PT1384075E

PT1384075E - Métodos de detecção de doença renal inicial em animais

Info

Publication number: PT1384075E
Application number: PT02733963T
Authority: PT
Inventors: Thomas Mcdonald; Wayne A Jensen; Annika Weber; Janet S Andrews
Original assignee: Heska Corp
Priority date: 2001-03-28
Filing date: 2002-03-28
Publication date: 2010-03-23
Also published as: JP2011232361A; CA2442074C; WO2002079781A1; AU2002305159B2; CY1109894T1; JP2009020120A; EP1384075B1; JP2006189461A; CA2442074A1; DK1384075T3; US7935495B2; JP2004537036A; EP1384075A1; US7172873B2; ATE452338T1; DE60234759D1; US20030022262A1; US20090098583A1; EP1384075A4

Description

ΕΡ 1 384 075/ΡΤ

DESCRIÇÃO

"Métodos de detecção de doença renal Inicial em animais" CAMPO DO INVENTO 0 presente invento refere-se à detecção de doença renal inicial em animais e, mais particularmente, à utilização de microalbuminúria como um marcador de doença renal inicial.

ANTECEDENTES DO INVENTO A doença glomerular é um termo geral utilizado para descrever várias doenças renais que podem conduzir a insuficiência renal e morte. A lesão do glomérulo aumenta a permeabilidade capilar a proteínas tais como albumina, resultando na presença de proteínas na urina (referida como proteinúria).

Em seres humanos, a proteinúria pode resultar de várias doenças, incluindo diabetes, hipertensão e nefropatia por IgA. 0 teste convencional para proteinúria em seres humanos consiste em utilizar um ensaio de tira-reagente (tipo "dipstick") de proteína padrão como descrito, por exemplo, em Bakris, Curr. Opin. in Neph. and Hypertension, 5:219-223 (1996). Estão disponíveis comercialmente tiras-reagentes, que estão impregnadas quimicamente com ácido sulfossalicílico, para medir proteínas numa amostra, por exemplo na Boehringer-Mannheim, Alemanha (Chemstrips™) e Ames Co., E.U.A. (Albustix™). Um inconveniente destes ensaios de tira-reagente é que estes requerem uma quantidade significativa de proteína na urina para esta ser detectada. Quantidades de proteína em humanos inferiores a 300 miligramas por dia não são detectáveis pelo ensaio de tira-reagente, ainda que a proteinúria possa ainda estar presente. Outro inconveniente destes ensaios baseados em proteína é que estes são incapazes de discriminar entre diferentes tipos de proteína (e.g., albumina, globulina, etc.) que podem estar presentes na urina. A proteinúria pode resultar da perda de proteínas de soro para o filtrado glomerular devida a glomerulonefrite; contudo, a proteinúria pode também estar presente devido a problemas não relacionados com doença renal tais como infecções da bexiga ou uma dieta rica em proteína. 2 ΕΡ 1 384 075/ΡΤ

Quantidades menores de albumina na urina, referidas como "microalbuminúria," indicam um nível de albumina que é superior ao de pacientes normais, mas inferior ao de pacientes com proteinúria evidente, í.e., clinicamente proteinúricos. Em humanos, a microalbuminúria refere-se a quantidades de albumina entre 30 miligramas por dia e 300 miligramas por dia, de acordo com Watts, Clin. Chem., 32(8):1544-1548 (1986). São conhecidos métodos para detectar microalbuminúria humana e estes incluem aqueles métodos que utilizam um anticorpo anti-albumina humana para detectar quantidades de albumina humana que não são detectáveis por métodos de tira-reagente conhecidos. Estes métodos de detecção de microalbuminúria em humano são descritos, por exemplo, na Patente U.S. N.° 5246835, concedida em 21 de Setembro de 1993, de Suzuki et al.

Ainda que a microalbuminúria possa ser detectada em humanos, a utilidade de detectar microalbuminúria em humanos pode ser muito limitada, pelo menos de acordo com alguns relatos. Por exemplo, a utilização dos testes de microalbuminúria para prever doença renal apenas tem sido recomendada para humanos com diabetes de acordo com Bakris, supra. Porque outras perturbações para além da diabetes, tais como hipertensão, doença cardíaca e nefropatia por igA, não conduzem a microalbuminúria consistente em humanos, de acordo com Bakris, supra, a detecção de microalbuminúria tem um valor preditivo pobre para doença renal tardia associada com estes estados de perturbações não diabéticas. Por conseguinte, a utilização de testes de microalbuminúria para rastrear doença renal potencial ou inicial em pacientes humanos não diabéticos não é geralmente recomendada por Bakris, supra. A doença renal é também um problema de saúde significativo em animais de companhia, particularmente cães e gatos. Em cães, a principal causa de doença renal é a lesão do glomérulo no rim. Ainda que a lesão glomerular em cães possa ocorrer de várias formas, é muito habitualmente causada quando imunocomplexos (í.e., complexos anticorpo/antigénio) em circulação são depositados nos capilares glomerulares como resultado de doença sistémica como descrito em Batamuzi, et al., Vet Record, 143; 16-20 (1988). Várias doenças têm sido implicadas na patogénese da formação de imunocomplexos, incluindo por exemplo, dirofilaríase e outras infecções parasitárias, diabetes, hipotiroidismo e outras. 3 ΕΡ 1 384 075/ΡΤ A doença renal inicial em medicina veterinária tem sido caracterizada por alterações glomerulares detectáveis por histopatologia, incluindo a utilização de microscópio óptico ou ocasionalmente imunofluorescência como noticiado em Vaden, Proc. 17th ACVIM, 420 (1999). Contudo, como noticiado nesse artigo, Estas técnicas podem conduzir a diagnóstico errado da causa da doença renal. A determinação da causa da doença renal é útil na formulação de um regime de tratamento apropriado. Por exemplo, se a causa da doença renal for mediada imunitariamente, então a terapia imunossupressora pode ser apropriada. No entanto, ensaios actualmente disponíveis para detectar microalbuminúria humana não são suficientemente sensíveis para detectar microalbuminúria canina. A WO 00/37944 descreve um método para detecção e tratamento de doença renal. A EP 0 198 639 refere-se a um método para a determinação de albumina.

Assim, existe uma necessidade para ensaios para detectar doença renal canina inicial em animais de companhia. O presente invento satisfaz esta necessidade e proporciona também vantagens relacionadas.

SUMÁRIO DO INVENTO O presente invento refere-se a um método para a detecção de doença renal inicial em canídeos, felídeos e equídeos. Animais preferidos para testar doença renal inicial são cães, gatos e cavalos. Concretizações do método aqui revelado são baseadas na constatação de que a presença de albumina numa amostra a partir de um animal, na gama de 10 pg/ml a 300 pg/ml, pode ser utilizada como um indicador de doença renal inicial. A amostra a testar é uma amostra de urina.

Qualquer ensaio capaz de detectar albumina pode ser utilizado no presente método ainda que métodos preferidos utilizem ensaios de base imunológica, preferivelmente ensaios num único passo. O ensaio mais preferido é um ensaio de base imunológica utilizando um anticorpo anti-albumina.

Pode-se utilizar qualquer anticorpo que se ligue a albumina do animal de teste; anticorpos preferidos ligam-se a albumina canina e/ou albumina felina e/ou albumina equina. 4 ΕΡ 1 384 075/ΡΤ

Anticorpos preferidos são TNBl, TNB3, TNB4, TNB5, TNB6, H352, H386, H38 7, H388, H389, H390, H391, H393, H394, H395, H396, H397, H398, H399, H400, H401 e H402. Células cultivadas produzem anticorpos adequados para a prática do presente invento.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO O presente invento refere-se em geral a um novo método de detecção de doença renal inicial em canídeos, felídeos e equídeos, e à utilização nesse método de novos anticorpos que se ligam selectivamente a albumina a partir de uma ou mais espécies de animal. Mais particularmente, o presente invento refere-se à constatação de que a presença de microalbuminúria pode ser utilizada para prever doença renal inicial in canídeos, felídeos e equídeos, particularmente doenças renais mediadas imunitariamente. Deste modo, os métodos podem também ser úteis para prescrição de um tratamento para um animal. Um tratamento adequado pode ser desenhado para retardar ou prevenir o aparecimento de doença renal de fase tardia. Exemplos de um tal tratamento incluem, por exemplo, modificação farmacológica ou dietética. 0 presente invento é também útil na monitorização da eficácia de um tratamento prescrito. 0 invento proporciona um método de acordo com a reivindicação 1. Uma quantidade de albumina numa gama desde cerca de 10 pg/ml a cerca de 300 pg/ml na amostra é indicativa de doença renal inicial. É de notar que o termo "uma" entidade refere-se a uma ou mais dessa entidade. Por exemplo, uma proteína refere-se a uma ou mais proteínas ou a pelo menos uma proteína. Como tal, os termos "uma", "uma ou mais" e "pelo menos uma" podem ser aqui utilizados indiferentemente. Os termos "compreendendo", "incluindo" e "possuindo" podem também ser utilizados indiferentemente. Adicionalmente, os termos "quantidade" e "nível" são também equivalentes e podem ser utilizados para descrever uma concentração ou uma quantidade específica. Para além disso, o termo "seleccionado entre o grupo consistindo de" refere-se a um ou mais membros do grupo na lista que se segue, incluindo misturas (i.e. combinações) de dois ou mais membros.

Como aqui utilizado, o termo "doença renal" é definido como uma disfunção do processo de filtração glomerular. A disfunção glomerular pode ser transiente ou pode ser crónica, 5 ΕΡ 1 384 075/ΡΤ dependendo da causa subjacente da doença. Uma consequência da disfunção glomerular é que proteínas, que são normalmente retidas no sangue, perdem-se através do glomérulo para o filtrado glomerular e, eventualmente, para a urina. Um exemplo de uma proteína que pode estar presente na urina devido a disfunção glomerular é a albumina e a sua presença na urina para níveis baixos foi denominada microalbuminúria. 0 termo "microalbuminúria", como aqui utilizado, refere-se a uma quantidade de albumina que está presente numa amostra numa gama de cerca de 10 pg/ml a cerca de 300 pg/ml quando a amostra está normalizada para um peso específico de 1,010 grama/mililitro (g/ml). Esta é superior à quantidade encontrada em animais saudáveis que é tipicamente baixa, i.e., inferior a 10 pg/ml. A microalbuminúria pode surgir como consequência de lesão do rim resultante, por exemplo, de glomerulonefrite mediada por imunocomplexo. Como aqui utilizado, o termo "doença renal de fase tardia" é utilizado para definir um estado no qual um animal perdeu 70% ou mais da sua função renal, com níveis elevados correspondentes nos metabolitos do soro do animal, em particular níveis de azoto de ureia no sangue (BUN, do inglês "blood-urea nitrogen") e níveis de creatinina no soro. Como aqui utilizado, o termo "doença renal inicial" é definido como a presença de microalbuminúria num animal na ausência de alterações detectáveis na função renal (i.e. BUN aumentado, creatinina no soro ou capacidade diminuída para concentrar urina). Como tal, um nível de albumina numa amostra de urina na gama de cerca de 10 pg/ml a cerca de 300 pg/ml quando a amostra é normalizada para um peso específico de 1,010 g/ml é indicativa de doença renal inicial.

Animais preferidos incluem, mas não estão limitados a, gatos, cães e cavalos.

Como aqui utilizado, um gato refere-se a qualquer membro da família dos gatos (i.e., Felidae), incluindo gatos domésticos, gatos selvagens e gatos de jardim zoológico. Exemplos de gatos incluem, mas não estão limitados a, gatos domésticos, leões, tigres, leopardos, panteras, pumas, linces ruivos, linces, jaguares, chitas e gatos-bravos africanos. Um gato preferido é um gato doméstico. Como aqui utilizado, um cão refere-se a qualquer membro da família Canidae, incluindo, mas não limitado a, cães domésticos, cães selvagens, raposas, lobos, chacais e coiotes, e outros membros da família Canidae. Um cão preferido é um cão doméstico. Como aqui utilizado, um 6 ΕΡ 1 384 075/ΡΤ cavalo refere-se a qualquer membro da família Equidae. Um equídeo é um mamífero ungulado e inclui, mas não está limitado a, cavalos domésticos e cavalos selvagens, tais como, cavalos, mulas, burros e zebras. Cavalos preferidos incluem cavalos domésticos, incluindo cavalos de raça.

Numa concretização do presente invento, obtém-se, ou colhe-se, uma amostra a partir de um animal a testar quanto à microalbuminúria. 0 animal pode ser ou não suspeito de ter doença renal em fase inicial. Uma amostra é qualquer espécime obtido a partir do animal que pode ser utilizado para medir a perda de albumina a partir do glomérulo. A urina é a amostra utilizada. Amostras de urina podem ser colhidas a partir de animais por métodos conhecidos na especialidade, incluindo, por exemplo, colheita enquanto o animal está a evacuar, ou colheita por cateterização, ou por cistocentese. A urina pode ser refrigerada ou congelada antes do ensaio, mas é ensaiada preferivelmente logo após a colheita.

Embora não necessário para o presente invento, a amostra pode ser pré-tratada como desejado. Por exemplo, a amostra pode ser normalizada para um peso específico desejado. A normalização da amostra por métodos de diluição apropriados conhecidos na especialidade permite a quantificação de microalbuminúria independente da concentração (e.g. peso específico) da amostra. Ainda que qualquer peso específico desejado possa ser facilmente seleccionado pelos peritos na especialidade, um peso específico particularmente adequado é 1,010. Se se desejar outro valor de peso específico para normalização de uma amostra, os peritos na especialidade podem facilmente determinar as quantidades de albumina apropriadas que cairão dentro da definição de microalbuminúria para o peso específico desejado.

Após obtenção da amostra, determina-se o nível de albumina nessa amostra. Como aqui utilizado, os termos "determinar", "determinar o nível de albumina", "determinar a quantidade de albumina", "determinar o nível de albumina" e similares, pretendem abranger qualquer técnica que possa ser utilizada para detectar ou medir a presença de albumina numa amostra. A albumina é um exemplo de um analito. O termo "analito", como aqui utilizado, é utilizado para descrever qualquer molécula ou composto presente numa amostra. Estas 7 ΕΡ 1 384 075/ΡΤ técnicas podem dar quaisquer resultados qualitativos ou quantitativos. Os niveis de albumina podem ser determinados por detecção da proteína albumina inteira ou por detecção de fragmentos, produtos de degradação ou produtos de reacção de albumina. Num método preferido, o nível de albumina é determinado utilizando um composto de ligação a albumina adequado.

Como aqui utilizado, os termos "molécula de ligação a albumina", "composto de ligação a albumina", "composto anti-albumina" e similares são utilizados indiferentemente e referem-se a qualquer molécula que se liga a albumina e forma um complexo estável. Um composto de ligação a albumina preferido é um que selectivamente se liga a albumina de um animal. 0 termo "selectivamente se liga a albumina" significa que preferencialmente se liga a albumina em contraste com a ligação a outras proteínas não relacionadas com albumina. Um composto de ligação a albumina particularmente útil é um anticorpo anti-albumina. Como aqui utilizados, os termos "anticorpo anti-albumina", "anticorpo para albumina", "anticorpo para albumina animal", "anticorpo possuindo especificidade por albumina de animais", "anticorpo de albumina animal" e similares referem-se a um anticorpo que preferencialmente se liga a albumina a partir de um ou mais animais. Um anticorpo anti-albumina particularmente adequado liga-se preferencialmente a albumina canina, felina e/ou equina em contraste com a ligação a proteínas caninas, felinas ou equinas não relacionadas, diferentes. Outro anticorpo anti-albumina particularmente adequado liga-se preferencialmente a albumina canina em contraste com a ligação a uma proteína canina não relacionada, diferente. Outro anticorpo particularmente adequado para albumina de animais de companhia liga-se preferencialmente a albumina felina em contraste com a ligação a uma proteína felina não relacionada, diferente. Outro anticorpo particularmente adequado para albumina de animais de companhia liga-se preferencialmente a albumina equina em contraste com a ligação a uma proteína equina não relacionada, diferente. 0 presente invento utiliza também anticorpos isolados (i.e., retirados do seu meio natural) que selectivamente se ligam a albumina de uma ou mais espécies animais. Anticorpos isolados para utilização no presente invento podem incluir anticorpos no soro ou anticorpos que foram purificados em vários graus. Anticorpos para utilização no presente invento 8 ΕΡ 1 384 075/ΡΤ podem ser policlonais ou monoclonais, ou podem ser equivalentes funcionais tais como fragmentos de anticorpo e anticorpos produzidos por engenharia genética, incluindo anticorpos de cadeia simples ou anticorpos quiméricos que se podem ligar a um ou mais epítopos na albumina. Um método adequado para produzir anticorpos eficazes para utilização no presente invento inclui (a) administrar a um animal uma quantidade eficaz de uma proteína, péptido ou seu mimetopo para produzir os anticorpos e (b) recuperar os anticorpos. Anticorpos criados contra proteínas definidas ou mimetopos podem ser vantajosos porque estes anticorpos não estão substancialmente contaminados com anticorpos contra outras substâncias que possam de outro modo causar interferência num ensaio de diagnóstico. Métodos para produzir estes anticorpos são conhecidos na especialidade e estão descritos em detalhe em Harlow et al., Antibodies, a Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Labs Press, 1988), e incluem a imunização de animais para produzir preparações de anticorpos policlonais que são recuperados, por exemplo, a partir de fluido ascítico e purificados por métodos conhecidos na especialidade para produzir preparações que são reactivas contra albumina animal. Muitas espécies têm proteínas partilhando sequências intimamente relacionadas e por isso pode ser difícil utilizar protocolos de imunização padrão para produzir anticorpos que reconhecem uma proteína a partir apenas de uma espécie. Assim, é também contemplada a modificação de métodos padrão utilizados para produzir anticorpos, tais como, por exemplo, técnicas de hibridação subtractiva. Estas modificações podem ser aquelas conhecidas dos peritos na especialidade ou técnicas adicionalmente modificadas como revelado neste pedido de patente. Noutro método, anticorpos para utilização no presente invento são produzidos de modo recombinante utilizando técnicas reveladas em Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Labs Press, 1989) .

Como anteriormente referido, outros métodos adequados incluem a produção de anticorpos monoclonais. Resumidamente, anticorpos monoclonais são produzidos a partir da fusão de células de baço de um animal imunizado e células de mieloma para produzir um hibridoma. Os hibridomas podem ser rastreados quanto à produção do anticorpo apropriado, e depois cultivados e os anticorpos colhidos. Como aqui utilizado, o termo "célula cultivada" refere-se a hibridomas ou qualquer célula que produz um anticorpo. Métodos para produzir e rastrear estes 9 ΕΡ 1 384 075/ΡΤ hibridomas são descritos em Harlow, et al., supra. Métodos para preparar um antigénio, tal que os anticorpos produzidos serão reactivos com albumina animal, são conhecidos na especialidade e são descritos, por exemplo, em Harlow, et al., supra. A preparação do material de antigénio para injecção no animal inclui qualquer técnica conhecida na especialidade, e inclui, por exemplo, utilização de uma proteína a todo o comprimento, utilização de péptidos seleccionados a partir de regiões imunogénicas da proteína, modificação do antigénio por métodos tais como, por exemplo, acoplamento de dinitrofenol, acoplamento de arsinilo, desnaturação do antigénio, acoplamento de antigénio a transportadores de proteína tais como, por exemplo, hemocianina de lapa Fissurella, péptidos contendo locais de ligação a receptores de células T de Classe II, a pérolas, e qualquer outro método conhecido na especialidade. Ver Harlow, et al., supra.

Os anticorpos anti-albumina para utilização no presente invento podem incluir anticorpos multifuncionais, por exemplo um anticorpo bifuncional possuindo pelo menos uma porção funcional que especificamente se liga a albumina animal. Estes anticorpos multifuncionais podem incluir, por exemplo, uma molécula quimérica compreendendo uma porção da molécula que se liga a albumina animal e uma segunda porção que permite à molécula quimérica ligar-se a um substrato ou ser detectada de um modo tal que a ligação à albumina não seja prejudicada. Exemplos de segundas porções adequadas incluem mas não estão limitados a um fragmento de uma molécula de imunoglobulina, uma proteína fluorescente ou uma enzima.

Para além de anticorpos anti-albumina, moléculas de ligação a albumina podem também incluir proteínas e péptidos que se ligam a albumina. Estas proteínas e péptidos podem ser de fontes naturais, recombinantes ou sintéticas, e podem ou não ser purificados. Exemplos de proteínas de ligação a albumina, não anticorpo, incluem, mas não estão limitados a, a Proteína A de 42 quilodaltons (kDa) de Staphlococcus aureus, Proteína G de S. aureus e Escherichia coli, a proteína de ligação de albumina de 60 kDa de rato (gp60) e a proteína cubilina de túbulo renal de humano. É também contemplada a utilização de homólogos funcionais destas proteínas, a partir destas ou de outras espécies, para a detecção de albumina. Podem também ser utilizados híbridos ou fusões de proteínas de ligação a albumina que retêm a sua capacidade de ligação a albumina. Nestes híbridos, a porção de ligação a albumina da 10 ΕΡ 1 384 075/ΡΤ proteína será unida à uma segunda porção o que permite ao híbrido ser ligado a um substrato ou ser detectado. Exemplos de segundas porções adequadas incluem, mas não estão limitados a, um fragmento de uma molécula de imunoglobulina, um marcador epitópico, uma proteína fluorescente ou uma enzima.

Uma molécula de ligação a albumina para utilização no presente invento pode estar contida numa formulação. Por exemplo, um anticorpo pode ser combinado com um tampão no qual o anticorpo é solubilizado e/ou com um transportador. Tampões e transportadores adequados são conhecidos dos peritos na especialidade. Exemplos de tampões adequados incluem qualquer tampão no qual uma molécula de ligação a albumina pode funcionar para se ligar selectivamente a albumina, tal como, mas não limitado a, solução salina tamponada com fosfato, água, solução salina, tampão de fosfato, tampão HEPES (solução salina tamponada de ácido N-2-hidroxietilpiperazino-N'-2-etanossulfónico), tampão TES (solução salina tamponada com Tris-EDTA), tampão Tris e tampão TAE (Tris-acetato-EDTA). Exemplos de transportadores incluem, mas não estão limitados a, matrizes poliméricas, toxóides e albuminas de soro, tais como albumina de soro de bovino. Os transportadores podem ser combinados com uma molécula de ligação a albumina ou conjugados (í.e. ligados) a uma molécula de ligação a albumina de um modo tal por forma a não interferir substancialmente com a capacidade da molécula de ligação a albumina para selectivamente se ligar a albumina. Adicionalmente, formulações adequadas do presente invento podem incluir não apenas a molécula de ligação a albumina para albumina específica da espécie, mas também um ou mais antigénios ou anticorpos adicionais úteis para detecção de albumina.

Como aqui utilizado, o termo "pôr contacto" refere-se à apresentação de uma amostra contendo putativamente albumina a um composto de ligação a albumina, por exemplo, por combinação ou mistura da amostra com o composto de ligação a albumina. Quando está presente albumina na amostra, forma-se então um complexo de albumina-composto; esta formação de complexo está relacionada com a capacidade de um composto anti-albumina para selectivamente se ligar à albumina de modo a formar um complexo estável que pode ser detectado. A detecção pode ser qualitativa, quantitativa ou semi-quantitativa. A ligação de albumina na amostra ao composto de ligação a albumina é levada a cabo sob condições adequadas para formar um complexo. Estas condições (e.g., concentrações apropriadas, tampões, 11 ΕΡ 1 384 075/ΡΤ temperaturas, tempos de reacção), bem como métodos para optimizar estas condições, são conhecidas dos peritos na especialidade. A ligação pode ser medida utilizando uma variedade de métodos padrão na especialidade incluindo, mas não limitados a, imunoensaios de enzima (e.g., ELISA), imunoprecipitações, ensaios de imunotransferência (irmunoblot) e outros imunoensaios como descrito, por exemplo, em Sambrook et al.f supra, e Harlow, et ai., supra. Estas referências proporcionam também exemplos de condições de formação de complexos.

Numa concretização, um complexo de albumina/composto de ligação a albumina, também aqui referido como um complexo de albumina-composto, pode ser formado em solução. Noutra concretização, pode-se formar um complexo de albumina/composto de ligação a albumina no qual a albumina ou o composto de ligação a albumina está imobilizado sobre (e.g., revestido sobre) um substrato. Técnicas de imobilização são conhecidas dos peritos na especialidade. Materiais de substrato adequados incluem, mas não estão limitados a, plástico, vidro, gel, celulóide, tecido, papel e materiais particulados. Exemplos de materiais de substrato incluem, mas não estão limitados a, látex, poliestireno, nylon, nitrocelulose, agarose, algodão, PVDF (polifluoreto de vinilideno) e resina magnética. Formas adequadas para material de substrato incluem, mas não estão limitados a, um poço (e.g., poço de placa de microtitulação), uma placa de microtitulação, uma tira-reagente (dipstick), uma fita, uma pérola, um dispositivo de fluxo lateral, uma membrana, um filtro, um tubo, um disco, uma matriz do tipo celulóide, uma partícula magnética e outros particulados. Substratos particularmente preferidos incluem, por exemplo, uma placa de ELISA, uma tira reagente, uma fita de imunotransferência por pontos (immunodot), uma placa de radioimunoensaio, uma pérola de agarose, uma pérola de plástico, uma pérola de látex, uma esponja, um fio de algodão, uma ficha de plástico, uma membrana de imunotransferência, um papel de imunotransferência e uma membrana de fluxo contínuo. Numa concretização, um substrato, tal como um particulado, pode incluir um marcador detectável. Para descrições de exemplos de materiais de substrato, ver, por exemplo, Kemeny, D.M. (1991) A Practical Guide to ELISA, Pergamon Press,

Elmsford, NY págs. 33-44, e Price, C. e Newman, D. eds.

Principies and Practice of Immunoassay, 2.a edição (1997) Stockton Press, NY, NY. 12 ΕΡ 1 384 075/ΡΤ

Numa concretização preferida, um composto anti-albumina é imobilizado sobre um substrato, tal como um poço de placa de microtitulação, uma tira-reagente {dipstick), uma fita de imunotransferência por pontos ou um dispositivo de fluxo lateral. Uma amostra de urina colhida a partir de um animal é aplicada ao substrato e incubada sob condições adequadas (í.e., suficientes) para permitir a formação de complexo de composto anti-albumina/albumina ligado ao substrato (í.e., albumina na amostra liga-se ao composto anti-albumina imobilizado sobre o substrato).

De acordo com o presente invento, uma vez formado, é detectado um complexo de molécula de ligação a albumina/albumina. Como aqui utilizado, o termo "detecção da formação de complexo" refere-se à identificação da presença de composto de ligação a albumina complexado a albumina. Se são formados complexos, a quantidade de complexos formada pode ser quantificada, mas não é necessário que o seja. A formação de complexo, ou ligação selectiva, entre uma composição de albumina putativa com um composto de ligação a albumina pode ser medida (í.e., detectada, determinada) utilizando uma variedade de métodos padrão na especialidade (ver, por exemplo, Sambrook. et al. supra.), exemplos dos quais são aqui revelados. Um complexo pode ser detectado de vários modos incluindo mas não limitados à utilização de um ou mais dos seguintes ensaios: imunoensaio ligado a enzima, um imunoensaio ligado a enzima competitivo, um radioimunoensaio, um imunoensaio de fluorescência, um ensaio quimioluminescente, um ensaio de fluxo lateral, em ensaio de fluxo contínuo, um ensaio de aglutinação, um ensaio baseado em particulados (e.g., utilizando particulados tais como, mas não limitados a, partículas magnéticas ou de polímeros de plástico, tais como pérolas de látex ou poliestireno), um ensaio de imunoprecipitação, um ensaio BioCore™ (e.g., utilizando ouro coloidal), um ensaio de imunotransferência por pontos (e.g., Sistema Immunodot CMG, Fribourg, Suíça), e um ensaio de imunotransferência (e.g., um Western blot), um ensaio de fosforescência, um ensaio de fluxo contínuo, um ensaio baseado em materiais particulados, um ensaio de cromatografia, um ensaio baseado em PAGe, um ensaio de ressonância plasmónica de superfície, um ensaio espectrofotométrico e um ensaio sensorial electrónico. Estes ensaios são bem conhecidos dos peritos na especialidade. 13 ΕΡ 1 384 075/ΡΤ

Podem ser utilizados ensaios para dar resultados qualitativos ou quantitativos dependendo de como estes são utilizados. Os resultados do ensaio podem ser baseados na detecção da molécula de albumina inteira ou de fragmentos, produtos de degradação ou produtos de reacção de albumina. Alguns ensaios, tais como aglutinação, separação de particulados e imunoprecipitação, podem ser observados visualmente (e.g., quer pelo olho quer por máquinas, tais como um densitómetro ou espectrofotómetro) sem a necessidade de um marcador detectável.

Noutros ensaios, a conjugação (i.e., ligação) de um marcador detectável ao composto anti-albumina, ou a um reagente que se liga selectivamente ao composto anti-albumina, ajuda a detectar a formação de complexo. Um marcador detectável pode ser conjugado ao composto ou reagente anti-albumina num local que não interfere com a capacidade do composto anti-albumina para se ligar a albumina. Métodos de conjugação são conhecidos dos peritos na especialidade. Exemplos de marcadores detectáveis incluem, mas não estão limitados a, um marcador radioactivo, um marcador fluorescente, um marcador quimioluminescente, um marcador cromofórico, um marcador enzimático, um marcador fosforescente, um marcador electrónico; um marcador de sol de metal, uma pérola corada, um marcador físico ou um ligando. Um ligando refere-se a uma molécula que se liga selectivamente a outra molécula. Marcadores detectáveis preferidos incluem, mas não estão limitados a, fluoresceína, um radioisótopo, uma fosfatase (e.g., fosfatase alcalina), biotina, avidina, uma peroxidase (e.g., peroxidase de rábano), beta-galactosidase, e compostos relacionados com biotina ou compostos relacionados com avidina (e.g., estreptavidina ou ImmunoPure® NeutrAvidin).

Numa concretização, um complexo de albumina animal-composto pode ser detectado por contacto de uma amostra com um anticorpo específico do composto conjugado a um marcador detectável. Um marcador detectável pode ser conjugado a um anticorpo anti-albumina ou outro composto que se liga ao composto de ligação a albumina de um modo tal por forma a não bloquear a capacidade do anticorpo anti-composto ou do outro composto para se ligar ao composto de ligação a albumina canina que está a ser detectada. Marcadores detectáveis preferidos incluem, mas não estão limitados a, fluoresceína, um radioisótopo, uma fosfatase (e.g., fosfatase alcalina), biotina, avidina, uma peroxidase (e.g., peroxidase de rábano), 14 ΕΡ 1 384 075/ΡΤ beta-galactosidase, e compostos relacionados com biotina ou compostos relacionados com avidina (e.g., estreptavidina ou

ImmunoPure® NeutrAvidin).

Noutra concretização, um complexo é detectado por contacto do complexo com uma molécula indicadora. Moléculas indicadoras adequadas incluem moléculas que se podem ligar ao complexo de albumina/molécula de ligação a albumina ou à albumina. Como tal, uma molécula indicadora pode compreender, por exemplo, um reagente de ligação a albumina, tal como um anticorpo. Moléculas indicadoras preferidas que são anticorpos incluem, por exemplo, anticorpos reactivos com os anticorpos de espécies de animais nos quais os anticorpos anti-albumina são produzidos. Uma molécula indicadora pode estar ela própria ligada a um marcador detectável para utilização no presente invento. Por exemplo, um anticorpo pode estar conjugado a biotina, peroxidase de rábano, fosfatase alcalina ou fluoresceina.

Na prática do invento, podem-se utilizar uma ou mais camadas e/ou tipos de moléculas secundárias ou outras moléculas de ligação capazes de detectarem a presença de uma molécula indicadora. Por exemplo, um anticorpo secundário não marcado (í.e., não conjugado a um marcador detectável) que selectivamente se liga a uma molécula indicadora pode ser ligado a um anticorpo terciário marcado (í.e., conjugado a um marcador detectável) que se liga selectivamente ao anticorpo secundário. Anticorpos secundários, anticorpos terciários e outras moléculas secundárias ou terciárias adequadas podem ser facilmente seleccionados pelos peritos na especialidade. Moléculas terciárias preferidas podem também ser seleccionadas pelos peritos na especialidade com base nas caracteristicas da molécula secundária. A mesma estratégia pode ser aplicada para camadas subsequentes.

Preferivelmente, a molécula indicadora é conjugada a um marcador detectável. Adiciona-se um agente de revelação, se requerido, e o substrato é submetido a um dispositivo de detecção para análise. Nalguns protocolos, acrescentam-se passos de lavagem após um ou ambos os passos de formação de complexo de modo a remover reagentes em excesso. Se se utilizarem estes passos, estes envolvem condições conhecidas dos peritos na especialidade tal que os reagentes e excesso sejam removidos mas o complexo fique retido. 15 ΕΡ 1 384 075/ΡΤ

Uma concretização para detectar microalbuminúria envolve a utilização de um ensaio de fluxo lateral, exemplos dos quais estão descritos na Patente U.S. N.° 5424193, concedida em 13 de Junho de 1995, por Pronovost et al.; Patente U.S. N.° 5415994, concedida em 16 de Maio de 1995, por Imrich et al.; WO 94/29696, publicada em 22 de Dezembro de 1994, por Miller et al.; e WO 94/01775, publicada em 20 de Janeiro de 1994, por Pawlak et al. Um ensaio de fluxo lateral é um exemplo de um ensaio num único passo. Num ensaio num único passo, uma vez obtida e preparada a amostra para ensaio, apenas é necessária uma única acção por parte do utilizador para detectar a presença de um analito. Por exemplo, a amostra, em todo ou em parte, pode ser aplicada a um dispositivo que depois mede o analito na amostra. Numa concretização, uma amostra é colocada num dispositivo de fluxo lateral que inclui os componentes seguintes: (a) uma estrutura de suporte definindo um percurso de fluxo; (b) um reagente de marcação compreendendo uma pérola conjugada a um anticorpo especifico, o reagente de marcação estando impregnado na estrutura de suporte dentro de uma zona de marcação; e (c) um reagente de captura. Anticorpos preferidos incluem os aqui revelados. O reagente de captura está localizado a jusante do reagente marcador numa zona de captura ligada em termos fluidos à zona de marcação de um modo tal que o reagente de marcação possa fluir da zona de marcação para a zona de captura. A estrutura de suporte compreende um material que não impede o fluxo das pérolas da zona de marcação para a zona de captura. Materiais adequados para utilização como uma estrutura de suporte incluem um material iónico (i.e., aniónico ou catiónico) . Exemplos de um tal material incluem, mas não estão limitados a, nitrocelulose, PVDF ou carboximetilcelulose. A estrutura de suporte define um percurso de fluxo que é lateral e está dividido em zonas, nomeadamente uma zona de marcação e uma zona de captura. O dispositivo pode ainda incluir uma zona de recepção de amostra localizada ao longo do percurso de fluxo, preferivelmente a montante do reagente de marcação. O percurso de fluxo na estrutura de suporte é criado por contacto de uma porção da estrutura de suporte a jusante da zona de captura, preferivelmente no final do percurso de fluxo, com um absorvente capaz de absorver líquido em excesso a partir das zonas de marcação e captura.

Noutra concretização, um dispositivo de fluxo lateral utilizado para detectar albumina inclui: (a) uma estrutura de suporte definindo um percurso de fluxo; (b) um reagente de 16 ΕΡ 1 384 075/ΡΤ marcação compreendendo um anticorpo anti-albumina como acima descrito, o reagente de marcação impregnado na estrutura de suporte numa zona de marcação; e (c) um reagente de captura, o reagente de captura estando localizado a jusante do reagente de marcação numa zona de captura ligada em termos fluidos à zona de marcação de um modo tal que o reagente de marcação pode fluir da zona de marcação para a zona de captura. 0 dispositivo inclui também preferivelmente uma zona de recepção de amostra localizada ao longo do percurso de fluxo, preferivelmente a montante do reagente de marcação. 0 dispositivo inclui também preferivelmente um absorvente localizado no final do percurso de fluxo. Uma concretização preferida inclui um reagente de captura compreendendo anticorpo anti-albumina canina.

Uma vez medido o nivel de albumina, pode então efectuar-se a avaliação de estar ou não presente doença renal inicial. Avaliação da presença de doença renal inicial significa comparar o nivel de albumina na amostra de teste com o nivel encontrado em animais saudáveis. A presença de microalbuminúria na amostra, na ausência de alterações na função renal, é indicativa de doença renal inicial. Como aqui utilizado, o termo "indicativo de doença renal inicial" significa que está presente disfunção glomerular suficiente para permitir que a albumina passe para a urina na gama desde cerca de 10 pg/ml a cerca de 300 pg/ml. A quantidade de albumina presente na amostra pode variar dependendo da quantidade de lesão presente mas, na doença renal inicial, o nivel de albumina é superior ao encontrado em animais saudáveis mas inferior ao detectável por métodos actuais utilizados para medir proteinúria. No presente invento, a determinação de doença renal inicial é efectuada quando se determina que o nivel de albumina na amostra está na gama desde cerca de 10 pg/ml a cerca de 300 pg/ml. O limite superior dos niveis de albumina pode também ser cerca de 25 pg/ml, cerca de 50 pg/ml, cerca de 75 pg/ml, cerca de 100 pg/ml, cerca de 125 pg/ml, cerca de 150 pg/ml, cerca de 175 pg/ml, cerca de 200 pg/ml, cerca de 225 pg/ml, cerca de 250 pg/ml, cerca de 275 pg/ml ou cerca de 300 pg/ml. O nivel de albumina na amostra pode variar dependendo da gravidade da lesão no rim. Concretizações preferidas do presente invento podem detectar albumina quando cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80% ou cerca de 90% da função renal está perdida. Uma concretização mais preferida pode detectar 17 ΕΡ 1 384 075/ΡΤ microalbuminúria a tempo para intervenção médica que pode então retardar ou prevenir o aparecimento de doença renal de fase tardia. Esta intervenção pode incluir, por exemplo, mas sem estar limitada, a utilização de compostos farmacológicos ou modificações dietéticas para retardar ou prevenir a progressão de doença renal.

Uma concretização do presente invento utiliza um dispositivo de "tira-reagente" (dipstick) que pode detectar microalbuminúria em animais. As tiras-reagentes podem ser construídas de vários modos que parcialmente dependem do modo como serão utilizadas. Podem ser mantidas directamente numa amostra (e.g., uma corrente de urina), mergulhadas directamente em amostra contida num recipiente de colheita ou amostra aplicada a uma fita contida numa cassete ou plataforma de plástico. Outro exemplo de uma tira-reagente é um dispositivo de "de fluxo contínuo", um exemplo do qual é um sistema de ensaio imunométrico heterogéneo baseado num anticorpo de captura imobilizado sobre uma membrana ligada a um reservatório absorvente. Uma "pérola" refere-se a um substrato particulado, composto de uma matriz tal como látex ou poliestireno, que pode ser ligado de modo cruzado, covalentemente ou não covalentemente, a uma molécula de detecção. Uma concretização preferida do ensaio de "tira-reagente" é um sistema imunométrico, descrito na Patente U.S. N.° 5656502, concedida em 12 de Agosto de 1997, de MacKay e Fredrickson, e Patente U.S. N.° 6001658, concedida em 14 de Dezembro de 1999 de Fredrickson. Particularmente preferido é um dispositivo ImmunoDip disponível na Diagnostic Chemicals Ltd., PEI, CA.

Podem também ser utilizados métodos não imunológicos. De modo a detectar microalbuminúria, podem-se utilizar métodos, tais como pré-concentração da urina de modo a concentrar a albumina, para aumentar a sensibilidade do teste à proteína. Estes métodos não imunológicos incluem, por exemplo, electroforese de urina, onde a detecção de microalbuminúria pode ser determinada por métodos conhecidos na especialidade, e incluem, por exemplo, coloração de proteina. Noutra concretização, pode-se utilizar um teste de albumina baseado em proteína para determinar a microalbuminúria numa amostra pré-concentrada de urina a partir de um animal.

Os métodos do presente invento podem ser utilizados para detectar nefropatia num canídeo, felídeo ou equídeo, 18 ΕΡ 1 384 075/ΡΤ particularmente quando a nefropatia é glomerulonefropatia, e especialmente glomerulonefrite. Mais especificamente, a medição de microalbuminúria está correlacionada com a presença de doença renal inicial num animal alvo. Como aqui utilizado, o termo "nefropatia" e/ou "doença renal" refere-se a qualquer doença dos rins, e pode incluir, por exemplo, nefrite dos tecidos renais glomerulares, tubulares ou intersticiais.

Esta nefropatia de fase inicial pode resultar de muitas causas diferentes, incluindo, por exemplo, alergia, cancro, infecção parasitária, virai ou bacteriana de qualquer tecido no animal, exposição a toxinas renais, doenças mediadas imunitariamente, tais como lúpus eritematoso sistémico e vasculite, doenças malignas, rodenticidas, Vitamina D3, pielonefrite, leptospirose, obstrução do tracto urinário, doença inflamatória crónica, pioderma, pancreatite, prostatite, doenças mediadas imunitariamente, doenças dentárias, pressão sanguínea elevada ou diabetes. Como aqui utilizado, um "agente infeccioso" é um agente que infecta animais e inclui, mas não está limitado a, vírus, bactérias, fungos, endoparasitas e ectoparasitas. Exemplos de agentes infecciosos virais incluem, mas não estão limitados a, adenovírus, calicivírus, coronavírus, vírus da esgana, vírus da hepatite, vírus herpes, vírus de imunodeficiência, vírus de peritonite infecciosa, vírus de leucemia, vírus oncogénicos, vírus papiloma, vírus parainfluenza, parvovírus, vírus da raiva e reovírus, bem como outros vírus causadores de cancro ou relacionados com o cancro. Exemplos de agentes infecciosos bacterianos incluem, mas não estão limitados a, Actinomyces, Bacillus, Bacteroides, Bartonella, Bordetella, Borrelia, Brucella, Campylobacter, Capnocytophaga, Clostridium, Corynebacterium, Coxiella, Dermatophilus, Ehrlichia, Enterococcus, Escherichia, Francisella, Fusobacterium, Haemobartonella, Helicobacter, Klebsiella, bactérias de forma L, Leptospira, Listeria, Mycobacteria, Mycoplasma, Neorickettsia, Nocardia, Pasteurella, Peptococcus, Peptostreptococcus, Proteus, Pseudomonas, Rickettsia, Rochalimaea, Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus e Yersinia. Exemplos de agentes infecciosos fúngicos incluem, mas não estão limitados a, Absidia, Acremonium, Alternaria, Aspergillus, Basidiobolus, Bipolaris, Blastomyces, Candida, Chlamydia/ Coccidioides, Conidiobolus, Cryptococcus, Curvalaria, Epidermophyton, Exophiala, Geotrichum, Histoplasma, Madurella, Malassezia, Microsporum, Moniliella, Mortierella, Mucor, Paecilomyces, Penicillium, 19 ΕΡ 1 384 075/ΡΤ

Phialemonium, Phialophora, Prototheca, Pseudallescheria, Pseudomicrodochium, Pythium, Rhinosporidium, Rhizopus, Scolecobasídíum, Sporothrix, Stemphylium, Trichophyton, Trichosporone e Xylohypha. Exemplos de agentes infecciosos parasitas protozoários incluem, mas não estão limitados a, Babesia, Balantidium, Besnoitia, Cryptosporidium, Eimeria, Encephalitozoon, Entamoeba, Giardia, Hammondia, Hepatozoon, Isospora, Leishmania, Microsporidia, Neospora, Nosema, Pentatrichomonas, Plasmodium, Pneumocystis, Sarcocystis, Schistosoma, Theileria, Toxoplasma e Trypanosoma. Exemplos de agentes infecciosos parasitas helmínticos incluem, mas não estão limitados a, Acanthocheilonema, Aelurostrongylus, Ancylostoma, Angiostrongylus, Ascaris, Brugia, Bunostomum, Capillaria, Chabertia, Cooperia, Crenosoma, Dictyocaulus, Dioctophyme, Dipetalonema, Diphyllobothrium, Diplydium, Dirofilaria, Dracunculus, Enterobius, Filaroides, Haemonchus, Lagochilascaris, Loa, Mansonella, Muellerius, Nanophyetus, Necator, Nematodirus, Oesophagostomum, Onchocerca, Opisthorchis, Ostertagia, Parafilaria, Paragonimus, Parascaris, Physaloptera, Protostrongylus, Setaria, Spírocerca, Spirometra, Stephanofilaria, Strongyloides, Strongylus, Thelazia, Toxascaris, Toxocara, Trichinella, Trichostrongylus, Trichuris, Uncinaria e Wuchereria. Exemplos de agentes infecciosos ectoparasitas incluem, mas não estão limitados a, pulgas, carraças, incluindo carraças duras e carraças moles, moscas tais como melgas, mosquitos, flebótomos, moscas negras, moscas do cavalo, moscas dos chifres, moscas de veado, moscas tsé-tsé, moscas do estábulos, moscas causadoras de míase e mosquitos picadores, formigas, aranhas, piolhos, ácaros, e percevejos tais como percevejos das camas e percevejos hematófagos. 0 presente invento pode também incluir a medição de múltiplos analitos. Outros analitos podem ser qualquer analito que possa ser detectado numa amostra, adequado para utilização na detecção de doença renal inicial. Podem-se utilizar analitos adicionais para detectar, por exemplo, uma doença infecciosa ou erros de metabolismo congénitos. 0 presente invento utiliza anticorpos que se ligam a albumina a partir de um animal que está a ser testado. Um anticorpo preferido é um que detecta níveis de albumina quando a quantidade na amostra é cerca de 50 pg/ml, mais preferivelmente 25 pg/ml, mais preferivelmente 10 pg/ml. Outro anticorpo preferido é um que detecta níveis de albumina quando 20 ΕΡ 1 384 075/ΡΤ a quantidade na amostra é cerca de 50 pg/ml, mais preferivelmente cerca de 25 pg/ml, mais preferivelmente cerca de 10 pg/ml e o método de detecção é um dispositivo de tira-reagente descrito na Patente U.S. N.° 6001658. Um anticorpo preferido é um que compete com qualquer dos anticorpos monoclonais TNB1, TNB3, TNB4, TNB5, TNB6, H352, H386, H387, H388, H389, H390, H391, H393, H394, H395, H396, H397, H398, H399, H400, H401 ou H402 pela ligação selectiva a albumina animal, preferivelmente albumina canina. Outra concretização preferida é um anticorpo que se liga ao mesmo epitopo ou a um epitopo relacionado, como definido por homologia de sequência, ligado pelos anticorpos TNB3, TNB6 e H402. Um anticorpo preferido é seleccionado entre o grupo consistindo de TNB1, TNB3, TNB4, TNB5, TNB6, H352, H386, H387, H388, H389, H390, H391, H393, H394, H395, H396, H397, H398, H399, H400, H401 e H402. É mais preferido um anticorpo seleccionado entre o grupo consistindo de TNB3, TNB6 e H402. Como aqui utilizado, os termos "compete" e "inibe a ligação selectiva" referem-se à capacidade de um anticorpo para impedir outro anticorpo de se ligar à mesma proteina como descrito nos exemplos inclusos. O presente invento pode utilizar kits adequados para detecção de albumina animal utilizando os métodos aqui revelados. Meios de detecção adequados incluem as técnicas aqui reveladas, utilizando compostos que se ligam à albumina animal desejada, tais como, por exemplo, um anticorpo anti-albumina. Como tal, um kit pode também compreender um marcador detectável, tal como um anticorpo que se liga selectivamente ao composto de ligação a albumina ou outras moléculas indicadoras. O kit pode também conter componentes associados, tais como, mas não limitados a, tampões, rótulos, recipientes, folhetos, tubagens, frascos, seringas e outros. O presente invento é baseado numa constatação surpreendente de que a microalbuminúria em canídeos pode ser utilizada como um marcador para prever o desenvolvimento de doença renal em cães não diabéticos bem como em cães diabéticos, uma vez que a microalbuminúria não tem um valor claramente preditivo em pacientes humanos não diabéticos. São contempladas utilizações similares noutros animais como reivindicado. Contudo, apesar desta constatação surpreendente, até ao presente invento, não existiam métodos eficazes para detectar microalbuminúria em cães. Os métodos convencionais de detecção de microalbuminúria em humanos não detectam microalbuminúria no cão como a seguir descrito nos exemplos. 21 ΕΡ 1 384 075/ΡΤ

Os exemplos são fornecidos para efeitos de ilustração e não pretendem limitar o âmbito do presente invento.

Exemplo 1

Medição de microalbuminúria em cães normais, CRF e ARF

Colheram-se amostras de urina de 134 pacientes caninos no Colorado State University Teaching Hospital. Estas amostras incluíram urina de cães normais, cães padecendo de insuficiência renal crónica, cães padecendo de insuficiência renal aguda e cães proteinúricos sem insuficiência renal. Congelaram-se as amostras a -20°C durante pelo menos 24 horas e depois descongelaram-se antes da utilização. Os níveis de albumina foram quantificados por um ensaio de imunodifusão micro-radial como descrito em McDonald, Weber & Thiele, "Construction and Use of a Template Block for Radial Immunodiffusion", Anal. Biochem. 186:165-168 (1990) utilizando um anticorpo anti-albumina comercial (anticorpo policlonal de coelho anti-albumina de cão, disponível na Nordic Immunology distribuído por Accurate Chemical and Scientific Corp., Westbury, N.Y.). Para este ensaio, adicionou-se o anticorpo a 1,5% (vol/vol) a agarose EEO fundida a 0,75% (p/vol) em PBS. Verteram-se géis com uma espessura de 0,75 mm entre duas placas de vidro. Deixaram-se os géis solidificar e, após se remover uma das placas de vidro, deixou-se secar ligeiramente. Colocaram-se blocos acrílicos, descritos em McDonald et al., supra., sobre a agarose e colocaram-se 5 μΐ de amostra ou de padrão em cada poço do bloco acrílico. As amostras foram ensaiadas ou não diluídas ou, se o anel resultante era demasiado grande para medir a amostra, foram diluídas e de novo testadas. A curva de calibração utilizando albumina de cão (albumina de cão fracção V, disponível na Sigma, St. Louis, MO) era linear dentro da gama de 10 - 100 pg/ml.

Deixaram-se os blocos acrílicos sobre a agarose e colocou-se a unidade numa câmara húmida e incubou-se de um dia para o outro à temperatura ambiente. Encharcaram-se depois os géis de agarose em água destilada durante várias horas para remover a proteína em excesso do gel, secou-se o gel e depois corou-se com Azul Brilhante de Coomassie, tal que os anéis de precipitina pudessem ser facilmente visualizados. Mediu-se o diâmetro de cada anel e comparou-se o diâmetro do anel a partir de cada amostra com a curva de calibração e calculou-se a concentração de albumina de cada amostra. 22 ΕΡ 1 384 075/ΡΤ A vantagem da utilização deste sistema para medição de albumina na urina é que este sistema é mais sensível que o ensaio tradicional com poços cortados nos géis. Esta sensibilidade aumentada está relacionada com a entrega concentrada do antigénio a uma pequena área em contraste com a maior área superficial criada pelas arestas de um poço cortado na agarose. Para este estudo inicial, amostras que tinham um nível menor ou igual a 50 pg/ml foram consideradas normais, amostras que tinham níveis entre 51 e 300 pg/ml foram consideradas microalbuminúricas e aquelas que tinham níveis acima de 300 pg/ml foram consideradas macroalbuminúricas. Os resultados deste estudo são apresentados na Tabela 1.

Tabela 1. Níveis urinários de albumina em 134 amostras de urina caninas Nível de albumina Número de animais Percentagem Normal (0-50 pg/ml) 59 44% Microalbuminúria (51-300 pg/ml) 21 16% Macroalbuminúria (>300 pg/ml) 54 40%

Exemplo 2

Quantificação ELISA de microalbuminúria

Dilui-se igG de coelho anti-albumina de soro canina (igG anti-CSA) a 375 ng/ml em tampão de revestimento (50 mM Na2C02/NaCH03, pH 9,6). Adiciona-se a solução de IgG anti-CSA diluída a uma placa de MaxiSorp™ C8 Break-apart Microwells (Cat. Nunc # 473768) a 100 μΐ/poço, tapa-se e incuba-se de um dia para o outro (16 a 24 horas) a 4°C. Lava-se a placa quatro vezes com solução salina tamponada com fosfato com 0,05% de Tween 20 (PBS-T) num equipamento de lavagem de placas automático e seca-se com mata-borrão. Adiciona-se tampão de bloqueio (StabilCoat™ disponível na Surmodics Cat. #SC01-1000) a 200 μΐ/poço, tapa-se e incuba-se à temperatura ambiente durante pelo menos 1 hora.

Enquanto se bloqueia, prepara-se uma série de diluições de albumina de soro canina (CSA). Primeiro, dilui-se a CSA a 120 ng/ml em diluente de ensaio (hidrolisado de caseína a 0,1% em PBS-T). Dilui-se esta solução em série (1 parte para 1 parte) para perfazer 60 ng/ml, 30 ng/ml, 7,5 ng/ml, 23 ΕΡ 1 384 075/ΡΤ 3,75 ng/ml e 1,875 ng/ml. Utilizam-se os últimos 5 padrões para a curva de calibração (30 ng/ml e menos) conjuntamente com um padrão "zero" (diluente de ensaio sem CSA). Cada amostra de urina a ser testada é diluída 1/500, 1/1000, 1/2000, 1/4000, 1/8000, 1/16000 e 1/32000 em diluente de ensaio.

Lava-se depois a placa quatro vezes num equipamento de lavagem de placas automático e seca-se com mata-borrão. Adicionam-se padrão de CSA e amostra de urina diluída a 100 μΐ/poço de cada aos poços de teste. Adiciona-se diluente de ensaio a poços em duplicado para controlo dos valores residuais. Tapa-se a placa e incuba-se durante 2 horas à temperatura ambiente. Como anteriormente, lava-se a placa quatro vezes com PBS-T e seca-se com mata-borrão.

Diluir igG de cabra anti-CSA marcada com biotina (Bethyl Laboratories, Cat. #E40—113)] a 125 ng/ml em diluente de ensaio. Adicionar 100 μΐ/poço de IgG de cabra anti-CSA marcada com biotina diluída a todos os poços de teste. Tapar a placa e incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente. Como anteriormente, lavar a placa quatro vezes com PBS-T e secar com mata-borrão.

Diluir estreptavidina marcada com peroxidase de rábano (KPL Cat.# 14-30-00) a 500 ng/ml (diluição 1/1000) em diluente de ensaio e adicionar a todos os poços de teste a 100 μΐ/poço. Tapar e incubar à temperatura ambiente durante 30 minutos. Como anteriormente, lavar a placa quatro vezes com PBS-T e secar com mata-borrão.

Misturar em conjunto as soluções do sistema de dois componentes de peroxidase TMB microwell (KPL Cat.#50-76-03) em volumes iguais e adicionar 100 μΐ/poço da mistura TMB a todos os poços. Tapar e incubar durante 30 minutos à temperatura ambiente. A reacção é parada por adição de 100 μΐ/poço de solução de paragem (H3P04 1 M) directamente ao TMB em cada poço. Ler os poços a 450 nm num espectrofotómetro. Calcular a média dos valores de todos os poços em duplicado, se existirem, e subtrair o valor residual a todos os valores de teste. Gerar uma curva de calibração a partir dos valores dos padrões e gerar uma linha de regressão (r2>0,95). Utilizando a fórmula de regressão, calcular o valor de CSA (ng/ml) para cada amostra e multiplicar este valor pelo factor de diluição. 24 ΕΡ 1 384 075/ΡΤ

Apenas deverão ser utilizados valores que caem na porção linear da curva de calibração.

Exemplo 3

Utilização da tira ImmunoDip™ para a detecção de microalbuminúria em urina canina

Obtiveram-se três tiras ImmunoDip™ (código de produto 700-01) para a detecção de microalbuminúria em humanos na Diagnostic Chemicals Limited, Charlottetown, Prince Edward Island, Canadá. Seleccionaram-se duas amostras de urina canina (numeradas 1086 e 1098) de um grupo de amostras obtidas a partir de cães no Colorado State University Veterinary

Teaching Hospital, Fort Collins, Colorado. As amostras 1086 e 1098 foram seleccionadas com base nos seus níveis de albumina como determinados por um ELISA interno para detectar microalbuminúria em cães. A amostra 1086 era uma amostra negativa e a amostra 1098 tinha uma concentração de albumina de 221 pg/ml. Para um controlo positivo, adicionaram-se aproximadamente 50 μΐ de sangue humano a 5 ml de água desionizada. A medição de albumina na urina foi realizada de acordo com as indicações do fabricante. Resumidamente, adicionaram-se a um tubo de ensaio 3 ml de urina ou da água salpicada de sangue. Removeu-se a tira ImmunoDip da bolsa e colocou-se no tubo de ensaio contendo a urina assegurando que o nível de fluido estava acima do orifício de passagem no dispositivo. Deixou-se o dispositivo na amostra durante um mínimo de 3 minutos após o que este foi removido e lido por comparação das intensidades relativas das duas bandas de acordo com o folheto de interpretação de resultados que acompanha o kit de teste. Os resultados do ELISA interno e dos testes ImmunoDip são apresentados na Tabela 2.

Tabela 2. Tira ImmunoDip™ para resultados de microalbuminúria

Amostra ELISA interno ImmunoDip 1086 0 pg/ml Negativo 1098 221 pg/ml Negativo Água salpicada com sangue Não testado Positivo 25 ΕΡ 1 384 075/ΡΤ Ο limite de detecção no teste immunoDip para albumina de urina humana é 12 pg/ml. A amostra 1098 continha urina canina num nível significativamente acima deste limite inferior, mas ainda assim era negativa para albumina pelo teste ImmunDip™. Estes dados sugerem que este dispositivo não reconhece albumina canina, pelo menos não de modo a detectar microalbuminúria.

Exemplo 4

Utilização de fitas de teste Micral® para a detecção de microalbuminúria em urina canina

Obtiveram-se catorze tiras de teste de urina Micral® (código de produto 417146) para a detecção de microalbuminúria em humanos na Roche BMC, Indianapolis, Indiana. Seleccionaram-se treze amostras de urina canina a partir de um grupo de amostras obtidas a partir dos cães dos funcionários. As amostras para utilização foram seleccionadas com base nos seus níveis de albumina como determinados por um ELISA interno para detectar microalbuminúria em cães. As amostras 2A, 4A & 16A eram amostras negativas enquanto as restantes amostras tinham concentrações de albumina com um valor na gama de 31,3 a >650 pg/ml. Como controlo positivo, adicionaram-se 50 μΐ de sangue humano a 5 ml de água desionizada. A medição de albumina na urina foi realizada de acordo com as indicações do fabricante. Resumidamente, colheu-se a urina de cada cão num copo de colheita de amostra. Adicionalmente, colocou-se água salpicada com sangue num tubo de ensaio. Removeu-se a tira Micral® do frasco e colocou-se no copo de colheita (ou tubo de ensaio contendo a água salpicada com sangue) assegurando que o nível de fluido estava, em cada caso, acima das duas linhas a preto dos dispositivos. Deixou-se o dispositivo na amostra durante 5 segundos, removeu-se e deixou-se assentar horizontalmente durante 1 minuto.

Determinou-se o resultado por comparação da cor da almofada de teste com a escala de cor no frasco, de acordo com o folheto de resultados que acompanhava o teste. Os resultados do ELISA interno e do teste Micral® são apresentados na Tabela 3. O limite de detecção no teste Micral® para albumina humana é cerca de 20 pg/ml. várias amostras continham níveis de albumina canina significativamente acima deste limite inferior, mas ainda assim eram negativas para albumina pelo 26 ΕΡ 1 384 075/ΡΤ teste Micral®. Estes dados sugerem que este dispositivo não reconhece albumina de urina canina, pelo menos não de modo a detectar microalbuminúria.

Tabela 3. Resultados da fita de teste de urina Micral®

Amostra ELISA Interno Micral® IA 79,4 pg/ml Negativo 2A 3,9 pg/ml Negativo 4A 5,9 pg/ml Negativo 5A 35,9 pg/ml Negativo 9A 48,6 pg/ml Negativo 15A 69,4 pg/ml Negativo 16A 8,3 pg/ml Negativo 29A 119,1 pg/ml Negativo 86A 31,3 pg/ml Negativo 87A 65,2 pg/ml Negativo 14 >650 pg/ml Negativo 19 Positivo Negativo 45 650 pg/ml Negativo Água salpicada com sangue Não testado Positivo

Exemplo 5

Obtiveram-se catorze tiras ImmunoDip™ (código de produto 700-01) para a detecção de microalbuminúria em humanos na Diagnostic Chemicals Limited, Charlottetown, PE, Canadá. Seleccionaram-se treze amostras de urina canina de um grupo de amostras obtidas a partir de cães que eram aparentemente normais. As amostras para utilização foram seleccionadas com base nos seus níveis de albumina como determinados por um ELISA interno para detectar microalbuminúria em cães. As amostras 2A, 4A & 16A eram amostras negativas enquanto as restantes amostras tinham concentrações de albumina com um valor na gama de 31,3 a >650 pg/ml. Como controlo positivo, adicionaram-se 50 μΐ de sangue humano a 5 ml de água desionizada. A medição de albumina na urina foi realizada de acordo com as indicações do fabricante. Resumidamente, adicionaram-se a um tubo de ensaio 3 ml de urina ou da água salpicada de 27 ΕΡ 1 384 075/ΡΤ sangue. Removeu-se a tira immunoDip da bolsa e colocou-se no tubo de ensaio contendo a urina assegurando em cada caso que o nivel de fluido estava acima do orifício de passagem no dispositivo. Deixou-se o dispositivo na amostra durante um mínimo de 3 minutos após o que este foi removido e lido por comparação das intensidades relativas das duas bandas de acordo com o folheto de interpretação de resultados que acompanha o kit de teste. Os resultados do ELISA interno e dos testes immunoDip são apresentados na Tabela 4.

Tabela 4. Tira ImmunoDip™ para resultados de microalbuminúria ELISA interno ELISA interno ImmunoDip™ IA 79,4 pg/ml Negativo 2A 3,9 pg/ml Negativo 4A 5,9 pg/ml Negativo 5A 35,9 pg/ml Negativo 9A 48,6 pg/ml Negativo 15A 69,4 pg/ml Negativo 16A 8,3 pg/ml Negativo 29A 119,1 pg/ml Negativo 86A 31,3 pg/ml Negativo 87A 65,2 pg/ml Negativo 14 >650 pg/ml Negativo 19 Positivo Negativo 45 650 pg/ml Negativo Água salpicada com sangue Não testado Positivo 0 limite de detecção no teste ImmunoDip™ para albumina humana é cerca de 20 pg/ml. Várias amostras continham niveis de albumina canina significativamente acima deste limite inferior, mas ainda assim eram negativas para albumina pelo teste ImmunoDip™. Estes dados sugerem que este dispositivo não reconhece albumina de urina canina, pelo menos não de modo a detectar microalbuminúria. 28 ΕΡ 1 384 075/ΡΤ

Exemplo 6

Utilização de fitas de teste Micral® para a detecção de mlcroalbumlnúrla em urina canina

Obtiveram-se cinco tiras de teste de urina Micral® (código de produto 417146) para a detecção de microalbuminúria em humanos na Roche BMC, Indianapolis, Indiana. Seleccionaram-se treze amostras de urina canina a partir de um grupo de amostras obtidas a partir de cães que eram aparentemente normais. As amostras para utilização foram seleccionadas com base nos seus níveis de albumina como determinados por um ELISA interno para detectar microalbuminúria em cães. As amostras 7 e 12 eram amostras negativas enquanto as amostras 14 e 25 tinham níveis de albumina de 621 pg/ml e >650 pg/ml, respectivamente. Como controlo positivo, adicionaram-se 50 μΐ de sangue humano a 5 ml de água desionizada. A medição de albumina na urina foi realizada de acordo com as indicações do fabricante. Resumidamente, colheu-se a urina de cada cão num copo de colheita de amostra. Para o controlo positivo, colocou-se água salpicada com sangue num tubo de ensaio. Removeu-se a tira Micral® do frasco e colocou-se no copo de colheita (ou tubo de ensaio contendo a água salpicada com sangue) assegurando que o nível de fluido estava, em cada caso, acima das duas linhas a preto dos dispositivos. Deixou-se o dispositivo na amostra durante 5 segundos, removeu-se e deixou-se assentar horizontalmente durante 1 minuto. Determinou-se o resultado por comparação da cor da almofada de teste com a escala de cor no frasco, de acordo com o folheto de resultados que acompanhava o teste. Os resultados do ELISA interno e do teste Micral® são mostrados na Tabela 5.

Tabela 5. Resultados da tira de teste de urina Micral®

Amostra ELISA interno Micral® 7 2,1 pg/ml Negativo 12 0,8 pg/ml Negativo 14 621 pg/ml Negativo 25 >650 pg/ml Negativo Água salpicada com sangue Não testado Positivo 29 ΕΡ 1 384 075/ΡΤ Ο limite de detecção no teste Micral® para albumina humana é cerca de 20 pg/ml. As amostras 14 e 25 continham níveis de albumina canina significativamente acima destes limites inferiores, mas ainda assim eram negativas para albumina pelo teste Micral®. Estes dados sugerem que este dispositivo não reconhece albumina de urina canina, pelo menos não de modo a detectar microalbuminúria.

Exemplo 7

Prevalência de microalbuminúria em cães

Para este estudo, examinaram-se duas populações separadas. Uma população de amostra foi obtida a partir de cães clinicamente normais (n=86). A segunda população de amostra foi obtida a partir de pacientes do Colorado State University Teaching Hospital (n=150) apresentados para procedimentos electivos de rastreio de saúde de rotina, bem como para avaliação de problemas de saúde. Quantificou-se a microalbuminúria utilizando um ELISA de captura de antigénio. Os resultados desta medição foram normalizados para um peso específico de 1,010 para terem em conta concentrações de urina variáveis. A albumina na urina dos pacientes de hospital foi também testada utilizando fitas de teste de proteína na urina Petstix 8™ (Idexx Cat.# 98-06959-00).

Dos 86 cães clinicamente normais, 68 (79%) tinham concentrações de albumina normalizadas <1,0 mg/dL, 16 (19%) tinham concentrações de albumina normalizadas >1,0 mg/dL e <30,0 mg/dL e 2 (2%) tinham concentrações de albumina normalizadas >30,0 mg/dL. Dos 159 pacientes de hospital, 112 (70%) tinham fita de teste de urina negativa e 51 das 112 (46%) amostras de fita de teste negativa tinham concentrações de albumina normalizadas >1,0 mg/dL. Reciprocamente, 19 de 80 (24%) amostras com <1,0 mg/dL de albumina eram positivas na fita de teste de urina (ver Tabela 6) . 30 ΕΡ 1 384 075/ΡΤ

Tabela 6

Concentrações normalizadas de albumina na urina (# de amostras) Resultado da fita de teste de proteína na urina (n=159) Neg. (112) Vestig. (20) 1+ (15) 2-4+ (12) < 1,0 mg/dL (80) 61 (54%) 12 (60%) 5 (33%) 2 (17%) > 1,0 e <30,0 mg/dL (58) 49 (44%) 6 (30%) 2 (13%) 1 (8%) >30,0 mg/dL (21) 2 (2%) 2 (10%) 8 (53%) 9 (75%)

Nas duas populações examinadas, a prevalência de microalbuminúria (>1,0 mg/dL e <30,0 mg/dL) variou de 19% a 36%. A partir destes resultados, a microalbuminúria parece ser prevalecente num número significativo de cães. Além disso, a utilização de fitas de teste de proteína na urina disponíveis comercialmente para a detecção de albuminúria produz um número substancial de resultados falsos positivos.

Exemplo 8

Purificação de albumina de soro canina

Este Exemplo revela um método para produção de albumina de soro canina. Ajustou-se soro canino a sulfato de amónio a 50% (p/v), abanou-se a solução durante 3 horas a 4°C, e o material insolúvel precipitou por centrifugação a 10000 χ g durante 30 minutos. Removeu-se o sobrenadante e dialisou-se em Tris 25 mM, pH 8,0. Carregou-se o material solúvel numa coluna Q-Sepharose Hi-Trap pré-equilibrada (Pharmacia, Peapack, NJ) e eluíram-se as proteínas utilizando um gradiente linear de NaCl de 0 a 1,0 M ao longo de 25 volumes de coluna (CV). Analisaram-se as fracções recolhidas por SDS-PAGe e reuniram-se as fracções contendo albumina canina e armazenaram-se até serem necessárias. Utilizando este método, purificaram-se 414 mg de albumina a partir de 20 ml de soro canino. A sequenciação de proteína confirmou que a proteína purificada era albumina canina.

Exemplo 9

Produção de anticorpos anti-albumina canina

Este exemplo revela o método utilizado para produzir anticorpos monoclonais (MAb) TNBl, TNB2, TNB3, TNB4, TNB5, TNB6 que reconhecem albumina de soro canina (CSA). 31 ΕΡ 1 384 075/ΡΤ

Imunizaram-se ratinhos Balb/C por injecção subcutânea com Adjuvante Completo de Freund misturado com 25 pg, 50 pg ou 100 pg de albumina de soro canina (disponível na Sigma, St. Louis, MO) . Após quatro semanas, obtiveram-se amostras de sangue e determinaram-se por ELISA os títulos de anticorpo anti-CSA. Com base nestes dados, escolheram-se os três ratinhos imunizados com 100 pg de CSA para utilização posterior na produção de hibridomas. A dois destes ratinhos deram-se injecções intravenosas (IV) contendo 100 pg de CSA e o terceiro ratinho recebeu 100 pg intraperitonealmente. Três dias mais tarde, submeteram-se os ratinhos a eutanásia, removeram-se os baços e esvaziaram-se de células T, e fundiram-se as células de baço com células de mieloma de ratinho SP2/0 de acordo com protocolos padrão. Testaram-se colónias de hibridoma individuais quanto à produção de MAb que reconhecem CSA e expandiram-se as colónias positivas e clonaram-se por diluição até se estabelecerem linhas estáveis segregando MAb.

Exemplo 10

Produção de anticorpos anti-albumina canina utilizando hibridação subtractiva

Este Exemplo revela procedimentos utilizando técnicas de hibridação subtractiva para produzir anticorpos monoclonais (MAb) que reconhecem albumina de soro canina (CSA).

Produziram-se linhas de células de hibridoma anti-CSA canina utilizando o método publicado de hibridação subtractiva seguinte. Injectaram-se intraperitonealmente ratinhos Balb/C com 1,0 mg de BSA Fraction V (disponível na Boehringer Manheim, Indianapolis, IN), seguindo-se injecções IP de ciclofosfamida (CY) (100 mg/kg) aos 10 minutos, 24 e 48 horas pós-injecção de BSA. Repetiu-se este tratamento com BSA/CY duas semanas mais tarde. Após outras duas semanas, administrou-se ao ratinho uma injecção subcutânea (SC) contendo 100 pg de CSA (produzida como descrito no Exemplo 8) misturada com Adjuvante Completo de Freund. Após terem passado duas semanas adicionais, obtiveram-se amostras de sangue e determinaram-se por ELISA os títulos de anticorpo contra CSA e BSA. Administrou-se depois intraperitonealmente uma segunda injecção de CSA (100 pg) para reforçar os títulos de anticorpo anti-CSA nos animais. Duas semanas mais tarde, administrou-se 32 ΕΡ 1 384 075/ΡΤ ao ratinho uma injecção intravenosa (IV) de CSA (50 pg) e, após três dias, sacrificou-se o ratinho, colheram-se os seus esplenócitos e fundiram-se com células de mieloma SP2/0 de ratinho utilizando polietilenoglicol (PEG) seguindo procedimentos padrão. Testaram-se colónias de hibridoma individuais quanto à produção de MAb que reconhecem CSA e expandiram-se as colónias positivas e clonaram-se por diluição até se estabelecerem linhas estáveis segregando MAb. Este procedimento resultou na produção de linhas de hibridoma H398 e H399.

Para além das linhas de células de hibridoma produzidas pelo procedimento anterior, utilizou-se o procedimento de hibridação subtractiva modificado seguinte para produzir linhas de células de hibridoma anti-CSA adicionais. Injectaram-se 30 pg de CSA (produzida como descrito no Exemplo 8) na almofada da pata de um ratinho Balb/C. Três meses mais tarde, administrou-se ao ratinho uma injecção intraperitoneal (IP) contendo 30 pg de CSA. Quatro meses após a injecção IP, administrou-se ao ratinho uma segunda injecção IP contendo 1,0 mg de BSA, seguindo-se injecções IP de ciclofosfamida (CY) (100 mg/kg) aos 10 minutos, 24 e 48 horas pós-injecção de BSA. Após duas semanas, repetiu-se este tratamento com BSA/CY e, após terem decorrido duas semanas mais, administrou-se ao ratinho uma injecção subcutânea (SC) de CSA (100 pg) misturada com adjuvante completo de Freund. Após outras duas semanas, obtiveram-se amostras de sangue e determinaram-se por ELISA os títulos de anticorpo contra CSA e BSA. Administrou-se depois ao ratinho uma injecção intravenosa (IV) de CSA (50 pg) e, após três dias, sacrificou-se o ratinho, colheram-se os seus esplenócitos e fundiram-se com células de mieloma SP2/0 de ratinho utilizando polietilenoglicol (PEG) seguindo procedimentos padrão. Testaram-se colónias de hibridoma individuais quanto à produção de MAb que reconhecem CSA e expandiram-se as colónias positivas e clonaram-se por diluição até se estabelecerem linhas estáveis segregando MAb. Este protocolo resultou na produção de linhas de células de hibridoma H384, H385, H386, H387, H388, H389, H390, H391, H392, H393, H394, H395, H396, H400, H401 e H402. 33 ΕΡ 1 384 075/ΡΤ

Exemplo 11

Detecção de albumina de soro canina por ELISA

Este exemplo revela a utilização de um ELISA de fase sólida para testar a capacidade dos anticorpos anti-albumina de soro canina (CSA) para detectar CSA.

Revestiram-se os poços de uma placa de microtitulação com CSA (50 pg/poço) (produzida como descrito no Exemplo 8) em tampão carbonato (carbonato/bicarbonato 50 mM, pH 9,6) e armazenou-se a placa de um dia para o outro a 4°C. No dia seguinte, removeu-se o liquido em excesso, secou-se a placa com mata-borrão, e adicionaram-se a cada poço 150 μΐ de tampão de bloqueio (caseína a 0,1% em PBS contendo 0,05% de Tween-20). Incubou-se a placa à temperatura ambiente (TAmb) durante 30 minutos, após o que se removeu o tampão de bloqueio e se adicionaram a cada poço 50 μΐ de sobrenadante de hibridoma (quer não diluído quer diluído em tampão de bloqueio) . Após uma hora de incubação à TAmb, lavaram-se os poços duas vezes utilizando tampão de lavagem (PBS contendo 0,05% de Tween-20), adicionaram-se a cada poço 50 μΐ de igG e IgM de cabra anti-ratinho conjugados com HRP (disponíveis na KPL Labs, Gaithersburg, MD) e incubou-se a placa à TAmb durante 30 minutos. Lavaram-se os poços duas vezes com tampão de lavagem e adicionaram-se a cada poço 50 μΐ de sistema de substrato TMB (disponível na KPL Labs). Incubou-se a placa à TAmb durante 10 minutos após o que se parou a reacção pela adição de 50 μΐ de ácido sulfúrico 2 N a cada poço. A placa foi lida a 450 nm utilizando um leitor de placas ELISA e os resultados são a seguir apresentados na Tabela 7.

Tabela 7.

Anticorpo Não diluído 1:10 1:100 TNBl 1288 852 326 TNB3 1242 1263 922 TNB4 1449 1431 1546 TNB5 1528 1585 1478 TNB6 1782 1436 1103 H386 1274 1273 1187 H387 1394 1369 1326 H388 1485 1529 1408 H389 1685 1646 1265 H390 1558 892 250 34 ΕΡ 1 384 075/ΡΤ

Anticorpo Não diluido 1:10 1:100 H391 1490 1325 916 H393 1744 1603 1640 H394 435 955 577 H395 1265 1049 1001 H396 1564 1773 1390 H397 49 59 48 H398 1822 1641 1501 H399 775 144 6 4 H400 1572 1610 1239 H401 1839 1683 1511 H402 1799 1752 1447

Exemplo 12

Detecção de albumina de várias espécies por ELISA

Este exemplo demonstra a capacidade de três Ab monoclonais anti-albumina canina para reconhecerem albumina de soro bovina (BSA), canina (CSA), equina (HSA) ou humana (HuSA) por ELISA utilizando o protocolo delineado no Exemplo 11 com a excepção de que se revestiram os poços com diluições em série de 1 para 3 (de 5 pg/ml a 0,002g/ml) da albumina indicada. Adicionalmente, utilizaram-se 10 pg do anticorpo indicado em cada poço. Os resultados são apresentados na Tabela 8.

Tabela 8. TNB3 Proteína de revestimento Concentração de albumina (pg/ml) BSA CSA HSA HuSA 5 0,62 3,53 1,67 0,12 1,667 0, 52 3,50 1,37 0,15 0,556 0,43 3,51 0,87 0,17 0,185 0,57 3,43 0,34 0,16 0,062 0,20 3,14 0,19 0,15 0,021 0,17 2,08 0,16 0,16 0,007 0,17 0,35 0,13 0,13 0,002 0,11 0,20 0, 09 0,10 35 ΕΡ 1 384 075/ΡΤ TNB6 Proteína de revestimento Concentração de albumina (pg/ml) BSA CSA HSA HuSA 5 0,18 3, 68 0, 90 1,69 1,667 0, 42 3,59 0, 69 0,78 0,556 0,30 3,59 0, 52 0,47 0,185 0,24 3,43 0,32 0,23 0,062 0,22 3,17 0,26 0,26 0,021 0,21 2,36 0, 22 0,22 0,007 0,20 1,18 0, 21 0,22 0,002 0,22 0, 55 0,21 0,23 H402 Proteína de revestimento Concentração de albumina (pg/ml) BSA CSA HSA HuSA 5 0, 41 3,41 0,87 0,97 1,667 0,40 3,35 0, 71 0,59 0,556 0,38 3,31 0, 57 0, 41 0,185 0,35 3,23 0,42 0,37 0, 062 0,32 2,98 0,36 0,34 0, 021 0,35 2,10 0,32 0,31 0, 007 0,35 1,20 0,18 0,31 0, 002 0,35 0,65 0,32 0,33

Estes dados demonstram que os mAb TNB3, TNB6 e H402 têm uma afinidade muito mais elevada por CSA em comparação com BSA, HSA ou HuSA.

Exemplo 13 ELISA de competição utilizando os mAb anti-albumina H402, TNB3 e TNB6

Este exemplo compara a capacidade dos anticorpos monoclonais H402, TNB3 e TNB6 em competir pela ligação a albumina de soro canina (CSA). Mediu-se a competição entre 36 ΕΡ 1 384 075/ΡΤ anticorpos por revestimento de uma placa ELISA inteira com CSA, adição de um anticorpo primário marcado a todos os poços da placa e depois medição da capacidade de vários anticorpos não marcados em competir com o anticorpo primário pela ligação a CSA. (Todos os anticorpos primários foram marcados utilizando biotina disponível na Pierce Chemical, Rockford, IL de acordo com as instruções do fabricante). Deste modo, utilizou-se cada placa para testar a capacidade de um anticorpo primário individual em competir com dois outros anticorpos anti-albumina quanto à capacidade para ligação a CSA. Adicionalmente, utilizou-se em cada placa anticorpo criado contra o domínio extracelular de cadeia alfa de receptor de igE de elevada afinidade de humano (anti-FceRIa) como controlo negativo. Os detalhes do ensaio são como se segue:

Revestiram-se três placas ELISA de um dia para o outro a 4°C com CSA a 1 pg/ml. No dia seguinte, lavaram-se os poços utilizando tampão de lavagem (PBS + 0,05% de Tween-20) e bloquearam-se com solução de bloqueio (STABILCOAT® IMMUNOASSAY STABILIZER; disponível na SurModics, Inc., Eden Prairie, Minnesota) de acordo com as instruções do fabricante. Lavaram-se depois os poços utilizando tampão de lavagem e adicionaram-se 100 μΐ de um único anticorpo primário marcado, H402 a 20 ng/ml, TNB3 a 8 ng/ml ou TNB6 a 12 ng/ml (ajustaram-se as concentrações utilizando tampão de diluição (caseína a 0,1% em PBS + 0,05% de Tween-20)) a todos os poços de uma placa individual, tal que cada placa contivesse um anticorpo primário diferente. A uma fila de poços em cada placa adicionaram-se depois 100 μΐ de anticorpo secundário, H402, TNB3, TNB6 ou anti-HuFCcRl a 20 pg/ml. Realizaram-se depois diluições em série de 1 para 2, por diluição de cada anticorpo secundário através da placa tal que as concentrações finais de anticorpo secundário foram de 10 pg/ml a 9 ng/ml. Incubaram-se as placas à temperatura ambiente (TAmb) durante 2 horas, lavaram-se com tampão de lavagem e adicionaram-se 100 μΐ de estreptavidina conjugada com peroxidase de rábano (diluída 1:1000 em tampão de diluição). Após uma incubação de 1 hora à TAmb, lavaram-se os poços com tampão de lavagem e adicionaram-se a cada poço 100 μΐ de solução de revelação (substrato TMB; disponível na KPL Labs, Gaithersburg, MD). Após uma incubação de 30 minutos à TAmb, as placas foram lidas a 450 nm utilizando um leitor de placas ELISA. Os resultados deste ensaio são apresentados na Tabela 9. 37 ΕΡ 1 384 075/ΡΤ

Tabela 9. Η402 como anticorpo primário Anticorpo (secundário) concorrente Concentração de anticorpo (ng/ml) H402 TNB3 TNB6 Anti-HuFCERl 10000 0, 069 2,292 0, 087 2,584 5000 0,164 2,328 0, 195 2,576 2500 0,271 2,341 0, 300 2,551 1250 0,517 2,275 0, 559 2,569 625 1,212 2,255 1, 093 2,592 312, 5 2,104 2,262 1, 683 2,540 156,25 2,548 2,293 2, 239 2,557 78,125 2,670 2,381 2, 402 2,512 39,06 2, 752 2,461 2, 514 2,518 19,53 2, 765 2, 427 2, 655 2,660 9, 77 2, 798 2, 657 2, 611 2, 639 0 2, 710 2,641 2, 577 2,642 TNB3 como anticorpo primário Anticorpo (secundário) concorrente Concentração de anticorpo (ng/ml) H402 TNB3 TNB6 Anti-HuFCERl 10000 2,295 0, 090 2, 290 2,479 5000 2, 493 0,245 2, 409 2,645 2500 2, 445 0,395 2, 247 2,508 1250 2, 480 0, 796 2, 185 2,397 625 2, 485 1,534 2,239 2, 428 312, 5 2,378 2, 084 2, 208 2, 483 156,25 2,529 2,535 2, 324 2, 484 78,125 2, 463 2, 643 2, 351 2, 497 39, 06 2,566 2,674 2, 390 2,509 19,53 2,607 2, 740 2, 520 2,602 9, 77 2, 763 2, 716 2, 611 2,669 0 2, 867 2, 798 2, 756 2, 764 38 ΕΡ 1 384 075/ΡΤ TNB6 como anticorpo primário Anticorpo (secundário) concorrente Concentração de anticorpo (ng/ml) H4 02 TNB3 TNB6 Anti-HuFCERl 10000 0,122 2,307 0,134 2,490 5000 0,303 2, 410 0, 310 2,604 2500 0, 459 2,177 0, 473 2,569 1250 0, 769 2,276 0, 733 2,550 625 1,446 2,283 1,383 2,501 312, 5 2,126 2,319 2, 053 2, 402 156,25 2,502 2,430 2, 358 2,564 78,125 2, 647 2,455 2, 480 2, 516 39,06 2, 743 2,496 2, 557 2, 530 19,53 2, 745 2,579 2, 605 2, 582 9, 77 2, 787 2,697 2, 654 2,559 0 2, 772 2, 685 2,319 2,377

Os dados demonstram que os anticorpos monoclonais H402 e TNB6 competem pela ligação de albumina de soro canina consistente com estes anticorpos partilhando os mesmos epitopos, ou aproximadamente relacionados. Os dados demonstram ainda que a ligação de albumina de soro canina por TNB3 não é afectada por H402 ou TNB6.

Exemplo 14

Ligação de albumina canina e felina por H352, H398 e TNB3

Este exemplo compara a capacidade de três anticorpos anti-albumina (H352, H398 & TNB3) em se ligarem a albumina canina (CSA) ou felina (FSA).

Realizou-se o ensaio de ligação como se segue. Para permitir a detecção, conjugou-se peroxidase de rábano (HRP) (Pierce Chemical, Rockford, IL) quer a CSA quer a FSA seguindo o protocolo do fabricante. Revestiram-se os poços de uma placa de microtitulação com uma gama de concentrações (de 10 pg/ml a 9,77 ng/ml) de anticorpo (H352, H398 ou TNB3) em tampão de carbonato (carbonato/bicarbonato 50 mM, pH 9,6) e armazenaram- 39 ΕΡ 1 384 075/ΡΤ se as placas de um dia para o outro a 4°C. No dia seguinte, removeu-se o liquido em excesso e bloquearam-se os poços utilizando solução de bloqueio (STABILCOAT® IMMUNOAS SAY STABILIZER; disponível na SurModics, Inc., Eden Prairie, Minnesota) seguindo as instruções do fabricante. Após remoção da solução de bloqueio, enxaguaram-se os poços utilizando tampão de lavagem (PBS contendo 0,05% de Tweeen-20) e adicionaram-se HRP-FSA (diluído 1:400 em tampão de carbonato) ou hrp-CSA (diluído 1:800 em tampão de carbonato) aos poços e incubou-se a placa à temperatura ambiente (TAmb) durante 30 minutos. Removeu-se o conjugado de HRP-albumina, lavaram-se os poços duas vezes utilizando tampão de lavagem e adicionaram-se a cada poço 50 μΐ de sistema de substrato TMB (disponível na KPL Labs, Gaithersburg, MD). Incubou-se a placa à TAmb durante 10 minutos após o que se parou a reacção pela adição a cada poço de 50 μΐ de ácido sulfúrico 2 N. A placa foi lida a 450 nm utilizando um leitor de placas ELISA. Os resultados são a seguir apresentados na Tabela 10.

Tabela 10. mAb H352 H398 TNB3 Proteína de revestimento Concentração de MAb (ng/ml) FSA CSA FSA CSA FSA CSA 10000 4,200 4,184 2, 984 3, 887 0,055 4,191 5000 4,200 4,200 1, 944 2, 806 0,047 4,184 2500 4,189 4,160 1,532 2,333 0,049 4,177 1250 4,127 4,200 1,187 1, 941 0,099 4,186 625 2, 740 4, 084 0, 493 0, 769 0,043 4,178 312,5 1,266 2, 814 0,168 0,282 0,045 3,410 156,25 0, 713 1, 598 0, 095 0,135 0,043 2,400 78,13 0,324 0, 859 0, 078 0, 090 0,042 1,109 39, 06 0,178 0, 413 0, 053 0, 063 0,043 0,543 19,53 0,107 0,236 0, 047 0, 055 0,049 0,309 9, 77 0,077 0,132 0, 050 0, 051 0,059 0,191 0 0,044 0, 048 0, 048 0, 061 0,049 0,048 40 ΕΡ 1 384 075/ΡΤ

Os dados mostram que o anticorpo monoclonal H352 se liga tanto FSA como CSA com afinidade aproximadamente igual. O anticorpo monoclonal H398 reconhece também tanto FSA como CSA ainda que este tenha afinidade mais elevada por CSA. Finalmente, os dados demonstram que o anticorpo monoclonal TNB3 se liga especificamente a CSA e não se liga a FSA.

Exemplo 15

Albumina em caninos padecendo de doença renal induzida por verme do coração

Este exemplo revela os niveis de albumina presentes na nefropatia de canino induzida por Dirofilaria immitis. Neste modelo, infectam-se animais com D. immitis o que resulta em lesão renal devida a lesão do glomérulo induzida por complexo antigénio-anticorpo como descrito em Grauer, G.F., et al., American Journal of Tropical Medicine and Hygiene; 39(4), 1988, págs. 380-387. É conhecido neste modelo que o antigénio de D. immitis aparece no sangue aproximadamente sete meses pós-infecção. Para este exemplo, infectaram-se animais com D. immitis e colheram-se amostras de urina mensalmente por cateterização. Será de notar que, em alguns casos, o processo de cateterização pode resultar em níveis elevados de albumina; como resultado, os animais apenas foram considerados positivos em relação a microalbuminúria quando se verificou que estes eram microalbuminúricos em duas amostras consecutivas. A quantidade de albumina em cada amostra foi determinada utilizando um ensaio ELISA. Os resultados são a seguir apresentados na Tabela 11. As caixas assinaladas N/A indicam quando não estava assinalada qualquer amostra. 41 ΕΡ 1 384 075/ΡΤ

Tabela 11

Identificador do animal Meses pós-infecção HOP (A) IGH (A) POR (A) SSH (A) XTJ (A) YOH (A) AXH (B) CAH (B) FVH (B) GUH (B) HOH (B) VIP (B) 1 74,9 0, 2 2,3 1,9 0,3 2,9 8,0 72,6 0,3 3,7 4,2 2,1 1 2,1 3,8 2,4 0,3 N/A 8,7 4,0 4,0 3,7 0, 2 0,4 2 33,8 2, 0 9,5 2,4 29, 9 N/A 3,3 0,2 3,0 3,3 0,9 2,6 4 1,3 16, 4 0,3 3,0 0,3 0,3 3,7 22, 7 2,5 2,3 1,8 5,4 5 2,2 4,2 N/A 2, 0 18,1 4,2 3,4 3,0 0,3 1,9 0, 2 4,1 6 4,9 9,9 N/A 2, 5 N/A 0,3 0,2 2,6 2,7 1,5 0,4 0,4 7 1,4 48,1 0, 3 0,3 20, 7 45,6 3,9 0,3 1,9 20,7 3,3 8,1 8 8,4 N/A 18, 0 N/A 60, 6 16, 2 3,1 4,8 6, 5 2, 8 8, 5 15, 4 9 26,2 2,9 4,4 0,4 46, 8 16,1 6,0 0,3 24, 6 3,6 0,3 N/A 10 N/A 11, 0 3,4 10, 8 26,2 15, 7 13,1 21, 3 54, 0 60,3 0, 2 46,0 11 52,1 125, 7 43, 5 36, 9 180,6 67, 8 3,9 27, 3 11, 5 6, 5 59,5 736, 12 58,5 16,2 22, 2 52, 9 51, 3 54,9 6,8 76, 2 23, 4 5,9 97,4 167,2 13 113, 5 56, 4 25,1 8,1 132, 4 112, 7 14,7 30,1 327,2 13, 3 65,5 132,6 14 134, 3 60, 2 132,1 16, 8 123,0 82, 9 66, 6 65, 8 500,0 5,0 285, 7 69,06,1 15 206, 0 4,0 122,0 23, 7 39,1 18,6 3,8 16, 4 500,0 8,0 107, 8 34, 8 16 37,3 7,6 500,0 5,4 52, 5 10,1 5,5 17, 8 500,0 4,9 43,1 N/A 17 N/A 45, 2 N/A 8, 6 181,6 89,1 30, 9 19, 8 500,0 16, 4 53, 0 N/A 18 18,8 112,1 211,1 5,4 70, 4 26,8 10,5 14,9 N/A 5,4 21,3 N/A 19 16, 7 67, 0 176, 7 12,1 208,4 N/A N/A 36, 3 N/A 4,9 57,1 N/A 20 N/A N/A N/A N/A 500,0 N/A N/A N/A N/A 1,9 N/A N/A 21 N/A N/A N/A N/A N/A 37,9 9,2 41, 7 N/A 11,0 17,1 N/A 22 1,6 4,7 75, 8 9,1 500,0 27, 2 22, 2 500, 0 N/A 3,2 46,2 N/A 23 83,2 37, 6 30, 3 17, 5 500,0 60,3 54,3 500,0 N/A 5,2 37, 7 N/A

Os dados demonstram que após infecção com D. immitis, existe um aumento progressivo no nível de albumina na urina. Adicionalmente, a maioria dos animais ficou microalbuminúrica em 1-2 meses após o aparecimento de antigénio de D. immitis no sangue. A microalbuminúria podia ser detectada em todos os animais no final do estudo. 42 ΕΡ 1 384 075/ΡΤ

Exemplo 16 Níveis de albumina em caninos padecendo de nefrite hereditária

Este exemplo compara o nível de microalbuminúria (MA) com um marcador habitualmente utilizado para doença renal, a razão proteína urinária/creatinina (UP/C), ao longo do tempo, em animais padecendo de nefrite hereditária (HD). Neste modelo, os animais são portadores de um defeito genético que resulta no desenvolvimento rápido de doença renal no decurso da vida dos animais como descrito em Lee, G.E., American Journal of Veterinary Research, 1999: 60, págs. 373-383. Neste exemplo, colheu-se periodicamente urina a partir de uma colónia de cães normais e de uma colónia de cães padecendo de HD. Determinou-se a quantidade de albumina em cada amostra utilizando um ensaio ELISA. Adicionalmente, determinou-se a razão proteína urinária/creatinina (UP/C) utilizando um laboratório veterinário de referência. Por esta medição, considera-se que está presente doença renal quando a razão UP/C é superior a 1,0. Os resultados deste estudo são a seguir apresentados na Tabela 12.

Tabela 12

Identificação do animal Fonzi (controlo) Jakc (controlo) Ned (controlo) Oscar (controlo) Pete (controlo) Idade (semanas) Razão UP/C MA (pg/ml) Razão UP/C MA Razão UP/C MA (pg/ml) Razão UP/C MA (pg/ml) Razao UP/C MA (Ug/ml) 8 0,1 2 1,6 0 0,2 5 0,6 2 0,9 3 11 0,2 2 0,7 5 0,2 5 0,2 8 0,3 4 13 0,3 1 0,3 0 0,2 5 0,9 3 0,4 2 15 1,0 3 0,6 6 0,2 5 0,3 4 0,2 2 17 0,2 1 0,2 3 0,2 5 0,1 3 0,2 6 19 0,4 15 0,5 4 0,2 5 0,1 3 21 0,1 4 1,0 7 0,2 5 0,1 2 0,1 1 23 0,3 0 0,2 3 0,2 5 0,2 1 0,1 1 25 0,6 1 0,1 6 0,2 5 0,1 1 0,1 20 27 0,1 1 0,2 6 0,2 5 0,1 0 0,1 6 30 0,1 2 0,1 4 0,2 5 0,1 2 0,0 1 34 0,2 220 0,1 4 0,2 5 0,1 1 0,1 2 38 0,1 1 0,1 2 0,2 5 0,1 1 0,1 4 43 ΕΡ 1 384 075/ΡΤ

Ethan (HN) Frasier (HN) Greg (HN) Ike HN) Lester (HN) Idade (semanas) Razão UP/C MA (gg/ml) Razão UP/C MA (gg/ml) Razão UP/C MA (pg/ml) Razão UP/C MA (gg/ml) Razão UP/C MA (ug/ml) 8 0,2 4 0,1 6 0,1 2 1,0 6 0,8 10 11 0,3 9 0,2 4 0,1 4 0,2 10 0,4 8 13 0,6 4 0,2 1 0,3 2 0,2 1 0,5 12 15 0,5 8 0,3 12 0,1 12 0,7 7 0,3 3 17 0,1 17 0, 6 358 0,2 487 1,0 557 0,4 7 19 1,0 82 2,3 314 0,4 2 4,4 918 0,6 115 21 3,0 136 1,1 30 0,2 2 6,6 1574 1,0 561 23 6,2 4954 5,1 2145 0,3 71 12,5 5560 3,0 615 25 10,1 744 9,0 3000 1,6 603 16,6 2920 3,7 17 27 6,6 1179 7,3 2020 3, 5 1499 15,3 3904 7,0 1477 30 15,7 2734 12,3 2696 5,7 1733 16,5 2276 9,3 1679 34 11,6 1901 12, 9 2 8,2 309 4,4 3608 8,7 1992 38 6,4 3310 13, 9 3597 8, 8 4845 8,5 4465 8,1 1919 Nate (HN) Newt (HN) Quark (HN) Quirt (HN) Eddie (HN) Idade (semanas) Razão UP/C MA (gg/ml) Razão UP/C MA (Ug/ml) Razao UP/C MA (Ug/ml) Razão UP/C MA ^g/ml) Razao UP/C MA (Ug/ml) 8 0,4 6 0,2 5 0,1 2 0,4 1 1,6 16 11 0,4 0 0,4 0 0,1 3 0,4 4 0,2 10 13 0,4 5 0,2 4 0,7 11 0,2 3 0,4 6 15 0,4 2 0,1 19 0,3 5 0,1 1 0,3 6 17 0,3 4 1,1 116 0,4 74 0,1 12 0,1 5 19 0,6 7 1,5 265 0,6 232 0,2 25 0,4 10 21 0,2 52 2,4 1321 2,8 620 0,6 267 1,2 1063 23 2,1 340 8,7 2665 9,2 1223 3,4 543 2,8 1307 25 2,2 622 9,6 4711 8,8 1938 4,6 1208 8,7 1947 27 3,2 483 10,1 1309 7,8 2007 9,1 3054 6,9 1052 30 5,8 1529 9,0 2989 14, 1 3419 9,3 2747 13,9 3188 34 7,3 1483 8,8 1806 13, 1 3055 9,9 6379 10,5 4927 38 8,9 2955 8,1 6487 12,2 3118 9,5 3044 12, 7 6717 44 ΕΡ 1 384 075/ΡΤ

Felix (HN) Fred (HN) Gus (HN) Neal (HN) Norm (HN) Idade (semanas) Razão UP/C MA ^g/ml) Razao UP/C MA (Ug/ml) Razão UP/C MA ^g/ml) Razao UP/C MA (ug/ml) Razão UP/C MA ^g/ml) 8 0,7 1 0,3 3 0,1 5 0,8 0 0,3 1 11 0,1 8 0,1 12 0,1 4 0,2 3 0,1 1 13 0,1 1 0,5 1 0,1 22 0,4 3 0,1 0 15 0,3 5 0,6 1 0,2 55 0,1 2 0,5 1 17 0,8 122 0,5 6 1,7 24 0,4 2 0,7 4 19 0,3 87 0,3 13 2,2 77 0,6 428 0,5 7 21 0,8 903 0,8 9 3,9 16 0,6 210 1,3 354 23 2,6 1679 0,6 81 9,3 1565 6,6 1335 5,7 1535 25 6,9 16170 1,9 152 6 f 4 3950 8,4 4091 9,5 3290 27 10,2 2452 3,5 11 5,2 1263 10,1 1158 5, 5 798 30 12,0 2612 8,1 1887 8,3 2648 9,2 2523 6,8 2796 34 9,3 4146 7,1 3403 8 f 5 4583 10,1 1767 11,5 2603 38 10,4 6218 10,8 7141 7,9 3759 10,4 2906 7,0 3403 Paul (HN) Quinn (HN) Scooter (HN) Idade (semanas) Razão UP/C MA (pg/ml) Razão UP/C MA (gg/ml) Razão UP/C MA (pg/ml) Razão UP/C MA (μg/ml) Razão UP/C MA ^g/ml) 8 0,6 0,1 1,4 11 0,1 8 0,1 1 0,2 3 13 0,4 1 0,2 5 0,3 7 15 0,2 0 0,2 1 0,1 21 17 0,1 6 0,1 3 0,3 66 19 0,7 6 0,6 5 2,7 323 21 0,1 58 0,1 16 4,3 20 23 1,3 206 0,6 29 8,8 2678 25 2,0 598 1,5 224 11,3 2957 27 4,2 674 2,1 431 10, 1 3864 30 4,0 2650 5,4 1468 11, 2 2118 34 5,5 0 10,0 1395 12,5 5098 38 6,4 4324 8,6 1624 8,4 3238

Os dados demonstram que existe um aumento progressivo em microalbuminúria em animais padecendo de nefrite hereditária. Adicionalmente, detectou-se microalbuminúria em virtualmente todos os animais antes da razão UP/C ser superior a 1,0.

Lisboa, 2010-03-16

Claims

ΕΡ 1 384 075/ΡΤ 1/1 REIVINDICAÇÕES 1. Método para identificar um animal possuindo doença renal inicial ou em risco de desenvolver doença renal de fase tardia, o referido método compreendendo a determinação da quantidade de albumina numa amostra de urina obtida a partir do animal, onde uma quantidade de albumina numa gama desde cerca de 10 pg/ml a cerca de 300 pg/ml na amostra de urina, quando o peso especifico da amostra está normalizado para 1,010 g/ml, é indicativa de um animal possuindo doença renal inicial ou estando em risco de doença renal de fase tardia, onde o animal é seleccionado entre o grupo consistindo em canídeos, felídeos e equídeos.
2. Método da Reivindicação 1, onde a quantidade de albumina na amostra é determinada por: (a) contacto da amostra de urina com um anticorpo anti-albumina para formar um complexo compreendendo albumina e o anticorpo anti-albumina; (b) detecção do referido complexo; e (c) avaliação da quantidade de albumina presente na amostra de urina a partir da quantidade de complexo de albumina-anticorpo detectada.
3. Método da Reivindicação 1, onde a quantidade de albumina na amostra de urina é determinada utilizando um ensaio seleccionado entre o grupo consistindo num imunoensaio ligado a enzima, um radioimunoensaio, um imunoensaio de fluorescência, um ensaio quimioluminescente, um ensaio de fluxo lateral, um ensaio de tira-reagente {dipstick), um ensaio de aglutinação, um ensaio baseado em materiais particulados, um ensaio de imunoprecipitação, um ensaio de imunotransferência por pontos {immunodot), um ensaio de imunotransferência {immunoblot), um ensaio de imunodifusão, um ensaio de fosforescência, um ensaio de fluxo contínuo, um ensaio de cromatografia, um ensaio baseado em PAGe, um ensaio sensorial electrónico, um ensaio de ressonância plasmónica de superfície e um ensaio de espectroscopia de correlação com fluorescência. Lisboa, 2010-03-16