Przedmiotem wynalazku jest sposób lacznego oznaczania izoenzymów 4 i. 5 dehydrogenazy mle¬ czanowej oraz odczynnik testowy do oznaczania Izoenzymów dehydrogenazy mleczanowej na dro¬ dze przemiany mleczanu i nikotynoamidoadenino- -dwunukleotydu w^ pirogronian. Sposób ten stosuje sie zwlaszcza do badania plynów ustrojowych.Wiadomo, ze dehydrogenaza mleczanowa zwykle 2wana w skrócie LDH, wystepuje w postaci pieciu izomerów. Przy oznaczaniu aktywnosci poszcze¬ gólnych izomerów wazna role odgrywa optymalny dobór róznych substratów oraz najkorzystniejszego pH. Dla poszczególnych izoenzymów wielkosci te nie sa jeszcze calkowicie znane.Dotychczas w celu oznaczania wszystkich izoen¬ zymów albo rozdzielano je metoda elektroforezy (porównaj np. „Izoenzyme der Lactatdehydroge- _nase", Reihe Biochemie und Klinik von S. L. Ko¬ walewski, G. Thieme Verlag, Stuttgart 1972, str. 29) albo z calosci LDH w roztworze wiazano LDH-2 do —5 i oznaczano najczesciej wystepujacy LDH-1.Opis dotychczasowej standardowej metody pracy znalezc mozna w ksiazce „Enzymatische Analyse" lom I, Verlag Chemie, Weinheim, 1970, strona 557.Jako najkorzystniejszy odczyn srodowiska reak¬ cji przemiany mleczanu w pirogranian podano tu wartosci pH 8,3—8,9. Faktycznie we wszystkich znanych metodach oznaczania, w celu mozliwie najpelniejszego ujecia izoenzymów, stosuje sie za¬ sadowy lub co najwyzej obojetny zakres pH.Stwierdzono, ze pod wplywem zmiany pH po¬ szczególne izoenzymy moga przechodzic jedne w drugie, a takze zachodzi zjawisko zmiany konfigu¬ racji, co naturalnie prowadziloby do przesuniecia rzeczywistych wartosci poszczególnych izoenzymów.Celem wynalazku jest wyeliminowanie wyste¬ pujacych w dotychczasowych metodach zbyt skom¬ plikowanych etapów rozdzielania i ciagle stwier¬ dzanych niedokladnosci oznaczania ogólnej ilosci izoenzymów oraz zapewnienie optymalnego ozna¬ czenia izoenzymów 4 i 5 LDH, które maja duze znaczenie w badaniu zmian patologicznych u lu¬ dzi i zwierzat. Dalszym celem wynalazku jest opra¬ cowanie zestawu odczynników oraz srodka diagno¬ stycznego umozliwiajacego specjalne zastosowanie sposobu wedlug wynalazku.Stwierdzono, ze obnizenie wartosci pH ponizej punktu zobojetnienia przy w zasadzie znanej re¬ akcji przemiany mleczanu i NAD w pirogronian, prowadzi do optymalnego uchwycenia izoenzymów 4 i 5, przy czym oczywiscie moze wystepowac je¬ den z dwóch enzymów lub oba enzymy razem.Sposób wedlug wynalazku polega na tym, ze"re¬ akcje prowadzi sie w srodowisku o pH 6 do 6,5.Wartosc pH waha sie w zaleznosci od stosowanego ukladu buforowego jednak optimum dla wiekszo¬ sci roztworów buforowych i praktycznie wszyst¬ kich oznaczen znajduje sie w podanym zakresie.Dla najczesciej stosowanego ukladu buforowego trójetanoloamina — NaOH optimum jest przy pH 38 61998 619 od 6,3 do 6,4. Takie pH przy stosowaniu praktycz¬ nie wszystkich roztworów buforowych jest odpo¬ wiednie do bardzo dobrego uchwycenia L.DH-4 i -5, które na przyklad wystepuja w plynach. Do reakcji wystarcza niewielka ilosc cieczy, jednak korzystnie prowadzi sie ja w srodowisku cieklym.Proces przemiany przebiega w znany sposób w temperaturze okolo 37°C. Przy tym ilosci koenzy¬ mu ustala sie tak, by byly one optymalne i wy¬ starczajaca dla wszystkich obecnych * izoenzymów, co mozna okreslic po przeprowadzeniu kilku ty¬ powych prób korzystajac z nizej podanych wska¬ zówek.Wiadomo, ze oznaczania izoenzymów 4 i 5 LDH maja duze znaczenie zwlaszcza przy badaniach ply¬ nów ustrojowych. Podczas gdy u zdrowego czlo¬ wieka omawiane izoenzymy wystepuja glównie w tkankach, to przy anormalnym wzroscie tkanki, leukemii lub innych chorobach wystepuja one w znacznym stezeniu w surowicy lub innych plynach ustrojowych. Stwierdzono, ze wystepuja one zwla¬ szcza w plynie pochwowym w wypadku patolo¬ gicznych zmian w dolnych kobiecych drogach rod¬ nych. Ich okreslenie pozwala wiec wczesnie posta¬ wic diagnoze zmian patologicznych.Metode oznaczania Wedlug wynalazku mozna stosowac do wszystkich plynów ustrojowych.Podczas gdy w metodzie standartowej (porównaj Enzymatische Analyse, tom I a.a.O) poleca sie jako optymalne stosowac pH 8,3 i 8,9, to w metodzie wedlug wynalazku swiadomie odbiega sie od tego zakresu pH. Przyczyny ustalenia wyzej podanego zasadowego zakresu pH nalezy szukac w tym, ze w rekacji Mleczan + NAD+ pirogronian + NADH + H+ powstaje proton w stosunku stechiometrycznym do przemiany mleczanu. Aby równowage LDH przesunac na prawo, prowadzi sie reakcje w sro¬ dowisku alkalicznym.Natomiast wedlug wynalazku np. przy oznacza¬ niu izoenzymów w surowicy lub osoczu badana próbke buforuje sie za pomoca ukladu trójetano- loamina NaOH do pH 6,3—6,4 i doprowadza takze do tej samej wartosci pH stosowanego w próbie odczynnika testowego. Dla oznaczen orientacyj¬ nych nastawia sie najpierw z grubsza pH na 6— —3,5 i potem buforuje tak, by w trakcie wlasci¬ wego oznaczania pH wynosilo scisle 6,3—6,4. Przy albuminie surowiczej dodaje sie w znany sposób glutation. Stosownie do tego przeprowadzenie op¬ tymalnego oznaczenia izoenzymów 4 i 5 dehydro¬ genazy mleczanowej przy pH 6,3^6,4 wymaga przesuniecia równowagi reakcji wedlug schematu LDH Mleczan + NAD+ ^ pirogronian + NADH + H+ w prawo za pomoca reakcji ubocznych. W tym ce- 60 lu dodaje sie w znany sposób metosiarczan fena- zyny, dzieki któremu koenzym NADH jest ciagle utleniany.Jednak przy niektórych plynach ustrojowych opisane wyzej stosunki sa inne, gdy wartosc ich 65 40 45 50 55 wlasnego pH znacznie odbiega od wartosci pH 6,3—6,4. Takim plynem ustrojowym jest zwlaszcza plyn pochwowy, którego pH wynosi okolo 4. W tym przypadku optymalna wartosc pH podczas przemiany uzyskuje sie za pomoca odpowiedniego odczynnika testowego. Oznacza to, ze stosuje sie odczynnik testowy o wyzszej wartosci pH, która obniza sie do wartosci 6—6,5, korzystnie 6,3—6,4 w obecnosci plynu pochwowego.Roztwór buforowy, odczynnik testowy lub sro¬ dek diagnostyczny powinien miec taka wartosc pH, aby w przypadku badanych plynów ustrójo^ wych o wartosci wlasnego pH odbiegajacej od wartosci 6—6,5 podczas przemiany mleczanu i ni- kotynoamidoadeino-dwunikleotydu w pirogronian pH wynosilo 6—6,5, korzystnie 6,3—6,4. W przy¬ padku stosowania suchego preparatu . wymagane pH dotyczy jego roztworu.W specjalnym przypadku badania plynu pochwo¬ wego, którego naturalna wartosc pH sie nie zmie¬ nia, szczególnie przydatny do oznaczania jest bu¬ for trójetanoloamina-NaOH, przy czym pH odczyn¬ nika testowego nastawia sie na 7, podczas gdy w przypadku badanych próbek nastawionych na war¬ tosc pH 6,3—6,4 odczynnik testowy równiez nasta¬ wia sie na te wartosc.W celu stwierdzenia ewentualnych zmian pato¬ logicznych w dolnych kobiecych drogach rodnych mozna stosowac srodek diagnostyczny stanowiacy nosnik zwlaszcza tampon zawierajacy odczynnik testowy wedlug wynalazku. Po wprowadzeniu do pochwy albo pobraniu rozmazu, w wypadku ist¬ nienia w pochwie izoenzymów LDH, zachodzi pro¬ ces przemiany przy pH okolo 6—6,5, korzystnie 6,3—6,4.Odczynnik testowy wedlug wynalazku jest cie¬ cza o nastepujacym skladzie: 1 Roztwór buforów trójetanoloamina- -NaOH, pH 7,0 Mleczan sodowy (sól sodowa kwasu D,L-mle- kowego) Metosiarczan fenazyny (PMS) Nikotynoamido-ade- ninodwuinukleotyd (NAD+) chlorek nitro^bleki- tu tetrazoliowego korzystny sklad . ,0 milimoli 67,5 „ 0,1 „ 1,5 „ 0,3 „ dolna i górna [ granica zawarto-E sci [ 1,0-150 milimolJ -350 „ [ 0,01-1,0 „ 0,1-10 „ 0,01-1,5 „ [ Obecnosc LDH w plynie pochwowym stwierdza sie jezeli po uplywie okolo 5 do 10 minut tampon przyjmie niebieskie zabarwienie wskutek znanego tworzenia sie formazanu lub metosiarczanu fena¬ zyny. Do srodka diagnostycznego do stosowania w pochwie nalezy dobrac stabilny i nie atakujacy tkanki roztwór buforowy. Szczególnie przydatny jest tu roztwór buforowy trójetanoloamina-NaOH.98 619 Odczynnik testowy nanosi sie na znane nosniki, zwlaszcza tampony, w dowolny sposób. Wiadomo, ze tego rodzaju odczynniki testowe musza byc chronione przed dzialaniem swiatla, a nosniki za¬ wierajace takie odczynniki testowe do momentu zastosowania musza byc przechowywane bez do¬ stepu swiatla. Sa dwie korzystne metody nanosze¬ nia odczynnika testowego na tampon: wstrzykiwa¬ nie okolo 2 ml wybranego odczynnika testowego w tampon albo nasycenie konca tamponu na od¬ cinku okolo V* cm 2 ml odczynnika testowego i wysuszenie tamponu, zwlaszcza przez wymrazanie.Odczynnik testowy mozna takze naniesc na przy¬ klad tylko na ruchomy sznurek w tamponie, któ¬ ry w razie potrzeby mozna latwo z tamponu usu¬ nac. Bardzo wygodne jest takze naniesienie od¬ czynnika testowego na bawelniany wyrób w po¬ staci tasmy lub sznurka, który umieszcza sie w tamponie.Poniewaz przy zastosowaniu szybkiej metody oznaczania patologicznych zmian w dolnych kobie¬ cych drogach rodnych polegajacej na wprowadze¬ niu odczynnika testowego do pochwy, nie wiado¬ mo ile jest plynu pochwowego, a jego ilosc i pH ulegaja wahaniom w czasie, nalezy przy przygo¬ towywaniu odczynników testowych zarezerwowac duza pojemnosc buforowa tak, by w trakcie doko¬ nywania oznaczenia w miejscu reakcji utrzymana zostala wartosc pH 6—6,5, korzystnie 6,3—6,4. Po¬ niewaz pojemnosc buforowa odczynnika testowego zawartego w ruchomym sznurku czasami w prak¬ tyce nie wystarcza, celowym byloby w tym wy¬ padku zaopatrzyc tampon w wieksza ilosc substan¬ cji buforowej tak by w kazdym (przypadku zapew¬ nic wystarczajace zbuforowanie czesci sznurka naj¬ blizszej tamponowi.Tego rodzaju nosniki z odczynnikiem testowym nie musza byc zakladane przez lekarza, kazda ko¬ bieta moze je sama zastosowac. Niebieskie zabar¬ wienie wystepujace po 15 lub 30- minutowym prze¬ bywaniu tamponu w pochwie wskazuje niebezpie¬ czenstwo zmian patologicznych i jest znakiem ostrzegawczym, ze nalezy zglosic sie do lekarza.Jezeli jednak uzyty tampon lub ruchomy sznu¬ rek czy tasme trzeba przechowywac, szczególnie w przypadku stosowania przez lekarza lub gdy pacjentka chce tampon przeslac lekarzowi, to trze¬ ba ten tampon poddac odpowiedniej obróbce.Tampon nalezy zdezynfekowac celem usuniecia zapachu oraz zapewnic trwalosc zabarwienia w trakcie dluzszego okresu przechowywania. Obróbki tej dokonuje sie przez zanurzenie uzytego do ba¬ dania tamponu w 20%-owym roztworze zywicy akrylowej w toluenie. (Paraloid firmy Merck, 20°/o roztwór w toluenie).Podczas gdy dotychczasowe metody oznaczania LDH sa wybitnie metodami laboratoryjnymi i po¬ nadto posiadaja wyzej wspomniane wady, to spo¬ sób wedlug wynalazku stwarza mozliwosc przepro¬ wadzenia przez nieprzeszkolonego uzytkownika szybkiego i wystarczajaco dokladnego ilosciowego oznaczenia dla pewnych okreslonych celów jak na przyklad dla plynu pochwowego. Jest to szczegól¬ nie wazne dla pacjentów z nowotworami.Wedlug danych literaturowych, u duzej ilosci pacjentów z nowotworami dotychczas zbadano 26 enzymów. Najwyzsza diagnostyczna czulosc posia¬ da LDH, w surowicy (nie w wydalinach) stwier^ dzono podwyzszenie zawartosci o 40—90°/o. W przypadku stwierdzonego guza okazalo sie, ze se¬ ryjne oznaczanie LDH w surowicy jest przydatne do kontroli przebiegu choroby i leczenia. Podwyz¬ szenie LDH nie' jest cecha specyficzna dla nowo¬ tworów, ale zawsze jest sygnalem powaznego scho- io rzenia i razem z innymi charakterystycznymi obja¬ wami moze sluzyc do postawienia diagnozy o ist¬ nieniu nowotworu.Omówiony korzystny odczynnik testowy nanie¬ siony na tampon zastosowano w seryjnych bada- niach przeprowadzonych na okolo 100 zdrowych kobietach oraz pacjentkach z rakiem szyjki macicy (Carcinoma odli uteri), z rakiem trzonu macicy (Carcinoma corporis) i rakiem „in situ" (Carcino¬ ma in situ). Najlepsze rezultaty osiagnieto z tam- ponem zalozonym na okres 15 do 30 minut. Po wyjeciu tamponu mozna bezposrednio stwierdzic nastepujace zabarwienie: % brak zabarwienia zabarwienie rózowe zabarwienie jasno nie¬ bieskie z fioletow"ym odcieniem niebieskie ciemno niebieskie — wynik negatywny — wynik jeszcze ne¬ gatywny — + — + + — + + + Jezeli wystepuje niebieskie (++) lub ciemnonie¬ bieskie (+ + +) zabarwienie to wówczas we wszy¬ stkich przypadkach wystepowal rak, co zgadzalo sie zawsze z wynikami badan patologicznych. Przy jasnoniebieskim zabarwieniu potwierdzala sie pra¬ wie zawsze bez wyjatku diagnoza „strefa zmian".Zabarwienie rózowe stwierdzono dotad tylko u zdrowych kobiet (takze u ciezarnych do 15 dnia 43 ciazy).Sposób oznaczania „in vitro" a wiec na przy¬ klad badanie surowicy lub osocza przeprowadza sie w znany sposób. Jedyna nieodzowna zmiana jest koniecznosc .nastawiania za pomoca odpowied- 45 nich buforów odpowiedniego pH na .przyklad 6— —6,5 w przeciwienstwie do dotychczas stosowane¬ go silnie zasadowego srodowiska reakcji. W zwia¬ zku z tym nie ma tu potrzeby podawania doklad¬ niejszego opisu. Dla oznaczen wartosci bezwzgle- 50 dnych mozna przeprowadzic cechowanie zmian bar¬ wy w oparciu o standartowe próbki LDH. Barwe cechowanych próbek utrwala sie na pewien czas w taki sam sposób, jak przy konserwacji tamponu.Ponizsze przyklady pokazuja jeszcze dwie mozli- 55 wosci nanoszenia odczynników testowych na tam¬ pon. a) Metoda zanurzania. Popularne tampony hi¬ gieniczne scislo owija sie w srodku raz lub dwa razy podobnie jak paskiem tasma „Tesa" o szero- 60 kosci 1 cm. Otuline tamponu otwiera sie po prze¬ ciwnej stronie do tej, przy której znajduje sie nitka do wyciagania, przez co odslania sie po¬ wierzchnie cylindryczna tamponu. Zwyklym pro¬ bówkom szklanym o pojemnosci 18 ml ("ormat 65 DIN) odcina sie zaokraglone dno. Do tak otrzy- \7 • manej rurki szklanej wprawadza sie tampon w ten sposób, zeby otwarty z jednej strony tampon swoja równa powierzchnia zamykal koniec rurki.Nitke do wyciagania umocowuje sie na drugim koncu rurki za pomoca plastra, tasmy Tesa itp. Te strone rurki, po której jest otwarta otoczka tam¬ ponu zanurza sie w roztworze odczynnika wedlug wynalazku. Kazdy tampon wchlania 2,0 ml roz¬ tworu. Przygotowywanie roztworu i wszystkie opi¬ sane tu czynnosci zwiazane ze sporzadzaniem roz¬ tworu odczynnika testowego nalezy przeprowa¬ dzac w ciemni przy swietle jednobarwnym (swia¬ tlo fotograficzne w zakresie czerwonym „swiatlo czerwone'). • Spreparowane w ten sposób tampony razem z rurkami szklanymi poddaje sie w ciemnosci susze¬ niu przez wymrozenie (liofilizuje), wysuszone tam¬ pony wyjmuje sie z rurek np. za pomoca nitki do wyciagania i stale w ciemnosci ewentualnie w ciemni przy swietle czerwonym pakuje w papier nieprzepuszczajacy swiatla, ewentualnie w folie lub barwna papier i przechowuje chroniac od swiatla. b) Metoda wstrzykiwania. Nastepujace prace " prowadzi sie w ciemni. W tampon wstrzykuje sie za pomoca 2 ml strzykawki 2 ml roztworu od¬ czynnika testowego. Po przeciwnej stronie tampo¬ nu w stosunku do tej, po której znajduje sie nit¬ ka do wyciagania, wbija sie igle strzykawki przez otoczke w tampon i igle prowadzi powoli wstrzy¬ kujac, w kierunku dlugosci az do drugiego konca tamponu. W ten sposób tampon zostal równomier¬ nie zwilzony. Nastepnie tampon suszy sie przez wymrazanie i tak jak w przykladzie a) pakuje i przechowuje.Mieszanine reakcyjna mozna w zasadzie naniesc na kazdy chlonny nosnik. Do oznaczen plynu pochwowego lub w pochwie okazaly sie bardzo przydatne przezroczyste folie na przyklad folia z octanu celulozy uzywana do elektroforezy lub produkt „Parafilm M" firmy American Chemcom- pany. W miejscach, w których folia wchodzi w kontakt (przez nakladanie) z LDH wystepuje za¬ barwienie o odcieniu niebieskim. Tego rodzaju fo¬ lie maja te zalete, ze sa mechanicznie bardziej od¬ porne niz bibula filtracyjna i nadaja sie do stabi¬ lizacji i przechowywania a przy tym moga byc zupelnie przezroczyste. Przy tym intensywnosc za¬ barwienia zupelnie nie ulega zmianie.Folie o powierzchni 1,5 do 2,0 cm2 mozna stoso¬ wac z polecenia lekarza — fachowca przy podej¬ rzeniu zmian w blonie sluzowej pochwy. W miej¬ scu gdzie znajduja sie grudki komórek rakowa¬ tych nastepuje zabarwienie (w postaci punkcików) podobnie jak na tamponach.Nastepujacy przyklad objasnia zastosowanie spo¬ sobu wedlug wynalazku w ramach badan labora¬ toryjnych. Do kuwety wkroplono za pomoca pipe¬ ty 1,80 ml 0,5 molowego roztworu buforowego TRA o pH 6,2, 0,10 ml pirogronianu (7 mg/ml), 0,05 ml NADH (10 mg/ml), 0,03 ml H20 i 0,02 ml LDH-4 lub LDH-5 (5 mg/ml).LDH-4 i -5 moga oczywiscie, jak juz wspom- LZG Zaki. Nr 3 w Fafo. 619 8 niano, wystepowac pojedynczo lub w mieszaninie.Do. cechowania stosuje sie substancje czysta, w przypadku zwyklych badan laboratoryjnych w ilo¬ sci jednakowej z iloscia badanej surowicy. Samo oznaczanie przeprowadza sie w znany sposób. PL PL PL PL PL