PL241266B1 - Zastosowanie mikrocząstek na bazie polilaktydu, poliglikolidu lub ich kopolimerów - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są mikrocząstki na bazie polilaktydu, poliglikolidu lub ich kopolimerów do zastosowania jako nośnik leków.

Podawanie leków bezpośrednio do komórek jest intensywnie badane od wielu lat. Opracowanie leku, który można podać do określonego miejsca w organizmie i w skutecznej dawce, jest od dawna celem szerokich badań w licznych ośrodkach naukowych jak i laboratoriach farmaceutycznych. Z uwagi na liczne, negatywne efekty uboczne leków stosowanych w chemioterapii nowotworów, właśnie ta grupa leków była najszerzej badana pod względe m lokalnej, sterowanej terapii [Beck i wsp., 1993].

Leki oprócz pożądanych właściwości terapeutycznych, muszą spełniać określone warunki fizyko-chemiczne, które umożliwią im dotarcie do określonego miejsca w organizmie, spełnienie swojej roli i bezpiecznie wydalenie w formie metabolitów.

Badania Decuzzi i Ferrariego [Decuzzi i wsp., 2006] wykazały, że pożądanym kształtem nośnika leku jest kształt kulisty, co z jednej strony pozwala na stosunkowo łatwe i silne przyleganie do ściany śródbłonka, a z drugiej pozwala na stosunkowo prostą endocytozę i internalizację do wnętrza komórki śródbłonka (zazwyczaj do makrofagów i lizosomów) w zależności od wielkości mikrosfer [Ding i wsp., 2006].

Znane jest ze zgłoszenia wynalazku nr PL394897 zastosowanie mikrosfer z polilaktydu zawierających co najmniej jedną substancję aktywną, przy czym opisane tam mikrosfery podaje się bezpośrednio do śródbłonka ssaków, zwłaszcza naczyń krwionośnych lub jam ciała wysłanych śródbłonkiem.

Znany jest także z wynalazku CN105963773 sposób otrzymywania kompozytowych mikrosfer kopolimeru kwasu mlekowego kwasu glikolowego-hydroksyloapatytu. Sposób wytwarzania obejmuje następujące etapy, w których (1) flokulant hydroksyloapatytu wytwarza się metodą strącania; (2) mikrosfery hydroksyloapatytu wytwarza się przez spiekanie w wysokiej temperaturze; (3) mieszany roztwór hydroksyloapatytu, kwasu mlekowego, kwasu glikolowego i katalizatora lipazy poddaje się obróbce odgazowującej przez odmrażanie.

Nieoczekiwanie w stosunku do opisanego stanu wiedzy okazało się, że bardzo korzystne jest zastosowanie mikrocząstek o kształcie elipsoidalnym, a nie kulistym wykonanych z polilaktydu, poliglikolidu lub ich kopolimerów zawierających co najmniej jedną substancję biologicznie czynną.

Istotą wynalazku są mikrocząstki z polilaktydu, poliglikolidu lub ich kopolimerów, zawierające co najmniej jedną substancję aktywną o charakterze lipofilnym, o kształcie elipsoidalnym, gdzie stosunek ich długości do szerokości wynosi korzystnie około 2:1, do zastosowania jako nośnik leków.

Korzystnie gdy ich średnia długość wynosi 3,63 μm, zaś średnia szerokość 1,99 μm a średni stosunek osi wielkiej do małej wynosi 1,86.

Mikrocząstki jako substancje aktywne zawierają substancje dobrze rozpuszczalne w dichlorometanie, a słabo rozpuszczalne w wodzie, w szczególności statyny (inhibitory reduktazy 3-hydroksy-3-metyloglutarylo-koenzymu A (HMG-CoA): simwastatynę, lowastatynę, prawastatynę, fluwastatynę, pitavastatynę oraz atorwastatynę, cilostazol, 17e-estradiol, inhibitory białek transportujących estry cholesterolu (cholesterol ester transfer protein (CETP) inhibitors), inhibitory metaloproteinaz, które są inkorporowane do mikrocząstek.

Mikrocząstki o elipsoidalnym kształcie łatwiej ulegają kontaktowi ze ścianą naczynia po podaniu dotętniczym lub dożylnym (wykonują bardziej skomplikowane ruchy w świetle naczynia i tym samym łatwiej ulegają zderzeniu ze śródbłonkiem naczynia) i fagocytozie (wchłonięciu przez komórki) znacznie łatwiej niż klasyczne mikrocząstki o kształcie kulistym (mikrosfery i mikrokapsuły).

Mikrocząstki o kształcie elipsoidalnym są bardziej skuteczne w przenoszeniu substancji/leków bezpośrednio do ściany naczynia krwionośnego w porównaniu z mikrocząstkami kulistymi.

Dzięki ich kształtowi (na skutek mikrozawirowań prądu krwi w tych miejscach) mikrocząstki osadzają się preferencyjnie w miejscach, gdzie występują uszkodzenia śródbłonka i/lub stany zapalne. Pozostają tam około kilku tygodni i ulegają biodegradacji (kolejne kilka tygodni) połączonej z uwalnianiem przenoszonego leku (Fig. 1, 2, 3). Na Fig. 1 zamieszczono schemat, który obrazuje naczynie krwionośne (tętnica) oraz różnice w zachowaniu się elementów morfotycznych krwi/mikrosfer kulistych oraz mikrosfer elipsoidalnych.

Na Fig. 2 przedstawiono aortę szczura oraz mikrosfery zawierające simwastatynę SVPLA znakowane dodatkowo dansylohydrazyną, „zanurzone” w ścianie aorty. Fig. 3 pokazuje fragment mięśnia dźwigacza jądra myszy - mikrokrążenie, badanie in vivo (BalbC/a) oraz SWPLA znakowane mikrosfery, zlokalizowane w miejscach mikrouszkodzeń tętniczki.

PL 241 266 B1

Otrzymywanie mikrocząstek według wynalazku o kształcie elipsoidalnym z polilaktydu, poliglikolidu lub ich kopolimerów.

Mikrocząstki z polilaktydu, poliglikolidu lub ich kopolimerów o kształcie elipsoidalnym według wynalazku otrzymuje się dwuetapowo.

Otrzymywanie mikrosfer metodą odparowania rozpuszczalnika z emulsji. Polimer lub kopolimer i co najmniej jedną z wyżej wymienionych substancji biologicznie czynnych rozpuszcza się w dichlorometanie (CH2CI2) i wkrapla do 1% wodnego roztworu polialkoholu winylowego przy silnym mieszaniu za pomocą homogenizatora. Następnie emulsję podgrzewa się do 30-35°C i utrzymuje się ją w tej temperaturze przez 36-48 h w otwartym naczyniu umożliwiając odparowanie dichlorometanu. Wytworzone mikrosfery trzykrotnie odwirowuje się i przemywa wodą destylowaną. Metoda ma zastosowanie do otrzymywania mikrosfer z substancjami, które są dobrze rozpuszczalne w dichlorometanie, a słabo rozpuszczalne w wodzie takie jak simwastatyna, lowastatyna, fluwastatyna czy atorwastatyna.

Sporządza się ok. 10% roztwór poli(alkoholu winylowego), następnie dodaje się mikrosfery wytworzone sposobem opisanym wyżej. Mieszaninę wylewa się na płaską powierzchnię i pozostawia do wyschnięcia. Wytworzony film (matrycę) poddaje się rozciąganiu w określonej temperaturze, w określonym czasie i z określoną siłą, następnie matrycę rozpuszcza się w wodzie. Uzyskane cząstki trzykrotnie odwirowuje się i przemywa wodą destylowaną.

Na Fig. 4 (in vitro) przedstawiono uwalnianie simwastatyny z mikrosfer. Na Fig. 5 pokazano mikrocząstki elipsoidalne o średniej długości 3,63 μm, średniej szerokości 1,99 μm i średnim stosunku osi wielkiej do małej równym 1,86.

Poniżej przedstawiono przykłady wykonania wynalazku.

P r z y k ł a d I. Sposób przygotowania i charakterystyka mikrocząstek elipsoidalnych o średnim stosunku osi wielkiej do małej równym 1,86 z kopolimeru poli(D,L-laktydu) i glikolidu o ciężarze cząsteczkowym 38 000-54 000 (nazwa handlowa RESOMER RG 504) zawierających simwastatynę.

Mikrosfery otrzymano metodą odparowania rozpuszczalnika z emulsji. RESOMER RG 504 i simwastatynę (10% wagowych w stosunku do polimeru) rozpuszczono w dichlorometanie (CH2CI2) i wkroplono do 1% wodnego roztworu polialkoholu winylowego przy silnym mieszaniu za pomocą homogenizatora. Uzyskana w ten sposób wodna emulsja roztworu polimeru i simwastatyny w dichlorometanie była mieszana mieszadłem wolnoobrotowym przez 48 godzin w temp. 35°C. Wytworzone mikrosfery trzykrotnie odwirowano i przemyto wodą destylowaną.

Do przygotowanej 10 cm³ zawiesiny zawierającej 0,2-0,4 g mikrosfer wytworzonych sposobem opisanym wyżej dodano 1,0 g poli(alkoholu winylowego). Po rozpuszczeniu mieszaninę wylano na płaską powierzchnię i pozostawiono do wyschnięcia. Wytworzony film o grubości 0,16-0,20 mm pocięto na paski o szerokości 1 cm i długości 3,5 cm i każdy pasek poddano rozciąganiu w temperaturze 110°C w czasie 120 min ciężarem o masie 206 g. Następnie matrycę rozpuszczono w wodzie. Uzyskane cząstki o kształcie elipsoidalnym 3-krotnie odwirowano i przemyto wodą destylowaną.

Zawartość leku wyznaczona metodą UV-VIS wynosiła 7,5% wag. w stosunku do suchych mikrocząstek. Wielkość i kształt cząstek wyznaczono z obrazów uzyskanych za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego Jeol-5500LV, mierząc wielkość ponad 900 cząstek.

Na Fig. 5 przedstawiono przykładowe zdjęcie mikrocząstek o średniej długości 3,63 μm i szerokości 1,99 μm oraz średnim stosunku osi wielkiej do małej 1,86 μm. Przed podaniem do naczynia, zawiesinę mikrosfer przepuszczano przez filtr membranowy 5 μm (Milipore, Nylon Net Filter, Merck, USA) w celu separacji zbyt dużych mikrosfer.

P r z y k ł a d II. Sposób przygotowania i charakterystyka mikrocząstek elipsoidalnych o średnim stosunku osi wielkiej do małej równym 5,28 z kopolimeru poli(D,L-laktydu) i glikolidu (nazwa handlowa RESOMER® RG 504) zawierających simwastatynę.

Mikrocząstki o kształcie przedstawionym jak na Fig. 5 otrzymano za pomocą analogicznej procedury jak w przykładzie I, stosując rozciąganie w temperaturze 110°C w czasie 120 min ciężarem o masie 635 g.

Badania (na modelu zwierzęcym, szczur, aorta) mikrocząstek elipsoidalnych nieoczekiwanie wykazały, że są one bardziej skuteczne w przenoszeniu substancji bezpośrednio do ściany naczynia w porównaniu do cząstek kulistych, co wykazano w badaniach porównawczych w modelu zwierzęcym (Fig. 6, Fig. 7). Przed podaniem do naczynia, zawiesinę mikrosfer przepuszczano przez filtr membranowy 5 μm (Milipore, Nylon Net Filter, Merck, USA) w celu separacji zbyt dużych mikrosfer.

W trakcie przeprowadzonych badań wykazano, że mikrosfery umożliwiły depozycję (koncentrację) w ścianie naczynia (w miejscach uszkodzeń śródbłonka ściany naczynia) substancji/leku rzędu

PL 241 266 B1 kilkudziesięciu razy większym od maksymalnego, chwilowego stężenia w osoczu krwi - po podaniu dotętniczym czy dożylnym.

Fig. 6 przedstawia ocenę depozycji elipsy/sfery, ich koncentrację w ścianie naczynia (aorta szczura), zaś Fig. 7 - ocenę depozycji elipsy/sfery wyrażoną jako średnia z danych grup, gdzie elipsy wypadły znacznie korzystniej niż sfery.

Fig. 8 przedstawia obecność makrofag w ścianie naczynia (aorta szczura) w ciągu 24 h, Fig. 9 przedstawia obecność makrofag w ścianie naczynia (aorta szczura) w ciągu 30 dni.

Po jednorazowym podaniu dotętniczym (ia) lub dożylnym (iv) mikrocząstki elipsoidalne pozwalają na znacznie bardziej skuteczne podawanie substancji/leku bezpośrednio do ściany naczynia w porównaniu do mikrosfer (2,84 ± 0,46 / p<0,01), a wielokrotnie (do kilkuset razy) większych koncentracji substancji/leku w porównaniu do maksymalnych osiąganych przy klasycznym podaniu iv/ia lub per os * (leki podawane per os czy parenteralnie praktycznie nie ulegają, mierzalnie istotnej koncentracji w ścianie naczynia krwionośnego).

Podawanie leków takich jak statyny, za pomocą mikrocząstek według wynalazku pozwala na osiągnięcie dużej koncentracji statyn w ścianie naczynia. Obserwowano bardzo korzystny efekt plejotropowy (tzn. przeciwzapalny, stabilizujący blaszki miażdżycowe) tych leków, praktycznie nieosiągalny (z uwagi na potrzebę stosowania bardzo wysokich dawek leków i związanych z tym efektów ubocznych) w trakcie standardowej terapii per os, a wykazany w wielu badaniach na zwierzętach [Blum A, Shamburek R.].

Mikrocząstki elipsoidalne, zbudowane z polilaktydu, poliglikolu lub ich kopolimerów pozwalają na wielotygodniową, lokalną terapię po jednorazowym podaniu ia czy iv. W wyniku biodegradacji, uwalniają stopniowo substancję leczniczą, dokładnie w miejscu gdzie jest ona potrzebna.

Badania na szczurach

Wyjaśnienie skrótów:

S-SMPLA; mikrosfery zawierające simwastatynę

E-SMPLA; elipsoidalne mikrosfery zawierające simwastatynę

MPLA; same, czyste mikrosfery (z polilaktydu)

SW: simwastatyna

Test z dużym stężeniem zawiesiny z mikrosfer E-SMPLA (1400 μg/szczura)

Koncentracja SW w ścianie naczynia po podaniu zawiesiny E-SMPLA/S-SMPLA do aorty szczura - Ocena ilościowa depozycji simwastatyny w ścianie naczynia po podaniu mikrosfer elipsoidalnych z simwastatyną (2 grupy; 6 szczurów z mikrosferami elipsoidalnymi/po 6 próbek ściany naczynia od każdego szczura=36 próbek/+ 6 szczurów z mikrosferami sferycznymi/po 6 próbek ściany naczynia od każdego szczura=36 próbek)

Użyto zawiesiny mikrocząstek elipsoidalnych w PBS o stężeniu 20 mg/ml, (po przeliczeniu 1400 μg/ml simwastatyny).

Ten roztwór wyjściowy oznaczono jako 100%

Analogicznie po rozcieńczeniu, roztwór 50% zawierał 700 μg simwastatyny/ml;

roztwór 25% zawierał 350 μg simwastatyny/ml.

Podawano zawsze tę samą dawkę simwastatyny, czyli 1400 μg/szczura;

ml r-ru 100% ml r-ru 50% ml r-ru 25%

Przygotowane roztwory zawiesin mikrosfer z polilaktydu zawierające simwastatynę (SMPLA) o stężeniach simwastatyny. 0,07 mg w suchej masie mikrosfer 100%, 50%, 25% podawano donaczyniowo (aorta brzuszna). Przed podaniem do naczynia, zawiesinę mikrosfer przepuszczano przez filtr membranowy 5 μm (Milipore, Nylon Net Filter, Merck, USA) w celu separacji zbyt dużych mikrosfer.

I grupa mikrocząstki kuliste S-SMPLA; 1 grupa po 6 szczurów

II grupa mikrocząstki elipsoidalne E-SMPLA; 1 grupa po 6 szczurów (Pobierano po 6 próbek aorty brzusznej od każdego szczura)

Przeprowadzono badania w modelu zwierzęcym szczurów, gdzie badane zwierzęta podzielono na dwie grupy badawczą (gdzie badano mikrocząstki elipsoidalne) i kontrolną (gdzie badano mikrocząstki kuliste) po sześć sztuk zwierząt w każdej grupie. Doświadczenia w grupie badawczej przeprowadzono z mikrosferami elipsoidalnymi z poli(L.L-laktydu) o średniej wielkości 3,63x1,99 μm (które pokazano na Fig. 5), zaś w grupie kontrolnej z mikrosferami kulistymi o średniej wielkości 4,6 μm.

PL 241 266 B1

Przed podaniem do naczynia, zawiesinę mikrosfer przepuszczano przez filtr membranowy 5 μm (Milipore, Nylon Net Filter, Merck, USA) w celu separacji zbyt dużych mikrosfer.

Aby podać odpowiednie stężenia uprzednio przygotowanych roztworów, należało w znieczuleniu pentanobarbitalem (30 mg na kg) podawanym dootrzewnowo, naciąć uprzednio zdezynfekowaną i ogoloną skórę zwierzęcia w okolicy pachwiny. Po odsłonięciu dystalnej części aorty, podwiązywano ją na 30 sekund, w tym czasie wprowadzano odpowiednie stężenie zawiesiny mikrocząstek do naczynia. Następnie przepłukiwano naczynie roztworem 1 ml soli fizjologicznej. Po 30 minutach od depozycji zawiesiny i przepłukania naczynia solą fizjologiczną, zwiększano dawkę pentanobarbitalu (55 mg/kg m.c [Górska, 2000]. Następnie wycinano odpowiednie fragmenty naczynia (aorta). Pobrane wycinki zawieszano w buforze (0,9% NaCI) i zamrażano. Z każdego fragmentu naczynia wykonano po 6 skrawków, które poddawano analizie.

W kolejnym etapie wykorzystując metodę spektrofotometrii UV badano depozycję mikrosfer SVPLA w ścianie naczynia po wyżej opisanym podaniu zawiesiny mikrosfer. W badaniu wykorzystano technikę opisaną w publikacji Wanga, z wykorzystaniem specjalnie zaadoptowanej dla simwastatyny (SV) spektrofotometrycznej oceny drugiej pochodnej UV o porównywalnej dokładności z HPLC [Wang i wsp., 2000]. Po pobraniu fragmentów ścian aorty, materiał biologiczny poddano homogenizacji i następnie rozpuszczono w 100 ml acetonitrylu i 0,025M buforze fosforanowym, o pH 4 (65:35, v/v) mieszając w mieszadle mechanicznym przez 3 godziny. Pobierano próbki o obj. 5 mL i odwirowywano. Supernatant poddawano analizie na spektrofotometrze (Hitachi 2800, Japan). Wyniki uzyskane przedstawiono na Fig. 6 i 7, w postaci średniej depozycji SW w ścianie naczynia ± SD (odchylenie standardowe) - jako % całkowitej dawki Simw podanej do naczynia (podawano odpowiednio obj. 1 ml zawiesiny 100% mikrosfer SMPLA; 2 ml 50% zawiesiny SMPLA; 4 ml zawiesiny SMPLA do aorty szczura).

Claims (2)

1. Mikrocząstki z polilaktydu, poliglikolidu lub ich kopolimerów, zawierające co najmniej jedną substancję aktywną o charakterze lipofilnym, o kształcie elipsoidalnym gdzie stosunek ich długości do szerokości wynosi korzystnie 2:1, do zastosowania jako nośnik leków.

2. Mikrocząstki do zastosowania według zastrz. 1, znamienne tym, że ich średnia długość wynosi 3,63 μm, zaś średnia szerokość 1,99 μm a średni stosunek osi wielkiej do małej wynosi 1,86.