PT100568A - Anticorpos monoclonais e antigeneos para o melanoma humano - Google Patents
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Description
"ΜΕ20: ANTICORPOS MONOCLONAIS E ANTIGÉNEOS PARA O MELANOMA HUMANO"
Campo Técnico da Invengão A presente invenção diz respeito à descoberta de uma nova proteina da superfície celular designada por antigéneo ME20 (AgME20), que existe nas células de melanoma humano, e de anticorpos tais como o mAB ME20 e fragmentos de anticorpos, os quais foram desenvolvidos e reagem imunemente de modo espe cífico com essa proteína da superfície celular. A presente invenção refere-se também a novos péptidos que contêm regiões nas suas sequências de resíduos aminoácidos que correspondem praticamente aos domínios do AgME20.
Antecedentes da Invenção
As células tumorais expressam alguns antigéneos que não existem, ou existem em pequenas quantidades, nas suas cor respondentes partes celulares normais. Muitos deles são anti géneos de diferenciação partilhados por células tumorais por células tumorais e por algumas células embriónicas. Admite--se que alguns desses antigéneos com selectividade suficiente em tumores possam vir a servir como eventuais agentes terapêu ticos . Esta possibilidade tem vindo a ser ponderada no caso do melanoma maligno [Hellstrõm e Hellstrõm , in Accomplishment in Câncer Research - 1984 Prize Year, General Motors Câncer Research Foundation, J. G. Fornter & J. E. Rhoads, eds., J. B.
Lippincott Company, Philadelphia, (1985) pp. 216-240; Hellstròm e Hellstrõm, in In Vitro Diagnosis of Human Tumors Using Mono-clonal Antibodies, Immunology Series, Η. Z. Kupchick, ed. Mareei Dekker, Inc. New York/Basel, (1988) Vol 39, pps. 123-139]^ e também nos casos de outros tumores [Burchell e Taylor-Papa-dimitrious, in R. W. Baldwin e V. S. Byers, eds., Monoclonal Antibodies for Tumor Detection e Drug Targeting, Academic Press (1985) pps. 1-15; Kemshead, ibid, pp. 281-302]. Têm sido preparados muitos anticorpos para os antigé-nêos da superfície celular que são expressos pelos tumores humanos em quantidades maiores do que pelos tecidos normais. É também ponto assente que alguns anticorpos para os antigé-neos da superfície celular podem ser citotóxicos para as células tumorais na presença de um agente complementar (Hellstrõm et al., (1962) Progr. Allergy 9^:158-245; Hellstrõm e Hellstrõm Human Melanoma; S. Ferrone, ed., Springer-Verlag, New York, Berlin, Heidelburg (1990) pps. 442-466)e que alguns anticor pos podem desempenhar a função de mediadores da citotoxicida dè celular dependente do anticorpo ([Perlmann et al., (1969) Adv. Immunol. 11^:117-193; MacLennan et al., (1969), Immunol. 17^:896-910; Shurzak et al., (1972) Int. J. Câncer _9: 316-323] .
No primeiro caso é necessária uma .fonte adequada de agente complementar (geralmente coelho ou cobaia) e no último caso é necessária uma fonte de células efectoras (geralmente proveniente do murganho).
Os anticorpos tais como aqueles que são dirigidos pa ra os antigéneos associados aos tumores podem aniquilar as cé lulas tumorais humanas na presença de células efectoras humanas [Hellstrõm et al., (1981) Int. J. Câncer 27:281-285] na
presença de soro humano que constitui uma: fonte de agente complementar [Hellstrõm et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. 82:1499-1502; Hellstrõm et al., (1985) Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology ,
Vol. 27, pps. 149-164, Alan R. Liss, Inc., NY] .
Os anticorpos anti-tumor têm sido utilizados em imuno--histologia [Garrigues et al., (1982) Int. J. Câncer 29:511-515; Natali et al., in Carcinogenesis - A Comprehensive Sur-vey, C. J. Conti, T. J. Slaga e A. J. P. Klein-Szanto, eds.,
Raven Press, Ltd. New York, (1989) Vol. 11. pps. 133-164] e em imunoterapia [Hellstrõm e Hellstrõm (1988) Pigment Cell Res. S.1:180-184; Neuwelt et al., (1987) Neurosurgery 20:885--895], e ainda na obtenção de imagens para diagnóstico [Larson et al., (1983) J. Clin. Invest. 72^2101-2114; Murray et al., (1988) in Malignant Melanoma: Biology, Diagnòsis e Therapy, L. Nathanson, ed., Khiwer Academic Publishers, Boston, pps. 123-149] .
Algumas técnicas para a preparação de agentes anti--cancro implicam a marcação de anticorpos com isótopos radio activos [Larson et al., (1983) Clin. Invest. T2:2101-2114 ;
Order, (1984) Compr. Ther. 10^9-18; Carrasquillo et al., (1984) Câncer Treatments Reports 68^:317-328; de Nardo et al., (1985) Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys. 11^335-345 , ou a conjugação de anticorpos para toxinas [Jansen et al., (1982) Immunol. Rev. 6_2:185-216; Vitetta e Uhr (1984) Trans-plant. 3_7:535.538] ou ainda fãrmacos anti-cancro [Ghose et al., (1972) Brit. Med. J. 3:495-499; Hurwitz et al., (1975) Câncer Res. 35^:1175-1181; Rowland et al., (1985) Câncer Immu-nol. Immunother. 19:1-7]. Nesses casos o anticorpo proporcio -4- ίγ. na a especificidade de discriminar o agente para a célula tu-moral adequada e o isótopo ou o fãrmaco proporcionam a capaci dade para destruir o tumor. Contudo, uma desvantagem deste tipo de abordagem, até ao momento da presente invenção, tem sido a falta de uma elevada especificidade do anticorpo o qual em muitos casos se pode ligar também a tecido não canceroso.
Uma vez que tanto os fármacos anti-cancro como os radioisõto pos possuem um nivel elevado de toxicidade para os tecidos normais, esta incorporação não específica em diversos órgãos tais como os rins, o fígado ou a medula óssea pode eventualmente originar efeitos secundários consideráveis.
Outro tipo de abordagem à terapia do cancro consiste no desenvolvimento de imunogénes específicos, frequentemente apresentados como vacinas terapêuticas [Hellstrõm, K. E., Hel. lstróm, I., e Hu, S.-L. (1990) "Why Câncer Vaccines?" In: New Generation Vaccines: The Molecular Approach (Woodrow, G. C., e Levine, Μ. M., eds) Mareei Dekker, Inc. pps 885-862], Esses imunogénes são utilizados para induzir um estado de imunidade tumoral activa nos pacientes. O nível de especificidade turno ral é crucial para este processo e a presente invenção encami nha esta questão para o caso do melanoma que éum neoplasma a_l tamente maligno.
Sumário da Invenção A presente invenção visa proporcionar um anticorpo mo noclonal designado por mAB ME20 o qual é imunoespecífico para uma proteína da superfície celular existente nas células: de melanoma humano e também em células de uma fraeção de nevos -5- . ..· Lf, displasicos mas nao significativamente noutras células. Admi-te-se que tanto o melanoma como os nevos derivem embriológica mente da cristã neural. A presente invenção engloba também fragmentos de mAb ME20 tais como os fragmentos Fab, Fv, Fab' e (Fab1)2 e ainda outros anticorpos e fragmentos com especifi cidade idêntica. 0 anticorpo monoclonal ME20 (e os seus fra£ mentos) pode ser unido funcionalmente, ou conjugado a outro composto tal como um fãrmaco, uma toxina, um agente marcador, um radionuclido, um factor de crescimento ou uma enzima. A presente invenção refere-se também a métodos de diagnostico e terapêuticos que utilizam esse anticorpo e descreve ainda os métodos e as composições para a utilização desses anticor pos monoclonais.
Por outro lado a presente invenção visa ainda um novo antigêneo da superfície celular designado por AgME20, caracte-rlstico das células do melanoma humano, e visa também um pépti^ do praticamente puro que contém uma região que corresponde a um domínio do antigêneo da superfície celular do melanoma tal como o antigêneo AgME20. A presente invenção descreve também métodos de diagnóstico e terapêuticos que utilizam esse péptido e descreve ainda os métodos e as composições que utilizam esse novo péptido.
Descrição dos Aspectos Preferenciais A presente invenção refere-se a compostos e a métodos úteis na detecção e no tratamento do melanoma humano.
Especificamente, a presente invenção refere-se a um no vo anticorpo monoclonal mAb ME20 e aos seus fragmentos tais co -6- mo Fab, Fv, Fab' e Fíab'^ e refere-se também às cadeias po-lipeptidicas sintetizadas que reagem imunemente de modo espe cífico com uma proteína da superfície do melanoma humano ,
AgME20, â qual se liga o anticorpo mAb ME20'tal como agora descrito. A presença desta proteína existente á superfície das células apenas é detectável em células de melanoma e em Λ células de uma fracção de nevos displãsicos (2 em 6 testados). Admite-se que tanto o melanoma como os nevos derivem embriolo gicamente de células da cristã neural. 0 anticorpo mAb ME20, os seus fragmentos e outros anticorpos e fragmentos que se li gam de modo idêntico podem ser utilizados, inter alia, na de-tecção e/ou no tratamento do melanoma, quer isoladamente quer em conjunto com um outro composto. De acordo com o aspecto preferencial, um anticorpo ou um fragmento da presente invenção une-se funcionalmente a um composto tal como um fãrmaco, uma toxina, um agente marcador, um factor de crescimento, um radionuclido ou um radioisótopo ou uma enzima.
Tal como agora utilizado, o termo "reage imunemente" refere-se à produção de uma interacção de ligação específica de natureza semelhante à ligação imunolõgica que ocorre entre um antigéneo e um anticorpo dirigido para esse antigéneo. De acordo com um aspecto preferido da presente invenção, um poli pêptido tal como o anticorpo monoclonal mAb ME20-, reage imune, mente com um antigéneo de superfície celular, tal'como o an-tigineo AgME20, nas células do melanoma humano. Ospolipép-tidos da presente invenção ligam-se às células e tecidos adul^ tos humanos normais em grau muito menor do que ãs células do melanoma.
Tal como agora utilizado o termo "ligam-se em muito menor grau" significa que a ligação não serã de todo detectã- -7- vel quando se utilizarem técnicas imuno-histológicas normali zadas. Pelo contrário, o anticorpo mAb ME20 liga-se com um elevado grau de especificidade a um novo antigéneo caracterís; tico do melanoma humano. 0 anticorpo mAb ME20 e polipeptidos e fragmentos idên ticos da presente invenção tal como descrito antes, podem unir-se funcionalmente a outros compostos e podem'ser utiliza dos para fins de diagnóstico, localização ou terapêuticos.
Tal como agora utilizados, os termos "polipéptido" e "anticorpo" são intermutáveis e referem-se a uma molécula de origem natural ou sintética constituída por resíduos aminoáci. dos acoplados por ligações peptldicas que podem reagir imunemente de modo específico com uma proteína da superfície celular do melanoma humano, englobando as proteínas glicosiladas designadas por imunoglobulinas (anticorpos), fragmentos de an ticorpos e proteínas sintéticas e fragmentos de proteínas que são capazes de se combinar ou reagir imunemente de modo específico com uma proteína da superfície do melanoma.
Tal como é agora utilizado, o termo "antigéned1 refere--se a uma entidade que é capaz de se unir especificamente a um anticorpo. No caso de um antigéneo ser capaz de induzir a produção, de anticorpos designa-se também por "imunogene".
Tal como é agora utilizado o termo "ligado funcional-mente" refere-se a uma ligação que não interfere com a capacidade de qualquer dos grupos ligados funcionar conforme descrito. De acordo com um aspecto preferencial, o anticorpo mAb ME20 está ligado funcionalmente a um composto biologicamente activo tal como um fãrmaco de modo a permitir que o polipepti do se una a uma proteína da superfície do melanoma humano e sem -8- -8- ν· / qualquer interferência com a actividade biológica do fármaco.
De acordo com um aspecto particularmente preferido o anticorpo mAb ME20 está funcionalmente ligado a um fármaco quimioterapêutico tal como a dacarbazina, a adriamicina ou a mitomicina C.
Os pólipeptidos da presente invenção que reagem imune mente de modo especifico com o antigéneoME20 englobam anticor pos tais como o anticorpo monoclonal mAb ME20. A actividade biológica dos anticorpos é multifacetada. A região Fc da mo lêcula determina em grande parte a capacidade das moléculas do anticorpo para activarem o agente complementar e medeia a citotoxicidade celular dependente do anticorpo (CCDA) [Uanue and Benacerraf (1984) Textbook of Immunology, 2nd Edition, WiJL liams and Wilkins, Chap. 12, pps. 218-238].
Os anticorpos encontram-se divididos em diversas clajs ses e sub-classes. Os anticorpos monoclonais preferidos da presente invenção pertencem às sub-classes IgGl, IgG2a e IgG3. De um modo geral, os anticorpos das sub-classes IgG2a e IgG3 podem mediar frequentemente a CCDA e activar o complemento em soro.
Os polipeptidos da presente invenção encontram-se preferencialmente presentes numa composição farmacêutica conjunta mente com um ou vários veículos farmaceuticamente aceitáveis.
Tal como agora utilizado o termo "veículo farmaceuti^ camente aceitável" refere-se a um composto susceptível de ser administrado a um paciente e que não produza efeitos tóxicos ou indesejados ao fazer-se esssa administração. Como exemplos ilustrativos de veículos farmaceuticamente aceitáveis referem--se as soluções salinas tamponadas com fosfato, a solução de -9- -9-
Ringer, os óleos, os geles e as microesferas e ainda os lipo somas. Existem outros veículos farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos no campo farmacêutico e que se consideram en globados pela presente invenção.
Tal como é agora utilizado o termo "agente marcador" refere-se a um único átomo ou molécula que ao ficar funciona lmente ligado a um produto da presente invenção permite a detecção da sua presença num método de ensaio. A título ilus^ trativo refere-se como agentes marcadores os corantes fluorescentes, os radioisótopos, as enzimas e os anticorpos que podem ser detectados independentemente ou que podem ser dete ctados conjuntamente com a adição de um substracto ou de outra molécula que com eles reaja. 0 anticorpo monoclonal mAb ME20 existe em duas formas isotípicas, respectivamente IgGl e IgG2a, tendo essas formas sido produzidas a partir de hibridomas que se encontram depositados na American Type Culture Collection (colecção américa na de culturas tipo) (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, em total conformidade com os requisitos de deposição exigidos pelo United States Patent and Trademark Office (Instituto de Marcas e Patentes Norte Americano) e pelo Tratado de Budapeste, em 4 de Junho de 1991, possuindo respec tivamente os números de acesso HB10764 e HB10763.
Os anticorpos da presente invenção são especificamen-te imunoreactivos com sítios determinantes num antigeneo gli-coproteico, conhecido pela designação AgME20, associado com células do melanoma humano e o qual não foi encontrado noutros tumores humanos. Essa especificidade imunorreactiva para esses anticorpos diminui bastante a probabilidade dos anticorpos da -10- presente invenção se ligarem aos carcinomas da mama, do pul mão, do cólon e de tipo idêntico.
Em particular salienta-se que não foi observada qual. quer ligação do anticorpo mAb ME20 às células normais adultas de seres humanos e que os tecidos foram detectados por ensaio imuno-histológico.
Os anticorpos da presente invenção são úteis tanto isoladamente como em combinação com outros agentes em métodos tumoristáticos e/ou tumoricidas para o tratamento do melanoma. Esses anticorpos podem ser preparados pelos processos de hibri doma, recombinantes ou de síntese e abrangem os fragmentos , multímeros e os seus derivados. Tal como agora utilizado o termo "multímero" refere-se a uma molécula que contém várias unidades repetitivas de uma porção da molécula. Um péptido multimérico da presente invenção contém preferencialmente entre 2 e cerca de 10 regiões repetitivas de uma porção de uma sequência de resíduos de aminoácidos do péptido funcionalmente' ligadas entre si. De acordo com um aspecto da presente in venção proporciona-se um anticorpo multimérico que corresponde a vãrias moléculas de um anticorpo, tal como o anticorpo mAb ME20, funcionalmente ligadas entre si originando uma molécula que possui vários sítios de ligação funcionais podendo cada um deles reagir imunemente de modo especifico com uma proteína da superfície celular do melanoma humano tal como o antigéneo AgME20. Os anticorpos da presente invenção também podem ser utilizados em métodos e testes para a diagnose, de-tecção e tratamento do melanoma humano. A presente invenção engloba também um péptido substan cialmente purificado que contém uma região que emita ou prati- -11- -11-
camente corresponde a um domínio de uma proteína da superfície celular do melanoma humano. Os péptidos da presente invenção são capazes de reagir imunemente de modo específico como um anticorpo da presente invenção tal como o anticorpo mAb ME20.
Tal como agora utilizado o termo "substancialmente" refere-se a um nível elevado de semelhança. Um péptido subs tancialmente purificado da presente invenção significa uma preparação que possui menos de dez por cento de outros péptidos diferentes. Uma sequência substancialmente idêntica de acordo com a presente invenção exibe uma variação menor do que dez por cento relativamente ã sequência de referência.
De acordo com um aspecto preferido , um péptido da pre sente invenção engloba moléculas de origem natural ou sintética substancialmente purificadas que contêm sequências de resíduos de aminoácidos e/ou glicosilação.que podem reagir imunemente com o anticorpo monoclonal ME20.
Esses péptidos podem ser preparados por métodos norma lizados de purificação de proteínas e por síntese química ou recombinante e englobam fragmentos, multímeros e os seus deri. vados que mantenham a capacidade de reagir' imunemente de modo específico com os anticorpos da presente invenção. A proteína da superfície celular do melanoma humano, ME20, designada por AgME20, é uma glicoproteína que possui um peso molecular compreendido aproximadamente entre 80 kD e 120 kD. De acordo com um aspecto preferido a proteína da superfície celular do ME20 possui um peso molecular, determinado em conformidade com o protocolo SDS-PAGE, compreendido aproximadamente entre 100 kD e 116 kD. -12- -12-
Os anticorpos da presente invenção podem ser utiliza dos em métodos de tratamento e para a detecção de melanoma humano.
De acordo com um aspecto, um anticorpo da presente in venção susceptivel de se ligar a uma proteína de superfície celular do melanoma humano pode ser utilizado para detectar a presença de células de melanoma humano em ensaios efectua-dos in vitro e in vivo. De acordo com este método faz-se con tactar as células humanas de um paciente com uma quantidade eficaz do anticorpo de modo a permitir a ligação do anticorpo a quaisquer células de melanoma que se encontrem presentes. Depois procede-se ã detecção da presença do anticorpo ligado recorrendo-se a qualquer dos diversos métodos conhecidos na especialidade. A título ilustrativo refere-se que os métodos de detecção englobam a detecção radiográfica da presença de um radioisótopo funcionalmente ligado ao anticorpo, a utilização de um segundo anticorpo identificador que possa ser detectã-vel e o qual reaja imunemente com a região exposta do anticor po ligado e ainda a utilização de meios indicadores, tais como um substracto que é convertido numa molécula fluorescente por uma enzima funcionalmente ligada ao anticorpo.
De acordo com outro aspecto administra-se um polipép-tido da presente invenção, tal como o anticorpo mAb ME20, segundo lima dose terapeuticamente eficaz a um determinado pacien te, em conjunto com um agente quimioterapêutico durante um in tervalo de tempo considerado suficiente para originar a inibi^ ção de proliferação adicional de quaisquer células de melanoma presentes. A título ilustrativo refere-se que os agentes qui-mioterapêuticos são preferencialmente os fãrmacos e as toxinas -13 vulgarmente utilizados no tratamento do melanoma. 0 agente quimioterapêutico pode ser adicionado separadamente do poli^ péptido da presente invenção, em conjunto com o polipéptido ou funcionalmente ligado ao polipéptido tal como sucede no caso de um conjungado entre um fãrmaco e um polipéptido. Δ presente invenção abrange também uma composição imunogênica susceptível de gerar uma resposta imune quando administrada a um paciente. As composições imunogénicas con têm um péptido da presente invenção substancialmente purificado correspondente a uma região de uma proteína da superfície celular do melanoma humano e contêm também um agente que aumenta a resposta imune tal como um hapteno ou um adjuvante, como o alúmen. Este tipo de proteína da superfície celular , tal como o AgME20, também pode ser administrado a um paciente em diversos tipos de "vacinas", por exemplo, o AgME20 pode ser expressado num vírus de uma vacina recombinante [Estin et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:1052-1056] contendo o géne que codifica o péptido associado ao melanoma de 80 -120 kD ou uma sua parte. Reivindica-se também como parte da presente invenção outros imunógénes^ específicos associados ao antigéneo AgME2 0.
De acordo com um aspecto da presente invenção administra-se uma composição imunogênica contendo um péptido da presente invenção a um determinado paciente numa dose suficiente para gerar uma resposta imune dirigida ãs células do melanoma humano. De acordo com a presente invenção faz-se observar que a composição peptídica imunogênica pode gerar uma resposta imune num paciente sendo especificamente dirigi, da contra um epítope presente na proteína da superfície celu -14 lar do melanoma humano tal como o antigeneo AgME20. A presente invenção engloba também estojos que contêm anticorpos e/ou péptidos, contendo ainda esses estojos instruções adequadas para a sua utilização. De acordo com um aspecto específico, cada estojo de acordo com a presente invenção contém o anticorpo monoclonal ME20.
Os exemplos seguintes ilustram mais claramente a pre sente invenção e têm apenas objectivos ilustrativos e não li mitativos. EXEMPLO 1 ANTICORPO MONOCLONAL ME20 A. Preparação do anticorpo ME20
Utilizaram-se murganhos da estirpe Balb/C (com aproxi^ madamente 2 meses de idade) que receberam seis inoculações , tanto por via subcutânea (sc) como intraperitoneal (ip), com células de melanoma humano. As primeiras quatro inoculações foram efectuadas com um afastamento temporal de cerca de um mês, efectuando-se a quinta inoculação uma semana mais tarde e efectuando-se a sexta inoculação três semanas após a quinta inoculação. Cada inoculação continha cerca de 10 células de melanoma humano H3614 e/ou H3606 (obtidas a partir de tumores primários); as inoculações 1, 2 e 3 continham células H3614 e as inoculações 4, 5 e 6 continham simultaneamente células H3614 e H3606.
Decorridos três dias após a sexta inoculação procedeu· -se â remoção do baço de um murganho e utilizou-se no protoco lo de fusão. Destruíu-se o baço de modo a obter-se células efectuando raspagens sobre diversos crivos e depois enxaguou--se com meio RPMI. As células do baço foram separadas do tecido restante por centrifugação a 200 x g durante 10 minutos e com elas preparou-se uma nova suspensão em meio RPMI e a seguir misturou-se com células do mieloma Ag8-653 segundo uma proporção entre células de Ag8-653/cêlulas de baço da or dem de 1:10.
Submeteu-se a mistura de células Ag8-653 e de células de baço imunizadas a centrifugação a 200 x g durante 10 minutos e depois removeu-se o meio sobrenadante mantendo-se as células ã temperatura de 37°C.
Adicionou-se polietileno-glicol (PEG, 1 ml) ãs células durante um período de um minuto com agitação durante mais um minuto.
Adicionou-se meio de Dulbecco modificado por Iscove (MDMI) sem HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina) (a quantidade adicionada foi de 1 ml durante o período de 1 minuto); depois adicionou-se mais 8 ml durante 2 minutos. Submeteu-se as células a centrifugação durante 10 minutos a 160 x g ã tem peratura ambiente. Removeu-se o sobrenadante e com as células preparou-se uma nova suspensão em 25 ml de MDMI. Misturou-se - 8 depois essa nova suspensão celular com 2 x 10 timocitos de murganho recentemente obtidos a partir de murganhos da estirpe Balb/C com a idade compreendida entre 3 e 4 semanas. A mistura de cultura celular de células Ag8-653, célu las de baço e timocitos foi utilizada para a preparação de uma suspensão num volume de MDMI e 2 ml de 50 x HAT. Manteve-se a -16- cultura à temperatura de 37°C sob uma atmosfera contendo 7 %
de C02 durante um intervalo de tempo variável entre 12 e 16 horas e depois procedeu-se ã transferência das células para placas de microtitulação de 96 cavidades na quantidade de
uma atmosfera contendo 7% de C02· Decorridos 3 dias procedeu-se ao exame microscópico das placas para a determinação da eficiência da fusão.
Efectuou-se depois o rastreio das células híbridas para verificação da produção de anticorpos e os híbridos po sitivos foram transferidos para placas de 48 cavidades adicionando-se mais timocitos.
Depois procedeu-se ao rastreio dos anticorpos resul^ tantes produzidos pelos clones híbridos, em conformidade com o ensaio imunoabsorvente ligado ã enzima (protocolo ELI_ SA) na imunização de linhas celulares do melanoma e fibro-blastos (fibroblastos da pele humana). Isolou-se o anticor po ME20 com base na sua propriedade de ligação ãs células do melanoma mas sem qualquer ligação aos fibroblastos. Obte ve-se ainda uma melhor caracterização do mAb ME20 por imuno--histologia e análise celular em SCAF.
Foram efectuados estudos utilizando o método de se-lecção celular activada por fluorescência (SCAF) ãs tempera turas de 4°C e de 37°C sobre células do melanoma H3606. Os resultados adiante apresentados demonstram que o anticorpo ME20 se liga fundamentalmente ã superfície celular do melanoma ã temperatura de 4°C e ã temperatura de 37°C o anticor po foi detectado essencialmente na região perinuclear. A localização perinuclear foi ainda confirmada por microsco- -17- -17-
pia confocal. A internalização do anticorpo ocorre ã tempe ratura de 37°C. B. Imuno-histoloqia A ligação do anticorpo mAb ME20 a diversos tecidos humanos normais e tumorais foi observada de acordo com as técnicas imuno-histolõgicas da peroxidase-anti-peroxidase (PAP) descritas por Hellstrôm et al., (1983) J. Immunol. 130: 1467. Os resultados indicados no Quadro 1 demonstraram que o anticorpo mAb ME20 se liga especificamente ao melanoma humano e que se liga a cerca de 1/3 dos nevos diplãsicos ensaiados, mas não se liga ao tecido humano normal. Admite-se que tanto as células do melanoma como as células dos nevos derivam embriologicamente da cristã neural e podem partilhar ou expressar alguns dos antlgéneas de superfície comuns. A inexi^ tência de qualquer ligação detectãvel do anticorpo mAb ME20 ao tecido normal demonstra que este anticorpo é altamente especifico e útil para a detecção e para o tratamento do me lanoma humano. -18- -18-
QUADRO 1
IMUNO-HISTOLOGIA TECIDO TUMORAL TECIDO NORMAL Tipo Positivo/Não testado Tipo Positivo/Não En saiado Mama 0 10 Supra-renais 0 3 Cólon 0 10 Intestino 0 1 Pulmão 0 15 Cérebro 0 1 Melanoma 18 19 Mama 0 3 Ovário 0 2 Cólon 0 6 Nevos (di-plásicos) 2 6 Esófago 0 3 Coração 0 4 Rim 0 10 Fígado 0 8 Pulmão 0 8 Nevo linfático 0 4 Nervo óptico 0 1 Ovários 0 2 Pâncreas 0 6 Pele 0 5 Baço 0 9 Estômago 0 4 Testículos 0 2 Tirõide 0 2 Amígdalas 0 1 -19- C. Caracterização do anticorpo ME20 com o anticorpo mAb ME20
Marcou-se metabolicamente células do melanoma H3606 35 utilizando S-metionina durante 10 minutos seguindo-se a incubação em meio RPMI-1640 isento de metionina enriquecido com 5% de soro de bovino fetal tratado por diãlise, durante um intervalo de tempo compreendido entre 0 e 10 horas e ã temperatura de 37°C. Extraíu-se depois o agregado celular com solução salina tamponada com fosfato a pH 7,4 , contendo alternativamente 1% de NP-40, PMSF (10 yug/ml) e aprotinina (20 jag/ml) ou 0,4% de Triton X-100 e inibidores de proteinase. Provocou-se a imnuprecipitação do antígéneo ME20 incubando o lisado celular com o anticorpo mAb ME20 du rante 15 minutos ã temperatura de 4°C. O complexo antigeneo -anticorpo precipitou com anti-IgG do murganho conjugado no coelho e "Protein A-Sepharose" (Sigma Chemical Co., St.
Louis, MO). Apõs a lavagem do imunoprecipitado submeteu-se a análise por SDS-PAGE de acordo com o protocolo sob condições de redução e efectuou-se a sua visualização por fluoro grafia apõs impregnação do gel com "AMPLIFY'' (Amersham, Ar-lington Heights, IL).
As células do melanoma humano H3606 foram marcadas 3 metabolicamente com H-glucosamina por incubaçao em 50% de DMEM de ISCOVE, 50% de meio RPMI-1640 isento de glicose e 5% de soro fetal de bovino tratado por diãlise. O antigeneo ME20 foi imunoprecipitado a partir do lisado celular com mAb ME20, anti-IgG de murganho conjugado no coelho e "Protein A-Sepharose". Submeteu-se o imunoprecipitado a análise de -20- acordo com o protocolo SDS-PAGE sob condições de redução e efectuou-se a visualização por autorradiografia.
Surgiu uma banda principal Mr = 105000 (conforme d£ terminado pelo protocolo SDS-PAGE em geles de poliacrilami-da a 7,5%) do antigeneo AgME20 decorridos 10 minutos de marcação e permaneceu como banda predominante durante cerca de 1 hora, tornando-se muito fraca decorridas cerca de 3 horas. Surgiu um componente de alevado peso molecular de Mr = 120000 ao fim de 10 minutos e manteve-se presente durante 2 horas. Decorridos tempos de ensaio mais longos (4 a 10 horas) a banda Mr = 97000 foi o componente mais predominante imuno-precipitado pelo anticorpo mAb ME20. ✓ O anticorpo ME20 precipitou especificamente antige-neos glicoproteicos com Mr = 120000, Mr = 105000 e Mr = 97000 conforme determinado pelo protocolo SDS-PAGE em geles de po liacrilamida a 7,5%. Os resultados demonstram que o determinante antigénico reconhecido pelo anticorpo mAb ME20 está localizado sobre uma nova glicoproteína. O antigeneo ligado ã membrana é libertado num meio condicionado de células H3606. A forma solúvel do antigeneoAgME20 possui um valor Mr = 97000. A análise da sequência aminoterminal indica que a forma solúvel do antigeneoAgME20 possui a mesma sequência aminoterminal do antigeneoME20 ligado à membrana e que e tam bem uma glicoproteína de cadeia única. D. Caracterização da ligação do anticorpo monoclonal ME20
Investigou-se a capacidade do anticorpo mAb ME20 pa ra se ligar e internalizar em células tumorais pelo método -21 indirecto da imunotoxina com o objectivo de se detectar a internalizaçào de um conjugado anticorpo-toxina com subsequente aniquilação das células que internalizam o conjugado, em conformidade com o método de Till et al., (1988) Can cer Res. 4^: 1119-1123. Pez-se reagir um fragmento FAB de anti-imunoglobulina do murganho conjugada na cabra aco piado a uma cadeia de ricina A com células previamente ex postas a uma concentração de 10 ^ig/ml de mAb ME20 ou de mAb BR96. 0 anticorpo mAb BR96 é um anticorpo monoclonal que se liga especificamente às células cancerosas da mama, do cõlon e do pulmão e ê internalizado pelas células positivas em antigeneoBR96 [Hellstrom et al., (1990) Câncer Res. 50^:2183-2190] .
Os valores de inibição percentual de sobrevivência das células testadas em conjunto com os valores da proporção de ligação, conforme medidos pelo métcdo da SCAF, encon tram-se representados no QUADRO 2 e demonstram a internalização do anticorpo mAb em células de melanoma humano, tal como evidenciado pela aniquilação especifica das células do melanoma no caso do anticorpo mAb ME20. -22- QUADRO 2
FACS
Linha Celular Anticorpo . % de inibição Proporção < inibição 3606 ME20 95 16 (melanoma) BR961 26 1 3774 ME 20 82 2 (melanoma) BR96 8 1 2669 ME20 94 5 (melanoma) BR96 5 1 HT29 ME20 0 1 (cólon) BR96 6 1 2707 ME20 31 1 (pulmão) BR96 98 29 3396 ME20 17 1 (mama) BR96 99 54 1 O anticorpo mAb BR96 liga-se ãs células cancerosas da mama, do cólon e do pulmão e é internalizado pelas célu las positivas em antígénea A análise pelo método da SCAF da ligação do anticor po mAb ME20, conforme se mostra no QUADRO 2, mediu a ligação de um anticorpo secundário marcado por isotiocianato de fluoresceína (FITC) ãs células tumorais in vitro que ha viam sido tratadas com a concentração de 10 ug/ml de mAb BR96 ou de mAb ME20. -23-
Foram ainda efectuados outros estudos, conforme se mostram no QUADRO 3, utilizando um anticorpo secundário de um anticorpo de murganho conjugado na cabra marcado com FITC. A proporção de ligação representa o quociente entre o brilho, designado por equivalente linear de fluorescência (ELF), de células afectadas pelo anticorpo especifico mAb ME2G e a população celular não afectada.
ELF amostra - = Proporção de ligação ELF I η controlo
Realizou-se a microscopia confocal sobre células de melanoma humano H3606 com o objectivo de se ilustrar melhor a internalização do anticorpo mAb ME20. As células H3606 viáveis foram coloridas por exposição, a temperatura de 4 C, ao anticorpo mAb ME20 conjugado em ficoeritrina (mAb ME20-PE). 0 anticorpo marcado associou-se ãs microvilosidades localizadas sobre a membrana plãsmica das células.
No caso em que as células marcadas de modo idêntico foram mantidas ã temperatura de 37°C durante 2 horas, o mAb ME20 apresentou uma localização perinuclear citoplãsmica dji-fusa e esteve praticamente ausente da superfície celular in dicando que o anticorpo havia sido internalizado.
Estes estudos indicaram a distribuição nativa aparen te do antígeneoAgME20. As células que haviam sido previamen te permeabilizadas por detergente e fixadas com paraformal- -24- -24-
deído foram expostas ao mAb ME20-PE. A distribuição ciai celular da ligação do anticorpo observada foi idêntica ã que se observou antes no caso da ligação do anticorpo mAb ME20 ã temperatura de 4°C. Além disso houve também uma intensa coloração associada com um compartimento perinuclear acêntrico, possivelmente representando o aparelho de Golgi. Estas observações sugerem que o antígeneo AgME20 recentemen te sintetizado é transportado através do aparelho de Golgi, exportado para a superfície da membrana plásmica e é depois internalizado apõs ligação pelo mAb ME20.
Estudou-se a avidez de ligação do anticorpo mAb ME20 ãs células do melanoma humano H3606 para dois isótopos do anticorpo mAb ME20. Submeteu-se o anticorpo mAb ME20 ioda-125 do ( I-mAbME20)a um ensaio de imunorreactividade em relação ãs células positivas do antígeneo e depois utilizou-se em estudos de ligação com células H3606. Procedeu-se ã anã lise de Scatchard e os resultados obtidos traduzem um valor Ka de aproximadamente 10 M tanto para o isótopo IgGl como IgG2 do anticorpo mAb ME20. EXEMPLO 2 AMTIGENEO. ME20 A. Purificação
Isolou-se o antígeneoME20 (AgME20) a partir de célu las tumorais do melanoma humano (células H3606) obtidas a partir de uma lesão metastãsica definida pelos inventores como linha celular e purificou-se parcialmente por cromato grafia de imunoafinidade. Com as células H3606 preparou-se uma suspensão em solução salina fisiológica tamponada com fosfato (PBS). Adicionou-se um volume igual de tampão de solubilização até se obter uma concentração final de 0,4 M de NaCl, 1% de Triton X-100,· 10 mM de EDTA em 17 mM de tampão de fosfato, pH 7,6. 0 tampão continha os seguintes inibidores de proteinase: 1 mM de PMSF (fluoreto de fenil-metilsulfonilo), 2 mM de BAEE (éster etílico de N ¢( -ben-zoíl-L-arginina), e 1 jig/ml de cada um dos componentes leu peptina, aprotinina e pepstatina. As células foram tratadas com tampão de solubilização sob agitação suave durante 30 minutos ã temperatura de 4°C. Removeu-se o material in solúvel por centrifugação a 100000 x g durante 90 minutos e ã temperatura de 4°C. Purificou-se o antígenso ME20 a par tir do sobrenadante por cromatografia de imunoafinidade. Preparou-se uma solução de mAb ME20 (5 mg/ml) em tampão de fosfato de sódio 0,2 M contendo NaCl 0,5 M, pH 8,2 e adicio nou-se a 1 g de tresil-Sepharose húmido (Sigma). Manteve--se a reacçao de acoplamento sob agitação suave revolvendo durante 16 horas ã temperatura de 4°C. Tratou-se o gel com Tris-HCl 0,2 M, pH 8,5 durante 5 horas e ã temperatura de 20°C e lavou-se com: (1) tampão de acetato de sódio 0,2 M contendo NaCl 0,5 M, pH 3,5; (2) tampão de fosfato 17 mM contendo NaCl 0,4 M e 1% de Triton X-100, pH 7,4; (3) solução salina fisiológica tamponada com fosfato contendo 1% de Triton X-100, pH 7,4; (4) dietilamina 100 mM contendo 0,2% de Triton X-100, pH 11,5; e (5) solução salina fisiológica tamponada com fosfato contendo 1% de Triton X-100. Aplicou-se o lisado celular a uma coluna de 1 ml de (mAb -26- -26-
ΜΕ20)-Sepharose e fez-se recircular durante 12 a 16 horas ã temperatura de 4°C. Lavou-se o suporte de afinidade com PBS contendo 0,2% de Triton X-100 e efectuou-se a eluição do an tigeneocom dietilamina 100 mM contendo 0,2% de Triton X-100, pH 11,5. Neutralizou-se o produto de eluição com tampão Tris-HCl 2M, pH 6,8. 0 antigéiEO AgME20 parcialmente purificado foi ainda melhor purificado em conformidade com o protocolo SDS-PAGE . 0 produto eluldo da coluna foi submetido a diãlise na presen ça de 0,1% de SDS. Procedeu-se em conformidade com o proto colo SDS-PAGE (10% de acrilamida) de acordo com o método de Laemmli utilizando miniplacas de gel com espaçadores com a espessura de 0,75 mm (BioRad).
Após electroforese procedeu-se ã coloração do gel de SDS-poliacrilamida com azul brilhante de Coomassie e depois descolorou-se. Efectuou-se a excisão das bandas do antige^ieo ME20 coloridas (Mr = 116000 e 100000) com uma lâmina de barbear e depois submeteu-se a electroeluição. ✓
Também se recuperou o antigeneoME20 a partir dos geles de SDS-poliacrilamida por electrocoloração sobre uma mem brana "Problot" (Applied Biosystems, Inc.) utilizando "Mini--Transblot Electrophoretic Transfer Cell" (BioRad Laboratories, Richmond, CA), conforme descrito por Matsudaira, P., (1987), J. Biol. Chem. 261; 10035-10038. A membrana foi tingida com azul brilhante de Coomassie, depois foi descolorida e procedeu-se à excisão das bandas do antigeneo AgME20 coloridas (Mr = 116000 e 100000) utilizando uma lâmina de barbear para posterior analise da sequência aminoterminal. -27 B. Análise sequencial
Efectuou-se a degradação automática segundo Edman de três preparações, respectivamente com 9,9 pmoles, 7,7 pmoles e 3,0 pmoles, cada uma de antígeneo AgME20 num sequenciador de proteinas em líquido pulsatõrio, modelo 475A (Applied Bio systems, inc.) equipado com um carregador de reacção de fluxo vertical transverso, conforme descrito por Hewick e colaboradores [Hewick, R. M., et al., (1981) J. Biol. Chem. 256: 7990-7997].
Os derivados de fenil-tio-idantoina (PTH) com amino-ãcidos foram analisados por cromatografià liquida de elevado rendimento de fase inversa (CLERfi) utilizando um modelo 120A de uma unidade de CLER em tempo real (Applied Biosystems , Inc.) com uma coluna PTH Cl8 (2,1 x 220 mm, Applied Biosystems, Inc,) e utilizando para eluição um gradiente de acetato de sódio/tetra-hidrofurano/acetonitrilo. A redução e a quantificação dos resultados foram efectuadas utilizando uma interface Nelson 760, um computador Hewlett Packard 9816 e um modelo 900A/modelo 475A da aplicação informática para análise do cromatograma (Applied Biosystems, Inc.).
Os estudos das sequências indicaram que 3 antigereos ME20 principais ligados à membrana (Mr = 116000; 100000; e 80000, conforme determinado pelo protocolo SDS-PAGE ém 10% de geles de poliacrilamida ) possuíam sequências de aminoãcidos aminoterminais idênticas. A sequência aminoterminal designa da por sequência I.D. NQ 1 é a seguinte: -28- -28- K V P R N Q D w L G Lys Vai Pro Arg Asn Gin Asp Trp Leu Gly 1 5 10 V S R Q L R T K A W Vai Ser Arg Gin Leu Arg Thr Lys Ala Trp 15 20 N R Q L Y P E W T X Asn Arg Gin Leu Tyr Pro Glu Trp Thr X 25
(X: o aminoãcido não foi identificado) ^ ^ 4. *
Alem disso isolou-se uma forma solúvel do antigeneo AgME20 a partir do meio condicionado de células H3606. Purificou-se o antígeneopor cromatografia de afinidade e recu perou-se a partir da coluna do anticorpo mAb ME20 por elui-ção com dietilamina 100 mM, pH 11,5, na ausência de Triton X-100. O valor Mr do antigeneo solúvel foi de 97000.
Procedeu-se ã comparação da sequência aminoterminal do antigeneoAgME20 relativamente à base de dados PIR recente mente actualizada (edição 27) e ã base de dados integrada MIPSX. A comparação de sequências nao revelou semelhanças significativas com qualquer outra sequência conhecida. A memória descritiva e os exemplos anteriores tem co mo objectivo ilustrar a presente invenção mas sem contudo a limitarem. E possível introduzir diversas variações e modificações sem que haja afastamento do espírito e do âmbito da presente invenção. -29- -29-
LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: Hellstrom, Ingegerd
Hellstrom, Karl Erik Marquardt, Hans
(ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: "ME20: ANTICORPOS MONOCLONAIS E ANTIGÊNEOS PARA O MELANOMA HUMANO" (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 1 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) ENDEREÇO: Bristol-Myers Squibb Company (B) RUA: 3005 First Avenue (C) CIDADE: Seattle (D) ESTADO: Washington (E) PAÍS: USA (F) CP: 98121 (v) ELEMENTOS INFORMÁTICOS: (A) TIPO DE MEIO: Disquete (B) COMPUTADOR: IBM PC compatível
(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA:
Patentln Release Versão Nõ 1.0 (vi) DADOS ACTUAIS DO PEDIDO DE PATENTE: (A) N0MERO DO PEDIDO: (B) DATA DE DEPÕSITO: (C) CLASSIFICAÇÃO:
Cviii) INFORMAÇÕES SOBRE O REPRESENTANTE/AGENTE: (A) NOME: Sorrentino, Joseph (B) NÚMERO DE REGISTO: 32,598 (C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/PROCESSO: ON0084- (ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: (206) 728-4800 (B) TELEFAX: (206) 448-4775 INFORMAÇÃO PARA A SEQ. ID NQ: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 29 Aminoãcidos (B) TIPO: Aminoãcido (D) TOPOLOGIA: Linear (li) TIPO DE MOLÉCULA: Péptido (iii) HIPOTÉTICO: Nenhum (iv) ANTI- -SENTIDO: Nenhum (v) TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal (Vi) FONTE ORIGINAL: (A) ORGANISMO: Homo sapiens (F) TIPO DE TECIDO: Melanoma (H) LINHA CELULAR: células H3606 do Melanoma Humano -31- -31- (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°: 1
Lys Vai Pro Arg Asn Gin Asp Trp Leu Gly 15 10
Vai Ser Arg Gin Leu Arg Thr Lys Ala Trp 15 20
Asn Arg Gin Leu Tyr Pro Glu Trp Thr 25
Claims (54)
- ‘s REIVINDICAÇÕES 1. - Anticorpo, caracterizado pelo facto de reagir de maneira imune e de um modo específico com uma proteína da superfície celular do melanoma humano, possuindo essa proteí^ na superficial um peso molecular compreendido entre SO e 120 kD aproximadamente, e de se encontrar presente em células de tumores de melanoma humano mas não existir noutras cê lulas de tumores humanos.
- 2. - Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, ca racterizado pelo facto de possuir as características de liga ção do anticorpo monoclonal ME20, possuindo um isotipo IgGl tal como produzido por um hibridoma com o Número de Acesso da ATCC HB10764.
- 3. - Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, ca racterizado pelo facto de possuir as características de liga ção do anticorpo monoclonal ME20, possuindo um isotipo IgG2a conforme produzido por um hibridoma que possui o Número de Acesso da ATCC HB10763. 2 (
- 4. - Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, carac terizado pelo facto de a proteína da superfície celular possuir um peso molecular de aproximadamente 100 kDa.
- 5. - Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, cara£ terizado pelo facto de a proteína da superfície celular ser uma proteína glicosilada possuindo uma sequência terminal de resíduos de aminoácidos praticamente correspondente à Sequência I.D. No. 1.
- 6. - Anticorpo de acordo com a reivindicação 5, carajc terizado pelo facto de a proteína superficial possuir um peso molecular de cerca de 116 kDa.
- 7. - Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, carac^ terizado pelo facto de o polipêptido ser um fragmento de anticor po susceptível de reagir de maneira imune e de um modo específi co com a proteína da superfície celular do melanoma.
- 8. - Anticorpo de acordo com a reivindicação 7, carac: terizado pelo facto de o fragmento de anticorpo incorporar um fragmento Fab, Fv, Fab' ou FCab'^·
- 9. - Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, carac terizado pelo facto de incorporar também um composto ligado 3funcionalmente ao anticorpo.
- 10.- Anticorpo de acordo com a reivindicação 9, ca-racterizado pelo facto de o composto ser seleccionado entre o grupo constituído por um agente identificador, um fãrmaco, uma toxina, um factor de crescimento, um radionuclido e uma enzima.
- 11. - Anticorpo de acordo com a reivindicação 10, carácter izado pelo facto de o referido fãrmaco ser a dacarbazina.
- 12. - Fragmento de anticorpo, caracterizado pelo facto de ser susceptível de reagir de maneira imune e de um modo especifico com a proteína da superfície celular de melanoma hu mano e de a referida proteína da superfície celular possuir um peso molecular compreendido entre aproximadamente 80 kDa e cerca de 120 kDa.
- 13. - Fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo facto de o fragmento incorporar um fragmento Fab, Fv, Fab1 ou (Fab1^·
- 14. - Composição farmacêutica, caracterizada pelo fa£ to de incorporar um anticorpo que reage de maneira imune e de um modo especifico com uma proteína da superfície celular do melanoma humano, conjuntamente com um veiculo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
- 15.- Composição farmacêutica de acordo com a reivin dicação 14, caracterizada pelo facto de o anticorpo ser de tipo monoclonal possuindo as características de ligação do anticorpo monoclonal ME20, possuindo um isotipo IgGl, que é produzido por um hibridoma que possui o Número de Acesso da ATCC HB10764.
- 16.- Composição farmacêutica de acordo com a reivin dicação 14, caracterizada pelo facto de o anticorpo ser de tipo monoclonal possuindo as características de ligação do anticorpo monoclonal ME20, possuindo um isotipo IgG2a, que é produzido por um hibridoma que possui o Número de Acesso da ATCC HB10763.
- 17, - Composição farmacêutica de acordo com a reivin dicação 14, caracterizada pelo facto de o anticorpo ser um fragmento de anticorpo.
- 18. - Composição farmacêutica de acordo com a reivin dicação 17, caracterizada pelo facto de o fragmento de anticor po incorporar um fragmento Fab, Fv, Fab' ou (Fab1^. 5
- 19. - Método para determinar a presença de células de melanoma humano, caracterizado pelo facto de: a) se fazer contactar células humanas com uma quantidade eficaz de um anticorpo susceptível de reagir de maneira imune e de um modo específico com uma proteína da superfície celular de melanoma humano de modo a proporcionar a ligação desse anticorpo a quaisquer células de melanoma humano presentes; e b) se detectar a ligação do anticorpo à proteína da superfície celular do melanoma.
- 20. - Método de acordo com a reivindicação 19, cara£ terizado pelo facto de o referido anticorpo ser um anticorpo ou um seu fragmento, possuindo características de ligação do anticorpo monoclonal ME20, possuindo um isotipo IgGl que é produzido por um hibridoma que tem o Número de Acesso da ATCC HB10764.
- 21.- Método de acordo com a reivindicação 19, carac terizado pelo facto de o referido anticorpo ser um anticorpo ou um seu fragmento possuindo características de ligação do anticorpo monoclonal ME20, possuindo um isotipo IgG2a que é produzido por um hibridoma que tem o Número de Acesso da ATCC HB10763. 6
- 22. - Método de acordo com a reivindicação 19, carac-terizado pelo facto de a ligação do anticorpo às células do melanoma humano ser determinada pela detecção da presença de meios identificadores funcionalmente ligados ao anticorpo.
- 23. - Método de acordo com a reivindicação 22, carac-terizado pelo facto de o meio identificador ser um radionucli-do.
- 24. - Método de acordo com a reivindicação 22, carac-terizado pelo facto de o meio identificador ser uma marca fluorescente.
- 25. - Método de acordo com a reivindicação 22, carac-terizado pelo facto de o meio identificador ser uma enzima.
- 26. - Método de acordo com a reivindicação 19, carac-terizado pelo facto de as células e o anticorpo contactarem in vitro.
- 27. - Método de acordo com a reivindicação 21, carac-terizado pelo facto de as células e o anticorpo contactarem in vivo.
- 28.- Método para a localização de células de melanoma 7 fp num paciente, caracterizado pelo facto de se administrar a esse paciente uma quantidade eficaz de um anticorpo susceptível de reagir de maneira imune e de um modo específico com a proteína da superfície celular das células de melanoma humano durante um intervalo de tempo suficiente para que o anticorpo se ligue especificamente às células do melanoma e por se detectar depois a presença de quaisquer células do melanoma com o anticorpo que lhe fica ligado.
- 29. - MétodoNde acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo facto de a presença das células do melanoma ser determinada por detecção da presença do meio identificador funcionalmente ligado ao anticorpo.
- 30. - Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo facto de se determinar a presença das células do melanoma mediante administração ao paciente um reagente susceptí vel de se ligar e de indicar a presença das células do melanoma ligadas ao anticorpo.
- 31. - Método de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo facto de o reagente ser um segundo anticorpo susceptível de se ligar ao anticorpo ligado ao melanoma, estando esse segundo anticorpo funcionalmente ligado ao meio indicador. δ
- 32, - Método de acordo com a reivindciação 29, carac-terizado pelo facto de o meio identificador ser um radioisóto-po.
- 33. - Método para o tratamento do melanoma num pacien te, caracterizado pelo facto de se administrar a esse paciente uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo susceptí vel de reagir de maneira imune e de um modo específico com uma proteína da superfície celular de células de melanoma humano, conjuntamente com um agente quimioterapeutico durante um intervalo de tempo suficiente para inibir a proliferação das células do melanoma.
- 34.- Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo facto de o anticorpo se ligar funcionalmente a um composto seleccionado entre o grupo constituído por um fármaco, uma toxina, um factor de crescimento, um radionuclido e uma enzima.
- 35. - Método de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo facto de o agente quimioterapeutico ser um fãrma-co seleccionado entre o grupo constituído por doxorrubicina, dacarbazina, mitomicina C, cis-platina e uma nitrosoureia.
- 36. - Método de acordo com a reivindicação 34, carac- 9terizado pelo facto de o composto ser um radioisótopo.
- 37. - Péptido praticamente purificado que contém uma região que corresponde praticamente a um domínio de uma proteí^ na da superfície celular do melanoma humano ou de um seu fragmento, caracterizado pelo facto de a referida região ser susceptível de reagir de maneira imune e de um modo específico com o anticorpo monoclonal ME20 tal como produzido pelo hi-bridoma que possui o Número de Acesso da ATCC HB10764 ou o Número de Acesso da ATCC HB10763.
- 38. - Péptido de acordo com a reivindicação 37, carac terizado pelo facto de se ligar funcionalmente a um composto selecciónado entre o grupo constituído por um agente identificador, um fármaco, uma toxina, um factor de crescimento, um radionuclido, um hapteno e uma enzima.
- 39, - Péptido de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo facto de a referida proteína da superfície ce lular do melanoma possuir um peso molecular compreendido entre cerca de 80 kD e cerca de 116 kD e uma sequência terminal de resíduos de aminoãcidos correspondente ã sequência I.D. No. 1.
- 40, - Péptido de acordo com a reivindicação 39, carac terizado pelo facto de conter uma região praticamente corres- 10 pondente a um domínio glicosilado de uma proteína de 100 kD.
- 41.- Péptido de acordo com a reivindicação 39, ca-racterizado pelo facto de conter uma região praticamente correspondente a um domínio glicosilado de uma proteína de 116 kD.
- 42.- Péptido de acordo com a reivindicação 37, ca-racterizado pelo facto de ser produzido por expressão recom-binante.
- 43. - Composição farmacêutica, caracterizada por incorporar um péptido praticamente purificado que contém uma região que corresponde praticamente a um domínio de uma proteína da superfície celular do melanoma humano ou um seu fragmento, sendo essa região susceptível de reagir de maneira imune e de um modo especifico com o anticorpo monoclonal ME20 tal como produzido pelo hibridoma que possui o Número de Acesso da ATCC HB10764 ou o Número de Acesso da ATCC HB10763 e um veículo tolerável sob o ponto de vista fisiologico.
- 44. - Composição imunogênica, caracterizada pelo fac^ to de incorporar um péptido praticamente purificado que contém uma região que corresponde praticamente a um domínio de uma proteína da superfície celular do melanoma humano ou um 11seu fragmento, sendo essa região susceptível de reagir imunemente com um anticorpo que possui as características de ligação do anticorpo monoclonal ME20 tal como produzido por um hibridoma que possui o Número de Acesso da ATCC HB10764 ou o Número de Acesso da ATCC HB10763 e um agente intensificador da resposta imune.
- 45. - Composição de acordo com a reivindicação 44, caracterizada pelo facto de o agente intensificador da resposta imune estar ligado funcionalmente ao péptido.
- 46. - Composição de acordo com a reivindicação 44, caracterizada pelo facto de o agente intensificador da resposta imune ser um hapteno.
- 47. - Composição de acordo com a reivindicação 44, caracterizada pelo facto de o agente intensificador da resposta imune ser um adjuvante tolerável sob o ponto de vista fisio lógico.
- 48. - Composição de acordo com a reivindicação 47, caracterizada pelo facto de o adjuvante ser alúmen.
- 49. - Método para induzir uma resposta imune num paciente dirigido a um melanoma humano, caracterizado pelo facto 12de se administrar a esse paciente uma quantidade imunogénica de um peptido que contém uma região que corresponde praticamente a um domínio de uma proteína da superfície celular do melanoma humano, ou um seu fragmento, sendo essa região susceptível de reagir imunemente com um anticorpo que possui as característi-cas de ligação do anticorpo monoclonal ME20 tal como produzido por um hibridoma que possui o Número de Acesso da ATCC HB10764 ou o Número de Acesso da ATCC HB10763.
- 50. - Método de acordo com a reivindicação 49, carac: terizado pelo facto de se administrar adicionalmente ao paciente um agente intensificador da resposta imune.
- 51. - Estojo utilitário, caracterizado por compreender : a) uma embalagem que contêm um anticorpo ou um seu fragmento que de modo específico reage imunemente com uma proteína da superfície celular do melanoma humano; e b) instruções para a sua utilização.
- 52. - Estojo utilitário de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo facto de o anticorpo possuir as caracte-rísticas de ligação do anticorpo monoclonal ME20 produzido por um hibridoma que possui o Número de Acesso da ATCC HB10764 ou 13o Número de Acesso da ATCC HB10763.
- 53.- Estojo de acordo com a reivindicação 51, carac-terizado pelo facto de compreender também uma embalagem que contém um péptido praticamente purificado que contém uma região que corresponde praticamente a um domínio de uma proteína da superfície celular do melanoma humano, ou um seu fragmento, sendo essa região susceptível de reagir de maneira imune e de um modo específico com o anticorpo monoclonal ME20 tal como produzido pelo hibridoma que possui o Número de Acesso da ATCC HB10764 ou o Número de Acesso da ATCC HB10763.
- 54.- Estojo utilitário, caracterizado pelo facto de compreender: a) uma embalagem que contém um péptido praticamente purificado que contém uma região que corresponde praticamente a um domínio de uma proteína da superfície celular do melanoma humano, ou um seu fragmento, sendo essa região susceptível de reagir de maneira imune e de um modo específico com o anticorpo monoclonal ME20 tal como produzido pelo hibridoma que possui o Número de Acesso da ATCC HB10764 ou o Número de Acesso da ATCC HB10763; e b) instruções para a sua utilização. Oliciuí do Propriedade Industrio.14 14RESUMO "ME20: ANTICORPOS MONOCLONAIS E ANTIGÊNEOS PARA O MELANOMA HUMANO" A presente invenção refere-se a uma nova clas^ se de moléculas polipeptídicas, incluindo anticorpos, que reagem de maneira imune e de um modo específico com uma proteína da superfície celular que ê detectavel nas células dos tumores do melanoma humano, conjuntamente com péptidos específicos correspondentes aos domínios imunorreactivos das proteínas da superfície celular. A invenção descreve também métodos para dete£ tar e para tratar o melanoma humano. Ό Agenfe Ohcial da Propriedade Industriai
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| BB1A | Laying open of patent application |
Effective date: 19930413 |
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| FC3A | Refusal |
Effective date: 19990408 |