PL90704B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych nierozpuszczalnych w wodzie preparatów prot¬ einowych, przy czym w preparatach tych proteiny osadzone sa na nowych, usieciowanych, zdolnych do pecznie¬ nia kopolimerów. Mozna na przyklad wytwarzac nowe preparaty z enzymów nierozpuszczalnych w wodzie i stosowac do prowadzenia reakcji, katalizowanych przez enzymy.Kowalencyjne wiazanie substancji z nierozpuszczalnymi polimerami jako nosnikami zyskuje w ostatnich latach na wzrastajacym znaczeniu. Szczególne zalety wykazuje osadzanie katalitycznie czynnych zwiazków, na przyklad enzymów, poniewaz mozna je w takiej postaci po zakonczeniu reakcji latwo oddzielic i wielokrotnie ponownie stosowac.Znane jest stosowanie nosnika z reaktywnymi grupami kopolimerów bezwodnika kwasu maleinowego i zwiazków winylowych. Kopolimery bezwodnika kwasu maleinowego z etylenem i zwiazkami monowinylowymi staja sie jednak w czasie reakcji z wodnymi roztworami enzymów mniej lub bardziej rozpuszczalne w wodzie, takze celowe jest dodanie przed lub w czasie reakcji dodatkowego srodka sieciujacego, na przyklad dwuaminy.Tak wytworzone preparaty enzymów sacza sie wzglednie trudno i posiadaja rozpuszczalne skladniki, co pro¬ wadzi do strat zwiazanego enzymu (E. Katchelski, Biochemistry 3, (1964) strony 1905—1919).Znane sa ponadto kopoI imety z akryloamidu i kwasu maleinowego, które przeprowadza sie droga dodatko¬ wego ogrzewania w postac bezwodnikowa. Produkty te sa wzglednie slabo usieciowane, pecznieja znacznie w wodzie i posiadaja jedynie mierna trwalosc mechaniczna, co prowadzi do strat przez scieranie w czasie sto¬ sowania tych zywic (opis wylozeniowy RFN nr 1 908 290).Znane sa tez jako nosniki silnie usieciowane polimery, otrzymane droga kopolimeryzacji bezwodnika kwasu maleinowego z eterami dwuwinylowymi. Dzieki przemiennemu sposobowi kopolimeryzacji monomerów polime¬ ry te zawieraja znaczny udzial grup bezwodnikowych, na przyklad powyzej 50% wagowych bezwodnika kwasu maleinowego, uwarunkowany ciezarem czasteczkowym monomerów eterów winylowych i stad jedynie we wzglednie waskich granicach daje sie dostosowac do kazdorazowego celu stosowania opis wylozeniowy RFN nr 2 008 996).2 90 704 Celem wynalazku bylo opracowanie nowych produktów reakqi bialek i peptydów z nowymi, silnia usi* ciowanymi, zdolnymi do pecznienia w wodzie kopolimerami o zmieniajacej sie w szerokim zakresie zawartosci cyklicznych grup bezwodników kwasów dwukarboksylowych. Nowe produkty reakcji bialek i peptydów z no¬ wymi kopolimerami nie powinny wykazywac wad znanych dotychczas preparatów proteinowych lub tez wyka¬ zywac je w nieznacznym jedynie stopniu. Cel ten osiagnieto, stosujac sposób wedlug wynalazku.Sposobem wedlug wynalazku nierozpuszczalne w wodzie preparaty proteinowe wytwarza sie w ten sposób, ze polimeryzuje sie, w odniesieniu do calkowitej ilosci monomerów, A) 0,1—50% wagowych, zwlaszcza 2—25% wagowych, bezwodników a, 0-monoolefinowo nienasyconych kwasów dwukarboksylowych, B) 35-90% wago¬ wych, zwlaszcza 50—85% wagowych, dwu- i/lub poli/met/ akrylanów dwu- i/lub polioli i C) 5—60% wagowych, zwlaszcza 10—50% wagowych, przynajmniej jednego hydrofilowego monomeru to jest zwiazku, dajacego sie polimeryzowac o jednym wiazaniu nienasyconym, nie posiadajacego grup funkcyjnych, reagujacych z grupami bezwodnikowynrii i tworzacego polimery hydrofilowe, przy czym zawartosc procentowa A—C wynosi 100, droga polimeryzacji straceniowej lub perelkowej w rozpuszczalnikach lub mieszaninach rozpuszczalników obojetnych w stosunku do grup bezwodnikowych, w temperaturze 20—200°C, w obecnosci zwiazków, tworzacych rodniki i tak wytworzone kopolimery poddaje reakcji z roztworami bialek z wytworzeniem preparatów proteinowych.Sposobem wedlug wynalazku mozna wytwarzac na przyklad nierozpuszczalne w wodzie preparaty enzy: matyczne, które mozna stosowac do reakcji, katalizowanych przez enzymy.Kopolimery, stosowane jako produkty wyjsciowe dla preparatów proteinowych, wytwarza sie w sposób nastepujacy: Jako bezwodniki a, 0-monoolefinowo nienasyconych kwasów dwukarboksylowych o 4—9 atomach wegla, zwlaszcza o 4—5 atomach wegla, stosowane do wytwarzania kopolimerów, nalezy wymienic bezwodnik kwc»su maleinowego, itakonowego lub cytrakonowego, zwlaszcza bezwodnik kwasu maleinowego. Do kopolimeryzacji mozna stosowac równiez mieszaniny tych bezwodników.Stosowane w sposobie wedlug wynalazku jako dwu i/lub polimetakrylany lub dwu- i/lub poliakrylany dwu- i/lub polioli stosuje sie pochodne zwiazków o przynajmniej dwóch grupach alkoholowych lub fenolowych, zwla¬ szcza alkoholowych grupach OH lub ich produkty reakcji z tlenkami alkilenowymi o 2—8 atomach wegla, zwlasz¬ cza o 2—4 atomach wegla lub z mieszaninami tych tlenków alkilenowych, przy czym na 1 mol zwiazków, zawie¬ rajacych grupy hydroksylowe przypada 1—104, a zwlaszcza 1—10 elementów tlenku alkilenu. Jako tlenki alkile- nu stosuje sie na przyklad tlenek etylenu, tlenek propylenu, tlenek butylenu, tlenek trójmetylenu, tlenek cztero- metylenu, bis-chlorometylooksacyklobutan, tlenek styrenu, zwlaszcza zas tlenek etylenu i tlenek propylenu.Mozliwe jest równiez stosowanie produktów reakcji zwiazków o przynajmniej 2 aktywnych atomach wodoru wedlug Zerewitinowa, nie nalezacych do alkoholi lub fenoli, z wymienionymi wyzej tlenkami alkilenowymi, celem wytworzenia dwu- i/lub poli-/met/ akrylanów.Stosowane w sposobie wedlug wynalazku dwu- i/lub poli-/met/-akrylany dwu- i polioli wytwarza sie w zna¬ ny sposób, na przyklad droga reakcji dwu- i/lub polioli z chlorkiem kwasu /met/akrylowego w obecnosci w przyblizeniu równomolarnych w przeliczeniu na chlorek kwasowy ilosci trzeciorzedowych amin, takich jak trójetyloamina, w temperaturze ponizej 20°C, w obecnosci benzenu (opis wylozeniowy RFN nr. 1 907 666).Jako dwu- wzglednie poMole o przynajmniej 2 atomach wegla, a zwlaszcza o 2—12 atomach wegla, w gre wcho¬ dza glikol etylenowy, propandiol- 1, 2, propandiol-1,3, butandiole, zwlaszcza butandiol-1,4, heksandiole, dekan- diole, gliceryna, trójmetylolopropan, pentaerytryt, sorbit, sacharoza i ich produkty reakcji z tlenkami alkileno¬ wymi, jak podano wyzej, a takze polibis-chlorometylo-oksacyklobutan lub tlenek polistyrenu. Mozna stosowac równiez mieszaniny dwu- i polioli. Korzystnie stosuje sie dwuakrylany lub dwumetakrylany dioli o 2—4 atomach wegla i/lub produkty reakcji 1 mola tych dioli z 1—10 molami tlenku alkilenu o 2—4 atomach wegla lubtrójme- tylolopropanotrójmetakrylanem.Szczególnie korzystnie stosuje sie dwumetakrylany glikolu etylenowego, glikolu dwuetylenowego, glikolu trójetylenowego, glikolu czteroetylenowego lub wyzszych glikoli polialkilenowych o ciezarach czasteczkowych do 500 lub. ich mieszaniny.Trzecia grupa skladników kopolimeryzacji sklada sie z monomerów hydrofilowych o jednym wiazaniu nienasyconym. Jako takie skladniki mozna stosowac wszystkie dajace sie polimeryzowac zwiazki o jednym wiazaniu nienasyconym, nie posiadajace grup funkcyjnych, reagujacych z grupami bezwodnikowymi i tworzace polimery hydrofilowe.Hydrofilowe monomery posiadaja korzystnie przynajmniej jedna grupe karboksylowa, aminokarbonylowa, sulfonowa lub sulfamoilowa, przy czym grupy aminowe rodnika aminokarbonylowego lub sulfamoilowego moga byc ewentualnie podstawione grupami alkilowymi o 1—4 atomach wegla lub grupami alkoksymetyJowymi o 1—4 atomach wegla w grupie alkoksylowej.Dla przykladu mozna wymienic kwas akrylowy, kwas metakrylowy, monoester kwasu maleinowego o 1—8 atomach wegla w rodniku alkoholowym, N-winylolaktamy, takie jak N-winyiopirolidon, amid kwasu metakry-90 704 3 lowego, N-podstawione amidy kwasu /met/akrylowego, takie jak N-metylo- i N-metoksymetyloamid kwasu /met/akrylowego i N-akryloilo-dwumetylotauryna.Zwiazki te dodaje sie w zaleznosci od zadanej hydrofilowosci i zdolnosci do pecznienia kopolimerów i od dlugosci lancucha tlenku polialkilenowego (n) wielowartosciowego estru kwasu /met/akrylowego, w ilosci —60% wagowych mieszaniny monomerów. Dodatek tych monomerów poza wplywem na hydrofilowosc nad¬ spodziewanie wplywa równiez na strukture polimerów, co stanowi przy wytwarzaniu polimerów perelkowych szczególna zalete, poniewaz w tym przypadku wybór rozcienczalników, dodawanych do mieszaniny monomerów jest znacznie ograniczony warunkiem nierozpuszczalnosci w weglowodorach parafinowych i obojetnoscia w sto¬ sunku do grup bezwodnikowych.Dzieki szerokiej mozliwosci zmian w skladzie mieszaniny monomerów mozna w szerokim zakresie opty¬ malnie dopasowac dla kazdorazowego zastosowania hydrofilowosc, gestosc usieciowania, zdolnosc do pecznienia i zawartosc grup bezwodnikowych w kopolimerach, stosowanych w sposobie wedlug wynalazku.Do stosowanych w sposobie wedlug wynalazku dwu- i/lub poli-/met/akrylanów mozna dodawac równiez zwykle stosowane srodki sieciujace, zawierajace przynajmniej 2 niesprzezone wiazania podwójne, na przyklad adypinian dwuwinylowy, amid kwasu metylenobisakrylowego, trójakrylofo rmaI lub trójaIIilocyjanuran w ilos¬ ciach okolo 0,01-30% wagowych mieszaniny monomerów.Polimeryzacje mozna na przyklad prowadzic w organicznym rozpuszczalniku jako polimeryzacje stracenia* wa, przy czym polimer zaczyna wytracac sie wkrótce po rozpoczeciu polimeryzacji. W zasadzie mozna stosowac wszystkie rozpuszczalniki obojetne na grupy bezwodnikowe. Szczególnie korzystnymi rozpuszczalnikami sa alifa¬ tyczne, cykloalifatyczne i aromatyczne weglowodory, jak równiez weglowodory podstawione chlorowcem, weglowodory alkiloaromatyczne i estry kwavow karboksylowych, na przyklad heptan, oktan, izooktan, frakcje benzyny o temperaturze wrzenia okolo 60-200°C, cykloheksan, benzen, toluen, ksyleny, chlorobenzen, dwu- chlorobenzeny, octan etylu, octanbutylu. x Rozpuszczalniki powinny korzystnie posiadac temperature wrzenia przynajmniej 60°C i dawac sie latw© usunac z polimeru straceniowego pod zmniejszonym cisnieniem. Na 1 czesc mieszaniny monomerów stosuje sie okolo 2—50, zwlaszcza 5—20 czesci wagowych rozpuszczalnika. Wlasciwosci kopolimerów, zwlaszcza objetosc nasypowa i powierzchnia wlasciwa, zaleza w istotny sposób od rodzaju i ilosci rozpuszczalnika.W wielu przypadkach korzystne jest stosowanie mieszanin wyzej wymienionych rozpuszczalników lub roz¬ poczynanie polimeryzacji w rozpuszczalniku rozpuszczajacym polimer i dodawanie w sposób ciagly w ciagu polt* meryzaqi srodka wytracajacego polimer. Srodek stracajacy mozna równiez dodawac w okreslonych okresach w jednej lub kilku porcjach. Ponadto mozna równiez wprowadzac do pewnej ilosci rozpuszczalnika mieszanine monomerów razem z odpowiednim inicjatorem w postaci roztworu lub tez rozpuszczalnika, takze podczas poli¬ meryzacji utrzymuje sie równomierne nieznaczne stezenie monomerów. Przez stosowanie monomerów /met/ak¬ rylowych o róznej hydrofilowosci i zmienianie warunków polimeryzacji mozna w bardzo szerokim zakresie wytwarzac produkty o zdolnosci pecznienia, gestosci i powierzchni wlasciwej, dostosowanych do kazdorazo¬ wego celu, przy równoczesnej dobrej wytrzymalosci mechanicznej.Kopolimery, wystepujace w preparatach otrzymywanych wedlug wynalazku korzystnie wytwarza sie zwla¬ szcza droga polimeryzacji w zawiesinie. Najczesciej stosowany sposób polimeryzacji perelkowej, podczas której zawiesza sie monomery w wodzie, ewentualnie z dodatkiem organicznego rozpuszczalnika, daje sie w tym przypadku zastosowac z niewielkim powodzeniem, poniewaz bezwodnik szybko ulega hydrolizie, a powstajacy kwas dwukarboksylowy przewaznie przechodzi do fazy wodnej i jedynie niewielka ilosc zostaje wbudowana do polimeru. Dlatego tez korzystnie prowadzi sie polimeryzacje w zawiesinie w srodowisku organicznym. Jako faze ciagla stosuje sie zwlaszcza weglowodory parafinowe, takie jak heksan, heptan, oktan i wyzsze homologi, weglo¬ wodory cykloalifatyczne, takie jak cykloheksan, jak równiez mieszaniny parafin, takie jak frakcje benzyny lub olej parafinowy. Monomery i inicjator rozpuszcza sie w rozpuszczalniku, nie mieszajacym sie z parafinami, oboje¬ tnym w stosunku do grup bezwodnikowych, takim jak na przyklad acetonitryl, dwumetyloformamid, suIfotlenek dwumetylowy lub szesciometylotrójamid kwasu fosforowego i najczesciej rozprowadza przez dodanie srodków dyspergujacych w fazie ciaglej. Stosunek objetosciowy fazy ciaglej do fazy monomeru wynosi 1:1 do 10:1, zwlaszcza 2:1 do 5:1.Do stabilizowania zawiesiny mozna stosowac na przyklad mono- i dwuoleiniany gliceryny, jak równiez mieszaniny tych zwiazków, mono- i trójoleiniany, wzglednie stearyniany sorbitanu, monoetery glikoli polietyle¬ nowych z alkoholem stearylowym lub lauryIowym albo nonylofenolem, monoestry glikoli polietylenowych z kwasem oleinowym, stearynowym i innymi kwasami tluszczowymi o wiecej niz 10 atomach wegla, jak równiez sól sodowa estru dwuoktylowego kwasu suIfobursztynowego. Substancje te stosuje sie korzystnie w ilosci 0,1—10% w odniesieniu do mieszaniny monomerów iw zasadzie rozpuszcza w fazie weglowodorowej. Wielkosc czastek polimerów zawiesinowych poza zwiekszeniem szybkosci mieszania mozna zmniejszyc za pomoca dodania dalszej powierzchniowo czynnej substancji, na przyklad alkilosulfonianu, w ilosci 0,01—2% w odniesieniu do monomerów.4 90 704 Polimeryzacje rozpoczyna sie za pomoca rodnikowych inicjatorów. Odpowiednimi inicjatorami sa na przyklad zwiazki azowe lub zwiazki nadtlenowe. Najczesciej stosowanym do rozpoczecia polimeryzacji zwia¬ zkiem azowym jest nitryl kwasu azoizomaslowego. Jako inicjujace zwiazki nadtlenowe w gre wchodza zwlaszcza nadtlenki dwuacyjowe, takie jak nadtlenek dwubenzoilu lub nadweglany, takie jak nadweglan dwuizopropylu i dwucykloheksylu. Mozna równiez jako inicjatory stosowac nadtlenki dwualkilowe, wodoronadtlenki i aktywne w organicznych rozpuszczalnikach uklady redox.Inicjatory dodaje sie w ilosci 0,01—10%, zwlaszcza 0,1—3%, w odniesieniu do ilosci wagowej mieszaniny monomerów.Polimeryzacje prowadzi sie w temperaturze okolo 20—200°C, zwlaszcza w temperaturze 50—100°C w za¬ leznosci od szybkosci rozpadu inicjatorów i najczesciej ponizej temperatury wrzenia rozpuszczalnika, a przy polimetyzacji perelkowej ponizej temperatury mieszania obydwu faz. Ponadto z reguly korzystne jest prowadze¬ nie polimeryzacji w obojetnej atmosferze beztlenowej.Kopolimery wytworzone droga polimeryzacji straceniowej, sa bezbarwnymi lub lekko zólto zabarwionymi proszkowatymi substancjami o objetosci nasypowej od 1,5—30 ml/g, zwlaszcza 2—20 ml/g i o powierzchni wla¬ sciwej 0,1-500 m2/g, zwlaszcza 1—400 m2/g. Zawartosc grup karboksylowych po zmydleniu grup bezwodni- kowych, oznaczona miareczkowo, wynosi 0,01—14 milirównowaznjków/g, zwlaszcza 0,02—11 milirównowazni- ków/g.Polimery zawiesinowe sa bialymi lub slabo zabarwionymi perelkami, które w niektórych przypadkach moga byc nieforemne i posiadaja srednice 0,03—3 mm, zwlaszcza 0,05, 0,5 mm i objetosc nasypowa okolo 1,4—8 ml/g, zwlaszcza 1, 4—5 ml/g. Zawartosc grup karboksylowych po hydrolizie grup bezwodnikowyeh wynosi 0,01—14 milirównowazników/g, zwlaszcza 0,02—11 milirównowazników/g.Kopolimety, stosowane w sposobie wedlug wynalazku, zawieraja jednostki kopolimeru, rozmieszczone w zasadzie statystycznie. Dzieki znacznej gestosci usieciowania kopolimery sa nierozpuszczalne w wiekszosci rozpuszczalników. Dlatego tez ich ciezary czasteczkowe nie daja sie oznaczyc.Kopolimery moga w wodzie droga pecznienia powiekszyc swoja objetosc nasypowa 1,1—3-krotnie. Nadaja sie dobrze jako zywice nosnikowe do wiazania substancji, które moga reagowac z grupami bezwodnikowymi kopolimerów. Ponadto posiadaja one znakomita trwalosc mechaniczna i dzieki temu nie wykazuja praktycznie scieralnosci.Wyzej opisane zywice nosnikowe wiaza wszystkie substancje, posiadajace grupy funkcyjne, które moga reagowac z grupami bezwodnikowymi polimerów. W bialkach i peptydach sa to przede wszystkim znajdujace sie na koncu grupy aminowe lizyny i wolne grupy aminowe lancuchów peptydowych. Postepuje sie przy tym tak, ze do mieszanego wodnego roztworu bialka w temperaturze 0—30°C dodaje sie potrzebna ilosc polimeru. Stosunek wagowy bialka do zywicy nosnikowej moze wahac sie w szerokich granicach i daje sie dostosowac do zamie¬ rzonego celu. Dobre wydajnosci osiaga sie przy stosunku 1 czesc wagowa bialka na 4—10 czesci wagowych nosnika z polimeru. Optymalne stosunki zaleza jednak zarówno od skladu, jak i od budowy polimeru oraz od rodzaju bialka.W przypadku licznych enzymów celowe jest równiez dodawanie stabilizatora. Jako stabilizatory w gre wchodza glikole polietylenowe lub niejonowe srodki zwilzajace, celem oslabienia denaturacji na powierzchniach, jak równiez znane odczynniki na grupy SH lub jony metali przy pewnych enzymach. Wartosc pH utrzymuje sie korzystnie za pomoca pH-statu przy wartosci optymalnej dla danego wiazania. Ta wartosc pH lezy w zakresie .2—9, korzystnie 5—7. Przy stosowaniu penicylinacylazy okazalo sie korzystne prowadzenie procesu przy war¬ tosci pH =5,7—6,8. Trzeba przy tym dodawac w celu utrzymania stalej wartosci pH zasady nieorganiczne, na przyklad roztwory wodorotlenków metali alkalicznych lub zasady organiczne, na przyklad trzeciorzedowe aminy organiczne. Przebieg reakcji widoczny jest z zuzytej ilosci zasady, potrzebnej do utrzymania stalej wartosci pH. W temperaturze pokojowej reakcja trwa okolo 16 godzin, w temperaturze 4°C do 40 godzin. Nastepnie odsacza sie zywice i przemywa buforami lub solami w granicach stezen 0,2-1 m, celem usuniecia niewielkiej ilosci jonogennie zwiazanego bialka.Zwiazana substancje oznacza sie albo za pomoca analizy elementarnej lub przy enzymach, lub inhibitorach za pomoca pomiaru czynnosci enzymatycznej, lub hamowania czynnosci enzymatycznej. Wydajnosc zwiazanej substancji zalezy od rodzaju substancji i skladu polimeru. Tak na przyklad aminokwasy i niskoczasteczkowe peptydy zostaja zwiazane praktycznie calkowicie. Lecz równiez przy bialkach wydajnosc zwiazanej aktywnosci enzymatycznej wynosi 20 do ponad 90% wyjsciowej aktywnosci.Zgodnie ze stanem techniki (opis patentowy RFN DOS nr. 1 935 711 i 2 008 990) wiazanie bialek pro¬ wadzi sie w roztworach buforów w stezeniach 0,05-0,2 m. Jezeli nie stosuje sie buforu, wtedy wzrasta ilosc jonogennie zwiazanego bialka (opis patentowy RFN DOS nr. 1 935 711). Nadspodziewanie okazalo sie, ze przy zywicach, stosowanych w sposobie wedlug wynalazku sprzeganie w srodowisku wolnym od jonów daje maksy-90 704 5 malne wydajnosci kowalencyjnie zwiazanego enzymu. Stale optymalne wartosci pH przy tym sposobie poste¬ powania mozna utrzymac za pomoca pH-statu.Stosowanie zywic z enzymami posiada w technice szczególne znaczenie, poniewaz za ich pomoca mozna wytwarzac technicznie wartosciowe produkty. Uprzednie zwiazanie biologicznych katalizatorów wedlug wyzej podanego sposobu umozliwia zupelnie ich oddzielenie od mieszaniny reakcyjnej za pomoca prostych sposobów rozdzielania oraz, istotne ze wzgledów ekonomicznych, wielokrotne ich stosowanie. Ponadto w wielu przypad¬ kach ulega istotnej poprawie trwalosc wrazliwych i kosztownych bialek.Ponizej podano kilka przykladów stosowania substancji, zwiazanych z nosnikiem, które mozna wytwarzac sposobem wedlug wynalazku.Grupe proteaz, takich jak trypsyna, chymotrypsyna, papaina, elastaza mozna na przyklad stosowac do wytwarzania hydrolizatów bialkowych dla procesów mikrobiologicznych. Ponadto enzymy moga równiez sluzyc do usuwania bialek antygenowych z farmaceutycznych substancji czynnych.Acylazy stosuje sie w technice do wytwarzania kwasu 6-amino-penicylanowego z penicylin lub do rozdzie¬ lania racematów acylowanych aminokwasów. Amylaza zwiazana z nosnikiem moze sluzyc do hydrolitycznej odbudowyskrobi. ' Specjalne hydrolazy, takie jak asparaginaza lub ureaza mozna stosowac w postaci zwiazanej jako srodek leczniczy w krazeniu pozaustrojowym.Te i inne liczne mozliwosci zastosowan opisano w literaturze, na przyklad Chem.Eng.News, 15.2.1971, strona 86 i Rev.Purea. Appl.Chem. 21,83 (1971).Dalsza obszerna dziedzina zastosowan substancji, zwiazanych z nosnikami, jest chromatografia powinowac¬ twa.Tak na przyklad mozna wyodrebnic przeciwciala za pomoca zwiazanych z nosnikiem antygenów lub tez haptenów i na odwrót —za pomoca zwiazanych przeciwcial (7-globuliny) wyodrebniac antygeny. Podobnie mozna wzbogacac specyficznie enzymy za pomoca zwiazanych inhibitorów lub analogów substratów. Wiadomo na przyklad, ze mozna otrzymywac trypsyne i chymotrypsyne za pomoca zwiazanych roslinnych lub zwierze¬ cych inhibitorów. Do innych przykladów nalezy otrzymywanie peptydaz na specjalnych zwiazanych peptydach lub wyodrebnianie plazminy za pomoca lizyny, zwiazanej z nosnikiem. Przegladowe prace na temat tej dziedziny zastosowan ukazaly sie w Naturwissenschaften [G.Feinstein, 58, 389, (1971)] i w Chromatographic Reviews [F.Fried, 14,121,(1971)].Celem wytworzenia kwasu 6-aminopenicylanowego (6-AP) mozna rozszczepic penicyliny za pomoca acylaz z drobnoustrojów, takich jak bakterie, zwlaszcza E.coli, Erwinia lub Actinomycetes, jak Streptomyces, Micromo- nospora, Nocardia i grzyby, jak Fusarium i drozdze.Wedlug sposobu opisanego w opisie patentowym RFN nr. 1 111 778, dotyczacym wytwarzania 6-AP zada¬ je sie roztwór penicyliny G szlamem bakteryjnym, zawierajacym enzym penicylinacylaze (E.C. 3.5.1.11).W wyniku dzialania tego enzymu ulega odszczepieniu znajdujaca sie w lancuchu bocznym grupa karbonamidowa penicyliny bez otwarcia pierscienia /Maktamowego.Stosowanie zawiesin drobnoustrojów ma nastepujace wady: a) Zawiesina drobnoustrojów zawiera poza wewnatrzkomórkowa penicylinacylaza inne bialka i enzymy, jak równiez skladniki pozywki lub ich produkty przemiany, powstale podczas fermentacji. Zanieczyszczenia te nie daja sie calkowicie odmyc z przekrystalizowanego 6-AP podczas jego przerabiania. b) Zawiesina drobnoustrojów daje sie ekonomicznie skutecznie zastosowac jedynie jeden raz. c) Zawiesina drobnoustrojów zawiera zanieczyszczenia i inne enzymy, inaktywujace penicyline i/lub 6-AP przez otwarcie pierscienia /Maktamowego. d) Zawiesina zawiera jedynie niewielkie ilosci penicylinacylazy. Stosowanie wiekszej ilosci materialu, za¬ wierajacego enzymy, na przyklad celem skrócenia czasu trwania reakcji i tym samym celem uzyskania wyzszych wydajnosci 6-AP przy mniejszej ilosci obcych produktów, nie jest praktycznie mozliwe. e) Wydajnosc w produkcji 6-AP zaleza od zmiennej ilosci tworzacej sie penicylinacylazy w kazdej z szarz fermentacyjnych. f) Calkowite oddzielenie zawieszonych drobnoustrojów wymaga w czasie przeróbki szarz 6-AP dodatko¬ wego etapu, powodujacego straty wydajnosci. Celem usuniecia bialkowych zanieczyszczen, mogacych wywoly¬ wac odczyny alergiczne, konieczne sa dalsze etapy oczyszczania. (Brytyjskie opisy patentowe nr. nr. 1 169 696, 1 078 847,1 114 311).Unika sie wszystkich wymienionych wad, stosujac zamiast zawiesiny drobnoustrojów penicylinacylaze, otrzymana przez kowalencyjne zwiazanie z nierozpuszczalnym w wodzie nosnikiem.Znane sa wprawdzie próby wytwarzania 6-AP za pomoca enzymatycznego rozszczepiania penicylin penicy- linacytaza, zwiazana z nosnikiem (opisy patentowe RFN DOS 1 917 057, DOS 1 907 365), nie udalo sie jednak6 90 704 przeprowadzic ich w skali technicznej. Przyczyny tego leza po pierwsze w mechanicznych wlasciwosciach stoso¬ wanego materialu nosnika, które prowadza do strat wskutek scierania, po drugie przy niewielkich wydajnosciach sposobu udalo sie uzyskac jedynie niewielka specyficzna czynnosc penicylinacylazy, zwiazanej z nosnikiem.Znane jest równiez stosowanie nierozpuszczalnego enzymu, wytworzonego droga Wwarencyjh^ego~wiazaTnIa~ penicylinacylazy z mieszanym polimerem z akryloamidu, N,N'*metylenobisakryloamidu i bezwodnika kwasu ma* leinowego. Produkt ten wykazal jednak przy rozszczepianiu penicyliny w skali technicznej wady, poniewaz silnie pecznieje i nie jest mechanicznie trwaly. Wady te ograniczaja mozliwosc kilkakrotnego stosowania w skali tech¬ nicznej tak wytworzonej zywicy.Stwierdzono, ze unika sie wymienionych wad, stosujac do rozszczepiania penicylin penicylinacylaze, zwia- zana»z nierozpuszczalnym nosnikiem, otrzymana wedlug wynalazku.Rozszczepianie penicylin za pomoca penicylinacylazy, zwiazanej z nosnikiem, otrzymanej wedlug wynalazku, mozna prowadzic w prosty sposób równiez w skali wielkotechnicznej. Nierozpuszczalny enzym, zwiazany z nos¬ nikiem, zawiesza sie w roztworze, zawierajacym 75000—150000 miedzynarodowych jednostek/ml penicyliny, 1 mg soli potasowej benzylopenicyliny G, co odpowiada 1598 jednostkom miedzynarodowym, na przyklad penicyliny G lub penicyliny V. Rozszczepianie enzymatyczne prowadzi sie przy stalej wartosci pH w zakresie 6—9, zwlaszcza w zakresie optymalnej wartosci pH dla zwiazanej penicylinacylazy, na przyklad przy wartosci pH=7,8. Celem zobojetnienia odszczepionego rodnika acylowego, na przyklad kwasu fenylooctowego lub kwasu fenoksyoctowego, stosuje sie wodne roztwory alkaliów, na przyklad lug potasowy lub sodowy, lub aminy organiczne, zwlaszcza trójetyloamine. Z zuzytej ilosci zasady mozna wnioskowac o szybkosci reakcji i zakon¬ czeniu rozszczepiania. Penicylinacylaza katalizuje zarówno rozszczepianie penicyliny do 6-AP, jak równiez resyn- teze penicyliny z produktów rozszczepienia. Równowaga zalezy od wartosci pH srodowiska.. Przy nizszych wartosciach pH równowaga przesuwa sie na korzysc produktu wyjsciowego-penicyliny.Mozna to wykorzystac do transacylowania penicylin w obecnosci innych rodników acylowych lub do syntezy penicylin z6-AP. ' ' . Temperatura reakcji enzymatycznego rozszczepiania wynosi korzystnie 38°C. Przy nizszych temperaturach spada czynnosc enzymu. Jezeli na przyklad rozszczepianie prowadzi sie w temperaturze 25°C, to trzeba sto¬ sowac dwa razy tyle enzymu, niz w temperaturze 38°C, jezeli chce sie uzyskac jednakowe czasy trwania reakcji.Predkosc reakcji zalezy wdanej temperaturze od czynnosci wlasciwej i ilosci penicylinacylazy, zwiazanej z nosnikiem. Ponadto szybkosc reakcji zalezy od stosunku ilosci penicylinacylazy, zwiazanej z nosnikiem do stezenia penicyliny. Szarza poddawana rozszczepieniu o stezeniu 100.000 jednostek miedzynarodowych soli potasowej penicyliny G ulega hydrolizie zupelnej po uplywie 10 godzin przy wartosci pH=7,8 i w temperaturze 38°C do 6-AP i kwasu fenylooctowego, jezeli na jednostke penicylinacylazy stosuje sie 3 ? 10s jednostek penicyliny G (jako jednostke enzymu (U) definiuje sie taka aktywnosc, która hydrolizuje 1 /imol kwasu 6-nitro- -3-/fenyloacetylo/-amino-benzoesowego (NIPAB) na minute w temperaturze 25°C). Udzial suchej zywicy, bedacej nosnikiem enzymu, wynosi tylko 0,5—1% mieszaniny reakcyjnej. Jezeli stosuje sie na 105 jednostek miedzynarodowych penicyliny G 2 jednostki penicylinacylazy, wtedy zupelne rozszczepienie trwa jedynie dwie godziny. Mozliwe sa równiez krótsze czasy trwania reakcji, przy stosowaniu wiekszej ilosci zwiazanej penicylina¬ cylazy, na przyklad przy stosowaniu penicylinacylazy z krystalicznego enzymu, zwiazanej z nosnikiem. < Penicylinacylaze, zwiazana z nosnikiem, mozna wytworzyc sposobem wedlug wynalazku w postaci pere¬ lek. Wyróznia sie ona znaczna trwaloscia mechaniczna i wzglednie znacznym ciezarem wlasciwym. Wlasciwosci te umozliwiaja przy wielokrotnym stosowaniu, uzywanie jej w ciagu dlugiego okresu czasu. Wlasciwosci te umozliwiaja ponadto intensywne mieszanie wsadów w procesach produkcyjnych oraz proste oddzielanie za po¬ moca wirowania bez strat, spowodowanych mechanicznym uszkodzeniem, na przyklad przez scieranie. W ten sposób uzyskuje sie w procesach, prowadzonych szarzami, klarowne przesacze, dajace sie przerabiac dalej bez dodatkowego saczenia, celem uzyskania produktu koncowego 6-AP.Penicylinacylaza, zwiazana z nosnikiem, otrzymana wedlug wynalazku, umozliwia szybkie i proste saczenie, poniewaz dzieki mechanicznej trwalosci nie tworza sie drobne czastki, zatykajace powierzchnie saczaca. Dalsze korzysci daje zywica w procesie produkcyjnym, prowadzonym szarzami, ze wzgledu na stosunkowo znaczny ciezar wlasciwy, umozliwiajacy szybkie osadzanie sie zywicy tak, ze po zakonczeniu procesu produkcyjnego latwo mozna zlewarowac ciecz, znajdujaca sie nad zywica. Wynika z tego uproszczenie sposobu postepowania, poniewaz zywica w procesie, prowadzonym szarzami, pozostaje w reaktorze i mozna ja stosowac bezposrednio do nastepnego rozszczepienia.* • Wlasciwosci polimeru umozliwiaja ponadto stosowanie penicylinacylazy nie tylko w procesach, prowadzo¬ nych szarzami, lecz równiez w ciaglych sposobach wytwarzania, na przyklad w kolumnach reakcyjnych, przy czym postac perelek umozliwia uzyskanie koniecznej duzej szybkosci przeplywu.Wytworzony podczas rozszczepiania enzymatycznego 6-AP wyodrebnia sie po oddzieleniu zywicy z enzy¬ mem z roztworu reakcyjnego znanymi sposobami (na przyklad opis patentowy RFN nr. 1 111 778) i przekry-90 704 7 stalizowuje przy wartosci pH =4,3.Przy rozszczepianiu penicyliny za pomoca penicylinacylazy, zwiazanej z nosnikiem wedlug wynalazku, uzyskuje sie wyzsze wydajnosci 6-AP, niz stosujac szlam bakterii E.coli oraz równiez wyzsze, niz przy stosowaniu enzymu, zwiazanego z zywica wedlug zgloszenia patentowego RFN P 2 157 970,4. Tak wiec 6-AP wyodrebnia sie z wydajnoscia okolo 90% wydajnosci teoretycznej. Takwytworzony 6-AP nie zawiera bialek jako zanieczysz¬ czen. Nie zawiera równiez praktycznie polimerów, które moga powstac w innych sposobach wytwarzania. Wyklu¬ czone sa uboczne dzialania alergiczne, powodowane przez bialka lub polimery.Penicylinacylaza, zwiazana z nosnikiem, otrzymana wedlug wynalazku, umozliwia wielokrotne stosowanie w ciagu dlugiego okresu czasu. Równiez i potem czynnosc jest praktycznie w pelni zachowana.Ponizsze przyklady wyjasniaja blizej sposób wedlug wynalazku. Temperatury wrzenia w przykladach ozna¬ czono pod normalnym cisnieniem.Przyklad I. a) 70 g dwumetakrylanu glikolu czteroetylenowego, 20 g kwasu metakrylowego, 10 g bezwodnika kwasu maleinowego i 1 g nitrylu kwasu azoizomaslowego rozpuszcza sie w 1 litrze benzenu i nastepnie polimeryzuje w ciagu 4 godzin w temperaturze 60°C. Nastepnie dodaje sie 1 g nitrylu kwasu azoizomaslowego i 200 ml benzy¬ ny (temperatura wrzenia 100—140°C) i polimeryzuje w ciagu 2 godzin w temperaturze 70°C i w ciagu 2 godzin w temperaturze 80°C. Polimer w postaci proszku przemywa sie dokladnie eterem naftowym (temperatura wrze¬ nia 30—50°C) i suszy pod zmniejszonym cisnieniem. Wydajnosc wynosi 96 g, objetosc nasypowa: 8,8 ml/g, objetosc pecznienia w wodzie: 12,4 ml/g, powierzchnia wlasciwa: 8,6 m2/g, zawartosc kwasu po zmydleniu grup bezwodnikowych = 3,85 milirównowazników/g. b) 6 g zywicy nosnikowej, wytworzonej wedlug przykladu la, zawiesza sie w roztworze 610 jednostek (U) penicylinacylazy w 150 ml wody. Przez dodawanie 1 n roztworu NaOH, przy zastosowaniu pH-statu, utrzymuje sie wartosc pH-6,3 i miesza zawiesine w ciagu 20 godzin w temperaturze 25°C. Nastepnie odsacza sie przez filtr ze szkla spiekanego G3 i przemywa, stosujac po 300 ml 0,05 m buforu fosforanowego o wartosci pH=7,5, zawierajacego 1 m chlorku sodowego i takim samym buforem bez chlorku sodowego. Przez dalsze przemywanie nie mozna juz wiecej wyeluowac substancji czynnej. Ciecz znad osadu i roztwory z przemywania laczy sie i oznacza ich czynnosc enzymatyczna. W równowaznej ilosci oznacza sie enzymatyczna czynnosc wilgotnej zywicy.Wyniki: czynnosci enzymatyczne (test NIPAB) roztwórwyjsciowy 610 U ciecz znad osadu + roztwory z przemywania 112 U zywica nosnika po reakcji 561 U, co odpowiada 92% czynnosci wyjsciowej.Czynnosc enzymatyczna penicylinacylazy oznacza sie kolorymetrycznie lub miareczkowo za pomoca 0,002 m kwasu 6-nitro-37N-fenylo-acetylo/-aminobenzoesowego (NIPAB) jako substratu przy wartosci pH=7,5 w temperaturze 25°C. Molarny wspólczynnik ekstynkcji powstajacego kwasu 6-nitro-3-aminobenzoesowego wynosi E405nm = 9090. 1 jednostka (U) odpowiada reakcji 1 jurno la substratu na minute. c) W roztworze 40 ml ureazy w 32 ml wody zawiesza sie 400 mg zywicy nosnikowej, wytworzonej wedlug przykladu la. Stale mieszajac w temperaturze pokojowej utrzymuje sie stala wartosc pH = 6,0 przez dodawanie 1 n lugu sodowego. Po uplywie 16 godzin reakcja jest zakonczona. Odsacza sie zywice i przemywa buforem, jak w przykladzie Ib.Wyniki: czynnosc enzymatyczna roztwórwyjsciowy 168 U ciecz znad osadu + roztwory z przemywania 64,5 U zywica nosnika poreakcji 87 U, co odpowiada 52% czynnosci wyjsciowej.Czynnosc enzymatyczna ureazy oznacza sie miareczkowo za pomoca 0,17 m mocznika jako substratu w temperaturze 25°C i przy wartosci pH=6,1. 1 jednostka (U) odpowiada ilosci enzymu, zu zywajacej 1 jumol mocz nika, to znaczy 2 jumole kwasu solnego na minute. d) W roztworze 100 mg trypsyny w 32 ml 0,02 m chlorku wapniowego zawiesza sie 500 mg zywicy nosni¬ kowej, wytworzonej wedlug przykladu la. Mieszajac stale w temperaturze 4°C utrzymuje sie stala wartosc pHs6,3 przez dodawanie 1 n roztworu wodorotlenku sodowego. Po 16 godzinach odsacza sie zywice i przemywa buforem, jak w przykladzie Ib.Wyniki: czynnosc enzymatyczna8 90 704 roztwórwyjsciowy 110 U ciecz znad osadu + roztwory z przemywania 15,6 U zywica nosnika poreakcji 64 U, co odpowiada 58% czynnosci wyjsciowej. • Czynnosc enzymatyczna oznacza sie kolorymetrycznie wedlug Tuppy, Z.Physiol.Chem. 329 (1962) 278, stosujac benzeno-arginino-p-nitro-anilid (BAPNA) jako substrat. 1 jednostka (U) odpowiada rozszczepieniu 1 /imola substratu na minute w temperaturze 25°C i przy wartosci pH=7,8.Przyklad II. a) Roztwór 80 dwumetakry lanu glikolu czteroetylenowego, 10 g kwasu metakrylowego, 10 g bezwodnika kwasu maleinowego i 1 g nitrylu kwasu azoizomaslowego w 1 litrze benzenu poddaje sie polimeryzacji, wolno mieszajac wciagu 4 godzin w temperaturze 60°C, wciagu 2 godzin w temperaturze 70°C i w ciagu 1 godziny w temperaturze 80°C. Odsacza sie polimer, miesza trzykrotnie z benzenem, przemywa eterem naftowym i suszy pod zmniejszonym cisnieniem. Wydajnosc wynosi 70 g, objetosc nasypowa: 7,0 ml/g, objetosci pecznienia w wo¬ dzie: 8,2 ml/g, powierzchnia wlasciwa: 5,3 m2/g, zawartosc kwasu po zmydleniu grup bezwodnikowych = 2,55 milirównowazników/g. b) 1 g polimeru, wytworzonego wedlug przykladu Ma, poddaje sie reakcji analogicznie do przykladu Ib z penicylinacylaza w 33 ml wody przy wartosci pH =6,3.Wyniki; czynnosci enzymatyczne (test NIPAB) roztwórwyjsciowy 118 U ciecz znad osadu + roztwory z przemywania 21 U zywica nosnika poreakcji 82 U, co odpowiada 69% czynnosci wyjsciowej c) Z 1 g polimeru, wytworzonego wedlug przykladu lla, wytworzono zawiesine w 100 mg hemoglobiny i 30 ml wody. Ze pomoca automatycznego dodawania 0,2 N roztworu wodorotlenku sodu utrzymano pH przy stalej wartosci 6,2. Wsad mieszano w temperaturze pokojowej wciagu 20 godzin, po czym otrzymana zywice odsaczono przez wkladke ze spiekanego szkla (filtr G3) i przemyto ja kolejno, kazdorazowo 50 ml 0,05 M buforu fosforanowego, zawierajacego 1 M roztwór chlorku sodu i ponownie buforem fosforanowym ale bez chlorku sodu. Przesacz i popluczyny polaczono i okreslono w tym roztworze zawartosc bialka metoda biu- retowa, stwierdzajac obecnosc jeszcze 45 mg bialka. Przemyta zywica zawierala 30 mg bialka co w przeliczeniu na ciezar suchej zywicy (1,245 g w odniesieniu do 0,4% N) odpowiada 2,38%. d) Z 1 g polimeru, wytworzonego wedlug przykladu II, wytworzono zawiesine w roztworze 100 mg ka¬ zeiny w 30 ml wody. Reakcje i obróbke wsadu po reakcji prowadzono wedlug sposobu, opisanego w przykla¬ dzie II. W przesaczu, polaczonym z popluczynami, stwierdzono metoda biuretowa zawartosc jeszcze 15 mg bial¬ ka. Przemyta zywica zawierala 0,55% N w przeliczeniu na ciezar suchej zywicy (1,205), co odpowiada 42 mg (3,52%) kazeiny, zwiazanej z zywica.Przyklad III. a) 60 g dwumetakrylanu glikolu czteroetylenowego, 30 g kwasu metakrylowego, 10 g bezwodnika kwasu maleinowego i 1 g nitrylu kwasu azoizomaslowego rozpuszcza sie w 300 ml acetonitrylu. Roztwór ten zawiesza sie w1 litrze benzyny (temperatura wrzenia 100—140°C) zawierajacej 5g mieszaniny mono- i dwuoleinianu gliceryny i polimeryzuje w ciagu 22 godzin w temperaturze 60°C.Perelki polimeru odsacza sie, zawiesza trzykrotnie w benzenie i nastepnie dwukrotnie w eterze naftowym (temperatura wrzenia 30-50°C) i suszy pod zmniejszonym cisnieniem. Wydajnosc wynosi 94 g bialych kulek, objetosc nasypowa: 4,4 ml/g, objetosc pecznienia w wodzie: 5,5 ml/g, powierzchnia wlasciwa: 6,6 m2/g, srednia srednica czastki: okolo 200 fi, zawartosc kwasu po zmydleniu grup bezwodnikowych = 4,3 milirównowa- zników/g. b) 1 g polimeru, wytworzonego wedlug przykladu lila, poddaje sie analogicznie do przykladu Ib reakcji z penicylinacylaza w 33 ml wody przy wartosci pH=6,3.Wyniki: czynnosc enzymatyczna (test NIPAB) roztwórwyjsciowy 118 U ciecz znad osadu + roztwory z przemywania 43 U zywica nosnika poreakcji 96 U, co odpowiada 81% czynnosci wyjsciowej. « ' , , Przyklad IV. a) Roztwór 2100 g dwumetakrylanu glikolu czteroetylenowego, 600 g kwasu metakrylowego, 300 g bez¬ wodnika kwasu maleinowego i 30 g nitrylu kwasu azoizomaslowego w 7,5 litra acetonitrylu polimeryzuje sie90 704 9 w 21 litrach benzyny (temperatura wrzenia 100—140°C), w której rozpuszczono 150 g mieszaniny mono- i dwu- oleinianu gliceryny w ciagu 1 godziny w temperaturze 50°C i w ciagu 20 godzin w temperaturze 60°C. Odsacza sie polimer perelkowy, miesza dwukrotnie z toluenem i raz z eterem naftowym (temperatura wrzenia 30—50°C) i suszy w temperaturze 60°C. Wydajnosc wynosi 2,95 kg, objetosc nasypowa: 4,7 ml/g, objetosc pecznienia w wodzie: 5,4 ml/g, srednia srednica czastek: okolo 0,3 mm, zawartosc kwasu po zmydleniu grup bezwodniko- wych = 4,0 milirównowazników/g. b) 1 g polimeru, wytworzonego wedlug przykladu IVa, poddaje sie analogicznie do przykladu Ib reakcji z penicylinacylaza w 33 ml wody przy wartosci pH=6,3.Wyniki: czynnosc enzymatyczna (test NIPAB) w roztworzewyjsciowym 107 U ciecz znad osadu + roztwory z przemywania 27 U zywica nosnika poreakcji 67 U, co odpowiada 63% czynnosci wyjsciowej. c) 20 g polimeru, wytworzonego wedlug przykladu IVa, dodaje sie, mieszajac, w temperaturze pokojowej do 600 ml roztworu 1,0 g niespecyficznej elastazy z trzustki wieprzowej. Utrzymuje sie stala wartosc pH = 5,8.Po uplywie 16 godzin odsacza sie zywice i przerabia w sposób, opisany w przykladzie Ib.Wyniki: czynnosc enzymatyczna (test kazeinowy) roztwórwyjsciowy 2180 E ciecz znad osadu + roztwory z przemywania 993 E zywica nosnika po reakcji 1225 E, co odpowiada 56% czynnosci wyjsciowej.Czynnosc enzymatyczna niespecyficznej elastazy oznacza sie miareczkowo za pomoca kazeiny jako sub- stratu [stezenie 11,9 mg/ml] przy wartosci pH=8,0 i w temperaturze 25°C. 1 jednostka (E) odpowiada zuzyciu 1 Jbtmola lugu potasowego na minute. < d) 1 g zywicy-nosnika, wytworzonej wedlug przykladu IV, przemyto suchym acetonem, odsaczono i pro¬ dukt jeszcze zawilgocony acetonem zawieszono w 20 ml wody, po czym natychmiast doprowadzono odczyn zawiesiny do wartosci pH=6,2 i wlaczono urzadzenie do automatycznego miareczkowania o pojemniku wypel¬ nionym 0,2 N roztworem wodorotlenku sodu. Z chwila, kiedy odczyn zawiesiny zywicy osiagnal pH=5,8—6,0, dodano roztwór 100 mg albuminy z surowicy bydlecej w 10 ml wody. Zawiesine mieszano wciagu 20godzin w temperaturze pokojowej przy stalej wartosci pH=6,2. Nastepnie zywice odsaczono poprzez wkladke ze szkla spiekanego (filtr G3) i kolejno przemyto, kazdorazowo 50 ml 0,05 M buforu fosforanowego o pH=7,5, zawieraja¬ cego 1M chlorku sodu i tym samym buforem bez chlorku sodu. W przesaczu polaczonym z popluczynami stwierdzono, metoda biuretowa, zawartosc jeszcze 62 mg bialka. Przemyta zywica (4,6 g) w przeliczeniu na ciezar suchej substancji (1,150 g) zawierala 0,45% N, co odpowiada 2,8% wzglednie 32 mg bialka. e) 1 g zywicy-nosnika, wytworzonej wedlug przykladu IVd, poddano reakcji wedlug sposobu, opisanego w przykladzie IVd, ze 100 mg cytochromu C i dalszej obróbce wedlug przykladu IVd. W przesaczu i poplu¬ czynach stwierdzono, metoda biuretowa, zawartosc 7,8 mg bialka. Przemyta zywica zawiera 0,9% N w przelicze¬ niu na ciezar suchej zywicy, co odpowiada 5,84% zawartosci bialka tj. 70 mg bialka.Przyklad V. a) Roztwór 80 g dwumetakrylanu glikolu czteroetylenowego, 10 g kwasu metakrylowego, 10 g bezwodnika kwasu maleinowego i 1 g nitrylu kwasu azoizomaslowego w 300 ml acetonitrylu polimeryzuje sie analogicznie do przykladu lila. Wydajnosc wynosi 92 g bialych jajowatych czasteczek, objetosc nasypowa: 2,5 ml/g, objetosc pecznienia w wodzie: 3,2 ml/g, powierzchnia wlasciwa: 1,7m2/g, srednia srednica czastek: 125*z, zawartosc kwasu po zmydleniu grup bezwodnikowych = 3,5 milirównowazników/g, s b) 1 g polimeru, wytworzonego wedlug przykladu Va, poddaje sie reakcji z penicylinacylaza w 33 ml wody przy wartosci pH=6,3 analogicznie do przykladu Ib.Wyniki: czynnosc enzymatyczna (test NIPAB) roztwórwyjsciowy 118 U ciecz znad osadu + roztwory z przemywania 34 U zywica nosnika poreakcji 61 U, co odpowiada 52% czynnosci wyjsciowej. < Przyklad VI. a) Roztwór 50 g dwumetakrylanu glikolu etylenowego, 40 g kwasu metakrylowego, 10 g bezwodnika kwa¬ su maleinowego i 1 g nitrylu kwasu azoizomaslowego w 300 ml acetonitrylu zawiesza sie w 1 litrze benzyny10 90 704 (temperatura wrzenia 100-140°C), w którym rozpuszczono 5g mieszaniny mono- i dwuoleinianu gliceryny i polimeryzuje wciagu 20 godzin w temperaturze 60°C. Polimer perelkowy odsacza sie, zawiesza trzykrotnie w benzenie i dwukrotnie w eterze naftowym (temperatura wrzenia 30-50°C) i suszy w temperaturze 50°C pod zmniejszonym cisnieniem. Wydajnosc wynosi 87 g# objetosc nasypowa: 4,8 ml/g, objetosc pecznienia w wodzie: ,6 ml/g, powierzchnia wlasciwa: 13,2 m2/g, zawartosc kwasu po zmydleniu grup bezwodnikowyeh - 4,2 mili- równowazników/g. b) 1 g polimeru, wytworzonego wedlug przykladu Via, poddaje sie analogicznie do przykladu Ib reakcji z penicylinacylaza w 33 ml wody przy wartosci pH=6,3.Wyniki: czynnosc enzymatyczna (test NIPAB) roztwórwyjsciowy 118 U ciecz znad osadu i roztwory po przemywaniu 29 U zywica nosnika poreakcji 55 U, co odpowiada 47% czynnosci wyjsciowej.Przyklad VII. a) Roztwór 50 g trójmetakrylanu trójmetylowopropanu, 30 g kwasu metakrylowego, 20 g bezwodnika kwasu maleinowego i 1 g nitrylu kwasu azoizomaslowego w 300 ml acetonitrylu polimeryzuje sie analogicznie do przykladu Via. Wydajnosc wynosi 86 g, objetosc nasypowa: 2,0 ml/g, objetosc pecznienia w wodzie: 2,2 ml/g, srednia srednica czastek: okolo 30/x, zawartosc kwasu po zmydleniu grup bezwodnikowych: 4,1 milirówno- wazników/g. b) 1 g polimeru, wytworzonego wedlug przykladu VI la, dodaje sie w temperaturze pokojowej, mieszajac, do roztworu 100 mg lizyny w 32 ml wody. Utrzymuje sie stala wartosc pH=6,3. Po uplywie 16 godzin odsacza sie zywice, zawiesza w 50 ml 1 m roztworu chlorku sodowego, odsacza i przemywa 100 ml wody, pozostalosc suszy pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 100°C i oznacza zawartosc azotu wedlug Kjeldahla.Wyniki: ciezar po wysuszeniu: 860 mg zawartosc azotu: 1,5%, co odpowiada zawartosci 65 mg lizyny w zywicy. Stanowi to 65% uzytej ilosci lizyny.Przyklad VIII. Analogicznie do przykladu Via polimeryzuje sie nastepujace zwiazki (zmiany ilosci bezwodnika kwasu maleinowego): Próba TGDM (g) MAS (g) MSA (g) AIBN (g) Acetonitryl (ml) Benzyna (ml) Emulgator (g) Wydajnosc V (ml/g) VQ(ml/g) Kwas (milrrówn./g)i a 75 1 250 1000 95 3,4 4,4 3,1 b 70 1 250 1000 2,5. 93 3,4 6,0 42 c 65 1 250 1000 86 3,6 4,5 3,6 d 60 1 250 1000 88 2.6 3,5 3,8 e 55 1 250 1000 80 3,0 4,0 3.9 f 50 1 250 1000 70 3,2 4.3 4,7 g 45 1 250 1000 70 2.5 3,4 4.3 TGDM = dwumetakrylan glikolu czteroetylenowego MAS - kwas metakryIowy MSA = bezwodnik kwasu maleinowego AIBN = nitryl kwasu azoizomaslowego emulgator = mieszanina mono- i dwuoleipjanów gliceryny Vs ** objetosc nasypowa Vq = objetosc pecznienia w wodzie kwas = zawartosc kwasu po zmydleniu grup bezwodnikowych Przyklad IX. a) Roztwór 70 g dwumetakrylanu glikolu czteroetylenowego, 20 g kwasu akrylowego, 10 g bezwodnika kwasu maleinowego i 1 g nitrylu kwasu azoizomaslowego w 1 litrze benzenu ogrzewania bez dostepu powietrza i miesza powoli w ciagu 4 godzin w temperaturze 60°C, w ciagu 2 godzin w temperaturze 70°C i w ciagu 2 godzin w temperaturze 80°C. Drobnoziarnisty polimer stracony zawiesza sie trzykrotnie w benzenie i dwukrotnie w acetonitrylu, odsacza i suszy pod zmniejszonym cisnieniem. Wydajnosc wynosi 94 g, objetosc nasypowa: 6,8 ml/g, objetosc pecznienia w wodzie: 7r6 ml/g, zawartosc kwasu po zmydleniu grup bezwodnikowych ¦ 1,64 milirównowazników/g.90 704 11 b| 1 g polimeru, wytworzonego wedlug przykladu IXa, poddajesie wedlug przykladu fb reakcji z penicyli- nacylaza w 32 ml wody przy wartosci pH=6,3.Wyniki: czynnosc enzymatyczna (test NIPAB) roztwórwyjsciowy 107 U ciecz znad osadu + roztwór z przemywania 26 U zywica nosnika poreakcji 38 U, co odpowiada 36% czynnosci wyjsciowej.Przyklad X. a) Roztwór 50 g dwumetakrylanu glikolu czteroetylenowego, 40 g N-winylopirolidonu, 10 g bezwodnika kwasu maleinowego i 1 g nadweglanu dwucykloheksylowego w 200 ml acetonitrylu zawiesza sie w 1 litrze ben¬ zyny (temperatura wrzenia 100—140°C), zawierajacej 5 g mieszaniny mono- i dwuoleinianów gliceryny i ogrzewa, mieszajac, w ciagu 18 godzin w temperaturze 50°C. Nastepnie dodaje sie 1 g inicjatora i miesza w ciagu dalszych 8 godzin w temperaturze 60°C. Kuleczki polimeru przemywa sie dokladnie benzenem i eterem naftowym i suszy pod zmniejszonym cisnieniem. Wydajnosc wynosi 54 g przezroczystych perelek, objetosc nasypowa: 1,6 ml/g, objetosc pecznienia w wodzie: 2,4 ml/g, srednia srednica czastek: okolo 0,3 mm. < Zawartosc kwasu po zmydleniu grup bezwodnikowych - 3,3 milirównowazników/g. Zawartosc azotu: 3,4% * 27% N-winylopirolidonu. « b) 1 g polimeru, wytworzonego wedlug przykladu Xa, poddaje sie analogicznie do przykladu Ib reakcji z penicylinacylaza w 33 ml wody przy wartosci pH=6,3.Wyniki: czynnosc enzymatyczna (test NIPAB) roztwórwyjsciowy 107 U ciecz znad osadu + roztwory po przemywaniu 26 U zywica nosnika poreakcji 82 U, co odpowiada 77% czynnosci wyjsciowej.Przyklad XI. a) Roztwór 70 g dwumetakrylanu glikolu czteroetylenowego, 20 g amidu kwasu metakrylowego, 10 g bezwodnika kwasu maleinowego, 1 g nitrylu kwasu azoizomaslowego i 200 ml acetonitrylu zawiesza sie w ben¬ zynie analogicznie do przykladu Va i polimeryzuje. Wydajnosc wynosi 93 g, objetosc nasypowa: 2,0 ml/g, obje¬ tosc pecznienia w wodzie: 3,3 ml/g, zawartosc kwasu po zmydleniu grup bezwodnikowych: 1,7 milirówno¬ wazników/g. b) 1 g polimeru, wytworzonego wedlug przykladu Xla, poddaje sie reakcji z penicylinacylaza w 32 ml wody przy wartosci pH=6,3 analogicznie do przykladu Ib.Wyniki: czynnosc enzymatyczna (test NIPAB) roztwórwyjsciowy 107 U ciecz znad osadu i roztwory po przemywaniu 42 U zywica nosnika poreakcji 33 U, co odpowiada 31% czynnosci wyjsciowej.Przyklad XII. a) Roztwór 60 g dwumetakrylanu glikolu czteroetylenowego, 30 g N-metoksymetyloamidu kwasu akry¬ lowego, 10 g bezwodnika kwasu maleinowego i 1 g nitrylu kwasu azoizomaslowego w 200 ml acetonitrylu zawie- - sza sie w 1 litrze benzyny, w której rozpuszczono 5 g mieszaniny mono- i dwuoleinianów gliceryny i polime¬ ryzuje w ciagu 20 godzin w temperaturze 60°C. Polimer perelkowy odsacza sie, zawiesza trzykrotnie w octanie etylu i suszy pod zmniejszonym cisnieniem w temperaturze 50°C. Wydajnosc wynosi 97 g, objetosc nasypowa: 1,6 ml/g, objetosc pecznienia w wodzie: 3,1 ml/g, srednia srednica czastek: okolo 3 mm. » b) 1 g polimeru, wytworzonego wedlug przykladu XIla, poddaje sie reakcji z penicylinacylaza w 32 ml wody przy wartosci pH=6,3, analogicznie do przykladu Ib.Wyniki: czynnosc enzymatyczna (test NIPAB) roztwórwyjsciowy 107 U ciecz znad osadu + roztwory po przemywaniu 49 U zywice nosnika poreakcji 25 U, co odpowiada 23% czynnosci wyjsciowej.Przyklad XIII. a) Stosujac do reakcji wedlug przykladu XIla, zamiast N-metoksymetyloamidu kwasu akrylowego 30 g N-metoksymetyloamidu kwasu metakrylowego, uzyskuje sie nastepujacy wynik: wydajnosc wynosi 94 g, obje-12 90 704 tosc nasypowa: 2,4 ml/g, objetosc pecznienia w wodzie: 3,9 ml/g, srednia srednica czastek: okolo 0,6 mm. < b) 1 g polimeru, wytworzonego wedlug przykladu XII la, poddaje sie reakcji z penicylinacylaza w 32 ml wody przy wartosci pH-6,3 analogicznie do przykladu Ib.Wyniki: czynnosc enzymatyczna (test NIPAB) roztwórwyjsciowy 107 U ciecz znad osadu i roztwory po przemywaniu 60 U zywica nosnika poreakcji 24 U, co odpowiada 22% czynnosci wyjsciowej. « Przyklad XIV. 8,5 g dwumetakrylanu tlenku propylenu oMn = 1000 (liczba hydroksylowa 112) 5 g kwasu akrylowego, 3,5 g bezwodnika kwasu maleinowego i 200 mg nitrylu kwasu azoizomaslowego wprowadza sie do ampulki, po czym usuwa z ampulki powietrze zastepujac je azotem i ampulke zatapia, a nastepnie ogrzewa w temperaturze 65°C w ciagu 20 godzin. Po zakonczeniu reakcji ampulke rozbija sie, blok polimeru rozdrabnia, trzykrotnie szlamuje acetonem i suszy w temperaturze 50°C przy 50 tor.Wydajnosc: 13 g Objetosc nasypowa: 2,5 ml/g Objetosc pecznienia w wodzie 3,3 ml/g Zawartosc kwasu oznaczona po zmydleniu grup bezwodnikowych: 4,66 mE/g.Przyklady XV—XXII. Wsady polimeryzacyjne o skladzie podanym w tablicy 1, w atmosferze azotu, mieszano wciagu 20 godzin w temperaturze 60°C. Proszkowy polimer odsaczono i trzykrotnie szlamowano w toluenie, jak i jeden raz w eterze naftowym (o temperaturze wrzenia 30-50°C). Produkty wytworzone wedlug przykladów XIX i XX szlamowano trzykrotnie w acetonie) i wysuszono pod zmniejszonym cisnieniem w tem¬ peraturze 50°C. PL PL

Claims (6)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nierozpuszczalnych w wodzie preparatów proteinowych, znamienny tym, ze polimeryzuje sie w odniesieniu do ogólnej ilosci kopolimeru A) 0,1—50% wagowych bezwodników a^-monooIe- finowo-nie nasyconyeh kwasów dwukarboksylowych o 4—9 atomach wegla, B) 35—90% wagowych dwu i/lub poli-/met/akrylanów dwu- i/lub polioli i C) 5—60% wagowych przynajmniej jednego dajacego sie polimeryzowac zwiazku o jednym wiazaniu nienasyconym, nie posiadajacego grup funkcyjnych reagujacych z grupami bezwo- dnikowymi i tworzacego polimery hydrofilowe, przy czym laczna zawartosc procentowa A—C wynosi 100%, metoda polimeryzacji straceniowej lub polimeryzacji perelkowej w rozpuszczalnikach lub mieszaninach rozpusz¬ czalników obojetnych w stosunku do grup bezwodnikowych, w temperaturze 20—200/C, w obecnosci zwiazków, tworzacych rodniki, nastepnie kopolimer w wodnej zawiesinie poddaje sie reakcji z roztworem bialka.

2. Sposób wytwarzania nierozpuszczalnych w wodzie preparatów proteinowych, znamienny tym, ze usieciowany kopolimer skladajacy sie z kopolimeryzowanych jednostek a) 0,1—30% wagowych bezwodników a,/J-monoolefinowo nienasyconych kwasów dwukarboksylowych o 4—9 atomach wegla, B) 35—90% wagowych dwu- i/lub poli-/met/akrylanów dwu i/lub polioli i C) 5—60% wagowych przynajmniej jednego dajacego sie polimeryzowac zwiazku o jednym wiazaniu nienasyconym, nie posiadajacego grup funkcyjnych reagujacych z gru¬ pami bezwodnikowymi i tworzacego polimery hydrofilowe, przy czym laczna zawartosc procentowa A—C wynosi 100, poddaje sie reakcji w wodnej zawiesinie z roztworem bialka.

3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze w odniesieniu do calkowitej ilosci monomerów w kopolimerze polimeryzuje sie A) 0,1-50% wagowych bezwodników ajJ-monoolefinowo nienasyconych kwa¬ sów dwukarboksylowych o 4-9 atomach wegla, B) 35—90% wagowych dwu- i/lub po Ii/met/ akrylanów dwu i/lub polioli oraz C) 5—60% wagowych przynajmniej jednego dajacego sie polimeryzowac zwiazku o jednym wiazaniu nienasyconym, nie posiadajacego grup funkcyjnych reagujacych z grupami bezwodnikowymi i tworza¬ cego polimery hydrofilowe, przy czym laczna zawartosc procentowa A-C wynosi 100%, metoda polimeryzacji straceniowej !ub polimeryzacji perelkowej, w rozpuszczalnikach lub mieszaninach rozpuszczalników obojetnych w stosunku do grup bezwodnikowych, w temperaturze 20-200°C, w obecnosci zwiazków tworzacych rodniki, nastepnie poddaje reakcji z wodnymi roztworami penicylinacylazy o niskiej zawartosci soli, przy wartosci pH=5,7-6,8.

4. Sposób wedlug zastrz. 3, znamienny tym, ze reakcje kopolimeru z roztworem penicylinalazy rozpoczyna sie przy stezeniu soli w srodowisku reakcyjnym nizszym od 0,02 mola/litr. <

5. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze usieciowany kopolimer skladajacy sie z kopolime¬ ryzowanych jednostek A) 0,1-30% wagowych bezwodników a^-monoolefinowo nienasyconych kwasów dwu-90 704 13 karboksylowych o 4-9 atomach wegla, B) 35-90% wagowych dwu- i/lub poli-/met/akrylanów dwu i/lub polioli oraz C) 5-60% wagowych przynajmniej jednego dajacego sie polimeryzowac zwiazku o jednym wiazaniu niena¬ syconym, nie posiadajacego grup funkcyjnych reagujacych z grupami bezwodnikowymi i tworzacego polimery hydrofiloweTprzy czym laczna zawartosc procentowa A-C wynosi 100, poddaje sie reakcji z wodnym roztwo¬ rem penicylinacylazy o niskiej zawartosci soli w zakresie wartosci pH=5,7-6,8.

6. Sposób wedlug zastrz. 5; znamienny tym, ze stezenie soli w srodowisku reakcyjnym na poczatku reakcji kopolimeru z roztworem penicylinacylazy jest nizsze niz 0,02 mola/litr.14 90 704 Tablica Przykladnr XV XVI XVII XVIII XIX XX XXI XXII : f Bezwodnik kwasu maleinowego(g) 5 20 5 Bezwodnik kwasu itakonowego(g) 25 10 0.1 30 Bezwodnik kwasu cytrakonowego(g) 2 Kwas akrylowy(g) 30 7,5 10 Kwas metakryIowy(g) 25 30 15 Amid kwasu akrylowego(g) 40 Dwuakrylan glikolu etylenowego (g) 65 Dwumetakrylan glikolu etylenowego(g) 17,5 Dwumetakrylan glikolu etylenowego(g) 73 60- Dwuakrylan glikolu trójetylenowego(g) 60 Trójakrylantrój metylo Io propanu"(g) 40 Dwumetakrylan glikolu czteroetylenowego(g) 89,9 Trójmetakrylan TM P-300 (g) Nitryl kwasu azoizomaslowego (g) Toluen (ml) Benzyna (t. wrz. 100-140°C/ml) Ester etylowy kwasu octowego (ml) Wydajnosc Vs(ml/g) VQ(ml/g) +/ Zawartosc kwasu (mE/g) TMP—300-trójmetakry lan = trójmetakry lan tlenku etylenu/tlenku propylenu (1 : 1), kopolimer o M 300 (liczba hydroksylowa =¦ 542) z reakcji zapoczatkowanej trójmetylopropanem. V§ = objetosc nasypowa Vq ' = objetosc pecznienia w wodzie *) zawartosc kwasu oznaczona po zmydleniu grup bezwodnikowych. 1 250 750 96 6,3 8.7 4,27 0,5 250 250 47 7.5 13,0 8.31 1 400 600 98 4,0 6.0 232 1 500 500 95 6,1 9,3 4,54 1 1000 94 3.5 4,0 3,03 1 500 500 97 5.6 8,1 1.46 30 0,5 250 250 45 8.0 12.5 4.48 1 250 750 •97 2,2 3,3 3.86 Prac. Poligraf. UP PRL naklad 120+18 Cena 10 zl PL PL