PT106445B

PT106445B - Sistema transportador de poliplexes peguilado, seu processo de preparação, intermediários e composições farmacêuticas

Info

Publication number: PT106445B
Application number: PT106445A
Authority: PT
Inventors: Mafalda De Castro Ascens O Marques Videira
Original assignee: Univ Lisboa
Priority date: 2012-07-15
Filing date: 2012-07-15
Publication date: 2014-10-13
Also published as: PT106445A

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO REFERE-SE EM GERAL A UM SISTEMA FARMACÊUTICO TRANSPORTADOR DE MOLÉCULAS E MAIS EM PARTICULAR A SISTEMAS FARMACÊUTICOS TRANSPORTADORES DE MOLÉCULAS COMPLEXADAS O QUAL COMPREENDE PELO MENOS UM NÚCLEO CONSTITUÍDO POR NANOPARTÍCULAS LIPÍDICAS SÓLIDAS, NÃO POLIMÉRICAS, SUBMICROMÉTRICAS; UMA ZONA INTERMÉDIA COMPREENDENDO UM POLIPLEX POLIMÉRICO DE QUITOSANO OU UM SEU DERIVADO E UM OU MAIS ÁCIDOS NUCLEICOS; E UMA CAMADA EXTERIOR DE REVESTIMENTO POLIMÉRICA COMPREENDENDO UM OU MAIS POLÍMEROS ANFIFÍLICOS. UM SISTEMA DE ACORDO COM A PRESENTE INVENÇÃO PERMITE SUPRIMIR OS EFEITOS TÓXICOS VERIFICADOS NA ADMINISTRAÇÃO DE POLIPLEXES, LIPOPLEXES OU NANOTRANSPORTADORES COM CARGA SUPERFICIAL POSITIVA, AUMENTANDO POR SUA VEZ A EFICÁCIA DE TRANSFECÇÃO E POSSIBILITANDO A ADMINISTRAÇÃO DE SEQUÊNCIAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS IN VIVO. A PRESENTE INVENÇÃO REFERE-SE AINDA A PROCESSOS DE PREPARAÇÃO DO REFERIDO SISTEMA E A COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS CONTENDO TAIS SISTEMAS BEM COMO À SUA UTILIZAÇÃO.

Description

DESCRIÇÃO

Sistema transportador de poliplexes peguilado, seu processo de preparação, intermediários e composições farmacêuticas

CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se em geral a um sistema farmacêutico transportador de moléculas e mais em particular a sistemas farmacêuticos transportadores de moléculas complexadas. A presente invenção refere-se ainda a processos de preparação do referido sistema e a composições farmacêuticas contendo tais sistemas bem como ao seu uso.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

As moléculas de ácido ribonucleico (RNA) de dupla cadeia podem inibir a expressão de genes homólogos, em organismos eucarióticos, por um processo chamado mecanismo de interferência de RNA (RNAi) descrito por Fire e Craig Mello. Este mecanismo é levado a cabo por pequenas moléculas de RNA de interferência como o pequeno RNA interferência (siRNA) ou os micro RNA de interferência (miRNA), geradas intracelularmente através da clivagem de moléculas longas de RNA de dupla cadeia. Este processo, do qual resultam moléculas de siRNA ou miRNA com 19 a 25 nucleótidos, é mediado pela acção de uma proteína específica denominada Dicer.

As pequenas sequências de siRNA assim formadas associam-se a um complexo multiproteico contendo uma nuclease de modo a formar um complexo de silenciamento induzido complexo molécula por RNA (RISC). Por torna-se activo após de siRNA ou antisentido complementar, sequência proteína Selected para se induzindo acção de perda de deixando ao miRNA, ligar a clivagem alvo, bloqueando desta alvo [Laufer SD, Detzer in of uma helicase, este uma das cadeias da livre a sequência mensageiro (RNAm) endonucleotídica deste

RNA na

A, strategies for the delivery RNA technologies and their Delivery systems for forma a expressão Sczakiel G, Restle of siRNA in vitro vivo;

Aigner A. ;

siRNAs to induce RNA interference da

T;

and of applications, 2010:29the direct application (RNAi) in vivo; Journal

Biomedicine and Biotechnology; 2006:1-15. Kurreck J; RNA interference: from basic research to therapeutic applications; Angew Chem Int Ed Engl; 2009; 48(8):1378-98.

Lares MR, Rossi JJ, Ouellet DL; RNAi and small interfering RNAs in human disease therapeutic applications; Trends Biotechnol; Nov 2010; 28(11): 570-9. Tseng YC, Mozumdar S,

Huang L; Lipid-based systemic delivery of siRNA; Adv Drug

Deliv Rev; 25 Jul 2009; 61(9):721-31].

A possibilidade de desenhar pequenas moléculas sintéticas de siRNA ou miRNA para silenciar a expressão de genes envolvidos na proliferação, sobrevivência, angiogénese, metastização, inibição da apoptose e resistência a fármacos em células que apresentam alteração das suas funções, torna esta tecnologia uma estratégia terapêutica promissora em várias áreas terapêuticas, especialmente a da oncologia.

Contudo, quer devido à degradação promovida pelas nucleases dos fluídos biológicos quer a uma ineficiente internalização celular das sequências oligonucleotídicas na sua forma livre, um dos maiores desafios no desenvolvimento de terapias baseadas em siRNA ou miRNA está relacionado com o problema da distribuição sistémica após administração e, posteriormente, com a passagem destes através da membrana celular das células alvo. Após a internalização celular, que ocorre maioritariamente por endocitose, os siRNA ou os miRNA são incluídos nos endossomas a partir dos quais se escapam para o citoplasma, exercendo aí a sua actividade de silenciamento pós-transcricional. 0 escape endossómico é um dos passos mais importantes relacionados com a eficiência de transfecção de um sistema de veiculação para material genético. Durante o percurso intracelular as nanopartículas permanecem sequestradas em vesículas endossómicas onde a matriz do veículo é degradada progressivamente e o material genético é libertado por ruptura da vesícula endóssomica. No entanto, a permanência dos oligonucleótidos no interior da vesícula, até à formação do lisossoma, provoca a degradação das sequências nucleotídicas [de Martimprey H, Vauthier C, Malvy C, Couvreur P; Polymer nanocarriers for the delivery of small fragments of nucleic acids:oligonucleotides and siRNA; Eur J Puri N, perspectives distinctions

Pharm Biopharm; 2009; 71(3):490-504. Gary DJ, siRNA delivery: and phenomenological J Control

Won on f rom

YY; Polymer-based the fundamental polymer-based DNA

Release; 2007; 121(1-2):64-73. Mao delivery;

S, Sun W, Chitosan-based formulations for delivery of DNA Adv Drug Deliv Rev; 2010;62(1):12-27 ] . 0 fenómeno ruptura da membrana endossómica com consequente do material

Kissel T;

and siRNA;

inerente à através de esponja de capacidade endosomal, genético para o citoplasma pode ser um mecanismo normalmente designado por definido protoes. Este fenómeno é de um veículo exercer um efeito induzindo o intumescimento libertação induzido efeito como a tampao sobre o pH dos endossomas por osmose iões cloreto provocado protões e devido à acumulação excessiva de [de Martimprey H, Vauthier C, Malvy C, Couvreur P; Polymer nanocarriers for the delivery of small fragments of nucleic acids:oligonucleotides and siRNA; Eur J Pharm Biopharm; 2009; 71(3):490-504. Oskuee RK, Phillipp A, Dehshahri A, Wagner E, Ramezani M; The impact of carboxyalkylation of branched polyethylenimine on effectiveness in small interfering RNA delivery; The Journal of Gene Medicine; 2010; 12(9):729-38; Epub 2010/08/05].

À	inclusão	de	material	genético numa	célula
eucariótica dá-se o	nome	de transfecção [Kopatz I,	Remy JS,
Behr JP;	A model	for	non-viral	gene delivery:	through

J Gene syndecan adhesion molecules and powered by actin;

Med.;

Jul 2004; 6(7):769-76

I Mortimer, P

Tam, I

MacLachlan, RW Graham, EG Saravolac e PB Joshi;

lipid-mediated transfection of cells in culture

Cationic requires mitotic activity; Gene Therapy; 1999; 6:403—411]

A baixa taxa de sucesso das estratégias de administração local de ácidos nucleicos não complexados e a ausência de transportadores eficazes para a entrega intracelular selectiva de siRNA ou miRNA sintéticos com vista à sua aplicação terapêutica demonstram a enorme necessidade de desenvolver sistemas eficazes de transporte in vivo de sequências oligonucleotídicas. São conhecidos vários sistemas de veiculação de moléculas que visam ultrapassar ou limitar tais problemas.

Relativamente à administração de siRNAs ou miRNAs, a ligação destas sequências a um vector de transfecção, virai ou não virai, promove uma melhor estabilidade após administração in vivo, protegendo simultaneamente os ácidos nucleicos da degradação pelas nucleases. Atualmente, os sistemas virais de veiculação de ácidos nucleicos originam habitualmente elevadas eficiências de transfecção. No entanto, apresentam problemas relacionados com toxicidade, imunogenicidade, humoral e celular, e potencial inflamatório [de Martimprey H, Vauthier C, Malvy C, Couvreur P; Polymer nanocarriers for the delivery of small fragments of nucleic acids:oligonucleotides and siRNA; Eur J Pharm Biopharm; 2009; 71(3):490-504. Xiong XB, Falamarzian A, Garg SM, Lavasanifar A; Engineering of amphiphilic block copolymers for polymeric micellar drug and gene delivery; J Control Release; 2011; 155(2):248-61. Ozpolat B, Sood AK, Lopez-Berestein G; Nanomedicine based approaches for the delivery of siRNA in câncer; Journal of internai medicine; 2010; 267(1):44-53; Epub 2010/01/1]. A estes vectores está também associado o perigo de ocorrência de mutações, recombinações e efeitos carcinogéneos. Também tem sido intensamente proposta como alternativa à administração de sequências de ácidos nucleicos simples, a utilização de vectores não virais, sintéticos, que envolvem a complexação do RNA com lípidos (lipoplexes) ou polímeros (poliplexes) catiónicos, como o quitosano, ou ainda a incorporação destas sequências em nanopartículas poliméricas ou lipídicas [Xiong XB, Falamarzian A, Garg SM, Lavasanifar A; Engineering of amphiphilic block copolymers for polymeric micellar drug and gene delivery; J Control Release; 2011; 155(2):248-61. Ozpolat B, Sood AK, Lopez-Berestein G; Nanomedicine based approaches for the delivery of siRNA in câncer; Journal of internai medicine; 2010; 267(1):44-53; Epub 2010/01/12].

De entre estes, o quitosano é um polissacarídeo catiónico natural que tem demonstrado ser biocompatível, não inflamatório, não tóxico e biodegradável. Vantagens em termos de veiculação selectiva, internalização celular e tráfico intracelular têm sido demonstradas para os complexos formados entre este polímero, ou os seus derivados, e sequências nucleotídicas de carga fortemente negativa, como são os ácidos nucleicos. Contudo, apesar da sua já reconhecida capacidade para formar poliplexes e proteger o material genético da acção das nucleases, a sua administração sistémica está igualmente comprometida pelo carácter catiónico dos complexos formados [de Martimprey H, Vauthier C, Malvy C, Couvreur P; Polymer nanocarriers for the delivery of small fragments of nucleic acids:oligonucleotides and siRNA; Eur J Pharm Biopharm; 2009; 71(3):490-504, Mao S, Sun W, Kissel T; Chitosan-based formulations for delivery of DNA and siRNA; Adv Drug Deliv Rev. 2010; 62(1):12-27]. Tais sistemas catiónicos apresentam forte toxicidade sistémica uma vez que desencadeiam processos de inflamação devidos maioritariamente à formação de agregados em presença das proteínas séricas, opsoninas e proteínas do complemento [Alexis, F, Pridgen, E, Moinar, LK e Farokhzad, OC; Factors affecting the clearance and biodistribution of polymeric nanoparticles; Mol Pharm; 2008; 5:505—515]. Em particular, a US 2011/0287547 (Cory J. Berkland, L. ) divulga composições e processos de libertação de ácidos nucleicos compreendendo um polímero catiónico (HIV-péptido transativador de transfecção (TAT)), um ácido nucleico e um ião metálico (cálcio) [US 2011/0287547]. Estes transportadores permitem uma veiculação do ácido nucleico direcionada às células alvo.

Recentemente têm surgido outras abordagens visando limitar a formaçao de agregados que traduzem um nível de toxicidade que impede a utilização clínica daqueles sistemas. Entre estas abordagens, destaca-se o revestimento dos complexos polímero- ou lípido-RNA com poli(etilenoglicol) (PEG) ou com os seus derivados processo este também conhecido por peguilação. Foi demonstrado que a peguilação de poliplexes anula a carga positiva e em consequência diminui a formaçao de agregados e consequentemente a toxicidade associada [Ogris, M, Brunner, S, Schuller, S,

Kircheis,

R, Wagner, E; PEGylated DNA/transferrin-PEI complexes: reduced interaction with blood components, extended circulation in blood and potential for systemic gene delivery; peguilados, desvantagens, celular dos

Gene Ther; 1999;

6:595-605]. Tais complexos apresentar múltiplas retardar a internalização material podem como por exemplo transportadores < genético, dificultando ainda endo/lisossómica durante o percurso intracelular.

contudo, que veiculam o o processo de digestão

Um problema comum aos sistemas transportadores nãovirais recentemente desenvolvidos está relacionado com a baixa taxa de eficiência na transfecção de sequências oligonucleotídicas. A ausência de sistemas de administração eficazes e seguros é confirmada pelo número reduzido de ensaios clínicos de fase III [http://clinicaltrials.gov].

pedido de patente EP2460516A2 (UNIVERSIDAD DEL PAIS VASCO) 2011.02.10 divulga um sistema transportador para administração de material genético com base em nanoparticulas lipídicas preparadas por evaporação por solvente seguido de sonicação ou em alternativa por HPH, as quais apresentam carga fortemente positiva em resultado da utilização simultânea de um tensioactivo catiónico e de um péptido de carga positiva. 0 sistema é composto por lípidos sólidos misturados com tensioactivos catiónicos, tensioactivos não-iónicos, polissacarídeos, ácidos nucleicos e péptidos de carga positiva. A desvantagem que tal sistema apresenta é a toxicidade resultante da carga positiva conferida ao sistema pela mistura daqueles compostos.

Existe assim a necessidade de desenvolver um sistema farmacêutico transportador de sequências de ácidos nucleicos suprimindo os efeitos administração nanotransportadores aumentando por sua de com tóxicos verificados com a ou poliplexes, lipoplexes carga superficial positiva, a eficácia de transfecção e vez possibilitando a administraçao de sequências de ácidos nucleicos in vivo.

Na descrição e reivindicações a palavra compreender e variações desta palavra não se destinam a excluir outras características técnicas, aditivos, excipientes, componentes ou passos.

Objectivos, vantagens e características adicionais tornar-se-ão evidentes para as pessoas competentes na matéria pela análise da descrição ou pela prática da invenção. Os exemplos seguintes são apresentados a título ilustrativo e não se destinam a limitar a presente invenção.

Além disto, a presente invenção abrange toda as combinações possíveis da concretizações particulares e preferidas aqui descritas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção foi realizada tendo em vista superar as desvantagens referidas no estado da técnica e é objecto da presente invenção proporcionar um sistema farmacêutico transportador de poliplexes ou sequência de ácidos nucleicos que consiste em:

a) um núcleo constituído por nanopartículas lipídicas sólidas, não poliméricas, submicrométricas, i.e. com um diâmetro de partícula médio inferior a 1 micron;

b) uma zona intermédia compreendendo um poliplex polimérico de glicolquitosano, o qual compreende 25 a 50% (v/v) de glicolquitosanos com um peso molecular entre 20 e 150 kD e um ou mais ácidos nucleicos; e

c) uma camada exterior de revestimento polimérica compreendendo um ou mais polímeros anfifílicos selecionados de entre o grupo dos polímeros contendo polietilenoglicol ou polióxido de propileno.

Em outros aspectos da presente invenção as nanopartículas consistem em pelo menos entre 1,0 e 3,0 % (m/m^ _{de nanopartículas} i_lpídlcas sólidas) de um lípido sólido e pelo menos 12,5 a 50 % (m/m_lípldo) de um agente tensioactivo não iónico. 0 lípido sólido utilizado pode compreender pelo menos um acilglicerol selecionado de entre um mono, um di ou um triacilglicerol de cadeia carbonada entre C₁₆ e C₂₂ ou uma sua mistura e de preferência é um palmitoestearato de glicerilo com cadeia carbonada de C₁₆, composto por e 80% de ácido palmítico mono, di e tri-esterifiçado.

tensioativo é um tensioativo não iónico que pode ser selecionado de preferência de entre o grupo dos monoestearatos de sorbitano, polisorbato 60 ou 80.

Numa concretização preferida do sistema da presente invenção as nanopartículas lipídicas sólidas podem conter um ou mais ingredientes farmaceuticamente ativos permitindo uma terapia conjugada; de farmaceuticamente ativo particular preferidos paclitaxel, agentes podem o docetaxel os que entre os múltiplos ingredientes utilizáveis podem referir-se em antineoplásicos; antineoplásicos ser usados são por exemplo o ou a doxorubicina; concentrações especialmente adequadas de paclitaxel estão entre 80 e 200 μς por ml de produto.

Quando o sistema de compreende ácidos nucleicos (ácido desoxirribonucleico), acordo com a estes podem ou RNA, em presente invenção compreender DNA especial siRNA o miRNA, e porções ou fragmentos dos mesmos. 0 siRNA ou o miRNA podem ser seletivos para uma sequência específica de RNA mensageiro que controla a síntese de uma proteína.

polímero anfifílico que constitui a camada exterior de revestimento compreende de preferência um polímero com a seguinte estrutura:

PEG-PE em que PEG significa polietilenoglicol com peso molecular compreendido entre

1000 e 2000 e PE significa fosfatildiletanolamina.

Em uma variante preferida do sistema da presente invenção, a camada exterior de cobertura pode estar funcionalizada por ligação de um ou mais anticorpos ou fragmentos de anticorpos, para receptores celulares específicos.

Opcionalmente, o sistema de acordo com a presente invenção pode compreender um ligando selecionado de entre o grupo constituído por péptidos, anticorpos ou um fragmento de anticorpo, em particular cetuximab, anti-CD44, bevacizumab ou o transtuzuma.

Constitui um outro objecto da presente invenção um sistema farmacêutico transportador de poliplexes peguilado que compreende um núcleo constituído por nanopartículas lipídicas sólidas, não poliméricas, submicrométricas, rodeado por unidades de poliplex de quitosano, ou um seu derivado e um ou mais ácidos nucleicos, seus derivados, porções ou fragmentos.

Num outro aspecto a presente invenção tem por objecto um processo de preparação de um sistema farmacêutico transportador de poliplexes da presente invenção que compreende os passos de:

a) mistura de uma solução aquosa de quitosano ou de um seu derivado com uma solução aquosa de um ácido nucleico, uma sua porção ou fragmento, e incubação durante 15 a 30 minutos, para obter um poliplex ou complexo polimérico de quitosano e de um ácido nucleico, uma sua porção ou fragmento; b) incorporação nanopartículas diâmetro entre do poliplex obtido no passo a) em lipídicas sólidas estabilizadas, com um 20 e 250 nm, contendo um fármaco ou ingrediente activo, conjugado intermediário nanopartículas -poliplex;

c) revestimento por intermediário obtido ou não pelo menos para obter um lipídicas sólidas peguilação no passo b) do grupo dispersão lipídicas sólidas-poliplex, do conjugado re-hidratando um polímero anfifílico polioxietilenos com conjugado nanopartículas a forma de filme seco; e d) opcionalmente, funcionalização da conjugado peguilado submicrométrico, diâmetro de partícula médio inferior a 1 dos polímeros constituída pelo sob superfície

i.e. com do um micron, obtido.

A fracçao hidrófila do polímero anfifílico, numa forma de concretização preferida, é funcionalizada com péptidos, anticorpos ou preferivelmente cetuximab, um fragmento de anticorpo, anti-CD44, bevacizumab ou o transtuzumab.

Igualmente a presente invenção tem por objecto o processo de preparação de um sistema farmacêutico transportador de poliplexes segundo o qual o poliplex é incorporado em nanopartículas lipídicas sólidas, não poliméricas, submicrométricas de modo que as nanopartículas ficam cobertas de unidades de poliplex com diâmetros médios de 200 nm.

Adicionalmente a invenção tem por objecto composições farmacêuticas que compreendem uma quantidade farmaceuticamente eficaz de pelo menos um sistema transportador de ácidos nucleicos da presente invenção.

sistema e composições de acordo com a invenção podem ser usados por exemplo como medicamentos no tratamento de tumores sólidos, primários ou resultantes da fixação de metástases por terapia génica, combinada ou não com fármacos convencionais. Tais sistemas e composições destinam-se ao uso pela via de administração tópica, intravenosa, subcutânea e intraperitoneal.

Estas e outras vantagens da presente invenção ficarão mais evidentes e serão melhor compreendidas com recurso às figuras, descrição e reivindicações anexas que se seguem.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

As Figuras 1 a) e 1 b) são gráficos de fluorescência que representam a internalização das nanoparticulas com siRNA-GFP (proteína de fluorescência verde) marcadas com FITC (isotiocianato de fluoresceína) determinada por citometria de fluxo. No eixo das abcissas da Figura la) representa-se a detecção da dispersão frontal e no eixo das ordenadas a detecção da dispersão lateral. No eixo das abcissas das Figuras lb) representa-se a detecção por fluorescência e no eixo das ordenadas a contagem de células.

A Figura 1 a) corresponde ao controlo negativo (células não incubadas com partículas). Este controlo negativo está representado na Figura 1 b) pela curva i, representando as curvas ii e iii a internalização completa no interior das células de tumor maligno da mama MDA-MB-231/GFP das partículas, ao fim de 2 horas e 4 horas, respectivamente.

É possível verificar um ligeiro aumento no número de células GFP negativas nas células que foram incubadas com as nanopartículas com siRNA-GFP, mostrando a actividade de silenciamento das partículas.

As Figuras 2 a), 2 b) e 2 c) são fotografias obtidas por microscopia confocal de células de tumor maligno da mama MDA-MB-231, após duas horas de incubação com o transportador de poliplexes (CO305); as manchas assinaladas com x correspondem às partículas marcadas com FITC, as manchas marcadas com y correspondem aos lisossomas marcados com reagente vermelho Lysotracker®, a mancha marcada com z corresponde aos núcleos das células marcados com um marcador fluorescente de DNA nuclear como o marcador azul fluorescente de ácidos nucleicos (DAPI), as manchas marcadas com w representam a co-localização das nanopartículas nos lisossomas. A linha branca é a escala e marca os 10 pm.

Os gráficos das Figuras 3 a) e 3 b) correspondem à formulação sem siRNA e os gráficos das Figuras 3 c) e 3 d) às partículas com siRNA.

No eixo das abcissas das Figuras 3 a) e 3 c) representa-se a detecção da dispersão frontal e no eixo das ordenadas a detecção da dispersão lateral. No eixo das abcissas das Figuras 3b) e 3 d) representa-se a detecção por fluorescência verde e no eixo das ordenadas a contagem de células.

As figuras 3 a) e 3 b) correspondem ao grupo controlo em que as células foram incubadas nas mesmas condições com nanopartículas sem o siRNA-GFP.

As Figuras 3 c) e 3 d) são gráficos relativos à eficácia de silenciamento da proteína GFP, após incubação com 15,0 nM de siRNA-GFP incluído no transportador de poliplexes CO254 por um período de 6h. As curvas representam a população de células de tumor maligno da mama MDA-MB-231/GFP viáveis.

As Figuras 4a) e 4 b) são gráficos de fluorescência relativos à eficácia de silenciamento da proteína GFP, representando o eixo das ordenadas a contagem de células, o eixo das abcissas a emissão de fluorescência, o pico i as células com GFP, positivas, e todas as células incluídas no intervalo considerado para as células sem GFP, negativas.

As Figuras 4a) e 4 b) são gráficos de fluorescência que representam a internalização das nanopartículas com miRNA marcadas com FITC por citometria de fluxo em MDA-MB231/GFP. No eixo das abcissas da Figura 4 a) representa-se a detecção da dispersão frontal e no eixo das ordenadas a detecção da dispersão lateral. No eixo das abcissas das Figuras 4 b) representa-se a detecção por fluorescência e no eixo das ordenadas a contagem de células. A Figura 4 a) corresponde ao controlo negativo (células não incubadas com partículas). Este controlo negativo está representado na Figura 4 b) pela curva i, representando as curvas ii e iii a internalização completa no interior das células de tumor maligno da mama MDA-MB-231/GFP das partículas, ao fim de 2 horas e 4 horas, respectivamente.

As Figuras 5 a), 5 b) e 5 c) são fotografias obtidas por microscopia confocal relativas à internalização das nanopartículas com pDNA marcadas com FITC de células de tumor maligno da mama MDA-MB-231, após duas horas de incubação com as nanopartículas; as manchas assinaladas com x correspondem às partículas marcadas com FITC, as manchas marcadas com y correspondem aos lisossomas marcados com reagente vermelho Lysotracker®, a mancha marcada com z são os núcleos das células marcados com um marcador fluorescente de DNA nuclear como o DAPI, as manchas marcadas com w representam a co-localização das nanopartículas nos lisossomas. A linha branca é a escala e marca os 10 pm.

As Figuras 6 a), 6 b) e 6 c) são fotografias obtidas por microscopia confocal relativas à internalização das nanopartículas com pDNA marcadas com FITC, em células de tumor maligno da mama MDA-MB-231, após duas horas de incubação com as nanopartículas; as manchas assinaladas com x correspondem às partículas marcadas com FITC, as manchas marcadas com y correspondem aos lisossomas marcados com reagente vermelho Lysotracker®, a mancha marcada com z são os núcleos das células marcados com um marcador fluorescente de DNA nuclear como o DAPI, as manchas marcadas com w representam a co-localização das nanopartículas nos lisossomas. A linha branca é a escala e marca os 10 pm.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENÇÃO

De modo a alcançar a aplicabilidade biomédica para a terapia génica as barreiras biológicas têm que ser ultrapassadas. Os ácidos nucleicos nus apresentam frequentemente uma biodisponibilidade comprometida, que se relaciona geralmente com a entrega sistémica in vivo e ulterior localização intracelular, nomeadamente clearance/eliminação rápida, fraca absorção celular e degradação mediada por nuclease. Assim, têm sido procuradas estratégias para permitir obter sistemas de entrega de genes eficientes, prevenindo a perda de actividade e melhorando a eficiência de transfecção.

As soluções da arte anterior mais recente envolvem a utilização de complexos catiónicos, lipidicos ou poliméricos, ou ainda, a produção de nanotransportadores coloidais, virais ou não virais, para a veiculação de sequências de ácidos nucleicos. As limitações reportadas são maioritariamente relacionadas com a administração internalização nucleotidicas

2011/0287547].

celular e a libertação no citoplasma da célula A patente US 2011/0287547, solução uma vez que configura um complexo das alvo in vivo, a sequências [ref, US por exemplo não representa uma positivo em que os valores de toxicidade relatados se apresentam mantidos.

Para obviar as limitações associadas à terapêutica com base em ácidos nucleicos, nomeadamente com siRNA e com miRNA, proporciona-se pela presente invenção um sistema transportador de poliplexes ou conjugado utilizando como polímero catiónico o quitosano ou um seu derivado, como por exemplo o glicolquitosano, que é capaz de promover o escape endossomal do material genético através do já definido efeito esponja. O poliplex é incorporado em nanoparticulas lipídicas com vista a obter composições terapêuticas particularmente adequadas à maximização da internalização celular do sistema que transporta o material genético. A composição farmacêutica da presente invenção está protegida por um revestimento hidrófilo, obtido por peguilação da nanopartícula lipídica transportadora de poliplexes,

permitindo	a sua administraçao sistémica.
No	sistema ou conjugado peguilado da presente
invenção,	lipídico, para o transporte de um ou mais

complexos ácido nucleico-quitosano, os referidos complexos estão posicionados intermediariamente entre o núcleo lipidico e o revestimento hidrófilo com PEG ou um seu derivado. A capacidade de polímeros catiónicos, como o quitosano ou os seus derivados para complexar com polianiões como os ácidos nucleicos (poliplex) está sobejamente comprovada [Ogris M, Wagner E.; Targeting tumors with nonviral gene delivery systems; Drug Discovery Today; 2002; 7(8):479-485] .

O conjugado peguilado transportador de um ou mais poliplexes, permite a administração in vivo de ácidos nucleicos, obviando os problemas de toxicidade verificados com os poliplexes catiónicos recorrentemente descritos na literatura [Kapoor, Diane J. Burgess, Siddhesh D. Patil; Physicochemical characterization techniques for lipid based delivery systems for siRNA; International Journal of Pharmaceutics; 2012; 427:35—57] por ser capaz de ultrapassar as barreiras biológicas devido à carga neutra e ao efeito de nuvem hidrófila conferidos pelo revestimento com PEG ou um seu derivado.

O sistema da presente invenção compreende pelo menos um ligando de superfície, compreendendo o ligando um anticorpo ou um fragmento de anticorpo capaz de reconhecer receptores de membrana caracteristicamente sobre-expressos nas células neoplásicas, como por exemplo, o anti-CD44 ou o anti-VEGF.

Adicionalmente a conhecida avidez sinérgica presente na ligação entre este polímero catiónico e compostos lipídicos foi considerada na presente invenção para promover a adsorção do esqueleto positivamente protonado de quitosano complexado com os ácidos nucleicos—poliplex, às nanopartículas lipídicas as quais podem conter na sua matriz um fármaco ou estar vazias.

As abordagens terapêuticas que permitem direcionar os ácidos nucleicos têm sido alvo de extensa investigação, como forma de ultrapassar a ausência de seletividade dos transportadores coloidais em geral. 0 aumento de permeabilidade da vasculatura do tumor é, juntamente com o bloqueio da drenagem linfática, o factor que mais contribui para a acumulação de nanopartículas nos tecidos tumorais, um mecanismo que é conhecido por efeito de permeabilidade e retenção (EPR). A peguilação que caracteriza a composição farmacêutica da presente invenção proporciona um sistema transportador de poliplexes do tipo conjugado-camada externa revestido com uma ou mais camadas de polímeros anfifílicos com a fracção hidrófila disposta para a zona exterior, protegendo deste modo o sistema das interações com os fluidos biológicos após administração local ou por via sistémica. Tal revestimento permite ainda o aumento do tempo de circulação do sistema [Pecot CV, Calin GA, Coleman RL, Lopez-Berestein G, Sood AK; RNA interference in the clinic: challenges and future directions; Nat Rev Câncer; 2011 Jan;ll(l):59-67].

Com as vantagens de ser não reconhecível pelo sistema do complemento, de ser específico para células neoplásicas, caracterizadas por conter pelo menos um receptor de membrana sobre-expresso, de promover via efeito esponja a libertação do ácido nucleico no citoplasma da célula alvo e, de permitir em certos modos de realizaçao combinações com ingredientes farmaceuticamente ativos, a composição farmacêutica objecto da presente invenção configura uma solução única que ultrapassa todas as limitações da arte anterior acima descritas.

Outras vantagens e características da invenção tornar-se-ão evidentes a partir da descrição detalhada da mesma que se segue e pode ser realizada por meio dos elementos e combinações particularmente reivindicados nas reivindicações anexas.

As nanoparticulas lipídicas usadas são selecionadas de entre as adequadas para qualquer via de administração incluindo pulmonar, tópica, intravenosa, subcutânea e intraperitoneal.

As nanoparticulas lipídicas podem estar vazias ou compreender quaisquer ingredientes farmaceuticamente ativos isolados ou em combinação. Exemplos de ingredientes ativos farmaceuticamente activos particularmente adequados são os agentes antineoplásicos como, por exemplo, o paclitaxel, o docetaxel ou a doxorubicina.

Exemplos paclitaxel são as sólido (m/m total (m/m de lípido) e composição final.

de que de nanoparticulas adequadas contendo compreendem entre 1,0 e 3,0% de lípido SLN), 25 a 50 % de agente tensioactivo entre 80 a 200 μς de paclitaxel por ml de resulta conjugado poliplex-nanopartículas lipídicas sólidas da ou quitosano negativas. O ligaçao por interações electrostáticas do um seu derivado às entre o grupo e 250 kDa.

quitosano ou um seu dos glicolquitosanos, sistema ácidos nucleicos nanoparticulas lipídicas derivado é selecionado de preferência entre 10 invenção permite direcionar em transportadores coloidais neoplásicas uma vez que os por ligação aos receptores da da presente incorporados seletivamente para células ligandos de superfície podem, membrana celular, modular a entrada seletiva na célula alvo, em qualquer estádio da doença.

Após entrada na célula e durante a permanência nas vesículas endossómicas, o polímero anfifílico é lisado libertando a nanopartícula lipídica coberta com o complexo quitosanosiRNA que promove a ruptura endossomal, libertando o material genético no citoplasma e evitando simultaneamente o processo de digestão que poderia ocorrer no endossoma maduro e a exposição dos ácidos nucleicos a um ambiente de PH muito baixo. Ao mesmo tempo que a nanopartícula lipídica se apresenta às enzimas endossómicas para ser digerida. Após digestão do lípido, o fármaco activo é libertado igualmente no citoplasma.

A invenção tem por objecto adicional o processo de preparação do sistema de transporte de poliplex da presente invenção, conjugado poliplex-SLN peguilado que compreende o revestimento do referido conjugado por meio da re-hidratação de um filme de polímero anfifílico, compreendendo pelo menos entre 1 a 2 mg/ml (total da formulação), selecionado de entre o grupo dos polímeros contendo poli etilenoglicol, como por exemplo, PEG-PE (PM=1000 e PM=2000) ou copolímeros tribloco PEO-PPO-PEO, na qual PPO é poli(óxido de propileno), com diferentes graus que dependem de parâmetros como o peso molecular, nomeadamente os poloxâmeros com grau 68, 108, 124, 237, 338 e 407.

Os poliplexes preparados com glicolquitosano são particularmente adequados para permitir pelo referido efeito esponja a ruptura precoce do endossoma, libertando, assim, o ácido nucleico no citoplasma. O quitosano e os seus derivados, por exemplo os glicolquitosanos, são conhecidos pela sua afinidade para compostos lipídicos. A literatura refere para formas farmacêuticas orais destes compostos uma actividade de absorção de gorduras compatível com perda de peso [Lang Guenther, Wendel Harald, Konrad Eugen; Quaternary hydroxy-propyl-substituted chitosan derivatives, cosmetic compositions based thereon and processes for the production thereof; US 4772689].

processo de preparação do conjugado peguilado submicrométrico, contendo pelo menos um complexo polimérico de quitosano ligado a um transportador lipidico compreende:

(i) preparação de nanopartículas lipídicas (SLN) com diferentes percentagens de lípido, diferentes percentagens de polisorbato 80 e diferentes concentrações de ingrediente activo, de modo a obter nanopartículas com um diâmetro compreendido entre 20 e 250 nanómetros (nm), (ii) preparação de um poliplex, ou seja um complexo polimérico entre o quitosano ou um seu derivado e um ácido nucleico, por incubaçao dos dois componentes durante 15 a 30

minutos, entre os 20 e 232 c,
(iii)	incorporação	do	poliplex no	sistema
transportador	lipidico (SLN),	de	modo a obter um	conjugado
intermediário	onde o sistema	SLN	transporta pelo	menos um
ácido nucleico	, ou seja, SLN-poliplex,

(iv) peguilação do conjugado intermediário obtido no passo (iii) por re-hidratação de um filme seco obtido com pelo menos um polímero anfifílico do grupo dos polímeros polioxietilenos com a dispersão constituída pelo conjugado SLN-poliplex, (v) funcionalização da superfície do conjugado peguilado, obtendo-se um sistema nanoparticulado, com um diâmetro médio entre os 2 0 e os 250 nm e com uma carga de superfície com valores entre os 0,185 e + 2,153 (mV).

As composições farmacêuticas da presente invenção compreendem um sistema farmacêutico transportador lipidico de complexos quitosano-sequência nucleotídica isoladas ou em combinação com veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

As composições farmacêuticas da presente invenção, são sistemas coloidais constituindo de acordo com a classificação galénica, formas farmacêuticas líquidas de aspecto esbranquiçado, pouco viscosas, em que a fase dispersa sólida se encontra dispersa no interior da fase externa aquosa. Podem ser utilizadas como base na preparação de outras formas farmacêuticas como por exemplo, cápsulas, geles, colírios, xaropes, aerossoles, cremes, etc. Quando presentes, os diluentes, lubrificantes e semelhantes são seleccionados de entre os disponíveis na arte farmacêutica.

Um perito na especialidade compreenderá que a presente invenção não está limitada à libertação de drogas ou agentes farmacêuticos. Quaisquer substâncias de ocorrência natural ou sintéticas, incluindo agentes de diagnóstico e materiais terapêuticos podem ser libertados de acordo com a presente invenção. Estas substâncias incluem, mas não estão a elas limitadas anoréticos, analgésicos, antiartríticos, agentes bloqueadores adrenérgicos, esteróides, vacinas, péptidos, hormonas, anticorpos, antibióticos, agentes antivirais, vitaminas, enzimas, genes, material genético, citotoxinas, bactérias, micróbios, agentes virais e semelhantes.

A dose a ser administrada, do fármaco citostático e do ácido nucleico, é ajustada à posologia clinicamente determinada. A concentração de fármaco incorporado nas SLN é determinada por HPLC, enquanto que a concentração de ácido nucleico é determinada por espectrofotómetro NanoDrop™.

Além disto o perito na especialidade compreenderá que a quantidade de produto ou substância farmacêutica usada na presente invenção dependerá da dose necessária a ser administrada e do tratamento desejado. 0 perito na especialidade compreenderá que tratamento se refere a qualquer finalidade desejada com a administração do ingrediente farmaceuticamente ativo incluindo prevenção, controlo, cura, manutenção ou melhoramento da saúde e semelhantes. Igualmente um perito na especialidade saberá que a presente invenção não está limitada à libertação de um único agentes- farmaceuticamente ativo. Efetivamente mais do que um agente farmacêutico pode ser libertado usando o sistema de libertação da presente invenção.

sistema farmacêutico e as composições farmacêuticas que o contêm são especialmente aptos para o tratamento seletivo de células tumorais, quando funcionalizado por adsorção à superfície peguilada do conjugado de péptidos, anticorpos ou fragmentos de anticorpos selecionados de preferência entre o cetuximab, anti-CD44, bevacizumab ou transtuzumab.

A composição terapêutica contendo o conjugado da presente invenção uma vez internalizada em uma célula neoplásica provoca o silenciamento específico de uma proteína codificada pelo mRNA alvo.

Um regime de administração sistémica permite a acumulação do sistema conjugado da presente invenção nos tecidos lesados, os ligandos ligados à superfície do conjugado peguilado, permitem um direcionamento seletivo para células cujos os receptores membranais dos ligandos acima referidos se apresentem sobre-expressos.

No contexto da presente descrição e reivindicações entende-se por poliplex um complexo formado por polímeros catiónicos e ácidos nucleicos por interações electrostáticas.

Qualquer gama ou valor aqui apresentado pode ser alterado, diminuído ou aumentado sem perda dos efeitos pretendidos, como será evidente para o perito na especialidade a partir das explicações aqui apresentadas.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Preparação de nanopartículas de lípidos sólidos (SLN)

Prepararam-se nanopartículas de lípidos sólidos (SLN) de acordo com o método de emulsificação/solidificação descrito na Patente de Invenção Portuguesa n.^ 104.693, que se considera aqui incorporada por referência. Os materiais de partida, suas quantidades e caracteristicas das SLN obtidas constam das Tabelas I a), I b) e I c), que se seguem.

Como será facilmente compreensível para um perito na especialidade, qualquer método de obtenção de nanopartículas de lípidos sólidos que originem partículas inferiores a 250 nm pode ser igualmente utilizado.

TABELA I a)

Composições do transportador de poliplexes peguilado sem fármaco e sem ácido nucleico com 12,5% (p/p lípido) de Tween 80

Palmistoestearato de glicerido C₁₆	1% (p/p total SLN)
PEG-PE (mg/ml)	2	4	6
Produto	SLN 101	SLN 102	SLN 103
Diâmetro médio (nm)	274	253	204
índice de Polidispersão	0,223	0,204	0,194

Palmistoestearato de glicerido C₁₆	1,5% (p/p total SLN)
PEG-PE (mg/ml)	2	4	6
Produto	SLN 201	SLN 202	SLN 203
Diâmetro médio (nm)	283	264	256
índice de Polidispersão	0,252	0,239	0,220

Palmistoestearato de glicerido C₁₆	2,0% (p/p total SLN)
PEG-PE mg/ml	2	4	6
Produto	SLN 301	SLN 302	SLN 303
Diâmetro médio (nm)	292	303	320
índice de Polidispersão	0,282	0,271	0,259

Palmistoestearato de glicerido C₁₆	3,0% (p/p total SLN)
PEG-PE (mg/ml)	2	4	6
Produto	SLN 401	SLN 402	SLN 403
Diâmetro médio (nm)	298	300	310
índice de Polidispersão	0,302	0,299	0,275

TABELA I b)

Composições do transportador de poliplexes peguilado sem fármaco e sem ácido nucleico com 25% (p/p lípido) de Tween 80

Palmistoestearato de glicerido C₁₆	1% (p/p total SLN)
PEG-PE (mg/ml)	2	4	6
Produto	SLN 104	SLN 105	SLN 106
Diâmetro médio (nm)	135	120	110
índice de Polidispersão	0,216	0,186	0,153

Palmistoestearato de glicerido C₁₆	1,5% (p/p total SLN)
PEG-PE (mg/ml)	2	4	6
Produto	SLN 204	SLN 205	SLN 206
Diâmetro médio (nm)	139	142	150
índice de Polidispersão	0,231	0,204	0,198

Palmistoestearato de glicerido C₁₆	2,0% (p/p total SLN)
PEG-PE mg/ml	2	4	6
Produto	SLN 304	SLN 305	SLN 306
Diâmetro médio (nm)	159	170	185
índice de Polidispersão	0,235	0,218	0,201

Palmistoestearato de glicerido C₁₆	3,0% (p/p total SLN)
PEG-PE (mg/ml)	2	4	6
Produto	SLN 404	SLN 405	SLN 406
Diâmetro médio (nm)	127	140	161
índice de Polidispersão	0,258	0,248	0,251

TABELA I c)

Composições do transportador de poliplexes peguilado sem fármaco e sem ácido nucleico com 50% (p/p lípido) de Tween 80

Palmistoestearato de glicerido C₁₆	1% (p/p total SLN)
PEG-PE (mg/ml)	2	4	6
Produto	SLN 107	SLN 108	SLN 109
Diâmetro médio (nm)	86	92	30
índice de Polidispersão	0,103	0,176	0,149

Palmistoestearato de glicerido C₁₆	1,5% (p/p total SLN)
PEG-PE (mg/ml)	2	4	6
Produto	SLN 207	SLN 208	SLN 209
Diâmetro médio (nm)	112	118	124
índice de Polidispersão	0,203	0,181	0,170

Palmistoestearato de glicerido C₁₆	2,0% (p/p total SLN)
PEG-PE mg/ml	2	4	6
Produto	SLN 307	SLN 308	SLN 309
Diâmetro médio (nm)	129	140	148
índice de Polidispersão	0,239	0,201	0,196

Palmistoestearato de glicerido C₁₆	3,0% (p/p total SLN)
PEG-PE (mg/ml)	2	4	6
Produto	SLN 407	SLN 408	SLN 409
Diâmetro médio (nm)	110	118	131
índice de Polidispersão	0,231	0,224	0,220

Os resultados obtidos indicados nas Tabelas I a), I b) e I

c), demonstram que o diâmetro médio do sistema transportador peguilado diminui com o aumento da percentagem de tensioactivo (p/p total de SLN). 0 efeito do aumento de PEGPE não é significativo. A partir de estes dados selecionouse o transportador SLN 105 para ensaio subsequente no transporte de fármacos e ácidos nucleicos.

Exemplo 2

Preparação do intermediário poliplex-complexo siRNA quitosano.

a. Preparação do poliplex

Mistura-se uma solução aquosa de ácido nucleico, p.ex. siRNA, diluída (25.000nM) numa solução aquosa de quitosano (1000 μς/ιηΐ) ou de um seu derivado como o glicolquitosano. A mistura obtida é agitada vigorosamente (vortex) durante o tempo necessário para obter uma mistura homogénea, habitualmente alguns segundos. A mistura homogénea é deixada incubar até obtenção do poliplex desejado sob a forma de solução homogénea a uma temperatura adequada, normalmente entre 15 e 2 0^ c, normalmente 18^ c, durante alguns minutos, habitualmente 25 a 30 minutos.

Seguindo o procedimento acima indicado, prepararam-se vários outros poliplexes variando a concentração de material genético de forma adequada para uma concentração na formulação final entre 100 e 1000 nM e variando a concentração da solução aquosa de quitosano entre 22 e 1000 μς/ιηΐ e que constam das Tabelas II a), II b) e II c), que se seguem.

b. Preparação do produto intermédio SLN-poliplex por incorporação do poliplex nas nanopartículas lipídicas

Após arrefecimento das nanopartículas lipídicas a temperaturas entre os 18^ C e os 25^ C, o poliplex é incorporado sob agitação magnética suave, até obtenção de um intermediário de sistema farmacêutico transportador de poliplexes peguilhado, líquido esbranquiçado com aspecto homogéneo constituído por nanopartículas cobertas de unidades de poliplex com diâmetros médios da ordem dos 200 nanómetros, habitualmente durante 4 horas.

Semelhantemente, prepararam-se vários conjugados peguilados variando a proporção o intermediário poliplex:nanopartículas entre 1:1 a 1:3 (volume/volume) como descrito nas Tabelas II a), II b) e II c), e nos exemplos seguintes, tendo como base o produto SLN 105 (Tabela I b)).

Como se observa pelos dados das Tabelas II a), II b) e II c), o silenciamento aumenta para razões SLN:poliplex de 1:2 (v/v).

TABELA II a)

Eficácia de silenciamento da proteína GFP de diferentes conjugados peguilados com base no produto SLN 105, em células de tumor maligno da mama MDA-MB-231/GFP em cultura, para concentrações finais de 100 nM de siRNA

Quitosano	20 μς/ιηΐ
SLN:poliplex	1:1	1:2	1:3
Conjugado peguilado	CO 21	CO 22	CO 23
Silenciamento	2%	3%	5%

Quitosano	250 μς /ml
SLN:poliplex	1:1	1:2	1:3
Conjugado peguilado	CO 251	CO 252	CO 253
Silenciamento	6%	12%	10%

Quitosano	500 μς /ml
SLN:poliplex	1:1	1:2	1:3
Conjugado peguilado	CO 301	CO 302	CO 303
Silenciamento	5%	10%	8%

Quitosano	1000 μς /ml
SLN:poliplex	1:1	1:2	1:3
Conjugado peguilado	CO 1001	CO 1002	CO 1003
Silenciamento	25%	34%	30%

TABELA II b)

Eficácia de silenciamento da proteína GFP de diferentes conjugados peguilados com base no produto SLN 105, em células de tumor maligno da mama MDA-MB-231/GFP em cultura, para concentrações finais de 300 nM de siRNA

Quitosano	20 μς/ιηΐ
SLN:poliplex	1:1	1:2	1:3
Conjugado peguilado	CO 24	CO 25	CO 26
Silenciamento	7%	9%	8%

Quitosano	250 μς /ml
SLN:poliplex	1:1	1:2	1:3
Conjugado peguilado	CO 254	CO 255	CO 256
Silenciamento	15%	23%	20%

Quitosano	500 μς /ml
SLN:poliplex	1:1	1:2	1:3
Conjugado peguilado	CO 304	CO 305	CO 306
Silenciamento	15%	25%	21%

Quitosano	1000 μς /ml
SLN:poliplex	1:1	1:2	1:3
Conjugado peguilado	CO 1004	CO 1005	CO 1006
Silenciamento	36%	45%	40%

TABELA II c)

Eficácia de silenciamento da proteína GFP de diferentes conjugados peguilados com base no produto SLN 105, em células de tumor maligno da mama MDA-MB-231/GFP em cultura, para concentrações finais de 1000 nM de siRNA

Quitosano	20 μς/ιηΐ
SLN:poliplex	1:1	1:2	1:3
Conjugado peguilado	CO 2 7	CO 2 8	CO 2 9
Silenciamento	10%	12%	11%

Quitosano	250 μς /ml
SLN:poliplex	1:1	1:2	1:3
Conjugado peguilado	CO 257	CO 258	CO 259
Silenciamento	40%	54%	49%

Quitosano	500 μς /ml
SLN:poliplex	1:1	1:2	1:3
Conjugado peguilado	CO 307	CO 308	CO 309
Silenciamento	40%	54%	49%

Quitosano	1000 μς /ml
SLN:poliplex	1:1	1:2	1:3
Conjugado peguilado	CO 1007	CO 1008	CO 1009
Silenciamento	60%	86%	79%

Exemplo 3

Preparação do conjugado C0305

Preparou-se um poliplex quitosano-siRNA-GFP a partir de 491 μΐ de uma solução aquosa de glicolquitosano a 500 μς/ιηΐ de água e de 9 μΐ de uma solução aquosa siRNA-GFP 50000 nM à temperatura de 232 C sob forte agitação (vortex) durante 1 minuto. Incorporaram-se 500 μΐ de poliplex obtido em 1000 μΐ do produto SLN 105 (Tabela I b)) na proporção 1:2 (v/v), resultando no conjugado desejado com uma concentração final de siRNA de 300 nM. Após agitação magnética durante 4 horas, à temperatura ambiente do conjugado obtido, o mesmo foi peguilado por re-hidratação de um filme de PEG-PE preparado por evaporação a pressão reduzida a partir de 600 μΐ de uma solução de PEG-PE a 10 mg/ml produzindo o conjugado peguilado CO305 (Tabela II b)).

A superfície do conjugado CO305 foi funcionalizada por adsorção do anticorpo Cetuximab marcado com FITC, por agitação durante 2 min à temperatura ambiente, ao abrigo da luz, para uma concentração final de anticorpo de 14 nM.

Exemplo 4

Preparação do conjugado CO254

Usou-se o procedimento descrito no exemplo 1, com a exceção da utilização de uma solução aquosa de glicolquitosano a 250 μ9/πι1 para formar o poliplex. Misturaram-se 500 μΐ de poliplex em 500 μΐ do produto SLN 105 (Tabela I b)) na proporção 1:1 (v/v), obtendo-se o conjugado peguilado desejado CO254 com uma concentração final de siRNA 300 nM (Tabela II b)).

Exemplo 5

Preparação do conjugado com um ácido nucleico siRNA-ErbB3

Usou-se o procedimento descrito no exemplo 1, com a exceção da preparação do poliplex em que foram utilizados 241 μΐ de uma solução aquosa de glicolquitosano a 20 μg/ml para formar o poliplex com 9 μΐ de uma solução aquosa de siRNA-ErbB3 25000 nM. Misturaram-se 250 μΐ do poliplex em 500 μΐ do produto SLN 105 (Tabela I b)) na proporção 1:2 (v/v), obtendo-se o conjugado peguilado desejado com uma concentração final de siRNA-ErbB3 300 nM.

Exemplo 6

Preparação do conjugado CO254 com um ácido nucleico miRNA hsa-miR-29a

Usou-se o procedimento descrito no exemplo 1, com a exceção da preparação do poliplex em que foram utilizadas 480 μΐ de uma solução aquosa de glicolquitosano a 20 μg/ml para formar o poliplex com 20 μΐ de uma solução miRNAhsa-miR29a com 20.000 nM. Os 500 μΐ de poliplex foram incorporados em 1000 μΐ do produto SLN 105 (Tabela I b)) na proporção 1:2 (v/v), obtendo-se o conjugado peguilado desejado com uma concentração final de miRNA hsa-miR-29a 300 nM.

Exemplo 7

Preparação de um conjugado contendo um pDNA

Usou-se o procedimento descrito no exemplo 1, com a exceção da preparação do poliplex onde foi utilizada 241 μΐ de uma solução aquosa de glicolquitosano a 20 μς/ιηΐ para formar o poliplex com 9 μΐ de uma solução pDNA com 25000 nM. Misturaram-se 250 μΐ de poliplex em 500 μΐ da formulação SLN 105 (Tabela I b)) na proporção 1:2 (v/v), obtendo-se o conjugado peguilado desejado com uma concentração final de pDNA de 300 nM.

Exemplo 8

Eficácia de transfecção do conjugado C0305 obtido no exemplo 1

A eficácia de transfecção do conjugado CO305 (Tabela II b)), obtida no exemplo 1, foi avaliada in vitro por citometria de fluxo e microscopia confocal em células de tumor maligno da mama MDA-MB-231. Para tal, 100.000 células de tumor maligno da mama MDA-MB-231 foram incubadas com 100 μΐ de amostra de conjugado C0505 diluída em meio de cultura RPMI 1640, a 1:20 (v/v). A amostra de células aderentes incubadas com o conjugado CO305 foi dividida em dois lotes, sendo o primeiro lote A incubado durante duas horas (ii) e o segundo lote B incubado durante quatro horas (iii). Após incubação, o meio de cultura com a amostra foi retirado, e as células aderentes lavadas com meio fresco. As células lavadas foram tripsinizadas e ressuspendidas em tampão fosfato (PBS). A internalização celular foi medida por análise por citometria de fluorescência (FACS) (figuras 1 a)

e 1 b)) e revelando	microscopia confocal (figuras 2 uma eficiência de internalização	a) , 2 b) superior	e 2 c) ), a 90%.
Exemplo 9
Eficácia	de	silenciamento	e	internalização do	conjugado

CO254 do exemplo 2

A eficácia de silenciamento produzido por 15,0 nM siRNA-GFP transportado pelo conjugado CO254 (Tabela II b)), foi avaliada in vitro por análise por citometria de fluxo (FACS) (figuras 3 a), 3 b), 3 c) e 3d)) em células de tumor maligno da mama MDA-MB-231/GFP em cultura. Cerca de 100.000 células estiveram em contacto com 15,0 nM siRNA-GFP transportado pelo conjugado CO254 por um período de incubação de 2 h ou 4 h a 372 C com 5% de humidade relativa (HR) . Após incubação, o meio de cultura com a amostra foi retirado, e as células aderentes lavadas com meio fresco. Após lavagem, as células foram tripsinizadas e ressuspendidas em tampão fosfato (PBS). Os resultados obtidos mostram uma eficiência de silenciamento em 15 % das células (Figura 3 c) e 3 d)) frente a 5,3% de células negativas obtidos no grupo controlo (células incubadas nas mesmas condições com conjugados sem siRNA, Figuras 3 a) e 3

b)).

Exemplo 10

Eficácia de transfecção do conjugado do exemplo 3

A eficácia de transfecção do conjugado produzido no exemplo 3, foi avaliada in vitro por análise por citometria de fluxo (FACS) em células do cancro do pulmão A549-GFP em cultura. Cerca de 100.000 células estiveram em contacto com 15,0 nM siRNA-ErbB3 transportado pelo conjugado obtido no exemplo 3, por um período de incubação de 6 h a 372 C com 5% HR. Após incubação, o meio de cultura com a amostra foi retirado, e as células aderentes lavadas com meio fresco. Após lavagem, as células foram tripsinizadas e ressuspendidas em tampão fosfato (PBS). Os resultados obtidos mostram uma eficiência de internalização superior a 75%.

Exemplo 11

Eficácia de transfecção do conjugado do exemplo 4

A eficácia de transfecção do conjugado, obtido no exemplo 4, foi avaliada in vitro por análise por citometria de fluxo (FACS) e por microscopia confocal em células de tumor maligno da mama MDA-MB-231. Cerca de 100.000 células estiveram em contacto com 15,0 nM de miRNA hsa-miR-29a transportado pelo conjugado peguilado preparado no exemplo 4, por um período de incubação de 2 h e um grupo incubado por 4 h a 375 C com 5% HR. Após incubação, o meio de cultura com a amostra foi retirado, e as células aderentes lavadas com meio fresco. Após lavagem, as células foram tripsinizadas e ressuspendidas em tampão fosfato (PBS). A internalização celular foi medida por análise por citometria de fluorescência (FACS) (figuras 4a) e 4 b)) e microscopia confocal (figuras 5 a), 5 b) e 5 c)), revelando uma eficiência de internalização superior a 90%.

Exemplo 12

Eficácia de transfecção do conjugado do exemplo 5

A eficácia de transfecção do conjugado, obtido no exemplo 5, foi avaliada in vitro por microscopia confocal em 100.000 células de tumor maligno da mama MDA-MB-231 (Figura 6 a), 6 b) e 6 c)). Cerca de 100.000 células estiveram em contacto com 15,0 nM de pDNA transportado pelo conjugado por um período de incubação de6ha37^C com 5% HR. Após incubação, o meio de cultura com a amostra foi retirado, e as células aderentes lavadas com meio fresco. Após lavagem, as células foram tripsinizadas e ressuspendidas em tampão fosfato (PBS). A internalização celular foi observada por microscopia confocal (figuras 6 a), 6 b) e 6 c)), revelando um elevado grau de internalização.

Lisboa, 27 de Setembro de 2014

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Sistema farmacêutico transportador de poliplexes caracterizado por consistir em:

a) um núcleo constituído por nanopartículas lipídicas sólidas, não poliméricas, submicrométricas i.e. com um diâmetro de partícula médio inferior a 1 micron;

b) uma zona intermédia compreendendo um poliplex polimérico de glicolquitosano, o qual compreende 25 a 50% (v/v) de glicolquitosanos com um peso molecular entre 20 e 150 kD e um ou mais ácidos nucleicos; e

c) uma camada exterior de revestimento polimérica compreendendo um ou mais polímeros anfifílicos selecionados de entre o grupo dos polímeros contendo polietilenoglicol ou polióxido de propileno.
2. Sistema farmacêutico transportador de poliplexes de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as nanopartículas consistirem em entre 1,0 e 3,0 % (m/m_{total de}nanopartículas lipídicas sólidas) de um lípido sólido e pelo menos 12,5 a 50 % (m/m_lípldo) de um agente tensioactivo não iónico.
3. Sistema farmacêutico transportador de poliplexes de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado por o lípido sólido compreender pelo menos um

2/7 acilglicerol selecionado de entre um mono, um di ou um triacilglicerol de cadeia carbonada entre C₁₆ e C₂₂ ou uma sua mistura.

4. . Sistema farmacêutico transportador de poliplexes de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3,

caracterizado por o lípido sólido ser palmitoestearato de glicerilo com cadeia carbonada de C₁₆, composto por 80% de ácido palmítico mono, di e triesterifiçado.

5. . Sistema farmacêutico transportador de poliplexes de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4,

caracterizado por o tensioativo não iónico ser selecionado de preferência de entre o grupo dos monoestearatos de sorbitano, polisorbato 60 ou 80.

6. . Sistema farmacêutico transportador de poliplexes de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5,

caracterizado por as nanopartículas compreenderem um ou mais ingredientes farmaceuticamente ativos.

7. . Sistema farmacêutico transportador de poliplexes de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o

ingrediente farmaceuticamente ativo ser um agente antineoplásico.

8. . Sistema farmacêutico transportador de poliplexes de acordo com qualquer das reivindicações 6 ou 7, caracterizado por o agente antineoplásico ser selecionado de entre o

3/7 paclitaxel, o docetaxel ou a doxorubicina.

9. Sistema farmacêutico transportador de poliplexes de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o ingrediente farmaceuticamente ativo ser paclitaxel numa concentração de 80 a 200 μ9 por ml de produto.

10. Sistema farmacêutico transportador de poliplexes de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por os ácidos nucleicos compreenderem DNA, uma sua porção ou fragmento.

11. Sistema farmacêutico transportador de poliplexes de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por os ácidos nucleicos compreenderem RNA, uma sua porção ou fragmento.

12. Sistema farmacêutico transportador de poliplexes de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por os ácidos nucleicos compreenderem siRNA ou miRNA.

13. Sistema farmacêutico transportador de poliplexes de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o polímero anfifílico compreender um polímero com a seguinte estrutura:

PEG-PE em que PEG significa polietilenoglicol com peso molecular compreendido entre 1000 e 2000 e PE significa
4/7 fosfatildiletanolamina.

14. Sistema farmacêutico transportador de poliplexes de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado por a camada exterior de cobertura estar f uncionalizada por ligação de um ou mais anticorpos ou fragmentos de anticorpos, para receptores celulares específicos.

15. Sistema farmacêutico transportador de poliplexes de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado por compreender ainda um ligando selecionado de entre o grupo constituído por péptidos, anticorpos ou um fragmento de anticorpo, em particular cetuximab, anti-CD44, bevacizumab ou o transtuzumab.

16. Processo de preparação de um sistema farmacêutico

transportador de poliplexes de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado por compreender os passos de: a) mistura de uma solução aquosa de quitosano com uma

solução aquosa de um ácido nucleico, uma sua porção ou fragmento, e incubação durante 15 a 30 minutos, para obter um poliplex ou complexo polimérico de quitosano, e de um ácido nucleico, uma sua porção ou fragmento;

b) incorporação do poliplex obtido no passo a) em nanopartículas lipídicas sólidas estabilizadas, com um
5/7 diâmetro entre 2 0 e 250 nm, contendo ou nao um fármaco ou ingrediente activo, para pelo menos obter um conjugado intermediário nanopartículas lipídicas sólidas-poliplex;

c) revestimento por peguilaçao do conjugado intermediário obtido no passo b), re-hidratando um polímero anfifílico do grupo dos polímeros polioxietilenos com dispersão constituída pelo conjugado nanopartículas lipídicas sólidas-poliplex, sob a forma de filme seco; e

d) opcionalmente, funcionalização da superfície do conjugado peguilado submicrométrico i.e. com um diâmetro de partícula médio inferior a 1 micron, obtido.

17. Processo de preparação de um sistema farmacêutico transportador de poliplexes de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por a fracção hidrófila do polímero anfifílico ser funcionalizada com péptidos, anticorpos ou um fragmento de anticorpo.

18. Processo de preparação de um sistema farmacêutico transportador de poliplexes de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado por compreender ainda incorporação de um ligando selecionado de entre o grupo constituído por péptidos, anticorpos ou um fragmento de anticorpo, em particular cetuximab, anti-CD44, bevacizumab ou o
6/7 transtuzumab.

19. Processo de preparação de um sistema farmacêutico transportador de poliplexes de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo facto de as nanoparticulas cobertas de unidades de poliplex terem diâmetros médios de 200 nm.

20. Composição farmacêutica caracterizada por compreender uma quantidade farmaceuticamente eficaz de pelo menos um sistema transportador de ácidos nucleicos de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 15.

21. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 20, para uso como medicamento caracterizada pela via de administração tópica, intravenosa, subcutânea e intraperitoneal.

22. Sistema farmacêutico transportador de poliplexes tal como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, para uso no tratamento de tumores sólidos, primários ou resultantes da fixação de metástases por terapia génica, combinada ou não com fármacos convencionais.

23. Sistema farmacêutico transportador de poliplexes tal como reivindicado em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, para uso no tratamento de tumores sólidos, primários ou resultantes da fixação de metástases por terapia génica, combinada ou não com fármacos convencionais caracterizado
7/7 pela via de administração tópica, intravenosa, subcutânea e intraperitoneal.