PL243397B1

PL243397B1 - Reaktywne pochodne barwników Safirinium oraz ich zastosowanie

Info

Publication number: PL243397B1
Application number: PL432806A
Authority: PL
Inventors: Przemysław Szafrański; Patryk KASZA; Patryk Kasza; Marek Cegła; Jarosław Sączewski; Joanna FEDOROWICZ; Joanna Fedorowicz
Original assignee: Gdanski Univ Medyczny; Univ Jagiellonski
Priority date: 2020-02-04
Filing date: 2020-02-04
Publication date: 2023-08-21
Also published as: PL432806A1

Abstract

Przedmiotem wynalazku są aktywne związki, stanowiące pochodne Safirinium oraz ich zastosowanie do znakowania cząsteczek chemicznych w reakcji cykloaddycji azydków i alkinów.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są reaktywne pochodne triazolopirydyniowych i triazolochinoliniowych barwników Safirinium oraz ich zastosowanie do znakowania fluoroscencyjnego cząsteczek chemicznych w reakcji cykloaddycji azydków i alkinów. Katalizowana miedzią reakcja cykloaddycji azydków i alkinów, której produktami są 1,4-dipodstawione triazole (Schemat 1), jest „sztandarowym” przykładem podejścia „click chemistry”, zaproponowanego w 2001 roku przez K. B. Sharplessa. Podstawowym założeniem tego podejścia jest wykorzystanie reakcji prostych i wydajnych, przebiegających w łagodnych warunkach [1]. Od początku jednym z głównych zastosowań tej strategii syntetycznej było znakowanie fluorescencyjne biocząsteczek lub substancji biologicznie czynnych. Liczne przykłady takiego wykorzystania cykloaddycji przedstawione są w szeregu prac przeglądowych [2-5], z których szczególnie obszerna i aktualna jest praca Thirumurugana i współpracowników [6].

R¹ ® ... Cum m-N

R^z

Schemat 1. Ogólny schemat katalizowanej miedzią reakcji cykloaddycji azydków i alkinów.

Ponieważ azydki organiczne, terminalne alkiny, a także powstające z nich 1,2,3-triazole nie występują w podstawowych procesach biologicznych organizmów żywych, a katalizowana jonami miedzi reakcja cykloaddycji może bez większych trudności przebiegać w środowisku wodnym wobec jonów i innych cząsteczek, jest ona uważana za reakcję „bioortogonalną”, czyli taką, która nie zakłóca procesów biologicznych, a zarazem nie jest przez nie utrudniana. Ta właściwość reakcji cykloaddycji azydków i alkinów jest niezwykle cenna, ponieważ dzięki odpowiednio zaprojektowanej procedurze znakowania pozwala na selektywne śledzenie wybranych procesów biologicznych lub biocząsteczek in vitro lub nawet in vivo z wykorzystaniem zjawiska fluorescencji. Przykładem takiego zastosowania może być metoda śledzenia wbudowywania azydotymidyny (lek przeciwwirusowy używany w leczeniu HIV) do DNA opisana w 2011 przez Koha i współpracowników [7].

Ze stanu techniki znane są barwniki fluorescencyjne połączone z reaktywnymi fragmentami, które mogą ulegać reakcjom z grupami aminowymi i innymi - szereg takich związków został ujawniony w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym PCT WO 2012/129128A1, czy w patentach europejskich EP2223086B1 oraz EP2686680 B1. Wśród reaktywnych grup funkcyjnych umożliwiających połączenie barwnika z innymi cząsteczkami można wyróżnić estry A/-hydroksysukcynimidowe, które pozwalają na łatwe tworzenie wiązań amidowych. Układ fluorescencyjny może być zaopatrzony również we fragmenty takie jak grupa izotiocyjanianowa, czy inne. Barwniki zawierające w swojej strukturze grupę karboksylową mogą być przekształcane w reaktywne estry in situ, za pomocą odczynników aktywujących takich jak N,Λ/'-dicykloheksylokarbodiimid (DCC), czy karbonylodiimidazol (CDI). Przykłady reaktywnych barwników fluorescencyjnych zawierających fragment A/-hydroksysukcynimidowy (EP2686680B1 lub EP2223086B1) albo grupę izotiocyjanianowa (FITC) poniżej przedstawiono na Schemacie 2:

EP2686680B1

EP2223086B1

FITC

PL 243397 BI

Z literatury naukowej znane są także alkinowe pochodne barwników fluorescencyjnych, mogące ulegać reakcji cykloaddycji z azydkami organicznymi.

Schemat 3. Alkinowe znaczniki używane w znakowaniu fluorescencyjnym w ramach koncepcji click chemistry: A - DIB-ET, B - prop-fmoc, C - Cy3, D - fluoresceina, E - dansyl, F - alkaloid drzewa chinowego, G - BODIPY

Większość alkinowych znaczników została zaprojektowana poprzez modyfikację chemiczną znanych w literaturze barwników, jak na przykład DIB-ET (A) [8], prop-fmoc (B) [9], pochodne cyjaniny (Cy3, Cy5) (C) [7], pochodne ksantenu (fluoresceina) (D) [10], dansyl (E) [11], alkaloidy drzewa chinowego (F) [12], BODIPY (G) [13] (Schemat 3). Dla większości alkinowych barwników fragment acetylenowy wprowadzano poprzez tworzenie wiązania amidowego bądź estrowego (prop-fmoc (B), cyjaniny (C), fluoresceina (D), dansyl (E), BODIPY (G)). Reakcje tworzenia takich wiązań chemicznych należą do szybkich i nie wymagają specjalnych warunków. Jednakże z uwagi na obecność reaktywnych miejsc w strukturze cząsteczek barwnika, które po modyfikacji nie wpływają na właściwości fluorescencyjne, możliwe jest wprowadzenie alkinu za pomocą innych metod syntetycznych. Przykładowo w przypadku syntezy DIB-ET (A) przeprowadzono reakcję tworzenia wiązania węgiel-węgiel w reakcji dibenzoilu, octanu amonu oraz 4-etynylobezaldehydu. Natomiast w przypadku alkaloidów drzewa chinowego (F) w pierwszym etapie otrzymuje się dibromową pochodną olefiny, a następnie po działaniu mocnej zasady w wyniku eliminacji powstaje fragment alkinowy. Alkinowe znaczniki fluorescencyjne wykorzystywane są do znakowania głównie struktur o znaczeniu biologicznym [14], takich jak lek azydotymidyna [8,9,12], cukry [15], białka [11], nukleotydy [16], wirusy [10]. Środowisko biologiczne w różnych systemach może różnić się na tyle, że często konieczne jest dostosowanie reagentów do panujących warunków. Złożoność strukturalna znaczników fluorescencyjnych i wynikające z tego trudności w ich syntezie stanowią poważne ograniczenie w badaniach naukowych [17]. Poszukiwanie nowych barwników zawierających fragment alkinowy stanowi ważny element dynamicznego rozwoju metod biokoniugacji.

Podobnie jak w przypadku alkinowych pochodnych barwników fluorescencyjnych, znanych jest szereg pochodnych azydkowych, uzyskanych poprzez modyfikację znanych układów fluorescencyjnych zawierających grupę karboksylową lub aminową. Przykładem mogą być pochodne fluoresceiny (H [18]), rodaminy (I [19]), cyjaniny (M [20]). Fragment azydkowy wprowadzany jest do struktury barwników również bezpośrednio, najczęściej jako podstawnik pierścieni aromatycznych, lub fragmentów alkilowych. Przykłady znanych azydkowych pochodnych barwników fluorescencyjnych przedstawiono na Schemacie 4.

PL 243397 BI

Schemat 4: Struktury barwników fluorescencyjnych zawierających fragment azydkowy: H - pochodna fluoresceiny, I - rodaminy, J - kumaryny, K i L - dansylu, M - cyjaniny, N - BODIPY [21,22],.

Barwniki fluorescencyjne Safirinium-P (P1 i P2) oraz Safirinium-Q (P4 i P5) (Schemat 6) oraz sposób ich otrzymywania zostały ujawnione w polskim opisie patentowym PL 223740 B1. Wspólnym rdzeniem powyższych związków jest fragment PO (Schemat 6) zawierający układ 1,2,4-triazolopirydyniowy podstawiony grupą karbonylową zapewniającą punkt przyczepu ugrupowań reaktywnych. Ujawnione struktury wykorzystano do fluorescencyjnego znakowania przetrwalników bakteryjnych [30] oraz w proteomice jako znaczników jonizacyjnych w badaniach hydrolizatów białkowych. [31]

PO

PL 243397 BI

Schemat 6. Barwniki fluorescencyjne Safirinium-P (P1 i P2) oraz Safirinium-Q (P4 i P5) ujawnione w opisie patentowym PL 223740 B1.

Właściwości fizykochemiczne barwników Safirinium oraz uzyskiwanych na ich bazie znaczników fluorescencyjnych w formie aktywnych estrów z A/-hydroksyimidem kwasu bursztynowego (NHS), takie jak wysoka wydajność kwantowa fluorescencji, duże przesunięcie Stokesa, rozpuszczalność w wodzie, stabilność chemiczna, odporność na foto-wybielanie oraz brak zależności właściwości optycznych od pH, predysponują tę grupę związków do roli barwników fluorescencyjnych, posiadających potencjał zastosowania. Oprócz opisanych wyżej barwników znane są również ich pochodne zawierające podstawniki w układzie chinoliny, a także analogi o bardziej rozbudowanym szkielecie. Synteza, struktura i właściwości fizykochemiczne tych pochodnych zostały ujawnione w pracy Fedorowicz i współpracowników [32].

Pomimo opisania w stanie techniki pochodnych, które mogą zostać wykorzystane jako znaczniki fluoroscencyjne, brakuje nadal związków łączących się selektywnie w sposób szybki i z dużą wydajnością ze znakowanymi cząsteczkami za pomocą innych technik niż wiązanie amidowe powstałe w wyniku działania amin na estry A/-hydroksysukcynimidowe. Stan techniki nie opisuje związków o strukturze, która umożliwiałaby wykorzystanie ich w katalizowanej miedzią bioortogonalnej reakcji cykloaddycji azydków i alkinów. Powyższe problemy rozwiązał prezentowany wynalazek.

1. Pierwszym przedmiotem wynalazku jest związek o wzorze (S1):

gdzie:

X oznacza ugrupowanie wybrane z grupy zawierającej: NH, O, przy czym n wynosi od 1 do 10 atomów węgla w ugrupowaniach metylenowych,

Ri oznacza podstawnik wybrany z grupy obejmującej podstawniki o wzorach od (W1) do (W2):

W1 W2

R², R³ - oznacza podstawnik alkilowy o ilości węgli od 2 do 8,

R⁴, R⁵, R⁶ - oznacza podstawnik metylowy albo atom wodoru, albo R⁴ oznacza podstawnik metylowy albo atom wodoru natomiast podstawniki R⁵ i R⁶ są połączone i tworzą układ aromatyczny o wzorze ogólnym S2, gdzie podstawniki R⁷ - R¹⁰ oznaczają atom wodoru:

przy czym anion A^- stanowi jon wybrany z grupy zawierającej: F^-, Ch, Br, h.

PL 243397 BI

W korzystnej realizacji wynalazku związek o wzorze (S1) jest opisany strukturą:

gdzie:

X oznacza ugrupowanie wybrane z grupy zawierającej: NH albo O, przy czym n określa od 1 do 7 atomów węgla w ugrupowaniach metylenowych,

R¹ oznacza podstawnik wybrany z grupy obejmującej podstawniki o wzorach od (W1) do (W2):

W1 W2

R², R³ - oznaczają podstawnik alkilowy o ilości atomów węgla od 2 do 8,

R⁴, R⁵, R⁶ - oznacza podstawnik metylowy albo atom wodoru, przy czym anion A- stanowi jon bromkowy Br·

W kolejnej korzystnej realizacji wynalazku związek (S1) dla celów niniejszego wynalazku został wybrany z grupy zwierającej pochodne o wzorach P6-P11:

Bromek 2,2-dietylo-5,7-dimetylo-8-[(prop-2-yn-1-ylo)karbamoilo]-2/-/,3/-/-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pirydyn-2-iowy (P6),

Bromek 5,7-dimetylo-2,2-dioktylo-8-[(prop-2-yn-1-ylo)karbamoilo]-2/-/,3/-/-[1,2,4]triazolo[4,3-a]-pirydyn-2-iowy (P7),

Bromek 2,2-dietylo-5,7-dimetylo-8-[(prop-2-yn-1-yloksy)karbonylo]-2/-/,3/-/-[1,2,4]triazolo[4,3-a]-pirydyn-2-iowy (P8),

Bromek 8-[(5-azydopentylo)karbamoilo]-5,7-dimetylo-2,2-dioktylo-2/-/,3/-/-[1,2,4]triazolo[4,3-a]piridyn-2-iowy (P9),

Bromek 8-[(5-azydopentylo)karbamoilo]-5,7-dimetylo-2,2-dietylo-2/-/,3/-/-[1,2,4]triazolo[4,3-a]piridyn-2-iowy (P10),

- Bromek 8-[(7-azydoheptylo)karbamoilo]-5,7-dimetylo-2,2-dietylo-2/-/,3/-/-[1,2,4]triazolo[4,3-a]piridyn-2-iowy (P11), przedstawione poniżej:

PL 243397 BI

Me O

Me

P7 C₈H₁₇

Korzystnie, przedmiotem wynalazku jest związek o wzorze (S2):

gdzie:

ugrupowanie X jest wybrane z grupy zawierającej: NH, O, przy czym n wynosi od 1 do 10 atomów węgla w ugrupowaniach metylenowych,

Ri - oznacza podstawnik wybrany z grupy obejmującej podstawniki o wzorach od (W1) do (W2):

R², R³ oznacza podstawnik alkilowy o ilości węgli od 2 do 8,

R⁴ - oznacza podstawnik wybrany z grupy zawierającej: metylen albo atom wodoru, R⁷, R⁸, R⁹, R¹⁰ - oznacza atom wodoru, przy czym anion A^- stanowi jon wybrany z grupy zawierającej: F^-, Ch, Br, h.

PL 243397 BI

W korzystnej realizacji wynalazku związek o wzorze (S2) jest opisany strukturą:

gdzie:

ugrupowanie X oznacza grupę NH, przy czym n wynosi od 1 do 7 atomów węgla w ugrupowaniach metylenowych, Ri - oznacza podstawnik (W1) lub (W2):

W1 W2

R², R³ oznacza podstawnik alkilowy o ilości węgli od 2 do 8,

R⁴ - oznacza podstawnik wybrany z grupy zawierającej: metylen albo atom wodoru,

R⁷, R⁸, R⁹, R¹⁰ - oznacza atom wodoru, przy czym anion A- stanowi jon Br.

W kolejnej korzystnej realizacji wynalazku związek (S2) został wybrany z grupy zawierającej pochodne o wzorach Ρ12-P13:

Bromek 2,2-dietylo-4-[(prop-2-yn-1-ylo)karbamoilo]-7/-/,2/-/-[1,2,4]triazolo[4,3-a]chinolin-2-iowy (P12),

Bromek 2,2-dioktylo-4-[(prop-2-yn-1-ylo)karbamoilo]-7/-/,2/-/-[7,2,4]triazolo[4,3-a]chinolin-2-iowy (P13), przedstawione poniżej

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie związku według wynalazku zdefiniowanego powyżej do znakowania cząsteczek chemicznych w reakcji cykloaddycji azydków i alkinów.

Dla celów niniejszego opisu jako „podstawnik alkilowy” uznaje się grupę spełniającą ogólny wzórCnH2n+i, o nierozgałęzionym łańcuchu węglowym np. metyl, etyl, n-propyl, n-oktyl.

Dla celów niniejszego opisu jako „podstawnik alkenylowy” uznaje się grupę spełniającą ogólny wzór C_nH2n-i, o nierozgałęzionym łańcuchu węglowym np. etenyl, propenyl.

Dla celów niniejszego opisu jako „podstawnik alkinowy” uznaje się grupę zawierającą przynajmniej jedno wiązanie trójkrotne w łańcuchu węglowym rozgałęzionym lub nierozgałęzionym.

Zaletą rozwiązania według wynalazku jest zwiększenie selektywności procesu łączenia barwnika fluorescencyjnego z cząsteczką docelową poprzez zastosowanie bioortogonalnej reakcji cykloaddycji azydków i alkinów, która znalazła szerokie zastosowanie w znakowaniu biocząsteczek.

Obecność fragmentów azydkowych i alkinowych w cząsteczkach przedstawionych barwników pozwala na ich wykorzystanie do znakowania z użyciem reakcji cykloaddycji azydków i alkinów w wersji katalizowanej miedzią(l) lub niekatalizowanej. Oprócz cykloaddycji 3+2, zarówno pochodne azydkowe [35], jak i alkinowe [33,34] mogą ulegać szeregowi innych reakcji chemicznych.

Reaktywne barwniki stanowiące przedmiot niniejszego wynalazku mogą być zastosowane do znakowania substancji zawierających odpowiednie kompatybilne grupy funkcyjne takie jak azydek lub alkin. Szczególnym przykładem takiej reakcji jest reakcja barwnika zawierającego fragment alkinowy przyłączony wiązaniem amidowym, z azydkami organicznymi o różnej strukturze. Oprócz podanych przykładów analogicznym reakcjom mogą ulegać także inne azydki, w tym pochodne znanych leków jak, a nawet bardziej złożonych układów.

Przykłady realizacji zobrazowano poniżej. Na rysunkach przedstawiono: fig. 1 widmo ¹H-NMR bromku 2,2-dietylo-5,7-dimetylo-8-[(prop-2-yn-1-ylo)karbamoilo]-2H,3H-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pirydyn-2-iowego (P6), fig. 2 widmo 1H-NMR bromku 2,2-dietylo-5,7-dimetylo-8-{[(1-tetradecylo-1 H-1,2,3-triazol-4-ilo)metylo]karbamoilo}-2 H ,3 H-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pirydyn-2-iowego, otrzymanego według procedury z Przykładu 3, ze związku P6 i azydku tetradecylu, fig. 3 Widma absorpcyjne i emisyjne w zakresie UV-Vis dla pochodnych pirydyniowych (S1), przy czym widma emisyjne rejestrowano przy długości fali wzbudzenia 350-370 nm, fig. 4 widma absorpcyjne i emisyjne w zakresie UV-Vis dla pochodnych chinoliniowych (S2), przy czym widma emisyjne rejestrowano przy długości fali wzbudzenia 350-370 nm.

Przykład 1. Synteza aktywnego estru N-hydroksysuksynimidowego Safirinium P według publikacji [30]

4,6-Dimetyloizoksazolo[3,4-b ]pirydyn-3(1 H )-on, dietyloaminę (1,1 equiv) oraz formaldehyd (1,1 equiv.) w postaci 37% wodnego roztworu rozpuszczono w metanolu i ogrzewano w zamkniętym naczyniu w temperaturze 50 stopni Celsjusza w ciągu 1 godziny. Po zakończeniu ogrzewania, mieszaninę reakcyjną odparowano pod obniżonym ciśnieniem.

Produkt wyżej opisanej reakcji (2,2-dietylo-5,7-dimetylo-2,3-dihydro-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pirydy-2-nio-8-karboksylan) rozpuszczono w metanolu i zakwaszono metanolowym roztworem HCI. Rozpuszczalnik odparowano pod obniżonym ciśnieniem i otrzymany w ten sposób chlorowodorek użyto do kolejnej reakcji.

Otrzymany wcześniej chlorowodorek, N,N'-diizopropylokarbodiimid (DIC, 1,5 equiv.) oraz N-hydroksyimid kwasu bursztynowego (NHS, 2 equiv.) rozpuszczono w DMF i mieszano w temperaturze pokojowej przez dwie godziny. Następnie mieszaninę reakcyjną odparowano pod obniżonym ciśnieniem, a uzyskaną stałą substancję przemyto dwukrotnie małymi ilościami acetonu.

Przykład 2. Ogólna procedura syntezy estrów i propargiloamidów Safirinium P (S1, gdzie X = NH lub O; R¹ = W1) oraz Q (S2, gdzie X = NH lub O; R¹ = W1)

Do estru N-hydroksysuksynimidowego Safirinium P (przykład 1) lub Q dodano 1,5 equiv. propargiloaminy (dla X = NH) lub alkoholu propargilowego (dla X = O), rozpuszczono w dichlorometanie, a następnie dodano 1,1 równoważnika bezwodnego węglanu potasu. Następnie mieszano w temperaturze pokojowej przez noc. Po zakończeniu reakcji, mieszaninę reakcyjną przesączono przez sączek karbowany w celu usunięcia węglanu potasu. Otrzymany przesącz odparowano pod obniżonym ciśnieniem.

Przykład 3. Ogólna procedura reakcji cykloaddycji alkinowych pochodnych barwników (S1 i S2, gdzie R¹ = W1) z azydkami organicznymi.

Do 100 mg propargiloamidu Safirinium rozpuszczonego w 3 mL dichlorometanu dodano 1,05 równoważnika molowego azydku organicznego, następnie 10 mol% 0,05 M wodnego roztworu CuSO4, i 10 mol% AMTC (2-{4-[(dimetyloamino)metylo]-1,2,3-triazolilo}cykloheksan-1-ol). Reakcję rozpoczęto przez dodanie 10 mol% askorbinianu sodu w postaci wodnego roztworu o stężeniu 10 mg/mL. Mieszaninę uzupełniono wodą tak, aby po dodaniu roztworu askorbinianu sodu objętość wody wynosiła 1,5 mL. Reakcję prowadzono przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza, intensywnie mieszając. Po zakończeniu reakcji rozpuszczalniki odparowano pod obniżonym ciśnieniem.

Przykład 4. Ogólna procedura chromatograficznego oczyszczania reaktywnych barwników i ich triazolowych pochodnych (S1 i S2)

Kolumnę chromatograficzną wypełniono odgazowaną pod obniżonym ciśnieniem zawiesiną żelu krzemionkowego w metanolu. Po poprawnym ułożeniu się żelu, kolumnę nasycono solą nieorganiczną poprzez przemywanie nasyconym metanolowym roztworem soli (np. jodek potasu, chlorek sodu, bromek sodu, bromek potasu, chlorek potasu). Po zakończeniu nasycania kolumny, rozdział chromatogra ficzny prowadzono według standardowej procedury preparatywnej chromatografii cieczowej. Po zakończeniu rozdziału nadmiar soli nieorganicznej w zebranych frakcjach eluentu zawierających oczyszczaną substancję usunięto przez krystalizację.

Przykład 5. Synteza azydoalkiloamidowych pochodnych Safirinium (S1 i S2, gdzie X = NH; R¹ = W2)

Azydoalkioamidowe pochodne barwników Safirinium otrzymywano w reakcji aktywnych estrów N-hydroksysuksynimidowych Safirinium z odpowiednią azydoalkiloaminą wobec bezwodnego węglanu potasu.

Ester N-hydroksysuksynimidowy Safirinium P (przykład 1) rozpuszczono w dichlorometanie, dodano 2 równoważniki molowe azydoalkiloaminy oraz 1,5 równoważnika bezwodnego węglanu potasu. Następnie mieszano w temperaturze pokojowej przez noc. Po zakończeniu reakcji, mieszaninę reakcyjną przesączono przez sączek karbowany w celu usunięcia węglanu potasu. Otrzymany przesącz odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Uzyskany produkt oczyszczano chromatograficznie według procedury opisanej w Przykładzie 4.

Przykład 6. bromek 2,2-dietylo-5,7-dimetylo-8-[(prop-2-yn-1-ylo)karbamoilo]-2H,3H-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pirydyn-2-iowy (P6)

Pochodną otrzymano wg procedury opisanej w przykładach 1-2 i oczyszczono według procedury opisanej w przykładzie 4

1H-NMR (CHLOROFORM-d, 300 MHz): δ = 8,40 (t, J = 4,7 Hz, 1H), 6,55 (s, 2H), 5,99 (s, 1H), 4,11 (dd, J = 5,0, 2,6 Hz, 2H), 3,99-4,08 (m, 2H), 3,69-3,83 (m, 2H), 2,58 (d, J = 7,6 Hz, 6H), 2,22 (t, J = 2,3 Hz, 1H), 1,43 (t, J = 6,7 Hz, 6H) ppm, ¹³C-NMR (CHLOROFORM-d, 75 MHz): δ = 163,0, 159,6, 156,5, 144,3, 113,9, 107,4, 79,6, 73,0, 71,4, 62,6, 29,6, 29,2, 22,9, 19,7, 8,6 ppm, LC-MS: Rt = 2,04 min; 100%; m/z [M]⁺ = 287

Przykład 7. 5,7-dimetylo-2,2-dioktylo-8-[(prop-2-yn-1-ylo)karbamoilo]-2 H ,3 H-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pirydyn-2-iowy (P7)

1H-NMR (METHANOL-d4, 300 MHz): δ = 6,16 (s, 1H), 5,95 (s, 2H), 4,11 (d, J = 2,9 Hz, 2H), 3,553,76 (m, 4H), 2,64 (t, J = 2,6 Hz, 1H), 2,42 (s, 3H), 2,34 (s, 3H), 1,81 (br. s, 4H), 1,29-1,39 (m, 20H), 0,89 (t, J = 7,0 Hz, 6H) ppm, LC-MS: Rt = 7,24 min; 95,31%; m/z [M]⁺ = 455.

Przykład 8. 2,2-dietylo-5,7-dimetylo-8-[(prop-2-yn-1-yloksy)karbonylo]-2H,3H-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pirydyn-2-iowy (P8)

1H-NMR (CHLOROFORM-d, 300 MHz): δ = 6,42 (s, 2H), 5,91 (s, 1H), 4,88 (d, J = 2,9 Hz, 2H), 4,02-4,12 (m, 2H), 3,64-3,76 (m, 2H), 2,58 (s, 3H), 2,51 (t, J = 2,3 Hz, 1H), 2,36 (s, 3H), 1,46 (t, J = 7,0 Hz, 6H) ppm, LC-MS: Rt = 2,96 min; 95,19%; m/z [M]⁺ = 288

Przykład 9. bromek 8-[(5-azydopentylo)karbamoilo]-5,7-dimetylo-2,2-dioktylo-2 H ,3 H-[1,2,4]triazolo[4,3-a]piridyn-2-iowy (P9)

Pochodną otrzymano wg procedury opisanej w przykładach 1 oraz 5 i oczyszczono według procedury opisanej w przykładzie 4

1H-NMR (METHANOL-d4, 500 MHz): δ = 6,12 (s, 1H), 5,81 (s, 2H), 3,71-3,80 (m, 2H), 3,51-3,66 (m, 4H), 3,30-3,33 (m, 2H), 2,35 (s, 3H), 2,28 (s, 3H), 1,72-1,87 (m, 4H), 1,57-1,66 (m, 4H), 1,45-1,51 (m, 2H), 1,27-1,38 (m, 20H), 0,86-0,90 (m, 6H) ppm, ¹³C-NMR (METHANOL-d4, 126 MHz): δ = 164,6, 155,9, 153,1, 142,9, 111,5, 111,1,73,5, 66,4, 51,1,41,2, 38,9, 31,5, 28,9, 28,5, 28,2, 26,0, 23,8, 22,4, 22,3, 22,2, 19,1, 17,3, 13,0 ppm LC-MS: Rt = 7,90 min; 84,24%; m/z [M]⁺ = 528,63; UV-VIS: λmax = 257 nm; 362 nm

Przykład 10. 8-[(5-azydopentylo)karbamoilo]-5,7-dimetylo-2,2-dietylo-2 H ,3 H-[1,2,4]triazolo[4,3-a]-piridyn-2-iowy (P10)

1H-NMR (CHLOROFORM-d, 500 MHz): δ = 7,85 (t, J = 5,7 Hz, 1H), 6,42 (s, 2H), 6,05 (s, 1H), 4,04 (dq, J = 13,3, 6,8 Hz, 2H), 3,71-3,83 (m, 2H), 3,34-3,43 (m, 2H), 3,23-3,33 (m, 2H), 2,60 (s, 3H), 2,56 (s, 3H), 1,55-1,71 (m, 4H), 1,38-1,54 (m, 8H) ppm, ¹³C-NMR (CHLOROFORM-d, 126 MHz):

δ = 163,3,158,7,156,7,143,3,114,1, 109,0, 100,0, 73,5, 62,8, 51,4, 51,1, 39,9, 39,4, 29,0, 28,6, 28,3,

26,9, 24,3, 23,8, 22,7, 20,2, 8,9 ppm, LC-MS: Rt = 3,61 min; 100%; m/z [M]⁺ = 360,34; UV-VIS: Xmax = 256 nm; 355 nm

Przykład 11. 8-[(7-azydoheptylo)karbamoilo]-5,7-dimetylo-2,2-dietylo-2H,3H-[1,2,4]triazolo[4,3-a][4,3-a]-triazolo[4,3-o]piridyn-2-iowy (P11)

Pochodną otrzymano wg procedury opisanej w przykładach 1 oraz 5 i oczyszczono według procedury opisanej w przykładzie 4 ¹H- NMR (CHLOROFORM-d, 500 MHz): δ = 7,81 (t, J = 5,4 Hz, 1H), 6,51 (s, 2H), 5,98 (s, 1H), 3,98 (m, 2H), 3,74 (m, 2H), 3,27-3,34 (m, 2H), 3,18-3,22 (m, 2H), 2,56 (s, 3H), 2,50 (s, 3H), 1,50-1,54 (m, 4H), 1,42 (t, J = 7,2 Hz, 6H), 1,30-1,33 (m, 6H) ppm, ¹³C-NMR (CHLOROFORM-d, 126 MHz): δ = 163.3, 158.3, 156.7, 143.3, 113.9, 109.1,73.7, 62.4, 53.6, 51.4, 39.5, 29.3, 28.8, 28.7, 26.9, 26.7, 26.7, 22.6, 20.0, 8.9 ppm, LC-MS: Rt = 4,42 min; 100%; m/z [M]⁺ = 388,38; UV-VIS: Xmax - 255 nm; 354 nm

Przykład 12. bromek 2,2-dietylo-4-[(prop-2-yn-1-ylo)karbamoilo]-1 H,2H-[1,2,4]triazolo[4,3-a]chinolin-2-iowy (P12)

Pochodną otrzymano wg procedury opisanej w przykładzie 2 i oczyszczono według procedury opisanej w przykładzie 4 ¹H- NMR (METHANOL-d4, 300 MHz): δ = 8,76 (s, 1H), 7,91-7,97 (m, 1H), 7,78-7,87 (m, 1H), 7,357,47 (m, 2H), 6,09 (s, 2H), 4,24 (d, J = 2,9 Hz, 2H), 3,87-4,00 (m, 4H), 3,06-3,11 (m, 1H), 1,48 (t, J = 7,0 Hz, 6H) ppm, ¹³C-NMR (DMSO-ds, 75 MHz): δ = 173,2, 160,9, 154,1, 145,0, 135,3, 134,5, 131,5, 124,3, 120,6, 115,2, 114,9, 81,0, 74,0, 73,1,61,1,29,5, 25,7, 8,4 ppm, LC-MS: Rt = 2,85 min; 99,45%; m/z [M]⁺ = 309

Przykład 13. bromek 2,2-dioktylo-4-[(prop-2-yn-1-ylo)karbamoilo]- 1H,2H-[1,2,4]triazolo[4,3-a]chinolin-2-iowy (P13)

Pochodną otrzymano wg procedury opisanej w przykładzie 2 i oczyszczono według procedury opisanej w przykładzie 4 ¹H NMR (CHLOROFORM-d, 300 MHz): δ = 8,79 (s, 1H), 8,21 (t, J = 3 Hz, 1H), 7,72-7,81 (m, 2H), 7,53 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,39 (t, J = 7,6 Hz, 1H), 6,56 (s, 2H), 4,27-4,36 (m, 2H), 4,25 (dd, J = 5,3, 2,3 Hz, 2H), 3,73-3,86 (m, 2H), 2,26-2,31 (m, 1H), 1,71-1,86 (m, 4H), 1,19-1,45 (m, 20H), 0,75-0,93 (m, 6H) ppm, LC-MS: Rt = 7,40 min; 94,06%; m/z [M]⁺ = 477

Przykład 14. bromek 2,2-dietylo-5,7-dimetylo-8-{[(1-tetradecylo-1 H-1,2,3-triazol-4-ilo)metylo]karbamoilo}-2 H ,3 H-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pirydyn-2-iowy

Pochodną otrzymano wg procedury opisanej w przykładzie 3 i oczyszczono według procedury opisanej w przykładzie 4 ¹H- NMR (CHLOROFORM-d, 300 MHz): δ = 8,77 (br. s, 1H), 7,60 (s, 1H), 6,59 (s, 2H), 6,01 (s, 1H), 4,64 (d, J = 5,3 Hz, 2H), 4,32 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 3,98-4,12 (m, 1H), 3,75-3,87 (m, J = 12,3, 7,0 Hz, 2H), 2,61 (br. s, 3H), 2,59 (s, 3H), 1,84-1,93 (m, 2H), 1,45 (t, J = 6,7 Hz, 6H), 1,22-1,32 (m, 24H), 0,84-0,90 (m, 3H) ppm, ¹³C-NMR (CHLOROFORM-d, 75 MHz): δ = 163,3, 159,4, 156,5, 143,7, 122,2, 114,0, 108,0, 73,6, 62,5, 50,6, 35,0, 31,9, 30,2, 29,6, 29,6, 29,5, 29,4, 29,3, 29,0, 26,5, 22,9, 22,7, 20,0, 14,1, 8,8 ppm, LC-MS: Rt = 7,40 min; 94,06%; m/z [M]⁺ = 477

Przykład 15. Wykorzystanie azydoalkiloamidowych pochodnych Safirinium w reakcji cykloaddycji azydków i alkinów

Do 0,79 mmol (48 mg) bromku 8-[(5-azydopentylo)karbamoilo]-5,7-dimetylo-2,2-dioktylo-2 H ,3 H-[1,2,4]triazolo[4,3-a]-piridyn-2-iowego dodano 1,5 eq. fenyloacetylenu (1,18 mmol, 33 mg, 36 μL) i 2 mL chlorku metylenu. Następnie dodano 0,05 M wodnego roztworu CuSO4 (1,58 mL, 10 mol% Cu), AMTC (20 mol%, 35 mg) oraz askorbinianu sodu (10 mol%, 16 mg), rozpuszczonego w 2,5 mL wody tak, aby całkowita ilość wody wynosiła 4 mL, a stosunek objętościowy DCM:woda 1:2. Reakcję prowadzono w temperaturze pokojowej przez noc. Po zakończeniu reakcji, mieszaninę reakcyjną odparowano pod obniżonym ciśnieniem i oczyszczano chromatograficznie według procedury opisanej w Przykładzie 4.

Otrzymany produkt poddano analizie NMR i LC-MS.

¹H- NMR (CHLOROFORM-d, 500 MHz): δ = 7,78 (br. s, 1H), 7,73 (m, 3H), 7,36 (t, J = 7,4 Hz, 2H), 7,26-7,30 (m, 1H), 6,43 (br. s, 2H), 5,86 (s, 1H), 4,38 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 3,81 (dt, J = 13,3, 6,8 Hz, 2H), 3,64 (br. s, 2H), 3,35 (q, J = 5,9 Hz, 2H), 2,50 (br. s, 3H), 2,46 (s, 3H), 1,90-2,00 (m, 2H), 1,66-1,82 (m, 4H), 1,61 (quin, J = 7,0 Hz, 2H), 1,19-1,40 (m, 22H), 0,81 ppm (t, J = 6,9 Hz, 6H), ¹³C-NMR (CHLOROFORM-d, 126 MHz): δ = 163,4, 158,1, 156,4, 143,1, 130,6, 129,0, 128,2, 125,6, 113,8, 109,0, 74,3, 67,3, 50,1,42,1,38,8, 31,7, 29,5, 29,3, 29,2, 28,5, 26,3, 23,6, 23,4, 23,2, 22,7, 22,5, 20,2, 14,1 ppm, LC-MS: Rt = 7,68 min; 82,88%; m/z [M]⁺ = 630,66; UV-VIS: Xmax = 250 nm; 361 nm

Literatura:

[1] H.C. Kolb, M.G. Finn, K.B. Sharpless, Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions, Angew. Chemie Int. Ed. 40 (2001) 2004-2021. doi:10.1002/1521-3773(20010601)40:11<2004::AID-ANIE2004>3.3.CO;2-X.

[2] G.C. Tron, T. Pirali, R.A. Billington, P.L. Canonico, G. Sorba, A.A. Genazzani, Click Chemistry Reactions in Medicinal Chemistry: Applications of the 1,3-dipolar Cycloaddition Between Azides and Alkynes, Med. Res. Rev. 28 (2008) 278-308.

[3] H.C. Kolb, K.B. Sharpless, The growing impact of click chemistry on drug discovery, Drug Discov. Today. 8 (2003) 1128-1137. doi:10.1016/S1359-6446(03)02933-7.

[4] J.E. Moses, A.D. Moorhouse, The growing applications of click chemistry., Chem. Soc. Rev. 36 (2007) 1249-62. doi:10.1039/b613014n.

[5] Y.L. Angell, K. Burgess, Peptidomimetics via copper-catalyzed azide-alkyne cycloadditions., Chem. Soc. Rev. 36 (2007) 1674-89. doi:10.1039/b701444a.

[6] P. Thirumurugan, D. Matosiuk, K. Jozwiak, Click chemistry for drug development and diverse chemical-biology applications., Chem. Rev. 113 (2013) 4905-79. doi:10.1021/cr200409f.

[7] M. Koh, J. Park, H. An, S.B. Park, Ratiometric analysis of zidovudine (ZDV) incorporation by reverse transcriptases or polymerases via bio-orthogonal click chemistry., Chem. Commun. 47 (2011) 7614-7616. doi:10.1039/clccl2518d.

[8] Y. Maeda, N. Kishikawa, K. Ohyama, M. Wada, R. Ikeda, N. Kuroda, Fluorescence derivatization method for sensitive chromatographie determination of zidovudine based on the Huisgen reaction., J. Chromatogr. A. 1355 (2014) 206-10. doi:10.1016/j.chroma. 2014.06.017.

[9] P.W. Szafrański, P. Kasza, M. Kępczyński, M.T. Cegła, Fluorescent 1,2,3-triazole derivative of 3'-deoxy-3-azidothymidine: synthesis and absorption/emission spectra, Heterocycl. Commun. 21 (2015) 263-267. doi:10.1515/hc-2015-0195.

[10] Q. Wang, T.R. Chan, R. Hilgraf, V. V. Fokin, K.B. Sharpless, M.G. Finn, Bioconjugation by copper(l)-catalyzed azide-alkyne [3 + 2] cycloaddition, J. Am. Chem. Soc. 125 (2003) 3192-3193. doi:10.1021/ja021381e.

[11] A. Deiters, T.A. Cropp, M. Mukherji, J.W. Chin, J.C. Anderson, P.G. Schultz, Adding Amino Acids with Novel Reactivity to the Genetic Code of Saccharomyces Cerevisiae, J. Am. Chem. Soc. 125 (2003) 11782-11783. doi:10.1021/ja0370037.

[12] D. Baraniak, K. Kacprzak, L. Celewicz, Synthesis of 3'-azido-3'-deoxythymidine (AZT)-Cinchona alkaloid conjugates via click chemistry: Toward novel fluorescent markers and cytostatic agents, Bioorg. Med. Chem. Lett. 21 (2011) 723-726. doi:10.1016/j.bmcl. 2010.11.127.

[13] M.R. Decan, S. Impellizzeri, M.L. Marin, J.C. Scaiano, Copper nanoparticle heterogeneous catalytic 'click' cycloaddition confirmed by single-molecule spectroscopy, Nat. Commun. 5 (2014) 4612. doi:10.1038/ncomms5612.

[14] P. Thirumurugan, D. Matosiuk, K. Jozwiak, Click Chemistry for Drug Development and Diverse Chemical-Biology Applications, Chem. Rev. 113 (2013) 4905-4979.

doi:10.1021/cr200409f.

[15] M.A. Breidenbach, J.E.G. Gallagher, D.S. King, B.P. Smart, P. Wu, C.R. Bertozzi, Targeted metabolic labeling of yeast N-glycans with unnatural sugars, Proc. Natl. Acad. Sci. 107 (2010) 3988-3993. doi:10.1073/pnas.0911247107.

[16] S.A. Ingale, F. Seela, Stepwise click functionalization of DNA through a bifunctional azide with a chelating and a nonchelating azido group, J. Org. Chem. 78 (2013) 3394-3399. doi:10.1021/jo400059b.

[17] www.sigmaaldrich.com, Sigma-Aldrich, Merck, Online Prod. Cat. (2018). http://www.sigma- aldrich.com/chemistry/chemistry-products.html?TablePage=18413131.

[18] A. Horatscheck, S. Wagner, J. Ortwein, B.G. Kim, M. Lisurek, S. Beligny, A. Schutz, J. Rademann, Benzoylphosphonate-Based Photoactive Phosphopeptide Mimetics for Modulation of Protein Tyrosine Phosphatases and Highly Specific Labeling of SH2 Domains, Angew. Chemie Int. Ed. 51 (2012) 9441-9447. doi:10.1002/anie.201201475.

[19] C. Grost, T. Berg, PYRROC: the first functionalized cycloalkyne that facilitates isomer-free generation of organic molecules by SPAAC, Org. Biomol. Chem. 13 (2015) 3866-3870. doi:10.1039/C50B00212E.

[20] J.M. Holstein, F. Muttach, S.H.H. Schiefelbein, A. Rentmeister, Dual 5' Cap Labeling Based on Regioselective RNA Methyltransferases and Bioorthogonal Reactions, Chem. - A Eur. J. 23 (2017) 6165-6173. doi:10.1002/chem.201604816.

[21] t Xiaolin Zhang, *, ^f and Yi Xiao, X. Qiant, Highly Efficient Energy Transfer in the Light Harvesting System Composed of Three Kinds of Boron-Dipyrromethene Derivatives, (2007). doi:10.1021/OL702381J.

[22] Z. Xiaolin, X. Yi, Q. Xuhong, Highly efficient energy transfer in the light harvesting system composed of three kinds of boron-dipyrromethene derivatives, Org. Lett. 10 (2008) 29-32. doi:10.1021/ol702381j.

[23] M. Link, X. Li, J. Kleim, O.S. Wolfbeis, Click Chemistry Based Method for the Preparation of Maleinimide-Type Thiol-Reactive Labels, European J. Org. Chem. 2010 (2010) 692-6927. doi:10.1002/ejoc.201001085.

[24] T. Mashima, K. Oohora, T. Hayashi, Successive energy transfer within multiple photosensitizers assembled in a hexameric hemoprotein scaffold, Phys. Chem. Chem. Phys. 20 (2018) 3200-3209. doi:10.1039/C7CP05257J.

[25] Y. Arai, K. Yokoyama, Y. Kawahara, Q. Feng, I. Ohta, A. Shimoyama, S. Inuki, K. Fukase, K. Kabayama, Y. Fujimoto, Time-lapse monitoring of TLR2 ligand internalization with newly developed fluorescent probes, Org. Biomol. Chem. 16 (2018) 3824-3830.

doi:10.1039/C70B03205F.

[26] N. Vurgun, R.F. Gómez-Biagi, M. Nitz, Access to Versatile e-Cyclodextrin Scaffolds through Guest-Mediated Monoacylation, Chem. - A Eur. J. 22 (2016) 1062-1069. doi:10.1002/chem. 201503131.

[27] N. Stephanopoulos, Z.M. Carrico, M.B. Francis, Nanoscale Integration of Sensitizing Chromophores and Porphyrins with Bacteriophage MS2, Angew. Chemie. 121 (2009) 9662-9666. doi:10.1002/ange.200902727.

[28] D. Kim, D. Ma, M. Kim, Y. Jung, N.H. Kim, C. Lee, S.W. Cho, S. Park, Y. Huh, J. Jung, K.H. Ahn, Fluorescent Labeling of Protein Using Blue-Emitting 8-Amino-BODIPY Derivatives, J. Fluoresc. 27 (2017) 2231-2238. doi:10.1007/sl0895-017-2164-5.

[29] K. Nakazono, T. Oku, T. Takata, Synthesis of rotaxanes consisting of crown ether wheel and sec-ammonium axle under basic condition, Tetrahedron Lett. 48 (2007) 3409-3411.

doi:10.1016/J.TETLET.2007.03.064.

[30] J. Sączewski, K. Hinc, M. Obuchowski, M. Gdaniec, The Tandem Mannich-Electrophilic Amination Reaction: a Versatile Platform for Fluorescent Probing and Labeling, Chem. - A Eur. J. 19 (2013) 11531-11535. doi:10.1002/chem.201302085.

[31] R. Behrendt, P. White, J. Offer, Advances in Fmoc solid-phase peptide synthesis, J. Pept. Sci. 22 (2016) 4-27. doi:10.1002/psc.2836.

[32] J. Fedorowicz, J. Sączewski, Z. Drażba, P. Wiśniewska, M. Gdaniec, B. Wicher, G. Suwiński, A. Jalińska, Synthesis and fluorescence of dihydro-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pyridin-2-ium-carboxylates: An experimental and TD-DFT comparative study, Dye. Pigment. 161 (2019) 347-359. doi:10.1016/J.DYEPIG.2018.09.005.

[33] P. Siemsen, R.C. Livingston, F. Diederich, Acetylenic Coupling: A Powerful Tool in Molecular Construction, Angew. Chemie Int. Ed. 39 (2000) 2632-2657. doi :10.1002/1521-

3773(20000804)39:15<2632 ::AID-AN I E2632>3.0.CO;2-F.

[34] M. Beller, J. Seayad, A. Tillack, H. Jiao, Catalytic Markovnikov and anti-Markovnikov Functionalization of Alkenes and Alkynes: Recent Developments and Trends, Angew. Chemie Int. Ed. 43 (2004) 3368-3398. doi:10.1002/anie.200300616.

[35] S. Brase, C. Gil, K. Knepper, V. Zimmermann, Organic azides: an exploding diversity of a unique class of compounds., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 44 (2005) 5188-240.

Claims

1. Związek o wzorze (S1):

gdzie:

W1 W2

R², R³ - oznacza podstawnik alkilowy o ilości węgli od 2 do 8,

R⁴, R⁵, R⁶ - oznacza podstawnik metylowy albo atom wodoru, albo

R⁴ oznacza podstawnik metylowy albo atom wodoru natomiast podstawniki R⁵ i R⁶ są połączone i tworzą układ aromatyczny o wzorze ogólnym S2, gdzie podstawniki R⁷ - R¹⁰ oznaczają atom wodoru:

przy czym anion A^- stanowi jon wybrany z grupy zawierającej: F^-, Ch, Br, h.

2. Związek według zastrz. 1 o wzorze (S1):

gdzie:

'^ν-'ν^θ

W1

W2

PL 243397 BI

R², R³ - oznaczają podstawnik alkilowy o ilości atomów węgla od 2 do 8,

R⁴, R⁵, R⁶ - oznacza podstawnik metylowy albo atom wodoru, przy czym anion A^- stanowi jon bromkowy Br

3. Związek według zastrz. 2 wybrany z grupy zwierającej pochodne o wzorach P6-P11:

- Bromek 2,2-dietylo-5,7-dimetylo-8-[(prop-2-yn-1-ylo)karbamoilo]-2/-/,3/-/-[1,2,4]triazolo[4,3-a]pirydyn-2-iowy (P6),

- Bromek 5,7-dimetylo-2,2-dioktylo-8-[(prop-2-yn-1-ylo)karbamoilo]-2/-/,3/-/-[1,2,4]triazolo[4,3-a]triazolo[4,3-a]pirydyn-2-iowy (P7),

- Bromek 2,2-dietylo-5,7-dimetylo-8-[(prop-2-yn-1-yloksy)karbonylo]-2/-/,3/-/-[1,2,4]triazo I o-[4,3-a]-p i rydy η-2-iowy (P8),

- Bromek 8-[(5-azydopentylo)karbamoilo]-5,7-dimetylo-2,2-dioktylo-2/-/,3/-/-[1,2,4]triazolo[4,3-a]triazolo[4,3-o]piridyn-2-iowy (P9),

- Bromek 8-[(5-azydopentylo)karbamoilo]-5,7-dimetylo-2,2-dietylo-2/-/,3/-/-[1,2,4]triazolo[4,3-a][4,3-o]piridyn-2-iowy (P10),

P11 C₈H₁₇

4. Związek według zastrz. 1 o wzorze (S2):

gdzie:

PL 243397 Β1

W1

W2

R², R³ oznacza podstawnik alkilowy o ilości węgli od 2 do 8,

R⁴ - oznacza podstawnik wybrany z grupy zawierającej: metylen albo atom wodoru R⁷, R⁸, R⁹, R¹⁰-oznacza atom wodoru, przy czym anion A^- stanowi jon wybrany z grupy zawierającej: F^- Cl, Br, h

5. Związek według zastrz. 4 o wzorze (S2):

gdzie:

W1

W2

R², R³ oznacza podstawnik alkilowy o ilości węgli od 2 do 8,

R⁴ - oznacza podstawnik wybrany z grupy zawierającej: metylen albo atom wodoru, R⁷, R⁸, R⁹, R¹⁰-oznacza atom wodoru, przy czym anion A- stanowi jon Br.

6. Związek według zastrz. 4 lub 5 wybrany z grupy zwierającej pochodne o wzorach P12-P13:

- Bromek 2,2-dietylo-4-[(prop-2-yn-1-ylo)karbamoilo]-7/-/,2/-/-[1,2,4]triazolo[4,3-a]chinolin-2-iowy (P12),

- Bromek 2,2-dioktylo-4-[(prop-2-yn-1-ylo)karbamoilo]-7/-/,2/-/-[1,2,4]triazolo[4,3-a]]chinolin-2-

-iowy (P13), przedstawione poniżej:

P12 Et

7. Zastosowanie związku określonego w zastrz. 1-6 do znakowania cząsteczek chemicznych w reakcji cykloaddycji azydków i alkinów.