PT1397380E

PT1397380E - Péptido de antigénio múltiplo que mostra múltiplas cópias de um epítopo de um polipéptido que forma uma placa e métodos para utilizar o mesmo

Info

Publication number: PT1397380E
Application number: PT02737552T
Authority: PT
Inventors: Beka Solomon
Original assignee: Univ Ramot
Priority date: 2001-06-20
Filing date: 2002-06-20
Publication date: 2007-04-30
Also published as: DE60217107T2; CA2450783A1; US20050053575A1; ES2279869T3; DE60217107D1; EP1397380A2; EP1397380B1; DK1397380T3; ATE349468T1; WO2003000719A8; WO2003000719A3; WO2003000719A2; AU2002310474A1

Description

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DESCRIÇÃO "PÉPTIDO DE ΑΝΤΙGÉNIO MÚLTIPLO QUE MOSTRA MÚLTIPLAS CÓPIAS DE UM EPÍTOPO DE UM POLIPÉPTIDO QUE FORMA UMA PLACA E MÉTODOS PARA UTILIZAR O MESMO"

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Campo da Invenção A presente invenção refere-se a um produto antigénico que apresenta péptidos de antigénios para induzir uma resposta imune eficaz para a prevenção ou a reabsorção de depósitos de uma doença que forma uma placa, tal como contra ο Αβ na Doença de Alzheimer.

Descrição da Técnica Relacionada A patologia da doença de Alzheimer (AD), a doença conformacional rttais estudada, é caracterizada principalmente por placas amilóides extracelulares e entrançados neurofibrilares intracelulares (Price et al., 1993). A relação entre estas lesões e o processo da doença tem sidc discutida há muito tempo. A teoria dominante corrente da etiologia e patogénese de AD está relacionada à hipótese de cascata amilóide (Hardy and Allsop, 1991; Selkoe, 1996; Hardy, 1997) os quais afirmam que a produção em excesso do péptido de β amilóide (ΑβΡ ou Αβ), ou o fracasso para limpar este péptido, leva ao AD principalmente através da deposição amilóide que está envolvido na formação dos entrançados neurofibrilares. Estas lesões são depois 2 associadas com a morte da célula que é reflectida na falha de memória, as marcas desta demência (Goate, 1991; Hardy et al., 1998). Ao longo de vários anos a hipótese de cascata amilóide ganhou força através da observação que as mutações causadas por AD foram identificadas na proteína precursora do β amilóide (ΑβΡ) e nos genes da presenilina (Sherrington, et al, 1995; Levy-Lahad, et al.t 1995).

Muitos investigadores estudaram a propensão do ΑβΡ ou dos seus fragmentos para se reunirem em agregados insolúveis (para revisão ver Maggio e Mantyh, 1996). Ao passo que o segmento hidrofóbico no domínio de terminal C do ΑβΡ desenvolve uma estrutura de cordão β em soluções aquosas, independentemente do pH ou das condições de temperatura, a região de terminal N pode apresentar conformações diferentes e propriedades de solubilidade dependendo das condições ambientais (Hollossi et al., 1989, Soto et al., 1995; Barrow e Zagorsky, 1991) . A região de terminal N parece fornecer os meios para os contactos interfibrilares, bem como para as interacções entre um filamento e outras proteínas ou estruturas celulares que se associam muitas vezes com deposições de β amilóide (Fraser et al., 1993). 0 domínio de terminal N contém sequências que permitem a existência de um equilíbrio dinâmico entre o hélice α e as conformações de cordão β. As perturbações do equilíbrio de vários estados conformacionais do péptido do β amilóide podem ser causadas por modificações de pH locais, alterações da hídrofobícidade ambiental, ou a ligação de outras proteínas (Soto et al., 1995; Kirschenbaum e Daggett, 1995).

Desagregação e prevenção in vitro de β amilóide fibrilar 3

Os filamentos amilóides, semelhantes aos encontrados em placas amilóides e amilóides cerebrovasculares, podem ser reunidos a partir do β péptido quimicamente sintetizado em condições experimentais bem definidas in vitro, e o efeito em células neurais pode ser neurotóxico ou neurotrófico, dependendo do β amilóide fibrilar (Lorenzo e Yanker, 1990; Howlett et al., 1995). Ά formação amilóide in vitro é um processo cinético e termodinâmico complexo e a reversibilidade do crescimento da placa amilóide in vitro sugere um equilíbrio de estado estável entre ο ΑβΡ em placas e em solução (Maggio e Mantyh, 1996). A dependência da polimerização dc ΑβΡ em interacções de péptido-péptido para formar um fibrilo de folha β dobrado e a influência de estímulo de outras proteínas na reacção sugerem que a formação amilóide pode ser sujeita a modulação. A pergunta essencial é como prevenir ou, melhor, como inverter as modificações conformacionais que resultam na formação do conformante da proteína patológica rica em folha β. Baseado no paradigma de mimetismo conformacional, foi suposto que os péptidos sintéticos pequenos, "mini acompanhantes", podem ser designados para interagir especificamente com o fragmento da proteína que está a sofrer as modificações conformacionais e seria útil na estabilização de uma conformação desejada por se adicionarem resíduos específicos que favorecem ou desfavorecem a adopção de um determinado motivo estrutural (Soto, 1999).

Recentemente, a aproximação imunológica no tratamento de doenças conformacionais ganhou maís atenção. As interacções de anticorpo-antigénio envolvem modificações conformacionais tanto no anticorpo como no antigénio que pode variar de insignificante a considerável. A ligação de anticorpos monoclonais de alta afinidade (mAbs) a regiões de alta flexibilidade e a antigenicidade podem alterar a dinâmica molecular do antigénio inteiro (Frauenfelder et ai., 1979; Karplus e Petsko, 1990).

Os mAbs apropriados interagem com locais estratégicos onde o desdobramento da proteína é iniciado, por meio disso estabilizando a proteína e prevenindo precipitação adicional (Solomon e Balas, 1991; Katzav-Gozansky et ai., 1996). Os anticorpos monoclonais foram verificados que estabilizam a conformação de um antigénio contra a dobragem incorrecta e reconhecem um epítopo incompletamente dobrado, induzindo a conformação nativa numa proteína parcialmente não dobrada (Blond & Goldberg, 1987; Carlson. e Yarmush., 1992; Solomon e Schwartz, 1995). 0 laboratório dos presentes inventores investigou um grande painel de mAbs contra várias regiões de ΑβΡ e verificou que só os mAbs dirigidos ao local em direcção às regiões de terminal N do péptido β apresentam propriedades de anti-agregação, sendo capazes de prevenir a formação amilóide e dissolver os agregados já formados. Os mabs 6C6 e 10D5 levantados contra a região de terminal N do ΑβΡ (resíduos 1-28) pode desagregar os fibrilos Αβ e restaurar a solubilidade do péptido. A ligação de tais anticorpos interferiu com interacções não covalentes entre os fibrilos amilóides e levou à deterioração da reunião amilóide fibrilar em uma forma amorfa, mesmo em proporções molares Αβ/péptido de 1:10-100. A prevenção da agregação do péptido, bem como a solubilízação dos agregados já formados, necessitou de uma proporção equimolar de Αβ/péptido, indicando o nível molecular dessas interacções (Solomon et al., 1996; Hanan e Solomon, 1996; Solomon et al., 1997). O efeito da neurotoxicidade foi verificado estar em correlação com a formação dos agregados de Αβ e com a extensão da estrutura da folha β (Pike et al., 1995). Os efeitos de Αβ na redução dos MTT em células PC 12 5 são conhecidos como ocorrendo em concentrações abaixo daqueles que resultam na morte da célula (Sladowsky et al., 1993) e representam primeiros marcadores do compromisso metabólico que no fim leva à degeneração celular. A ligação do mAb 6C6 ao amilóide β fibrilar previne a neurotoxicidade de Αβ, como medido pelo ensaio de MTT, devido à desagregação dos fibrilos de β amilóide.

Os métodos de engenharia do anticorpo foram aplicados para minimizar o tamanho dos mAbs (135-900 kDa) enquanto se mantém a sua actividade biológica (Winter et al., 1994). Estas tecnologias e a aplicação da tecnologia de PCR para criar grandes repertórios de gene de anticorpo fazem o fago do anticorpo apresentar um instrumento versátil para o isolamento e a caracterização dos anticorpos de cadeia singular Fv (scFv) (Hoogenboom et ai., 1998). Os scFvs podem ser expostos na superfície do fago para manipulação adicional ou podem ser libertados como um fragmento solúvel de scFv (~25 kd). 0 laboratório dos presentes inventores projectou um scFv que apresenta propriedades anti-agregativas semelhantes à molécula de IgM parental (Frenkel et ai., 2000a). Para a construção dos scFv, os genes de anticorpo do hibridoma 508 anti-ΑβΡ IgM foram clonados. 0 anticorpo segregado mostrou actividade específica em direcção à molécula de ΑβΡ na prevenção dos seus efeitos tóxicos em células PC 12 culturadas.

Os anticorpos Fv de cadeia singular ordenados por local são o primeiro passo em direcção aos anticorpos terapêuticos alvo no cérebro através de aproximações intracelulares ou extracelulares. A capacidade do anticorpo 508F (Fv) de cadeia singular para dissolver os fibrilos Αβ já formados sugere que só o antigénio que liga o 6 local dos anticorpos está envolvido na modulação da conformação de β amilóide. A sequência EFRH de terminal N do péptido β amilóide é o epitopo de anticorpos anti-agregativos A existência de sequências que são cineticamente envolvidas no processo de dobragem foi anteriormente sugerida em outros sistemas e foi demonstrada através de experiências ín vitro de desnaturação-renaturação (Silen e Agard, 1989) . Tais sequências, que podem desempenhar um papel no caminho da dobragem, sugerem a possibilidade a que elas servem não só para o processo de dobragem mas também podem contribuir para a estabilidade conformacional. A identificação dos "epítopos de agregação" como sequências que estão relacionadas aos locais onde a agregação da proteína é iniciada, e a preparação de anticorpos monoclonais contra estas regiões, facilita o entendimento e a prevenção dos processos de agregação da proteína. A desagregação bem como a prevenção de amilóide foram verificadas como sendo dependentes da posição dos epítopos no β amilóide e as características de ligação dos mAbs (Solomon et ai., 1997; Hanan e Solomon, 1996). A região de terminal N do β péptido foi sugerida como sendo o local imunodominante em ΑβΡ. Os mabs que se levantaram contra os fragmentos de ΑβΡ que compreendem os amino ácidos 1-16 no laboratório dcs presentes inventores demonstraram que esta região apresenta características antigénicas aumentadas comparadas com o resto do péptido β amilóide.

Utilizando o banco de fago-péptido, composto de fagos filamentosos 7 que apresentam péptidos combinatórios casuais, os resíduos de EFRH (SEQ ID NO: 5) localizados nas posições 3-6 do ΆβΡ de terminal N foram definidos como o epítopo de anticorpos anti-agregativos dentro do βΑΡ (Frenkel et al., 1998). 0 epítopo de EFRH (SEQ ID NO: 5) está disponível para a ligação do anticorpo quando o péptido de β amilóide está quer em solução ou é um agregado, e o bloqueamento deste epítopo por anticorpos afecta a dinâmica de todas as moléculas, prevenindo a auto-agregação bem como permitindo a resolubilização de agregados já formados. A identificação do epítopo do mAb 2H3, que não pode afectar a formação de β amilóide apesar do facto de se ligar ao péptido de β amilóide de terminal N, clarifica a importância desta região de sequência específica, definida como um epítopo de anti-agregação, no comportamento da molécula de ΑβΡ inteira (Frenkel et al., 1999).

Imunização contra ο β amilóide com o fago EFRH como antigénio 0 bloqueio do epítopo de EFRH (SEQ ID NO: 5) por anticorpos ordenados por local foi verificado para modular a dinâmica da agregação bem como a resolubilização de agregados já formados. No entanto, tais pequenos péptidos sintéticos, que consistem de epítopos de anticorpo, são antigénios geralmente pobres que necessitam da síntese química de um péptido e têm de ser acoplados a um grande portador, mas mesmo depois eles podem induzir uma resposta imune de baixa afinidade. Um novo procedimento de imunização para levantar os anticorpos anti-ΆβΡ, utilizando como antigénio os fagos filamentosos que apresentam só o péptido de EFRH (SEQ ID NO: 5) , foi desenvolvido no laboratório dos presentes inventores. Os bacteríofagos filamentosos têm sido extensivamente utilizados nos últimos anos para a 'apresentação' na sua superfície de grandes repertórios de péptidos gerados por se clonarem oligonucleótidos casuais na extremidade de 5' dos genes que codificam a proteína revestida de fago (Scott e Smith, 1990; Scott, 1992). Como recentemente relatado, os bacteriofagos filamentosos são veículos excelentes para a expressão e a apresentação de péptidos exteriores numa variedade de biológicos (Greenwood et al., 1993; Medynski, 1994) . A administração de fagos filamentosos induz uma resposta imunológica forte aos sistemas de efeitos de fago (Willis et al., 1993; Meola et al., 1995). As proteínas revestidas de fagos pIII e pVIII são proteínas que têm sido muitas vezes utilizadas para a apresentação de fagos. A aproximação do fago filamentoso recombinante para se obterem antigénios de péptido específicos tem uma vantagem principal sobre a síntese química, uma vez que os produtos obtidos são o resultado da fidelidade biológica do maquinísmo de translação e não são sujeitos aos níveis de pureza de 70-94 % comuns na síntese de fase sólida dos péptidos. O fago apresenta uma fonte facilmente renovável de antigénio, uma vez que o material adicional pode ser obtido pelo crescimento de culturas bacterianas. A imunização com o fago de apresentação de EFRH (SEQ ID NO; 5) pode, num período de tempo curto, levantar a concentração elevada dos anticorpos de elevada afinidade (IgG) capazes de prevenir a formação de β amilóide e de minimizar os efeitos tóxicos adicionais. O nível de anticorpo no soro foi verificado como esndo relacionado com o número de cópias de péptidos por fago (Frenkel et al., 2000b) .

Os anticorpos que resultam da imunização do fago de EFRH (SEQ ID NO: 5) são semelhantes no que se refere às suas propriedades imunológicas para anticorpos levantados por injecção directa com o β amilóide total (Tabela 1) . Estes anticorpos reconhecem o 9

comprimento completo do β péptido (1-40) e apresentam propriedades de anti-agregação como os anticorpos levantados contra o péptido de Αβ inteiro e/ou ο β amilcdde (Frenkel et al.r 2000b, 2001). A elevada imunogenicidade de fagos filamentosos permite o levantamento de anticorpos contra os auto-antigénios. A imunização de porcos da Guiné com o fago de EFRH (SEQ ID NO: 5) como um antigénio, no qual a sequência de ΑβΡ é idêntica à dos seres humanos, resultou na produção de auto-anticorpos (Frenkel et al., 2001) .

Tabela 1: Inibição competitiva por vários péptidos dentro de βΑΡ do anticorpo do soro levantado contra Í88-EFRH em comparação com o anticorpo* : de anti-agregação de amilóide. PÉPTIDO RESÍDUOS SORO DE RATO Anticorpo* de anti-agregação FRH (resíduos 4-6 de ΑβΡ) ~10“3 M 3 x IO-3 M' EFRH (resíduos 3-6 de ΑβΡ) e 6,0 x 10'6 M (SEQ ID NO: 5) 3 x 10'6 M DAEFRH (resíduos 1-6 de ΑβΡ) e 3,0 x IO’6 M 8 x 10~7 M (resíduos 1-6 de SEQ ID NO: 2) DAEFRHD (resíduos 1-7 de ΑβΡ) e (resíduos 1-7 de SEQ ID 5,0 x 10~6 M 9 x 1CT7 M NO: 2) DAEFRHDSG (resíduos 1-9 de ΑβΡ) e 5,0 x 10"6 M 1 x 10~6 M (SEQ ID NO: 2) βΑΡ ¢1-40) 3,0 x 10~6 M 8 x IO"7 M WVLD (SEQ ID NO: 3) Nd** Nd** * Frenkel et al,, 1998 ** Valor de IC50 ou menor do que 10'2 M que não pode ser detectado pelo ensaio de

ELISA 10

Os dados acima mencionados demonstraram que um bacteriofago recombinante que apresenta um auto-epitopo pode ser utilizado como uma vacina para induzir os auto-anticorpos para o tratamento da doença. Os fagos filamentosos são normalmente cultivados por se utilizar uma estirpe de laboratório de E. coli, e embora a estirpe que ocorre naturalmente possa ser diferente, é razoável assumir que a libertação do fago no intestino vai resultar em infecção da flora intestinal natural. O laboratório dos presentes inventores verificou que os fagos inactivados por UV são tão imunogénicos como as suas duplicações infectivas. Há evidência da longa duração dos fagos filamentosos nos intestinos dos animais imunizados que pode explicar a resposta imune de longa duração encontrada nos ratos imunizados com pílula (Zuercher et al., 2000).

Devido à elevada antigenicidade do fago, a administração pode ser dada pela via intranasal, a qual é a forma mais fácil para a imunização sem qualquer utilização de adjuvante. Como as modificações olfactivas são propostas para desempenhar um papel na doença de Alzheimer (Murphy, 1999) a imunização mucosal é uma indução eficaz dos anticorpos IgA de ΑβΡ específicos para prevenir o efeito patológico local da doença. A eficácia do antígénio do fago EFRH no levantamento de anticorpos de β amilóide de anti-agregação (Solomon e Frenkel, 2000) contra o β amilóide total mostra que: a. a elevada imunogenícidade do fago permite a produção de elevada titulação de anticorpos de IgG num período curto de semanas sem a necessidade da administração de adjuvante; b. a auto-expressão do antigénio levou à imunização de longa duração; 11 c. o papel-chave do epítopo de EFRH na formação do β amilóide e a sua elevada imunogenicidade levou aos anticorpos de anti-agregação que reconhecem o péptido do β amilóide total, substituindo a utilização dos fibrilos do β amilóide.

Desempenho de anticorpos anti β amilóides em modelo de ratos transgénicos de AD Vários laboratórios têm produzido ratos transgénicos que produzem A β e desenvolvem placas e danos de neurónios nos seus cérebros (revisto em Van Leuven, 2000) . Embora eles não desenvolvam a morte do neurónio comum e a demência grave vista na doença humana eles são usados como modelos para o estudo da doença de Alzheimer. A produção de anticorpos anti β amilóides, por imunização com ο Άβ fibrilar do modelo de rato de AD, leva à inibição da formação de placas amilóides e às neurites distróficas associadas no cérebro do rato (Schenk et al., 1999), e aumenta a capacidade prática da vacinação contra o AD. No entanto, por causa da imunogenicidade baixa dos fibrilos de Αβ, a administração de antigénio repetida na presença de adjuvante é necessária para se obterem os anticorpos anti-ΑβΡ necessários para afectar a formação da placa. Além disso, a imunização com fibrilos tóxicos pode induzir mais acumulação do próprio amilóide tóxico. Um outro conjunto de experiências mostrou que a administração periférica de anticorpos contra o péptido de β amilóide foi suficiente para reduzir a carga de amilóide nos cérebros de ratos afectados (Bard et al., 2000). Apesar dos seus niveis de soro relativamente modestos, os anticorpos passivamente administrados foram capazes de entrarem no sistema nervoso central, depurar as placas e induzir a libertação do amilóide pré-existente. As pequenas quantidades de tais anticorpos que cruzam a barreira do 12 cérebro - sangue (0,1 % de níveis de soro) poderiam ser suficientes para atenuar a agregação adicional destas espécies em placas coradas densas de Αβ fibrilar. Como este conjunto de Αβ é pequeno, e porque os anticorpos para esta forma de Αβ só poderiam ter de inibir a reunião de fibrilos de Αβ para ter um efeito funcional, estes anticorpos não têm necessariamente de causar grandes modificações no Αβ cerebral total. Estes anticorpos convertem ο Αβ, as placas coradas densas, para difundir os depósitos de Αβ.

Por comparação, dos anticorpos testados só os mAbs 10D5, 3D6 e PabAPi-42, dirigidos às regiões de terminal N do ΑβΡ demonstraram a eficácia in vivo. Em contraste os mAbs 16C11, 21F12 e o anticorpo de controlo TM2a, dirigidos a outras regiões de ΑβΡ, foi inactivos. Este resultado é compatível com a incapacidade destes dois anticorpos de depurar as placas depois da administração in vivo e explica a sua incapacidade de provocar a libertação da placa (Bard et ai., 2000). Estes dados in vivo confirmam os dados prévios in vitro (Solomon et ai., 1996; 1997) que só os anticorpos dirigidos a epítopos estratégicos, tais como o EFRH (SEQ ID NO: 5), apresentam as assim chamadas propriedades 'semelhantes a acompanhantes' na dissolução das placas e na prevenção da sua formação. Estes dados também confirmam que só uma pequena quantidade de anticorpos é necessária para interferir com as interacções não covalentes entre os fibrilos de ΑβΡ para desagregá-los em uma configuração não tóxica amorfa.

Os modelos dos animais apropriados foram usados para testar os efeitos dos anticorpos de anti β amilóides tanto no dano cerebral como nas perdas cognitivas causadas pela doença de Alzheimer. De facto, a imunização com o péptido de β amilóide melhora a aprendizagem e a memória, bem como diminui o dano cerebral em 13 modelos de ratos (Janus et al., 2000; Morgan et al., 2000; Chen et al., 2000). Os resultados apoiam uma redução anteríormente observada na formação de depósitos de amílóide mas eles vão além disso mostrar que a imunização também ofereceu aos ratos um pouco de protecção dos défices de aprendizagem 'espacial' que normalmente acompanham a formação da placa. Ambos os grupos sugerem que quer uma redução pequena ou selectiva no depósito de (3 amílóide pode ser suficiente para proteger contra a demência. Cada grupo usou testes diferentes da memória espacial, na qual os ratos tiveram de nadar e subir a uma plataforma localizada invisivelmente abaixo da superfície de um conjunto de água. É notável que ambos os grupos verificaram que a imunização com o péptido de β amílóide oferece a protecção significativa do défice de desempenho dependente da idade e do amílóide visto em controlos não imunizados. A evidência dos defeitos da aprendizagem que dependem da idade (e estão associados com a acumulação crescente do péptido β amílóide) foi comprovada em um dos principais modelos de rato com a doença de Alzheimer (Chen et al. 2000). Os autores mostram que estes defeitos podem ser distinguidos do défice independente da idade, mas só por plano e análise experimental cuidadoso.

Estas descobertas indicam que o excesso de expressão de Αβ e/ou as placas de Αβ estão associadas com a função cognitiva perturbada e, mais importante, sugerem que algumas mas não todas as formas de aprendizagem e de memória são ensaios comportamentais convenientes do défice cognitivo progressivo associado com o tipo de patologia da doença de Alzheimer. O mecanismo pelo qual os anticorpos anti β amilóides bloqueiam o défice de aprendizagem e de memória não é entendido. Uma possibilidade é a de que os anticorpos neutralizam ο Αβ em algum 14 compartimento restringido ou esgotam uma forma não depositada de Αβ (por exemplo, uma forma solúvel) que é responsável pela perda da memória observada (Morgan et al.r 2000). Recentemente, ο Αβ solúvel tem sido proposto como a causa da perda de sinapse em ratos transgénicos com ΑβΡ, uma vez que algumas linhas transgénicas desenvolvem reduções na imunoreactividade da sinaptofisina em circunvoluções dentadas sem desenvolverem depósitos de Αβ. Uma segunda possibilidade é a de que a microglia activada pelos anticorpos pode compensar ο Αβ depositado, permitindo por esse meio a função cognitiva normal. Uma explicação alternativa é a de que a imunização afecta ο Αβ em uma determinada conformação, como as formas de β folhas em protofibrilos. O anterior é mais provável por causa da reuniões oligoméricas de Αβ em β folhas ('protofibrilos') como um imunogénio, e os antisoros resultantes de um modo preferido reconheceram as formas de β folha do Αβ. Isto é significativo porque os anticorpos monoclonais levantaram os epitopos de Αβ que iniciam a reunião de inibição da agregação de fibrilo de protofibrilos oligoméricos de Αβ sintético in vitro (Solomon et ai., 1996). É possível, por isso, que os anticorpos induzidos nos ratos transgénicos possam ligar-se a agregados oligoméricos de β folha e inibam a reunião adicional. Esta espécie de Αβ é especialmente neurotóxica, um intermediário crítico na fibrilogenese e um prognosticador exacto da neurodegeneração. É concebível, no entanto, que a imunização poderia modular o metabolismo do Αβ através de vários mecanismos distintos, incluindo a destruição de Αβ por fagocítose microglial (Schenk et al.r 1999) ou por função determinante do anticorpo para activar os receptores Fc capazes de retirar o ímunocomplexo ο Αβ fibrílar com anticorpos ordenados por local. 15 A patente norte americana No. 5 229 490 descreve um produto antigénico que compreende um homopolímero dendítrico que contém resíduos monoméricos, em que uma pluralidade de sequências de proteína antigénicas são juntas por ligações covalentes (MAPS) . Este produto antigénico, adequado para vacinas contra várias doenças infecciosas, fornece um portador alternativo aos portadores naturais tais como as proteínas, os hidratos de carbono, os lípidos ou os lipossomas.

No entanto este documento não se refere à utilização de tais produtos para o tratamento de doenças que formam placas tais como a doença de Alzheimer.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção fornece um produto antigénico que inclui um péptido de antigénio múltiplo (MAP) que contém uma pluralidade de um epítopo de um polipéptido que forma depósito envolvido numa doença ou perturbação que forma placa tal como a doença de Alzheimer. Este MAP é baseado num polímero dendrítico construído numa molécula principal que é pelo menos bifuncional/difuncional e que contém até 16 grupos funcionais terminais aos quais um péptido de antigénio que compreende um epítopo β amilóíde compreende a sequência de amino ácido SEQ ID NO: 5 é junto por ligações covalentes. A presente invenção também fornece uma composição de imunização que contém o produto antigénico de acordo com a presente invenção como um ímunogénio.

Um outro aspecto da presente invenção fornece além disso um método para induzir uma resposta imune contra um polipéptido que forma depósito envolvido numa doença que forma placa por se administrar o produto antigénico da presente invenção. A resposta imune induzida é eficaz para a prevenção, a inibição da formação, e/ou a reabsorção de depósitos de uma doença que forma placa, tal como contra ο Αβ na Doença de Alzheimer.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A figura 1 mostra uma representação esquemática de uma forma de realização de um péptido de antigénio múltiplo (MAP) numa resina de Wang homo octa-ramifiçada. A seta representa o local de clivagem e o YYEFRHDS sombreado (SEQ ID NO: 1) é a sequência do péptido de antigénio. A figura 2 mostra uma linha de tempo em semanas para as injecções e hemorragias na imunização e a monitorização de ratos imunizados com o produto antigénico MAP-YYEFRHDS (SEQ ID NO: 1). A figura 3 mostra um gráfico das titulações de imunoglobulínas no dia 22 de uma primeira hemorragia depois de uma segunda injecção do MAP-YYEFRHDS (SEQ ID NO: 1). A figura 4 mostra um gráfico das titulações de IgG e IgM nos soros de ratos imunizados por ELISA contra o epitopo de EFRH (SEQ ID NO: 5) no dia 26 de uma segunda hemorragia depois de uma segunda injecção de MAP-YYEFRHDS (SEQ ID NO: 1). A figura 5 mostra um gráfico das titulações de IgG nos soros de ratos imunizados no dia 70 de uma segunda hemorragia depois de uma terceira injecção de MAP-YYEFRHDS (SEQ ID NO: 1). 17 A figura 6 mostra um gráfico das titulações de IgG nos soros de ratos imunizados no dia 105 de uma terceira hemorragia depois de uma terceira injecção de MAP-YYEFRHDS (SEQ ID NO: 1). A figura 7 mostra uma comparação das titulações de IgG em soros de rato 17 semanas depois da terceira injecção de MAP-YYEFRHDS (SEQ ID NO: 1). A figura 8 mostra uma representação esquemática de uma outra forma de realização de um péptido de antigénio múltiplo numa resina Wang homo octa-ramifiçada. A seta representa o local de clivagem e a sequência do péptido de antigénio YEFRHYEFRH (SEQ ID NO: 4) tem uma repetição da sequência do epitopo Αβ de EFRH (SEQ ID NO: 5) . Este MAPA também é conhecido como MAP-(EFRH)2. A figura 9 mostra uma linha de tempo em semanas para injecções e hemorragias na imunização e na monitorização de ratos imunizados com 0 produto antigénico MAP-YEFRHYEFRH (SEQ ID NO: 4) mostrado na Fig. 8 ou o complexo entre a estreptavidina e o MAP biotinilado mostrado na Fig. 11. A figura 10 mostra um gráfico das titulações de IgG no soro de ratos depois da imunização com o MAP-YEFRHYEFRH (SEQ ID NO: 4). A figura 11 mostra uma representação esquemática de um complexo entre a estreptavidina e o MAP biotinilado. A figura 12 mostra um gráfico das titulações de IgG no soro de ratos depois da imunização com o complexo entre a estreptavidina e o MAP-YYEFRHDS biotinilado (SEQ ID NO: 1) como uma forma de realização do complexo mostrado na Fig. 11. 18 A figura 13 mostra uma representação esquemática de ainda uma outra forma de realização de um péptido de antigénio múltiplo numa resina Wang homo tetra-ramifiçada. Oito cópias da sequência do péptido de antigénio PrP (144-152) está presente no MAP e é mostrado como DYEDRYYRE (SEQ ID NO: 6). A figura 14 mostra um gráfico das titulações de IgG contra a sequência do péptido de antigénio PrP (144-152) de SEQ ID NO: 6. Dois ratos foram imunizados cinco vezes com o antigénio de MAP que tem oito cópias de SEQ ID NO: 6 como a sequência de péptido de antigénio, que é a parte do hélice 1 de PrP. A primeira imunização incluiu o adjuvante de Freund completo ao passo que as imunizações subsequentes incluíram adjuvantes de Freund incompletos. 0 nível de anticorpo foi medido utilizando o ensaio de ELISA.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção é baseada na descoberta de que um péptido de antigénio múltiplo que transporta uma multiplicidade do epítopo de EFRH (SEQ ID NO: 5) de ΆβΡ tinha causado uma resposta imunológica inesperadamente superior comparada com a obtida através da imunização quer com o comprimento completo de ΆβΡ ou com o epítopo de EFRH (SEQ ID NO: 5) exposto na superfície de um bacteriófago filamentoso na variação de centenas a milhares de cópias por fago. Em vista desta resposta imunológica inesperadamente superior aos epítopos de EFRH (SEQ ID NO: 5) num múltiplo sistema de péptido de antigénio, a presente invenção é destinada para abranger largamente os produtos antigénicos que transportam múltiplas cópias de um epítopo de um polipéptído que forma depósito envolvido numa doença que forma placa num múltiplo sistema de péptido de antigénio. 19

Tal como aqui utilizado na especificação e na secção das reivindicações que se seguem, o termo "doença que forma placa" refere-se a doenças caracterizadas pela formação de placas por uma proteína de agregação (péptido que forma], tal como, mas não limitado a, beta-amilóide, soro de amilóide A, cistantina C, cadeia linear de kappa IgG, ou a proteína prião (PrP), em doenças tais como, mas não limitados a, ataque prematuro da doença de Alzheimer, ataque tardio da doença de Alzheimer, doença de Alzheimer presintomátíca, amiloídose de SAA, síndroma Isiandesa hereditária, senilidade, mieloma múltiplo, e a encefalopatias esponjiformes transmissíveis (TSE), também conhecidas como doenças de prião que são conhecidas por afectarem os seres humanos, tais como por exemplo, doença de Kuru, doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD), doença de Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS), e insónia familiar fatal (FFI) ou em animais, tais como, por exemplo, a encefalite espongíforme bovina e cenurose (BSE). 0 produto antigénico de acordo com a presente invenção é estruturalmente baseado num polímero dendrítico no qual os antigénios/epítopos são covalentemente ligados às ramificações que irradiam de uma molécula principal. Estes polímeros dendríticos são caracterizados por concentrações mais elevadas de grupos funcionais por unidade de volume molecular do que os polímeros vulgares. Geralmente, eles são baseados sobre duas ou mais ramificações idênticas originárias de uma molécula principal que tem pelo menos dois grupos funcionais. Tais polímeros foram descritos por Denkewalter et al. na patente norte americana N°. 4 289 872, e por Tomalia et al. em várias patentes norte americanas incluindo as patentes norte americanas N°s. 4 599, 400 e 4 507 466. Outros polímeros da classe foram descritos por Erickson na patente norte americana No. 4 515 920. Os polímeros são muitas vezes referidos 20 como polímeros dendríticos porque a sua estrutura pode ser simbolizada como uma árvore com um tronco de núcleo e várias ramificações. Diferentemente de uma árvore, no entanto, as ramificações nos polímeros dendríticos são todas substancialmente idênticas. Este sistema dendrítico foi denominado o sistema de péptido de antigénio múltiplo (MAPS), o qual é o nome usualmente utilizado para a um portador de antigénio/antigénio de combinação que é composto de duas ou mais, normalmente idênticas, moléculas antigénicas covalentemente ligadas a um núcleo dendrítico que é composto de unidades principais as quais são pelo menos bifuncionais/difuncionais. Cada unidade bifuncional numa ramificação fornece uma base para o crescimento adicionado. O núcleo dendrítico de um sistema de péptido de antigénio múltiplo pode ser composto de moléculas de lisina. Por exemplo, uma lisina é ligada através de ligações de péptido através de cada um dos seus grupos amino a duas lisinas adicionais. Esta segunda molécula de geração tem quatro grupos amino livres cada um dos quais pode ser covalentemente ligado a uma lisina adicional para formar uma terceira molécula de geração com oito grupos amino livres. Um péptido pode ser ligado a cada um destes grupos livres para formar um antigénio de péptido múltiplo octavalente (MAP). O processo pode ser repetido para formar quartas ou mesmo mais elevadas gerações de moléculas. Com cada geração, o número de grupos amino livres aumenta geometricamente e pode ser representado por 2nf em que n é o número da geração. Alternativamente, a molécula de segunda geração que tem quatro grupos amino livres pode ser usada para formar um MAP tetravalente, isto é, um MAP que tem quatro péptidos covalentemente ligados ao núcleo. Muitas outras moléculas, incluindo, por exemplo, o ácido aspártico e o ácido glutâmico, ambos os quais têm dois grupos de carboxilo e um grupo amino para produzir os ácidos poliaspártico ou poliglutâmico com grupos de 21 carboxilo livres 2n, podem ser usados para formar o núcleo dendritico de um sistema de péptido de antigénio múltiplo.

Como será evidente da discussão a partir daqui, alguns dos portadores ou moléculas principais usados para formar o produto da presente invenção são de um peso molecular tal que eles não poderiam ser normalmente considerados como polímeros. No entanto, uma vez que a sua estrutura básica é semelhante aos polímeros dendríticos, é conveniente descreve-los como tal. Por isso, o termo "polímero dendritico" será algumas vezes usado aqui para definir o produto da invenção. 0 termo inclui moléculas portadoras que são suficientemente grandes para serem consideradas como polímeros bem como aquelas que podem conter unicamente três monómeros. A química necessária para executar a síntese dos polímeros dendríticos é conhecida e disponível. Com os amino ácidos, a química para bloquear os grupos funcionais que não devem reagir e depois remover os grupos de bloqueio quando se deseja que os grupos funcionais devem reagir tem sido descrita em detalhe em numerosas patentes e artigos na literatura técnica. Os polímeros dendríticos e o MAP inteiro podem ser produzidos numa resina como na síntese de Merrifield e depois retirados do polímero. Tomalia utilizou a amónia ou etilenodiamína como a molécula principal. Neste procedimento, a molécula principal é feita reagir com um éster de acrilato através da adição de Michael e os grupos de éster retirados por hidrólise. As moléculas de primeira geração resultantes contêm três grupos de carboxilo livres no caso da amónia e quatro grupos de carboxilo livres quando é empregue etilenodiamína. Tomalia estende o polímero dendritico com etilenodiamína seguido por um outro monómero de éster acrílico, e repete a sequência até o peso molecular desejado ter sido 22 alcançado. Será, no entanto, rapidamente evidente para um especialista na técnica, que cada ramificação do polímero dendrítico pode ser alongada por qualquer de vários procedimentos seleccionados. Por exemplo, cada ramificação pode ser estendida por múltiplas reacções com moléculas de lisina.

Erickson utilizou a técnica clássica de Merrifield na qual um polipéptido substancialmente de qualquer peso molecular desejado é cultivado a partir de um suporte de resina sólido. Como a técnica é utilizada para a preparação de polímeros dendríticos, a molécula de ligação que junta o polímero ao suporte de resina é trifuncional. Um dos grupos funcionais está envolvido na ligação à resina, os outros dois grupos funcionais servem como o ponto de partida para o crescimento do polímero. 0 polímero é retirado da resina quando o peso molecular desejado foi obtido. Um procedimento de clivagem padrão é o tratamento com o fluoreto de hidrogénio líquido a 0 °C durante uma hora. Um outro procedimento, e o mais satisfatório, é utilizar um complexo de fluoreto de hidrogénio e dimetilsulfeto (HF: DMF) como descrito por Tam et al. (1983). Este procedimento minimiza muito as reacções colaterais e a perda do péptido.

Denkewalter, num exemplo do seu processo, utiliza a lisina como a molécula principal. Os grupos amino da molécula principal são bloqueados pela conversão a grupos de uretano. 0 grupo de carboxilo é bloqueado pela reacção com benzidrilamina. A hidrólise dos grupos de uretano gera uma benzidrilamida de lisina com dois grupos amino livres que servem como os pontos de partida para o crescimento do polímero dendrítico. Este breve traçado de três dos procedimentos disponíveis para a produção de polímeros dendríticos deve ser adequado para ensinar aos especialistas na técnica os princípios básicos da tecnologia corrente. Eles também ensinarão ao técnico 23 especialista as caracteristicas salientes dos polímeros, um dos mais importantes dos quais é que os polímeros fornecem um grande número de grupos funcionais disponíveis num pequeno volume molecular. 0 resultado é que uma alta concentração de antigénios num pequeno volume pode ser conseguida por se juntar o antigénio àqueles grupos funcionais disponíveis. Além disso, o produto molecular resultante contém uma alta proporção de antigénios num portador relativamente pequeno, isto é, a proporção do antigénio em relação ao portador é bastante alta. Isto está em contraste com os produtos convencionais usados como uma base para as vacinas. Esses produtos convencionais muitas vezes são compostos de uma pequena quantidade de antigénio numa grande quantidade de portador.

Outras caracteristicas importantes do polímero dendrítico como um portador de antigénio são que a estrutura exacta é conhecida; não há nenhuns contaminantes que possam eles próprios ser antigénicos, produzir a irritação de tecido ou outras reacções indesejáveis; a concentração exacta do antigénio é conhecida; o antigénio é simetricamente distribuído no portador; e o portador pode ser utilizado como uma base para mais do que um antigénio para que as vacinas multivalentes possam ser produzidas. A vantagem principal dos MAPS desta invenção como a base para as vacinas é que diferentemente de sistemas prévios que usam portadores naturais tais como a hemocianina retirada às lapas, o toxóide de tétano e a albumina de soro de bovino, os portadores desta invenção são entidades químicas totalmente definidas nas quais os antigénios são dispersos em concentrações conhecidas. Adicionalmente, o antigénio compreende uma grande parte da molécula, não uma proporção relativamente pequena e indefinida da molécula, como no caso de portadores naturais

Em adição ao polímero dendrítico como um portador, uma molécula de estreptavidína ou de avídina pode ser usada para estender adicionalmente o tamanho do produto antígénico e por isso evitar a utilização de adjuvantes em conjunto para a imunização e também oferecer a capacidade de fornecer uma pluralidade de MAP numa molécula singular. A estreptavidína e a avidina são proteínas tetraméricas que transportam um local de ligação de bíotina por monómero e por isso são capazes de ligar até quatro moléculas de bíotina. A característica multivalente da estreptavidína ou da avidina pode ser usada para formar um complexo com um a quatro MAPS biotinilados como um grande produto antígénico. 0 número de locais de bíotina ligados com o MAP biotinilado pode ser ajustado por se fazer variar a proporção molar da estreptavidína (ou da avidina): MAP biotinilado, tal como 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 ou MAP biotinilado em excesso. Isto vai permitir que um, dois, três, ou quatro MAP biotinilados sejam ligados no complexo com a estreptavidína ou a avidina. Depois da ligação de MAP biotinilado à estreptavidína ou à avidina, quaisquer locais de ligação da bíotina livre na estreptavidína ou na avidina podem ser bloqueados com a biotina. A Fig. 11 mostra um complexo de estreptavidína com quatro MAP octavalentes biotinilados.

Pode ser que o número de epítopos de um polipéptido que forma depósito envolvido numa doença ou perturbação que forma placa no produto antígénico da presente invenção pode afectar como forte uma resposta imune é gerada pela imunização com o produto antígénico. Isto pode explicar por que a presença de dois epítopos por péptido antígénico em um MAP octavalente (para um total de 16 epítopos) no Exemplo 2 levantou uma reacção imune mais forte do que o MAP octavalente no Exemplo 1 (para um total de 8 epítopos) . Como a resposta imune eliciou pela estreptavidína: o complexo de MAP do 25

Exemplo 3, que transporta um total de cerca de 32 epítopos por produto antigénico da presente invenção, parece ser mais baixo do que a resposta imune levantada pelo MAP octavalente do Exemplo 2 com 15 epitopos totais, o número óptimo de epitopos por produto antigénico pode estar na variação de maior do que oito mas menor do que 32. Embora ainda não tenha sido testado, o presente inventor espera que um complexo de estreptavidina com quatro MAPs tetra-ramíficados que têm um total de 16 epitopos seria equivalente a um complexo de estreptavidina com dois MAPs octa-ramifiçados que têm um total de 16 epitopos desde que os epitopos nos MAPs tetra e octa-ramifiçados sejam iguais.

Como aqui utilizado, o termo "biotina" ou "biotinilado" é destinado a abranger a biotina, a biocitina e outros análogos da biotina tais como o éster de N-hidroxisuccinimida de caproato de amido de biotina, ácido 4-amidobenzóico de biotina, hidrazida de caproílo de biotinamida e outros derivados e conjugados de biotina. Outros derivados incluem a biotina-dextrano, éster de biotina-disulfeto-N-hidroxisuccinimida, quinolina de amido de biotina-6, hidrazida de biotina, éster de d-biotin-N-hidroxisuccinimida, maleimida de biotina, éster de p-nitrofenilo de d-biotina, nucleótidos biotinilados e amino ácidos biotinilados tais como N-epsilon-biotinil-1-1isina.

Os termos "estreptavidina" e "avidina" como aqui utilizados são destinados a abranger a avidina da glicoproteina da clara de ovo nativa e formas deglicosiladas de avidina ou de estereptavidina, estreptavidinas produzidas por estirpes seleccionadas de Streptomyces, por exemplo, Streptomyces avídinii, quer nas suas formas nativas de 72 kDa ou de 5260 kDa truncadas estáveis, avidina ou estreptavidina recombinante ou quimicamente sintetizada, as suas 26 variantes com substituições de amino ácidos, os seus derivados com modificações quimicas, e os seus fragmentos enquanto que a tal "estreptavidina" ou "avidina" ainda vão acomodar a ligação de biotina. Alguns destes materiais estão comercialmente disponíveis, por exemplo, a avidina nativa, as avidinas e estreptavidínas deglicosiladas, ou podem ser preparados por métodos bem conhecidos (ver Green 1975 para a preparação de avidina e estreptavidina; Bayer et al. 1995, para a preparação de avidina deglicosilada). A avidina recombinante e a estreptavidina recombinante podem ser preparadas por técnicas de ADN recombinante padrão, por exemplo, como descrito por Chandra e Gray, 1990, e por Argarana et al., 1986, para a avidina recombinante e estreptavidina recombinante, respectivamente. Um derivado daa avidina, a EXTRAVIDINA pode ser obtido em várias formas funcionalmente derivatizadas ou conjugadas da firma Sigma Chemical Company (St. Lcuis, MO) . Um outro exemplo de um derivado da avidina é a NEUTRALITEAVIDINA (Belovo Chemicals, Bastogne, Belgium), uma forma deglicosilada da avidina, a qual foi obtida enzimaticamente, apresenta um pi neutro, e grupos de lisina livres de marcação para derivatização adicional.

Quando os MAPS são para ser empregues para produzir uma vacina, também aqui mencionada como uma composição de imunização, é preferido que a molécula principal seja um amino ácido que ocorre naturalmente tal como a lisina para que possa ser tratada pelo corpo depois dos caminhos metabólicos habituais. No entanto, como será explicado mais completamente a partir daqui, os amino ácidos que não ocorrem naturalmente, mesmo aqueles que não são a-amíno ácidos podem ser empregues. Os ácidos, ou quaisquer outras moléculas assimétricas usadas na criação da molécula principal podem estar quer na forma de L ou de D. 27

Embora os polímeros dendríticos tenham sido principalmente descritos mais acima como polímeros de poliamida, será rapidamente evidente que os portadores desta invenção não são limitadas às poliamidas dendríticas. Alguma de uma larga variedade de moléculas que têm pelo menos dois grupos funcionais disponíveis pode servir de moléculas principais. 0 propileno glicol, por exemplo, pode servir como a base para um polímero dendrítico de poliéster. 0 ácido succínico com glicóis ou aminas seleccionados pode servir como uma molécula principal para gerar poliésteres ou poliamidas. Os diisocianatos podem ser usados para gerar poliuretanos. 0 ponto importante é que a molécula principal tem pelo menos dois grupos funcionais disponíveis a partir dos quais as ramificações idênticas podem ser geradas por reacções de tipo de armação sequencial com moléculas adicionais que também têm pelo menos dois grupos disponíveis funcionais ou de âncora em cada ramificação. No caso mais simples no qual a molécula principal tem dois grupos funcionais disponíveis e cada geração de continuação tem dois grupos funcionais disponíveis, o número de locais de âncora aos quais as moléculas de antigénio podem ser ancoradas é expressas por 2n, em que n é o número da geração.

Para uma discussão mais completa da química dos polímeros dendríticos, a atenção é dirigida para Tomalia et al. (1985), Aharoni et al. (1982), e para as patentes norte americanas seguintes Nos. 4 289 872; 4 558 120; 4 376 861; 4 568 737; 4 507 466; 4 587 329; 4 515 920; 4 599 400; 4 517 122; e 4 600 535. A invenção presente, nas suas formas de realização presentemente preferidas, fornece um sistema de péptido de antigénio múltiplo que compreende uma base de polímero dendrítico com uma pluralidade de locais de âncora covalentemente ligados a moléculas antigénicas as 28 quais podem ser iguais ou diferentes. Os polímeros compreendem uma molécula principal central que tem pelo menos dois grupos funcionais aos quais as ramificações moleculares que têm grupos funcionais terminais são covalentemente ligadas. Os grupos funcionais terminais nas ramificações são covalentemente ligados a moléculas antigénicas, principalmente descritas aqui como antigénios de péptidos. O antigénio seleccionado pode ser separadamente sintetizado ou de outra maneira obtido e junto ao portador. Alternativamente, o antigénio pode ser sintetizado no portador. Por exemplo, se o antigénio é um oligopéptido ou um polipéptido de peso molecular relativamente baixo, e os grupos funcionais disponíveis no polímero são grupos amino ou grupos de carboxilo, o antigénio pode ser sintetizado por se estender cada ramificação do polímero utilizando técnicas de síntese de péptido conhecidas. A Fig. 1 mostra a estrutura de um polímero dendrítico de MAP numa resina que pode ser empregue na prática desta invenção. Como será visto, é um produto de polílisina dendrítico de três gerações. Pode ser obtido comercialmente, por exemplo, como uma resina de Wang octa-ramificada ou tetra-ramif içada com um núcleo de MAP de um número de fornecedores, isto é, Advanced ChemTech, Inc. Louisville, KY, ou pode ser produzido por técnicas de fase sólida convencionais por se gerar o polímero numa resina de Pam ou de Pop. Ver Mitchell et aí, (1978) e Tam et al, (1980) . O polímero é depois clivado da resina utilizando, de um modo preferido HF: DMS. A polílisina dendrítica, foi construída a partir de um ligante de glicina originalmente junto através de um ligante de benzilo à resina. Outros ligantes tais como a alanina podem ser empregues. Naturalmente, o ligante pode ser omisso, como mostrado na Fig. 1, 29 ou uma pluralidade de moléculas ligantes pode ser utilizada. A Fig. 1 mostra um antigénio de péptído junto directamente a cada um dos grupos funcionais disponíveis em cada fracção de lisina terminal. No caso quando o antigénio é um péptido relativamente curto, por exemplo, de 6 a 14 resíduos, pode ser útil estender a polilisina através de um ligante tal como um simples tri ou tetrapéptido de glicina, de alanína oude beta alanina. No entanto, para os péptidos antigénicos com mais do que 14 resíduos, o ligante é normalmente desnecessário.

Uma forma de realização preferida de um produto antigénico, em que um antigénio de péptido é junto a cada um dos grupos funcionais disponíveis em cada fracção de lisina num MAP octavalente, é mostrada na Fig. 8. Este MAP-YEFRHYEFRH (SEQ ID NO: 4) mostrado na Fig. 8 também é mencionado aqui como MAP-(EFRH)2 porque ele tem o epítopo de EFRH (SEQ ID NO: 5) repetido duas vezes no antigénio do péptido. Como demonstrado no Exemplo 2, este produto antigénico produziu uma forte resposta imune e é, por isso, uma forma de realização preferida da presente invenção.

Adícionalmente divulgado é de um produto antigénico em que um antigénio de péptido PrP (144-152) (SEQ ID NO: 6) é junto a cada um dos grupos funcionais disponíveis em cada fracção de lisina num MAP octavalente, que é mostrado na Fig. 13. Como demonstrado no Exemplo 4, este produto antigénico também produziu uma resposta imune forte e é mencionado só para objectivos ilustrativos. A presente invenção foi descrita para conveniência, principalmente como aplicada a produtos construídos em lisina como a molécula principal. De facto a lisina e as moléculas semelhantes à lisina 30 tais como a ornitina, a nor-lisina e a alanína aminc são moléculas preferidas para construir o produto desta invenção porque eles são relativamente fáceis de se obter, são fáceis de trabalhar, e produzem bons rendimentos. Tais moléculas principais podem ser representadas pela fórmula geral:

HjN—(CHj)*

(ÇHa)jr~NHj -C—(CHi),—COOH

I H em que x, y e z são números inteiros de 0 a 10, de um modo preferido de 0 a 4 desde que pelo menos um deles seja 1 e os grupos amino não podem ser ligados ao mesmo átomo de carbono. Nas moléculas mais preferidas, o total de x, y e z é de 2 a 6 e os grupos amino são separados pelo menos por dois grupos de metileno.

Outras moléculas principais preferidas incluem a diamina de etileno e como moléculas com cadeias mais longas tais como diamina de propileno e diamina de butileno. Tais moléculas podem ser representadas pela fórmula geral H2N-CH2-(CH2)n-CH2-NH2 em que n é um número inteiro de 0 a 10, de um modo preferido de 0 a 3. Naturalmente a amónia também pode ser empregue como uma molécula principal. 0 desenvolvimento de vacinas sintéticas contra um grande número de doenças tem sido muito acelerado por causa do reconhecimento que uma vacina não tem de ser baseada numa proteína nativa, mas pode 31 ser baseada num segmento de peso molecular baixo da proteína nativa. Estes segmentos, normalmente chamados determinantes ou epítopos imunogénicos são capazes de estimular a produção de anticorpos que vão proteger contra, por exemplo, a infecção por um vector infeccioso do antigénio da proteína nativa. Os determinantes imunogénicos são péptidos de peso molecular muitas vezes baixo que podem ser convenientemente sintetizados. Se eles não puderem ser sintetizados, eles podem ser separados na forma pura da própria proteína nativa. A partir daqui, estes imunostimulantes antigénicos vão ser referidos como péptidos antigénicos.

As formas de realização principais desta invenção podem ser largamente definidas como produtos antigénicos que compreendem uma molécula principal dendrítica ou polímero ao qual uma pluralidade de antigénios tais como os péptidos antigénicos que contêm os epítopos de um polipéptido que forma depósito envolvido numa doença ou perturbação da formação de depósito de placa são covalentemente ligados aos grupos funcionais disponíveis. Os antigénios ou os epítopos podem ser diferentes, embora de um modo preferido os antigénios ou os epítopos sejam iguais.

Mais especificamente, as formas de realização principais da invenção podem ser definidas como produtos antigénicos ou sistemas de portadores que compreendem uma base de polímero dendrítico o qual é uma molécula principal central que tem pelo menos dois grupos funcionais disponíveis aos quais as ramificações de comprimentos seleccionados são juntos. Cada ramificação da molécula termina pelo menos com um grupo funcional, de âncora, disponível, uma pluralidade dos quais são convalentemente ligados a moléculas antigénicas. 32 0 péptído antigéníco que é covalentemente junto aos grupos funcionais terminais disponíveis no polímero dendrítico contém pelo menos uma cópia de um epítopo de um polipéptido que forma depósito, isto é, ο β amilóide que compreende a sequência de amino ácido de SEQ ID NO: 5, envolvido na formação de depósitos em doenças ou perturbações que formam placa. 0 exemplo não restritivo de doenças ou perturbações que formam placa inclui ataque precoce da doença de Alzheimer, o ataque tardio da doença de Alzheimer, a doença de Alzheimer presintomática, a amiloidose de SAA, a síndroma Islandesa hereditária, a senilidade, o mieloma múltiplo, a doença de kuru, a doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD), a doença de Gerstmann-Straussler-Scheinker (GSS), e a insónia familiar fatal (FFI). Quando mais do que uma cópia de um epítopo, tal como duas ou três cópias está presente no péptído antigéníco, um espaçador de 1-8 resíduos de amino ácidos, de um modo preferido de 1-4 resíduos, separa as múltiplas cópias do epítopo.

Na forma de realização preferida da presente invenção, o epítopo é o EFRH (SEQ ID NO: 5) . Os exemplos não restritivos de um péptído antigéníco que contém este epítopo preferido são mostrados na Tabela 1 e em Frenkel et al. (1998), com o péptido antigéníco de SEQ ID NO: 1 a ser o mais preferido. Para os péptidos antígénicos pequenos, como os que têm de 6-12 resíduos, um polímero dendrítico octa-ramifiçado (oito grupos funcionais terminais) tal como a resina de Wang do MAP octa-ramifiçado, é preferido. No entanto, para péptidos maiores, na variação de cerca de 20 resíduos de amino ácidos ou maiores, um polímero dendrítico tetra-ramifiçado, como a resina de Wang de MAP tetra-ramifiçado é preferido. Um exemplo preferido de um péptido maior é um péptido antigéníco que contém os resíduos 106-126 do epítopo da proteína prião. 33

Os documentos WO 00/72876 e WO 00/72880 divulgam entre uma lista longa de exemplos possíveis, o uso de MAP4 como um portador de um péptido que contém um epítopo Αβ. Não há nenhum dado nas publicações que mostre que alguns destes constructos foram de facto feitos ou testados. A imunogenicidade inesperadamente superior do constructo de MAP da presente invenção não é divulgado ou sugerido pelas duas publicações acima mencionadas. Para a extensão que se pode considerar que qualquer divulgação específica nestas publicações antecipa qualquer aspecto genérico da presente invenção, a divulgação genérica da presente invenção deve ser entendida como incluindo uma condição que exclui qualquer tal espécie anteriormente divulgada nas referidas publicações. Os aspectos da presente invenção que não são antecipados pela divulgação das referidas publicações são não evidentes a partir da divulgação das referidas publicações por causa dos resultados aqui divulgados ou alegados inesperadamente superiores.

Uma vantagem da presente invenção é a de que o polímero dendrítico pode servir como um portador para dois ou mais antígénios diferentes, se desejado. Uma forma de realização desta invenção que utiliza este procedimento é baseada na utilização de uma polilisína dendrítica ou outra molécula estruturalmente semelhante que emprega diferentes grupos de bloqueio amino, um dos quais é estável à hidrólise ácida, o outro dos quais é estável à hidrólise alcalina. Isto permite proteger qualquer dos grupos amino da lisina através do método de protecção ortogonal. 0 fluorenílmetiloxicarbonilo (Fmoc) é um grupo de protecção instável de base e é completamente estável à desprotecção acídica. O grupo de bloqueio de t-butoxicarbonilo (Boc) é estável em condições básicas mas não estável em condições suavemente acídicas 34 tais como 50 % de ácido trifluoroacético. Através da escolha de Boc-lys (Boc) - OH, Boc-lys (Fmoc) - OH, Fmoc-lys (Boc) - OH ou Fmoc-lys (Fmoc) - OH, é possível colocar um conjunto de antigénios no grupo alfa amino de lisina e um outro no grupo ómega amino. Os especialistas na técnica da síntese de péptído podem rapidamente planear métodos de se conseguirem os mesmos tipos de produtos utilizando grupos de bloqueio diversos e outros polímeros dendríticos.

Algumas observações gerais aplicável à síntese de MAPS ajudará os especialistas na técnica. Essas são: 1. A síntese geralmente necessita de um tempo de união longo (2- 4 horas). 2. A formamida de dimetilo é geralmente um solvente mais conveniente do que o dicloreto de metileno. 3. A resina péptido não deve ser seca em nenhuma etapa da síntese uma vez que a redissolução é extremamente difícil. 4. A união deve ser estreitamente controlada para a realização da união através do método de ninidrina quantitativo. 5. Os MAPS são melhor clivados a partir da resina através do método de desprotecção ácido melhorado quer com HF ou com TFMSA (Tam, et ai., 1983 e 1986) em sulfeto de dimetilo para evitar fortes reacções colaterais catalisadas do ácido. 6. Os MAPS tendem fortemente a agregar-se depois da clivagem do suporte de resina. A purificação é melhor efectuada pela diálise extensa em condições básicas e fortemente desnaturadas num meio de diálise o qual é de 8M em ureia e mercaptoetanol para retirar os aditivos aromáticos indesejáveis das reacções de clivagem tais como o p-cresol e o tiocresol. A purificação adicional, se desejada, pode ser efectuada por se utilizar permeação de gel de elevado 35 desempenho ou cromatografia de troca de iões. Na maior parte dos casos os MAPS podem ser utilizados directamente sem purificação adicional.

Será evidente aos especialistas na técnica que muitas variações das estruturas mostradas e debatidas aqui são possíveis. Todas tais variações estão especificamente incluídas dentro do âmbito desta invenção. Por exemplo, ver a patente norte americana N°. 5 229 490, cujo conteúdo inteiro é aqui incorporado por referência. O produto antigénico da presente invenção pode incluir uma fracção de âncora de membrana lipofílica que confere propriedades adjuvantes entre as suas vantagens. Uma fracção de âncora de membrana lipofílica no terminal de carboxilo do MAP permite uma amplificação não covalente adicional através de uma forma micelar ou de um lipossoma. Consequentemente, o produto antigénico de acordo com a presente invenção pode ser além disso preparado com uma variedade de veículos, incluindo a encapsulação dentro dos lipossomas, para maior eficiência de libertação e concomitantemente a dosagem reduzida. A preparação de lipossomas é bem conhecida na técnica. A cisteína de tripalmitoil-S-glicerilo (P3C) e a lisina de palmitoílo (PL) estão não limitativos exemplos de fracções lipofílicas convenientes para o produto antigénico da presente invenção. O P3C, que é um ácido de lipoamino de Escherichia coli, é um mitogénio de célula B que provou em particular, ser próspero como um adjuvante não tóxico. Ver a patente norte americana No. 5 580 563 e DeFoort et al., (1992), cujos os conteúdos inteiros são aqui incorporados por referência. 36

Como os produtos desta invenção fornecem uma elevada concentração de antigénio num pequeno volume molecular, em muitos exemplos a composição de imunização das vacinas da invenção pode ser empregue, sem adjuvantes. Por exemplo, o Exemplo 3 demonstra que um complexo entre a estreptavidina e o MAP-YEFRHYEFRH (SEQ ID NO: 4) eliciou uma resposta imune forte sem um adjuvante. Geralmente, quanto maior for o produto antigénico da presente invenção menor é a necessidade para um adjuvante. No entanto, se um adjuvante é empregue, pode ser seleccionado a partir de qualquer dos normalmente empregues para estimular os sistemas imunogénicos de mamíferos. A composição de imunização/vacinas da invenção pode ser definida como compreendendo um portador farmaceuticamente aceitável em conjunto com uma quantidade de um produto antigénico da invenção que é suficiente para produzir uma resposta imunológica. Uma quantidade eficaz pode ser muito pequena. Poderá, como é conhecido, variar com o antigénio. Com o produto desta invenção, por causa da alta concentração de antigénio num volume molecular baixo, será maís baixo do que com as vacinas vulgares que empregam os mesmos antigénios. A quantidade que constitui um montante eficaz pode variar dependendo de se a vacina é destinada como um primeiro tratamento ou como um tratamento de intensificação.

Pode ser conveniente fornecer os produtos desta invenção como pós secos liofilizados ou congelados prontos para serem reconstituídos com um portador farmaceuticamente aceitável somente antes da utilização.

Os produtos antigénicos da presente invenção também podem ser empregues em vários testes de diagnóstico incluindo radioimunoensaio, a precipitação, a fixação de complemento, a 37 imunofluorescência dírecta e indirecta, a aglutinação e o imunoensaio ligado com a enzima. Para tal teste a fracção de diagnóstico junta ao polímero dendrítico pode ser marcada com uma marcação detectável, ou pode ser causada para reagir com um produto marcado tal como um anticorpo marcado para produzir um produto de reacção detectável. Os marcadores úteis incluem marcadores fluorescentes tais como a fluoresceína, a rodamina ou a auramina. Os isótopos radiactivos tais como o 14C 131I 123I e o 35S podem ser empregues. Os marcadores de enzima que podem ser utilizadas incluem, por exemplo, a peroxidade de rábano silvestre, a β-D-glucosidase, a β-D-galactosidase, a urease, a oxidase de glicose mais a peroxidase, e a fosfatase ácida. Os métodos para a marcação são bem conhecidos e não têm de ser descritos.

Em aplicações profiláticas, o produto antigénico da presente invenção é administrado a um paciente susceptível a, ou de outra maneira em perigo de, uma doença que forma placa tal como a doença de Alzheimer, numa quantidade suficiente para eliminar ou reduzir o risco, diminuir a gravidade, ou atrasar o ataque da doença, incluindo os sintomas comportamentaís bioquímicos e/ou histológicos da doença, as suas complicações e fenótipos patológicos intermediários apresentados durante o desenvolvimento da doença. Em aplicações terapêuticas, o produto antigénico da invenção é administrado a um paciente suspeito de, ou que já sofre de tal doença numa quantidade suficiente para curar, ou pelo menos deter parcialmente, os sintomas da doença (bioquímicos, histológicos e/ou comportamentaís), incluindo as suas complicações e fenótipos patológicos intermediários no desenvolvimento da doença. Em alguns métodos, a administração do produto antigénico reduz ou elimina o debilitamento miocognitivo em pacientes que ainda não desenvolveram a patologia de Alzheimer característica. Uma quantidade adequada de 38 realizar o tratamento terapêutico ou profilático é definido como uma dosagem terapeuticamente ou profilacticamente eficaz. Em ambos os regimes profiláticos e terapêuticos, o produto antigénico da presente invenção é normalmente administrado em várias doses até que uma resposta imune suficiente tenha sido alcançada. Tipicamente, a resposta imune é controlada e as doses repetidas são dadas se a resposta imune começar a diminuir.

As dosagens eficazes do produto antigénico da presente invenção, para o tratamento de uma doença ou perturbação que forma placa, tal como a doença de Alzheimer, variam dependendo de muitos factores diferentes, incluindo os meios da administração, o local visado, o estado fisiológico do paciente, se o paciente é um ser humano ou um animal, outras medicações administradas, e se o tratamento é profilático ou terapêutico. Normalmente, o paciente é um ser humano mas mamíferos não humanos incluindo mamíferos transgénicos também podem ser tratados. As dosagens de tratamento têm de ser tituladas para optimizar a segurança e a eficácia. A quantidade de imunogénio depende de se o adjuvante também é administrado, com dosagens mais altas mais provavelmente para ser necessário na ausência de adjuvante. Os 1-500 pg por paciente e mais usualmente de 5-500 pg por injecção para administração humana. Ocasionalmente, uma dose mais alta de 1-2 mg por injecção é utilizada. Tipicamente cerca de 10, 20, 50 ou 100 pg são usados para cada injecção humana. A massa de imunogénio também depende da proporção da massa do epítopo imunogénico dentro do imunogénio relativamente à massa de imunogénio como um todo. A regulação de tempo das injecções pode variar significativamente de uma vez por dia, a uma vez por ano, a uma vez numa década. Em qualquer dia determinado em que uma dosagem de imunogénio é dada, a dosagem é maior do que 1 pg/pacíente e normalmente maior do que 10 pg/paciente se o adjuvante também for 39 administrado, e pode ser maior do que 10-100 pg/paciente na ausência de adjuvante. Um regime típico consiste de uma imunização seguida por injecções de intensificador em intervalos de tempo, tais como intervalos de 6 semanas. Um outro regime consiste de uma imunização seguida por injecções de intensificador 1, 2 e 12 meses depois. Um outro regime implica uma injecção a cada dois meses da vida. Alternativamente, as injecções de intensificador podem estar em uma base irregular como indicado por se controlar a resposta imune. 0 produto antigénico da presente invenção para induzir uma resposta imune pode ser administrado por meio parentérico, tópico, intravenoso, oral, subcutâneo, intraarterial, intracranial, intraperitoneal, intranasal ou intramuscular para o tratamento profilático e/ou terapêutico. A via de administração mais típica de um agente imunogénico é a subcutânea embora outras vias possam ser igualmente eficazes. A seguinte via mais comum é a injecção intramuscular. Este tipo de injecção é na maior parte das vezes tipicamente executada nos músculos da perna ou do braço. 0 produto antigénico da invenção pode ser às vezes administrado em combinação com um adjuvante. Uma variedade de adjuvantes pode ser utilizada em combinação com o produto antigénico da invenção para se obter uma resposta imune. Os adjuvantes preferidos aumentam a resposta intrínseca a um imunogénio sem causar modificações conformacionais no imunogénio que afectem a forma qualitativa da resposta. Os adjuvantes preferidos incluem o hidróxido de alumínio e o fosfato de alumínio, lípido A de monofosforilo de 3 De-0-acilado (MPL®) (ver GB 2220211, RIBI ImmunoChem Research Inc., Hamilton, Montana, agora parte de Corixa). O Stimulon® QS-21 é um glicósido ou uma saponina de triterpeno isolado a partir da cortiça 40 da árvore de Quillaja Saponaria Molina encontrada na América do Sul (ver Kensil et al., 1995); patente norte americana No. 5 057 540 (Aquila BioPharmaceuticals, Framingham, MA). Outros adjuvantes são as emulsões de óleo em água (tais como esqualeno ou óleo de amendoim), opcionalmente em combinação com estimulantes imunes, tais como o lípido de monofosforilo A (ver Stoute et al., 1997). Um outro adjuvante é o CpG (WO 98/40100). Alternativamente, o produto antigénico pode ser ligado a um adjuvante. No entanto, tal união não deve modificar substancialmente a conformação do epitopo para afectar além disso a natureza da resposta imune. Os adjuvantes podem ser administrados como um componente de uma composição com o produto antigénico da invenção administrado separadamente, antes, ao mesmo tempo que, ou depois da administração de produto antigénico. Uma classe preferida de adjuvantes é a de sais de alumínio (alúmen), tais como o hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de alumínio. Tais adjuvantes podem ser usados com ou sem outros agentes de imunostimulação específicos tais como o MPL ou o 3-DMP, QS-21, amino ácidos poliméricos ou monoméricos tais como o ácido poliglutâmico ou a polilisina. Uma outra classe de adjuvantes é a de formulações de emulsão de óleo em água. Tais adjuvantes podem ser usados com ou sem outros agentes de imunostimulação específicos tais como péptidos de muramilo (por exemplo, N-acetilmuramil-L-treonii-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetíl-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (nor-MDP), N-acetil-muramil-L-alanrl-D-isoglutarninil-L-alanina-2-(1'-2' dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (MTP-PE), N-acetil-glucsaminil-N-acetilmuramil-L-Al-D-isoglu-L-Ala-dipalmitoxi propilamida (DTP-DPP) theramide©) , ou outros componentes de parede de célula bacterianos. As emulsões de óleo em água incluem (a) MF59 (WO 90/14837), que contém 5 % de Squalene, 0,5 % de Tween 80, e 0,5 % de Alcance 85 (opcionalmente que contém várias quantidades de 41 MTP-PE) formulado em partículas de submicron usando um microfluidizante tal como o microfluidizante de Modelo 11QY (Microfluidics, Newton MA), (b) SAF, que contém 10 % de Squalene, 0,4 % de Tween 80, 5 % de polímero L121 bloqueado por plurónico, e thr-MDP, quer microfluidizado numa emulsão de submicron ou vortexado para gerar uma emulsão de tamanho de partícula maior, e (c) sistema adjuvante de Ribi© (RAS) (Ribi ImmunoChem, Hamilton, MT), que contém 2 % de esqualeno, 0,2 % de Tween 80, e um ou mais componentes de parede de célula bacterianos do grupo que consiste de 5 monofosforilípido A (MPL), dimicolato de tiehalose (TDM), e esqueleto de parede de célula (CWS), de um modo preferido MPL + CWS (Detox®) . Uma outra classe de adjuvantes preferida é a de adjuvantes de saponina, tais como o Stimulon© (QS-21, Aquila, Framingham, MA) ou partículas geradas a partir daí tais como ISCOMs (complexos de imunostimulação) e ISCOMATRIX. Outros adjuvantes incluem o Adjuvante de Freunds Completo (CFA) e o Adjuvante de Freunds Incompleto (IFA). Outros adjuvantes incluem citoquinas, tais como as interleucinas (IL-1, IL-2, e IL-12), o factor de estimulação da colónia de macrófagos (M-CSF), o factor da necrose de tumor (TNF).

Um adjuvante pode ser administrado com um imunogénio como uma composição única, ou pode ser administrado antes, ao mesmo tempo ou depois da administração do imunogénio. O imunogénio e o adjuvante podem ser embalados e fornecidos no mesmo frasco ou podem ser embalados em frascos separados e misturados antes da utilização. 0 imunogénio e o adjuvante são tipicamente embalados com uma etiqueta que indica a aplicação terapêutica desejada. Se o imunogénio e o adjuvante forem embalados separadamente, a embalagem tipicamente inclui instruções para a sua mistura antes da utilização. A escolha de um adjuvante e/ou de um portador depende da estabilidade da 42 formulação imunogénica que contém o adjuvante, da via da administração, do horário de dosagem, da eficácia do adjuvante para a espécie a ser vacinada, e, em seres humanos, um adjuvante farmaceuticamente aceitável é aquele que foi aprovado ou é aprovável para a administração humana por corpos reguladores pertinentes. Por exemplo, o adjuvante Completo de Freund não é conveniente para a administração humana. 0 alúmen, MPL e QS-21 são preferidos. Opcionalmente, dois ou mais adjuvantes diferentes podem ser usados simultaneamente. As combinações preferidas incluem o alúmen com MPL, o alúmen com QS-21, o MPL com QS-21, e o alúmen, o QS-21 e o MPL em conjunto. Também, o adjuvante de Freund Incompleto pode ser usado (Chang et al., 1998), opcionalmente em combinação com qualquer de QS-2, e WPL e em todas as suas combinações. 0 produto antigénico da presente invenção muitas vezes é administrado como composições farmacêuticas que compreendem um agente activo, isto é, o produto antigénico, e uma variedades de outros componentes farmaceuticamente aceitáveis. Ver Remington's Pharmaceutical Science (15a edição, Mack Publishing Company, Easton, Pensilvânia, 1980). A forma preferida depende do modo desejado de administração e da aplicação terapêutica. As composições também podem incluir, dependendo da formulação desejada, portadores ou diiuentes não tóxicos, farmaceuticarnente aceitáveis, os quais são definidos como veiculos usualmente utilizados para formular composições farmacêuticas para administração humana ou animal. 0 diluente é seleccionado para não afectar a actividade biológica da combinação. Os exemplos de tais diiuentes são a água destilada, o soro tamponado por fosfato fisiológico, as soluções de Ringer, a solução de dextrose, e a solução de Hank. Além do mais, a composição ou a formulação farmacêutica também podem incluir outros portadores, adjuvantes, ou 43 agentes auxiliares ou estabilizadores não tóxicos, não terapêuticos, não imunogénicos e semelhantes.

As composições farmacêuticas também podem incluir macromoléculas grandes, lentamente metabolizadas tais como as proteínas, os polissacáridos tais como o chitosano, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos e copolímeros (tais como a agarose de sefarose funcionalizada por látex, celulose, e semelhantes), amino ácidos poliméricos, copolímeros de amino ácido, e agregados de lípido (tais como gotinhas de óleo ou lipossomas) . Adicionalmente, estes portadores podem funcionar como agentes de imunostimulação (isto é, adjuvantes).

Para a administração parentérica, o produto antigénico da presente invenção pode ser administrado como dosagens injectáveis de uma solução ou suspensão da substância num diluente fisiologicamente aceitável com um portador farmacêutico que pode ser um líquido estéril tal como óleos em água, salina, glicerol, ou etanol. Adicionalmente, as substâncias auxiliares, tais como os agentes de humidificação ou de emulsificação, os agentes tensioactivos, as substâncias de tampão de pH e os semelhantes podem estar presentes em composições. Outros componentes de composições farmacêuticas são aqueles de origem do petróleo, animal, vegetal, ou sintética, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja, e óleo mineral. Em geral, os glicóis tais como o propileno glicol ou o polietileno glicol são portadores líquidos preferidos, em particular para soluções inj ectáveis.

Tipicamente, as composições são preparadas como injectáveis, quer como soluções ou suspensões líquidas; as formas sólidas convenientes para solução em, ou suspensão em, portadores líquidos 44 antes da injecção também podem ser preparados. A preparação também pode ser emulsionada ou encapsulada em lipossomas ou micro partículas tais como poliláctidos, poliglicólidos, ou copolímeros para aumentar o efeito do adjuvante, como debatido em cima (ver Langer, 1990 e Hanes, 1997).

Os pacientes receptivos ao tratamento incluem indivíduos em perigo de uma doença que forma placa mas que não apresentam sintomas, bem como a pacientes que presentemente mostram sintomas. No caso da doença de Alzheimer, praticamente qualquer um está em perigo de sofrer da doença de Alzheimer se ele ou ela viverem bastante tempo. Por isso, o presente produto antigénico pode ser administrado profilaticamente à população em geral sem a necessidade de qualquer avaliação de risco do paciente sujeito. Os métodos presentes são especialmente úteis para os indivíduos que realmente têm um risco genético conhecido da doença de Alzheimer. Tais indivíduos incluem os que têm parentes que experienciaram esta doença, e aqueles cujo risco é determinado pela análise de marcadores genéticos ou bioquímicos. Os marcadores genéticos de risco em dírecção à doença de Alzheimer incluem mutações no gene APP, em particular as mutações na posição 717 e nas posições 670 e 671 referidas como as mutações de Hardy e Swedísh respectivamente. Outros marcadores de risco são as mutações nos genes de presenilina, PS1 e PS2, e ApoE4, a história da família da AD, a hipercolesterolemia ou a arteriosclerose. Os indivíduos que presentemente sofrem da doença de Alzheimer podem ser reconhecidos pela demência característica, bem como pela presença de factores de risco descritos em cima. Além do mais, um número de testes de diagnóstico estão disponíveis para identificar os indivíduos que têm a AD. Estes incluem a medição de tau CSF e dos níveis de Αβ42. O tau elevado e os níveis de Αβ42 reduzidos significa a presença da AD. Os indivíduos que sofrem da 45 doença de Alzheimer também podem ser diagnosticados por critérios de ADRDA.

Em pacientes sem sintomas, o tratamento pode começar em qualquer idade (por exemplo, 10, 20, 30) . Normalmente, no entanto, não é necessário começar o tratamento até que um paciente atinja os 40, 50, 60 ou 70. O tratamento tipicamente implica múltiplas doses durante um período do tempo. 0 tratamento pode ser controlado por anticorpo de ensaio, ou por respostas de célula B ao agente terapêutico (por exemplo, o produto antigénico da presente invenção) ao longo do tempo. Se a resposta falhar, uma dose de intensificador é indicada. No caso de pacientes potenciais da síndroma de Down, o tratamento pode começar pré-natalmente por se administrar o agente terapêutico à mãe ou pouco tempo depois do nascimento. A presente invenção também fornece métodos para detectar uma resposta imune contra um polipéptido que forma depósito envolvido numa doença de formação de depósito de placa num paciente que sofre de ou é susceptível à doença, por exemplo. Os métodos são especialmente úteis para controlar um curso do tratamento que é administrado a um paciente. Os métodos podem ser usados para controlar tanto o tratamento terapêutico em pacientes sintomáticos como o tratamento profilático em pacientes não sintomáticos por se controlar o anticorpo produzido em resposta à administração de imunogénio.

Alguns métodos implicam a determinação de um valor de base de uma resposta imune num paciente antes de se administrar uma dosagem do produto antigénico, e comparar isto com um valor da resposta imune depois do tratamento. Um aumento significativo (isto é, maior do 46 que a margem típica do erro experimental em medições de repetição da mesma amostra, expressa como um desvio padrão do meio de tais medições) em valor da resposta imune transmite um resultado de tratamento positivo (isto é, a administração do agente atingiu ou aumentou uma resposta imune). Se o valor para a resposta imune não se modificar significativamente, ou reduzir, um resultado de tratamento negativo é indicado. Em geral, espera-se que os pacientes que sofrem um curso inicial do tratamento com um agente imunogénico mostrem um aumento na resposta imune com doses sucessivas, as quais consequentemente atingem uma plataforma. A administração de agente é geralmente continuada enquanto a resposta imune está a aumentar. A obtenção da plataforma é um indicador que o administrado do tratamento pode ser descontinuado ou reduzido em dosagem ou frequência.

Em outros métodos, um valor de controlo (isto é, um meio e desvio padrão) da resposta imune é determinado para uma população de controlo. Tipicamente os indivíduos na população de controlo não receberam o tratamento prévio. Os valores medidos da resposta imune num paciente depois de se administrar um agente terapêutico são depois comparados com o valor de controlo. Um aumento significativo quanto ao valor de controlo (por exemplo, maior do que um desvio padrão do meio) transmite um resultado de tratamento positivo. Uma falta do aumento significativo ou uma redução transmite um resultado de tratamento negativo. A administração de agente é geralmente continuada enquanto a resposta imune está a aumentar relativamente ao valor de controlo. Como antes, a obtenção de uma plataforma quanto aos valores de controlo é um indicador de que a administração do tratamento pode ser descontinuada ou reduzida em dosagem ou frequência. 47

Em outros métodos, um valor de controlo de resposta imune (por exemplo, um meio e um desvio padrão) é determinado a partir de uma população de controlo de indivíduos que sofreram o tratamento com um agente terapêutico e cujas respostas imunes foram colocadas em plataforma em resposta ao tratamento. Os valores medidos da resposta imune num paciente são comparados com o valor de controlo. Se o nivel medido num paciente não é significativamente diferente (por exemplo, mais do que um desvio padrão) do valor de controlo, o tratamento pode ser descontinuado. Se o nível num paciente for significativamente abaixo do valor de controlo, a administração continuada de agente é garantida. Se o nível no paciente persistir abaixo do valor de controlo, então uma modificação no regime de tratamento, por exemplo, a utilização de um adjuvante diferente pode ser indicada.

Em outros métodos, um paciente que não está presentemente a receber o tratamento mas que sofreu um curso prévio do tratamento é controlado para a resposta imune para determinar se um recomeço do tratamento é necessário. 0 valor medido da resposta imune no paciente pode ser comparado com um valor da resposta imune anteriormente conseguida no paciente depois de um curso prévio do tratamento. Uma redução significativa relativamente à medição prévia (isto é, maior do que uma margem típica do erro em medições de repetição da mesma amostra) é uma indicação de que o tratamento pode ser retomado.

Alternativamente, o valor medido num paciente pode ser comparado com um valor de controlo (meio mais o desvio padrão) determinado numa população de pacientes depois de sofrer um curso do tratamento. Alternativamente, o valor medido num paciente pode ser comparado com um valor de controlo em populações de pacientes 48 tratados profilacticamente que permanecem sem os sintomas da doença, ou as populações dos pacientes terapeuticamente tratados que mostram uma melhoria das caracteristicas da doença. Em todos destes casos, uma redução significativa relativamente ao nível de controlo (isto é, mais do que um desvio padrão) é um indicador de que o tratamento deve ser retomado num paciente. A amostra de tecido para análise é tipicamente o sangue, o plasma, o soro, o fluido de mucosa ou cerebrospinal do paciente. A amostra é analisada para a indicação de uma resposta imune ao produto antigénico. A resposta imune pode ser determinada pela presença de, por exemplo, os anticorpos que especificamente se ligam ao péptido de Αβ. Os métodos de ELISA para se detectarem anticorpos específicos ao péptido Αβ são descritos nos Exemplos a seguir.

Tendo descrito agora geralmente a invenção, o mesmo será mais rapidamente entendido através da referência ao exemplo seguinte o qual é fornecido por meio de ilustração e não é destinado para ser restritivo da presente invenção. EXEMPLO 1

Preparação de MAP com o epítopo de EFRH (SEQ ID NO; 5) A cadeia de péptido TyrTyrGluPheArgHisAspSer (SEQ ID NO: 1) foi sintetizada (crescendo do terminal C para N) numa Resina de Wang octa-ramifiçada, beta resina Ala-Lys-2Lys-4Lys-4Fmoc, a qual é uma resina de núcleo de MAP. A resina de Wang octa-ramif içada foi obtida do fornecedor, Advanced ChemTeeh, Inc., Louísville, KY (www. peptide.com) e tem uma parte de clivagem que consiste de beta alanina à qual sete lisinas, ramificadas como uma árvore, são 49 ligadas. As ramificações terminam em quatro lisinas com dois grupos Fmoc cada um para um total de oito grupos Fmoc. A síntese do MAP pode ser executada de acordo com as instruções do fornecedor ou de acordo com qualquer número de protocolos de síntese de péptido tais como os descritos na patente norte americana No. 5 229 490, e Tam et al. (1989).

Preparação de um antigénio O estoque de MAP-YYEFRHDS (SEQ ID NO: 1; 2 mg/mL) foi preparado em 12,5 % de DMF. 2 mg de MAP-YYEFRHDS (SEQ ID NO: 1) foram dissolvidos em 125 pL de DMF e 875 pL de água destilada dupla foi depois adicionada para trazer o volume até 1 mL. O estoque foi armazenado num congelador.

Imunização de ratos Balb/C

Quatro ratos (denominados A, B, C, D) foram imunizados em intervalos de duas semana com 100 pg de MAP-YYEFRHDS (SEQ ID NO: 1) + adjuvante (quer adjuvante de Freund Completo ou de Freund Incompleto) por injecção intraperitoneal, e dois ratos foram imunizados com H2O + adjuvante como um controlo negativo. Todos os ratos foram ratos fêmeas com 8 semana de idade.

Protocolo de imunização

Dia 0 - a primeira injecção Dia 15 - a segunda injecção Dia 28 - a terceira injecção A linha de tempo (em semanas) para injecções e hemorragias é 50 mostrada na Fig. 2.

Ligação de anticorpos poiiclonais a péptidos de β amilóide

Em experiências da ligação do anticorpo ao péptido 1-16 de β amilóide, 100 ng/cavidade dos péptidos 1-16 de β amilóide biotinilados foram ligados a placas microtituladas revestidas de estreptavidina durante 1/2 h à temperatura ambiente. As placas de ELISA foram anteriormente revestidas com estreptavidina durante 16 h a 4 °C depois de lavagem, os anticorpos ligados ao β péptido foram detectados por incubação com anticorpos conjugados por peroxidase de armorácio, como anteriormente descrito em Frenkel et al. (1999). O tipo de Ig foi medido com o IgG de coelho anti-rato e IgM anti-rato marcado com a peroxidase de armorácio.

Análise de resposta imunológica

Como pode ser visto a partir dos resultados depois de ELISA contra o epitopo de EFRH em várias diluições (Fig. 3), a resposta imune é semelhante para cada rato.

Determinação do tipo de Ig em soros de ratos imunizados com ELISA contra o epitopo de EFRH (SEQ ID NO: 5) A Fig. 4 mostra que a maioria esmagadora de anticorpos é IgG e por isso fornece evidência de uma segunda resposta imune forte. Como visto a partir dos resultados da Fig. 5, cada rato conseguiu uma resposta imune adequada, mas o rato B mostrou um titulado mais alto. No dia 105, o titulado IgG nos soros de ratos imunizados é ainda bastante alto (Fig. 6). 51

Presença duradoura de IgG contra o epltopo de EFRH (resíduos 3-6 da SEQ ID NO: 1)

Como pode ser visto a partir da Fig. 1, a resposta imune é ainda forte depois de 17 semanas a partir da terceira injecção de MAP-YYEFRHDS (SEQ ID NO: 1), o que é 21 semanas depois da primeira injecção de MAP-YYEFRHDS (SEQ ID NO: 1). EXEMPLO 2 A cadeia de péptido TyrGluPheArgHisTyrGluPheArgHis (SEQ ID NO: 4), que tem dois epítopos de EFRH (SEQ ID NO: 5) e também é conhecida como MAP-(EFRH) 2, foi sintetizada da mesma maneira que a cadeia de péptido no Exemplo 1. 0 MAP-(EFRH)2 resultante é mostrado na Fig. 8. 0 estoque do MAP~(EFRH)2 de antigénio (10 mg/mL) foi preparado em 10 % de DMF e foi armazenado num congelador.

Imunização de ratos Balb/c

Dois ratos fêmea com 8 semanas de idade (denominados A e B) foram imunizados em intervalos de aproximadamente duas semanas com 100 pg de fago filamentoso de MAP-(EFRH)2 como adjuvante por injecção intraperitoneal.

Protocolo de imunização

Dia 0 - a primeira injecção de 3 x 102 fago + MA-(EFRH)2 100 pg por rato.

Dia 15 - a segunda injecção de 3 x 102 fago + MA-(EFRH)2 100 pg por rato.

Dia 34 - a terceira injecção de 3 x 102 fago + MA-(EFRH) 2 100 pg 52 por rato.

Dia 48 - a quarta injecção de MAP- (EFRH) 2 (100 pg) sem fago.

Dia 62 - a quinta injecção de MAP-(EFRH)2 (100 pg) . A linha de tempo aproximada (em semanas) para injecções e hemorragias é mostrada na Fig. 9.

Resposta imunológica

Como pode ser visto a partir dos resultados depois de ELISA contra o epítopo de EFRH em várias diluições (Fig. 10), a imunização com o MAP-(EFRH)2 produziu uma resposta imune forte como demonstrado pelos titulados de IgG soro elevado. EXEMPLO 3 0 antigénio de MAP-YYEFRHDS (SEQ ID NO: 1) preparado no Exemplo 1 foi biotinilado, e o antigénio biotinilado foi adicionado à esteptavidina em quatro porções em tubos durante 30 minutos cada. Os tubos foram incubados à temperatura ambiente com agitação suave. A esteptavidina: a proporção molar de MAP-YYEFRHDS (SEQ ID NO: 1) foi de 1:4. Depois da incubação, a mistura foi dializada contra o PBS ou H20. O complexo resultante de estreptavidina e o MAP-YYEFRHDS (SEQ ID NO: 1) biotinilado é mostrado na Fig. 11.

Imunização de ratos Balb/c

Dois ratos fêmea com 8 semanas de idade (denominados G e H) foram imunizados em intervalos de aproximadamente duas semanas com a estreptavidina e o complexo de MAP-YYEFRHDS (SEQ ID NO: 1) biotinilado (100 pg de MAP-YYEFRHDS (SEQ NO: 1) por rato) por 53 injecção intraperitoneal sem adjuvante.

Protocolo de imunização

Dia 0 - a primeira injecção Dia 15 - a segunda injecção Dia 34 - a terceira injecção Dia 48 - a quarta injecção Dia 62 - a quinta injecção A linha de tempo aproximada (em semanas) para injecções e hemorragias é mostrada na Fig. 9.

Resposta imunológica

Como pode ser visto a partir dos resultados depois de ELISA contra o epítopo de EFRH em várias diluições (Fig. 12), a imunização com o complexo de estreptavidina e o MAP-YYEFRHDS (SEQ ID NO: 1) biotinilado produziu uma boa resposta imune, embora não tão forte como a resposta imune observada no Exemplo 2 quando os titulados do soro IgG são comparados. EXEMPLO 4 (apenas para fins ilustrativos) 0 péptido antigénico é o humano PrP 144-152, DYEDRYYRE (SEQ ID NO: 6), a sequência reconhecida pelo anticorpo monoclonal 6H4 (Prionics AG) , com o MAP designado que apresenta oito cópias deste péptido antigénico (Fig. 13). 54

Os animais usados como um modelo de pesquisa para a imunização activa foram ratos BALB/C fêmea com oito semanas de idade, em que a respectiva sequência em ratos é diferente daquela dos seres humanos, isto é, a sequência de rato é 143-151 DWEDRYYRE (SEQ ID NO: 7), que tem uma eliminação e uma má combinação, Tyr a Trp, quando comparada com a ser sequência PrP 144-152 humana.

Os ratos foram imunizados uma vez a cada duas semanas com 100 ug de ΜΆΡ PrP (144-152) associado com o adjuvante de Freund e sangraram uma semana sim, uma semana não para examinar o titulado de anticorpo. A primeira imunização foi executada com CFA (adjuvante de Freund completo) enquanto as outras quatro foram executadas com IFA (adjuvante de Freund incompleto).

Os ratos foram sangrados a partir da veia do olho e o titulado de anticorpo contra o péptido foi medido usando o ensaio de ELISA. Os anticorpos de IgG que aumentaram contra o péptido foram observados depois da segunda imunização e alcançaram o seu pico depois da quinta imunização, com um titulado de 1:1,000 000 (Fig. 14).Como esperado durante aquele período de tempo, o nível do anticorpo de IgM caíram para um titulado de 1:50. A imunização foi cessada depois da quinta imunização, e oito semanas mais tarde os ratos foram sangrados outra vez e nível de anticorpos foi verificado alcançar um titulado de 1:100 000. Além do mais, o soro reconheceu todas as células de CHO por imuno-mancheamento da proteína de PrP.

REFERÊNCIAS

Argarana et al., Nucleic Acid Res.r 14: 1871-1882 (1986)

Bard, F., Cannon, C., Barbour, R., Burke, R-L., Games, D., Grajeda, 55 H., Guido, Τ., Hu, Κ., Huang, J., Johnson-Wood, K., Khan, K., Kholodenko, D., Lee, M., Lieberburg, I., Motter, R., Nguyen, M., Soriano, F., Vasquez, N., Weiss K., Welch, B., Seubert, P., Schenk, D. e Yednock, T. Os anticorpos perifericamente administrados contra o péptido de β amilóide entram no sistema nervoso central e reduzem a patologia num modelo de rato da doença de Alzheimer. Nature Medicine, 6: 916-920 (2000).

Barrow, C. J. e Zagorski, M. G. As estruturas de solução do péptido e is seus fragmentos constituintes: A relação à deposição de amilóide. Science 253, 179-182 (1991) .

Bayer et al., App. Biochem. Biotech., 53: 1-9 (1995)

Blond, S. e Goldberg, M. Os epítopos parcialmente nativos estão já presentes em intermediários precoces na dobragem da sintase de triptofano. Proc Natl Acad Sei USA 84, 1147-1151 (1987) .

Carlson, J. D. e Yarmush, M. L. Redobragem da proteína ajudada pelos anticorpos. Biotechnol. 10, 86-91 (1992).

Carrell, R. W., Lomas, D. A. Doença conformational. Lancet 350, 134-138 (1997) .

Chandra et al., Meth. Enzymol., 184: 70-79 (1990)

Chang et al., Advanced Drug Delivery Reviews, 32: 173-186 (1998)

Chen, G., Chen, K. S., Knox, J., Inglis, J., Bernard, A., Martin, S. J., Justice, A., McConlogue, L., Games, D., Freedman, S. T. e Morris, R. G. M. Um défice de aprendizagem relacionado com o 56 envelhecimento e placas de β amilóide num modelo de rato da doença de Alzheimer. Nature 408: 975-979 (2000).

DeFoort et al., Int. J. Peptide Protein Res., 40: 214-221 (1992)

Fraser, P. E., Levesque, L. e McLachlan, D. A. Bioquímica da doença de Alzheimer, placas amilóides. Clin. Biochem. 26, 339-349 (1993).

Frenkel, D., Balass, M. e Solomon, B. A sequência de EFRH de terminal N do péptido de β amilóide de Alzheimer representa o epítopo dos seus anticorpos de anti-agregaçào. J Neuroimmunology, 88, 85-90 (1998).

Frenkel, D., Balass, M., Kachalsky-Katzir, E. e Solomon, Β. A ligação de elevada afinidade de anticorpos monoclonais ao epítopo de EFRH sequencial do péptido de β amilóide é essencial para a modulação da agregação fibrilar. J. Neuroimmunology 95, 136-142 (1999) .

Frenkel, D., Solomon, B. e Benhar, I. Modulação da neurotoxicidade de β amilóide de Alzheimer por um anticorpo de cadeia singular dirigido ao local. J Neuroimmunol, 106: 23-31 (2000a).

Frenkel, D., Katz, O. e Solomon, B. Imunização contra as placas de β amilóide de Alzheimer através da administração do fago de EFRH. PNÃS 97, 21, 11455-11459 (2000b).

Frenkel, D., Kariv, N. e Solomon, B. Geração de auto anticorpos em direção à vacinação da doença de Alzheimer. Vaccine 19, 2615-2619 (2001). 57

Frauenfelder, H.; Petsko, G. A. e Tsernoglou, D. Difracçâo de raio X dependente da temperatura como uma prova da dinâmica estrutural da proteína. Nature, 280, 558-563 (1979).

Goate, A., Chartier-Harlin, M-C., Mullan, M. et al. (1991). Segregação de uma mutação de sentido invertido no gene da proteína de precursor amilóide com a doença de Alzheimer familiar. Nature 349, 704-706 (1991).

Gray, Arch., Biochem. Bíophys., 163: 426-428 (1974)

Green, Advances in Proteín Chemistry, 29: 85-133 (1975)

Greenwood, J., Willis, E. A. e Perham, N. R. Múltipla exposição de péptidos exteriores num bacteriófago filamentoso. J Mol

Biol, 220, 821-827 (1993).

Hanan, E. e Solomon, B. Efeito inibitório de anticorpos monoclonais na agregação do péptido de β amilóide de Alzheimer. Amyloid: Int. J. Exp. Clin. Invest. 3, 130-133 (1996).

Hanes, Advanced Drug Delivery Reviews, 28: 97-119 (1997)

Hardy, J. Amilóides, as presenilinsa e a doença de Alzheimer. Trends Neurosci. 20, 154-159 (1997) .

Hardy, J. e Allsop, D. Deposição de amilóides como o evento central na etiologia da doença de Alzheimer. Trends Pharmacol Sei. 12, 18295-18298 (1991).

Hardy, J., Duff, K., Hardy, K. G., Perez-Tur, J. e Hutton, M.

Dissecação genética da doença de Alzheimer e demências relacionadas: o amilóide e a sua relação com o tau. Nature Neurosci I, 355-358 (1998).

Hollosi, M., Otvos, L., Kaijtar, J., Percell, A. e Lee, V. Μ. Y. É a deposição de amilóide na doença de Alzheimer precedida por uma transição conformacional dupla induzida pelo ambiente? Pept Res 2, 109-113 (1989).

Hoogenboom, H. R., de Bruine, A. P., Hufton, S. E., Hoet, R. M.

Arends, J. W. e Roovers, R. C. Tecnologia que expõe o fago do anticorpo e as suas aplicações. Immunotechnology 4: 1-20 (1998).

Howlett, D. R., Jennings, K. H., Lee, D. C., Clark, M. S. G., Brown F., Wetzel, R., Wood, S. J., Camilleri, P. e Roberts, G. W. Estado de agregação e propriedades neurotóxicas do péptido de β amilóide de Alzheimer. Neurodegeneration, 4, 23-32 (1995).

Janus, C., Pearson, J., McLaurin, J., Mathews, P. M. Jiang, Y., Schmidt, S. D., Azhar Chisti, M., Horne, P., Heslin, D., French, J. , Mount, Η. T. J., Nixon, R. A., Mercken, M., Bergeron, C., Fraser, P. E., St. George-Hyslop, P. e Westaway, D. A imunização do péptido de Αβ reduz prejuízo comportamental e as placas num modelo da doença de Alzheimer. Nature 408: 979-982 (2000).

Karplus, M. e Petsko, G. A. Simulações de dinâmicas moleculares em biologia. Nature, 347, 631-639 (1990) .

Katzav-Gozansky, T., Hanan, E. e Solomon, B. Efeito de anticorpos monoclonais na prevenção da agregação da carboxipeptidase A.

Biotechnol Appl Biochem 23, 227-230 (1996). 59

Kelly, J. W. As conformações alternativas de proteínas amiloidogénicas que governam o seu comportamento. Curr. Opin. Struct. Biol. 6, 11-17 (1996).

Kensil et al., Desenho de Vacina: a abordagem à Subunidade e ao

Adjuvante (1995)

Kirshenbaum, K. e Daggett, V. Conformações dependentes do pH do fragmento do péptido (1-28) de β amilóide explorado usando a dinâmica molecular. Biochemistry 34, 7629-7639 (1995).

Langer, Science, 249: 1527 (1990)

Levy-Lahad, E., Wasco, W., Poorkaj, P. et al. Gene candidato para o cromossoma 1 do local da doença de Alzheímer familiar. Science 269, 973-977 (1995).

Lorenzo, A. e Yankner, B. A. A neurotoxicídade de β amilóide necessita da formação de fibrilo e é inibida pelo vermelho Congo. Proc. Natl. Acad. Scí. USA 91, 12243-12247 (1994).

Maggío, J. E. e Mantyh, P. W. Amilóide do érebro - uma perspectiva físico-química. Brain Pathol 6, 147-162 (1996).

Medynski, D. Exposição do fago: todo coberto e pronto para o desempenho. Biol Technol 12, 1134-1136 (1994).

Meola, A., Delmastro, P., Monaci, P. et al. Derivação de vacinas de mimotopos: as propriedades imunológicas dos mimotopos do antigénio de superfície do vírus B humano exposto no fago filamentoso. J Immuno 154, 3162-3172 (1995). 60

Morgan, D., Diamond, D. M., Gottschall, P. E., Ugen, K. E., Dickey C., Hardy, J., Duff, K., Jantzen, P., Dicarlo, G., Wilcock, D., Connor, K., Hatcher, J., Hope, C., Gordon, M. e Arendash, G. W. A vacinação do péptido de Αβ previne a perda de memória num modelo de animais com a doença de Alzheimer. Nature 408: 982 985 (2000).

Murphy, C. Perda da função olfativa na doença da demência. Physio. Behav. 66, 177-182 (1999).

Pike, C. J., Overman, M. J. e Cotman, C. W. As eliminações amino-terminais aumentam a agregação de péptidos β amilóide in vitro. J Biol Chem 270, 23895-23898 (1995).

Price, D. L., Borchelt, D. R. e Sisodia, S. S. A doença de Alzheimer e perturbações de prião da proteína de β amilóide a a amiloidose da proteína de prião. Proc Natl Acad Sei USA, 90, 6381-6384 (1993) .

Schenk, D., Barbour, R., Dunn, W., Gordon, G., Grajeda, H., Guido, T., Hu, K., Huang, J., Johnson-Wood, K., Khan, K., Kholodenko, D.,

Lee, M., Zhenmei, L., Lieberburg, I., Motter, R., Mutter, L., Soriano, F., Shopp, G., Vasquez, N., Vandevert, C., Walker, S., Wogulis, M., Yednock, T., Games, D. e Seubert, P. A imunização com β amilóide atenua a patologia como na doença de Alzheimer no rato PDAPP. Nature, 400, 173-177 (1999).

Scott, J. K. e Smith, G. PPesquisa de ligandos de péptido com um banco de epítopos. Science, 249, 386-390 (1990).

Selkoe, D. J. A proteína de β amilóide e a genética da doença de Alzheimer. J Biol Chem. 271, 18295-18298 (1996). 61

Sherrington, R., Rogaev, E. I., Liang, Y. et al. Clonagem de mutações de sentido invertido que carregam o gene no ataque precoce da doença de Alzheimer familiar. Nature 375, 754-760 (1995).

Silen, J. L. e Agard, D. A. A pró-região da protease de x-íltica não necessita de uma ligação física para activar o domínio da prótese in vivo. Nature 341, 462-464 (1989).

Sladowski, D., Steer, S. J., Clothier, R. H. e Balis, M. Um ensaio de MTT melhorado. J Immunol Methods. 157, 203-207 (1993).

Solomon, B. e Balas, N. Termo-estabilização da carboxipeptidase A por interacção com os seus anticorpos monoclonais. Biotechnol and App Biochem 14, 202-211 (1991).

Solomon, B. e Schwartz, F. Efeito semelhante a acompanhante de anticorpos monoclonais na redobragem da carboxipeptidase A desnaturada por calor. J of Molec Recognition. 8, 72-76 (1995).

Solomon, B., Koppel, R., Hannan, E. e Katzav, T. Os anticorpos monoclonais que inibem in vitro a agregação fibrilar do péptido de B amilóide de Alzheimer. Proc Natl Acad Sei USA, 93, 452455 (1996).

Solomon, B., Koppel, R., Frankel, D. e Hanan-Aharon, E. Desagregação do β amilóide de Alzheimer por mAb dirigido ao local. Proc Natl Acad Sei USA 94, 4109-4112 (1997).

Solomon, B. e Frenkel, D. Vacinação para a prevenção e tratamento da doença de Alzheimer. Drugs of Today, 36 (9), 655-663 (2000). 62

Soto, C. A doença de prião e de Alzheimer como as perturbações da conformação de proteína: implicações do desenho das abordagens terapêuticas adicionais. J. Mol. Med. 77, 412-418 (1999).

Soto, C., Castano, E. M., Frangione, B. e Inestrosa, N. C. 0 α helicoidal para a transição do cordão β no fragmento de terminal amino do péptido de β amilóide que modula a formação amilóide. J Biol Chem 270, 3063 (1995).

Stoute et ai., N. Engl. J. Med., 336: 86-91 (1997)

Tam et al., J. Am. Chem. Sic., 105: 6442 (1983)

Tam et al., J. Am. Chem. Soc., 108: 5242 (1986)

Van Leuven, F. Ratos transgénicos únicos e múltiplos como modelos para a doença de Alzheimer. Prog Neurobiol. 200061 (3): 305-12.

Review (2000) .

Willis, E. A., Perham, N. R. e Wraaith, D. (1993). Propriedades imunológicas de péptidos exteriores em exposições múltiplas num bacteriófago filamentoso. Gene, 128, 79-83.

Winter, G., Griffiths, A. D., Hawkins, R. E. e Hoogenboom, H. R. Criação de anticorpo através da tecnologia de exposição de fago. Annu Rev Immunol 12: 433-455 (1994).

Zuercher, A. W., Miescher, S. M., Voge, M., Rudolf, M.P., Stadler, Μ. B. e Stadler, B. M. Imunização anti-IgE oral com o fago de exposição do epítopo. Eur. J. Immunol. 30, 128-135 (2000).

LISTA DE SEQUÊNCIAS 63 <110> SOLOMON, Beka

<120> PRODUTO ANTIGÉNICO QUE APRESENTA MÚLTIPLAS CÓPIAS DE UM EPÍTOPO DE UM POLIPÉPTIDO QUE FORMA DEPÓSITO ENVOLVIDO EM DOENÇAS DE FORMAÇÃO DE PLACAS E MÉTODOS PARA UTILIZAR OS MESMOS

<130> SOLOMON = 4,IA PCT <14 0> AINDA NÃO DETERMINADO <141> 2002-06-20 <160> 7 <170> Versão 3.1 de Patentin

<210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Sintética <4 00> 1

Tyr Tyr Glu Phe Arg His Asp Ser 1 5 64

<210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Sintética <4 Ο0> 2

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly 1 5

<210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Sintética <400> 3

Trp Vai Leu Asp 1 <210> 4 <211> 10

<212> PRT <213> Sequência artificial <220> 65 <223> Sintética <400> 4

Tyr Glu Phe Arg His Tyr Glu Phe Arg His 15 10

<210> 5 <211> 4 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Sintética <400> 5

Glu Phe Arg His 1 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Sintética <4 00> 66 Asp Tyr Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu 1 5 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Sintética <4 00> 7

Asp Trp Glu Asp Arg Tyr Tyr Arg Glu 1 5

Lisboa, 23 de Março de 2007

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Produto antigénico, que contém uma pluralidade de epítopos de β amilóide, que compreende um polímero dendrítico, construído numa molécula principal que é pelo menos difuncional para fornecer ramificações e que contém até 16 grupos funcionais terminais para cada um dos quais um péptido antigénico que compreende um epítopo de β amilóide que compreende a sequência de amino ácido SEQ ID NO: 5 é unida por ligações covalentes.

2. Produto antigénico de acordo com a reivindicação 1, em que o referido polímero dendrítico contém oito grupos funcionais terminais aos quais um péptido antigénico é unido.

3. Produto antigénico de acordo com a reivindicação 1, em que o referido polímero dendrítico contém quatro grupos funcionais terminais aos quais um péptido antigénico é unido.

4. Produto antigénico de acordo com a reivindicação 1, em que o referido polímero dendrítico contém 16 grupos funcionais terminais aos quais um péptido antigénico é unido.

5. Produto antigénico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que o referido péptido antigénico compreende a sequência de amino ácido SEQ ID NO: 1.

6. Produto antigénico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que a referida molécula principal é a lisina. 2

7. Produto antigénico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que a referida molécula principal é seleccionada a partir do grupo que consiste de ácido aspártico e ácido glutâmico.

8. Produto antigénico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que a referida molécula principal tem a fórmula HjN-(CHj),-Ç-(CH2),-COOH H em que x, y e z são números inteiros de 0 a 10, e pelo menos um de x, y ou z é 1.

9. Produto antigénico de acordo com a reivindicação 8, em que os números inteiros x, y e z somam até um total no intervalo de 2 a 6 e os grupos amino são separados pelo menos por dois grupos de metileno.

10. Produto antigénico de acordo com a reivindicação 8, em que a referida molécula principal é seleccionada a partir do grupo que consiste de ornitina, nor-lisina e amino alanina.

11. Produto antigénico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que a referida molécula principal tem a fórmula H2N-CH2- (CH2) n-CH2-NH2 3 em que n é um número inteiro de 0 a 10.

12. Produto antigénico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que o péptido antigénico compreende dois epitopos do referido polipéptido que forma depósito.

13. Produto antigénico de acordo com a reivindicação 12, em que os referidos dois epitopos são idênticos.

14. Produto antigénico de acordo com a reivindicação 13, em que o péptido antigénico compreende a sequência de amino ácido SEQ ID NO: 4.

15. Produto antigénico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, que compreende adicionalmente uma molécula de avidina ou de estreptavidina, em que de um a quatro dos referidos polímeros dendríticos são cada um ligados à referida molécula de avidina ou de estreptavidina através de uma molécula de biotina conjugada ao referido polímero dendrítico para formar um complexo com a referida molécula de avidina ou de estreptavidina.

16. Produto antigénico de acordo com a reivindicação 15, em que dois ou três dos referidos polímeros dendríticos são ligados à referida molécula de avidina ou de estreptavidina.

17. Produto antigénico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, que compreende adicionalmente uma molécula que tem propriedades adjuvantes unida ao referido polímero dendrítico. 4

18. Produto antigénico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, o qual é encapsulado num lipossoma.

19. Composição de imunização, que compreende o produto antigénico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18 e um portador farmaceuticamente aceitável, excipiente, adjuvante ou agente auxiliar.

20. Utilização de um produto antigénico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18 para a produção de terapêuticas para o tratamento de uma doença ou perturbação de formação de placa que envolve ο β amilóide como o polipéptido de formação de depósito.

21. Utilização de acordo com a reivindicação 20, em que a referida doença ou perturbação de formação de placa é a doença de Alzheimer. Lisboa, 23 de Março de 2007