PT1373215E - Derivado de geldanamicina e metodo de tratamento de cancro utilizando o mesmo - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"DERIVADO DE GELDANAMICINA E MÉTODO DE TRATAMENTO DE CANCRO UTILIZANDO O MESMO"

REFERÊNCIA CRUZADA A APLICAÇÕES RELACIONADAS

Esta aplicação de patente reivindica prioridade à patente de aplicação provisória U.S. 60/280 078 arquivada a 30 de Março de 2001.

CAMPO DA INVENÇÃO

Esta invenção refere-se à geldanamicina, e de modo mais particular a novos derivados de geldanamicina, suas composições farmacêuticas, e a um método de utilização de tais derivados para a profilaxia e tratamento do cancro.

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO

Crê-se que o produto do gene ErbB2, que é um membro da família de receptores de tirosina cinases ErbB, desempenha um importante papel na malignidade de células tumorais.

Estudos têm mostrado que a sobre-expressão de ErbB2 causa a transformação celular e a tumorigénese, e experiências in vitro têm demonstrado que o ErbB2 é requerido para a indução da invasão de células de carcinoma por outros membros da família ErbB. A ansamicina de benzoquinona, geldanamicina, tem actividade anti-tumoral in vivo, e tem sido demonstrado causar uma rápida deplecção dos níveis proteicos de ErbB2. A geldanamicina é um inibidor específico de determinadas proteínas chaperones incluindo a proteína de choque térmico 90 (Hsp90) assim como a proteína regulada por glucose 94 (Grp94), que está localizada no retículo endoplasmático. Crê-se que a geldanamicina actua na proteína ErbB2 através da inibição da proteína chaperone 2

Hsp90, que se pensa ser necessária para funções próprias da proteína ErbB2. Também tem sido demonstrado que a Hsp90 está ligada à proliferação celular de tumores (ver L. Whitesell et al., Inhibition of Heat Shock Protein HSP-90-pp60v-src Heteroprotein Complex Formation by Benzoquinone Ansamycins: Essencial Role for Stress Proteins in Oncogenic Transformation, 91 Proc. Nat'l Acad. Sei. EUA 8324-8328 (1994); T.W. Schulte et al., Antibiotic Radicicol Bineis to the N-terminal Domain of Hsp90 and Shares Important Biological Activities with Geldanamicin, 3 Cell Stress and Chaperone Proteins 100-108 (1998); J.L. Johnson et al., Binding of p23 and Hsp90 During Assembly with the Progesterone Receptor, 9 Mol. Endocrinol. 670-678 (1995); W. Sullivan et al., Nucleotides and two functional States of Hsp90, 272 J. Biol. Chem. 8007-8012 (1997).

Foram sintetizados análogos de geldanamicina na tentativa de aumentar a biodisponibilidade e reduzir a toxicidade associada ao produto natural. São divulgados derivados de geldanamicina por exemplo na US 4 61 989, WO 9501342 e no J. Med. Chem. 1995.38.3806. No meio dos análogos mais bem sucedidos está o 17-alilaminogeldanamicina (17-AAG), que se encontra correntemente na fase I dos ensaios clínicos no Instituto Nacional de Cancro. Outros derivados de geldanamicina semelhantes substituídos na 17a posição existem como possíveis tratamentos para o cancro, tal como os descritos em R.C. Schnur et al., Inhibition of the Oncogene Product pl85erB~2 in Vitro and in Vivo by Geldanamicin and Dihydrogeldanamicin Derivatives, 3 8 J. Med. Chem. 3806-3812 (1995). Enquanto muitos destes compostos apresentam actividade relativamente significativa in vitro, poucos apresentam actividade in vivo suficiente em testes preliminares. Assim, estes compostos representam 3 fracos candidatos como potenciais meios de tratamento terapêutico. Adicionalmente, nenhum composto de geldanamicina ou seus derivados apresentou actividade in vivo quando administrados oralmente.

Assim, permanece uma necessidade de outros compostos anti-cancerigenos eficazes e métodos de utilização de tais compostos. A presente invenção pretende preencher essa necessidade. As vantagens particulares desta invenção, assim como caracteristicas inventivas adicionais, serão aparentes a partir da descrição da invenção aqui fornecida.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção fornece um composto de fórmula (I),

O w 1S Λ*

H,C 13

ÇH3 CH9 8 R3 ,0 'NH2 m 1 2 em que n=0 ou 1 e em que, quando n=l, cada R e R e hidrogénio, e quando n=0, existe uma ponte dupla entre C4 e c5; R3 é hidrogénio ou hidroxilo; R4 é hidrogénio ou hidroxilo; em que, quando R3 é hidrogénio, R4 é hidroxilo, e quando R3 é hidroxilo, R4 é hidrogénio; e 4 R5 é hidrogénio ou um grupo de fórmula (II) 4

O an em que cada R6, R7, e R8 é seleccionado de modo independente a partir do grupo consistindo em hidrogénio, halo, azido, nitro, um alquilo Ci-Cs, um alcóxilo Cq-Cs, arilo e ciano; e seus sais. A presente invenção também fornece uma composição farmacêutica compreendendo um composto da invenção e um transportador farmaceuticamente aceitável. É também descrito um método para tratar ou prevenir cancro num hospedeiro. 0 método compreende a administração do composto acima mencionado a um hospedeiro numa quantidade suficiente para tratar ou prevenir cancro num hospedeiro, onde o cancro do hospedeiro é tratado ou prevenido.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A invenção fornece um composto de fórmula (I), o s

NHjs R4

W 5 em que n=0 ou 1. Quando n=l, cada R1 e R2 é hidrogénio, e, quando n=0, existe uma ponte dupla entre C4 e C5. R3 e R4 são cada um de modo independente hidrogénio ou hidroxilo, em que, quando R3 é hidrogénio, R4 é hidroxilo, e quando R3 é hidroxilo, R4 é hidrogénio. R5 é hidrogénio ou um grupo de fórmula (II) 5

em que cada R6, R7 e R8 é seleccionado de modo independente a partir do grupo consistindo em hidrogénio, halo, azido, nitro, um alquilo Ci-Cs, um alcóxilo Ci-Cs, arilo e ciano. A invenção também fornece sais do composto de fórmula (I). As posições indicadas pelos números 1-21 no anel de ansamicina de benzoquinona nas fórmulas (I) e (III) representam átomos de carbono.

Numa forma de realização preferida da presente invenção, n=0 e existe uma ponte dupla entre C4 e C5. 0 hidrogénio é particularmente preferido para R5. Assim, um composto de modo particularmente preferido da presente invenção é um composto representado pela fórmula (III) (17— dimetilaminoetilamino-17-demetoxigeldanamicina).

HC/\ 0 ,? N f | H C«s Jí H3CO' ÇH3 CHj H OH q=í \h» (Hl) 6

Os compostos da presente invenção podem encontrar-se sob a forma de sal, que é de modo preferido um sal farmaceuticamente aceitável. Sais de adição ácida farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem aqueles derivados de ácidos minerais, tais como ácidos hidroclóricos, hidrobrómicos, fosfóricos, metafosfóricos, nítricos e ácidos sulfúricos, e ácidos orgânicos, tais como ácidos tartárico, acético, cítrico, málico, láctico, fumárico, benzóico, glicólico, glucónico, succínico, e ácidos arilsulfónicos, tais como, por exemplo, ácido p-toluenosulfónico.

De um modo preferido, os compostos da presente invenção têm solubilidade em água aumentada quando comparados com a Geldanamicina e/ou têm a capacidade para formar sais (e.g., sais ácidos) tendo solubilidade em água aumentada comparados com a Geldanamicina, enquanto retém actividade anti-cancerígena ou anti-tumoral in vitro e in vivo. Por exemplo, os compostos preferidos da presente invenção têm solubilidades em água de pelo menos cerca de 0,5 mg/ml ou pelo menos cerca de 1 mg/ml (e.g., pelo menos cerca de 1,5 mg/ml), de modo preferido pelo menos cerca de 2 mg/ml (e.g., pelo menos cerca de 2,5 mg/ml). De um modo mais preferido, os compostos da presente invenção tem solubilidades em água de pelo menos cerca de 3 (e.g., pelo menos cerca de 3,5 mg/ml) ou até pelo menos cerca de 4 mg/ml (e.g., pelo menos cerca de 4,5 mg/ml) . Ou mesmo maiores solubilidades em água (e.g., pelo menos cerca de 5 mg/ml). As solubilidades em água podem ser determinadas utilizando técnicas padrão conhecidas na técnica. Enquanto os compostos da presente invenção, de um modo preferido, têm solubilidade em água melhorada, as técnicas conhecidas na técnica podem ser utilizadas em conjunto com a presente 7 invenção para melhorar adicionalmente a solubilidade em água desses compostos. Por exemplo, o pH de uma formulação compreendendo o composto pode ser ajustado para optimizar a solubilidade em água do composto. Do mesmo modo, podem ser incorporados vários aditivos numa formulação compreendendo um composto da presente invenção. Aditivos úteis incluem co-solventes (e.g., polietilenoglicol) , agentes activos de superfície, agentes complexantes, agentes emulsificantes, compostos anfifílicos, lipossomas, e micro e nanopartículas, gue podem melhorar a solubilidade de um composto da presente invenção.

Os compostos da presente invenção apresentaram actividade in vivo significante quando comparada com compostos de estrutura semelhante. A actividade in vivo pode ser medida por qualquer método adequado conhecido na técnica. Métodos adequados incluem, por exemplo, um ensaio de fibras côncavas (HFA) e/ou teste xenográfico. Um método preferido de determinar a actividade in vivo utilizado em conjunto com a presente invenção é um ensaio de fibras côncavas, como descrito em M. G. Hollingshead et al., In Vivo Cultivation of Tumor Cells in Hollow Fibers, (57)2 Life Sei. 131-141 (1995). De um modo típico, um ensaio de fibras côncavas é utilizado como um rastreio preliminar para identificar compostos tendo actividade anti-cancerígena moderada a proeminente. 0 HFA pode ser utilizado em conjunto com outros métodos de teste, tais como testes xenográficos, para fornecer mais evidências à actividade anti-cancerígena in vivo do composto e, assim, a sua adequabilidade para o tratamento de uma doença particular.

Foi também descrito, de forma inesperada, que os compostos da presente invenção produzem actividade oral in vivo significativa quando administrada a um hospedeiro. Por actividade oral in vivo significativa, entende-se que o composto pode ser administrado oralmente a um hospedeiro para produzir uma pontuação HFA de modo a garantir futuros testes. Deve ser notado que nenhuma outra classe de compostos de geldanamicina ou seus derivados mostrou tal actividade oral in vivo significativa. Deste modo, os compostos da presente invenção seriam preferidos de entre outras opções de tratamento devido aos meios menos invasivos através dos quais o composto pode ser administrado de modo eficaz. A presente invenção também fornece uma composição farmacêutica compreendendo os compostos de geldanamicina de fórmula (I) aqui descritos. A composição farmacêutica pode compreender adicionalmente mais que um ingrediente activo. Por exemplo, a composição farmacêutica pode compreender mais que um composto da presente invenção, ela pode compreender um composto da presente invenção em combinação com outro agente ou fármaco farmaceuticamente activo, e semelhantes. A composição farmacêutica também compreende um transportador aceitável. De modo preferido, o transportador é um transportador farmaceuticamente aceitável. No que diz respeito a composições farmacêuticas, o transportador pode ser qualquer um dos utilizados de modo convencional para fazer uma composição farmacêutica. A escolha do transportador farmaceuticamente aceitável é limitada apenas por considerações fisico-quimicas, tais como a solubilidade e a falta de reactividade com o(s) composto(s) activo(s), e pela via de administração. Será apreciado pelos especialistas na técnica, em adição às seguintes 9 composições farmacêuticas descritas, que os compostos dos métodos da presente invenção possam ser formulados como complexos de inclusão, tais como o complexo de inclusão da ciclodextrina, ou lipossomas.

Os transportadores farmaceuticamente aceitáveis aqui descritos, por exemplo, veículos, adjuvantes, excipientes, e diluentes, são bem conhecidos para os especialistas na técnica e estão facilmente disponíveis. É preferível que o transportador farmaceuticamente aceitável seja quimicamente inerte ao(s) composto(s) activos e sem efeitos paralelos detrimentais ou toxicidade sob as condições de utilização. A escolha do transportador será determinada em parte pelo composto particular, assim como pelo método particular utilizado para administrar a composição. De um modo concordante, existe uma variedade de formulações adequadas da composição farmacêutica da presente invenção. As seguintes formulações para administração oral, por aerosol, parenteral, subcutânea, intravenosa, intramuscular, interperitoneal, rectal e vaginal são exemplificativas e de nenhum modo limitantes.

As formulações injectáveis encontram-se entre aquelas formulações que são preferidas em concordância com os métodos da presente invenção. Os requerimentos para transportadores farmaceuticamente eficientes para composições injectáveis são bem conhecidos para aqueles com conhecimentos comuns da técnica (ver, e.g., Pharmaceutics and Pharmacy Practice, J.B. Lippincott Company, Philadelphia, PA, Banker and Chalmers, eds., pág. 238-250 (1982), e ASHP Handbook on Injectable Drugs, Toissel, 4a edição, pág. 622-630 (1986)). É preferível que tais 10 composições injectáveis sejam administradas de modo intravenoso ou, no contexto do tratamento de cancro, de modo intratumoral (dentro do tumor) ou peritumoral (perto da periferia do tumor).

As formulações tópicas são bem conhecidas pelos especialistas na técnica. Tais formulações são particularmente adequadas no contexto da presente invenção para a aplicação na pele.

As formulações adequadas para administração oral podem consistir em (a) soluções liquidas, tais como uma quantidade eficaz do composto dissolvido em diluentes, tais como a áqua, solução salina, ou sumo de laranja; (b) cápsulas, saquetas, comprimidos, rebuçados e pastilhas, cada um contendo uma quantidade predeterminada do ingrediente activo, como sólidos ou grânulos; (c) pós; (d) suspensões num liquido apropriado; e (e) emulsões adequadas. As formulações de líquidos podem incluir diluentes, tais como água e álcoois, por exemplo, etanol, álcool benzilico, e o álcoois de polietileno, com ou sem a adição de um surfactante farmaceuticamente aceitável. As formas da cápsula podem ser do tipo comum revestidas por uma cobertura gelatinosa dura ou mole contendo, por exemplo, surfactantes, lubricantes, e preenchimentos inertes, tais como lactose, sacarose, fosfato de cálcio e amido de milho. As formas do comprimido podem incluir um ou mais de lactose, sacarose, manitol, amido de milho, amido de batata, ácido algínico, celulose microcristalina, acácia, gelatina, goma de guar, dióxido de silicone coloidal, sódio de croscarmelose, talco, estearato de magnésio, estearato de cálcio, estearato de zinco, ácido esteárico, e outros excipientes, colorantes, diluentes, 11 agentes tamponantes, agentes desintegrantes, agentes humidificantes, preservantes, agentes aromatizantes, e excipientes farmacologicamente compatíveis. As formas de rebuçado podem compreender o ingrediente activo num sabor, de modo usual a sacarose e acácia ou tragacante, assim como pastilhas compreendendo o ingrediente activo numa base inerte, tal como gelatina e glicerina ou sacarose e acácia, emulsões, géis e semelhantes contendo, em adição ao ingrediente activo, tais excipientes como são conhecidos na técnica. 0 composto presente inventivo, isolado ou em combinação com outros componentes adequados, pode ser feito em formulações de aerosol para ser administrado via inalação. Estas formulações de aerosol podem ser colocadas em agentes propulsores de pressão aceitáveis, tais como diclorodifluorometano, propano, azoto e semelhantes. Podem também ser formulados como farmacêuticos para preparações não-pressurizadas, tais como num nebulizador ou num atomizador. Tais formulações em spray podem também ser utilizadas para vaporizar mucosas.

As formulações adequadas para administração parenteral incluem soluções de injecção estéreis isotónicas aquosas e não-aquosas, que podem conter anti-oxidantes, tampões, bacteriostatos e solutos que tornam a formulação isotónica com o sangue do recipiente previsto, e suspensões estéreis aquosas e não-aquosas que podem incluir agentes de suspensão, solubilizantes, agentes de estreitamento, estabilizadores, e preservantes. 0 presente composto inventado pode ser administrado num diluente fisiologicamente aceitável num transportador farmacêutico, tal como um líquido estéril ou mistura de líquidos, 12 incluindo água, solução salina, dextrose aquosa e soluções de açúcar relacionadas, um álcool, tal como etanol, isopropanol, ou álcool hexadecil, glicóis, tais como propilenoglicol ou polietilenoglicol, dimetilsulfóxido, gliceróis keto, tais como 2,2-dimetil-l,3-dioxolano-4-metanol, éters, tais como poli(etilenoglicol) 400, um óleo, um ácido gordo, um éster ou glicérido de ácido gordo, ou um glicérido de ácido gordo acetilado com ou sem a adição de um surfactante farmaceuticamente aceitável, tal como um sabão ou um detergente, agente de suspensão, tal como pectina, carbómeros, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, ou carboximetilcelulose, ou agentes emulsificantes e outros adjuvantes farmacêuticos. Óleos, que podem ser utilizados em formulações parenterais incluem petróleo, óleo animal, vegetal ou sintético. Exemplos específicos de óleos incluem amendoim, sementes de soja, sésamo, semente do algodão, milho, azeitona, petrolato e mineral. Ácidos gordos adequados para a utilização em formulações parenterais incluem ácido oleico, ácido esteárico e ácido isoesteárico. Oleato de etilo e miristato de isopropil são exemplos de ésteres de ácidos gordos adequados.

Sabões adequados para a utilização em formulações parenterais incluem metal alcalino gordo, amónio e sais de trietanolamina e detergentes adequados incluem (a) detergentes catiónicos tais como, por exemplo, haletos de amónio dialquilo dimetilo e haletos de piridinio alquilo, (b) detergentes aniónicos tais como, por exemplo, sulfonatos de alquilo, arilo e olefina, sulfatos de alquilo, olefina, éter e monoglicéridos e sulfosuccinatos, (c) detergentes não-iónicos tais como, por exemplo, óxidos 13 gordos de amina, alcanolamidas de ácidos gordos e co-polímeros de polioxietilenopolipropileno, (d) detergentes anfotéricos tais como, por exemplo, alquil-b-aminopropionatos e sais de amónio quaternários 2-alquil-imidazolina e (e) suas misturas.

As formulações parenterais irão tipicamente conter de cerca de 0,5% até cerca de 25% por peso do ingrediente activo em solução. Podem ser utilizados preservantes e tampões. De forma a minimizar ou eliminar a irritação no local da injecção, tais composições podem conter um ou mais surfactantes não-iónicos tendo um balanço hidrófilo-lipófilo (HLB) de cerca de 12 a cerca de 17. A quantidade de surfactante em tais formulações irá de modo típico situar-se no intervalo de cerca de 5% a cerca de 15% por peso. Surfactantes adequados incluem ésteres de ácidos gordos de sorbitano de polietileno, tais como monooleato de sorbitano e os aductos de alto peso molecular de óxido de etileno com uma base hidrofóbica, formada pela condensação de óxido de propileno com propilenoglicol. As formulações parenterais podem ser apresentadas em contentores selados de doses unitárias ou de multi-doses, tais como ampolas e recipientes, e podem ser armazenadas em condições de criosecagem (liofilizados) requerendo apenas a adição do excipiente líquido estéril, por exemplo, água, para injecções, imediatamente antes da utilização. Podem ser preparadas soluções e suspensões de injecção extemporâneas a partir de pós estéreis, grânulos, e comprimidos do tipo descrito previamente.

Adicionalmente, os presentes compostos inventados, ou composições contendo esses compostos, podem ser feitos em supositórios misturando com uma variedade de bases, tais 14 como bases emulsificantes ou bases solúveis em água. As formulações adequadas para administração vaginal podem ser apresentadas como pessários, tampões, cremes, géis, pastas, espumas, ou fórmulas em spray contendo, em adição ao ingrediente activo, tais transportadores como são conhecidos na técnica como sendo apropriados.

Como discutido previamente, os derivados de geladanamicina, tais como aqueles aqui descritos, inibem certas proteínas chaperones incluindo as proteínas de choque térmico-90 (Hsp90) assim como a proteína reguladora de glucose-94 (Grp94). Foi demonstrado que a Hsp90 é necessária para uma função própria de ErbB2. Em adição, foi demonstrado que a Hsp90 está ligada à proliferação de células tumorais e crê-se que a ErbB2 desempenha um importante papel na malignidade das células tumorais. Nesta perspectiva, a presente invenção descreve adicionalmente um método de tratamento ou prevenção de cancro num hospedeiro. 0 método compreende a administração de um composto da presente invenção num hospedeiro numa quantidade suficiente para tratar ou prevenir cancro num hospedeiro, no qual o cancro do hospedeiro é tratado ou prevenido. 0 método para o tratamento de cancro utilizando o composto da presente invenção pode ser melhorado administrando um ou mais outros compostos anti-cancerígenos em paralelo com um ou mais outros compostos da presente invenção. Estes outros compostos anti-cancerígenos incluem, mas não estão limitados a, os conhecidos compostos anti-cancerígenos aprovados nos Estados Unidos e aqueles que irão ser aprovados no futuro. Ver, por exemplo, a Tabela 1 e Tabela 2 de Boyd, Current Therapy in Oncology, Section I. Introduction to Câncer Therapy (J.E. Niederhuber, ed.), 15

Capítulo 2, por B.C.Decker, Inc., Philadelphia, 1993, pág. 11-22. De um modo mais particular, os compostos anti-cancerígenos que são de modo preferido utilizados com os derivados de geldanamicina aqui descritos de acordo com a invenção incluem doxorubicina, bleomicina, vincristina, vinblastina, VP-16, VW-26, cisplatina, carboplatina, procarbazina e taxol para tumores sólidos em geral; agentes alquilantes, tais como BCNU, CCNU, metil-CCNU e DTIC, para cancros do cérebro ou do rim; e antimetabolitos tais como 5-FU e metotrexano para o cancro do cólon.

Um composto da presente invenção, de modo desejado, é administrado a uma célula que expresse ErbB2 na ausência do composto da presente invenção, ou a um hospedeiro incluindo tais células, numa quantidade suficiente para reduzir ou eliminar a expressão da proteína ErbB2. A quantidade de derivado de geldanamicina da presente invenção que é administrado é uma quantidade suficiente para reduzir a expressão de ErbB2 por pelo menos cerca de 20%, até à totalidade, quando comparado com a expressão de ErbB2 na ausência de derivados de geldanamicina da presente invenção. Será apreciado pelos especialistas na técnica que a redução da expressão da ErbB2 de pelo menos cerca de 30%, de pelo menos cerca de 40%, de pelo menos cerca de 50%, de pelo menos cerca de 60%, de pelo menos cerca de 70%, de pelo menos cerca de 80% ou de pelo menos 90% quando comparado com a expressão de ErbB2 na ausência de derivados de geldanamicina da presente invenção seja também benéfica para o hospedeiro.

Pode ser utilizado qualquer método adequado para medir níveis de expressão de ErbB2 em conjunto com a presente invenção. Métodos adequados incluem, por exemplo, 16 disposição diferencial, análise em série de expressão génica (SAGE), reacção quantitativa da polimerase de transcrição reversa em cadeia (QRT-PCR), clonagem de subtracção, macroarrays e microarrays (e.g., chips de DNA). Os níveis de expressão de ErbB2 podem ser medidos antes da administração do composto, de modo a serem determinados regimes de dosagem próprios, assim como durante e após a administração do composto de modo a determinar a biodisponibilidade e eficácia do composto in vivo.

Um especialista da técnica irá apreciar que os métodos adequados de administração dos derivados de geldanamicina da presente invenção, e composições compreendendo os derivados de geldanamicina da presente invenção, a um animal, tal como um mamífero, em particular um homem, estão disponíveis. Apesar de poder ser utilizada mais de uma via para administrar um composto particular, uma via particular pode fornecer uma reacção mais imediata e mais eficaz que outra via. De um modo concordante, os métodos aqui descritos são exemplificativos e de nenhum modo limitantes. A dose administrada a um animal, tal como um mamífero, em particular um humano, devia ser suficiente para prevenir o cancro, atrasar o seu despoletar, ou abrandar (ou parar) a sua progressão. Um especialista na técnica irá reconhecer que a dosagem irá depender da variedade de factores incluindo a força do composto particular empregue, assim como da idade, espécies, condição, e peso corporal do animal. 0 tamanho da dose irá também ser determinada pela via, temporização, e frequência de administração assim como da existência, natureza, e extensão de quaisquer efeitos paralelos adversos que podem acompanhar a administração de um composto particular e o efeito fisiológico desejado. 17

Doses e regimes de dosagem adequados podem ser determinados por técnicas convencionais de determinação de intervalos conhecidas pelos especialistas na técnica. De um modo geral, o tratamento é iniciado com doses menores, que são menos que a dose óptima do composto. Posteriormente, a dosagem é aumentada por pequenos incrementos até ser alcançado o efeito óptimo sob as circunstâncias. 0 presente método inventivo irá de modo típico envolver a administração de cerca de 0,1 a cerca de 100 mg de um ou mais dos compostos descritos acima por kg de peso corporal.

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos ilustram adicionalmente a presente invenção mas, claro, não devem ser entendidos de alguma forma como limitando o seu alcance. Foram preparados dois compostos da presente invenção (i.e., compostos A e B) e um composto comparativo (i.e., Composto C) como descrito abaixo. Cada um destes compostos foi subsequentemente utilizado num ensaio de fibras côncavas para determinar se o composto produziu actividade in vivo suficiente de forma a garantir testes adicionais.

Composto A

Preparação de 17-Dimetilaminoetilamino-l7-demetoxigel- danamicina

Uma mistura de geldanamicina (1,5 g, 2,68 mmol) (NCI, Lot No. 3059-25-1) e N,N-dimetiletilenodiamina (1,5 mL, 13,7 mmol) (Aldrich, Lot No. 04216AL) em cloreto de metileno seco (30 mL) (Burdick & Jackson, Lot No. BH516) foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora e subsequentemente colocada em água gelada (50 mL). Após as camadas orgânica e aquosa se tornarem visualmente separadas, foi extraída a 18 camada aquosa com cloreto de metileno (2 X 10 mL) . A solução combinada de cloreto de metileno foi lavada com água (2 X 10 mL), seca com MgS04 (J.T. Baker, Lot No. E01098) e evaporada num aspirador. O resíduo remanescente foi purificado por cromatografia de sílica-gel (30 g) (EM Science, Lot No. 325TA509634) eluindo com 10% de metanol (Chempure, Lot No. M178KMDH) em cloreto de metileno. As fracções contendo produto foram combinadas e concentradas num aspirador. O resíduo foi então dissolvido em cloreto de metileno quente (3 mL), arrefecido à temperatura ambiente e diluído com hexano (60 mL) (Chempure, Lot. No. M148KMRC). Esta mistura foi então agitada à temperatura ambiente durante 30 minutos. Foi recolhido por filtração um pó violeta formado, lavado com hexano (2 X 10 mL) e seco a 55 °C/0,1 mm Hg durante 6 horas para originar um composto alvo puro. Foram isoladas aproximadamente 1,59 g de 17-Dimetilaminoetilamino-17-demetoxigeldanamicina (96%) e foi utilizada no Exemplo 1.

Composto B

Preparação de Hidrocloreto de (17-Dimetoxi-17-[[2-dimetilamino)etil]amino]geldanamicina

Uma mistura de geldanamicina (15g, 26,75 mmol) (SAIC-Frederick, Lot No. 3155-28-1) e N,N-dimetil-etilenodiamina (15 mL, 37,83 mmol) (Aldrich, Lot No. HN04216AL) em cloreto de metileno seco (300 mL) (Mallinckrodt, Lot No. 4881KVJP) foi agitado à temperatura ambiente durante 1 hora e subsequentemente colocada em água gelada (500 mL). Após as camadas orgânica e aquosa se tornarem visualmente separadas, foi extraída a camada aquosa com cloreto de metileno (2 X 100 mL) . A solução combinada de cloreto de metileno foi lavada com água (2 X 100 mL) , seca com MgS04 19 (Spectrum, Lot No. HJ302) e evaporada numa bomba de diafragma. 0 resíduo remanescente (16,5 g, 26,75 mmol) foi dissolvido em cloreto de metileno (130 mL). Foi adicionado cloreto de hidrogénio (1,1 eq, 29,43 mmol) (Matheson, Lot No. T410242) dissolvido em dioxano (Aldrich, Lot No. 16619CQ) à solução resultando em precipitação imediata. Após agitação durante 30 minutos, os sólidos foram recolhidos, enxaguados com cloreto de metileno (50 mL) , e secos ao ar durante 18 horas para originar o sal de hidrocloreto de crude (17,2 g). Foi aquecida uma solução de produto de crude (17,2 g) em álcool aquoso (50% v/v, 200 mL) (Aaper Alcohol, Lot. No. 97A28UARAT) até refluxo, filtrada, e permitida a arrefecer durante 30 minutos. Após arrefecimento em gelo durante 30 minutos adicionais, os sólidos foram recolhidos, lavados com álcool anidro frio (50 mL) , e secos ao ar durante 1 hora. O produto foi seco adicionalmente a 70 °C/0,1 mmHg durante 17 horas para originar composto alvo puro. Foram isoladas aproximadamente 13,4 g de hidrocloreto de geldanamicina 17-Demetoxi-l7-[[2(dimetilamino)etil]amino] (82%) como um sólido violeta cristalino e foi utilizada nos Exemplos 1 e 2.

Composto C

Preparação_de_17-Dimetilaminopropilamino-17-demetoxi- geldanamicina

Uma mistura de geldanamicina (l,5g, 2,68 mmol) (NCI, Lot No. 3059-25-1) e 3-dimetilaminopropilamina (1,5 mL, 11,9 mmol) (Aldrich, Lot No. 08103CF) em cloreto de metileno seco (30 mL) (Burdick & Jackson, Lot No. BH516) foi agitada à temperatura ambiente durante 30 minutos e subsequentemente colocada em água gelada (50 mL) . Após as camadas orgânica e aquosa se tornarem visualmente 20 separadas, foi extraída a camada aquosa com cloreto de metileno (2 X 100 mL) . A solução combinada de cloreto de metileno foi lavada com água (2 X 100 mL) , seca com MgS04 (J.T. Baker, Lot No. E01098) e evaporada num aspirador. O resíduo remanescente foi purificado por cromatografia de sílica-gel (30 g) eluindo com 10% de metanol em cloreto de metileno. As fracções contendo produto foram combinadas e concentradas num aspirador. O resíduo foi então dissolvido em cloreto de metileno quente (3 mL), arrefecido à temperatura ambiente e diluído com hexano (60 mL) (Chempure, Lot. No. M148KMRC). Esta mistura foi então agitada à temperatura ambiente durante 30 minutos. Foi recolhido por filtração um pó violeta formado, lavado com hexano (2 X 10 mL) e seco a 55 °C/0,1 mm Hg durante 6 horas para originar um composto alvo puro. Foram isoladas aproximadamente 1,64 g de 17-Dimetilaminopropilamino-17-demetoxigeldanamicina (97%) e foi utilizada no Exemplo 1.

Os ensaios HFA e MTT

Os compostos A-C foram testados num ensaio de fibras côncavas para actividade in vivo. Cada composto foi testado contra um painel Standard de 12 linhas celulares de tumor humano incluindo NCI-H23, NCI-H522, MDA-MB-231, MDA-MB-435, SW-620, COLO 205, LOX IMVI, UACC-62, OVCAE-3, OVCAR-5, U251 e SF-295. As linhas celulares foram cultivadas em RPMI-1640 contendo 10% de FBS e 2 mM de glutamina. No dia anterior à preparação das fibras de côncavas, foi dado às células um suplemento de meio fresco para manter a fase de crescimento logarítmica. Para a preparação da fibra, as células foram recolhidas pela técnica de tripsinização padrão e ressuspendidas à densidade celular desejada. As suspensões celulares foram enxaguadas em fibras côncavas de fluoreto de polivinilideno 1 mm (PVDF) (exclusão de PM de 500000 Da) 21 e subsequentemente seladas ao calor em intervalos de 2 cm. As amostras geradas a partir destas selagens foram colocadas em meio de cultura de tecidos e incubadas a 37°C em 5% de CO2 durante 24-48 horas antes da implantação. Foi preparado um total de 3 linhas celulares de tumores diferentes para cada experiência de forma a que cada ratinho recebesse 3 implantes peritoneais (1 de cada linha celular tumoral) e 3 implantes subcutâneos (1 de cada linha celular tumoral). Foi conduzido um total de 4 experiências em cada ratinho (3 linhas celulares/experiência X 4 experiência = 12 linhas celulares).

No dia da implantação, as amostras de cada linha celular tumoral foram quantificadas para a massa celular viável por um ensaio MTT terminal estável de modo a que o tempo 0 de massa celular fosse conhecido. No ensaio MTT, as fibras foram incubadas em placas de 6 poços (1-6 fibras/poço) com 3 mL de meio completo pré-aquecido (37 °C) contendo MTT (1 mg/mL) (Sigma) durante 4 horas a 37 °C em 5% de CO2. A solução MTT foi aspirada e as fibras foram lavadas com 2 mL de solução salina contendo 2,5% de sulfato de protamina overnight a 4°C. Foi levada a cabo uma segunda lavagem com 2 mL de solução salina contendo 2,5% de sulfato de protamina, e as fibras foram mantidas a 4 °C durante um mínimo de 2 horas. As fibras foram então removidas do sulfato de protamina, individualmente alisadas, colocadas numa placa de 24 poços (1 fibra/poço) , cortada a meio e seca overnight numa câmara de biosegurança. Para extrair o formazano, foi adicionado DMSO (0,25 mL) a cada poço e as placas foram colocadas em rotação durante 4 horas à temperatura ambiente. As amostras extraídas foram transferidas para placas de 96 poços e a OD foi determinada a 540 nm. A partir destas medições espectrofotométricas, 22 foram calculadas as capacidades citostáticas e citocidais do composto em teste.

Após a implantação das fibras côncavas, os ratinhos foram tratados com um dos compostos, como listado nas Tabelas 1 e 2 iniciando no dia 3 e 4 a seguir à implantação de fibras e continuando uma vez por dia para um total de 4 doses. Cada composto foi determinado por injecção intraperitoneal (Exemplo 1) ou por administração oral (Exemplo 2) a niveis de 2 doses com 3 ratinhos/dose/ experiência. Os controlos veiculo consistiram em 6 ratinhos recebendo apenas o diluente do composto. As fibras foram recolhidas dos ratinhos no dia seguinte ao tratamento com o quarto composto e sujeitos ao ensaio MTT terminal estável. A densidade óptica de cada amostra foi determinada espectrofotometricamente a 540 nm e foi calculada a média de cada grupo de tratamentos. A percentagem de crescimento celular da rede foi determinada em cada grupo de tratamentos e comparada com a percentagem de crescimento celular da rede nos controlos veiculo tratados.

No contexto dos seguintes exemplos, os compostos foram seleccionados para testes adicionais (e.g., estudos de exposição tempo/dosagem, estudos farmacológicos preliminares, estudos de eficácia xenográfica subcutânea) na base de vários critérios de ensaio de fibras côncavas, incluindo (1) uma redução no crescimento celular de rede de 50% ou mais em 10 das 48 combinações teste possíveis; (2) uma redução no crescimento celular de rede de 50% ou mais num mínimo de 4 das 24 combinações distantes do local (pontuação SC); e/ou (3) morte celular de 1 ou mais linhas celulares em cada local de implante (redução na massa 23 celular viável abaixo do nível presente no início da experiência).

Para simplificar a avaliação, foi adoptado um sistema pontual que permite a rápida visualização da actividade de um dado composto. Para isto, foi designado um valor de 2 para cada dose de composto, o que resulta numa redução de 50% ou mais na massa celular viável. As amostras intraperitoneais (IP) e subcutâneas (SC) foram pontuadas separadamente de modo a que os critérios (1) e (2) pudessem ser avaliados independentemente. EXEMPLO 1

Este exemplo demonstra a actividade in vivo dos compostos da presente invenção quando comparados com o derivado de geldanamicina de estrutura semelhante.

Um ensaio de fibra côncavas foi conduzido com os Compostos A-C, como descrito acima. Os Compostos A e B foram misturados com solução salina e tween 80 (0,05%) de modo a obter dois níveis de dosagem de 75 mg/Kg/dose e 50 mg/Kg/dose, respectivamente. O Composto C foi também misturado com solução salina e tween 80 (0,05%) de modo a obter dois níveis de dosagem de 20 mg/Kg/dose e 13,4 mg/Kg/dose, respectivamente. Os níveis de dosagem óptimos foram determinados a partir de estudos prévios de toxicidade e desse modo as dosagens utilizadas representam o intervalo superior que pode ser administrado a um hospedeiro sem induzir efeitos tóxicos. Todos os três compostos foram administrados uma vez por dia durante quatro dias via injecção peritoneal. Após quatro dias, as fibras côncavas foram removidas dos ratinhos e sujeitas ao ensaio MTT como descrito acima. A percentagem da inibição 24 do crescimento celular foi calculado [(1-(% crescimento de rede tratado/% crescimento de rede controlo))*100] e foi designada uma pontuação HFA para cada composto na base deste cálculo, como indicado na Tabela 1.

Tabela 1

Composto Via de Dose/Unidades Pontuação Pontuaçao Pontuação administração (mg/Kg/dose) IP SC HFA Total IP 75 A IP 50 20 10 30 IP 75 B IP 50 24 18 42 IP 20 C IP 13,4 14 2 16

Como indicado nos resultados, cada composto da presente invenção (e.g., Compostos A e B) produz pontuações HFA significativamente maiores e, assim, actividade anti-cancerigena in vivo significativamente maior que um composto não da presente invenção (e.g., Composto C). EXEMPLO 2

Este exemplo demonstra a actividade in vivo oral de um composto da presente invenção.

Um ensaio de fibras côncavas foi conduzido com o Composto B da presente invenção, como descrito acima. O Composto B foi misturado com água de modo a obter dois níveis de dosagem de 75 mg/Kg/dose e 50 mg/Kg/dose, respectivamente. O Composto B foi então administrado oralmente (PO) uma vez por dia durante quatro dias. Após quatro dias, as fibras côncavas foram removidas dos ratinhos e sujeitos ao ensaio MTT como descrito acima. A percentagem da inibição do crescimento celular foi calculado [(1-(% crescimento de 25 rede tratado/% crescimento de rede controlo))*100] e foi designada uma pontuação HFA para cada composto na base deste cálculo, como indicado na Tabela 2.

Tabela 2

Composto Via de Dose/Unidades Pontuaçao Pontuação Pontuação administração (mg/Kg/dose) IP SC HFA Total PO 75 B PO 50 10 10 20

Baseado nos resultados indicados acima, o Composto B da presente invenção exibiu actividade anti-cancerigena in vivo significativa por administração oral.

Todas as referências aqui citadas, incluindo patentes de aplicação e publicações, são aqui incorporadas na sua totalidade por referência.

Enquanto esta invenção foi descrita com ênfase nas formas de realização preferidas, as variações das formas de realização preferidas podem ser utilizadas, e é pretendido que a invenção possa ser praticada de outra forma além da aqui especificamente descrita.

Lisboa, 18 de Outubro de 2006 1

REIVINDICAÇÕES 1.

Derivado de geldanamicina tendo a estrutura: o

H II I ii em que n=0 ou 1 e em que, quando n=l, cada R1 e R1 é hidrogénio, e quando n=0, existe uma ponte dupla entre C4 e R3 é hidrogénio ou hidroxilo; R4 é hidrogénio ou hidroxilo; em que, quando R3 é hidrogénio, R4 é hidroxilo, e quando R3 é hidroxilo, R4 é hidrogénio; e R5 é hidrogénio ou um grupo de fórmula

em que cada R6, R7, e R8 é seleccionado de modo independente a partir do grupo consistindo em hidrogénio, halo, azido, nitro, um alquilo Ci-Cs, um alcóxilo Ci-Cs, arilo e ciano; ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

Composto da reivindicação 1, em que n=0. 1 . 3. 2

Composto da reivindicação 2, em que o composto tem a estrutura

3. 2 O

CHj

O

ou um seu sal farmaceuticamente aceitável. 4. Composição farmacológica compreendendo o composto da reivindicação 1 e um transportador farmacologicamente aceitável. 5. Composição farmacológica compreendendo o composto da reivindicação 3 e um transportador farmacologicamente aceitável. 6. Utilização de um composto da reivindicação 1 na produção de um medicamento para o tratamento de cancro. 7. Utilização de acordo com a reivindicação 6, em que o composto é para ser administrado de modo oral. 8. Utilização de acordo com a reivindicação 6, em que o composto é para ser administrado de modo intravenoso. 9. Utilização de acordo com a reivindicação 6, em que o hospedeiro é um mamífero. 3 10. Utilização de acordo com a reivindicação 9, em que o hospedeiro é um humano. 11. Utilização de um composto da reivindicação 3 na produção de um medicamento para o tratamento de cancro. 12. Utilização de acordo com a reivindicação 11, em que o composto é para ser administrado de modo oral. 13. Utilização de acordo com a reivindicação 11, em que o composto é para ser administrado de modo intravenoso. 14. Utilização de acordo com a reivindicação 11, em que o hospedeiro é um mamífero. 15. Utilização de acordo com a reivindicação 14, em que o hospedeiro é um humano.

Lisboa, 18 de Outubro de 2006