PT107663B - Processo para a purificação de minicírculos - Google Patents
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Abstract
A PRESENTE INVENÇÃO DESCREVE UM PROCESSO PARA A PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DE MINICÍRCULOS SUPERENROLADOS QUE É FACILMENTE TRANSFERÍVEL PARA A ESCALA INDUSTRIAL. ESTES MINICÍRCULOS PODEM SER UTILIZADOS PELAS INDÚSTRIAS DA BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL E DA SAÚDE, ESPECIFICAMENTE NOS CAMPOS DA VACINAÇÃO POR DNA, DA TERAPIA CELULAR E GÉNICA E DA PRODUÇÃO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES EM CÉLULAS ANIMAIS.
Description
PROCESSO PARA A PURIFICAÇÃO DE MINICÍRCULOS
Campo da invenção
Campo técnico em que a invenção se insere
A presente invenção descreve processos para a purificação de minicirculos (4) de DNA de cadeia dupla superenrolados que contêm todas as unidades funcionais necessárias para a expressão de genes em células eucarióticas. Estes minicirculos (4) podem ser utilizados nos campos da vacinação por DNA, da terapia celular e génica e da produção de proteínas recombinantes em células animais via transfeção transiente. A invenção refere-se ao campo técnico da Engenharia Bioquímica/Biotecnologia.
Estado da técnica
Inúmeros trabalhos têm sido desenvolvidos nos últimos 20 anos em torno da utilização de vetores de DNA plasmídico para transferir e expressar genes de forma transiente em células e tecidos animais, quer em ambiente laboratorial, quer in vivo. Esta capacidade é crucial para um número de aplicações médicas e biotecnológicas. Por exemplo, a transferência de genes pode ser usada potencialmente: i) em terapia génica, para tratar doenças adquiridas (p. ex. cancro, SIDA) e desordens do foro genético (p. ex. fibrose quística), ii) na vacinação por DNA, para imunizar contra doenças infeciosas (p. ex. gripe, malária, etc.) e iii) na produção de proteínas recombinantes (p. ex. anticorpos) por cultivo de células animais em biorreatores.
vetor de DNA plasmidico típico contém regiões de origem bacteriana, que são necessárias para a sua produção num hospedeiro bacteriano, e uma cassete de expressão eucariótica, que é responsável pela produção do antigene ou da proteína de interesse em células animais. As sequências de DNA bacteriano (p. ex. a origem de replicação) e os genes necessários para a propagação dos vetores plasmídicos em células microbianas (p. ex. uma marca de seleção por antibiótico) constituem uma preocupação para as agências reguladoras uma vez que existe o risco de poderem ser adquiridas por Enterobacteriacea que vivem no trato intestinal dos sujeitos humanos e animais, e a partir daí disseminadas para outras espécies via transferência horizontal de genes.
Além disso, aquelas sequências podem prejudicar de forma severa a expressão da função codificada na cassete de expressão eucariótica. Por exemplo, o auge da expressão mediada por vetores plasmídicos, que tipicamente ocorre nas primeiras 48 horas após a transfeção das células animais, normalmente começa a decair de forma dramática devido ao silenciamento da expressão do transgene. Este silenciamento encontra-se relacionado com a presença de motivos citosinafosfato-guanina não-metilados (CpG) nas referidas sequências bacterianas que, ao estimular o sistema imune inato e a produção de citocinas, reprimem a expressão. As sequências bacterianas no vetor plasmidico podem também contribuir para silenciar a expressão ao formarem heterocromatina, uma forma de DNA altamente compacta que se propaga em direção a regiões reguladoras necessárias para a expressão eucariótica. Esta forma densa de DNA não permite a ligação de fatores de transcrição, inibindo assim a expressão da função genética codificada no transgene.
Os minicirculos são vetores de transferência de genes derivados de DNA plasmidico que contêm apenas a cassete de expressão eucariótica. Estes vetores já demonstraram um desempenho superior na transferência de genes quando comparados com os vetores plasmidicos convencionais. Para lá da maior segurança biológica devida à ausência das referidas sequências bacterianas, o menor tamanho dos minicirculos traduz-se também numa biodisponibilidade superior e numa expressão mais prolongada do transgene (Schleef et al., 2008).
Os minicirculos são produzidos in vivo por recombinação intramolecular especifica de um plasmideo parental (PP) através de dois locais de reconhecimento especifico que flanqueiam a cassete de expressão eucariótica. Este evento de recombinação origina duas moléculas superenroladas de DNA plasmidico: i) um minicirculo (MC) contendo a cassete de expressão eucariótica necessária para a expressão do transgene alvo nas células animais destinatárias e ii) um miniplasmideo replicante (MP) contendo os elementos bacterianos indesejáveis (Figura 2). Os minicirculos têm sido produzidos in vivo em estipes hospedeiras de Escherichia coli (E. coli) com o auxilio de diferentes recombinases expressas sob a ação de promotores induziveis. Por exemplo, a integrase do fago λ (Darquet et al., 1999) é induzida por um aumento de temperatura até 42°C que inativa a proteína cI587 repressora do promotor, enquanto a recombinase Cre, a integrase φΟ31 (e.g. Chen et al., 2003) e a resolvase ParA (e.g. Kobelt et al., 2012) são reguladas pelo sistema de expressão pBAD/araC.
Conseguir a recombinação de plasmideos parentais in vivo não é um processo trivial. Por exemplo, a colocação de uma cópia do gene de uma recombinase no cromossoma de E. coli (Bigger et al., 2001; Darquet et al., 1999, 1997; Kreiss et al., 1998) resultou numa eficiência de recombinação baixa, da ordem dos 60 %. Jechlinger e colaboradores, entre outros, demonstraram que uma recombinação completa pode ser obtida se cada plasmídeo parental codificar a sua própria recombinase (Jechlinger et al. , 2004) . Só quando dez cópias da integrase φΟ31 foram colocadas no cromossoma da estirpe hospedeira de E. coli é que todos os plasmídeos parentais recombinaram nos minicírculos e miniplasmídeos correspondentes (Kay et al., 2010) . O tipo de estirpe, o número de cópias do gene que codifica a recombinase em questão e a estratégia de fermentação são outros fatores que influenciam a eficiência de recombinação.
Para lá da recombinação propriamente dita, um dos desafios mais importantes numa ótica de produção consiste na purificação dos minicírculos das impurezas do hospedeiro (i.e. proteínas, DNA genómico, RNA, lipopolissacáridos) e dos subprodutos da recombinação (i.e. miniplasmídeo e plasmídeos parentais que não recombinaram) (Schmeer et al., 2008). Os primeiros protocolos de purificação descritos na literatura dependiam da linearização dos miniplasmídeos e dos plasmídeos parentais não recombinados por intermédio de endonucleases de restrição, seguida de uma ultracentrifugação em gradiente de densidade de cloreto de césio-brometo de etídio (CsCl-EtBr). Os rendimentos máximos obtidos com este método laborioso são da ordem de 1 mg de minicírculo por litro de cultura bacteriana (Bigger et al, 2001; Chen et al, 2003; Darquet et al. , 1997; Kreiss et al., 1998). Os fragmentos lineares obtidos após restrição podem também ser separados dos minicírculos superenrolados por eletroforese em gel de agarose (Nehlsen et al., 2006) .
Chen e colaboradores desenvolveram uma estratégica elegante de um passo apenas para purificar minicirculos que depende: i) da expressão simultânea da integrase PhiC31 e da endonuclease I-Scel sob controlo do sistema pBAD/araC e ii) da presença na sequência do miniplasmideo de um local de reconhecimento de 18 pares de bases para a endonuclease IScel (Che net al., 2005b). Com este sistema, a recombinação in vivo do plasmideo parental em minicirculo e miniplasmideo é seguida da restrição in vivo mediada pela enzima I-Scel do miniplasmideo e da degradação subsequente dos fragmentos lineares de DNA resultantes por nucleases bacterianas. Numa situação ótima, os lisados obtidos destas células estarão deste modo livres de plasmideos parentais e de miniplasmideos e assim os minicirculos poderão ser isolados e purificados por intermédio de um kit convencional de purificação de plasmideos. A co-expressão da integrase do bacteriófago PhiC31 e da endonuclease IScel resulta normalmente em rendimentos baixos já que um grande número de plasmideos parentais é destruído antes da formação dos minicirculos por recombinação. De modo a contornar este problema, Chen e colaboradores inseriram duas cópias adicionais de pBAD-PhiC31 na região bacteriana do plasmideo parental e usaram uma temperatura baixa de 32°C e um pH baixo de modo favorecer a recombinação e depois uma temperatura mais elevada de 37°C e a adição de meio Luria-Bertani (LB) fresco a pH 8 para aumentar a atividade da I-Scel. Estes esforços para desacoplar a recombinação da linearização foram recompensados com rendimentos de até 1.8 mg de minicirculo por litro e com purezas de minicirculo da ordem dos 95% (Chen et al. , 2005). O método foi ainda melhorado inserindo dez cópias de pBAD-PhiC31 e seis cópias de pBAD-I-Scel no cromossoma da estirpe BW27783 de E. coli. Como resultado obtiveram-se rendimentos globais na ordem de 3,4- 4,8 mg minicirculos/L com 0,4-1,5% de impurezas (Kay et al., 2010) . Graças a esta nova estirpe o método de produção de minicirculos foi grandemente simplificado, tornando-se comparável em termos de complexidade aos métodos laboratoriais de produção de plasmideos convencionais. Apesar destas melhorias, o rendimento e pureza dos minicirculos permanece altamente dependente da fisiologia da estirpe hospedeira e dos fatores ambientais dominantes durante o crescimento, replicação recombinação.
Em 2008, Mayrhofer e colaboradores introduziram um protocolo muito eficiente de purificação de minicirculos baseado em cromatografia que explora interações de afinidade proteina-DNA (Mayrhofer et al. , 2008) . O método depende da integração de dois locais lacOs (locais do operador da lactose) no plasmideo parental, numa posição localizada na região do minicirculo. Os locais lacOs são pequenas sequências de reconhecimento que possuem elevada afinidade para a proteína repressora do operão da lactose (repressor LacI). O repressor LacI foi então sintetizado, modificado por biotinilação e imobilizado em partículas porosas de Sepharose contendo estreptavidina tetramérica covalentemente ligada de modo a construir uma matriz cromatográfica com afinidade seletiva para os minicirculos com locais lacOs. As amostras contendo os minicirculos e miniplasmídeos foram então purificadas levando a cabo uma separação cromatográfica no modo ligação-lavagem-eluição habitual. A ligação não específica do miniplasmídeo (i.e. plasmideos sem locais lacOs) foi minimizada aumentando a concentração de NaCl no tampão de lavagem até 400 mM. Os minicirculos foram então eluídos com um tampão contendo 50 mM de Tris, pH 8, 500 mM de NaCl e 5 mM de isopropil β-D-l tiogalactopiranosideo (IPTG). A capacidade da coluna foi em média de 0,184 ± 0,045 mg de minicirculo por mL de matriz cromatográfica. Uma análise quantitativa por reação de polimerização em cadeia (q-PCR) revelou que o DNA eluido após um único passo de purificação com a matriz de afinidade com repressor LacI imobilizado consistia em 98,8% de minicirculo, 1% de miniplasmideo e 0,2% de plasmideo parental (Mayrhofer et al., 2008) . Este método apresenta-se assim como uma opção promissora para purificar minicirculos, originando um produto que vai de encontro às recomendações das agências reguladoras em termos de qualidade final. No entanto, o método não é capaz de separar minicirculos de plasmideos parentais não recombinados já que as duas moléculas contêm os locais lacOs de reconhecimento. Isto significa que é necessária uma recombinação altamente eficiente de modo a obter no final minicirculos livres de plasmideos parentais.
A patente US8236548B2 descreve um protocolo de produção de minicirculos que utiliza uma estirpe que contém os genes que codificam para a recombinase PhiC31 e para a endonuclease I-Scel. A expressão simultânea destes dois enzimas é necessária para i) recombinar o plasmideo parental em minicirculo e miniplasmideo e ii) linearizar especificamente o miniplasmideo e as moléculas de plasmideo parental não recombinadas in vivo. As moléculas de DNA linearizadas assim obtidas são concomitantemente digeridas por nucleases bacterianas de tal modo que no final do processo de cultura celular as células contêm apenas minicirculos.
A patente EP1620559B1 descreve um método de purificação de minicirculos que explora interações de afinidade DNA proteína. A estrutura do minicírculo contém dois locais lacOs que possuem grande afinidade para a proteína repressora do operão da lactose (LacI) . A captura dos minicírculos a partir de uma mistura complexa é conseguida utilizando suportes cromatográficos com LacI imobilizada.
A patente US7622252B2 descreve um método de produção de minicírculos que utiliza uma estirpe bacteriana sob condições tais que a atividade de topoisomerase IV é inibida, produzindo-se assim uma variedade de minicírculos e miniplasmídeos concatenados. Os minicírculos superenrolados são então libertados dos catenanos utilizando uma enzima de restrição que lineariza o miniplasmídeo e purificados subsequentemente por um método do estado da arte como a cromatografia ou a eletroforese em gel.
A patente EP2439276 descreve um processo para a preparação de um vetor de DNA circular na forma superenrolada que utiliza um plasmídeo parental que contém a sequência de interesse flanqueada por dois locais de restrição. Após produção num hospedeiro bacteriano, os plasmídeos parentais são linearizados in vitro com uma enzima de restrição que reconhece os referidos locais e a sequência de interesse é purificada e circularizada. Após purificação dos outros produtos de ligação, a molécula de DNA circular relaxada é enrolada por intermédio de uma girase de modo a produzir a molécula de DNA superenrolada.
De acordo com o exposto, existe a necessidade de desenvolver um processo de produção e purificação de minicírculos de DNA livres das impurezas do hospedeiro dos subprodutos da recombinação, que seja facilmente transferível para a escala industrial.
Sumário
Os minicírculos (4) são pequenas moléculas de DNA circular que podem ser usadas para transferir e expressar transientemente genes em células animais. Os perfis de segurança e eficiência únicos dos minicírculos (4) torna—os especialmente úteis em aplicações nos campos da vacinação por DNA, da terapia celular e génica e da produção de proteínas recombinantes em células animais. A aplicação dos minicírculos (4) nestas áreas tem sido dificultada pela inexistência de tecnologias de produção capazes de gerar as quantidades da ordem dos gramas/quilogramas necessárias para levar a cabo ensaios pré-clínicos e clínicos ou para montar campanhas de produção de proteínas recombinantes. A presente invenção descreve um método de produção e purificação de minicírculos (4) que pode ser transposto para a escala industrial.
Descrição detalhada da invenção
A invenção refere-se a um processo adequado à purificação de minicírculos (4) superenrolados que é facilmente transferível para a escala industrial. Estes minicírculos (4) são moléculas de DNA circular superenroladas que contêm uma cassete de expressão eucariótica funcional e que são livres de sequências bacterianas e outras impurezas. Estes minicírculos (4) podem ser usados como vetores de entrega de genes nos campos da vacinação por DNA, da terapia celular e génica e da produção de proteínas recombinantes em células animais.
A característica única do processo aqui descrito é que os minicírculos (4) podem ser produzidos com elevado grau de pureza, livres de miniplasmideos (5) ou de plasmideos parentais (3) , recorrendo a processos cromatográficos genéricos (p. ex., cromatografia de permuta iónica ou cromatografia de interação hidrofóbica). Esta caracteristica contribui grandemente para a facilidade de aumentar a escala do processo, tornando possível pela primeira vez antever a possibilidade de manufaturar grandes quantidades de minicírculos (4) de forma económica.
termo DNA plasmídico (pDNA) ou vetor plasmídico ou plasmídeo, refere-se a uma unidade genética extracromossómica composta por uma dupla cadeia de ácido desoxirribonucleico capaz de replicação autónoma intracelular.
termo plasmídeo parental (3) refere-se à molécula de plasmídeo (pDNA) composta por uma cassete de expressão eucariótica funcional flanqueada por dois locais de resolução de multímeros reconhecidos pela resolvase para, e pelas sequências bacterianas essenciais à propagação do plasmídeo no hospedeiro bacteriano. A parte bacteriana do plasmídeo parental (3) possui vários locais de reconhecimento específico para endonucleases de restrição com capacidade para introduzir cortes duplos (e.g. PvuII) ou simples (e.g. Nb.BbvCI) na cadeia açúcar fosfato do DNA.
termo minicírculo (4) refere-se a um plasmídeo possuindo a cassete de expressão eucariótica funcional que adicionalmente pode possuir outros elementos eucarióticos funcionais e um dos locais de resolução multiméricos.
termo miniplasmídeo (5) refere-se a um plasmídeo derivado do plasmídeo parental (3) que possui locais de reconhecimento especifico para endonucleases de restrição em localizações regulares ao longo da sequência e um dos locais de resolução multiméricos.
termo produtos de recombinação refere-se às moléculas de DNA covalentemente circularizadas que são obtidas depois da recombinação intramolecular do plasmideo parental (3) , nomeadamente minicirculo (4), miniplasmideo (5) e plasmideo parental (3) não recombinado residual.
termo locais de reconhecimento especifico para endonucleases refere-se a locais no miniplasmideo (5) que são reconhecidos por endonucleases de restrição, que concomitantemente modificam a estrutura dos miniplasmideos (5) por ação enzimática especifica (e.g. restrição simples ou dupla da cadeia de DNA) . Tais sequências são geneticamente introduzidas de modo a ser possível hidrolisar o miniplasmideo (5) em pequenos fragmentos lineares de DNA (6) ou transformar o miniplasmideo (5) superenrolado em miniplasmideo (5) relaxado.
Em algumas concretizações da invenção as enzimas de restrição são especificamente a enzima PvuII ou a enzima Nb.BbvCI.
termo fragmentos lineares de DNA (6) refere-se aos produtos da hidrólise enzimática do miniplasmideo (5) e do plasmideo parental (3) por ação de endonucleases de restrição que cortam as duas cadeias de DNA.
termo miniplasmideo (5) relaxado refere-se ao produto da hidrólise enzimática do miniplasmideo (5) superenrolado por ação de endonucleases de restrição que cortam apenas uma das duas cadeias de DNA.
termo moléculas derivadas dos miniplasmideos (5) refere-se a fragmentos lineares de DNA (6) e/ou a miniplasmideo (5) relaxado.
momento de densidade celular adequada refere-se ao momento que antecede a fase exponencial do crescimento celular, o qual pode ter uma duração mais ou menos extensa consoante o estado fisiológico da cultura usada como inoculo e as condições de crescimento. Este momento deve ser entendido como a fase estacionária inicial do crescimento celular.
plasmideo parental (3) no cerne do processo que aqui se descreve é construído para que seja possível obter minicirculos (4) com grau de pureza elevado e adequado a aplicações farmacêuticas, por um processo baseado em etapas cromatográficas que é fácil de implementar à escala industrial. As etapas do processo usado para produzir os minicirculos (4) são mostradas de forma esquemática na Figura 1.
plasmideo parental (3) contém: i) o polinucleótido de interesse, tipicamente uma cassete de expressão eucariótica que contém o gene alvo adequado à aplicação em causa, flanqueado por dois locais de recombinação orientados que são reconhecidos por uma recombinase específica e ii) um esqueleto com sequências de origem essencialmente bacteriana contendo os elementos necessários para a propagação do plasmideo parental (3) num hóspede bacteriano, incluindo uma origem de replicação e uma marca de seleção, que contém pelo menos um e geralmente vários locais de restrição (simples ou dupla) que não estão presentes no polinucleótido de interesse e nos locais de recombinação (Figura 2) . Este plasmideo parental (3) é primeiramente usado para transformar um estirpe bacteriana adequada à produção de DNA plasmidico, normalmente deficiente em endonuclease I funcional e em recombinase A (p. ex. Escherichia coli DH5a).
As etapas do processo de produção e purificação, objeto da presente invenção, são descritas em seguida:
Etapa 1: Fermentação + recombinação.
As células de E. coli contendo o plasmideo parental (3) são crescidas normalmente em balões de Erlenmeyer ou num fermentador, usando meios de cultura, temperatura e pHs adequados. 0 valor do pH deverá ser mantido entre 7 e 8, especialmente durante o processo de recombinação intramolecular. 0 crescimento é deixado progredir até se atingir uma densidade celular e fase de crescimento adequada (p. ex. fase estacionária inicial) de modo a maximizar os rendimentos de plasmideo parental (3). A recombinação intramolecular do plasmideo parental (3) em minicirculo (4) e miniplasmideo (5) é então despoletada introduzindo um fator de indução na cultura celular. 0 crescimento é mantido por um período de tempo suficiente para maximizar a eficiência de recombinação.
plasmideo parental (3) usado nesta invenção contém os locais de resolução multimérica (MRS) do operão parABCDE do plasmideo de largo espetro RK2. A recombinase específica que atua sobre os MRS é a resolvase ParA (1) cuja expressão se encontra sob o controlo do sistema pBAD/araC (Figura 3). As cassetes de DNA responsáveis pela recombinação (quer a pBAD/araC-parA quer a pBAD/araC-RBS-parA, que contém um local sintético de ligação ao ribossoma (RBS)) podem ser colocadas: 1) no plasmideo parental (3), 11) num plasmideo ajudante de baixo número de cópias que contém uma origem de replicação distinta daquela que se encontra no plasmideo parental (3) ou iii) no cromossoma do hospedeiro bacteriano usado para a propagação do plasmideo.
A proteína AraC atua negativamente na ausência de arabinose, inibindo a expressão da resolvase ParA (1) a partir do promotor BAD. Quando presente, a L-( + )arabinose (2) liga-se à AraC, estimulando de forma positiva a expressão da resolvase ParA (1) (Figura 3) . A glucose, e numa fase posterior os baixos niveis de cAMP, inibem a expressão descontrolada da resolvase ParA (1) a partir do promotor pBAD, prevenindo a ocorrência de recombinação prematura. Uma vez que os miniplasmideos (5) contêm a origem de replicação, este controlo apertado da expressão da resolvase ParA (1) é imprescindível para impedir que os miniplasmideos (5) se propaguem e sobreponham aos plasmideos parentais (3) , conduzindo assim à perda de minicirculos (4). Normalmente adiciona-se 0,5%-l% de glucose ao meio de cultura durante a preparação dos bancos celulares, crescimento de pré-inóculos e manipulação de plasmideos de modo a garantir que o plasmideo parental (3) se mantém intacto e predominante nas células.
A indução da resolvase ParA (1) a partir das cassetes de expressão descritas acima é efetuada por intermédio da adição de L-( + ) arabinose (2) ao meio de cultura a pH 7-8 e 37°C. A resolvase ParA (1) expressa catalisará então a recombinação intramolecular especifica dos dois MRS que flanqueiam a cassete de expressão no plasmídeo parental (3) (Figura 4) . Este evento origina duas moléculas de DNA circular fechado superenroladas: i) um minicírculo (4) (MC) que contém a cassete de transcrição eucariótica necessária para expressar o gene alvo e ii) um miniplasmídeo (5) replicativo (MP) que contém as sequências de origem bacteriana indesejadas (Figura 4). 0 processo de recombinação é deixado ocorrer por um tempo suficiente para maximizar a sua eficiência.
Nesta invenção, o controlo de expressão pelo sistema pBAD/araC foi ainda melhorado utilizando uma estire de E. coli (BW27783) otimizada para incorporar arabinose (Khlebnikov et al., 2001). Estas células expressam continuamente o transportador de membrana AraE que entrega a arabinose de modo rápido e uniforme no interior das células, eliminado assim a indução tudo-ou-nada do pBAD. Como resultado podem ser usadas quantidades muito menores de L-(+)arabinose (2) (cerca de 10000 vezes menos) para induzir o pBAD.
Etapa 2: Preparação dos produtos de recombinação.
Após a recolha, as células de E. coli sofrem um processo de rutura celular, por exemplo por lise alcalina, mecânica, térmica ou enzimática, que permite libertar os produtos de recombinação, minicírculo (4) e miniplasmídeo (5) das células. Os lisados obtidos são então tratados de modo a proporcionarem as condições ambientais adequadas para promover a atividade das endonuclease de restrição selecionadas sobre os miniplasmídeos (5). Em algumas situações o tratamento envolve a adição de isopropanol aos lisados de modo a promover a precipitação dos plasmídeos parentais (3), miniplasmideos (5), minicirculos (4) e DNA em geral. Após centrifugação e re-solubilização dos precipitados de DNA num tampão adequado, a restrição enzimática pode ser efetuada diretamente nos lisados clarificados, adicionando quantidades apropriadas das enzimas de restrição selecionadas. Preferencialmente, e de modo a obter minicirculos (4) com grau de pureza elevado, os produtos de recombinação são primeiramente isolados por um processo que utiliza cromatografia de interação hidrofóbica. Uma etapa de cromatografia de exclusão molecular é então usada para substituir o tampão por outro mais adequado à hidrólise enzimática que se segue. A preparação dos produtos de recombinação antes da hidrólise enzimática poderá também ser efetuada usando qualquer técnica de purificação descrita no estado da arte (e.g. cromatografia de permuta iónica).
Etapa 3: Hidrólise enzimática in vitro do miniplasmideo (5) e do plasmideo parental (3) por endonucleases de restrição.
Nesta etapa, a mistura de produtos de recombinação obtida na etapa anterior é sujeita a uma reação de hidrólise enzimática seletiva in vitro, por ação de endonucleases de restrição, tendo em vista a modificação da estrutura das moléculas de miniplasmideo (5) e de plasmideo parental (3) não recombinado. São utilizadas endonucleases de restrição que atuam sobre os locais de reconhecimento especifico para endonucleases que foram colocados na porção bacteriana do plasmideo parental (3).
Numa das concretizações da invenção, utilizam-se enzimas de restrição especificas que atuam cortando as duas cadeias de DNA por meio de duas incisões, uma em cada uma das cadeias açúcar-fosfato (e.g. PvuII), originando assim fragmentos lineares de DNA (6) de cadeia dupla.
No caso do plasmídeo pMINI8, descrito esquematicamente na Figura 2, a hidrólise com a endonuclease de restrição PvuII produz fragmentos de DNA lineares curtos com tamanhos entre 337 e 414 pares de bases (pb), que têm origem no miniplasmídeo, e fragmentos com 337 e 414 pares de bases mais um fragmento com (x + 281) pares de bases, que têm origem em plasmídeos parentais (3) que possam estar presentes na mistura, onde x corresponde ao tamanho do minicírculo (4) (que depende do gene de interesse que foi clonado) (Figura 5).
A restrição enzimática pode ser levada a cabo por adição de quantidades adequadas da enzima de restrição ao lisado clarificado que contém os produtos de recombinação ou às soluções que contêm os produtos de recombinação purificados. A temperatura ótima para a enzima de restrição PvuII é de 37°C e a restrição é conduzida durante 1-8 horas por adição de 0,5-4,0 unidades de enzima por μρ de plasmídeo total num tampão adequado. Desejavelmente os fragmentos de DNA linearizados deverão ser tão pequenos quanto possível de modo a maximizar a separação das moléculas de minicírculo (4) das impurezas de DNA durante os passos cromatográficos subsequentes.
Em algumas concretizações da invenção, fragmentos lineares de DNA (6) adicionais mais pequenos ou maiores poderão surgir consoante a construção do plasmídeo parental (3) e o local onde a cassete pBAD/araC-parA de expressão da resolvase ParA (1) é colocada. Se a cassete de expressão da resolvase ParA (1) for colocada num plasmídeo ajudante de baixo número de cópias que também contenha locais de restrição PvuII, esse plasmideo será também digerido, originado um conjunto de fragmentos de restrição próprio. Se a cassete for colocada no plasmideo parental (3) , o conjunto de fragmentos gerado a partir da restrição do miniplasmideo (5) e do plasmideo parental (3) também virá alterado. Nesse caso, modificações genéticas adicionais deverão ser consideradas para criar locais de restrição PvuII adicionais de modo a que seja possível manter uma separação satisfatória entre minicírculos (4) e fragmentos lineares de DNA (6) durante o processo de separação subsequente. Alternativamente, locais de restrição diferentes reconhecíveis por outras endonucleases de restrição que não a PvuII, que atuam cortando as duas cadeias de DNA, podem ser colocados no plasmideo parental (3) em locais ligeiramente diferentes.
Noutras concretizações da invenção, poderão utilizar-se endonucleases de restrição específicas que atuam cortando apenas uma das cadeias de DNA (e.g. Nb.BbvCI), em alternativa a endonucleases de restrição que produzem fragmentos lineares de DNA (6) a partir do miniplasmideo (5). Nestes casos, os miniplasmídeos (5) superenrolados são transformados em miniplasmídeos (5) relaxados, que poderão posteriormente ser separados das moléculas de minicírculo (4) superenrolado por uma técnica cromatográfica adequada.
A endonuclease de restrição (simples ou dupla) poderá ser uma enzima pura disponível comercialmente ou uma enzima produzida em células bacterianas pela tecnologia de DNA recombinante. Neste último caso, uma enzima parcialmente purificada poderá ser suficiente para que se obtenha uma hidrólise completa dos produtos de recombinação.
Etapa 4: Separação dos minicírculos (4) dos produtos da hidrólise enzimática.
Nesta etapa, os minicírculos (4) superenrolados são separados das moléculas derivadas dos miniplasmídeos (5), plasmídeos parentais (3) não recombinados obtidas na etapa anterior de hidrólise enzimática selectiva in vitro e de outras impurezas do processo.
Numa das concretizações da invenção, a separação robusta, reprodutível e escalável dos fragmentos lineares de DNA (6) obtidos por ação de enzimas de restrição específicas que atuam cortando as duas cadeias de DNA por meio de duas incisões, dos minicírculos (4) superenrolados foi conseguida através: (i) da modificação do plasmídeo parental (3) de modo a obter fragmentos de DNA após a hidrólise de miniplasmídeos (5) e plasmídeos parentais (3) com tamanhos que facilitam a separação cromatográfica dos minicírculos (4), (ii) de ligandos de permuta aniónica DEAE (dietil aminoetil) que separam as moléculas de DNA com base na sua densidade de carga, que por sua vez é função do seu comprimento e (iii) de um suporte cromatográfico que permite uma separação escalável, robusta e simples dos minicírculos (4) .
Numa das concretizações da invenção, um monólito de permuta aniónica DEAE é utilizado para purificar de forma eficiente os minicírculos (4) dos fragmentos lineares de DNA (6) . Um monólito típico consiste num leito contínuo feito de um bloco de material sólido altamente poroso com poros com tamanhos de 600-750 nm (Smrekar et al. , 2010, Urthaler et al. , 2005). A principal característica destes monólitos é permitirem que a fase fluida se escoe através desses grandes poros, aumentando em consequência o transporte de massa por convecção comparativamente aos processos lentos de difusão que prevalecem nas partículas cromatográficas convencionais. Por outro lado, os plasmideos são moléculas relativamente grandes (eixos de super-hélices com dimensões em torno de 560-1700 nm para plasmideos de 4 a 12 kilo pares de bases) que tipicamente adsorvem na superfície exterior das partículas cromatográficas. Por comparação, no caso dos monólitos a área disponível para adsorção de moléculas de plasmideos é consideravelmente maior (Smrekar et al., 2010) . Acresce ainda que as separações em monólitos são extremamente rápidas, como consequência dos caudais elevados a baixas pressões a que é possível operar, sendo normalmente caracterizadas por elevadas capacidades de ligação, rendimentos e resolução. Estas caracteristicas são independentes dos caudais e da escala, o que faz com que os monólitos sejam particularmente adequados a preparação de minicirculos (4) em grande escala.
Na presente invenção foram utilizados monólitos de polimetacrilato disponíveis comercialmente sob o nome Convective Interaction Media (CIM) (BIA Separations, Ljubljana, Slovenia).
Separaram-se 20 μg de produtos de recombinação num monólito CIM-DEAE (BIA Separations, V=0,34 mL) equilibrado com 20 mM Tris-HCl, pH 8, utilizando um gradiente crescente de NaCl de 590 mM a 67 0 mM (24 volumes de coluna, declive do gradiente de 10 %B /min, em que o tampão B contém 1 M de NaCl em 20 mM Tris-HCl, pH 8). Contudo, verificou-se que a resolução da separação diminuiu com o aumento da carga de alimentação (75 μg de pMINI7GFPVEGF) , como se mostra na Figura 7. De modo a aumentar a carga e por conseguinte a produtividade da separação na mesma coluna, o pH da fase móvel foi otimizado como se descreve seguidamente.
grupo amina do permutador aniónico fraco dietil amino etil (DEAE) encontra-se positivamente carregado a pH < 9. A valores de pH mais altos, os grupos DEAE desprotonam-se, perdendo a sua carga. 0 DNA é uma molécula grande fortemente eletronegativa que interage com matrizes de permuta aniónica através de locais múltiplos, estabelecendo uma interação muito forte. A valores elevados de pH, o número de grupos DEAE carregados é menor e portanto menos locais de ligação estão envolvidos na ligação a DNA. É assim possível eluir moléculas de DNA com concentrações de sal mais baixas. Por exemplo, a pH 9 bastou uma concentração de NaCl de 30 6 mM para eluir o DNA comparado com concentrações de 711 mM e 757 mM NaCl a pH 8 e pH 7, respetivamente (Figura 9). Além do mais, a pH 9 a resolução entre os fragmentos curtos de DNA e os minicirculos (4) aumentou, eluindo os dois grupos de molécula com uma diferença de 20 mM de NaCl. Esta diferença permite otimizar a separação por introdução de um gradiente em degrau.
A concentração de sal correspondente à cauda do pico de impurezas foi usada para guiar o estabelecimento de um esquema de eluição em degrau usando tampões 20 mM Tris-HCl, pH 9 (tampão A) e 1 M NaCl em 20 mM Tris, pH 9 (tampão B). Numa experiência típica, 2 mL de uma solução contendo minicirculos (4) e impurezas de DNA digerido (26 μg) foram injetados num monólito CIM-DEAE (0,34 mL) previamente equilibrado à temperatura ambiente com 5 volumes de coluna (CVs) de uma mistura de tampões A e B com uma concentração inicial de NaCl de 210 mM. Os minicirculos (4) foram separados dos fragmentos lineares de DNA (6) de impurezas por intermédio de um gradiente em degrau usando um caudal de 1 mL/min. A concentração de sal necessária para eluir as impurezas variou entre 230 mM e 330 mM de NaCl, dependendo dos lotes de amostra e tampões ou de fatores ambientais como a temperatura. Uma etapa de eluição longa, com uma duração de 15 CVs foi utilizada para garantir uma eluição completa das impurezas mesmo quando se utilizam cargas elevadas. Os minicirculos (4) eluíram durante o degrau de eluição a 40% de tampão B sob a forma de um pico estreito. No final de cada corrida a coluna foi regenerada com 5 CV de uma solução 1 M de NaCl.
O processo de separação de minicirculos (4) de fragmentos lineares de DNA (6) descrito nesta invenção é robusto e passivel de aumento de escala. Estas características tornam-no adequado à produção de quantidades de minicirculos (4) da ordem dos gramas-quilogramas necessárias à condução de ensaios pré-clinicos e clinicos ou ao estabelecimento de campanhas de produção de proteínas recombinantes por transfeção transiente.
A presente invenção pode ser colocada em prática usando outros ligandos e suportes cromatográficos, como monólitos, membranas e partículas, capazes de separar fragmentos lineares de DNA (6) de moléculas de minicirculos (4) superenrolados. Outros suportes monolíticos podem também ser usados como por exemplo monólitos baseados em sílica ou em poliacrilamida. Estes monólitos podem ter tamanhos de poros e densidades de grupos ativos variáveis.
Em algumas concretizações da invenção, quando a hidrólise enzimática é efetuada diretamente nos lisados clarificados e não produtos recombinados purificados, serão necessários passos adicionais de cromatografia para a obtenção final de minicirculos (4) com grau de pureza farmacêutica.
Noutras concretizações da invenção em que se utilizam endonucleases de restrição específicas que atuam cortando apenas uma das cadeias de DNA, os miniplasmídeos (5) relaxados obtidos poderão ser separados das moléculas de minicirculo (4) superenrolado por técnicas cromatográficas conhecidas no estado da arte como sendo capazes de separar isoformas de plasmideos.
Etapa 5: Troca de tampão
Após a separação dos fragmentos lineares de DNA (6) ou dos miniplasmídeos (5) relaxados, os minicirculos (4) purificados encontram-se no tampão utilizado para promover a eluição do suporte cromatográfico. Este tampão é normalmente trocado por um tampão de formulação adequado à utilização final dos minicirculos (4) (p.ex. estudos in vivo e in vitro) . Os métodos conhecidos no estado da arte para trocar tampões de soluções contendo DNA como por exemplo a cromatografia de exclusão molecular, a diálise ou a precipitação de DNA são adequados a este fim.
Descrição das figuras
A Figura 1 descreve esquematicamente o processo usado para produzir e purificar minicirculos (4).
A Figura 2 descreve esquematicamente os plasmideos parentais (3), pMINI5 e pMINI8. As sequências bacterianas contêm uma origem de replicação derivada do plasmideo pUC (pUC ORI), um marcador de seleção de resistência à canamicina (KanR), os locais de restrição PvuII que ocorrem naturalmente e os adicionados por engenharia genética (PvuII), assinaladas a preto. As cassetes de expressão eucariótica funcional contêm um promotor eucariótico (Peuk) , o gene de interesse (GOI) e um sinal de poliadenilação de terminação (poliA), assinalados a cinzento claro. As sequências bacterianas e as cassetes de expressão eucariótica funcional estão flanqueadas, em cada lado, por locais de resolução de multimeros orientados de forma semelhante (MRS), que são reconhecidas por uma recombinase especifica desses locais.
A Figura 3 representa um diagrama esquemático da cassete de DNA que possui a resolvase ParA (1) responsável pela recombinação. 0 gene ParA está sob o controle do promotor BAD (pBAD) e repressor AraC (araC) expressão. A proteína AraC atua negativamente na ausência de arabinose, inibindo a expressão da resolvase ParA (1) regulada pelo promotor BAD. Quando a L-( + ) arabinose (2) está presente, esta ligase à AraC, estimulando positivamente a expressão da resolvase ParA (1). 0 local de ligação ao ribossoma (RBS) é ilustrado no esquema em tamanho não proporcional.
A Figura 4 descreve esquematicamente e a título de exemplo, a formação de minicírculo (4) e miniplasmideo (5) resultante da recombinação do plasmideo parental (3) pMINI8 catalisada pela resolvase ParA (1) induzida por L( + )arabinose (2) . 0 minicírculo (4) contém a cassete de expressão eucariótica e um dos locais de resolução de multimeros e o miniplasmideo (5) contém os elementos bacterianos e um dos locais de resolução de multimeros.
A Figura 5 mostra esquematicamente a hidrólise in vitro pela endonuclease de restrição PvuII de uma mistura contendo, miniplasmídeos (5), minicírculos (4) e plasmídeos parentais (3) . A hidrólise produz fragmentos lineares de DNA (6) pequenos com 337-414 pb, provenientes do miniplasmídeo (5) , e fragmentos de 337-414 pb de comprimento e um fragmento de (x + 281) pb, proveniente do plasmídeo parental (3), onde x é a dimensão de minicírculos (4). Os minicírculos (4) são deixados intactos pela PvuII.
As figuras 6A e 6B ilustram uma hidrólise, pela enzima de restrição PvuII, dos produtos de recombinação presentes em amostras purificadas ou em lisados clarificados.
A figura 6A mostra a análise por eletroforese num gel de agarose de uma mistura obtida por hidrólise com PvuII do plasmídeo parental (3) pMINI8 contendo o gene da GFP, pMINI8GFP purificado. Os plasmídeos recombinados e purificados foram submetidos a hidrólise enzimática durante 1-3 horas a 37 °C por adição de 0,1-1 U da enzima de restrição PvuII (Thermo Scientific) por micrograma de produtos recombinantes, em tampão apropriado (0,1 mL) . O padrão de hidrólise do pMINI8GFP consiste em fragmentos lineares de DNA (6) pequenos, variando em tamanho entre 337 e 414 pb e um fragmento grande de 2162 pb que corresponde ao plasmídeo parental (3) não recombinado.
A figura 6B mostra a análise por eletroforese num gel de agarose de uma mistura obtida por hidrólise com PvuII (0,1— 1 U PvuII/^g durante 1-3 horas a 37 °C) de um lisado clarificado contendo o plasmídeo parental (3) pMINI5GFP (pMINI5 contendo o gene da GFP) e o plasmídeo auxiliar pMMBpar2A. O padrão de hidrólise do pMINI5GFP consiste em fragmentos lineares de DNA (6) de 751, 731, 698, 360 pb a partir do miniplasmideo (5) e um fragmento adicional de 2162 pb pertencente ao plasmideo parental (3) não recombinado. 0 plasmideo ajudante pMMBpar2A também possui cinco locais de clivagem para a enzima PvuII, resultando em fragmentos lineares de DNA (6) de 6414, 3356, 836, 416, 281 e 93 bp. Os últimos quatro fragmentos mencionados possuem uma massa relativa baixa e por isso não são visíveis no gel de agarose. Pista 61- produtos de recombinação purificados. Pista 6ii- produtos de recombinação a partir do lisado clarificado, pista 6iii- hidrólise dos produtos de recombinação presentes nos lisados clarificados, pista 6ivhidrólise dos produtos de recombinação presentes em amostras purificadas, pista M- marcadores de peso molecular.
A figura 7 mostra a separação, obtida por cromatografia num monólito de permuta aniónica DEAE, entre os produtos de recombinação e os fragmentos lineares de DNA (6).
As figuras 7A e 7B ilustram uma separação cromatográfica num disco monólito CIM-DEAE (V=0,34 ml; BIA Separations) de 21 pg de pMINI5GFPVEGF e pMMBpar2A previamente digeridos.
painel A mostra o cromatograma obtido com um gradiente crescente de NaCl 590-670 mM em 24 volumes de coluna (declive do gradiente de 1 % de B/min) . Tampão A: 20 mM Tris-HCl, pH 8, tampão B: 1 M de NaCl em 20 mM Tris-HCl, pH 8. O pico 71 corresponde aos fragmentos pequenos lineares de cerca de 350 pb, o pico 711 contém fragmentos de 750 pb e o pico 7111 corresponde ao minicirculo (4) MC-GFPVEGF superenrolado.
O painel B mostra a análise por eletroforese num gel de agarose (1%) das frações de cada um dos picos. Pista 7ivmistura carregada na coluna, pista M- marcadores de peso molecular, pistas 7i-frações correspondentes ao pico 7i, pistas 7ii-frações correspondentes ao pico 7ii, pistas 7iii-frações correspondentes ao pico 7iii.
As figuras 8A e 8B ilustram uma separação cromatográfica num disco monólito CIM-DEAE (V=0,34 mL; BIA Separations).
painel A mostra o cromatograma obtido com um gradiente crescente de NaCl de 690-770 mM de NaCl em 48 volumes de coluna (declive do gradiente de 0,5 % de B/min.). Tampão A: 20 mM Tris-HCl, pH 8, tampão B: NaCl 1 M (em 20 mM TrisHC1, pH 8) . O pico 8i corresponde aos fragmentos lineares de DNA (6) de cerca de 350 pb, o pico 8ii corresponde aos fragmentos de 750 pb e o pico 8iii corresponde ao minicírculo (4) MC-VEGF superenrolado.
O painel B mostra a análise por eletroforese num gel de agarose (1%) das frações de cada um dos picos. A pista 8iv corresponde aos produtos de recombinação do pMINI7VEGF após a indução, no momento da colheita e, a pista 8v, mostra a mistura digerida com PvuII carregada na coluna. As pistas agrupadas sob as designações 8i, 8ii e 8iii correspondem às frações dos picos 8i, 8ii e 8iii, respetivamente.
A Figura 9 mostra o efeito do pH da fase móvel na ligação, na retenção e na eluição de 13 pg de produtos recombinantes digeridos, na separação cromatográfica realizada num disco monólito CIM-DEAE (BIA Separations) . Com o aumento do pH menos grupos DEAE se apresentam carregados e devido a uma retenção mais fraca, é necessário para eluição do DNA uma concentração de sal mais baixa. %B representa a percentagem de tampão B utilizado.
As figuras 10A e 10B ilustram a separação cromatográfica num disco monólito CIM-DEAE (V=0,34 mL; BIA Separations) de pg de pMINI8GFP (pMINI8 contendo o gene da GFP) previamente digeridos.
painel A mostra o cromatograma obtido com um gradiente crescente de NaCl 210-290 mM em 24 volumes de coluna (declive do gradiente de 1 % de B/min.) Tampão A: 20 mM Tris-HCl, pH 9, tampão B: NaCl 1 M (em 20 mM Tris-HCl, pH 9) . O pico 101, a 7-8 minutos, corresponde a pequenos fragmentos lineares de DNA (6) de cerca de 350 pb e o pico 1011, a 9,5 minutos, corresponde ao minicírculo (4) MC-GFP.
O painel B mostra a análise por eletroforese num gel de agarose (1%) das frações de cada um dos picos. A pista 10111 corresponde à mistura de produtos recombinantes digerida com PvuII carregada na coluna, as pistas 101 correspondem às frações relativas ao pico 101, e as pistas 1011 correspondem às frações relativas ao pico 1011.
As figuras 11A e 11B ilustram a separação cromatográfica num disco monólito CIM-DEAE (V=0,34 mL; BIA Separations) de 48 pg de pMINI8GFP previamente digeridos.
O painel A mostra o cromatograma obtido com uma sucessão de de gradientes em degrau de NaCl: 21 % de B (5 volumes de coluna), 25,9 % de B (15 volumes de coluna), 40 % de B (5 volumes de coluna) e 100% de B (5 volumes de coluna) . Tampão A: 20 mM Tris-HCl, pH 9, tampão B: NaCl 1 M (em 20 mM Tris-HCl, pH 9) . O pico 111 corresponde aos fragmentos lineares de DNA (6) e o pico 1111, corresponde ao minicírculo (4) MC-GFP.
O painel B mostra a análise por eletroforese num gel de agarose (1%) das frações de cada um dos picos. A pista lliii corresponde à mistura de produtos recombinantes digeridos com PvuII carregada na coluna, as pistas 111 correspondem às frações relativas ao pico 111, e as pistas
1111 correspondem às frações relativas ao pico 1111.
Exemplos
Os exemplos seguintes são apresentados para proporcionar aos peritos na arte uma divulgação completa de como fazer e utilizar a presente invenção. Estes exemplos não se destinam a limitar o âmbito da invenção nem pretendem representar que as experiências abaixo são todas ou as únicas experiências efetuadas.
EXEMPLO 1
Plasmideos e estirpes bacterianas.
Construção de pVAXmini, pMINIGFP, pMINI5GFP, pMINI8GFP plasmideo parental (3) pVAXmini (5944 pb) que contém a cassete pBAD/araC-ParA, dois locais de resolução de multimeros (MRS) do operão parABCDE e o gene da proteína verde fluorescente (GFP), foi construído usando os seguintes plasmideos base: i) pVAXIGFP (3697 pb) , que contém o gene da GFP, e foi derivado de pVAXILacZ (Invitrogen, Carlsbad, CA), como descrito anteriormente (Azzoni et al., 2007) e ii) pUC57cas, que contém uma cassete com o gene da resolvase ParA (1) sob regulação do promotor BAD, o gene repressor AraC em sentido contrário e um local de resolução de multimeros (MRS) a montante do pBAD (obtido a partir NZYTech Lda, Lisboa, Portugal). Em primeiro lugar, os locais de clivagem para as enzimas de restrição Nsil e Sall foram introduzidos no pVAXIGFP por mutagénese dirigida utilizando 0,3 μΜ do iniciador MutNSilSalIfwd (CTATGGCTTCTAATGCATGGTTTTGTCGACAGCAAGCGAACCGG), 0,3 μΜ do iniciador MutNsilSalIrev (CCGGTTCGCTTGCTGTCGACAAAACCATGCATTAGAAGCCATAG) e 10 ng de DNA molde pVAXIGFP. Um local MRS para a resolvase ParA (1) foi gerado por amplificação por reação de polimerização em cadeia (PCR) usando 0,6 μΜ de MRS2fwd (CATGCATTCGCGATTGGTCAAATTGGG) contendo o local de restrição NruI (sublinhado), 0,6 μΜ de MRS2rev (TGCAAGCAACGCGTTAGCACATATGTG) contendo o local de restrição MluI (sublinhado) e 10 ng DNA molde pUC57cas. O fragmento de PCR e o plasmídeo pVAXIGFP foram digeridos com MluI e NruI. Para a clonagem usou-se uma pré-mistura 2x de ligação Clonables™ (Novagen), obtendo-se o plasmídeo pVAXMRS. A cassete de pBAD/araC-MRS foi amplificada utilizando o iniciador casParAfwd (CCCTCATGCATTCCCCCTTGG) , que contém o local de restrição Nsil (sublinhado), o iniciador casParArev (AGCCGTCGACTGCCCGGCTTA) , que contém o local de restrição Sall (sublinhado) , e também o plasmídeo pUC57cas como DNA molde. O fragmento de PCR e o plasmídeo pVAXMRS forma digeridos e posteriormente submetidos a ligação (prémistura 2x de ligação Clonables™, Novagen) originando pVAXmini (5944 pb).
O plasmídeo parental (3) pMINIGFP (4702 pb) foi originado a partir do pVAXmini (5944 pb), removendo a região pBAD/araCParA por hidrólise com Sfil e EcoRV, e tratamento da mistura com a endonuclease de mung bean (New England Biolabs), para remover as cadeias simples das extremidades e permitir a re-ligação usando a T4 DNA ligase (Promega).
Os plasmídeos pMINI5GFP, pMINI6GFP, pMINI7GFP, pMINI8GFP (4702bp) foram construídos através da introdução no pMINIGFP de respetivamente três, quatro e cinco locais de restrição adicionais para endonuclease PvuII. O pMINIGFP já possui dois locais PvuII (Figura 2). Os iniciadores para a mutagénese dirigida foram obtidos a partir de STABvida (Lisboa, Portugal) e as suas sequências são mostradas na Tabela 1. A mutagénese dirigida foi realizada por PCR com 1 pL de DNA polimerase KOD Hot Start (Novagen) , 5 pL de tampão lOx KOD, 4,5 pL de MgSO4, 5 pL de dNTPs, 10 ng de DNA molde pMINI e 0,2 pM de cada iniciador direto e reverso, num volume total de 50 pL. As condições de PCR (Whatman Biometra Tgradient) foram as seguintes: 2 min de ativação da DNA polimerase a 95 °C, e 16 ciclos de 20s a 95 °C, lOs a 69 °C e 2,5 minutos (aproximadamente 30s/kb) a 70 °C. Dez unidades (1 mL) da enzima de restrição Dpnl (Promega) foram adicionados diretamente à mistura de PCR para digerir o DNA metilado, isto é, o plasmideo molde não mutado, durante 1 hora a 37 °C. Células de E. coli DH5alpha foram transformados pela adição de 20 pL da mistura de PCR tratada enzimaticamente e as colónias positivas foram confirmadas pelo padrão de restrição do novo DNA plasmidico.
Tabela 1: Sequências dos iniciadores utilizados para criar o pMINI8GFP pela introdução de locais de clivagem para a enzima de restrição PvuII no pMINIGFP por mutagénese dirigida.
Nome do
Sequência 5'-3' iniciador direto: CTATGGAAAAACGCCAGCTGCGCGGCCTTTTTACGGTT pMINI5 a _____________________________________________________ reverso: AACCGTAAAAAGGCCGCGCAGCTGGCGTTTTTCCATAG direto:CCCTATGCTACTCCGTCCAGCTGTCAATTGTCTGATTCG pMINI5_b ___________________________________________________ reverso:CGAATCAGACAATTGACAGCTGGACGGAGTAGCATAGGG direto:GACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATAGCAGCTGCT AAAAC T T CAT T T T TAAT T TAAAA pMINI5_c ___________________________________________________ reverso:TTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAGCAGCTGCTATTATT
GAAGCATTTATCAGGGTTATTGTC direto: TGCCTGGCGTGGTGCAGCTGTCGGAGCTGG pMINI6 ___________________________________________________________ reverso: CCAGCTCCGACAGCTGCACCACGCCAGGCA
| pMINI7 | direto: | GCTAATCCTGTTACCAGCTGCTGCTGCCAGTGG |
| reverso | : CCACTGGCAGCAGCAGCTGGTAACAGGATTAGC | |
| pMINI8 | direto: | CGTGACCCATGGCGACAGCTGCTTGCCGAATATC |
| reverso | : GATATTCGGCAAGCAGCTGTCGCCATGGGTCACG |
Construção dos plasmideos pMMBparA, pMMBpar2A plasmideo de baixo número de cópias pMMB206 foi comprado à ATCC (37808™) . A inserção da cassete ParA-araC com os locais de ligação ao ribossoma (RBS) originais ou sintéticas neste plasmideo originou os plasmideos pMMBparA e pMMBpar2A, respetivamente. A força do RBS sintético foi calculado e a sequência foi desenhada usando a calculadora online de RBSs (Sali set al. , 2009) .
RBS original ...C®1®®TTTCTCCATACCCGTTTTTTTGGATGG
6 AU (ParA) AGTGAAACGATGGCGACGC.··
RBS sintética ...CÍÍÍÍÍBÍTTTCTCCATACTAAAACGAAGAGTAGG 20000 AU (Par2A) AGGAGACCAATGGCGACGC.··
A RBS sintética foi introduzida a montante do ParA, substituindo o RBS original do sistema induzivel pBAD/araC por SOEing PCR. Em primeiro lugar, dois fragmentos de tamanho semelhante apresentando sobreposição de 27 bp (nucleotideos sublinhados) do novo RBS foram sintetizados por PCR convencional utilizando os conjuntos de iniciadores Spar2Afwd (CGAAGCAGGGATTCTGCAAAC) e Spar2Arev (TGGTCTCCTCCTACTCTTCGTTTTAGTATGGAGAAACAGTAGAGAGTTGCGA) ou Spar2Bfwd (ACTAAAACGAAGAGTAGGAGGAGACCAATGGCGACGCGAGAGCAAC) e Spar2Brev (TGATAGCGGTCCGCCACA) e pVAXmini como DNA molde. No segundo passo, os dois fragmentos sintetizados foram emparelhados pelas regiões complementares e sujeitos a 5 ciclos sem iniciadores e, assim, criando um molde para a próxima reação de PCR com iniciadores das extremidades Spar2Afwd e Spar2Brev. A Figura 3 mostra um desenho esquemático da cassete pBAD/araC-RBS-ParA.
Construção da estirpe BWAA
A estirpe E. coli BVI21183 [F-, Δ (araD-araB) 567,
AlacZ4787 (: :rrnB-3) , λ~, Δ (araH-araF) 570 (: : FRT) , AaraEp532::FRT, (pPCp8araE535, rph-1, A (rhaD-rhaB) 568, hsdR514] capaz de absorção melhorada de arabinose foi comprada ao The Coli Genetic Stock Center at Yale (New Haven, CT) . A fim de obter uma estirpe adequada à produção de plasmideos, os genes responsáveis pela hidrólise não especifica de DNA (endA) e pela recombinação homóloga (recA) da estirpe BW27783 foram nocauteados por transdução PI (Baba et al. 2006), resultando na estirpe E. coli BWAA.
Construção da estirpe BW2P
A estirpe E. coli BW2P foi obtida a partir da estirpe BW27783, substituindo o gene endA pelo gene da resolvase ParA (1) fundida com o local de ligação ao ribossoma (RBS) sintético e por nocaute do gene recA. A inserção da cassete de pBAD/araC-RBS-ParA foi efetuada por uma recombinação λRed adaptada conforme descrito por Datsenko e Wanner (2000) e o nocaute do recA foi realizada através de transdução PI utilizando as técnicas conhecidas do perito na técnica (produzindo a nova estirpe E. coli BW2P.
Resumidamente, amplificou-se a cassete pBAD/araC-RBS-ParA localizada no plasmideo molde pTKIPpar2A entre Sall e Smal (Kuhlman & Cox, 2010) usando a Platinum PCR Supermix (Invitrogen) e 300 nM de cada um dos iniciadores (par2Afwd: TCGAGGTCGACTGCCCGGC e AraCSalIrev: TCCGTCAAGCCGTCGACTGTCTG).
A cassete ParA-araC-RBS-ParA foi purificada a partir dum gel de agarose e foi em seguida clonada no local Sall do plasmídeo pKD13 utilizando as técnicas conhecidas do perito na técnica. 0 plasmídeo resultante foi então usado para a amplificação da cassete de recombinação completa de Kan (canamicina) usando 300 nM de cada um dos iniciadores EndA_cass_for2: ATCTGGCTGATTGCATACCAAAACAGCTTTCGCTACGTTGCTGGCTCGTTTTAACACGG AGTAAGTGATGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC e EndAPar2Acasrev: GTTGTACGCGTGGGGTAGGGGTTAACAAAAAGAATCCCGCTAGTGTAGGTTAGCTCTTT CGCGCCTGGCATTAATTCCGGGGATCCGTCG. A homologia do gene endA alvo no genoma está sublinhada. A cassete de Kan foi usada para transformar células eletrocompetentes de E. coli BW27783/pKD46recA de modo a permitir a recombinação homóloga. O gene de resistência à canamicina foi removido por FLP recombinase codificada pelo plasmídeo pCP20 (Datsenko e Wanner, 2000) .
O nocaute do recA na estirpe de E. coli recém-formada foi realizado por transdução PI. Resumidamente, a transdução PI permite a transferência de material genético de uma estirpe dadora para uma estirpe recetora. A estirpe dadora, da coleção de Keio, contém uma cassete de resistência à canamicina (KanR) num único gene, nocauteando esse gene. As células do dador são infetadas pelo fago PI e o seu DNA é utilizado para transfetar as células recetoras. O gene de resistência à canamicina é removido utilizando a enzima recombinase de FLP (a partir do plasmídeo ajudante pCP20) pois atua nos locais FRT que ladeiam o gene KanR (Baba et al., 2006).
EXEMPLO 2
Crescimento de E. coli BWAA pMINI5GFP com o plasmídeo ajudante pMMBpar2A em cultura em balão agitado.
mL de meio LB (Luria Bertani) suplementado com os antibióticos apropriados (canamicina 30 pg/mL, cloranfenicol 34 pg/mL) e 0,5% (p/v) de glucose, foram inoculados com uma ansada de células congeladas de E. coli BWAA contendo o plasmideo parental (3) em conjunto com o plasmideo ajudante e incubadas durante a noite a 30 °C, 250 rpm. Em seguida, um volume adequado desse inoculo foi usado para inocular 250 mL de meio LB contendo antibióticos com uma densidade ótica (DO) de 0,1. Este meio foi incubado cerca de 4 horas a 37 °C, 250 rpm, até se atingir a fase estacionária, que, no caso da presente invenção, ocorre tipicamente para valores de densidade celular entre 3,5 e 4,5. Nessa altura, a transcrição da resolvase ParA (1) foi induzida por adição de 0,01 % de L-( + )arabinose (2) (Merck) diretamente ao meio tendo as células sido ainda incubadas durante mais uma ou duas horas, para permitir a recombinação do plasmideo parental (3) . Um desenho esquemático mostrando a recombinação do plasmideo parental (3) é apresentado na Figura 4. Este tipo de processo de produção rendeu 8,2 ± 1,0 mg/L de produtos recombinantes em que a eficiência de recombinação mais elevada foi de 95 % obtida após 2 horas de indução.
EXEMPLO 3
Crescimento de E. coli BW2P/pMINI8GFP em biorreator.
Um pré-inóculo foi preparado através da transferência de células a partir de células congeladas (1% v/v) a 5 mL de meio complexo [Bacto-peptona 10 g/L, extrato de levedura 10 g/L, (NH4)2SO4 3 g/L, K2HPO4 3,5 g/L, KH2PO4 3,5 g/L, tiamina 199 mg/L, MgSO4 1,99 g/L, solução de oligoelementos 1 ml/L] suplementado com 30 pg/mL de canamicina e 5 g/L de glucose.
As células foram cultivadas durante a noite a 30 °C e 250 rpm. No dia seguinte, um inoculo foi preparado por inoculação de 100 mL de meio complexo complementado com 2 g/L de glicerol, com 1% do inoculo de pré-cultura. Essas células foram cultivadas até a fase exponencial inicial, até valores de DO ao comprimento de onda de 600 nm de cerca de 1,1, a 37 °C e 250 rpm. As fermentações foram realizadas num biorreator Fermac 360 (Electrolab) com um volume de trabalho de 1,1 L. Em primeiro lugar, 1 L de meio complexo foi autoclavado no biorreator e os suplementos ao meio, solução de elementos traço, canamicina (30 mg/L) e glicerol (20 g/L ou 40 g/L) foram adicionados. O reator foi então inoculado com o volume de inoculo necessário para obter uma DO ao comprimento de onda de 600 nm inicial de 0,1. O ponto de ajuste para o oxigénio dissolvido foi ajustado para 30% utilizando uma cascata de agitação (200 rpm para 800 rpm) e o ar foi fornecido a um caudal de 1 vvm. O pH foi mantido a 7,10 utilizando NaOH 2 M e H2SO4 2 Μ. O antiespuma foi adicionado manualmente conforme necessário. Foram retiradas amostras periodicamente a partir do biorreator para quantificar a biomassa, glicerol, acetato e DNA plasmidico. O rendimento de produção volumétrica de DNA plasmidico analisado por HPLC foi de 53,7+6,2 mg/L, após 24 horas de crescimento. A eficiência de recombinação e a fração molar de minicirculos (4) na população plasmideo variou dependendo do esquema de indução. A indução de recombinação intramolecular por 0,01 % de L-( + ) arabinose (2) em fase exponencial (4 horas, DO cerca de 10) resultou em 100% de recombinação, após 2 horas de crescimento adicional contendo 10% da quantidade de minicirculos. A indução em fase estacionária precoce (12 horas, com um valor de DO de cerca de 40) por 12 horas resultou em 75% de recombinação com os minicirculos (4) representando 50% minicírculo (4) de plasmídeo total.
EXEMPLO 4
Preparação de pDNA purificado.
O DNA plasmidico total foi purificado a partir de células recolhidas no final da fermentação, usando um processo que combina rutura celular por lise alcalina, precipitação com isopropanol e sulfato de amónio, cromatográfia de interação hidrofóbica (HIC) e cromatográfia de exclusão molecular (SEC), adaptado de Diogo (2000, 2005). Resumidamente, as células correspondentes a 500 mL de cultura de biorreator foram ressuspensas em 110 mL de glucose 50 mM, EDTA 10 mM e Tris 25 mM pH 8. A lise foi realizada por adição de 110 mL de NaOH a 200 mM, a solução de dodecilsulf ato de sódio (SDS) 1% (w/v) em gelo, e parado pela adição de 110 mL prérefrigerados de uma solução 5 M de acetato/3 M de potássio pH 5,0. Os detritos celulares e os precipitados de DNA genómico/proteinas foram removidos por centrifugação (40 min, 9.000 rpm, 4 °C) e os ácidos nucleicos no sobrenadante (cerca de 300 mL) foram precipitadas por adição de 0,7 volumes de isopropanol à temperatura ambiente, 1 hora a 4 °C. O precipitado foi recuperado por centrifugação (40 minutos, 13.300 rpm, 4 °C) e lavagem com etanol (70% v/v) .
O sedimento contendo o plasmideo foi então ressuspenso em 10 mM Tris (pH 8) (1 mL por cada 25 mL de lisado original). Em seguida, dissolveu-se sulfato de amónio sólido na solução de plasmídeo de modo a obter uma concentração de 2,5 M para condicionar a amostra antes da cromatográfia de interação hidrofóbica. Após a incubação em gelo (15 minutos), algumas impurezas precipitaram e foram removidas por centrifugação (15 minutos, 13200 g, 4 °C) e descartadas. 0 sobrenadante contendo o plasmideo (cerca de 8 mL) foi carregado numa coluna de vidro preenchida com 25 mL de Phenyl Sepharose (GE Healthcare) e pré-equilibrada com sulfato de amónio 1,5 M em 10 mM Tris, pH 8 (2 mL/min) utilizando um sistema Akta Purifier 10. Realizou-se uma eluição isocrática com sulfato de amónio 1,5 M em 10 mM Tris-HCl, pH 8, a um caudal de 2 mL/min. Depois da eluição das moléculas não ligadas e fracamente retidas com 1,5 M de sal, a força iónica do tampão foi reduzido (Tris-HCl 10 mM, pH 8) para eluir espécies ligadas. Frações de 0,5 mL foram coletadas em tubos de 1,5 mL. As frações contendo o plasmideo foram então submetidas a cromatografia de exclusão de molecular na mesma coluna (6 mL da carga) usando uma corrida isocrática com 10 mM Tris, pH 8 (1 mL/min) como o tampão de equilíbrio e de corrida. Frações com 0,5 mL foram coletadas em tubos de 1,5 mL.
EXEMPLO 5
Hidrólise das impurezas dos produtos de recombinação (DNA plasmídico).
A hidrólise das impurezas (miniplasmideo (5) e plasmideo parental (3) não recombinado) do DNA de plasmideo é mostrada esquematicamente na Figura 5. Os plasmideos recombinados e purificados foram submetidos a hidrólise enzimática in vitro, durante 1-3 horas a 37 ° C por adição de 0,1-1 U da enzima de restrição PvuII (ThermoScientific) por pg de produtos recombinantes, num tampão apropriado. As amostras digeridas foram analisadas por eletroforese em gel (Figura 6A). A hidrólise foi realizada em volumes variáveis entre 0,1 e 7 mL. Hidrólise completa foi observada usando 1 U de enzima por micrograma de plasmideo em uma hora ou 0,5 U de enzima em 3 horas. O padrão digerido de pMINI8GFP consiste em fragmentos lineares de DNA (6) curtos variam em tamanho entre 337 e 414 pb e 2.162 pb do fragmento longo correspondente ao plasmideo parental (3) não recombinado. Os produtos de recombinação podem também ser digeridos diretamente no lisado clarificado obtido após a precipitação com isopropanol sob as mesmas condições utilizadas na hidrólise de amostras purificadas (Figura 6B). 0 padrão de hidrólise de pMINI5GFP consiste em fragmentos de 751, 731, 698, 360 pb a partir de espécies miniplasmideo (5) e um fragmento adicional de 2.162 pb correspondentes ao plasmideo parental (3) não recombinado. O plasmideo ajudante pMMBpar2A também exibe cinco locais de clivagem para a enzima PvuII, resultando em fragmentos lineares de DNA (6) de 6.414, 3.356, 836, 416, 281 e 93 bp, embora como os últimos quatro fragmentos mencionados exibam massa relativa baixa não são visíveis aparecem no gel de agarose.
EXEMPLO 6
Purificação dos minicirculos (4) MC-GFP, MC-VEGF e MCGFPVEGF num disco CIM-DEAE usando um gradiente de eluição a pH 8 .
O disco monolítico Convective (diethylamino, permutador anió Ljubljana, Eslovénia), com um no sistema AKTA Purifier 10 seguintes minicirculos (4) : (1.730 pb) (ver Figura 7) e Figura 8).
As sequências correspondentes possuem cinco ou sete locias d
Interaction Media (CIM)-DEAE uico fraco) (BIA Separations, volume de 0,34 mL foi usado (GE) para a separação dos MC-GFP (1.881 pb), MC-VEGF
MC-GFPVEGF (2.457 pb) (ver nos plasmideos parentais (3) 3 restrição PvuII, originando fragmentos lineares de DNA (6) de cerca de 750 bp e cerca de 350 bp após hidrólise com PvuII. O tampão A consistia em 20 mM Tris-HCl (pH 8) e o tampão B de 1 M de NaCl (em 20 mM Tris-HCl, pH 8) . Mais de 50 pL das misturas de hidrólise com PvuII foram injetados manualmente ou com um injetor automático na coluna previamente equilibrada com a concentração inicial de NaCl, à temperatura ambiente. Os minicirculos (4) foram separados das impurezas linearizados usando um gradiente crescente de B (50% a 80% de B) com um declive de 0,5 % ou 1% B/min com um caudal de 1 mL/min. A absorvância do eluato foi medida continuamente ao c.d.o. de 260 nm à saida do disco. Frações de 0,3 mL foram recolhidas em placas de 96 poços. A mistura contendo as frações do pico do minicirculo (4) foi submetida a troca de tampões por diálise ou usando tubos Microcon 3K ou 50K (Millipore).
EXEMPLO 7
Purificação do minicirculo (4) MC-GFP num disco CIM-DEAE com eluição por gradiente a pH 9.
O disco monolítico Convective Interaction Media (CIM)-DEAE (diethylamino, permutador aniónico fraco) (BIA Separations, Ljubljana, Eslovénia) , com um volume de 0,34 mL foi usado no sistema AKTA Purifier 10 (GE) para a separação do minicirculo (4) MC-GFP. O MC-GFP é obtido a partir de um plasmídeo parental (3) contendo oito locais de restrição PvuII que origina a partir do miniplasmídeo (5) fragmentos lineares de DNA (6) de cerca de 350 pb após a hidrólise com PvuII. O tampão A de eluição consistia em 20 mM Tris-HCl (pH 9) e o tampão B de 1 M de NaCl (em 20 mM Tris-HCl, pH 9) . 1 ou 2 mL de produtos de recombinação digeridos foram injetados manualmente em um disco pré-equilibrada à temperatura ambiente com 5 volumes de coluna de tampão com
NaCl na concentração inicial desejada. 0 minicirculo (4) foi separado das impurezas linearizadas usando um gradiente crescente de B (20% a 40 % de B) com um gradiente de 1 % de B/min e um caudal de 1 mL/min.
A absorvância do eluato foi medida continuamente ao c.d.o. de 260 nm à saida do disco. Frações de 0,2 mL foram recolhidas em placas de 96 poços. A mistura contendo as frações do pico do minicirculo (4) foi submetida a troca de tampões por diálise contra 10 mM Tris-HCl, pH 8. O cromatograma e as frações representativas são mostrados na Figura 10.
EXEMPLO 8
Purificação do minicirculo (4) MC-GFP num disco CIM-DEAE com eluição em degrau a pH 9.
O disco monolítico Convective Interaction Media (CIM)-DEAE (diethylamino, permutador aniónico fraco) (BIA Separations, Ljubljana, Eslovénia) , com um volume de 0,34 mL foi usado no sistema AKTA Purifier 10 (GE) para a separação do minicirculo (4) MC-GFP. O MC-GFP é obtido a partir de um plasmideo parental (3) contendo oito locais de restrição PvuII que origina a partir do miniplasmideo (5) fragmentos lineares de DNA (6) de cerca de 350 pb após a hidrólise com PvuII. O tampão A de eluição consistia em 20 mM Tris-HCl (pH 9) e o tampão B de 1 M de NaCl (em 20 mM Tris-HCl, pH 9) . 2 mL de produtos de recombinação digeridos foram injetados manualmente num disco de pré-equilibrado à temperatura ambiente com 5 volumes de coluna de tampão de NaCl a uma concentração inicial de 210 mM. O minicirculo (4) foi separado das impurezas linearizadas usando uma série de gradientes em degrau com um caudal de 1 mL/min.
A concentração de sal necessária para eluição das impurezas pode variar entre 230-330 mM de NaCl, dependendo do lote de amostra ou da preparação dos tampões de eluição. Um degrau longo de eluição, usando 15 volumes de coluna, foi utilizado para garantir a eluição completa das impurezas. O minicirculo (4) eluiu como um pico estreito, durante o degrau de eluição em 40% B. No final de cada corrida, a coluna foi regenerada com 5 volumes de coluna de 1 M de NaCl. Para a identificação exata do degrau mais critico: a eluição das impurezas, um gradiente de eluição principal de 50 microlitros de amostra com inclinação gradiente de 1 % de B/min, permitiu a identificação especifica de condutividade no final do pico de impureza e, portanto, identificar a correspondente % de B necessárias para definir o esquema de eluição em degrau do gradiente.
A absorvância do eluato foi medida continuamente ao c.d.o.
de 260 nm à saida do disco. Frações de 0,2 mL foram recolhidas em placas de 96 poços. A mistura contendo as frações do pico do minicirculo (4) foi submetida a troca de tampões por diálise contra 10 mM Tris-HCl, pH 8. O cromatograma e as frações representativas são mostrados na Figura 11.
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Claims (3)
1. Processo para a purificação de minicirculos (4) de DNA superenrolado contendo os passos de:
a) produção de células bacterianas que contêm um plasmideo parental (3) circular e indução da recombinação intramolecular;
b) rutura celular das células e preparação de uma mistura de produtos de recombinação, contendo minicirculos (4), miniplasmideos (5) e plasmideo parental (3) não recombinado;
caracterizado por conter ainda os passos de:
c) incubação, realizada in vitro, da referida mistura de produtos de recombinação com uma endonuclease de restrição, que especificamente reconhece e cliva os locais de restrição colocados nas sequências bacterianas dos miniplasmideos (5) e plasmideos parentais (3) não recombinados, com obtenção de uma mistura de minicirculos (4) intactos e de moléculas derivadas dos miniplasmideos (5) e plasmideos parentais (3) não recombinados, ambos modificados, por ação da referida endonuclease de restrição;
d) separação de minicirculos (4) superenrolados intactos das moléculas derivadas dos miniplasmideos (5) , plasmideos parentais (3) , ambos modificados, por processos cromatográficos utilizando suportes desprovidos de ligandos de afinidade.
2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a modificação de moléculas derivadas dos miniplasmídeos (5) e plasmídeos parentais (3) não recombinados ser efetuada por uma endonuclease de restrição específica que atua no local de restrição cortando as duas cadeias de DNA por meio de duas incisões, uma em cada uma das cadeias açúcar-fosfato, e por as moléculas derivadas dos miniplasmídeos (5) e plasmídeos parentais (3) não recombinados serem fragmentos lineares de DNA de cadeia dupla.
3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a modificação de moléculas derivadas dos miniplasmídeos (5) e plasmídeos parentais (3) não recombinados ser efetuada, em alternativa, por uma endonuclease de restrição específica que atua no local de restrição cortando apenas uma das cadeias de DNA por meio de uma incisão numa das cadeias açúcarfosfato, e por as moléculas derivadas dos miniplasmídeos (5) e plasmídeos parentais (3) não recombinados se encontrarem relaxadas.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
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Citations (3)
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-
2014
- 2014-05-28 PT PT10766314A patent/PT107663B/pt active IP Right Grant
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002083889A2 (en) * | 2001-04-10 | 2002-10-24 | Imperial College Innovations Limited | Methods for the production of minicircles |
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| SIMCIKOVA, M., ET AL., DESIGN: "construção e produção de minicírculos como vectores de entrega de genes", BOLETIM DE BIOTECNOLOGIA Nº, 1 January 0004 (0004-01-01) * |
| SIMCIKOVA, M., ET AL., ON THE DUAL EFFECT OF GLUCOSE DURING PRODUCTION OF PBAD/ARAC-BASED MINICIRCLES: "VACCINE", ELSEVIER LTD VOL., 1 January 0032 (0032-01-01) * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PT107663A (pt) | 2015-11-30 |
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