PT100580A

PT100580A - Producao e recuperacao de neurotrofinas recombinantes

Info

Publication number: PT100580A
Application number: PT100580A
Authority: PT
Inventors: Nikos Panayotatos; James P Fandl
Original assignee: Regeneron Pharma
Priority date: 1991-06-12
Filing date: 1992-06-09
Publication date: 1993-09-30
Also published as: WO1992022665A1; JPH06508036A; IL102170A0; NZ243084A; EP0590059A4; CA2111110A1; IE921888A1; AU2238792A; EP0590059A1

Description

74 061 6526-081-118 -2-

MEMÓRIA DESCRITIVA

Este pedido de patente é uma continuação em parte do pedido de patente co-pendente Ns de Série 07/715 185, apresentada em 12 de Junho de 1991, que é aqui incorporado por referência na sua globalidade.

1. INTRODUÇÃO

Este invento refere-se aos campos da neurobiologia, biologia molecular e bioquímica de proteínas e, em particular, a neurotrofinas e aos processos de produção e recuperação das mesmas.

2. ANTECEDENTES DO INVENTO

As neurotrofinas são um grupo de proteínas envolvidas no funcionamento do sistema nervoso. Elas estimulam o crescimento de células nervosas e, durante o desenvolvimento embrionário, suportam a sua sobrevivência. Até à data, os investigadores identificaram quatro neurotrofinas: factor de crescimento do nervo (NGF) fUllrich et al.. 1983, Nature 303:821-825). factor neurotrofico derivado do cérebro (BDNF) (Leibrock et al.. 1989, Nature 341:149-152). factor neurotrofico 3 (NT-3) (Maisonpierre et al.. 1990, Science 247:1446-14511 e neurotrofina-4 (Hallbook et al. . 1991, Neuron 6.:845-858). O factor de crescimento do nervo é essencial para o desenvolvimento e sobrevivência do sistema nervoso periférico e simpático e dos neurónios colinérgicos do cérebro. Ele está agora a ser testado para utilização na doença de Alzheimer. 0 BDNF promove a sobrevivência dos neurónios sensitivos no sistema nervoso central e representa uma esperança na terapia da doença de Parkinson. O NT-3 e a NT-4 foram recentemente obtidos, estando agora a ser investigado o seu papel biológico. Ã semelhança do NGF, o NT-3 parece actuar nos neurónios sensitivos e simpáticos. 0 NGF humano nativo possui três sub-unidades: α,Λ &X· Só a sub-unidade β possui actividade neurotrofica. 0 NGF-jS é 74 061 6526-081-118 3

produzido como uma pré-pró-proteína que é segregada pela célula e processada na forma madura. O pré-pró-péptido contém 187 resíduos de aminoácidos. Durante o processamento, removem-se as pré- e pró-sequências, visto que são dois resíduos de aminoácidos no terminal C. Isto dá uma proteína madura de 118 resíduos de aminoácidos. A proteína madura possui seis resíduos cisteína que formam três ligações dissulfureto. A proteína contém também muitos aminoácidos básicos resultando numa carga positiva a pH neutro.

Estruturalmente, as neurotrofinas formam uma família, tendo-se aparentemente desenvolvido a partir de um gene ancestral comum. (Hyman et al.. 1991, WO 91/03568). Por exemplo, a sequência de aminoácidos do polipéptido β do N6F humano (hNGF) é 90% homóloga à do NGF de ratinho e à do NGF de bovino; e as três neurotrofinas humanas, hNGF, hBDNF e hNT-3, partilham de 60% de homologia ao nível dos aminoácidos. Os seis resíduos cisteína estão conservados em todas as neurotrofinas conhecidas, implicando que as ligações dissulfureto sejam importantes para a função.

As fontes naturais de neurotrofinas são limitadas. A glândula submaxilar de ratinho é rica em NGF mas o isolamento é difícil e as quantidades recuperadas são pequenas (Hyman et al., 1991, WO 91/03568). Del la Valle et al. . (EP 0 333 574, 1989) descreveram o isolamento de pequenas quantidades de hNGF a partir da placenta humana por fraccionamento cromatográfico.

Por consequência, os investigadores voltaram-se para a genética molecular para proporcionar uma fonte rápida de neurotrof inas biologicamente activas. As sequências de ADN que codificam NGF, BDNF e NT-3 foram todas isoladas (Ullrich et al.. Nature 303:821-825; Hyman et al.. WO 91/03568; Hohn et al.. WO 91/03569; e Kaisho et al.. FEBS Letters 266:187-191). Os investigadores transformaram hospedeiros animais e não animais com estas sequências de modo a expressar as neurotrofinas.

Kanaya et al. (1989, Gene 83:65-74) fundiu uma sequência de 74 061 6526-081-118 4

ADN que codifica o hNGF maduro numa que codifica a sequência pré-pro do factor de emparelhamento a de levedura. Após a expressão, o sobrenadante de cultura continha uma proteína reconhecida pelos anticorpos hNGF-α. Contudo, a proteína parcialmente purificada exibiu baixa actividade neurotrófica. Além disso, o nível de expressão foi baixo. Kanaya et al.f afirmaram que estes resultados podem ser devidos ou à incapacidade do sistema da levedura para remover os dois resíduos de aminoácido extra do terminal C, durante a maturação ou a um problema com o dobramento da proteína hNGF.

Chan et al. (EP 0 370 171, 1990) produziram hNGF maduro em células de insectos. Eles fundiram um gene para pré-pró-hNGF ao promotor poli-hedrina e à sequência de comando do ADN baculovi-ral. Eles descreveram a produção de 6 /xg/ml de hNGF, mas não caracterizaram fisicamente o produto.

Os investigadores expressaram também NGF, BDNF e NT-3 humanos em sistemas de expressão de mamíferos. Bruce e Heinrich (1989, Neurobiolocrv of Aaina 10.:89-94) expressaram uma sequência de ADN que codifica o precursor completo para hNGF em células COS e detectaram o dímero hNGF no meio condicionado. Contudo, eles não puderam determinar a eficácia à qual o pré-pró-hNGF foi convertido no hNGF maduro. Kakinuma et al. (EP 0 414 151, 1991) expressaram hNGF activo em células CHO. Hyman et al. (WO 91/03568, 1991) expressaram hBDNF em células CHO. Nakahama et al. (EP 0 386 752, 1990) e Hohn et al. (WO 91/03569, 1991) expressaram hNT-3 em células COS.

Os sistemas de mamíferos proporcionam o meio mais natural para a produção de proteínas de mamíferos. Contudo, a produção de grandes quantidades de proteínas nestes sistemas é muito dispendiosa. Por consequência, há necessidade de desenvolver sistemas que sejam menos dispendiosos e mais produtivos. Um desses sistemas é a E. coli.

Os investigadores tentaram produzir neurotrofinas em E. coli. mas sem um sucesso significativo. Gray e Ullrich (EP 0 121

74 061 6526-081-118 -5-338, 1984) construíram um vector de expressão que codifica N-metionil-hNGF e expressaram o gene em E. coli. Eles descreveram a identificação do hNGF por imunodetecção em mancha Western, mas não isolaram a proteína nem demonstraram a actividade biológica.

Hu e Neet (1988, Gene:57-65) tentaram expressar o NGF de ratinho em E. coli. Eles clonaram uma sequência de ADN que codifica um NGF de ratinho, maduro, na qual substituíram a seri-na, o aminoácido do terminal N na proteína nativa, por metionina. Eles inseriram a sequência de ADN num plasmídeo que possui um promotor lambda PL induzível pela temperatura. Este sistema expressa outras proteínas heterólogas às taxas de 10% -25% da proteína celular total. Eles expressaram o gene e isolaram o NGF por precipitação com sulfato de amónio seguida por diálise contra tampão acetato. Contudo, como verificado por bioensaio, este sistema só rendeu 0,0005% a 0,1% de NGF. Os autores especularam que os rendimentos altamente inconsistentes e baixos eram devidos à toxicidade do NGF para as células, instabilidade ou ineficácia na tradução do AJRNm ou a ligações dissulfureto desemparelhadas na proteína oxidada, redobrada.

Iwai et al. (1986, Chem. Pharm. Buli. 34:4724-4730) descreveram a síntese de um gene que codifica hNGF com codões preferidos em E. coli. Eles expressaram directamente o gene como N-metionil-hNGF ou como uma proteína de fusão com hormona humana do crescimento. A expressão directa só tem um quarto da eficácia da expressão da proteína de fusão. Eles examinaram as proteínas por SDS-PAGE, mas, por outro lado, não as isolaram.

Dicou et al. (1989, J. Neurosci. Res. 22.:13-19) expressaram pré-pró-NGF de ratinho e um fragmento de hNGF como proteínas de fusão com jS-galactosidase e verificaram que a adição de inibidores da protease aumenta o rendimento.

Em resumo, as tentativas anteriores para expressar neurotrofinas em E. coli resultaram na morte da célula, baixos níveis de acumulação de proteínas e na expressão de proteínas 74 061 6526-081-118 -6- virtualmente sem qualquer actividade biológica.

3. SUMÁRIO DO INVENTO

J

Este invento proporciona processos de produção e recuperação de neurotrofinas recombinantes biologicamente activas a partir de células hospedeiras não animais. Os processos de produção de neurotrofinas recombinantes compreendem o passo de cultivar uma célula hospedeira transformada com uma molécula de ADN recombinante compreendendo uma sequência de controlo de expressão operativamente ligada a uma sequência de ADN que codifica uma neurotrofina. Quando as neurotrofinas São directamente expressas no citoplasma, as células hospedeiras são preferivelmente mutantes deficientes em protease e, tanto quanto é do nosso conhecimento, mutantes de gene regulador por choque térmico. Em hospedeiros bacterianos, o gene da neurotrofina está preferivelmente sob o controlo de um promotor controlável e a expressão é preferivelmente não-induzida ou reprimida até as células atingirem a última fase log. As neurotrofinas podem ser também segregadas a partir da célula durante a produção, proporcionando uma sequência de ADN que codifica um péptido de sinal a montante da sequência de ADN que codifica a neurotrof ina.

Os processos de recuperação de neurotrofinas recombinantes biologicamente activas produzidas por culturas de células hospedeiras compreendem o passo de solubilização da neurotrofina numa solução compreendendo um agente de desnaturação forte, estando a solução essencialmente isenta de agentes redutores. De acordo com uma concretização do invento a solução compreende ainda um inibidor da protease numa quantidade eficaz para inibir a degradação da neurotrofina por proteases. Outras concretizações do invento compreendem ainda alguns ou todos os passos seguintes: permutar o agente de desnaturação forte por um agente de desnaturação fraco; ajustar a solução de modo a compreender um aminoácido básico ou um equivalente a uma concentração eficaz para manter a solubilidade da neurotrofina num meio não-desnaturante; purificar a neurotrofina de outras 74 061 6526-081-118 7-

moléculas na solução; remover o agente de desnaturação fraco; e completar a purificação na ausência do agente de desnaturação.

Numa outra concretização do invento, a molécula de neurotrofina expressa em E. coli e recuperada numa forma biologicamente activa é a neurotrofina-4. Numa concretização preferida do invento dirigida para a expressão de NT-4 biologicamente activa em E. coli. a NT-4 é codificada por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência substancialmente como representada para hNT-4 na Figura 11 ( SEQ ID Na22) ou pode compreender uma sequência que é, pelo menos, cerca de setenta por cento homóloga de uma tal sequência.

4. DESCRICÃO DOS DESENHOS A Figura 1 é uma representação esquemática do plasmídeo PRPN133. A linha a cheio representa as sequências de ADN derivadas de pBR322 com a origem de replicação (ORI) e o gene da jS-lactamase (resistência à ampicilina) (Ap) indicados. As características identificativas do plasmídeo estão indicadas por regiões enquadradas com setas que indicam a direcção da transcrição ou replicação. PL indica o promotor lambda PL. rbsl é o promotor de tipo selvagem e o sítio de ligação ao ribossoma do fago T7 Φ1.1. 0 gene hNGF codifica um polipéptido maduro no qual o segundo resíduo de aminoácido, a serina, é substituída por treonina. cI857 indica o gene repressor λ inactivável por calor A Figura 2 mostra curvas dose-resposta para o NGF humano recombinante produzido em E. coli por (A) explantes dos gânglios da raiz dorsal (DRG) de embrião de galinha E8 e (B) DRG E8 dissociados. A Figura 3 representa as sequências de nucleótidos e de aminoácidos da LamB de tipo selvagem (Fig. 3A, SEQ ID Nal) e as sequências de sinal de LamB sintéticas, LamBl (Fig. 3B, SEQ ID Na2), LamB2 (Fig. 3C, SEQ ID Na3), LamB3 (Fig. 3D, SEQ ID Na4) e

6526-081-118 -8

LamB4 (fig. 3E, SEQ ID Ns5). A Figura 4 representa a cinética de processamento da sequência de sinal das sequências de sinal de LamB modificadas, LamBl e LamB3. Cultivou-se a estirpe BL21/DE3 contendo o plasmídeo LamB-hBDNF apropriado. Nesta estirpe, o gene que codifica a RNA-polimerase T7 foi inserido no cromossoma e está sob o controlo de transcrição do promotor lac (Studier e Moffatt, J. Mol. Biol. 189:113-30). A adição de IPTG às células em crescimento durante 10 minutos permite a síntese de RNA-polimerase T7. A subsequente adição de rifampicina, a 0,2 mg/ml, bloqueia a transcrição por RNA-polimerase de E. coli mas permite a transcrição por RNA-polimerase T7. Isto resulta na transcrição selectiva do gene LamB - hBDNF que é imediatamente colocado a jusante do último promotor T7 01.1 e do sítio de ligação ao ribossoma de rbs2. As células foram feitas pulsar com 35S-metionina durante 30 segundos e depois capturadas com um excesso de metionina fria. Fizeram-se amostragens das culturas aos tempos indicados após captura e as proteínas marcadas foram analisadas por SDS-PAGE a 15% e fluorografia. 0 processamento foi determinado por varrimento densitométrico do precursor e formas maduras de LamB-hBDNF. A Figura 5 é uma representação esquemática de pRPN121. A linha a cheio representa as sequências de ADN derivadas de pBR322 com a origem de replicação (ORI) e o gene da 0-lactamase (Ap) indicados. As características distintivas do plasmídeo são indicadas por regiões enquadradas com setas indicando a direcção da transcrição ou replicação (ORI). LacUV5 é o promotor. rbs2 indica o promotor T7 01.1 e o sítio de ligação ao ribossoma T7 §1.1 com menores substituições de nucleótidos do tipo selvagem concebidas para criar sítios de restrição adequados. LamB2 é a sequência de sinal. hBDNFmyc é o gene estrutural. A Figura 6 representa um perfil de proteínas de fraccionamento em Fast S-SEPHAROSE^ 1 do hBDNFmyc. O Extracto W3110 I(íF"/pRPN121 após cromatografia em DEAE foi fraccionado 74 061 6526-081-118

Ç*. / -9- como descrito numa coluna de Fast S-SEPHAROsá^)de 1,6 cm X 6,5 cm em ureia 7 M, histidina 50 mM, pH 5,0, EDTA 1 mM. As fracções indicadas foram analisadas por SDS-PAGE a 15% e as proteínas visualizadas por corante de Coomassie. Reuniram-se as fracções 26-30. A Figura 7 é um resumo do procedimento de purificação. A estirpe W3110 I<íF“/pRPN121 foi deixada crescer, induzida e extractada como acima descrito. As fracções de coluna reunidas foram analisadas por SDS-PAGE num gele de acrilamida a 15% e coradas com azul de Coomassie. Faixa 1, DEAE; faixa 2, Fast S-SEPHAROSI® 1; faixa 3, Fast S-SEPHAROSI^ 2; faixa 4, HPLC de fase inversa C4. Estão indicados os padrões de peso molecular. A Figura 8 representa uma curva de dose-resposta para a estimulação por hBDNFmyc purificado do desenvolvimento de neurite em DRG de embrião de galinha E8. A actividade do hBDNFmyc é comparada com a do hBDNF recombinante purificado a partir de uma linha de células do ovário de criceto Chinês. As duas proteínas foram purificadas a mais de 95% por HPLC de fase inversa C4. A Figura 9 representa uma curva de dose-resposta para a estimulação do desenvolvimento de neurite em DRG de embrião de galinha E8 por hBDNF recombinante purificado a partir de E. coli. 0 hBDNF foi purificado a mais de 95% por HPLC de fase inversa C4. A Figura 10 é uma representação esquemática do pRPN149. A linha a cheio representa as sequências de ADN derivadas de pBR322 com a origem de replicação (ORI) e o gene da /3-lactamase (Ap) indicados. As características distintivas do plasmídeo são indicadas por regiões enquadradas com setas indicando a direcção da transcrição ou replicação (ORI). LacUV5 é o promotor. rbs2 indica o promotor T7 §1.1 e o sítio de ligação ao ribossoma T7 §1.1 com menores substituições de nucleótidos do tipo selvagem concebidas para criar sítios de restrição adequados. LamBl é a sequência de sinal. hBDNF é o gene 74 061

6526-081-118 -10-estrutural. A Figura 11 é a sequência de ADN de uma porção do clone de fago genómico humano, isolado, 7-2 que codifica a NT-4 humana (SEQ ID Na22; Na de Acesso ao ATCC 75070). A proteína hNT-4 prevista codificada pelo clone genómico 7-2 é representada pelos símbolos, para aminoácidos, de uma letra (SEQ ID Na23). A região enquadrada representa o sítio de clivagem previsto da pré-proteína hNT-4. As setas indicam os resíduos conservados na pré-sequência. A região sublinhada (N-R-S) representa uma sequência de consenso para N-glicosilação. A região dentro de um circulo representa a metionina de início. O sítio aceitador de união está localizado no par de bases 461-462 (AG), representando a extremidade 3' do intrão. A Figura 12 é uma representação esquemática do pRG91. A linha a cheio representa as sequências de ADN derivadas de pBR322 com a origem de replicação (ORI) e o gene da /3-lactamase indicados. As características distintivas do vector são mostradas por regiões enquadradas. LacUV5 é o promotor. rbs2 é o promotor T7 $1.1 do fago e o sítio de ligação ao ribossoma T7 §1.1. LamB2 é a sequência de sinal. O plasmídeo pRG91 (Regeneron Pharmaceuticals) é um vector à base de pBR322 concebido para a expressão de proteínas recombinantes e sua secreção no espaço periplásmico da Escheri-chia coli. O vector consiste no promotor lacUV5, regulado, forte, seguido pelo promotor T7 ¢1.1 do fago e pelo sítio de ligação ao ribossoma inseridos entre os sítios de restrição EcoRI e NruI em pBR322. Estes elementos de controlo dirigem a expressão da sequência de sinal LamB2 à qual se podem fundir as sequências dos genes de proteína recombinante. As sequências de ADN entre os sítios de restrição NruI e PvuII únicos foram deleccionadas, resultando num número maior de cópias de plasmídeos. Este plasmídeo confere resistência à ampicilina (Ap). A Figura 13 é uma curva de dose-resposta para a hNT-4 74 061 6526-081-118 -11

expressa em E. coli. O extracto de proteína solúvel de uma cultura induzida da estirpe RFJ26 que contém o plasmídeo pRG173 foi ensaiado em explantes de gânglio da raiz dorsal E8. A actividade de fundo deste ensaio foi de 0,2 unidades. A Figura 14 representa o efeito da hNT-4 na actividade de CAT. 0 tratamento das culturas enriquecidas em neurónios motores com um extracto parcialmente purificado de uma cultura induzida da estirpe RFJ26 que contém o plasmídeo pRG173 resultou num aumento de 3,6 vezes (à diluição de 1:20) na actividade de CAT, após 48 horas, quando comparado a controlos não tratados (C-NT) e de tampão (C-tampão). 0 extracto de E. coli foi passado através de uma coluna de Sepharose-S como descrito infra antes do tratamento das culturas enriquecidas em neurónios motores.

5. DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

Como aqui utilizado, o termo "neurotrofina" refere-se a um qualquer membro da família das neurotrofinas, que ocorre naturalmente. Isto inclui as proteínas que ocorrem naturalmente que partilham de homologia de sequência de aminoácidos com uma qualquer neurotrofina conhecida e que conservam os seis resíduos cisteína característicos. (Algumas destas proteínas podem-se incluir estruturalmente na família das neurotrofinas, contudo podem exibir uma actividade biológica diferente da actividade neurotrófica). o termo "neurotrofina" refere-se também às neurotrofinas construídas cujas sequências de aminoácidos derivam ou se modelam de acordo com as neurotrofinas que ocorrem naturalmente. Por exemplo, incluem-se as neurotrofinas quiméricas que compreendem sequências de aminoácidos de diferentes neurotrofinas (por exemplo, NGF e NT-3) ou da mesma neurotrofina de espécies diferentes (por exemplo, hBNDF e BDNF de porco); neurotrofinas cujas sequências genéticas têm substituições pontuais, mutações por adição ou delecção; neurotrofinas derivadas da pré-pró-sequência (por exemplo, neurotrofinas que possuem os dois resíduos de aminoácidos do terminal carboxi codificados pelos codões que antecedem imediatamente o codão de 74 061 6526-081-118 -12-

paragem do gene nativo ("neurotrofina de comprimento total"); e inclui fragmentos de uma neurotrofina gue exibem actividade neurotrófica (por exemplo, aqueles cujos primeiros seis aminoácidos estão alterados ou deleccionados). Estes exemplos são descritivos e não têm a intenção de limitar a definição.

Este invento proporciona processos de produção e recuperação de neurotrofinas recombinantes biologicamente acti-vas. Ele proporciona ainda as neurotrofinas recombinantes, homogéneas, purificadas, preparadas por estes processos. Uma proteína recombinante, como utilizado nesta especificação, é uma proteína expressa a partir de uma molécula de ADN recombinante numa célula hospedeira transformada com ela. Uma molécula de ADN recombinante é uma molécula híbrida compreendendo sequências de ADN de diferentes fontes que foram ligadas umas às outras. Sam-brook et al. (1989, Molecular Clonina: A Laboratorv Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor) descrevem muitas técnicas convencionais para a tecnologia de ADN recombinante .

De acordo com este invento, a produção de neurotrofinas recombinantes envolve a cultura de uma célula hospedeira não animal transformada com uma molécula de ADN recombinante que possui uma sequência de controlo de expressão operativamente ligada a uma sequência de ADN que codifica uma neurotrofina. Uma sequência de controlo de expressão está operativamente ligada a uma sequência de ADN que codifica um polipéptido quando a sequência de controlo de expressão dirige e promove a transcrição e tradução da sequência de ADN. A cultura de uma célula hospedeira transformada envolve a incubação da célula em condições de cultura adequadas ao crescimento da célula e a expressão da sequência de ADN.

As sequências de ADN que codificam neurotrofinas estão disponíveis a partir de várias fontes. A literatura descreve sequências de ADN para as quatro neurotrofinas humanas conhecidas (i.e., hNGF (Gray et al.. EP 0 121 338, 1984), hBDNF (Hyman et al.. WO 91/03568), hNT-3 (Hohn et al., WO 91/03569) e 74 061 6526-081-118 -13-

NT-4 de Xenopus (Hallbook et al.. 1991, Neuron 6:845-858)) e para muitas neurotrofinas não humanas. Preferivelmente, referem-se estas sequências para direcção da construção de iniciadores de oligonucleótido adequados para amplificação. As bibliotecas genómicas são fontes adequadas de ADN para matrizes de PCR. São também úteis as bibliotecas de ADNc de células que se sabe expressarem ARNm de neurotrofina. Por exemplo, as bibliotecas de ADNc de ARNm do cérebro de feto humano contêm sequências para hBDNF. Podem-se também analisar as bibliotecas de ADNc e genómicas, utilizando-se qualquer um dos processos conhecidos na arte para identificar e isolar sequências de ADN que codificam neurotrofinas. Alternativamente, podem-se construir genes sintéticos ou semi-sintéticos utilizando-se sintetizadores de ADN convencionais. Sem dúvida que os investigadores vão encontrar sequências de ADN que codificam novas neurotrofinas. Os processos deste invento serão igualmente úteis na produção e recuperação destas neurotrofinas.

Especificamente, o invento refere-se em geral à produção de NT-4 ou de um seu derivado ou fragmento por crescimento de uma bactéria recombinante contendo um ácido nucleico que codifica NT-4 ou um seu derivado ou fragmento sob certas condições, de modo que a NT-4 ou um seu derivado ou fragmento sejam expressos pela bactéria, e à recuperação da NT-4 produzida ou derivado ou fragmento de NT-4. Numa concretização preferida, a NT-4 é NT-4 humana. Numa outra concretização, produz-se um derivado de NT-4 que é uma proteína quimérica ou de fusão. Numa concretização mais preferida, a NT-4 produzida, ou o derivado ou fragmento de NT-4, são biologicamente activos, i.e., capazes de exibir uma ou mais das actividades funcionais de NT-4 conhecidas, como ensaiado por qualquer um dos processos conhecidos na arte ou aqui apresentados (por exemplo, ensaios in vitro da capacidade para promover o desenvolvimento em explantes de DRG E8, da capacidade para estimular a actividade de CAT em culturas de neurónios motores; ver Secção 9, infra).

Numa concretização específica do invento, as sequências que codificam a NT-4 humana são expressas num sistema de expressão 74 061

6526-081-118 -14-

em E. coli e utiliza-se um esquema de purificação como descrito infra para se produzir quantidades úteis de NT-4 humana. O ácido nucleico que codifica a NT-4 humana que é assim expresso pode ser aquele contido no ácido nucleico pRG173 (Número de Acesso ao ATCC 75131) ou HG7-2 (Número de Acesso ao ATCC 75070) ou mostrado na Figura 11 (SEQ ID NB22)/ ou isolado por qualquer um dos processos conhecidos na arte, ou como se segue: As misturas dos oligonucleótidos 5' e 3' que representam todos os codões possíveis correspondentes às sequências NT-4 conhecidas ou às sequências de aminoácidos conservadas de neurotrofinas conhecidas são utilizadas como iniciadores na reacção em cadeia com polimerase (PCR). As reacções de amplificação por PCR primárias e secundárias de bibliotecas de ADNc ou genómicas, humanas (ou de outros mamíferos) resultam no isolamento de um produto de PCR que pode ser utilizado como sonda marcada com 32P, para isolar um clone de ADNc ou genómico de comprimento total que codifica NT-4. 0 termo "neurotrofina-4 humana", como aqui utilizado, dever-se-á entender significar um qualquer homólogo humano da NT-4 de Xenopus (Hallbook et al. . 1991, Neuron 6:845-858), incluindo uma molécula de neurotrofina homóloga ainda distinta (por exemplo, pelo menos com cerca de setenta por cento de homologia). A literatura descreve uma variedade de sequências de controlo de expresssão úteis para expressar sequências de ADN em hospedeiros não animais transformados. Estas incluem, entre outras, em bactérias, o sistema lac, o sistema trp. o sistema TAÇ, o sistema TRC. o promotor lambda P^, os últimos promotores T7 e as regiões de controlo da proteína de revestimento fd; e em leveduras, o promotor da fosfoglicerato-quinase, o promotor Gal 4, o promotor His, o promotor da álcool-desidrogenase, o promotor da fosfatase alcalina e o promotor do factor de emparelhamento a. Preferem-se as sequências de controlo de expressão controláveis e, entre estas, prefere-se ainda mais um promotor lambda PL induzível por temperatura, o promotor lacOV5 e o promotor T7 Φ1.1 para expressão em E. coli. A literatura descreve também uma variedade de sistemas de

,ο 74 061 6526-081-118 -15- vector de expressão/hospedeiro adequados para hospedeiros bacterianos e fúngicos, incluindo plasmídeos, bacteriófagos, cosmídeos e seus derivados. São exemplos destes sistemas, para bactérias, o col Fl, pCRl, pBR322, pMB9, RP4, fago lambda, M13 e vírus filamentosos; e, para leveduras, ο 2/i. Os plasmídeos preferidos em bactérias são estáveis na célula hospedeira e apresentam um número médio de cópias de 20-200 cópias por célula. Utilizaram-se plasmídeos derivados de pBR322, tais como aqueles descritos por Panayotatos (1987, Enoineerinq an Efficient Expression System, em Plasmids-A Praticai Approach, ed♦ Herdy, K., IRL Press, Oxford/Washington, D.C.). Em particular, preferem-se os plasmídeos da classe RPN, desenvolvidos por Regeneron Pharmaceuticals, Inc. e mais promenorizadamente descritos abaixo. A arte está também familiarizada com muitos hospedeiros não animais úteis para expressar proteínas heterólogas, incluindo E. coli. Bacillus. Streptomvces. Saccharomvces e Pichia pastoris. Prefere-se a E. coli. A cultura de células hospedeiras transformadas resulta na expressão das neurotrofinas. Verificou-se que as neurotrofinas expressas em bactérias estão sujeitas a degradação por proteases intracelulares, especialmente aquelas induzidas como parte da resposta por "choque térmico" a proteínas estranhas (Goff et al.. 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81;6647-6651). Por consequência, é preferível utilizar mutantes deficientes em protease como células hospedeiras. A expressão dos genes por choque térmico é regulada por genes reguladores por choque térmico, tal como o gene htpR de E. coli. Os mutantes do gene HtpR são deficientes na expressão de genes protease por choque térmico, assim como em outros genes que contribuem para a resposta ao choque térmico. Verificou-se que a expressão de neurotrofinas recombinantes em mutantes de gene regulador por choque térmico, especialmente mutantes htpR", aumenta significativamente o rendimento. São particularmente úteis os mutantes duplos HtpR" lon~. Prefere-se a estirpe LC137

74 061 6526-081-118 -3.6- ;ν( ·», ^ 6 de Ε. coli. um mutante htpR^s lon~. Esta estirpe está disponível a partir do Prof. Alfred Goldberg, Harvard University. A patente U.S. 4 758 512 (Goldberg et al.) descreve outras estirpes adequadas. Uma outra estirpe preferida de E. coli é a RFJ26.

As neurotrofinas são tóxicas para as células bacterianas que as expressam. Por consequência, e de forma a maximizar o rendimento, prefere-se induzir a expressão de neurotrofinas só em culturas bacterianas densas, por exemplo, culturas na última fase log. Utilizou-se um sistema induzível à base do promotor lambda PL e do repressor sensível à temperatura cI857. Induziu-se tipicamente a produção de neurotrofinas por alteração da temperatura de crescimento para 42°C durante 30 minutos e continuação da incubação durante 3-20 horas a 380-42°C. A indução da expressão durante mais do que 16 horas em células que crescem activamente causa eventualmente a morte das células. A incapacidade da E. coli para acumular neurotrofinas pode resultar de uma ou mais propriedades do gene ou proteína da neurotrofina. A estrutura do ARNm da neurotrofina, particularmente a estrutura próxima do ponto de início da tradução, pode impedir uma tradução eficaz. Alternativamente, a neurotrofina pode impedir a sua própria síntese por interacção directa com o seu ARNm, ou pode interagir directamente ou indirectamente com algum componente do mecanismo de replicação de ADN/transcrição/tradução de E. coli.

De acordo com uma outra concretização do presente invento, introduziu-se a neurotrofina para dentro do espaço periplásmico de E. coli em vez de a expressar intracelularmente. Isto realizou-se por fusão de uma sequência de sinal a uma neurotrofina madura. Um gene de sequência de sinal fundido na extremidade 5' do gene da neurotrofina pode proporcionar uma sequência de nu-cleótidos próxima do ponto de início de tradução que mais contribui para uma tradução eficaz, resultando assim em elevados níveis de acumulação de neurotrofina. Adicionalmente, o sequestro da neurotrofina no espaço periplásmico impede-a de interferir com um qualquer componente citosólico necessário para a 74 061 6526-081-118 -17-

síntese de proteínas. Ele protege-a também do ataque por proteases citosólicas. É também possível que a secreção de uma neurotrofina madura no espaço perlplásmico possa proporcionar um meio que mais contribui para o adequado dobramento da proteína.

Uma sequência de sinal é proporcinada pela construção de uma molécula de ADN recombinante na qual a sequência de ADN que codifica a neurotrofina compreende, de 5' para 3', um gene fundido que codifica uma sequência de sinal ou de comando adequada à célula hospedeira que está em-estrutura com uma sequência de ADN para a neurotrofina. A literatura descreve várias sequências de sinal úteis em tais construções. Por exemplo, a LamB, OmpA e PhoA são úteis em E. coli. (Denèfle et al.. 1985, Gene 85;499-510; Wong et_al., 1988, Gene 68:193-203). Prefere-se a LamB e, em particular, as sequências de sinal LamB modificadas que aumentam a eficácia na tradução do ARNm de LamB. Construiram-se genes para as sequências de sinal LamB modificadas da seguinte forma. Prepararam-se substituições degeneradas no terceiro nucleótido de vários codões de LamB, substituindo-se G ou C por A ou T. Estas substituições não alteram a sequência de aminoácidos do péptido de sinal LamB, mas diminuem o número potencial de ligações hidrogénio em qualquer estrutura secundária. Isto reduz a estabilidade das possíveis estruturas secundárias que envolvem esta região do ARNm de LamB. Introduziram-se também alterações nos codões com base nos modelos de utilização de codões, para se aproximar mais os codões mais frequentemente utilizados por E. coli.

Modificou-se também a sequência de sinal LamB para se aumentar a eficácia de processamento da proteína precursora LamB em proteína madura. A LamB nativa possui um núcleo hidrofóbico de 10 resíduos de aminoácidos. A análise mutacional de várias sequências de sinal de E. coli sugere que o comprimento da região de núcleo hidrofóbica pode ter um forte efeito na actividade da sequência de sinal. Verificou-se que o aumento do comprimento da região hidrofóbica pela adição de até dez resíduos de aminoácidos hidrofóbicos aumenta a eficácia de processamento dos polipéptidos precursores de fusão LamB. é preferível menos do que seis e é ainda mais preferível, quatro. Λ escolha dos amlnoácidos hidrofóbicos adicionados não é crítica, nem é crítica a localização precisa à qual eles são adicionados à região de núcleo hidrofóbico. Contudo, prefere-se adicionar o tetrapéptido Leu-Ala-Val-Leu ("LAVL·") (SEQ ID Na6) num sítio de restrição adequado próximo da extremidade do terminal N da região hidrofóbica. Descrevem-se, no Exemplo 7, genes particulares para as sequências de sinal LamB modificadas.

De acordo com o invento, as neurotrofinas recombinantes são libertadas da cultura de células hospedeiras por recolha das células, lise, centrifugação do lisado e recolha da pelota de lisado. Recolhem-se tipicamente as células por centrifugação. Para se inibir a degradação da neurotrofina após recolha das células, ressuspendem-se estas preferivelmente em EDTA 50 mM. Em seguida utilizam-se as células directamente ou congelam-se para posterior utilização. A arte está familiarizada com muitas técnicas de lise de células incluindo a enzimática (por exemplo, lisozima), a química (por exemplo, alcáli, SDS) e a mecânica (por exemplo, Prensa French, corte hidrodinâmico). Preferem-se os meios mecânicos porque há menos risco lesão das neurotrofinas. Prefere-se lisar as células por passagem destas através de uma prensa French ou de um esmagador de células STANSTED® a 68 948 kPa. Obtem-se a pelota de lisado por centrifugação, a cerca de 15 000 x g.

Este invento proporciona ainda processos de recuperação de neurotrofinas recombinantes produzidas em culturas de células. Estes processos ultrapassam os problemas associados aos processos convencionais de recuperação de proteínas recombinantes que foram aplicados a neurotrofinas.

As neurotrofinas nativas são solúveis em tampões neutros. Contudo, as neurotrofinas recombinantes de E. coli comportam-se como proteínas insolúveis. As neurotrofinas recombinantes foram detectadas na fracção citosólica e, quando exportadas, têm sido recuperadas a partir do espaço periplásmico utilizando-se técnicas padrão tal como choque osmótico, esferoplastia ou

vi?. 74 061 6526-081-118 -19- congelação-descongelação (Bochner et al.. patente U.S. 4 680 262). Contudo, elas só são isoláveis como uma pequena fracção das neurotrofinas totais na célula.

Muitas das proteínas de mamíferos expressas em bactérias são insolúveis. Quando produzidas num meio iónico estranho, elas não se dobram correctamente e expõem regiões hidrofóbicas normalmente escondidas. Consequentemente, as proteínas formam agregados e precipitam como corpos de inclusão. A literatura sugere que os resíduos cisteína destas proteínas sejam, pelo menos, parcialmente reduzidos ou desemparelhados (Tsuji et al. . 1987, Biochemistry 26:3129-3134).

I A literatura descreve técnicas padrão para purificar proteínas recombinantes de corpos de inclusão (ver, por exemplo, Builder et al.. patente U.S. 4 620 948; Hershenson et al.. patente U.S. 4 961 969; e Hung et al.. patente U.S. 4 734 362). Estas técnicas envolvem a dissolução da proteína numa solução compreendendo um desnaturante forte e um agente redutor. Após permuta do desnaturante forte por um desnaturante fraco, as proteínas são renaturadas numa solução neutra e oxidadas para formar as ligações dissulfureto correctas. A maioria das neurotrofinas recombinantes produzidas por estes processos são biologicamente inactivas. Pensa-se que isto w se deve, em parte, à complexidade da estrutura terciária das neurotrofinas. Após desnaturação da proteína e redução dos grupos sulfidrilo, o polipéptido não se torna a dobrar na configuração adequada para a ligação dissulfureto correcta. Além disso, estes resultados sugerem que estão presentes nos agregados neurotrofinas recombinantes que não são corpos de inclusão típicos.

Encontrou-se um processo para recuperar neurotrofinas recombinantes biologicamente activas a partir da fracção insolúvel de células hospedeiras. 0 processo envolve, essencialmente, a solubilização da neurotrofina num agente de desnaturação forte enquanto se mantém o correcto estado de 74 061 6526-081-118 -Ttar- of·. -20- oxidação da proteína evitando-se a utilização de agentes redutores. A redução das ligações dissulfureto durante a purificação destrói a actividade de polipéptidos de neurotrofina purificados. Este é um resultado inesperado porque a literatura (por exemplo, Tsuji et al.. 1987, Biochemistrv 26:3129-3134) ensina que as proteínas recombinantes insolúveis nos corpos de inclusão devem possuir ligações dissulfureto incorrectamente formadas ou reduzidas.

Para as neurotrofinas serem ainda recuperadas, o agente de desnaturação forte é substituído por um fraco, contudo, verificou-se também que a adição de um aminoácido básico, tal como histidina, ou um seu equivalente, ajuda a manter a neurotrofina solúvel durante o processo de renaturação que acompanha a remoção do desnaturante fraco (Prior et al.. 1990, WO 90/06764).

Estas verificações sugerem um novo modelo para o comportamento das neurotrofinas recombinantes. Pensa-se que a maioria dos polipéptidos de neurotrofina recombinante produzidos pela célula hospedeira se dobram adequadamente e formam as ligações dissulfureto correctas. Além disso, uma vez que as neurotrofinas possuem um pH elevado e estão positivamente carregadas a pH neutro, pensa-se que elas formam associações com moléculas negativamente carregadas na célula, por exemplo o ADN, ARN e outras proteínas. Consequentemente, elas tornam-se insolúveis a pH neutro. Os aminoácidos básicos ajudam a sua dissociação.

Mais especificamente, o presente processo de recuperação de neurotrofinas recombinantes produzidas por uma cultura de células hospedeiras compreende o passo de desnaturação da neurotrofina por dissolução desta numa solução compreendendo um agente de desnaturação forte, solução que é também essencialmente isenta de agentes redutores. 0 termo "agentes de desnaturação" como aqui utilizado refere-se a compostos que, em solução aquosa, desdobram reversivelmente proteínas dissolvidas eliminando, pelo menos parcialmente, a estrutura terciária e secundária através do rompimento de ligações hidrogénio ou da 74 061 6526-081-118 21

alteração do meio termodinâmico da proteína. As soluções de desnaturação forte incluem sais de guanidínio (por exemplo, cloridrato de guanidínio) e tiocianatos de metais alcalinos (por exemplo, tiocianato de sódio) a concentrações de 4 M - 9 M e ureia a 7 M - 9 M. As soluções de desnaturação preferidas são de guanidínio HC1 7 M - 9 M. As condições preferidas são pH 7,0 -pH 9,0 e temperatura ambiente. Prefere-se mais o guanidínio HC1 8 M, pH 8,0.

Deve-se manter também o estado de oxidação correcto dos átomos de enxofre nos resíduos cisteína durante este passo ou arriscamo-nos a perder a capacidade de recuperar qualquer neuro-trofina biologicamente activa. Por consequência, a solução deve estar essencialmente isenta de agentes redutores. Uma solução essencialmente isenta de agentes redutores é aquela na qual se mantêm as ligações dissulfureto da proteína. Até mesmo a adição de pequenas quantidades de agentes redutores de dissulfureto, tais como j8-mercaptoetanol ou ditiotreitol, durante a prática deste invento vai destruir a actividade da neurotrofina purificada.

As neurotrofinas recombinantes são aparentemente submetidas a degradação por metaloproteinases. Por consequência, recuperam-se, preferivelmente, as neurotrofinas em soluções que compreendem inibidores da metaloproteinase. Prefere-se os que-lantes de metais pesados, tal como EDTA. A concentração de EDTA pode atingir no mínimo, pelo menos, 1 mM e no máximo cerca de 200 mM. Preferem-se as concentrações de 5 mM - 80 mM e prefere-se mais a de 50 mM. Depois dos iões metálicos pesados, quelados, terem sido dialisados da solução, o EDTA pode ser reduzido ou eliminado. Langley et al.. 1990, EP 0 398 753, descreve péptidos úteis como inibidores da metaloproteinase. 0 processo de recuperação pode compreender também um ou mais dos passos seguintes. Após solubilização da neurotrofina, permuta-se o agente de desnaturação forte, na solução, por um agente de desnaturação fraco. As soluções de desnaturação fracas incluem ureia a 4 M - 9 M e, preferivelmente, 6M-8M, pH 7,0

74 061 6526-081-118 - ρΗ 9,0, à temperatura ambiente. A solução de desnaturação fraca mais preferível é a de ureia 7 M, Tris-HCl 50 mM, NaCl 10 mM, EDTA 5 mM, pH 8,0. A diálise é o processo preferido de permuta. Se o agente de desnaturação forte for a ureia 7,0 M -9,0 Μ, o agente de desnaturação fraco deste passo é, preferivelmente, ureia de menor concentração.

Remove-se o agente de desnaturação fraco da solução, de forma a renaturar a neurotrofina. A diálise ou a diafiltração contra uma solução não desnaturante é o processo preferido de remoção. Prefere-se o NaCl 0 M a 1 M como solução não desnaturante .

Um outro passo no processo de recuperação é a purificação da neurotrofina recombinante de outros contaminantes, na solução. Pode-se utilizar qualquer uma das técnicas de isolamento de proteínas, típicas, conhecidas na arte. Prefere-se um isolamento de três passos que envolve a permuta catiónica em S-SEPHAROSE^, a permuta aniónica em DEAE-SEPHAROSE^ e a cromatografia líquida de alta pressão de fase inversa (HPLC). 0 passo de isolamento pode começar numa qualquer fase após a solubilização da neurotrofina e pode continuar ao longo dos passos de permuta de agente de desnaturação e de remoção. Começa-se, preferivelmente, a purificação na fase de ureia, porque este agente não interfere com a cromatografia de permuta iónica e porque a purificação parcial torna mais fácil a dissolução da neurotrofina na solução não desnaturante.

Verificou-se que, a não ser que a neurotrofina esteja relativamente purificada, ela vai precipitar da solução quando se remover o agente de desnaturação fraco. A solubilidade depende do grau de pureza da neurotrofina assim como do carácter dos outros contaminantes na solução. Por exemplo, as moléculas negativamente carregadas tal como o ADN vão interferir com a solubilidade até mesmo de neurotrofinas muito puras. Por consequência, mantém-se a solubilidade da neurotrofina na solução não desnaturante por ajuste da solução de modo a compreender um aminoácido básico ou um equivalente, tal como 74 061 6526-081-118

-23- ο ácido indol-acético. A concentração desta espécie deve ser eficaz para manter a neurotrofina em solução. As soluções de aminoácidos básicos incluem histidina, lisina e arginina ou seus sais a concentrações acima de 10 mM. A histidina é útil em concentrações de 20 mM - 500 raM. Prefere-se mais a histidina em concentrações de 20 mM- loOmM. Se a neurotrofina na solução de desnaturação tiver sido suficientemente purificada antes da remoção do desnaturante, pode-se eliminar este passo.

Os resultados indicam que o presente processo produz moléculas de neurotrofina, uniformes, possuindo compativelmente o mesmo aminoácido N-terminal. Em contraste, verificou-se que a expressão de neurotrofinas no sistema de célula CHO de mamífero produz uma mistura de moléculas de neurotrofina com vários aminoácidos N-terminais. Por consequência, as neurotrofinas recombinantes produzidas pelo presente processo parecem ser únicas.

Os processos deste invento são também úteis na recuperação de outras proteínas que possuem propriedades bioquímicas similares às neurotrofinas. Isto é, os processos são úteis na recuperação de proteínas que se dobram correctamente em bactérias e que formam as ligações dissulfureto adequadas, mas, uma vez desnaturadas e reduzidas em técnicas de recuperação convencionais, são muito difíceis de renaturar com ligações dissulfureto adequadas. Isto inclui proteínas com um pH superior a cerca de 9,0 e que possuem, pelo menos, duas ligações dissulfureto. (As moléculas candidatas incluem o inibidor da protease de leucócitos secretores (Miller et al.. 1989, J. Bacterioloqy 171:2166-2172) e a CD4 recombinante de comprimento total (Fisher et al.. 1989 WO 89101940)).

Como aqui descrito numa secção de exemplo infra. o presente invento descreve a expressão da neurotrofina-4 humana biologicamente activa. A sequência de ADN da NT-4 humana foi sub-clonada no vector plasmídeo de ADN pRG91, resultando em pRGl73. Este plasmídeo contendo hNT-4 foi transformado na estirpe RFJ26 de E. coli. e os processos descritos na presente 74 061 6526-081-118

-24-

4 especificação foram utilizados para recuperar

biologicamente activa, a partir do sistema de cultura. Contudo, os requerentes não devem estar limitados a uma tal concretização específica. Por exemplo, qualquer sequência de ácido nucleico substancialmente homóloga à região de HG7-2 que codifica NT-4 humana pode ser utilizada para construir um qualquer número de vectores de expressão em plasmídeo de ADN como descrito na especificação ou conhecido do perito na arte, que por outro lado podem ser utilizados para transformar um qualquer número de estirpes bacterianas de E. coli de forma a produzir quantidades úteis de NT-4 biologicamente activa.

Os exemplos seguintes são apresentados de modo a que este invento possa ser melhor compreendido. Estes exemplos têm sómente o fim de ilustração e não são construídos para limitar, de qualquer forma, o âmbito do invento.

r. 74 061 6526-081-118 -25-nesta posição não é conservada em moléculas de NGF de outras espécies (Ibanez et al. f 1990, EMBO J. 9:1477-1483). Adicionalmente, o PAN-20 foi concebido para diminuir o teor em G+C desta região do gene NGF de maneira a não afectar a sequência da proteína resultante. O fragmento de ADN amplificado foi digerido com as endonucleases de restrição Sall e Eaql e ligado entre os sítios Sall e EagI de pRPN50 (Regeneron Pharmaceuticals, Inc. ) resultando no plasmídeo pRPN102. 0 pRPN50 deriva do plasmídeo de expressão pNKS97 (Panayotatos, 1987, Engineering an Efficient Expression System, em: Plasmids-A Praticai Approach, ed. Herdy, K., IRL Press, Oxford/Washington, D.C.) pela inserção do promotor lambda PL no sítio de inserção do promotor. O gene repressor lambda P^ cI857 foi incorporado em pRPN102 para facilitar a repressão a 30°C e para permitir a desrepressão por choque térmico a 42 "C. Esta sequência de ADN foi amplificada por PCR utilizando-se os iniciadores EVD-26 (57-CCATTATCGC GACCAGAGGT-37) (SEQ ID NB9) e EVD-27 (57-TCTTGCTCGC GAGTTATCAG CTATGCG-37) (SEQ ID Na10) que geram um sítio de restrição NruI em cada extremidade. Este fragmento de 821 pb estende-se 70 pb a montante da sequência de codificação de cI857 numa região que contém o promotor constitutivo PRM assim como 38 pb para além do codão de terminação de cI857. 0 fragmento cI857 amplificado por PCR foi digerido com NruI e ligado no sítio NruI de pRPN102. Os candidatos a esta ligação foram analisados para se encontrar um plasmídeo com a inserção cl857 que possui a mesma direcção de transcrição que o gene hNGF, resultando no plasmídeo pRPN133 (Fig. 1). 0 plasmídeo pRPN133 foi depositado na ATCC e foi-lhe atribuído o Na de acesso 75029.

Transformou-se a estirpe mutante htpR^s Rts lon“ de E. coli. LC137, com RPN133 para dar pRPN133/LC137.

Num balão de 2 litros, inocularam-se 400 ml de meio LB suplementado com 100 mg/1 de ampicilina com pRPNl33/LCl37 e incubou-se a 28°C com agitação. Na última fase de crescimento

74 061 6526-081-118 -26-logarítmico (DO590 = 1,0 - 2,0 sob estas condições), indn^iu-se ' a síntese de hNGF por adição à cultura durante a noite de 400 ml de meio Lb pré-aquecido a 55eC e continuou-se a incubação com agitação a 42°C durante 5 horas.

As células foram recolhidas por centrifugação e as pelotas de células armazenadas a -20°C. As pelotas de células (1,0 - 2,5 g) foram descongeladas, ressuspensas em 20,0 ml de tampão A (Tris-HCl 100 mM, EDTA 50 mM, pH 8,0), passadas através de um esmagador de células STANSTED® a 68 948 KPa e centrifugadas a 23 000 x g durante 15 minutos a 4°C. A pelota foi lavada duas vezes com 10,0 ml de guanidínio-HCl 2 M, EDTA 5 mM, pH 8,0.

Ressuspendeu-se a pelota em 40 ml de guanidínio-HCl 8 M, EDTA 5 mM, pH 8,0, utilizando-se um homogeneizador Potter, para se solubilizar o hNGF recombinante. Depois centrifugou-se a suspensão a 23 000 xg durante 15 minutos. 0 sobrenadante foi dialisado contra 2 litros de tampão B (ureia 7 M, histidina 100 mM, EDTA 0,1 mM, pH 6,0), com duas mudanças de tampão, a 25°C durante 20 horas. 0 dialisado foi centrifugado a 23 000 xg durante 15 minutos a 4°C. 0 sobrenadante foi aplicado numa coluna de S-SEPHAROSE® (2,5 cm x 6,0 cm d x h) equilibrada em tampão B e lavado até à absorvância de linha de base a 280 nm com o mesmo tampão. As proteínas foram eluídas com um gradiente de 300 ml de NaCl 0,0 M - 1,0 M em tampão B. Reuniram-se as fracções contendo hNGF.

As fracções reunidas foram dialisadas contra um excesso de volume de 100 vezes de tampão C (ureia 7 M, Tris-HCl 50 mM, EDTA 0,1 mM, pH 8,5) a 25°C durante 20 horas.

0 dialisado foi aplicado a uma coluna de DEAE-SEPHAROSE (2,5 x 7,5 cm d x h) equilibrada em tampão C a um caudal de 2,0 ml por minuto. As fracções passadas pela coluna contendo o hNGF foram reunidas e dialisadas duas vezes contra 40 volumes de histidina 100 mM, EDTA 0,1 mM, pH 6,0 a 4°C, durante a noite. O 74 061 6526-081-118 -27-

& & dialisado foi centrifugado a 23 000 x g durante 15 minutos a 4°C. 0 dialisado foi então aplicado a uma coluna (de permuta catiónica fraca) TOYOPEARL CM 6505® (1,0 x 5,0 cm) equilibrada com histidina 100 mM, EDTA 0,1 mM, pH 6,0 e eluído com um gradiente de NaCl de 0,0 M para 1,0 M. As fracções contendo o hNGF foram reunidas e filtradas através de um filtro MILLIPORE GV® e armazenadas a 4°C. A sequência do terminal amino da proteína purificada foi confirmada por sequenciação directa. A actividade biológica da proteína purificada foi testada quanto ao desenvolvimento de neurite em gânglios da raiz dorsal explantados E8 e dissociados (Fig. 2A e 2B) (Lindsay et al.. 1985, Dev. Biol. 112:319-328). Seguindo estes critérios, o hNGF recombinante purificado a partir de E. coli mostrou ser, por este processo, tão activo como o NGF purificado a partir da glândula salivar de ratinho.

7. EXEMPLO: PRODUÇÃO E RECUPERAÇÃO DE hBDNF RECOMBINANTE E DE hBDNFmvc DE E. COLI

7.1. SEQUÊNCIAS DE SINAL À BASE DE LAMB

Construiram-se sequências de sinal à base de LamB para facilitar quer a síntese quer a secreção de neurotrofinas em E. coli. A sequência de sinal LamB (Fig. 3A, SEQ ID Nal) é uma sequência de sinal de E. coli que ocorre naturalmente, que foi seleccionada para a construção de uma série de vectores de secreção à base da série pRPN de vectores de expressão desenvolvidos na Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Os vectores de secreção foram construídos por clonagem de fragmentos sintéticos de ADN que codificam a sequência de sinal LamB em pRPN09 ou pRPN16. Estes plasmídeos derivam do vector de expressão pNKS97 (Panayotatos, 1987, Engineering an Efficient Expression System, em: Plasmids-A Practical Approach, ed. Herdy, K., IRL Press, Oxford/Washington, D.C.) no qual foi inserido um promotor lacUV5. A LamB foi inserida no sítio de inserção do gene estrutural de forma a que a expressão da LamB esteja sob controlo do promotor lacUV5 ou T7 §1.1. Λ

74 061 6526-081-118 28- 0 fragmento de ADN sintético, LamBl (Fig. 3B, SEQ ID NB2), codifica 25 aminoácidos idênticos à sequência de sinal LamB de tipo selvagem. Contudo, alterou-se a sequência de nucleótidos relativamente à sequência de nucleótidos de tipo selvagem com a finalidade de se construírem sítios de enzima de restrição únicos e para a maximização da eficácia na tradução. LamBl possui também sete substituições de nucleótidos degeneradas, substituindo-se C ou G por A ou T. Isto reduz a estabilidade da estrutura secundária possível do ARNm. LamBl possui também vários sítios de restrição novos.

Criou-se também LamB2 (Fig. 3C, SEQ ID Na3) como modificação de LamBl. Para se preparar LamB2 realizaram-se alterações nos nucleótidos da extremidade 3' de LamBl, por amplificação por PCR. Estas alterações introduziram um sítio de restrição Eaql que facilita a clonagem de fragmentos de ADN de extremidade romba. A fusão do hBDNF maduro a LamBl resulta na síntese eficaz da proteína de fusão, em E. coli. A autenticidade do produto sintetizado foi confirmada por síntese selectiva num sistema de síntese de proteína isenta de células de transcrição-tradução acoplada dependente de ADN, pela síntese selectiva do produto utilizando-se um sistema de expressão de RNA-polimerase T7 em E. coli. e pela síntese do produto com um marcador mvc no terminal C que permite a identificação dos quimera com um anticorpo monoclonal específico de myc. Qualquer uma destas proteínas de fusão sintetizadas em E. coli foi processada até hBDNF maduro como evidenciado pela sua mobilidade em SDS-PAGE. O nível de expressão obtido com LamBl ou LamB2 resulta numa acumulação de hBDNF de cerca de 1% até 10% da proteína celular total.

Modificou-se LamBl para aumentar a eficácia de processamento. Inseriram-se quatro aminoácidos (Leu-Ala-Val-Leu ou LAVL) no sítio Nhel de LamBl para dar LamB3 (Fig. 3D, SEQ ID Na4). Realizou-se a mesma inserção em LamB2 para se obter LamB4 (Fig. 3E, SEQ ID Ns5). Esta inserção resulta na extensão da região de núcleo hidrofóbica de LamBl e LamB2 de 10 para 14

74 061 6526-081-118 -29- aminoácidos. Ela resulta num aumento de 5 vezes na velocidade de processamento da proteína de fusão hBDNF em hBDNF maduro (Fig. 4).

As moléculas LamB3- e LamB4-hBDNF que são exportadas para o periplasma são processadas em hBDNF maduro mais rapidamente do que as fusões de LamB de tipo selvagem. Contudo, são exportadas menos moléculas, logo a quantidade líquida de hBDNF maduro, neste caso, não é aumentada. Em qualquer caso a eficácia de translocação aumentada de LamB3 e LamB4 devia resultar em rendimentos aumentados de outras proteínas. O fragmento de sequência de sinal LamBl foi construído como dois oligonucleótidos sintéticos complementares (LamB80, 5'-ATGATCACAC TGCGTAAGCT TCCGCCTAGCT GTAGCAGTAG CAGCAGGTGT AATGTCTGCA CAGGCCATGG CCCGGGATCC-3' (SEQ ID NB11) e LamB88, 5'-CTAGGGATCC CGGGCCATGG CCTGTGCAGA CATTACACCT GCTGCTACTG CTACAGCTAG CGGAAGCTTA CGCAGTGTGA TCATCATG-3' (SEQ ID Nc12)), concebidos para produzir, após desnaturação/renaturação extremidades salientes correspondentes às dos sítios de restrição Spel e Sphl. Este fragmento de ADN foi ligado nos sítios de restrição Sphl e Spel de pRPN16 (Regeneron Pharmaceuticals, Inc.) resultando no plasmídeo pRPN52.

Este plasmídeo foi subsequentemente modificado, com a finalidade de se criarem sítios de restrição adicionais, pela inserção de um fragmento de ADN sintético, consistindo o produto desnaturado/renaturado nos oligonucleótidos LamB2A (5'-CATGGCCAGT CGGCCGAG-3' (SEQ ID N813)) e LamB2B (5'-GATCCTCGGC cgactggc-3' (SEQ ID N814)) complementares, entre os sítios de restrição Ncol e BamHI únicos na sequência de sinal LamBl em pRPN52. 0 plasmídeo resultante, pRPN88, contém a sequência de sinal LamB2 com sítios de restrição únicos na sequência de reconhecimento da peptidase de sinal para facilitar a fusão da sequência de sinal a uma outra sequência de ADN qualquer. A sequência de sinal LamB2 em pRPN88 está sob controlo de transcrição do promotor lacUV5 ou do promotor T7 Φ1.1 e controlo de tradução do sítio de ligação ao ribossoma T7 Φ1.1. 74 061 / Λ- k; ' 6526-081-118 μ·. -30- ,

7.2. PRODUÇÃO Ε RECUPERAÇÃO DE hBDNFmvc RECOMBINANTE O BDNFmyc humano é uma proteína que compreende, do terminal N para o terminal C, hBDNF maduro fundido num marcador antigénico. O marcador é um péptido que possui a sequência de aminoácidos EQKLISEEDL (SEQ id NB15). Estes dez resíduos de aminoácidos derivam do proto-oncogene c-myc humano. Os anticorpos que reconhecem este marcador são úteis na identificação de hBDNFmyc numa amostra (Evan et al., Mol. Cell. Biol. 5;3610-3616; ver também, S. Squinto et al.. "Assay Systems for Detecting Neurotrophic Activity", pedido de patente U.S. 07/5321,283, aqui incorporados por referência). A sequência de ADN de hBDNFmyc foi amplificada por PCR a partir de pCDM8-hBDNFmyc (Regeneron Pharmaceuticals, Inc.) utilizando-se os iniciadores de oligonucleótido N8-hBDNF (5'-CCCACTCTGA CCCTGCCCGC CGAGGG-3* (SEQ ID Na16)) e C2-hBDNFmyc (5'-GCTATGCGGC CGCTACAGAT CCTCCTC-3' (SEQ ID Na17)), para se construir uma proteína de fusão compreendendo a sequência de sinal LamB2 e a proteína hBDNFmyc. O fragmento de ADN amplificado foi digerido com Eaql e clonado nos sítios Bali e EacrI da sequência LamB2 em pRPN88, resultando no plasmídeo pRPN98.

Pode-se também produzir uma sequência de ADN que codifica hBDNFmyc por fusão de uma sequência de ADN que codifica hBDNF maduro a uma outra que codifica o marcador myc de dez aminoácidos. As sequências de ADN que codificam hBDNF maduro são isoladas por amplificação por PCR como descrito. (Hyman et al., 1991 WO 091/01568). Pode-se sintetizar quimicamente uma sequência de ADN de cadeia dupla que codifica o marcador peptídico myc de dez aminoácidos. Para o objectivo deste Exemplo, a sequência de ADN de hBDNFmyc híbrida é então fornecida com os sítios de restrição Bali e Eaql nas extremidades 5' e 3', respectivamente.

Deve-se observar que há dois sítios Bali em pRPN88 mas o sítio nas sequências derivadas de pBR322 é aproximadamente 50 vezes menos sensível a clivagem por Bali do que o sítio na -31- 74 061 6526-081-118 sequência de sinal de LamB2 devido à desmetilação de dcm (New England Biolabs). Em pRPN98 a sequência de sinal de LamB2 é fundida à parte madura da proteína hBDNFmyc de forma a que a clivagem na sequência de reconhecimento da peptidase de sinal deva dar a proteína hBDNFmyc que parte do resíduo histidina em +1 relativamente ao sítio de processamento da pró-proteína (Lei-brock, 1989, Nature 341:149-152).

As sequências de ADN entre os sítios NruI e PvuII únicos em pRPN98 foram deleccionadas para remover sequências que controlam o número de cópias do plasmídeo (Twigg e Sherratt, 1980, Nature 283:216-218). 0 plasmídeo resultante, pRPN121 (Fig. 5), possui um número de cópias cerca de 3 vezes maior do que o plasmídeo ascendente. 0 plasmídeo pRPN12l foi depositado no ATCC e foi-lhe atribuído o NB de Acesso 75028.

Transformou-se W3110 I^F" de E. coli com o pRPN121 para produzir W3110 lSF~/PRPN121.

Num balão de 2 1, inocularam-se 500 ml de meio LB com W3110 I<3F_/pRPN121 e deixou-se crescer até à última fase log, com agitação a 37 °C (DO590 de aproximadamente 1,0), após o que se adicionou lactose a uma concentração final de 1% (p/v) e a cultura foi arejada durante a noite a 37°C. As células foram recolhidas por centrifugação, lavadas uma vez em Tris-HCl 0,2 M, pH 8,0 e a pelota de células congelada a -70°C. A pelota de células (aproximadamente 5 g) foi descongelada e ressuspensa em 20 ml de Tris-HCl 0,2 M, pH 8,0, CaCl2 1 mM e 25 unidades de nuclease de micrococos (Boehringer Mannheim). A suspensão de células foi passada através de uma célula de pressão French a 55 158 kPa e depois centrifugada a 15 000 rpm durante 15 minutos, num rotor SA600 a 4°C. A pelota foi ressuspensa em 30 ml de Tris-HCl 0,2 M, pH 8,0, EDTA 10 mM, Triton X-100 a 2% e suavemente agitado à temperatura ambiente durante uma hora e depois centrifugada a 15 000 rpm durante 15 minutos num rotor SA600R, a 4°C. A pelota foi lavada duas vezes em 20 ml de guanidínio-HCl 2 Μ. A pelota foi ressuspensa em 10

74 061 6526-081-118 -32-ml de guanidínio-HCl 8 M, Tris-HCl 10 mM, pH 8,5, NaCl 10 mM, EDTA 1 mM utilizando-se um homogeneizador Potter. O extracto foi elevado até 20 ml com o mesmo tampão.

0 extracto foi dialisado durante a noite à temperatura ambiente contra 100 X volume de ureia 7 M, Tris-HCl 50 mM, pH 8.5, NaCl 10 mM, EDTA 1 mM.

0 dialisado foi aplicado num disco DEAE ZETA-PREP^(Cuno, Inc., Meriden, CT) equilibrado em ureia 7 M, Tris-HCl 50 mM, pH 8.5, EDTA 1 mM, a um caudal de 3 ml/minuto e lavado até atingir a linha de base com o mesmo tampão.

As fracções que passaram pelo disco foram elevadas até histidina 50 mM, pH 5,0, e depois dialisadas durante a noite a 4°C contra 100 X volume de ureia 7 M, histidina 50 mM, pH 5,0, EDTA 1 mM. O dialisado foi aplicado numa coluna de 1,6 cm x 6,5 cm de S-SEPHAROSE^ equilibrada com ureia 7 M, histidina 50 mM, pH 5,0, EDTA 1 mM, a um caudal de 1 ml/minuto, e lavado até atingir a linha de base com o mesmo tampão. As proteínas foram eluídas com um gradiente de NaCl de 0,0 M - 1,0 M em 200 ml. Recolheram-se as fracções contendo hBDNFmyc (Fig. 6).

As fracções contendo hBDNFmyc foram dialisadas contra 200 X volume de histidina 50 mM, pH 5,0, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM. 0 dialisado foi aplicado numa coluna de 1,6 cm x 1,5 cm de S-SEPHAROS^ equilibrada com histidina 50 mM, pH 5,0, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, a um caudal de 1 ml/minuto e lavado até atingir a linha de base com o mesmo tampão. As proteínas foram eluídas com um gradiente de NaCl de 0,0 M - 1,0 M em 200 ml. As fracções contendo hBDNFmyc foram recolhidas e reunidas. O hBDNFmyc desta amostra (aproximadamente 85% puro) foi directamente aplicado numa coliana de fase inversa C4 de 0,45 cm x 5,0 cm (VYDAC®) e eluído com um gradiente de acetonitrilo a 0-67% em ácido trifluoroacético 0,1% em 80 ml, a um caudal de 0,75 ml/minuto. A fracção do pico tinha uma pureza superior a 95% (Fig. 7). 74 061 6526-081-118 -33- ' €*’

Λ-' : £ A análise da sequência de aminoácidos do terminal N confirmou que a proteína purificada é o hBDNFmyc autêntico com um terminal N homogéneo (Leibrock, 1989, Nature 341:149-1521. 0 hBDNFmyc purificado foi biologicamente activo na promoção do desenvolvimento de neurite em explantes de gânglios da raiz dorsal (DRG) e em explantes de gânglios nodais de embriões de galinha E8, assim como na promoção da sobrevivência e de desenvolvimento dendrítico de neurónios dissociados de DRG de galinha E8 (Fig. 8). Esta actividade é comparável à do BDNF humano recombinante purificado a partir de extractos de células de mamíferos em ensaios de explantes de DRG. O material ensaiado corresponde à Fig. 7, faixa 4. 7.3. PRODUÇÃO E RECUPERAÇÃO DE hBDNF RECOMBINANTE 0 processo descrito para a produção e recuperação de hBDNFmyc foi também utilizado para produzir e recuperar hBDNF de comprimento total maduro, recombinante, e deu uma proteína com bioactividade similar (Fig. 9). A construção do plasmídeo pRPNl49 (Fig. 10), que expressa uma proteína de fusão LamBl-hBDNF, é análoga à construção de pRPN121. 0 fragmento de ADN de LamBl sintético, acima descrito, foi clonado nos sítios de restrição Sphl e Spel de pRPN09 (Regeneron Pharmaceuticals, Xnc.) resultando no plasmídeo pRPN31. A sequência de ADN do hBDNF maduro foi amplificada por PCR a partir de pCDM8-hBDNF (Regeneron Pharmaceuticals, Inc.) utilizando-se os iniciadores de oligonucleótido Nl-hBDNF (5'-ACTCTGACCC TGCCCGCCGA GGGGAGCTG-3') (SEQ ID Na18) e C1-hBDNF (5'-GCGCGGATCC CTATCTTCCC CTTTTAATGG TCAATGTAC-3') (SEQ ID Ns19). Este fragmento de ADN foi clonado em sítios Smal e BamHI de pRPN31 resultando no plasmídeo pRPN34. O fragmento Hindi11-BamHI que inclui o gene de fusão LamBl-hBDNF foi subsequentemente clonado nos sítios de restrição HindlII-BamHI de pRPN52 (acima descrito) resultando no plasmídeo pRPN66. A delecção NruI-PvulI das sequências pBR322 que resulta num maior número de cópias (acima descrito) foi realizada em pRPN66 resultando no plasmídeo pRPN149. Neste plasmídeo, a expressão de LamBl-hBDNF está sob controlo do 74 061 6526-081-118 34 y //

lacUVS e do promotor T7 §1.1 e do sítio de ligação ao ribossoma. 0 plasmídeo pRPN149 foi depositado na ATCC e foi-lhe atribuído o Na de Acesso 75027.

Transformou-se i3f“W3110 de E. coli com pRPN149. Produziu-se e recuperou-se o hBDNF recombinante pelo procedimento descrito no Exemplo 7.

8. EXEMPLO: PRODUÇÃO E RECUPERAÇÃO DO hNT-3 RECOMBINANTE 0 NT-3 humano é produzido e recuperado por processos similares aos descritos para hNGF e hBDNF.

Uma sequência de ADN que codifica o hNT-3 de comprimento total maduro é amplificada por PCR a partir de uma biblioteca de ADNc de células de cérebro humano (Hohn et al. . 1991, W0 91/03569, aqui incorporado por referência), utilizam-se os iniciadores de oligonucleótido EVD-45 (5'-CCTATGCAGA GCATAAGAGT CACCGAGGA-3') (SEQ ID Na20) e EVD-7 (57-GTAAGGGCGG CCGAAGTTTA ATAAATAAAG GTC-3') (SEQ ID Na21). Estes iniciadores derivam da sequência de ADN de NT-3 de ratazana (Maisonpierre et al., Science 247:1446-1451). O iniciador de sentido é quase idêntico à sequência de NT-3 humano. 0 iniciador anti-sentido hibrida aproximadamente a uma centena de pares de bases a jusante do codão de terminação do gene humano.

Este fragmento de ADN possui um sítio de restrição EagI no terminal C adequado para a inserção em sítios Bali e Eagl de pRPN88, onde vai substituir a sequência de ADN de hBDNF. O plasmídeo resultante é utilizado para transformar 1^^3110 de E. coli. Depois produz-se o hNT-3 recombinante e recupera-se como no Exemplo 7. Espera-se que o hNT-3 recombinante purificado a partir de E. coli exiba actividade de neurotrofina similar à descrita por Hohn et al.. 1991, (WO 91/03569).

9. EXEMPLO: PRODUÇÃO E RECUPERAÇÃO DA hNT-4 RECOMBINANTE DE

E. COLI 9.1. CONSTRUÇÃO DE PRG173 -35- -35- tá 74 061 6526-081-118 A sequência de ADN que codifica a região madura putativa do gene da NT-4 humana (hNT-4) foi amplificada por PCR a partir do ADN HG7-2 de NT-4, utilizando-se os oligonucleótidos N1-NT4 (5 7-CCGGGGTCTCTGAAACTGCACCAGCGAGTCG-37) [SEQ ID N°23] e C1-NT4 (5 7-GGTGCAGTTTCAGAGACCCCCATACGCCGGCTGCGGTTGGC-37) [SEQ ID Na24] como iniciadores. 0 oligonucleótido C1-NT4 produz um sítio de restrição EagI em 37 relativamente ao gene da NT-4. 0 fragmento produzido por PCR foi digerido com EagI e clonado em pRG91 digerido Mscl-Eagl. 0 plasmídeo resultante, pRG173, consiste na sequência de sinal LamB fundida na região madura de hNT-4 (a glicina no resíduo de aminoácido 81 na sequência traduzida HG7-2) sob controlo de transcrição dos promotores lacUV5 e T7 01.1 e controlo de tradução do sítio de ligação ao ribossoma T7 01.1. Este plasmídeo possui também a delecção ropl que aumenta o número de cópias do plasmídeo. A construção foi confirmada por análise com enzima de restrição do ADN de plasmídeo purificado, análise da sequência de ADN do plasmídeo purificado, síntese in vitro de uma proteína do tamanho aproximado que se espera ser codificada por pRG173 e síntese in vivo de uma proteína do tamanho apropriado que se espera ser codificada por pRG173 e que possui actividade estimulante do desenvolvimento de neurite (ver discussão, supra) e que tem o terminal N apropriado como determinado por sequenciação de aminoácidos (GVSETAPAE [SEQ ID Na25]).

9.2. PURIFICAÇÃO DA NT-4 HUMANA EXPRESSA EM RFJ26/PRG173 DE E. COLI

Deixou-se crescer durante a noite em meio LB, suplementado com 100 mg/1 de ampicilina a 37°C, com arejamento, uma cultura de 5 ml de pRG173 transformado na estirpe RFJ26 de E. coli. A cultura feita durante a noite foi diluída em 500 ml de LB e deixada crescer até uma DO590 =5,3 altura em que a expressão de hNT-4 foi induzida pela adição de lactose a 1% (p/v) e a cultura foi deixada crescer durante a noite com arejamento. As células foram então recolhidas por centrifugação e congeladas a -70°C. A pelota de células (7,2 gramas) foi descongelada e ressuspensa em 73 ml de Tris-HCl 200 mM, pH 8,0, EDTA 50 iM e lisada por 3 passagens sequenciais através do esmagador de células STANSTEE®. 74 061 6526-081-118 36

0 lisado foi então centrifugado a 26 000 x g durante 10 minutos, dando 83 ml de sobrenadante que contém a fracção solúvel. A fracção solúvel foi dialisada contra Tris-HCl 50 mM, pH 8,5 a 4°C durante 5 h e depois diluída 10 vezes com MES 20 mM, pH 6,0, e introduzida numa coluna Fast S-Sepharose equilibrada com MES 20 mM, pH 6,0 e eluída com NaCl 1 M em MES 20 mM, pH 6,0. A proteína NT-4 humana recombinante que estimulou o desenvolvimento de DRG E8 foi recuperada na lavagem com NaCl 1 M. A fracção insolúvel foi ressuspensa e homogeneizada em 83 ml de guanidínio-HCl 8 M, Tris-HCl 50 mM, pH 8,5, NaCl 10 mM, EDTA 1 mM. A fracção insolúvel foi dialisada contra ureia 7 M, Tris-HCl 50 mM, pH 8,5, e introduzida numa coluna Fast DEAE-Sepharose equilibrada em ureia 7 M, Tris-HCl 50 mM, pH 8,5. As fracções separadas foram recolhidas e dialisadas contra ureia 7 M, histidina 100 mM, pH 5,5, EDTA 1 mM e introduzidas numa coluna Fast S-Sepharose equilibrada em ureia 7 M, histidina 100 mM, pH 5,5, EDTA 1 mM, e a hNT-4 eluiu com um gradiente de NaCl 0-1M no mesmo tampão. As fracções contendo hNT-4 foram reunidas e dialisadas contra histidina 100 mM, pH 5,5, EDTA 1 mM. Fraccionou-se aproximadamente 95% da proteína hNT-4 com o material insolúvel.

9.3. PREPARAÇÃO DE CULTURAS ENRIQUECIDAS EM NEURÓNIOS MOTORES

Utilizaram-se nestas experiências embriões (E14) de ratazanas Sprague-Dawley (HSD ou Zivic-Miller). Sacrificaram-se ratazanas grávidas por asfixia com dióxido de carbono e os embriões foram rapidamente removidos e colocados em meio gelado para posterior dissecação. Removeu-se assepticamente a espinal-medula dos embriões de ratazana com 14 dias de gestação. A espi-nal-medula foi cortada desde a cauda até ao bolbo (ao nível do primeiro gânglio da raiz dorsal), liberta de gânglios sensitivos e de meninges aderentes. A medula foi então sub-dividida em segmentos ventrais e medio-dorsais para culturas separadas. Os tecidos da espinal-medula ventral foram cortados em pequenos pedaços e incubados em tripsina a 0,1% (GIBCO) e

74 061 6526-081-118 -37- desoxirribonuclease tipo 1 a 0#0l% (Sigma) em PBS a 37eC durante 20 minutos. A solução de tripsina foi então removida, lavada e substituída por meio que consiste em meio essencial mínimo (MEM) de Eagle a 45%, mistura nutriente de HamF12 a 45% (F12), soro de feto de vitelo inactivado por calor a 5% (GIBCO), soro de cavalo inactivado por calor a 5% (GIBCO), glutamina (2 raM), penicilina G (0,5 u/ml) e estreptomicina (0,5 μg/ml). O tecido foi então mecanicamente dissociado por trituração suave através de uma pipeta Pasteur e os sobrenadantes foram reunidos e filtrados através de uma fibra de nilão (Nitex, Tetko; 40 μιη). A suspensão de células filtrada foi então submetida a uma modificação do procedimento de fraccionamento descrito por Schnaar e Schaffner (1981, J. Neurosci. 1:204-217). Todos os passos foram realizados a 4 °C. Dissolveu-se metrizamida em meio F12:MEM (1:1) e estabeleceu-se um gradiente descontínuo que consistiu numa almofada de metrizamida a 18% (0,5 ml), 3 ml de metrizamida a 17%, 3 ml de metrizamida a 12% e 3 ml de metrizamida a 8%. A suspensão de células da espinal-medula ventral, filtrada, (2,5 ml) obtida como acima descrito foi estratificada em gradiente descontínuo e o tubo foi centrifugado a 2500 g durante 15 minutos utilizando-se um rotor oscilante (Sorvall HB4). A centrifugação resultou em três camadas de células: fracção I (à interface de 0-8%), fracção II (à interface de 8-12%) e fracção III (à interface de 12-17%). As células de cada interface foram removidas num pequeno volume (cerca de 1 ml), lavadas duas vezes com meio definido isento de soro que consiste em F12 a 50% e MEM a 50%, suplementado com glutamina (2 mM), insulina (5 μg/ml), transferrina (100 ^g/ml), progesterona (20 nM), putrescina (100 μΜ) e selenite de sódio (30 nM) (Bottenstein e Sato, 1979, PNAS 7jS:514-517). A contagem de células viáveis foi obtida por contagem em hemocitómetro na presença de tripano azul. As células da espinal-medula ventral, fraccionadas, (enriquecidas em neurónios motores) foram então colocadas a uma densidade de 100 000 células/cm2 em cavidades de 6 mm pré-revestidas com poli-L-ornitina (Sigma: 10 μg/ml) e laminina (GIBCO: 10 μg/ml). 0 tratamento com NT-4 foi administrado no dia da colocação. As culturas foram mantidas em meio definido isento de soro a 37°C em atmosfera de ar a 95%/C02 a 5% a uma humidade relativa

foram (C AT; 74 061 6526-081-118 -38- próxima de 100%. No dia 2 (48 horas), as células recolhidas para medição da colina-acetiltransferase Fonnum, 1975, J. Neurochem. 24:407-409).

9.4. RESULTADOS A fracção solúvel do esquema de purificação de uma cultura de pRG173/RFJ26 induzida durante uma noite foi ensaiada em explantes de DRG E8. A Figura 13 mostra uma estimulação dependente da dose do desenvolvimento de neurite nos explantes de DRG E8. A fracção insolúvel foi ensaiada em explantes de gânglios da raiz dorsal (DRG) E8 e não mostrou qualquer bioactividade. A proteína NT-4 humana recombinante recuperada a partir da lavagem com NaCl 1 M da fracção solúvel foi ensaiada quanto à actividade em culturas de neurónios motores dissociados preparadas como descrito supra na Secção de Exemplo 9.3. e noutros ensaios. A adição de NT-4 humana recombinante a uma diluição de 1:20 resultou num aumento de 3,6 vezes na actividade da colina-acetiltransferase na cultura enriquecida em neurónios motores 48 horas após o tratamento. 0 aumento de 3,6 vezes foi medido relativamente a controlos não tratados (C-NT) e de tampão (C-Tampão) (Figura 14).

9.5. DISCUSSÃO A subclonagem da região de codificação de NT-4 do bacteriófago HG7-2 a jusante dos promotores LAC UV5 e T701.1, do sítio de ligação ao ribossoma T701.1 e da sequência de sinal LamB resultou no plasmídeo pRG173. A transformação de pRG173 na estirpe RFJ26 de E. coli e a indução de culturas em larga escala de pRG173/RFJ26 resultaram na expressão de uma forma biologicamente activa de NT-4 humana recombinante. A capacidade para expressar uma forma biologicamente activa de NT-4 humana num sistema de expressão procariótica in vitro aumenta substancialmente a facilidade, com que a produção de NT-4 humana recombinante, péptidos ou seus derivados, pode ser escalonada quer para aplicação terapêutica quer para aplicação em

74 061 6526-081-118 -39 diagnóstico.

Assim, o presente exemplo demonstra que uma sequência de ADN que codifica uma NT-4 humana é susceptível a transcrição e tradução num sistema procariótico de modo que seja expressa a NT-4 humana, e a forma biologicamente activa é susceptível aos esquemas de purificação de modo que permaneça a actividade subsequentemente à purificação. 10. DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS As moléculas de ADN recombinante pRPN133 (hNGF), pRPN121 (hBDNFmyc) e pRPN149 (hBDNF) foram depositadas em 7 de Junho de 1991, pRG173 (NT-4) em 28 de Outubro de 1991 e o bacteriófago recombinante HG7-2 em 22 de Agosto de 1991 na American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, no âmbito Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microorganismos no âmbito das patentes, e com os números de acesso indicados.

MOLÉCULA DE ADN RECOMBINANTE Na DE ACESSO AO ATCC PRPN133 (hNGF) 75029 pRPNl21 (hBDNFmyc) 75028 pRPN14 9 (hBDNF) 75027 pRG17 3 (hNT-4) 75131 HG7-2 (clone genómico da NT-4 humana) 75070 O presente invento não está limitado no âmbito pelo microorganismos depositados ou pelas concretizações especificas aqui descritas. Na realidade, tornar-se-ão evidentes para os peritos na arte, a partir da descrição anterior e figuras que a acompanham, várias modificações do invento para além das aqui descritas, etende-se que tais modificações estejam incluídas no âmbito das reivindicações apensas.

As várias publicações que foram aqui citadas estão incorporadas por referência na sua globalidade.

Embora se tenha descrito um certo número de concretizações

74 061 6526-081-118 -40- deste invento, é evidente que estas concretizações básicas podem ser alteradas para proporcionar outras concretizações que utilizem os processos e composições deste invento. Por consequência, verificar-se-á que o âmbito deste invento inclui todas as concretizações alternativas e variações que são definidas na descrição anterior e pelas reivindicações apensas a ela; e o invento não está limitado pelas concretizações específicas que foram aqui apresentadas como exemplo.

Claims

74 061 6526-081-118 -41- REIVINDICACÕES 1 - Processo de recuperação de uma neurotrofina recombinante produzida numa cultura de células hospedeiras não animais, caracterizado por compreender o passo de solubilizar a neurotrofina numa solução compreendendo um agente de desnaturação forte, sendo a referida solução essencialmente isenta de agentes redutores.
2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o agente de desnaturação forte ser um sal de guanidínio 4 M - 9 M, um tiocianato de metal alcalino 4 M - 9 M ou ureia 7 M -9 M.
3 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o agente de desnaturação forte ser guanidínio HC1 7 M - 9 M.
4 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por o agente de desnaturação forte ser guanidínio HCl 8 M.
5 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda o passo de permuta do agente de desnaturação forte por um agente de desnaturação fraco.
6 - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por o agente de desnaturação fraco ser ureia 4 M - 9 M.
7 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o agente de desnaturação forte ser guanidínio HCl 7 M - 9 M e o agente de desnaturação fraco ser ureia 6 M - 8 M.
8 - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o agente de desnaturação forte ser guanidínio HCl 8 M e o agente de desnaturação fraco ser ureia 7 M.
9 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a solução compreender ainda um inibidor da metaloproteinase numa quantidade eficaz para inibir a degradação da neurotrofina

74 061 6526-081-118 por proteases.
10 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracteri-zado por a solução compreender ainda um inibidor da metaloproteinase numa quantidade eficaz para inibir a degradação da neurotrofina por proteases.
11 - Processo de acordo com a reivindicação 10, caracteri-zado por a solução compreender ainda EDTA 1 mM - 200 mM.
12 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracteri-zado por a solução compreender ainda EDTA 5 mM - 80 mM.
13 - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracteri-zado por a solução compreender ainda EDTA 50 mM.
14 - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracteri-zado por a solução compreender ainda EDTA 5 mM - 80 mM.
15 - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracteri-zado por a solução compreender ainda EDTA 50 mM.
16 - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracteri-zado por compreender ainda os passos de (1) ajustar a solução de modo a compreender um aminoácido básico ou ácido indol-acético a uma concentração eficaz para manter a solubilidade da neurotrofina num ambiente não desnaturante e (2) remover o agente de desnaturação fraco.
17 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracteri-zado por compreender ainda os passos de (1) ajustar a solução de modo a compreender um aminoácido básico ou ácido indol-acético a uma concentração eficaz para manter a solubilidade da neurotrofina num ambiente não desnaturante e (2) remover o agente de desnaturação fraco.
18 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracteri-zado por compreender ainda os passos de (1) ajustar a solução de 74 061 6526-081-118 -43-

modo a compreender histidina 20 mM - 500 mM e (2) remover o agente de desnaturação fraco.
19 - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracteri-zado por compreender ainda os passos de (1) ajustar a solução de modo a compreender histidina 20 mM - 100 mM e (2) remover o agente de desnaturação fraco.
20 - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracteri-zado por compreender ainda os passos de (l) ajustar a solução de modo a compreender histidina 20 mM - 100 mM e (2) remover o agente de desnaturação fraco.
21 - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracteri-zado por compreender ainda os passos de (1) ajustar a solução de modo a compreender histidina 20 mM - 100 mM e (2) remover o agente de desnaturação fraco.
22 - Processo de acordo com a reivindicação 15, caracteri-zado por compreender ainda os passos de (1) ajustar a solução de modo a compreender histidina 20 mM - 100 mM e (2) remover o agente de desnaturação fraco.
23 - Processo da reivindicação 3, 4, 7, 8, 12, 13, 14, 15, 19, 20, 21 ou 22, caracterizado por recuperar hNGF, hBDNF ou hNT-3 recombinante.
24 - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracterizado por recuperar hNGF recombinante possuindo serina substituída por treonina, como segundo resíduo de aminoácido, hBDNF de comprimento total e hNT-3 de comprimento total.
25 - Processo de produção de uma neurotrofina recombinante caracterizado por compreender o passo de cultivar uma célula hospedeira não animal, transformada com uma molécula de ADN recombinante compreendendo uma sequência de controlo de expressão controlável operativamente ligada a uma sequência de ADN que codifica uma neurotrofina, sendo a referida célula

74 061 6526-081-118 -44- hospedeira mutante de gene regulador por choque térmico.
26 - Processo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado por a célula hospedeira ser uma estirpe mutante de E. coli HtpRts lon~.
27 - Processo de acordo com a reivindicação 26, caracteri-zado por a célula hospedeira ser uma estirpe mutante de E. coli HtoRts lon~.
28 - Processo de acordo com a reivindicação 27, caracteri-zado por a célula hospedeira ser a estirpe LC137 de E. coli.
29 - Processo de acordo com a reivindicação 26, caracteri-zado por a sequência de controlo de expressão compreender um promotor \ PL.
30 - Processo de acordo com a reivindicação 27, caracteri-zado por a sequência de controlo de expressão compreender um promotor "X PL.
31 - Processo de acordo com a reivindicação 30, caracteri-zado por se produzir hNGF.
32 - Processo de acordo com a reivindicação 31, caracteri-zado por se produzir um hNGF em que a treonina substitui a serina, como segundo resíduo de aminoácido.
33 - Processo de acordo com a reivindicação 25, caracteri-zado por compreender o passo de cultivar a estirpe LC137 de E. coli transformada com pRPN133 (hNGF).
34 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 26-30, caracterizado por se produzir hNGF, hBDNF ou hNT-3.
35 - Processo de produção de uma neurotrofina recombinante caracterizado por compreender o passo de cultivar uma célula hospedeira não animal, transformada com uma sequência de ADN 74 061 6526-081-118 45-

< recombinante compreendendo uma sequência de controlo de expressão operativamente ligada a uma sequência de ADN compreendendo um gene fundido que codifica, de 5' para 3', uma sequência de sinal em-estrutura com a neurotrofina.
36 - Processo de acordo com a reivindicação 35, caracteri-zado por a célula hospedeira ser E. coli e a sequência de sinal ser LamB ou uma LamB modificada.
37 - Processo de acordo com a reivindicação 36, caracteri-zado por a sequência de controlo de expressão compreender um promotor lacUV5 e um sítio de ligação ao ribossoma T7 Φ1.1.
38 - Processo de acordo com a reivindicação 37, caracteri-zado por a sequência de sinal ser LamBl: SEQ ID N°2 - >Bcll | >Hind3 I >Nhel I >BspMl 1 1 1 20 1 1 | 140 1 * ★ 1 * 1 * C ATG ATG ATC ACA CTG CGT AAG CTT CCG CTA GCT GTA GCA GTA GCA GCA GGT G TAC TAC TAG TGT GAC GCA TTC GAA GGC GAT CGA CAT CGT CAT CGT CGT CCA Met Met lie Thr Leu Arg Lys Leu Pro Leu Ala Vai Ala Vai Ala Ala Gly> a a a a a a a LAMBI aaa aaaa> >BamHl I >Smal I I >Ncol >Xmal1| I I II 60 | I I 80 * I* III* GTA ATG TCT GCA CAG GCC ATG GCC CGGGATCCCTAG CAT TAC AGA CGT GTC CGG TAC CGG GCCCTAGGGATC Vai Met Ser Ala Gin Ala Met Ala> a a LAMBI a a a >

74 061 6526-081-118 -46 LamB2: SEQ ID Na3 >Bcll >Hind3 >Nhel >BspMl I III I 20 | |40 | * * | * | * * C ATG ATG ATC ACA CTG CGT AAG CTT CCG CTA GCT GTA GCA GTA GCA GCA GGT G TAC TAC TAG TGT GAC GCA TTC GAA GGC GAT CGA CAT CGT CAT CGT CGT CCA Met Met Ile Thr Leu Arg Lys Leu Pro Leu Ala Vai Ala Vai Ala Ala Gly> a a a a a a a LAMB2 aaaaaaa> >BamHl 1 >Ncol >Ball I I >Eagl 1 1 1 1 60 1 1 1 1 80 I 1 * 1* 1 ★ 1 * GTA ATG TCT GCA CAG GCC ATG GCC AGT CGGCCGAGGATCCCTAG CAT TAC AGA CGT GTC CGG TAC CGG TCA GCCGGCTCCTAGGGATC Vai Met Ser Ala Gin Ala Met Ala Ser> a' a a LAMB2 a a a > LamB3: SEQ ID Ns4 >Nhel . >Bcll I >Hind3 >Nhel >Scal >BspMl * 20 ★ | 40 * | + * C ATG ATG ATC ACA CTG CGT AAG CTT CCG CTA GCA GTA CTG CTA GCT GTA GCA G TAC TAC TAG TGT GAC GCA TTC GAA GGC GAT CGT CAT GAC GAT CGA CAT CGT GTA GCA GCA GGT GTA ATG TCT GCA CAG GCC ATG GCC AGTCGGCCGAGGATCCCTAG CAT CGT CGT CCA CAT TAC AGA CGT GTC CGG TAC CGG TCAGCCGGCTCCTAGGGATC Vai Ala Ala Gly Vai Met Ser Ala Gin Ala Met Ala> a a a a LAMB3 a a a a a > Met Met Ile Thr Leu Arg Lys Leu Pro Leu Ala Vai Leu Leu Ala Vai Ala> a a a a a a 1AMB3 a a a a a a >Eagl | >Ncol >Ball | >BamHl 1 1 1 1 60 801 1 1 100 * + *1 I * 1 1*

74 061 6526-081-118 -47- ou LamB4: SEQ ID N°5 >Nhel >Bcll I >Hind3 | >Nhel >Scal | I >BspMl I 1 1 1 4 1 20 * 1 1 1 1 | 40 1 * 1 1 * ATG ATG ATC ACA CTG CGT AAG CTT CCG TAC TAC TAG TGT GAC GCA TTC GAA GGC Met Met Ile Thr Leu Arg Lys Leu Pro a a a a a a a LAMB4 CTA GCA GTA CTG GAT CGT CAT GAC Leu Ala Vai Leu a a a a CTA GCT GTA GCA GAT CGA CAT CGT Leu Ala Vai Ala> a a a > >Eagl 1 >Ncol >Ball 1 1 I >BamHl 60 * * 801 *! 1 1 1 1 i * 1 | 100 1* GTA GCA GCA GGT GTA ATG TCT GCA CAG GCC ATG GCC AGTCGGCCGAGGATCCCTAG CAT CGT CGT CCA CAT TAC AGA CGT GTC CGG TAC CGG TCAGCCGGCTCCTAGGGATC Vai Ala Ala Gly Vai Met Ser Ala Gin Ala Met Ala> a a a a LAMB4 a a a a a >
39 - Processo de acordo com a reivindicação 38, caracteri-zado por se produzir hBDNF de comprimento total.
40 - Processo de acordo com a reivindicação 39, caracteri-zado por a sequência de sinal ser LamBl (SEQ ID Na2).
41 - Processo de acordo com a reivindicação 38, caracteri-zado por se produzir hBDNFmyc.
42 - Processo de acordo com a reivindicação 41, caracteri-zado por a sequência de sinal ser LamB2 (SEQ ID Na3) ou LamB4 (SEQ ID Na5).
43 - Processo de acordo com a reivindicação 35, caracteri-zado por compreender o passo de cultivar a estirpe i3f~W1330 de E. coli transformada com pRPN149 (hBDNF).
44 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 35-38, caracterizado por se produzir hNGF, hBDNF ou hNT-3.

74 061 6526-081-118
45 - Processo de recuperação de uma proteína recombinante produzida numa cultura de células hospedeiras não animais, possuindo a referida proteína um pH de pelo menos 9,0 e possuindo pelo menos duas ligações dissulfureto, caracterizado por compreender o passo de solubilizar a proteína numa solução compreendendo um agente de desnaturação forte, sendo a referida solução essencialmente isenta de um agente redutor.
46 - Plasmídeo caracterizado por ser o plasmídeo pRPN133 (hNGF).
47 - Plasmídeo caracterizado por ser o plasmídeo pRPN121 (hBDNFmyc).
48 - Plasmídeo caracterizado por ser o plasmídeo pRPN149 (hBDNF).
49 - Neurotrofina homogénea, purificada caracterizada por ser recuperada pelo processo da reivindicação 1.
50 - Neurotrofina homogénea, purificada caracterizada por ser recuperada pelo processo da reivindicação 5.
51 - Neurotrofina homogénea, purificada caracterizada por ser recuperada pelo processo da reivindicação 9.
52 - Neurotrofina homogénea, purificada caracterizada por ser recuperada pelo processo da reivindicação 10.
53 - Neurotrofina homogénea, purificada caracterizada por ser recuperada pelo processo da reivindicação 16.
54 - Neurotrofina homogénea, purificada caracterizada por ser recuperada pelo processo da reivindicação 17.
55 - Neurotrofina homogénea, purificada de acordo com qualquer das reivindicações 49-54 caracterizada por ser hNGF, hBDNF ou hNT-3.

74 061 6526-081-118 -49-
56 - Neurotrofina homogénea, purificada de acordo com a reivindicação 55 caracterizada por ser um hNGF no qual a treonina substitui a serina, como segundo resíduo de aminoácido.
57 - Neurotrofina homogénea, purificada de acordo com a reivindicação 55 caracterizada por ser uma neurotrofina de comprimento total.
58 - Gene para um gene de sequência de sinal de LamB modificada caracterizado por compreender uma sequência de ADN codificando uma sequência de sinal de LamB possuindo pelo menos uma substituição degenerada de G ou C por A ou T.
59 - Gene de acordo com a reivindicação 58 caracterizado por ter 7 substituições degeneradas.
60 - Gene de acordo com a reivindicação 59 caracterizado por ser LamBl (SEQ ID Ns2) ou LamB2 (SEQ ID NB3).
61 - Gene para um gene de sequência de sinal de LamB modificada caracterizado por compreender uma sequência de ADN codificando uma sequência de sinal de LamB possuindo uma região de núcleo hidrofóbica de 11-20 resíduos de aminoácidos.
62 - Gene de acordo com a reivindicação 61 caracterizado por compreender uma região de núcleo de 14 resíduos de aminoácidos.
63 - Gene de acordo com a reivindicação 62 caracterizado por a região de núcleo compreender o péptido LAVL (SEQ ID Nfi6).
64 - Gene de acordo com a reivindicação 63 caracterizado por ser LamB3 (SEQ ID Na4) ou LamB4 (SEQ ID NB5).
65 - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por se recuperar neurotrofina-4 recombinante.
66 - Processo de acordo com a reivindicação 65, caracteri-

74 061 6526-081-118 -só- β zado por se recuperar neurotrofina-4 humana.
67 - Processo de acordo com a reivindicação 66 para recuperação de neurotrofina-4 humana codificada por uma sequência de ADN tal como contida no bacteriófago HG7-2 tal como depositado no ATCC com o número de acesso 75070 e apresentada a seguir: SEQ ID N222 (Segue Sequência) 74 061 6526-081-118

10 20 30 40 50 60 70 80 CTTGTCACCCAGGTGGCACCCGAGTGGTGCACTCTCTGCTCACTGCAACCTCGGCCTCCTGGGTTCGAGTGATTCrcCTACCTCA 90 100 110 120 130 140 150 160 170 GCCTACTGAGTAGCTGGGATTACACGCGTGCAGCACTATGCCCGGrrAATTrTGGTATTTTTGGTAGAGATGAGGTTTCACCATG 180 190 200 210 220 230 240 250 TTGACCAGCTGCTCTGGAACTCCTCACCTCAAGTCATCCACCTGCCTCAGCCTCCCAGAGTGCTGGGATTAGAGGTGTGGGGCAC 260 270 280 290 300 310 320 330 340 AGTGCCTGGCCTGTAGTAGTTGAATATTTATTATTAATCTACAAGXTGCGCATTACGCAAGCCCTAGATATAGGGTCCCCCAAAC 350 360 370 380 390 400 410 420 ttctagaacaagggcttccccacaatcctggcaggcaagcctcccctggggttcccaacttctttccccactgaagtttttaccc intrão — 430 440 450 460 470 T 480 490 CCXICXCIAAXCCCAGCCTCCCTCTTTCTGTCTC CAG GTG CTC CGA GAG/ÁTGSCXC CCT CTC CCC TCA TGC Q V L R E V L P L P 5 c> 500 510 520 530 540 550 * * * ·* ♦ * XCC CTC CCC ATC CTC CTC CTT TTC CTC CTC CCC AGT GTG CCA ATT GAG TCC CAA CCC CCA CCC S L P I L L L F L L P S V P I E S Q P P P> 560 570 580 590 600 I 1610l 6201 * * * * * 1 \ *1 TCA ACA TTG CCC CCT TTT CTG GCC CCT GAG TGG GAC CTT CTC TCC CC X CGA GTA GTC CTG TCT S T L P P F L A P E W D L L s P R V V L s> 630 640 I 650 660 670 680 * • ★ * * AGG GGX GCC CCT GCT GGG CCC CCT CTG CTC TTC CTG CTG GAG GCT GGG GCC TTT CGG GAG TCA R G A P A G P P L L F L L E A G A F R E 5> 690 700 710 720 730 740 * * * * * * GCA GGT GCC CCG GCC AAC CGC AGC CGG CGT CGG GTG AGC GAA ACT GCA CCA GCG AGT CGT CGG A G A P A N R S R R G V S E T A P A s R R> 750 760 770 780 790 800 810 é * * * * * * GGX GAG CTG GCT GTG TGC GAT GCA GTC AGT GGC TGG GTG ACA GAC CGC CGG ACC GCT GTG GAC G E L A V c D A V 5 G W V T D F R T A V D> 820 830 - 840 850 860 870 • « * * Ψ • TTG CGT GGG CGC GAG GTG GAG GTG TTG GGC GAG GTG CCT GCA GCT GGC GGC AGT CCC CTC CGC L R G R E V E V L G E V P A A G G s P L R> 8B0 B90 900 910 920 930 * * * * * * CAG TAC TTC TTT GAA ACC CGC TGC AAG GCT GAT AAC GCT GAG GAA GGT GGC CCG GGG GCA GGT 0 r F F E T R c K A D N A E E G G P G A G> 940 950 960 970 980 990 * * * * * ★ GGA GGG GGC TGC CGG GGA GTG GAC AGG AGG CAC TGG GTA TCT GAG TGC AAG GCC AAG CAG TCC G G G C R G V D R R H W V S E C K A K 0 s> 1000 1010 1020 1030 1040 1050 1060 * * * • * * ·* TAT GTG CGG GCA TTG ACC GCT GAT GCC CAG GGC CGT GTG GGC TGG CGA TGG ATT CGA ATT GAC Y V R A L T A D A 0 G R V G K R W 1 R ϊ D> 1070 1080 1090 1100 1110 1120 1130 * * * » * * * ACT GCC TGC GTC TGC ACA CTC CTC AGC CGG ACT GGC CGG GCC TGAGACCCATGCCCAGGAAAATAACAGAG TAC V C T L L S R T G R A> 1140 1150 1160 1170 1180 1190 1200 1210 CTGGATGCTCAGAGACCTCAGGGATGGCCCAGCTCATCTAAGGACCCCAGTTTGGGAACTCATCAAATAATCACAAAATCACAAT 1220 1230 1240 1250 1260 1270 1280 1290 1300 TCTCTGATTTTGAGCTCAATCTCTGCAGGATGGGTGAAACCACATGGGGTTTTGGAGGTTGAATAGGAGTTCTCCTGGAGCAACT 1310 1320 1330 1340 1350 1360 1370 1380 tcagggtaataatgatgatgatataataataatagccactatttactgagtgtttactgtxtcttatccctaatacaxaactccx 1390 1400 CAGATCAACICXCATG 74 061 6526-081-118 -52-
68 - Processo de acordo com a reivindicação 66 para recuperação de neurotrofina-4 humana codificada por uma sequência de ADN tal como contida no plasmídeo de ADN pRG173, tal como depositado no ATCC com o número de acesso 75131 e apresentado a seguir: , locUV5 rbS2
69 - Processo de acordo com a reivindicação 25, caracteri-zado por se produzir neurotrofina-4.
70 - Processo de acordo com a reivindicação 69, caracteri-zado por se produzir neurotrofina-4 humana.
71 - Processo de acordo com a reivindicação 70 caracteri-zado por a neurotrofina-4 humana ser codificada por uma sequência de ADN tal como contida no bacteriófago HG7-2, tal como depositado no ATCC com o número de acesso 75070 e apresentada na reivindicação 67 (SEQ ID Na22).
72 - Processo de acordo com a reivindicação 70 caracteriza- 74 061 6526-081-118

-53- do por a neurotrofina-4 humana ser codificada por uma sequência de ADN tal como contida no vector plasmídeo de E. coli. pRG173, tal como depositado no ATCC com o número de acesso 75131 e apresentado na reivindicação 68.
73 - Processo de acordo com a reivindicação 25, caracteri-zado por compreender o passo de cultivar a estirpe RFJ26 de E. coli transformada com o vector plasmídeo de E. colif pRG173, tal como depositado no ATCC com o número de acesso 75131 e apresentado na reivindicação 68.
74 - Processo de acordo com a reivindicação 35, caracteri-zado por se produzir neurotrofina-4.
75 - Processo de acordo com a reivindicação 74, caracteri-zado por se produzir neurotrofina-4 humana.
76 - Processo de acordo com a reivindicação 75, caracteri-zado por a neurotrofina-4 humana ser codificada por uma sequência de ADN tal como contida no bacteriófago HG7-2 tal como depositado no ATCC com o número de acesso 75070 e apresentado na reivindicação 68.
77 - Processo de acordo com a reivindicação 75, caracteri-zado por a neurotrofina-4 humana ser codificada por uma sequência de ADN tal como contida no vector plasmídeo de E. coli. pRG173, tal como depositado no ATCC com o número de acesso 75131, tal como apresentado na reivindicação 68.
78 - Processo de acordo com a reivindicação 35, caracteri-zado por compreender o passo de cultivar a estirpe RFJ26 de E. coli transformada com o vector plasmídeo de E. coli. pRG173, tal como depositado no ATCC com o número de acesso 75131 e possuindo a sequência apresentada na reivindicação 68.
79 - Vector plasmídeo de ADN caracterizado por ser o pRPN91. 74 061 6526-081-118 -54-
80 - Plasmídeo de ADN, caracterizado por ser o plasmídeo de ADN pRG173, tal como depositado no ATCC com o número de acesso 75131 e possuindo a sequência apresentada na reivindicação 68.
81 - Neurotrofina-4 homogénea, purificada, caracterizada por ser recuperada pelo processo da reivindicação 49.
82 - Neurotrofina-4 homogénea, purificada de acordo com a reivindicação 81 caracterizada por ser neurotrofina-4 humana.
83 - Neurotrofina-4 homogénea, purificada de acordo com a reivindicação 82 caracterizada por ser codificada por uma sequência de ADN tal como contida no bacteriófago HG7-2 tal como depositado no ATCC com o número de acesso 75070 e apresentada na reivindicação 67.
84 - Neurotrofina-4 homogénea, purificada de acordo com a reivindicação 82, caracterizada por ser codificada por uma sequência de ADN tal como contida no vector plasmídeo de E. coli. pRG173, tal como depositado no ATCC com o número de acesso 75131, tal como apresentado na reivindicação 68.
85 - Processo de produção de NT-4 humana, caracterizado por compreender cultivar uma bactéria, contendo um ácido nucleico recombinante que codifica NT-4 humana, sob condições tais que a NT-4 humana seja expressa pela bactéria, e recuperar a NT-4 humana produzida.
86 - Processo de acordo com a reivindicação 85, caracterizado por a NT-4 humana ser biologicamente activa. Lisboa 9. JttL 1992 Por REGENERON PHARMACEUTICALS, INC =0 AGENTE OFICIAL-