ala Thr Leu Leu Phe Ala 210 215 220

Gly His Asp Ser Met Gin Gin Met Vai Gly Tyr Ser Leu Tyr Ala Leu 225 230 235 240

Leu Ser His Pro Glu Gin Arg Ala Ala Leu Arg Glu Asn Pro Asp Leu 245 250 255

Ile Asp Gly Ala Vai Glu Glu Leu Leu Arg Phe Leu Pro Leu Asn Gin 260 265 270

Leu Gly Vai Pro Arg Vai Cys Vai Glu Asp Vai Glu Leu His Gly Gin 275 280 285

Thr Ile Ser Ala Gly Asp Asn Vai Ile Pro Leu Tyr Ser Thr Ala Asn 290 295 300

Arg Asp Pro Gly Vai Phe Ala Asp Pro Asp Thr Phe Asp Ile Thr Arg 305 310 315 320

Lys Pro Glu His Asn Phe Ala Phe Gly Tyr Gly Ile His Gly Cys Pro 325 330 335

Gly Gin His Leu Ala Arg Vai Leu Ile Lys Vai Ala Thr Vai Arg Leu 340 345 350

Phe Glu Arg Phe Pro Asp Vai Arg Leu Ala Gly Asp Vai Pro Met Asn 355 360 365

Glu Gly Leu Gly Leu Phe Ser Pro Ala Glu Leu Arg Vai Thr Trp Gly 370 375 380

Ala Glu 385 203

ΕΡ 1 589 031 /PT

<210> 21 <211> 649 <212> ADN <213> Streptomyces hygroscopicus <400> 21 gtgagcgcgt ccgtgcagac catcaagctg ccgaacggca agaccgtcgc ccacgtcaac 60 ccgggcgagg cgcagttcct ctaccaggag atcttcgccg agcggtgcta cttgcggcgc 120 ggccttgagc tgcgagcggg tgacgtggtc ttcgacgtcg gcgcgaacat cggcatgttc 180 tcgctcttcg cccacctgga gtgccccgat gtcacggtgc acgccttcga gccggcgccg 240 gtgccgtacg ccgcgctcag ggccaatgcc gagcggtacg gcatcgcggg ccggttcgag 300 cagtgcgcgg tctcggacgt ggccggccgc ggcaagatga cgttctacac ggataccacg 360 atgatgtcgg gcttccaccc ggatccggcg acccgcgcgg agctgctgcg caggctcgcc 420 atcaacggcg ggtacagtgc cgaggccgcc gaccggatgc tggccgagct gccggacacc 480 agccaggtga tcgagacgtc cgtcgtacgc ctctccgacg tcatcgcgga gcggggcatc 540 acctcgatcg gactgctcaa gatcgatgtg gagaagaacg agcggcatgt gatggccggg 600 atcgacgcgg ccgactggcc gcgcatccgc caggtcgtca ccgaggtgc 649

<210> 22 <211> 649 < 212 > ADN <213> Streptomyces hygroscopicus <400> 22 gtgagcgcgt ccgtgcagac catcaagctg ccgtacggca gaccgtcggc ccacgtcaac 60 ccgggcgagg cgcagttcct ctaccaggag atcttcgccg agcggtgcta cttgcggcgc 120 ggccttgagc tgcgagcggg tgacgtggtc ttcgacgtcg gcgcgaacat cggcatgttc 180 tcgctcttcg cccacctgga gtgccccgat gtcacggtgc acgccttcga gccggcgccg 240 gtgccgtacg ccgcgctcag ggccaatgcc gagcggtacg ccatcgcggg ccggttcgag 300 cagtgcgcgg tctcggacgt ggccggccgc ggcaagatga cgttctacac ggataccacg 360 atgatgtcgg gcttccaccc ggatccggcg acccgcgcgg agctgctgcg caggctcgcc 420 atcaacggcg ggtacagtgc cgaggccgcc gaccggatgc tggccgagct gccggacacc 480 agccaggtga tcgagacgtc cgtcgtacgc ctctccgacg tcatcgcgga gcggggcatc 540 acctcgatcg gactgctcaa gatcgatgtg gagaagaacg agcggcatgt gatggccggg 600 atcgacgcgg gcgactggcc gcgcatccgc caggtcgtca ccgaggtgc 649

<210> 23 <211> 260 <212> PRT <213> Streptomyces hygroscopicus

204 ΕΡ 1 589 031 /PT <400> 23 Val Ser Ala Ser Vai Gin Thr Ile Lys Leu Pro Asn Gly Lys Thr Vai 15 10 15

Ala His Val Asn Pro Gly Glu Ala Gin Phe Leu Tyr Gin Glu Ile Phe 20 25 30

Ala Glu Arg Cys Tyr Leu Arg Arg Gly Leu Glu Leu Arg Ala Gly Asp 35 40 45

Val Val Phe Asp Val Gly Ala Asn Ile Gly Met Phe Ser Leu Phe Ala 50 55 60

His Leu Glu Cys Pro Asp Val Thr Val His Ala Phe Glu Pro Ala Pro 65 70 75 80

Val Pro Tyr Ala Ala Leu Arg Ala Asn Ala Glu Arg Tyr Gly Ile Ala 85 90 95

Gly Arg Phe Glu Gin Cys Ala Val Ser Asp Val Ala Gly Arg Gly Lys 100 105 110

Met Thr Phe Tyr Thr Asp Thr Thr Met Met Ser Gly Phe His Pro Asp 115 120 125

Pro Ala Thr Arg Ala Glu Leu Leu Arg Arg Leu Ala Ile Asn Gly Gly 130 135 140

Tyr Ser Ala Glu Ala Ala Asp Arg Met Leu Ala Glu Leu Pro Asp Thr 145 150 155 ' 160

Ser Gin Val Ile Glu Thr Ser Val Val Arg Leu Ser Asp Val Ile Ala 165 170 175

Glu Arg Gly Ile Thr Ser Ile Gly Leu Leu Lys Ile Asp Val Glu Lys 180 185 190 Asn Glu Arg His Val Met Ala Gly Ile Asp Ala Ala Asp Trp Pro Arg 195 200 205

Ile Arg Gin Val Val Thr Glu Val His Asp 210 215 lie Asp Gly Arg Leu Asp 220

Glu Val Leu Thr Leu Leu Arg Gly Gin Gly 225 230

Phe Thr Val Leu Ser Glu 235 240

Gin Glu Pro Leu Phe Ala Gly Thr Asp Ile 245 250

Tyr Gin Val Val Ala Arg 255

Arg Gly Asp Ala 260 205

ΕΡ 1 589 031 /PT

<210> 24 <211> 260 <212> PRT <213> Streptomyces hygroscopicus <400> 24

Val Ser Ala Ser Vai Gin Thr Ile Lys Leu Pro Tyr Gly Arg Pro Ser 15 10 15

Ala His Val Asn Pro Gly Glu Ala Gin Phe Leu Tyr Gin Glu Ile Phe 20 25 30

Ala Glu Arg Cys Tyr Leu Arg Arg Gly Leu Glu Leu Arg Ala Gly Asp 35 40 45

Val Val Phe Asp Val Gly Ala Asn Ile Gly Met Phe Ser Leu Phe Ala 50 55 60

His Leu Glu Cys Pro Asp Val Thr Val His Ala Phe Glu Pro Ala Pro 65 70 75 80

Val Pro Tyr Ala Ala Leu Arg Ala Asn Ala Glu Arg Tyr Ala Ile Ala 85 90 95

Gly Arg Phe Glu Gin Cys Ala Val Ser Asp Val Ala Gly Arg Gly Lys 100 105 110

Met Thr Phe Tyr Thr Asp Thr Thr Met Met Ser Gly Phe His Pro Asp 115 120 125

Pro Ala Thr Arg Ala Glu Leu Leu Arg Arg Leu Ala Ile Asn Gly Gly 130 135 140 206

ΕΡ 1 589 031 /PT

Tyr Ser Ala Glu Ala Ala Asp Arg Met Leu Ala Glu Leu Pro Asp Thr 145 150 155 160

Ser Gin Vai Ile Glu Thr Ser Vai Vai Arg Leu Ser Asp Vai Ile Ala 165 170 175

Glu Arg Gly Ile Thr Ser Ile Gly Leu Leu Lys Ile Asp Vai Glu Lys 180 185 190

Asn Glu Arg His Vai Met Ala Gly Ile Asp Ala Gly Asp Trp Pro Arg 195 200 205

Ile Arg Gin Vai Vai Thr Glu Vai His Asp Ile Asp Gly Arg Leu Asp 210 215 220

Glu Vai Leu Thr Leu Leu Arg Gly Gin Gly Phe Thr Vai Leu Ser Glu 225 230 235 240

Gin Glu Pro Leu Phe Ala Gly Thr Asp Ile Tyr Gin Vai Vai Ala Arg 245 250 255

Arg Gly Asp Ala 260

<210> 25 <211> 100 < 212 > ADN <213> Streptomyces hygroscopicus <400> 25 ggccacctcc atcgatctgt cacccgaact gaccgcggta ggccgccgca agttggcctc 60 gcgggggatc gataacgtca ccctggtcga gggtgacgtt 100

<210> 26 <211> 100 < 212 > ADN <213> Streptomyces hygroscopicus <400> 26 60 ggccacctcc atcgatctgt cacccgaact gaccgcggta ggcccccaca agttggcctc gcgggggatc gataacgtca ccctggtcga gggtgacgtt

<210> 27 <211> 210 < 212 > PRT <213> Streptomyces hygroscopicus 100 207 ΕΡ 1 589 031 /PT <400> 27

Met Leu Glu Leu Gly Thr Arg Leu Lys Phe Arg Phe Thr Gly Pro Leu 15 10 15

Leu Glu Ala Vai Asn Pro Arg Leu Gin Gly His Pro Tyr Asp Vai Leu 20 25 30

Met Arg Leu Leu Glu Gly Gly Arg Ile Glu Asn Vai Leu Glu Leu Cys 35 . 40 45

Gly Gly Thr Gly Phe Ala Ser Arg Met Leu Ala Glu Arg His Ser Lys 50 55 60

Vai Gin Ala Thr Ser Ile Asp Leu Ser Pro Glu Leu Thr Ala Vai Gly 65 70 75 80

Arg Arg Lys Leu Ala Ser Arg Gly Ile Asp Asn Vai Thr Leu Vai Glu 85 90 95

Gly Asp Vai Ser Thr Leu Pro Tyr Pro Asp Asp Ser Phe Asp Thr Vai 100 105 110

Met Ser Ala Phe Gly Leu His Glu Vai Pro Thr Ala Gly Arg Leu Ser 115 120 125

Ala Ile Arg Glu Ser Vai Arg Vai Leu Lys Pro Gly Gly Arg Phe Vai 130 135 140

Ile Vai Asp Leu Asp Arg Arg Thr Lys Tyr Gly Trp Thr Met Asp Leu 145 150 155 160

Phe Met Lys Vai Met Glu Pro Lys Phe Ala Pro Glu Vai Phe Gly Thr 165 170 175

Gly Leu Vai Asp Arg Leu Lys Glu Asn Gly Phe Thr Ile Asp His His 180 185 190

Glu Ser Ala Gly Pro Asn Gly Trp Thr Gin Ser Ile Vai Ala Thr Leu 195 200 205

Glu Ala 210

<210> 28 <211> 210 <212> PRT <213> Streptomyces hygroscopicus 208

ΕΡ 1 589 031 /PT <400> 28

Met Leu Glu Leu Gly Thr Arg Leu Lys Phe Arg Phe Thr Gly Pro Leu 15 10 15

Leu Glu Ala Vai Asn Pro Arg Leu Gin Gly His Pro Tyr Asp Vai Leu 20 25 30

Met Arg Leu Leu Glu Gly Gly Arg 35 40

Ile Glu Asn Vai Leu Glu Leu Cys 45

Gly Gly Thr Gly Phe Ala Ser Arg 50 55

Met Leu Ala Glu Arg His Ser Lys 60

Vai Gin Ala Thr Ser Ile Asp Leu 65 70

Ser Pro Glu Leu Thr Ala Vai Gly 75 80

Pro His Lys Leu Ala Ser Arg Gly 85

Ile Asp Asn Vai Thr Leu Vai Glu 90 95

Gly Asp Vai Ser Thr Leu Pro Tyr 100

Pro Asp Asp Ser Phe Asp Thr Vai 105 110

Met Ser Ala Phe Gly Leu His Glu 115 120

Vai Pro Thr Ala Gly Arg Leu Ser 125

Ala Ile Arg Glu Ser Vai Arg Vai 130 135

Leu Lys Pro Gly Gly Arg Phe Vai 140

Ile Vai Asp Leu Asp Arg Arg Thr 145 150

Lys Tyr Gly Trp Thr Met Asp Leu 155 160

Phe Met Lys Vai Met Glu Pro Lys 165

Phe Ala Pro Glu Vai Phe Gly Thr 170 175

Gly Leu Vai Asp Arg Leu Lys Glu 180

Asn Gly Phe Thr Ile Asp His His 185 190

Glu Ser Ala Gly Pro Asn Gly Trp Thr Gin Ser Ile Vai Ala Thr Leu 195 200 205

Glu Ala 210 <210> <211> <212> <213> <220> <223> 29 33

ADN

Sequência artificial iniciador <400> 29 gcaagcttgg taccgacacg ctcgccgaac agg 33 209

ΕΡ 1 589 031 /PT <210> <211> <212> <213> <220> 30 31 ADN Sequência artificial <223> Iniciador < 4 0 0 > 30 gcgcatgccc tagggtgtac attacttctc c 31 <210> <211> <212> <213> <220> 31 28 ADN Sequência artificial <223> iniciador < 4 0 0 > 31 tatctagact tcgcacgtgc ctgggaca 28 <210> <211> <212> <213> < 2 2 0 > 32 28 ADN Sequência artificial <223> iniciador < 4 0 0 > 32 agaagcttac ccaattccaa catcacct 28 <210> <211> <212> <213> < 2 2 0 > 33 28 ADN Sequência artificial <223> iniciador < 4 0 0 > 33 ggaagctttg accacacgcc gcccgttc 28 <210> <211> <212> <213> < 2 2 0 > 34 28 ADN Sequência artificial <223> iniciador < 4 0 0 > 34 atgcatgccc gccgcaaccc gctggcct 28 <210> <211> <212> <213> <220> 35 58 ADN Sequência artificial <223> iniciador 210

ΕΡ 1 589 031 /PT <400> 35 taaactagtc catctgagag tttcatatgg ccctattctg cccagccgct ctagaaat 58 <210> <211> <212> <213> <220> 36 58 ADN Sequência artificial <223> iniciador < 4 0 0 > 36 atttctagag cggctgggca gaatagggcc atatgaaact ctcagatgga ctagttta 58 <210> <211> <212> <213> < 2 2 0 > 37 46 ADN Sequência artificial <223> iniciador < 4 0 0 > 37 gggcatatga ggcaattgac tccgccggtc acggcaccgt actgcc 46 <210> <211> <212> <213> < 2 2 0 > 38 40 ADN Sequência artificial <223> iniciador <400> 38 ggggtctaga ggtcacgcca ccacaccctc gatctcgacc 40 <210> <211> <212> <213> < 2 2 0 > 39 44 ADN Sequência artificial <223> iniciador < 4 0 0 > 39 gggcatatgt cgacgaccga tcagggtgag accggaaagg cctg 44 <210> <211> <212> <213> < 2 2 0 > 40 48 ADN Sequência artificial <223> iniciador <400> 40 ggggtctaga ggtcagtcct ggggttcgag aagctcgccg gtctcctt 48 <210> <211> <212> <213> < 2 2 0 > 41 43 ADN Sequência artificial <223> iniciador 211

ΕΡ 1 589 031 /PT < 4 0 0 > 41 gggcatatga tccaacccga cgtcgtgacc gccttcacag cgg 43

<210> 42 <211> 44 <212> ADN <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> iniciador <400> 42 ggggtctaga ggtcacacgc ggacggcgat ctggtgccga tagg 44

<210> 43 <211> 42 <212> ADN <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> iniciador <400> 43 gggcatatgc agaccaaggt tctgtgccag cgtgacatca ag 42

<210> 44 <211> 50 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> iniciador <400> 44 ggggtctaga ggtcactaca gcgagtacgg atcgaggacg tcctcgggcg 50

<210> 45 <211> 40 <212> ADN <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> iniciador <400> 45 ggagatctca gcgagtacgg atcgaggacg tcctcgggcg 40

<210> 46 <211> 49 <212> ADN <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> iniciador <400> 46 gggcatatga gcaccgaagc tcagcaagag agcacgccca ccgcacgct 49

<210> 47 <211> 45 <212> ADN <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> iniciador 212 ΕΡ 1 589 031 /PT <400> 47 ggggtctaga ggtcactccg ctccccaggt gacccggagc tcggc 45

<210> 48 <211> 38 <212> ADN <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> iniciador <400> 48 gggcatatga gcgcgtccgt gcagaccatc aagctgcc 38

<210> 49 <211> 41 <212> ADN <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> iniciador <400> 49 ggggtctaga ggtcaggcgt ccccgcggcg ggcgacgacc t 41

<210> 50 <211> 27 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> iniciador <400> 50 catatgttgg aattgggtac ccgcctg 27

<210> 51 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> iniciador < 4 0 0 > 51 tctagacgct cacgcctcca gggtg 25

<210> 52 <211> 72 <212> ADN <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> iniciador <400> 52 ggggaattca gatctggtct agaggtcagc cggcgtggcg gcgcgtgagt tcctccagtc 60 gcgggacgat ct 72

<210> 53 <211> 47 <212> ADN <213> Sequência artificial 213 ΕΡ 1 589 031 /PT <22 0> <223> iniciador <400> 53 gggtctagat ccggacgaac gcatcgatta attaaggagg acacata 47

<210> 54 <211> 26 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> iniciador <400> 54 gggcatatga ccgatgccgg acgcca 26

<210> 55 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> iniciador <400> 55 ggggtctaga tcacgccacc atgccttcga 30

<210> 56 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Iniciador <400> 56 caaagcttcc tggcgcggtt cggccggca 29

<210> 57 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Iniciador <400> 57 tggcatgccc ttccccgccg ttccctggc 29

<210> 58 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 58 tggcatgccc ccgccgagct gacctggaa 29 214

ΕΡ 1 589 031 /PT

<210> 59 <211> 29 < 212 > ADN <213> sequência artificial <22 0> <223> iniciador <400> 59 gttctagagc ttacgcgtga tgtcgaacg 29

<210> 60 <211> 29 <212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> iniciador <400> 60 gctctagagc ccgcggctcg ccggacacg 29

<210> 61 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Iniciador < 4 0 0 > 61 cccctgcagg cgtccggcat cggtcatcag 30

<210> 62 <211> 31 <212> ADN <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Iniciador <400> 62 cgcctgcagg gatacggtcc gccgggtctg c 31

<210> 63 <211> 30 <212> ADN <213> Sequência artificial < 2 2 0 > <223> Iniciador <400> 63 ccaagcttgt acggttcgcc acgggcgtgc 30

Lisboa

Claims

ΕΡ 1 589 031 /PT 1/5 REIVINDICAÇÕES 1. Método de gerar análogos de ligandos de FKBP o qual incorpora uma unidade de iniciação não natural, compreendendo o referido método: (a) gerar uma estirpe recombinante na qual pelo menos o homólogo rapK foi delecionado ou inactivado; e (b) alimentar uma unidade de iniciação não natural à referida estirpe.
2. Método da reivindicação 1, o qual compreende adicionalmente delecionar um ou mais genes adicionais auxiliares.
3. Método de qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, o qual compreende adicionalmente restaurar por complementação um ou mais dos genes delecionados.
4. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 3, o qual compreende adicionalmente o passo de isolar e purificar os análogos de ligandos de FKBP gerados.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, no qual a referida unidade de iniciação não natural é consistindo em: ácido 2- 2- (cis/trans)-hidroxiciclo- 3- (cis/trans)-hidroxiciclo- 4- (cis/trans)-hidroxiciclo-2-(cis/trans)-metilciclo-4-(eis/trans)-metilciclo- 3- (eis/trans)-metoxiciclo- 4- (eis/trans)-metoxiciclo- seleccionada de entre o grupo norbornanocarboxílico; ácido hexanocarboxilico; ácido hexanocarboxilico; ácido hexanocarboxilico; ácido hexanocarboxilico; ácido hexanocarboxilico; ácido ácido hexanocarboxilico; hexanocarboxilico; ácido 4-oxociclo-hexanocarboxílico; ácido 2-oxociclo-hexanocarboxilico; ácido 4-trans-n-pentilciclo-hexanocarboxilico; ácido 2-trans-aminociclo-hexanocarboxílico; ácido 4-cís-aminociclo-hexanocarboxilico; ácido 4-(cis/trans)-aminometilciclo-hexanocarboxilico; ácido ciclopentanocarboxílico; ácido ciclobutanocarboxilico; ácido 1-metilciclo- hexanocarboxilico; ácido 3-trans-hidroxi-4-cís-fluorociclo-hexanocarboxilico e ácido 4-trans-hidroxi-3-cís-fluorociclo-hexanocarboxilico; ácido 3-cís-hidroxi-4-trans-fluorociclo-hexanocarboxilico e ácido 4-cís-hidroxi-3-trans-fluorociclo-hexanocarboxílico; ácido 3-cís-hidroxi-4-trans-clorociclo- ΕΡ 1 589 031 /PT 2/5 hexanocarboxílico e ácido 4-cis-hidroxi-3-trans-clorociclo-hexanocarboxílico; ácido 3-trans-hidroxi-4-cis-clorociclo-hexanocarboxílico e ácido 4-trans-hidroxi-3-cis-clorociclo-hexanocarboxílico; ácido 3-trans-ciclo-hexenooxidocarboxílico; ácido 3-cis-ciclo-hexenooxidocarboxílico; ácido 3,4-cis-di-hidroxiciclo-hexanocarboxílico e ácido 3,4-trans-di-hidroxiciclo-hexanocarboxílico; ácido ciclo-hexanoacético; ácido ciclo-hexanopropiónico e ácido 4-cis/trans-terc-butilciclo-hexanocarboxilico ou seus sais ou ésteres simples.
6. Método de acordo com a reivindicação 5, na qual a referida unidade de iniciação não natural é seleccionada de entre o grupo consistindo em: ácido ácido ácido ácido ácido 3- (cis/trans)- 4- (eis!trans)- 3- (eis/trans)- 4- (eis/trans)- 4-oxociclo-3- hidroxiciclo-hexanocarboxílico; hidroxiciclo-hexanocarboxílico; metoxiciclo-hexanocarboxílico; metoxiciclo-hexanocarboxílico; hexanocarboxílico; ácido ciclobutanocarboxílico; ácido trans-hidroxi-4-cís-fluorociclo-hexanocarboxílico e ácido trans-hidroxi-3-cís-fluorociclo-hexanocarboxílico; ácido cís-hidroxi-4-trans-fluorociclo-hexanocarboxílico e ácido cis-hidroxi-3-trans-fluorocicio-hexanocarboxílico; ácido cis-hidroxi-4-trans-clorociclo-hexanocarboxílico e cis-hidroxi-3-trans-clorociclo-hexanocarboxílico; trans-hidroxi-4-cís-clorociclo-hexanocarboxílico e trans-hidroxi-3-cís-clorociclo-hexanocarboxílico; trans-ciclo-hexenooxidocarboxílico; ácido hexenooxidocarboxílico; ácido 3,4-cís-di-hidroxiciclo-hexanocarboxílico e ácido 3,4-trans-di-hidroxiciclo-hexanocarboxílico; ácido ciclo-hexanopropiónico; ácido 4-cis/trans-terc-butilciclo-hexanocarboxílico ou seus sais ou ésteres simples. ácido ácido ácido ácido 4- 3- 4- 3- 4- 3- 4-3- 3-cís-ciclo-
7. Método de acordo com a reivindicação 5 desde que o iniciador não natural alimentado à referida estirpe recombinante não seja: ácido ciclo-hexanocarboxílico, ácido 3-cis, 4-trans-di-hidroxiciclo-hexanocarboxílico, ácido 1-ciclo-hexenocarboxílico, ácido 3-ciclo-hexenocarboxílico, ácido ciclo-heptanocarboxílico, ácido 3-(cis/trans)-metilciclo-hexanocarboxílico, ácido 4-(cis/trans)-metilciclo-hexanocarboxílico, ácido 1-ciclo-heptenocarboxílico ou ácido 5-cis-hidroxi1-3-ciclo-hexenocarboxílico. ΕΡ 1 589 031 /PT 3/5
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, no qual a estirpe recombinante da parte (a) é feita de acordo com um método compreendendo: (a) construir um plasmideo de deleção conjugativo numa estirpe de E. coli que é dam“, dcm“ ou dam” e dcm”; (b) gerar esporos da referida estirpe hospedeira adequada para conjugação, onde a referida estirpe é feita crescer a uma humidade de entre 10% e 40% e os esporos são colhidos entre o 5o e 30° dias; (c) conjugar a estirpe de E. coli do passo (a) com os esporos do passo (b) num meio que compreende por litro: i) 0,5g a 5g de macerado de milho em pó, ii) 0,1 g a 5g de extracto de levedura, iii) 0,lg a lOg de carbonato de cálcio; e iv) 0,01 g a 0,5 g de sulfato de ferro; contendo o referido meio adicionalmente BACTO Agar e amido e tendo sido seco para resultar numa perda de peso de 1-20%; e (d) opcionalmente cultivar a estirpe recombinante sob condições adequadas para produção de policétido.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 8, no qual a estirpe é seleccionada de entre o grupo consistindo em Streptomyces hygroscopicus subsp. hygroscopicus NRRL 5491, Actinoplanes sp. N902-109 FERM BP-3832, Streptomyces sp. AA6554, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus MA 6475 ATCC 14891, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus MA 6678 ATCC 55087, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus MA 6674, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus ATCC 55276, Streptomyces hygroscopicus subsp. ascomyceticus ATCC 14891, Streptomyces tsukubaensís No.9993 FERM BP-927, Streptomyces hygroscopicus subsp. yakushimaensis, Streptomyces sp. DSM 4137, Streptomyces sp. DSM 7348, Micromonospora n.sp. A92-306401 DSM 8429 e Streptomyces sp. MA 6858 ATCC 55098.
10. Método da reivindicação 9, no qual as estirpes são seleccionadas de entre o grupo consistindo em: S. hygroscopicus subsp. hygroscopicus NRRL 5491 e S. hygroscopicus var. ascomyceticus ATCC 14891. ΕΡ 1 589 031 /PT 4/5
11. Método da reivindicação 10, no qual a estirpe é o produtor de rapamicina S. hygroscopicus subsp. hygroscopicus NRRL 5491.
12. Método de acordo com a reivindicação 3, no qual o processo de restaurar os genes delecionados compreende: (a) construir uma cassete de genes que contém um ou mais dos genes delecionados e (b) transformar a referida estirpe recombinante que contém "clusters" biossintéticos que codificam ligandos de FKBP com a referida cassete de genes.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, no qual a referida cassete de genes é montada directamente num vector de expressão.
14. Método de acordo com a reivindicação 12 ou 13, no qual a complementação é homóloga.
15. Método de acordo com a reivindicação 12 ou 13, no qual a complementação é heteróloga.
16. Método de qualquer uma das reivindicações 2 a 15, no qual os referidos um ou mais genes auxiliares delecionados ou inactivados são seleccionados de entre o grupo consistindo em genes fornecedores da unidade de iniciação, genes fornecedores de precursor de aminoácido, citocromo P-450 monooxigenases, ferredoxinas e O-metiltransferases dependentes de SAM.
17. Método da reivindicação 16, no qual os genes delecionados ou inactivados são seleccionados de entre o grupo consistindo em rapL, rapN, rapO, rapM, rapQ, rapl e rapJ.
18. Estirpe recombinante que contém "clusters" biossintéticos que codificam ligandos de FKBP, na qual pelo menos o homólogo de rapK foi delecionado ou inactivado.
19. Estirpe recombinante de acordo com a reivindicação 18, na qual pelo menos o homólogo de rapK foi delecionado ou inactivado numa estirpe seleccionada de entre o grupo consistindo em Streptomyces hygroscopicus subsp. hygroscopicus NRRL 5491, Actinoplanes sp. N902-109 FERM BP-3832, Streptomyces sp. AA6554, Streptomyces hygroscopicus var. ascomyceticus MA 6475 ATCC 14891, Streptomyces hygroscopicus ΕΡ 1 589 031 /PT 5/5 Streptomyces Streptomyces Streptomyces Streptomyces hygroscopicus Streptomyces DSM 8429 e var. ascomyceticus MA 6678 ATCC 55087, hygroscopicus var. ascomyceticus MA 6674, hygroscopicus var. ascomyceticus ATCC 55276, hygroscopicus subsp. ascomyceticus ATCC 14891, tsukubaensís No.9993 FERM BP-927, Streptomyces subsp. yakushimaensis, Streptomyces sp. DSM 4137, sp. DSM 7348, Micromonospora n.sp. A92-306401 Streptomyces sp. MA 6858 ATCC 55098.
20. Estirpe recombinante de acordo com a reivindicação 19, onde as estirpes são seleccionadas de entre o grupo consistindo em S. hygroscopicus subsp. hygroscopicus NRRL 5491 e S. hygroscopicus var. ascomyceticus ATCC 14891.
21. Estirpe recombinante de acordo com a reivindicação 20, onde a estirpe é o produtor de rapamicina S. hygroscopicus subsp. hygroscopicus NRRL 5491.
22. Estirpe recombinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 21, onde genes auxiliares delecionados ou inactivados adicionais são seleccionados de entre o grupo consistindo em: rapL, rapN/O, rapQ, rapM, rapl e rapJ, onde a referida deleção não é rapQrapN/OrapMrapL. Lisboa,