PT1396539E - Anticorpo anti-factor viii da coagulação sanguínea de tipo humano - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"ANTICORPO ANTI—FACTOR VIII DA COAGULAÇÃO SANGUÍNEA DE TIPO HUMANO"

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a uma provisão de um anticorpo inibidor humano contra o factor VIII da coagulação sanguínea (a seguir igualmente referido como "FVIII") e a um fragmento de anticorpo que se liga ao FVIII humano e, desse modo, inibe especificamente a actividade de coagulação de FVIII.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A hemofilia A é uma doença genética onde o distúrbio ou deficiência de FVIII conduz à redução da actividade de coagulação sanguínea, resultando em hemorragia nos intestinos ou articulações, etc. Para o tratamento de doentes sofrendo de hemofilia A, tem sido efectuado tratamento suplementar de FVIII. Contudo, em cerca de 10% (8 a 15%) dos doentes que receberam tratamento suplementar, foi observada a indução de um anticorpo contra FVIII. Este anticorpo, denominado "anticorpo inibidor anti-FVIII", torna ineficaz o tratamento suplementar com os factores da coagulação sanguínea e a gestão hemostática dos doentes com hemofilia extremamente difícil. A elucidação da natureza do anticorpo inibidor anti-FVIII e do seu mecanismo de produção possibilitaria a inibição ou 1 regulação da produção do anticorpo inibidor. Até ao presente, tem havido investigação utilizando um anticorpo inibidor anti-FVIII (anticorpo policlonal), purificado a partir dos soros de doentes com hemofilia tendo anticorpos inibidores anti-FVIII ou um anticorpo inibidor anti-FVIII de murganho (anticorpo monoclonal de murganho), para proporcionar, desse modo, muita informação. Contudo, quanto à clonagem de anticorpo inibidor anti-FVIII de doentes, não tem havido quase nenhuma referência.

Por outro lado, o estudo epidemiológico demonstrou que os doentes com hemofilia exibiram baixa ocorrência de arteriosclerose, tal como enfarte do miocárdio, em particular, ocorrência significativamente baixa de enfarte do miocárdio letal (Br. J. Haemotol. 1990, 75, 525-530; Lancet 1995, 345(8943) 152-155); e que um nivel aumentado de FVIII no plasma pode ser possivelmente um factor de risco para o enfarte arterial ou arteriosclerose (Semin. Hematol. 1997, 34, 171-187; Thromb. Res. 1997, 84, 359-362).

Deste modo, é de prever que, se a baixa coagulação sanguínea pudesse ser mantida pela utilização de um anticorpo inibidor anti-FVIII, isto contribuiria para a prevenção e tratamento do enfarte arterial e arteriosclerose. Em particular, um anticorpo anti-FVIII que reconhece especificamente o FVIII activado isento do factor de von Willebrand (a seguir igualmente referido como "vWF") exibe depuração muito longa no sangue, visto ser incapaz de se complexar com o FVIII usualmente ligado ao vWF no sangue e, por este motivo, pode ser um excelente fármaco antitrombótico, em que a baixa coagulação sanguínea pode ser mantida durante um longo período de tempo com uma única administração e a hemorragia ou outros efeitos secundários adversos podem ser muito reduzidos. 2 Já tem havido numerosas tentativas para preparar anticorpos monoclonais de murganho contra FVIII em muitos laboratórios, incluindo aqueles preparados pela presente requerente e, por conseguinte, foi produzido um certo número de anticorpos monoclonais contra FVIII. Foi provado que alguns destes inibem a actividade de FVIII e que se comportam como um anticorpo inibidor anti-FVIII. Com estes anticorpos monoclonais de murganho foram obtidos numerosos resultados, incluindo a análise de regiões que inibem a actividade de FVIII, etc.

Contudo, um anticorpo inibidor anti-FVIII completamente humano não foi certamente preparado com sucesso, embora tenha sido tentado ao longo de mais de dez anos em muitos laboratórios com a técnica de hibridoma (técnica de hibridoma de humano/murganho ou humano/humano) ou a técnica de transformação EB, utilizando linfócitos de doentes tendo anticorpos inibidores anti-FVIII.

Em 1998, Marc G. Jacquemin et al. referiram o primeiro estabelecimento do método de preparação de um anticorpo inibidor anti-Factor VIII completamente humano, utilizando a técnica de transformação EB (Blood, 92(2), 1998, 496-506). Estabeleceram o anticorpo B02C11, que se supunha que inibia a ligação de FVIII com vWF ou com fosfolipidos e que reconhecia o domínio C2 de FVIII. Os genes VH e VL deste anticorpo foram derivados do fragmento DP5 e Vk3, respectivamente. Foram igualmente bem-sucedidos no estabelecimento de clones produzindo anticorpos inibidores anti-Factor VIII contra o domínio Cl com o método semelhante e referiram que os anticorpos são derivados de DP64 e Vk3 {Blood, 95, 2000, 156-163). Até ao presente, foram apenas Marc G. Jacquemin et al. que alguma vez estabeleceram um clone 3 produzindo tal anticorpo inibidor anti-FVIII derivado de humano com a técnica de hibridoma (técnica de hibridoma humano/murganho ou humano/humano) ou a técnica de transformação EB.

Por outro lado, a tecnologia de apresentação de fago de anticorpo referida por J. D. Marks et al. (J. Mol. Biol, 222, 581-597, 1991) é vantajosa, na medida em que um repertório de anticorpos de linfócitos de doentes, pode ser rastreado num período de tempo mais curto e em mais clones do que a técnica de hibridoma convencional ou a técnica de transformação EB. Nos últimos anos, tem havido uma tentativa de utilização desta tecnologia de apresentação de fago de anticorpo para o isolamento do anticorpo inibidor. W. H. Ouehand et al., referiram no International Congress on Thrombosis and Hemostasis, Junho de 1995 (Israel) (1995, ISTH) que clonaram um anticorpo anti-FVIII de cadeia única humano (scFv) a partir de bibliotecas de apresentação de fago de anticorpos humanos de dadores saudáveis e uma biblioteca de anticorpos de fagos humanos sintéticos. J. Davis et al., referiram igualmente no International Congress on Thrombosis and Hemostasis, Junho de 1997 que clonaram um anticorpo anti-FVIII de cadeia única humano (scFv) a partir de bibliotecas de apresentação de fago de anticorpos humanos, em que os genes VH foram derivados de doentes com hemofilia e os genes VL eram de dadores saudáveis. Contudo, nestas referências, as bibliotecas de apresentação de fago de anticorpos humanos foram construídas num modo sintético ou semi-sintético, em que não ambos VH e VL foram derivados de doentes com hemofilia. Além disso, embora os clones obtidos nestas referências se ligassem a FVIII, como demonstrado por ELISA, não foi provado se os clones inibiam a actividade de coagulação de FVIII. 4

Em 2000, E. N. van den Brink et al. referiram que construíram uma biblioteca de apresentação de fago de anticorpo, em que os genes da cadeia VL foram derivados de dadores saudáveis e os genes da cadeia VH eram de doentes tendo os anticorpos inibidores e isolados quatro clones reactivos com FVIII, dos quais dois clones foram reactivos com o domínio C2 de FVIII, ao passo que os outros dois foram reactivos com o domínio A2 de FVIII [van Den Brink, Human antibodies with specificity for the C2 domain of factor VIII are derived from VHl germLine genes (Blood, 2000; 95: 558-563); Molecular analysis of human anti-factor VIII antibodies by V gene phage display identifies a new epitope in the acidic region following the A2 domain (Blood, 2000; 96: 540-545) ] .

Foi referido que o domínio C2 de FVIII estava envolvido na ligação com vWF ou com os fosfolípidos e era uma região de reconhecimento principal de muitos anticorpos inibidores anti-FVIII presentes no sangue de doentes (Healey, J. F. et al., Residues Glu2181-Val2243 contain a major determinant of the inhibitory epitope in the C2 domain of human factor VIII, Blood, 1998, 92, 3701-3709) .

De acordo com o estudo por van den Brink et al., os fragmentos de anticorpo contra o domínio C2 obtidos desse modo não tiveram uma actividade inibidora contra FVIII. Consequentemente, um anticorpo anti-FVIII humano com a actividade inibidora ainda não foi isolado de um modo bem-sucedido sendo incapaz de proporcionar, por este motivo, informação suficiente. 5 A razao por que um anticorpo anti-FVIII humano com a actividade inibidora não podia ser isolado de um modo bem-sucedido com a tecnologia de apresentação de fago de anticorpo, presumiu-se ser a de que os genes da cadeia VL de fragmentos de anticorpo nao serem derivados de doentes e que poderiam existir alguns problemas no processo de rastreio.

DIVULGAÇÃO DA INVENÇÃO A presente requerente abordou e resolveu os problemas mencionados acima. Como um resultado, a presente requerente foi bem-sucedida no isolamento de novos anticorpos inibidores anti-FVIII tendo, distintamente, especificidade e actividade inibidora contra FVIII de linfócitos de um doente, pela tecnologia de apresentação de fago de anticorpo e analisaram as cadeias VH e VL dos referidos anticorpos específicos.

Consequentemente, a presente invenção refere-se aos seguintes itens:

Item 1. Fragmento génico codificando para uma cadeia VH de um anticorpo humano contra o factor VIII da coagulação sanguínea (FVIII), tendo uma actividade de inibição da actividade de coagulação (actividade inibidora) do FVIII humano, em que o referido anticorpo anti-FVIII humano não reconhece um complexo FVIII/factor de von Willebrand (vWF) e reconhece apenas o FVIII isento de vWF e em que as regiões determinantes de complementaridade (CDR1 a CDR3) da referida cadeia VH têm as seguintes sequências de aminoácidos: 6 CDR1: Glu Leu Ser Ile His (SEQ ID N°: 13); CDR2: Gly Leu Asp Arg Glu Asp Gly Lys Xaa Vai Ser Ala Gin Arg Phe Gin Gly (Xaa = Thr ou Ala) (SEQ ID N°: 14); CDR3: Gly Vai Ala Ser Asp Asp Asp Ala Phe Glu Ile (SEQ ID N°: 15).

Item 2. Fragmento génico do item 1, em que a referida cadeia VH tem uma sequência nucleotídica codificando para a sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo em SEQ ID N°: 2, 6 e 10.

Item 3. Fragmento génico codificando para uma cadeia VL de um anticorpo anti-FVIII humano, tendo uma actividade de inibição da actividade de coagulação (actividade inibidora) do FVIII humano, em que o referido anticorpo anti-FVIII humano não reconhece um complexo FVIII/factor de von Willebrand e reconhece apenas o FVIII isento de vWF e em que as regiões determinantes de complementaridade (CDRl a CDR3) da referida cadeia VL têm as seguintes sequências de aminoácidos: CDRl: Arg Ala Ser Gin Ser Ile Xal Xa2 Tyr Leu Asn (Xal = Ser ou Thr; Xa2 = Ser ou Arg) (SEQ ID N°: 16); CDR2: Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser (SEQ ID N°: 17); CDR3: Gin Xal Ser Tyr Xa2 Thr Pro Xa3 Thr (Xal = Gin ou His; Xa2 = Ser ou Thr; Xa3 = Leu ou Ile) (SEQ ID N°: 18).

Item 4. Fragmento génico do item 3, em que a referida cadeia VL tem uma sequência nucleotídica codificando para a 7 sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo em SEQ ID N°: 4, 8 e 12.

Item 5. Gene FV (scFv) de cadeia única compreendendo o fragmento génico codificando para a cadeia VH, como exposta no item 1 ou 2, ligado ao fragmento génico codificando para a cadeia VL, como exposta no item 3 ou 4.

Item 6. Fragmento génico codificando para o anticorpo anti-FVIII humano compreendendo o fragmento génico codificando para a cadeia VH, como exposta no item 1 ou 2, ligado ao fragmento génico codificando para a cadeia VL, como exposta no item 3 ou 4, em que o referido fragmento génico codificando para a cadeia VH e o referido fragmento génico codificando para a cadeia VL estão ligados a um gene de cadeia CH de anticorpo humano e a um gene de cadeia CL de anticorpo humano, respectivamente.

Item 7. Fragmento génico codificando para o fragmento de anticorpo anti-FVIII humano compreendendo o fragmento génico codificando para a cadeia VH, como exposta no item 1 ou 2, e/ou o fragmento génico codificando para a cadeia VL, como exposta no item 3 ou 4, em que o referido fragmento génico codificando para a cadeia VH e/ou o referido fragmento génico codificando para a cadeia VL estão ligados a um gene de cadeia CH de anticorpo humano, ou a uma sua parte, e a um gene de cadeia CL de anticorpo humano, ou a uma sua parte, respectivamente.

Item 8. Fragmento génico do item 7, em que o referido fragmento de anticorpo é seleccionado do grupo consistindo em Fab, Fab' e F(ab')2- 8

Item 9. Fragmento génico codificando para um fragmento de anticorpo anti-FVIII humano compreendendo o gene Fv de cadeia única, como exposto no item 5, ligado quer a um gene de cadeia CH de anticorpo humano, ou a uma sua parte, quer a um gene de cadeia CL de anticorpo humano, ou a uma sua parte.

Item 10. Anticorpo anti-FVIII humano ou um fragmento de anticorpo anti-FVIII humano expresso pela técnica de engenharia genética a partir de um vector de expressão no qual é incorporado o fragmento génico, como exposto em qualquer dos itens 1 a 9.

Item 11. Medicamento para a prevenção e tratamento de trombose, compreendendo o anticorpo anti-FVIII humano ou o fragmento do anticorpo anti-FVIII humano como exposto no item 10.

Item 12. Agente de diagnóstico para o FVIII activado, compreendendo o anticorpo anti-FVIII humano ou o fragmento do anticorpo anti-FVIII humano como exposto no item 10.

Item 13. Utilização do anticorpo anti-FVIII humano ou do fragmento do anticorpo anti-FVIII humano, como exposto no item 10, para a preparação de um medicamento para a prevenção e tratamento de trombose. 9

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Fig. 1 mostra uma medição de FVIII humano por ELISA, no qual uma placa de ELISA imobilizada com o anticorpo monoclonal FVIII A2 de murganho anti-humano é combinado com os clones scFv obtidos. A Fig. 2 mostra uma medição de FVIII com o kit de FVIII TestTeam utilizando os três scFvs de FVIII anti-humano purificados. A Fig. 3 mostra uma estimativa de uma actividade de FVIII residual com os scFvs purificados, pela medição do Tempo de Tromboplastina Parcial Activada (APTT) no qual o FVIII isento de de vWF ou uma preparação de FVIII compreendendo vWF multimérico, foi utilizado como FVIII humano.

MELHOR MODO DE REALIZAR A INVENÇÃO A fim de obter informação acerca da região variável (V) de um anticorpo inibidor anti-FVIII humano, a presente requerente amplificou, em primeiro lugar, os ADNc das cadeias pesada e leve de imunoglobulina de linfócitos B de sangue periférico de um doente com hemofilia A, tendo anticorpos inibidores anti-FVIII, por RT-PCR. Ambos os ADNc obtidos foram ligados entre si com ADN adaptadores, de modo a preparar ADN de Fv de cadeia única (scFv) em combinações aleatórias de cadeias VH e VL de linfócitos de doente.

Os ADN de scFv foram incorporados dentro de vectores fagemidicos pCANTAB5E para preparar bibliotecas de apresentação 10 de fago de scFv de doentes com hemofilia A compreendendo 107 clones. As bibliotecas foram depois colocadas em reacção com FVIII imobilizado contra uma fase sólida, por meio de anticorpo monoclonal anti-FVIII, para rastrear clones de apresentação de fago de scFv anti-FVIII capazes de ligação com FVIII. 0 anticorpo monoclonal anti-FVIII aqui utilizado é preparado pelas técnicas convencionais e inclui um anticorpo monoclonal de murganho. 0 anticorpo monoclonal anti-FVIII reconhece, de um modo preferido, um epitopo conformacional do dominio A2 de FVIII ou de uma cadeia L de FVIII activado. Com a utilização de tal anticorpo, torna-se possível reter o FVIII sobre o suporte sólido, sem afectar significativamente a sua conformação. Deste modo, neste sistema de rastreio descrito no contexto desta invenção, serão obtidos clones de fago que apresentem scFvs anti-FVIII que reconhecem epitopos excluindo aqueles reconhecidos pelos respectivos anticorpos monoclonais de murganho anti-FVIII.

Pela marcação do anticorpo monoclonal com biotina e utilizando partículas magnéticas com avidina imobilizada como uma fase sólida, os clones de apresentação de fago de scFv anti-FVIII capazes de ligação com o FVIII humano podem ser facilmente recuperados. 0 anticorpo monoclonal de murganho conjugado a biotina anti-FVIII permite o rastreio sem a necessidade de FVIII purificado e com uma quantidade vestigial de FVIII.

Em consequência do rastreio, foram isolados sete clones de scFv tendo a actividade de ligação a anti-FVIII e três destes clones inibiram a actividade de coagulação de FVIII. Os três 11 clones obtidos consistiram num gene VH de DP-5(l-24) da família de VH1 e um gene VL de DPK9(012/02) da família de VkI. Os outros quatro clones consistiram num gene VH de DP-88 ou 4M28 da família de VH1 e um gene VL de DPK22, Vg, DPK9 ou IGLV6S1, que eram diferentes daqueles dos clones tendo a actividade inibidora. Os genes VH dos clones que inibiram a actividade de coagulação de FVIII eram derivados do segmento DP-5, como em Marc G. Jacquemin et al., porém uma sequência de aminoácidos de CDR3 em VH diferiu grandemente daquela em Marc G. Jacquemin et al. Igualmente, observando-se que a actividade de ligação destes clones a FVIII foi quase perdida após mutação de serina ou treonina em CDR3 na cadeia VL em glutamina, revelou-se que a CDR3 na cadeia VL desempenha um importante papel na ligação destes clones a FVIII.

As sequências nucleotídicas e de aminoácidos das cadeias VH e VL dos três clones obtidos (YK3.3.38, YK3.3.40 e YK3.3.50) são mostradas na listagem de sequências, na qual as sequências das cadeias VH e VL de YK3.3.38 foram mostradas nas SEQ ID N°: 1-2 e 3-4; as sequências das cadeias VH e VL de YK3.3.40 nas SEQ ID N°: 5-6 e 7-8; e as sequências das cadeias VH e VL de YK3.3.50 nas SEQ ID N°: 9-10 e 11-12, respectivamente.

De entre estas sequências, as sequências de aminoácidos de CDR1 a CDR3 nas cadeias VH e VL são mostradas nas SEQ ID N°: 13 a 18. CDR1, CDR2 e CDR3 são como definidas por E. A. Kabat et al. [Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4a ed., U.S. Department of Health and Human Services, Washington DC (1987)]. 12 [cadeia VH] CDR1: Glu Leu Ser Ile His (SEQ ID N°: 13) CDR2: Gly Leu Asp Arg Glu Asp Gly Lys Xaa Vai Ser Ala Gin Arg Phe Gin Gly (Xaa = Thr ou Ala) (SEQ ID N°: 14) CDR3: Gly Vai Ala Ser Asp Asp Asp Ala Phe Glu Ile (SEQ ID N°: 15) [cadeia VL] CDR1: Arg Ala Ser Gin Ser Ile Xal Xa2 Tyr Leu Asn (Xal = Ser ou Thr; Xa2 = Ser ou Arg) (SEQ ID N°: 16) CDR2: Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser (SEQ ID N°: 17) CDR3: Gin Xal Ser Tyr Xa2 Thr Pro Xa3 Thr (Xal = Gin ou His; Xa2 = Ser ou Thr; Xa3 = Leu ou Ile) (SEQ ID N°: 18)

As sequências nucleotidicas e de aminoácidos mostradas nas SEQ ID N°: 1-2 e 3-4, 5-6 e 7-8, 9-10 e 11-12 correspondem, respectivamente, à cadeia pesada (cadeia VH) e cadeia leve (cadeia VL) da região V do anticorpo inibidor anti-FVIII humano tendo a actividade de inibição da actividade de coagulação de FVIII. A cadeia VH e/ou a cadeia VL aqui divulgadas foram obtidas na forma de scFv pela tecnologia de apresentação de fago de anticorpo. Contudo, a sua aplicação não está limitada a scFv. Nomeadamente, a cadeia VH e/ou a cadeia VL aqui divulgadas podem ser igualmente na forma de uma molécula completa de um anticorpo em que a cadeia VH e/ou a cadeia VL estão ligadas à região constante de uma imunoglobulina humana ou na forma de outros 13 fragmentos de anticorpo, incluindo Fab, Fab' ou F(ab')2, em que a cadeia VH e/ou a cadeia VL estão ligadas a uma parte da região constante de uma imunoglobulina humana ou um anticorpo de cadeia única (scAb), em que o scFv está ligado à região constante de uma imunoglobulina humana. A presente invenção prevê igualmente uma molécula proteica modificada, em que uma molécula proteica do anticorpo ou do fragmento de anticorpo desta invenção está conjugada com um modificador de elevado peso molecular.

Em consequência da análise da natureza do fragmento de anticorpo obtido de acordo com a presente invenção, o epitopo de FVIII reconhecido pelo fragmento de anticorpo foi perdido por tratamento de FVIII com SDS. Além disso, após ligação com o fragmento de anticorpo, o FVIII não se conseguia ligar a fosfolípidos ou vWF. Foi, deste modo, concluído que o fragmento de anticorpo não se ligou a FVIII ligado com vWF, como na corrente sanguínea, mas liga-se apenas a uma forma activada de FVIII isenta de vWF. 0 fragmento de anticorpo compete com anticorpos inibidores do plasma de um doente. Foi, deste modo, presumido que o fragmento de anticorpo reconheceu o mesmo epitopo que aquele reconhecido pelos anticorpos inibidores do doente, um epitopo dependente de estrutura no domínio C2 e tinha a propriedade semelhante àquela dos anticorpos inibidores do doente. A actividade inibidora contra FVIII do fragmento de anticorpo foi extremamente potente, i. e., 6700 a 29100 unidade

Bethesda/mg. 14

Como mencionado acima, o anticorpo monoclonal humano e a molécula de fragmento de anticorpo da presente invenção podem inibir de um modo potente a actividade de coagulação de FVIII e, por este motivo, podem ser incluídos num medicamento para a prevenção e tratamento da trombose. Em particular, o anticorpo monoclonal humano e a molécula de fragmento de anticorpo da presente invenção não reconhecem um complexo FVIII-vWF mas, em vez disso, reconhecem apenas uma forma activada de FVIII isenta de um factor de von Willebrand, que permite a reacção apenas com o FVIII activado mas não com o complexo FVIII-vWF, como ocorre usualmente no sangue.

Isto demonstra que o anticorpo monoclonal humano e a molécula de fragmento de anticorpo da presente invenção são um excelente novo agente antitrombótico em que podem ser esperados excelentes efeitos, não encontrados nos agentes antitrombóticos convencionais, tais como uma meia-vida muito longa no sangue e menor grau de efeitos secundários adversos, tal como hemorragia e os seus efeitos podem ser monitorizados por medição de APTT.

Igualmente, o anticorpo monoclonal humano e a molécula de fragmento de anticorpo da presente invenção, com base na sua propriedade, podem ser combinados com um anticorpo anti-FVIII reconhecendo um epitopo diferente (determinante antigénico) para proporcionar um imunoensaio para a medição de um nível sanguíneo de um FVIII activado isento de vWF.

Além disso, o anticorpo monoclonal humano e a molécula de fragmento de anticorpo da presente invenção têm muitas aplicações quando formados dentro de um complexo com um material imunoadsorvente compreendendo um adsorvente imunologicamente inactivo. 15

Em primeiro lugar, pode ser aplicado para purificação de uma quantidade vestigial de FVIII presente no plasma ou soro humano por cromatografia de afinidade. Pode ser igualmente aplicado para purificação de FVIII produzido em sobrenadante de cultura por células de cultura transformadas pela técnica de recombinação genética.

Em segundo lugar, é aqui descrito que o anticorpo monoclonal humano e a molécula de fragmento de anticorpo da presente invenção podem ser utilizados em imunoensaio para purificação de anticorpos anti-idiótipo contra a região variável da molécula a partir de plasma ou soro humano ou fracções ou preparações de imunoglobulina humana. Isto implica novas opções para medicamentos para o tratamento de doentes tendo os anticorpos inibidores com propriedade semelhante àquela do anticorpo da presente invenção.

Nomeadamente, é possivel que estes medicamentos inibam a actividade dos anticorpos inibidores anti-FVIII, pela remoção dos anticorpos inibidores quer através de administração sucessiva dos anticorpos anti-idiótipo mencionados acima a doentes, antes ou simultaneamente com a administração das preparações de FVIII, ou pela técnica de imunoadsorvente utilizando os anticorpos anti-idiótipo. Actualmente, no tratamento de doentes tendo os anticorpos inibidores, especialmente no caso de hemorragia séria ou durante operação, tem sido administrada aos doentes uma grande quantidade das preparações de FVIII, a fim de neutralizar os anticorpos inibidores no sangue e alcançar o nivel hemostático. Sabe-se, contudo, que este tratamento induz aumento nos anticorpos inibidores para conduzir a redução do efeito hemostático ou tendência para hemorragia. Pelo contrário, os anticorpos 16 anti-idiótipo como aqui se descrevem são vantajosos, na medida em que têm uma baixa imunogenicidade como um anticorpo humano e menos efeitos secundários adversos, em virtude da sua especificidade.

Torna-se igualmente possível remover especificamente anticorpos inibidores quando uma coluna é imobilizada com os anticorpos anti-idiótipo, em vez de uma coluna imobilizada com Proteína A, a qual tem sido utilizada para remoção de anticorpos inibidores. A presente invenção divulga igualmente um novo fármaco de terapia de tolerância para a indução de produção de anticorpos anti-idiótipo contra o anticorpo inibidor, pela utilização de um peptídeo da região variável, especialmente da região de determinação de complementaridade (CDR), do anticorpo monoclonal humano ou do fragmento de anticorpo da presente invenção ou um veículo de elevado peso molecular modificado com o referido peptídeo. A terapia de tolerância já foi tentada em doentes tendo os anticorpos inibidores com as preparações de FVIII. Nesta terapia, as preparações de FVIII são repetidamente administradas a doentes num curso regular, quando não é observada hemorragia, de modo que um título de inibidor seja reduzido ou que os anticorpos inibidores sejam totalmente removidos. Contudo, esta terapia é desvantajosa, na medida em que é extremamente dispendiosa, transporta um risco de tendência aumentada de hemorragia ou anafilaxia e pode ser apenas aplicada a doentes que tenham os anticorpos inibidores a um nível comparativamente inferior, porque nesta terapia as preparações de FVIII a 100 até 200 unidades/kg são administradas diariamente duas vezes ao dia ou as preparações de FVIII a 25 unidades/kg 17 sao administradas de dois em dois dias durante um longo período de tempo. A patente Japonesa N° 2838166 divulga uma composição farmacêutica para a inibição da produção de inibidor, utilizando um complexo imunológico compreendendo um antigénio de FVIII e um inibidor de FVIII, obtidos de plasma de doente e um método para a inibição da produção de inibidor. Contudo, o anticorpo inibidor anti-FVIII nela utilizado é preparado basicamente de componentes do plasma humano de doentes e, por este motivo, seria necessário um trabalho prodigioso para a preparação do componente e a homogeneidade e qualidade dificilmente poderiam ser mantidas. Além disso, foram referidos casos em que se verificou um grande número de complexos imunológicos no plasma de doentes que têm os anticorpos inibidores. Por conseguinte, a deposição melhorada dos complexos no baço, assim como efeitos secundários adversos, têm que ser considerados.

Em contrapartida, como descrita de acordo com a presente invenção, a produção de anticorpos anti-idiótipo contra o anticorpo inibidor é induzida pela utilização de um peptídeo da região variável, especialmente da região de determinação de complementaridade (CDR), do anticorpo monoclonal humano ou do fragmento de anticorpo da presente invenção ou um veículo de elevado peso molecular modificado com o referido peptídeo que permitiria, deste modo, a manipulação à semelhança da vacinação convencional.

Quando os doentes têm os anticorpos inibidores com a mesma especificidade e reactividade que aqueles do anticorpo monoclonal humano e fragmento de anticorpo da presente invenção, pensa-se que o seu idiótipo seja o mesmo. 18 A presente requerente verificou que, de entre as regiões variáveis de anticorpo aqui divulgadas, a região CDR3 da cadeia H e a região CDR3 da cadeia C contribuem particularmente para a estabilidade na ligação entre os anticorpos inibidores e FVIII. Deste modo, é de prever que a acção dos anticorpos inibidores no sangue possa ser suprimida pela imunização de doentes com peptideos destas CDR, de modo a induzir a produção de anticorpos anti-idiótipo. Além disso, os medicamentos e utilizações como divulgados no contexto da presente invenção, em que a produção de anticorpos anti-idiótipo contra a região de determinação de complementaridade, entre outras coisas, dos anticorpos inibidores é induzida, permitiria uma terapia segura da trombose, terapia que é extremamente específica e isenta de risco de tendência aumentada de hemorragia, etc. 0 anticorpo monoclonal humano da presente invenção pode neutralizar a actividade de coagulação do Factor VIII e ser incluído num medicamento para a prevenção e tratamento de trombose. 0 anticorpo monoclonal humano da presente invenção não reconhece um complexo Factor VlII/factor de von Willebrand mas reconhece apenas o Factor VIII isento do factor de von Willebrand. Consequentemente, pode ser um excelente novo agente antitrombótico com uma meia-vida extremamente longa no sangue com menor tendência de hemorragia, cujo efeito pode ser monitorizado por medição de APTT. 0 anticorpo monoclonal humano da presente invenção permite igualmente a detecção in vitro de FVIII activado no sangue. 0 anticorpo monoclonal humano da presente invenção possibilita igualmente o isolamento de um peptídeo para ser um epitopo antigénico e o isolamento de anticorpos anti-idiótipo no 19 plasma. Prevê-se que o peptídeo e os anticorpos anti-idiótipo obtidos sejam eficazes, do ponto de vista do mecanismo de neutralização ou de tolerância, para o tratamento de doentes com hemofilia tendo o anticorpo inibidor. A presente invenção divulga adicionalmente um novo fármaco de terapia de tolerância para a indução de produção de anticorpos anti-idiótipo contra os anticorpos inibidores, pela utilização de um peptídeo da região variável, especialmente da região determinante de complementaridade (CDR), do anticorpo monoclonal humano ou do fragmento de anticorpo da presente invenção ou um veículo de elevado peso molecular modificado com o referido peptídeo. A presente invenção é explicada em maior detalhe por meio dos seguintes exemplos que, contudo, não se pretende que restrinjam um âmbito da presente invenção em qualquer sentido.

Exemplo 1 de referência

Construção da biblioteca de fago de doente com hemofilia:

Uma biblioteca de fago foi construída fazendo referência ao método referido por J. D. Marks et al. (J. Mol. Biol., 222: 581-597, 1991) .

Foram separados linfócitos com Ficoll a partir de sangue periférico (28 mL) de um doente tendo o anticorpo inibidor anti-FVIII, lavados cuidadosamente com PBS e tratados com ISOGEN (Nippon Gene Co., Ltd.) para preparar um ARN total. 0 ARN total obtido foi dividido em três partes, cada uma delas foi 20 transcrita de um modo reverso com iniciadores p específicos das regiões constantes da IgG humana, cadeia κ ou cadeia X com o First Strand c ADN Synthesis kit (Pharmacia bio tec) para preparar ADNc para as respectivas regiões constantes. Os ADNc obtidos foram depois utilizados como um molde para a amplificação de genes da região V de anticorpo, por reacção de polimerização em cadeia (PCR) utilizando iniciadores específicos das famílias génicas como uma combinação de VH + JH, Vk + Jk e VX + JX, como referido por Marks et al.

Os genes VH e os genes Vk, e os genes VH e os genes VX, respectivamente, foram ligados entre si com ADN adaptadores pela técnica de agrupamento de PCR, para preparar ADN de scFv de cadeia única. Os ADN de scFv obtidos foram adicionados com sítios de restrição enzimática Not I e SfiI por PCR, separados electroforeticamente num gel de agarose e purificados. Os ADN de scFv purificados foram digeridos com as enzimas de restrição Sfi I (Takara) e NotI (Takara) e clonados dentro do fagemídeo pCANTAB5E (Pharmacia). Os fagemídeos pCANTAB5E nos quais foram incorporados os ADN de scFv foram introduzidos dentro de células TG1 de E. coli por electroporação, separadamente para VH-Vk e VH-VX. A julgar pelo número de células TG1 transformadas, foi estimado que os VH-Vk e VH-VX tinham diversidade de 1,03 x 107 e 4,85 x 106 clones, respectivamente. Utilizando as células TG1 transformadas, os anticorpos de fago foram expressos utilizando o fago auxiliador M13K07 para preparar uma biblioteca de apresentação de fago de scFv derivada de um doente. 21

Exemplo 2 de referência

Rastreio: 0 Factor VIII (Cross Eight M; 10 unidades/mL) dissolvido num tampão de rastreio (leite desnatado a 4%, albumina de soro bovino a 0,5%, IgG de murganho a 50 pg/mL, Tween 20 a 0,1%, TBS; 500 pL) e 0,5 pg/mL de anticorpos monoclonais anti-Factor VIII conjugados com biotina FVIII:C14-182 (murganho; reconhecendo a cadeia L do Factor VIII) ou FVIII:C14-282 (murganho; reconhecendo o domínio A2 da cadeia H de FVIII) dissolvidos num tampão de rastreio (500 pL) foram misturados num tubo de plástico (FALCON 2058) para reagirem, à temperatura ambiente, durante 30 minutos. A estes foi adicionada a biblioteca de fago apresentando anticorpo humano derivado de doentes (uma solução de fago apresentando anticorpos de cadeia única; 1 mL) para reagir, à temperatura ambiente, durante 1 hora e depois a 4 °C, de um dia para o outro.

Partículas magnéticas com avidina ligada (Perseptive; 100 pL) tratadas com leite desnatado a 2%/Tween 20 a 0,05%/TBS foram adicionadas à mistura anterior de anticorpo monoclonal anti-FVIII conjugado com biotina/FVIII (1 mL) e a mistura foi suavemente misturada, para cima e para baixo, durante 15 minutos. As partículas magnéticas foram recolhidas com um suporte magnético e lavadas com Tween 20 a 0,05%/TBS oito vezes e depois com tampão de Tris duas vezes. As partículas magnéticas foram suspenssas, após lavagem, num tampão de glicina (1 mL) e a suspensão foi deixada a repousar, à temperatura ambiente, durante 10 minutos para eluir o fago apresentando os anticorpos de cadeia única. À solução de fago eluído, após ajuste de pH com Tris(hidroximetil)aminometano-HCl (pH 7,5; 500 pL) , foi 22 adicionada cultura TG1 de E. coli (5 mL) na fase de crescimento logarítmico e a mistura foi suavemente agitada a 37 °C durante 1 hora para infectar a TG1 de E. coli.

As células TG1 infectadas foram centrifugadas a 3000 x g durante 5 minutos e após remoção do sobrenadante, suspenssas em meio 2 x YT (200 pL), inoculadas sobre placas SOBAG e cultivadas numa incubadora a 30 °C, de um dia para o outro. As colónias formadas foram recuperadas por adição de uma quantidade apropriada de meio 2 x YT e suspensão das colónias com um raspador (Coastor) . As células TG1 (500 pL) foram inoculadas em meio 2 x YTAG e resgatadas com um fago auxiliador para preparar uma biblioteca de apresentação de fago de anticorpo humano, após rastreio. O rastreio foi repetido três vezes para cada uma das bibliotecas de fago derivadas de um doente com hemofilia, VH-Vk e VH-VÀ. Após o terceiro rastreio, os clones foram opcionalmente seleccionados da placa SOBAG e foram realizadas a confirmação da expressão de scFv, confirmação da sua especificidade por ELISA em sanduíche de FVIII e análise de sequência nucleotídica.

Exemplo 3 de referência

Expressão e recuperação de scFv:

Um scFv solúvel foi expresso com HB2151 de E. coli, recuperado da fracção periplásmica de E. coli e purificado grosseiramente. Quando era necessária purificação adicional, a purificação de afinidade era realizada com o RAPAS Purification Module (Pharmacia Biotech). 23 A pureza da proteína scFv purificada foi confirmada por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida e transferência de Western dirigida contra o epitopo E-Tag no terminal C da proteína scFv. Uma concentração de proteína da proteína scFv purificada foi determinada com o kit Protein Assay (BIO-RAD).

Exemplo 4 de referência ELISA de FVIII para rastreio: 0 ELISA para rastreio dos clones isolados foi realizado como se descreve a seguir.

Dois anticorpos monoclonais de murganho anti-FVIII que reconhecem diferentes determinantes antigénicos, FVIII:C14-182 reconhecendo a cadeia L de FVIII e FVIII:C14-282 reconhecendo o domínio A2 da cadeia H de FVIII, foram imobilizados contra uma placa de ELISA para rastreio. Os anticorpos monoclonais anti-FVIII (5 pg/mL; 100 pL/poço), FVIII:014-182 ou FVIII:C14-282, foram colocados numa placa de ELISA (módulo MAXISORP (Nunc)) e a placa foi selada com uma placa selante (Sanko Junyaku Co., Ltd.) e deixada a repousar, à temperatura ambiente ou a 4 °C, de um dia para o outro, para imobilizar os anticorpos. Após lavagem com TBS três vezes, BSA a 1% em TBS (300 pL/poço) foi adicionado à placa que foi depois deixada a repousar, à temperatura ambiente, durante 1 hora para bloqueamento. À placa de ELISA foi adicionada uma solução de Factor VIII (Cross Eight M1000; Japanese Red Cross Society; 10 unidades/mL; 100 pL/poço) e a placa foi selada com uma placa selante e 24 deixada a repousar a 37 °C durante 2 horas. Após ter sido rejeitada a solução de FVIII e a placa de ELISA sido lavada cinco vezes com uma solução de lavagem de placa de ELISA, soluções de amostra (100 pL/poço) contendo quer scFv ou fago de apresentação de scFv foram adicionadas para reagir, à temperatura ambiente, de um dia para o outro. Após as soluções de amostra terem sido descartadas e a placa de ELISA sido lavada cinco vezes com uma solução de lavagem, foi adicionado um anticorpo secundário marcado com peroxidase de rábano (100 pL/poço) para reagir a 37 °C durante 1 hora. Após a solução de reacção ter sido descartada e a placa de ELISA sido lavada cinco vezes com uma solução de lavagem de placa de ELISA, foi adicionada uma solução de substrato para desenvolvimento (TMBZ-peróxido de hidrogénio; 100 pL/poço) para desenvolver, à temperatura ambiente até 37 °C, durante 5 a 10 minutos, enquanto a luz era blindada. Ácido sulfúrico a 1 N (100 pL/poço) foi adicionado à placa, para extinguir o desenvolvimento, e a absorvência a 450 nm foi medida com o Molecular Device Multiplate Autoreader SPECTRA MAX. Por consequência, todos os 99 clones estimados foram confirmados como sendo específicos de FVIII por ELISA em sanduíche de FVIII.

Exemplo 5 de referência

Análise de sequência de clones;

As regiões flanqueantes do gene scFv das colónias isoladas foram amplificadas por PCR. Os produtos de PCR obtidos foram digeridos com três a cinco enzimas de restrição, tais como PstI e Kpnl, e submetidas a electroforese em gel de agarose e as colónias foram classificadas com base nos seus padrões de banda. 25

Por consequência, 13 clones contendo um gene scFv completo foram identificados. As sequências de ADN de genes VH e genes VL destes clones foram determinadas com o Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (Applied Biosystems).

Exemplo 6

Estimativa de anticorpo de cadeia única anti-Factor VIII humano isolado: 0 ELISA de FVIII e um teste de inibição da actividade de coagulação foram realizados para os scFvs purificados para confirmar que sete scFvs se ligavam especificamente a FVIII. De entre estes, verificou-se que três scFvs inibem a actividade de coagulação de FVIII. Estes três clones, YK3.3.38, YK3.3.40 e YK3.3.50, foram adicionalmente estudados. A uma placa (módulo MAXISORP (Nunc)) imobilizada com os anticorpos monoclonais anti-FVIII, FVIII:C14-182 ou FVIII:Cl4-282, foi adicionada uma solução de FVIII (Cross Eight M1000; The Japanese Red Cross Society; 100 pL/poço), preparada a 0,001 até 10 unidades/mL, e a placa de ELISA foi selada com uma placa selante e deixada a repousar a 37 °C durante 2 horas. Após ter sido removida a solução de FVIII por aspiração e a placa sido lavada cinco vezes com uma solução de lavagem, uma solução de scFv (100 pL/poço) foi adicionada para reagir, à temperatura ambiente, de um dia para o outro. Após a solução de amostra ter sido removida por aspiração e a placa sido lavada cinco vezes com uma solução de lavagem, foi adicionado um anticorpo anti-Etag marcado com peroxidase de rábano (100 pL/poço) para reagir a 37 °C, durante 1 hora. Após a solução de amostra ter sido 26 removida por aspiração e a placa sido lavada cinco vezes com uma solução de lavagem, foi adicionada uma solução de substrato para desenvolvimento (TMBZ-peróxido de hidrogénio; 100 pL/poço) para desenvolver, à temperatura ambiente até 37 °C, durante 10 a minutos, enquanto luz era blindada. Ácido sulfúrico a 1 N (100 pL/poço) foi adicionado à placa, para extinguir o desenvolvimento, e a absorvência a 450 nm foi medida com o Molecular Device Multiplate Autoreader SPECTRA MAX. A Fig. 1 mostra os resultados obtidos com o scFv YK3.3.38, indicando que o FVIII podia ser detectado e medido com uma sensibilidade tão elevada como 0,01 unidade/mL, ou mais. Este sistema de medição tinha uma sensibilidade suficiente para a monitorização do FVIII activado no sangue, visto o nível sanguíneo de FVIII ter sido referido como sendo 0,01 unidade/mL, ou mais, mesmo em circunstâncias com elevada tendência para hemorragia.

Exemplo 7

Teste de inibição de actividade de coagulaçao;

Os anticorpos de cadeia única anti-Factor VIII humanos isolados foram estimados por medição do Tempo de Tromboplastina Parcial Activada (APTT) utilizando o kit de FVIII TestTeam (Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd.) e plasma deficiente em FVIII (DADE). A reacção no kit de FVIII TestTeam foi efectuada de acordo com as instruções do fabricante anexas para o processo (A) , método do Ponto Final, excepto que a escala foi reduzida para 27 1/4, para permitir a medição com uma placa de microtitulação de 96 poços. A medição do Tempo de Tromboplastina Parcial Activada (APTT) foi realizada com o Fibrintimer (Behring) como descrito em: National Committee for Clinicai Laboratory Standards. Collection, transport and Processing of blood specimens for coagulation testing and performance of coagulation assays, 2a Edição, Approved Guideline, Publicação NCCLS H21-A2, Villanova, PA. 1991; Sirridge, M. S.; Shannon, R., Laboratory Evaluation of Hemostasis and Thrombosis, 3a Ed., Filadélfia: Lea e Febinger, 1983: 130-133.

Para uma reacção antigénio-anticorpo, uma quantidade equivalente de uma diluição da amostra de anticorpo e uma solução de FVIII (Cross Eight Μ; 1 unidade/mL) foram misturadas em conjunto para reagirem a 37 °C, durante mais de 2 horas. A medição do kit de FVIII TestTeam ou Tempo de Tromboplastina Parcial Activada (APTT) foi depois realizada. A Fig. 2 mostra os resultados obtidos com o kit de FVIII TestTeam, indicando que todos os clones poderiam potencialmente inibir a actividade de FVIII a uma concentração de 10 ng/mL, ou mais. Foram obtidos resultados semelhantees com o Tempo de Tromboplastina Parcial Activada (APTT). 28

Exemplo 8

Estudo do efeito da presença do factor de von Willebrand: 0 efeito da presença de vWF foi estudado pela utilização tanto de FVIII quase isento de vWF (Cross Eight M, the Japanese Red Cross Society) como de FVIII purificado compreendendo vWF multimérico (Confact F; Juridical Foundation the Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute). A Fig. 3 mostra os resultados da medição do Tempo de Tromboplastina Parcial Activada (APTT) obtidos com YK3.3.38. Para comparação, foi utilizado plasma disponível comercialmente a partir de doentes tendo os anticorpos inibidores (GedrgeKingMedical, Inc. lot. GK1833- 929J2) . 0 estudo revelou que os clones de anticorpo anti-FVIII da presente invenção, YK3.3.38, YK3.3.40 e YK3.3.50, não inactivaram o FVIII ligado a vWF mas inactivaram o FVIII isento de vWF. 29

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute <120> Anticorpo de tipo humano contra o factor VIII da coagulação sanguínea <130> 663248 <150> JP 2001 -177640 <151> 2001-06 -12 <160> 18 <210> 1 <211> 360 <212> ADN <213> Humano <400> 1

Ctggggcctc agtgaaggtc 60 tccactgggt gcgacaggct 120 aagacgggaa aacagtctcc 180 cacccacaga cacaacctac 240 attactgtgc aacaggtgtt 300 caacggtcac cgtctcttca 360 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc tcctgcaagg tgtccggata caccctcact gaattatcca cctgaaaaag ggcttgagtg gataggaggt cttgatcgtg gcacagaggt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca atgcaactga ccagcctgtc atctgaggac acggccgtgt gcttccgatg acgatgcttt tgagatctgg ggccaaggga

<210> 2 <211> 120 <212> PRT 30 <213> Humano <400> 2 cag gtg cag ctg gtg cag tet ggg gct gag gtg aag aag cct ggg gee Gin Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Ala Glu Vai Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag gtc tcc tgc aag gtg tcc gga tac acc ctc act gaa tta Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Vai Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu 20 25 30 tcc ate cac tgg gtg cga cag gct cct gaa aaa ggg ctt gag tgg ata Ser Ile His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga ggt ctt gat cgt gaa gac ggg aaa aca gtc tcc gca cag agg ttc Gly Gly Leu Asp Arg Glu Asp Gly Lys Thr Vai Ser Ala Gin Arg Phe 50 55 60 cag ggc aga gtc acc atg acc gag gac aca ccc aca gac aca acc tac Gin Gly Arg Vai Thr Met Thr Glu Asp Thr Pro Thr Asp Thr Thr Tyr 65 70 75 80 atg caa ctg acc age ctg tca tet gag gac acg gee gtg tat tac tgt Met Gin Leu Thr Ser Leu Ser Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aca ggt gtt gct tcc gat gac gat gct ttt gag ate tgg ggc caa Ala Thr Gly Vai Ala Ser Asp Asp Asp Ala Phe Glu Ile Trp Gly Gin 100 105 110 ggg aca acg gtc acc gtc tet tca Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 31 <210> 3 <211> 324 <212> ADN <213> Humano <400> 3 60 120 180 240 300 324 gacatccagt tgacccagtc atcacttgcc gggcaagtca gggaaagccc ctaagctcct aggttcagtg gcagtggatc gaagattttg caacttacta gggaccaagg tggagatcaa tccatcctcc ctgtctgcat gagcattagc agctatttaa gatctatgct gcatccagtt tgggacagat ttcactctca ctgtcaacag agttacagta acgt ctgtaggaga cagagtcacc attggtatca gcagaaacca tgcaaagtgg ggtcccatca ccatcagcag tctgcaacct ccccgctcac tttcggcgga <210> 4 <211> 108 <212> PRT <213> Humano <400> 4 gac ate cag ttg acc cag tet cca tcc tcc ctg tet gea tet gta gga Asp Ile Gin Leu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 1 5 10 15 gac aga gtc acc ate act tgc cgg gea agt cag age att age age tat Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 tta aat tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gee cct aag etc ctg ate Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 32 tat gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tea agg ttc agt ggc Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc ate age agt ctg caa cct Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 gaa gat ttt gca act tac tac tgt caa cag agt tac agt acc ccg ctc Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr Ser Thr Pro Leu 85 90 95 act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag ate aaa cgt Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 5 <211> 360 <212> ADN <213> Humano <400> 5 gaggtgcagc tggtgcagtc tggggttgag gtgaagaagt ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg tgtccggata caccctcact gaattatcca tccactgggt gcgacaggct 120 cctgaaaaag ggcttgagtg gataggaggt cttgatcgtg aagacgggaa agcagtctcc 180 gcacagaggt tccagggcag agtcaccatg accgaggaca catccacaga cacaacctac 240 atgcaactga ccagcctgtc atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aacaggtgtt 300 gcttccgatg acgatgcttt tgaaatctgg ggccaaggga caatggtcac cgtctcttca 360 33 <210> 6 <211> 120 <212> PRT <213> Humano <400> 6 gag gtg cag ctg gtg cag tet ggg gtt gag gtg aag aag tet ggg gee Glu Vai Gin Leu Vai Gin Ser Gly Vai Glu Vai Lys Lys Ser Gly Ala 1 5 10 15 tca gtg aag gtc tcc tgc aag gtg tcc gga tac acc ctc act gaa tta Ser Vai Lys Vai Ser Cys Lys Vai Ser Gly Tyr Thr Leu Thr Glu Leu 20 25 30 tcc ate cac tgg gtg cga cag gct cct gaa aaa ggg ctt gag tgg ata Ser Ile His Trp Vai Arg Gin Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 gga ggt ctt gat cgt gaa gac ggg aaa gca gtc tcc gca cag agg ttc Gly Gly Leu Asp Arg Glu Asp Gly Lys Ala Vai Ser Ala Gin Arg Phe 50 55 60 cag ggc aga gtc acc atg acc gag gac aca tcc aca gac aca acc tac Gin Gly Arg Vai Thr Met Thr Glu Asp Thr Ser Thr Asp Thr Thr Tyr 65 70 75 80 atg caa ctg acc age ctg tca tet gag gac acg gee gtg tat tac tgt Met Gin Leu Thr Ser Leu Ser Ser Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys 85 90 95 gca aca ggt gtt gct tcc gat gac gat gct ttt gaa ate tgg ggc caa Ala Thr Gly Vai Ala Ser Asp Asp Asp Ala Phe Glu Ile Trp Gly Gin 100 105 110 ggg aca atg gtc acc gtc tet tca Gly Thr Met Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 34 <210> 7 <211> 324 <212> ADN <213> Humano <400> 7 gacatccagt tgacccagtc atcacttgcc gggcaagtca gggaaagccc ctaagctcct aggttcagtg gcagtggatc gaagattttg caacttacta gggacacgac tggagattaa <210> 8 <211> 108 <212> PRT <213> Humano tccatcctcc ctgtctgcat gagcattagc agctatttaa gatctatgct gcatccagtt tgggacagat ttcactctca ctgtcaacag agttacagta acgt ctgtaggaga cagagtcacc 60 attggtatca gcagaaacca 120 tgcaaagtgg ggtcccatca 180 ccatcagcag tctgcaacct 240 ccccgatcac cttcggccaa 300 324 <400> 8 gac ate cag ttg acc cag tet cca tcc tcc ctg tet gea tet gta gga Asp Ile Gin Lèu Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 1 5 10 15 gac aga gtc acc ate act tgc cgg gea agt cag age att age age tat Asp Arg Vai Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 35 tta ; 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Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 <210> 11 <211> 324 <212> ADN <213> Humano <400> 11 gacatcgtga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacatgcc gggcaagtca gtccattacc agatatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaaactcct gatctttgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cggttcagtg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaggattttg cgacttacta ctgtcaacac agttacacta ccccgctcac tttcggcgga 300 gggaccaaag tggatatcaa acgt 324

<210> 12 <211> 108 <212> PRT <213> Humano <400> 12 gac ate gtg atg Asp Ile Vai Met 1 gac aga gtc acc Asp Arg Vai Thr acc cag tet cca tcc tcc ctg tet gea tet gta gga Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly 5 10 15 ate aca tgc cgg gea agt cag tcc att acc aga tat Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser Ile Thr Arg Tyr 25 30 20 38 tta aat tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gee cct aaa ctc ctg ate Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 ttt gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tea cgg ttc agt ggc Phe Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 agt gga tct ggg aca gaa ttc act ctc acc ate age agt ctg caa cct Ser Gly Ser -Gly Thr Glu. Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 gag gat ttt gcg act tac tac tgt caa cac agt tac act acc ceg ctc Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin His Ser Tyr Thr Thr Pro Leu 85 90 95 act ttc ggc gga ggg acc aaa gtg gat ate aaa cgt Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Vai Asp Ile Lys Arg 100 105 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Humano <220> <223> CDRl de SEQUÊNCIA N <400> 13

Glu Leu Ser Ile His 5 39 <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> Humano <220> <223> CDR2 de SEQUÊNCIA Ν° 2, 6 ou 10 <223> Xaa representa Thr ou Ala. <400> 14

Gly Leu Asp Arg Glu Asp Gly Lys Xaa Vai Ser Ala Gin Arg Phe Gin 1 5 10 Gly <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Humano <220> <223> CDR3 de SEQUÊNCIA N° 2, 6 ou <400> 15

Gly Vai Ala Ser Asp Asp Asp Ala Phe Glu Ile 1 5 10 40 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> Humano <220> <223> CDR1 de SEQUÊNCIA Ν° 4, 8 ou 12 <223> Xal representa Ser ou Thr. <223> Xa2 representa Ser ou Arg. <400> 16

Arg Ala Ser Gin Ser Ile Xal Xa2 Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Humano <220> <223> CDR2 de SEQUÊNCIA N° 4, 8 ou 12 <400> 17

Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser 1 5 41 <210> 18 <211> 9 <212> PRT <213> Humano <220> <223> CDR3 de SEQUÊNCIA N 0 4, 8 ou <223> Xal representa Gin OU His . <223> Xa2 representa Ser OU Thr. <223> Xa3 representa Leu ou Ile. <400> 18

Gin Xal Ser Tyr Xa2 Thr Pro Xa3 Thr 1 5

Lisboa, 26 de Janeiro de 2009 42

Claims (9)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Fragmento génico codificando para uma cadeia VH de um anticorpo humano contra o factor VIII da coagulação sanguínea (FVIII), tendo uma actividade de inibição da actividade de coagulação (actividade inibidora) de FVIII humano, em que o referido anticorpo anti-FVIII humano não reconhece um complexo FVIII/factor de von Willebrand (vWF) e reconhece apenas o FVIII isento de vWF e em que as regiões determinantes de complementaridade (CDR1 a CDR3) da referida cadeia VH têm as seguintes sequências de aminoácidos: CDR1: Glu Leu Ser Ile His (SEQ ID N°: 13); CDR2: Gly Leu Asp Arg Glu Asp Gly Lys Xaa Vai Ser Ala Gin Arg Phe Gin Gly (Xaa = Thr ou Ala) (SEQ ID N°: 14); CDR3: Gly Vai Ala Ser Asp Asp Asp Ala Phe Glu Ile (SEQ ID N°: 15).
2. 2. Fragmento génico da reivindicação 1, em que a referida cadeia VH tem uma sequência nucleotídica codificando para a sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo em SEQ ID N°: 2, 6 e 10.
3. 3. Fragmento génico codificando para uma cadeia VL de um anticorpo anti-FVIII humano, tendo uma actividade de inibição da actividade de coagulação (actividade inibidora) de FVIII humano, em que o referido anticorpo anti-FVIII humano não reconhece um complexo FVIII/factor de von Willebrand e reconhece apenas o FVIII isento de vWF e em que as regiões determinantes de complementaridade (CDR1 a CDR3) da referida cadeia VL têm as seguintes sequências de aminoácidos: CDR1: Arg Ala Ser Gin Ser Ile Xal Xa2 Tyr Leu Asn (Xal = Ser ou Thr; Xa2 = Ser ou Arg) (SEQ ID N°: 16); CDR2: Ala Ala Ser Ser Leu Gin Ser (SEQ ID N°: 17); CDR3: Gin Xal Ser Tyr Xa2 Thr Pro Xa3 Thr (Xal = Gin ou His; Xa2 = Ser ou Thr; Xa3 = Leu ou Ile) (SEQ ID N°: 18) . Fragmento génico da reivindicação 3, em que a referida cadeia VL tem uma sequência nucleotidica codificando para a sequência de aminoácidos seleccionada do grupo consistindo em SEQ ID N°: 4, 8 e 12. Gene FV (scFv) de cadeia única compreendendo o fragmento génico codificando para a cadeia VH, como exposta na reivindicação 1 ou 2, ligado ao fragmento génico codificando para a cadeia VL, como exposta na reivindicação 3 ou 4. Fragmento génico codificando para o anticorpo anti-FVIII humano compreendendo o fragmento génico codificando para a cadeia VH, como exposta na reivindicação 1 ou 2, ligado ao fragmento génico codificando para a cadeia VL, como exposta na reivindicação 3 ou 4, em que o referido fragmento génico codificando para a cadeia VH e o referido fragmento génico codificando para a cadeia VL estão ligados a um gene de cadeia CH de anticorpo humano e a um gene de cadeia CL de anticorpo humano, respectivamente. 7. Fragmento génico codificando para o fragmento de anticorpo anti-FVIII humano compreendendo o fragmento génico codificando para a cadeia VH, como exposta na reivindicação 1 ou 2, e/ou o fragmento génico codificando para a cadeia VL, como exposta na reivindicação 3 ou 4, em gue o referido fragmento génico codificando para a cadeia VH e/ou o referido fragmento génico codificando para a cadeia VL estão ligados a um gene de cadeia CH de anticorpo humano, ou a uma sua parte, e a um gene de cadeia CL de anticorpo humano ou a uma sua parte, respectivamente.
4. 8. Fragmento génico da reivindicação 7, em que o referido fragmento de anticorpo é seleccionado do grupo consistindo em Fab, Fab' e F(ab')2.
5. 9. Fragmento génico codificando para um fragmento de anticorpo anti-FVIII humano compreendendo o gene Fv de cadeia única, como exposto na reivindicação 5, ligado quer a um gene de cadeia CH de anticorpo humano ou a uma sua parte, quer a um gene de cadeia CL de anticorpo humano ou a uma sua parte.
6. 10. Anticorpo anti-FVIII humano ou um fragmento de anticorpo anti-FVIII humano expresso pela técnica de engenharia genética a partir de um vector de expressão no qual o fragmento génico, como exposto em qualquer das reivindicações 1 a 9, é incorporado.
7. 11. Medicamento para a prevenção e tratamento de trombose, compreendendo o anticorpo anti-FVIII humano ou o fragmento do anticorpo anti-FVIII humano como exposto na reivindicação 10.
8. 12. Agente de diagnóstico para o FVIII activado, compreendendo o anticorpo anti-FVIII humano ou o fragmento do anticorpo anti-FVIII humano como exposto na reivindicação 10.
9. 13. Utilização do anticorpo anti-FVIII humano ou do fragmento do anticorpo anti-FVIII humano, como exposto na reivindicação 10, para a preparação de um medicamento para a prevenção e tratamento de trombose. Lisboa, 26 de Janeiro de 2009