PT1305037E - Medicamento analgésico. - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "MEDICAMENTO ANALGÉSICO" A presente invenção relaciona-se com a utilização de adenosina-5'-trifosfato-2',3'-dialdeido (oATP) na preparação de medicamentos analgésicos. A molécula de oATP deriva-se do ATP por meio da oxidação dos hidroxilos presentes nas posições 2'- e 3' da ribose em dialdeídos. Tal oxidação pode ser levada a cabo com um sal de ácido periódico, tal como descrito em P. N. Lowe et al., "Preparation and Chemical properties of periodate-oxidized adenosine triphosphate and some related compounds", Biochemical Society Transactions, Vol, 7:1131— 1133, 1979. 0 derivado ATP 2', 3'-dialdeido é utilizado, tradicionalmente, como um marcador de afinidade para sítios nucleotídicos enzimáticos (Easterbrook-Smith, B., Wallace, J. C. & Keech, D. B. (1976) Eur. J. Biochem. 62, 125-130), uma vez que é capaz de reagir com os resíduos de lisina não protonados presentes nos sítios nucleotídicos para formar bases de Schiff ou derivados de di-hidromorfolino (Colman, R. F. (1990) em The Enzymes - Sigman, D. S. e Boyer, P. D., eds - Vol 19, pp. 283-323, Academic Press, San Diego) . A molécula de oATP também tem sido utilizada para estudar a activação de plaquetas e inibir a estimulação do músculo esquelético da galinha por meio do ATP (Pearce, P. H., Wright, J. M., Egan C. M. & Scrutton, M. C. (1978) Eur. J. Biochem. 88, 543-554; Thomas, S. A., Zawisa, M. J., Lin, X. & Hume, R. I. (1991) Br. J. Pharmacol. 103, 1963-1969). -2-

Além disso, estudos em linhas de células macrófagas provaram que o oATP é capaz de bloquear o efeito de permeabilização da membrana plasmática induzido por ATP, de reduzir o nivel de hidrólises do ATP exógeno por ecto-ATPase de membrana e de inibir o inchaço, a vacuolisação e os efeitos de lise celular induzidos por ATP (Murgia et ãl.r The Journal of Biological Chemistry, (1993) pela The American Society for Biochemistry and Molecular Biology, inc., Vol. 268, N° 11, pp 8199). Tem sido sugerido que o oATP tem actividade antagonista em purinoceptores P2z/P2X7. A libertação de IL-ΐβ (interleucina Ιβ) dependente de LPS (= lipopolissacárido) de células microgliais que expressam P2z/P2X7 é, de facto, inibida, de forma selectiva por oATP (Ferrari D., et al., J. Exp. Med., (1997) Vol. 185, N.3, Páginas 579-582).

Verificou-se agora que o oATP exerce efeitos anti-inflamatórios e antinociceptivos excepcionais in vivo. Como modelo experimental, foi utilizada uma inflamação unilateral na pata traseira de um rato, depois de injecção intraplantar de adjuvante completo de Freund (FCA). A pata contralateral de animais tratados, bem como a de animais não tratados foi utilizada como controlo. A inflamação induzida por FCA ficou evidente, de 3 horas até 24-48 horas a seguir à injecção, pelo aumento do volume da pata, hipertermia e hiperalgia. Esta última foi avaliada por meio de um teste algesiométrico (teste de pressão da pata) capaz de avaliar o limiar nociceptivo. A injecção de oATP reduziu, de forma significativa, a sensação de dor (nocicepção), isto é, aumentou o limiar nociceptivo. Doses diferentes de oATP sempre induziram um efeito significativo, dose-dependente, que dura, aproximadamente, 12-24 horas, com um pico de efeito já uma hora após a administração. Além disso, as patas dos ratos tratados com -3- oATP apresentaram redução dos outros sinais inflamatórios (inchaço e hipertermia) . Num outro teste, a comparação entre o oATP e o diclofenaco, um fármaco anti-inflamatório conhecido utilizado em patologias artríticas, demonstrou que o oATP induz um efeito analgésico significativamente maior do que o diclofenaco. Um teste em que os ratos foram pré-tratados com fucoidina, um inibidor de diapedese de leucócito, demonstrou que a actividade do oATP é independente do recrutamento de leucócitos no local da inflamação. Os níveis de ATP nos locais da inflamação foram significativamente maiores nos animais não tratados, o que sugere que o oATP pode, até um certo ponto, bloquear a produção de ATP exógeno, evitando, deste modo, a sua actividade pró-inflamatória. A presente invenção relaciona-se com a utilização de oATP como medicamento para o tratamento de estados dolorosos. A invenção relaciona-se ainda com composições farmacêuticas contendo oATP como componente activo, em associação com excipientes farmaceuticamente aceitáveis. As formas adequadas para administrações por via oral, tópica ou parentérica são, por exemplo, comprimidos, pílulas revestidas com açúcar, cápsulas, granulados, pós, supositórios, xaropes, soluções, suspensões, cremes, pomadas, géis, pastas, loções, emulsões, spray. As composições farmacêuticas podem ser preparadas de acordo com o que está descrito no Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook, Mack Pub. Co., Nova Iorque, EUA, XVII Ed. A quantidade de componente activo por dosagem unitária pode variar de 0,05 a 100 mg por kg de peso corporal, a ser administrada uma ou mais vezes ao dia, dependendo da gravidade da doença a ser tratada e o estado do doente. A dosagem diária irá variar, de um modo geral, na gama de 1 a 300 mg, preferencialmente, de 10 a 100 mg. -4- 0 composto da invenção também pode ser utilizado em associação com outros fármacos anti-inflamatórios actualmente utilizados. 0 exemplo a seguir ilustra melhor a invenção.

Exemplo 1: actividade farmacológica do oATP

Indução de inflamação em ratos

Foram utilizados ratos Fischer, machos, consanguíneos, (Charles River Italy, Calco, Lecco, Itália) com um peso de cerca de 250 g. Os ratos, sob uma breve anestesia com isoflurano receberam uma injecção intraplantar do adjuvante completo de Freund (FCA) (0,15 mL) na pata direita traseira. Esta injecção induziu uma inflamação unilateral (de 3 horas a 24-48 horas a seguir à injecção) demonstrado pelo aumento no volume da pata, hipertermia e hiperalgia. A hiperalgia foi verificada por meio de um teste algesiométrico (Ugo Basile, Comerio, Itália) para determinar o limiar de pressão da pata, expresso em gramas, nomeadamente, a pressão necessária para provocar a retirada da pata, o que indica o valor do limiar nociceptivo. Foram utilizados 6 a 8 ratos para cada este. Durante estes ensaios, os animais foram tratados de acordo com as "directrizes éticas padrão" (NIH, 1985).

Tratamento com oATP A pata inflamada do rato recebeu, 24 horas depois da injecção de FCA, uma injecção intraplantar de doses -5- diferentes de oATP (56 a 336 μΜ), considerando o tempo 0 como o momento da injecção de oATP. Os valores do limiar nociceptivo obtidos estão apresentados Tabela 1 a seguir. TABELA 1 LIMIAR NOCICEPTIVO OU "LIMIAR DE PRESSÃO DA PATA" OATP 56 pM 112 pM 0' 60 ± 1,6 65 + 2, 0 30' 120 ± 2,1* 140 ± 3,5* 60' 190 ± 2,3* 180 ± 4,2* 90' 85 ± 2,5 150 ± 3,8* 120' 75 ± 1,8* 100 ± 3,0* 240' 75 ± 2,6* 105 ± 4,3* *1,2 = corte 224 pM 336 pM 50 + 1, 5 60 ± 1,9 350 ± 5, 4 * 300 ± 3,4* 400 ± 10, .3* => 750 *1 300 ± 11, ,2* => 750 *2 185 ± 7, 1* 600 ± 20,8* 180 ± 8, g* 550 ± 18,4* como a média ± S.E.M. (Erro

Os dados são expressos padrão médio) do limiar de pressão da pata (avaliado em g) p>0,05 vs tempo 0' (pata inflamada não tratada). *Teste de Mann-Whitney

Foram obtidos resultados semelhantes utilizando 35 pm de oATP em vez de 56 pm de oATP ou induzindo o processo inflamatório (injecção de FCA) durante 6 ou 12 horas em vez de 24 horas. Além disso, as patas tratadas com oATP eram menos dolorosas e também apresentaram redução dos sinais inflamatórios (inchaço, hipertermia) em comparação com as patas não tratadas.

Ficou evidenciado um efeito dose-dependente de oATP, embora tivessem sido obtidos efeitos significativamente altos na dose mínima utilizada. No -6- entanto, as doses mais baixas tiveram um efeito analgésico menos duradouro, possivelmente, devido à saturação incompleta dos receptores P2X7. 0 efeito da dose máxima de oATP utilizada foi testado num outro conjunto de experiências, durante tempos mais prolongados, em patas de ratos nos quais o processo inflamatório tinha sido induzido 48 horas antes (Tabela 2). Os dados demonstram que a injecção de oATP aumenta, de forma significativa, os valores do limiar nociceptivo durante um tempo extremamente prolongado, embora progressivamente decrescente em tempo. TABELA 2 LIMIAR NOCICEPTIVO OU "LIMIAR DE PRESSÃO DA PATA" 0' OATP 55 336 μΜ ± 2,0 30' 210 ± 10,7 60' 360 ± 25,8 90' 395 ± 30,2 120' 450 ± 38,1 180' 550 ± 45,9 240' 690 ± 56,6 12 horas 400 ± 29,7 24 horas 210 ± 7,2 26 horas 190 ± 3,3

Os valores do limiar nociceptivo das patas de controlo (tanto contralateral não inflamada como patas não tratadas) foram de aproximadamente 100-150, expressos como -Ι ο limiar nociceptivo ou limiar de pressão de pata e avaliado em g. A injecção intraplantar de ATP (0,9 mmoles) (o ATP extracelular é citolitico e, deste modo, possivelmente capaz de iniciar um sinal nociceptivo) induziu a redução do limiar nociceptivo de uma forma significativamente mais alta nas patas não inflamadas do que nas patas inflamadas (valores de 120 ± 3,2 a 25 ± 3,0 encontrados nas patas não inflamadas, 240' depois da injecção intraplantar de ATP) em comparação com uma diminuição de 65 ± 4,2 a 50 ± 4,1 nas patas inflamadas. Este resultado possivelmente indica que o ATP citolitico já se encontra presente em quantidades mais elevadas nas patas inflamadas do que nas patas não inflamadas. Por outro lado, o oATP foi eficaz em aumentar o limiar nociceptivo, durante um curto período de tempo, também nas patas não inflamadas, sendo já eficaz na concentração mais baixa de oATP (= 56 μΜ) . As curvas de dose/efeito nas patas não inflamadas podiam, de facto, ser sobrepostas (até 120' depois da administração de oATP) utilizando concentrações diferentes da molécula. A fim de verificar se o efeito analgésico do oATP era relacionado, até um certo ponto, à activação das células inflamatórias capazes de produzir β-endorfinas endógenas, alguns ratos foram injectados, por via intravenosa, com fucoidina (10 mg/kg). De facto, a fucoidina inibe a diapedese do leucócito e a sua acumulação no local da inflamação. Foi realizado um pré-tratamento com fucoidina em ambas as patas, 30' antes da injecção de FCA numa das patas do rato. O limiar da pressão de dor (PPT) foi medido tanto na pata não inflamada como na inflamada, antes e depois da injecção de oATP (224 ym) . Os resultados obtidos estão registados nos gráficos da Figura 1. A injecção de oATP não alterou, de forma significativa, os valores de PPT nas patas não -8- inflamadas, ao passo que, nas patas inflamadas, o tratamento com oATP recuperou os níveis de PPT que tinham sido severamente reduzidos pela injecção de FCA pró-inflamatório. Deste modo, o efeito analgésico do oATP foi independente do recrutamento de leucócitos.

Finalmente, a eficácia antinociceptiva do oATP foi comparada com a dum fármaco anti-inflamatório e analgésico, o diclofenaco. Depois da avaliação do limiar de dor basal, a inflamação unilateral da pata traseira dos ratos foi induzida por injecção de FCA. Três horas depois da injecção, os animais foram divididos em 2 grupos, que foram tratados, localmente, um com oATP (336 μΜ) e o outro com diclofenaco (15 mg) . A eficácia do analgésico oATP foi significativamente mais alta do que a do diclofenaco (os resultados de um ensaio típico estão registados na Figura 2). As concentração de oATP e de diclofenaco foram seleccionadas de modo a permitir uma boa dissolução da molécula em soro fisiológico estéril, antes da injecção intraplantar nos ratos.

Finalmente, a injecção intravenosa de oATP em ratos, nas doses intraplantares testadas, induziu o alívio da dor dose-dependente durante aproximadamente duas horas, embora, aparentemente, os reflexos ainda estivessem presentes. 0 teor de ATP foi avaliado nas patas de rato tratadas com oATP e nas patas contralaterais não tratadas. Os tecidos subcutâneos foram removidos tanto das patas inflamadas como das não inflamadas e rapidamente congelados em azoto líquido. As amostras do tecido congelado foram pesadas, homogeneizadas em tampão fosfato e, em seguida, tratadas com K2C03 e neutralizadas, e, finalmente, -9- centrifugadas. 0 sobrenadante foi utilizado para o ensaio de ATP, seguindo o método de luminescência.

Os valores de ATP foram significativamente mais elevados nos homogeneizados das patas não tratadas do que nas patas tratadas com oATP (1050 ± 90 nmoles/g de tecido fresco nos animais não tratados, vs. 320 ± 22 nmoles/g de tecido fresco nos animais tratados com oATP, cada valor é a média ± S.E.M. de 7 experiências). Isto indica que o oATP bloqueia a produção de ATP exógeno por meio de alguma estrutura tecidual, ligando aos seus receptores de membrana, reduzindo, deste modo, o dano induzido pelo ATP exógeno.

Exemplo 2: modificação do teor de ATP em tecidos subcutâneos periféricos a seguir ao tratamento com oATP - Ensaio de teor de ATP em pata de rato.

Determinamos, num grupo separado de ratos, as modificações no teor de ATP induzidas no tecido plantar por meio do processo inflamatório e/ou pelo tratamento com oATP. Em momentos estabelecidos, foram removidos tecidos subcutâneos da pata e rapidamente congelados em azoto liquido, com a finalidade de bloquear qualquer actividade metabólica. O tecido congelado foi homogeneizado com um politron (Kinematica GmbH, Luzerna, Suíça) em HCIO4 gelado a 6% para extrair os nucleótidos. O homogeneizado foi centrifugado e o sobrenadante foi utilizado para a determinação do ATP, seguindo o procedimento descrito anteriormente (Marni et al., Transplantation (1988), 46: 830-835) . O ensaio foi realizado pelo método de -10- luminescência (Ferrero et al., Res Commun Chem Path Phârmac 1984; 45: 55-67) . - Resultados

Medimos os níveis de ATP, em patas inflamadas (por tratamento com FCA, 24 horas) e patas não inflamadas tratadas com oATP, às 6 e 12 horas após a administração de oATP e em patas contralaterais não tratadas. Conforme registado na Figura 3, em tecidos não inflamados o tratamento com o oATP não alterou, de forma significativa, os níveis de ATP: os dados poderiam expressar os níveis intracelulares do metabolito, que não é modificado, de forma significativa, pelo tratamento com o oATP. Ao contrário, os níveis de ATP nos tecidos inflamados, significativamente mais elevados do que nos tecidos não inflamados, foram reduzidos, de forma significativa, pelo tratamento com o oATP. De facto, a libertação de ATP (ATP extracelular) das células requer o seu dano e ocorre durante o processo inflamatório e outros processos degenerativos. A ligação do oATP com os receptores localizados em muitas células e também em terminais nervosos sensoriais poderia bloquear, de forma competitiva, a ligação do ATP extracelular às mesmas estruturas, limitando a citotoxicidade relacionada com o ATP e induzindo o alívio da dor. Os nossos resultados indicam também que o tratamento com o oATP em tecidos inflamados limitam mais a produção de ATP por células inflamatórias ou outras células, possivelmente, por meio de um bloqueio da sua activação. -11 -

Figura 3: Efeitos da injecção intraplantar de oATP sobre os níveis de ATP de patas inflamadas ou não inflamadas. 0 teor de ATP, às 6 e 12 horas depois da injecção intraplantar de oATP (35 μΜ) nas patas do rato: inflamadas (por tratamento com FCA, 24 horas) (barras cheias), inflamadas, tratadas com oATP (barras achuriadas), não inflamadas (barras abertas), não inflamadas, tratadas com oATP (barras com linhas horizontais). *p<0,005 em comparação com as patas inflamadas, não tratadas, teste de Wilcoxon. Os dados estão expressos como médias ± S.E.M. de 7 experiências.

Lisboa, 10/07/2007

Claims (4)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de adenosina-5'-trifosfato-2',3'-dialdeído para a preparação de um medicamento para o tratamento de estados dolorosos.
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o medicamento está numa forma farmacêutica adequada para a administração oral, tópica ou parentérica.
3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o adenosina-5'-trifosfato-23'-dialdeído é administrado numa dosagem diária que varia de 1 a 300 mg
4. 4. Utilização de acordo com a reivindicação 3, em que as referidas gamas de dosagem variam de 10 a 100 mg. Lisboa, 10/07/2007