PL248245B1

PL248245B1 - Koniugaty kwasów hydroksycynamonowych i 9-amino-5,11-dimetylo-5H-indolo[2,3-b]chinoliny, sposób ich otrzymywania, zastosowanie medyczne oraz kompozycja farmaceutyczna

Info

Publication number: PL248245B1
Application number: PL445978A
Authority: PL
Inventors: Olga Michalak; Katarzyna Sidoryk; Marcin Cybulski; Marek Kubiszewski; Joanna TOBIASZ; Joanna Tobiasz; Anna Jaromin; Magdalena Zaremba-Czogalla
Original assignee: Siec Badawcza Lukasiewicz Inst Chemii Przemyslowej Imienia Profesora Ignacego Moscickiego; Univ Wroclawski We Wroclawiu
Priority date: 2023-08-31
Filing date: 2023-08-31
Publication date: 2025-11-12
Also published as: PL445978A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia są nowe amidowe koniugaty kwasu hydroksycynamonowego lub jego pochodnej oraz 9-amino-5,11-dimetylo-5H-indolo[2,3-b]chinoliny, inaczej nowe pochodne N-(hydroksy)cynamoilo-9-amino-5,11-dimetylo-5H-indolo[2,3-b]chinoliny, przedstawione wzorem I, w którym R-C(O)- oznacza grupę acylową pochodzącą od kwasu hydroksycynamonowego lub jego pochodnej oraz ich farmaceutycznie dopuszczalne sole. Wynalazkiem jest również sposób otrzymywania określonych powyżej nowych związków hybrydowych, a także ich zastosowanie medyczne oraz zawierająca je kompozycja farmaceutyczna. Otrzymane nowe pochodne o strukturze hybrydowej mogą być stosowane jako substancje aktywne w kompozycjach farmaceutycznych przeznaczonych do leczenia nowotworów.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są amidowe koniugaty kwasów hydroksycynamonowych (HCA) oraz 9-amino-5,11-dimetylo-5H-indolo[2,3-b]chinoliny, inaczej pochodne N-(hydroksy)cynamoilo-9-amino-5,11-dimetylo-5H-indolo[2,3-b]chinoliny, sposób ich otrzymywania, zastosowanie medyczne oraz kompozycja farmaceutyczna.

Pochodne N-(hydroksy)cynamoilo-9-amino-5,11-dimetylo-5H-indolo[2,3-b]chinoliny wykazują aktywność przeciwnowotworową i cytostatyczną. Mogą one znaleźć zastosowanie w przemyśle farmaceutycznym jako substancje aktywne w kompozycjach farmaceutycznych do stosowania w terapii przedwnowotworowej, a w szczególności raka trzustki.

Na podstawie analizy danych GLOBOCAN szacuje się, że w latach 2018-2040 liczba pacjentów wymagających rocznie pierwszego rzutu chemioterapii wzrośnie z 9,8 mln do 15,0 mln, co stanowi względny wzrost o 53% (Wilson BE et al. Lancet Oncol. 2019, 20(6), 769). W przypadku nowotworów zdiagnozowanych w Anglii w latach 2013-2016 spośród osób, które otrzymywały co najmniej jeden z głównych rodzajów leczenia, 28% było leczonych chemioterapią (PELE, Official Statistics Chemotherapy, Radiotherapy and Surgical Tumor Resections in England, kwiecień 2020 r.).

Powszechnie stosowaną grupą leków chemioterapeutycznych są nadal cytostatyki wpływające bezpośrednio lub pośrednio na DNA. Te środki terapeutyczne mogą wiązać się z DNA jako substancje alkilujące, interkalatory DNA lub związki ze zdolnością do stabilizowania kompleksu DNA-interkalatortopoizomeraza I/II. Chociaż w ostatnich latach poczyniono ogromne postępy we wczesnej diagnostyce i wprowadzaniu nowych terapii celowanych, wciąż istnieje zapotrzebowanie na nowe cząsteczki, które mają zdolność do pokonywania lekooporności oraz zwiększą skuteczność praktycznie stosowanych schematów terapeutycznych.

W wyniku wieloletnich badań odkryto nową generację cytostatyków, naturalnych alkaloidów, analogów neokryptolepiny z pierścieniem indolo[2,3-b]chinoliny (PL144539B1, Kaczmarek Ł. et al. Pol. J. Pharmacol. Pharm. 1981,33, 121. Peczynska-Czoch W. et al. w Buszel i Graefe Progress in Industrial Microbiology 1989, 27, 333; Kaczmarek Ł. et al., Archiv. Pharm. 1988, 321, 463).

Spośród prostych pochodnych indolo[2,3-b]chinoliny, cząsteczka 5,11-dimetylo-5H-indolo[2,3-b]chinoliny (DiMIQ) wykazuje wysoką aktywność cytotoksyczną wobec linii nowotworowych, w tym ludzkiego raka naskórkowego jamy ustnej KB z IC50 na poziomie lμM. (Kaczmarek Ł. et al. Bioorganic&Medicinal Chemistry 1999, 7(11), 2457; Kaczmarek Ł. et al. Arch Pharm (Weinheim) 1988, 321(8), 463; Jaromin A. et al. Drug Deliv. 2008, 15(1), 49). DiMIQ interkaluje z nicią DNA, a wzrost jego siły zależny jest od wartości pH, czyli występowania DiMIQ w postaci protonowanej (Peczyńska-Czoch W. et al. J. Med. Chem. 1994, 37, 3503). Ze względu na niską rozpuszczalność w środowisku wodnym i wysoką cytotoksyczność DiMIQ wobec normalnych komórek, zsyntetyzowano różne pochodne tego związku do badań struktura-aktywność, w celu znalezienia mniej toksycznej pochodnej zachowującej silne właściwości cytotoksyczne.

W opisie polskiego patentu PL206855 B1 ujawniono syntetyczne pochodne DiMIQ z podstawnikami dialkiloaminoalkilowymi połączonymi wiązaniami amidowymi, aminowymi lub eterowymi z układem aromatycznym. Wykazano ich aktywność cytotoksyczną wobec komórek KB.

Z kolei w polskich opisach patentowych PL202545 B1 i PL206681 B1 oraz publikacji Godlewska J. et al. (Radiol. Onkol. 2004, 38, 137) opisano pochodne cukrowe 5,11-dimetylo-5H-indolo[2,3-b]chinoliny oraz 6,11-dimetylo-6H-indolo[2,3-b]chinoliny. Podstawniki cukrowe, z deoksy-glukozą, deoksy-ramnozą, deoksy-laktozą, podstawniki aminoglikozylowe wprowadzono w pozycje 2 i 9 pierścienia aromatycznego indolo[2,3-b]chinoliny. Pochodne cukrowe charakteryzowały się lepszą rozpuszczalnością w wodzie w porównaniu z niepodstawionymi 5,11-dimetylo-5H-indolo[2,3-b]chinoliną oraz 6,11-dimetylo-6H-indolo[2,3-b]chinoliną, wykazując przy tym umiarkowaną aktywność wobec linii komórkowych KB (od kilku do kilkunastu μM).

Inną znaną grupą związków są koniugaty DiMIQ z aminokwas ami lub peptydarni. Pochodne te wykazywały znacznie lepszą rozpuszczalność w roztworach wodnych przy wyższej lub równej cytotoksyczności in vitro. Ponadto, charakteryzowały się znacznie poprawioną selektywnością względem komórek zdrowych w porównaniu z wyjściową 5,11-dimetylo-5H-indolo[2,3-b]chinoliną (K. Sidoryk i in., J. Med. Chem. 2012, 55 (11), 5077, patent PL 219085). Pochodne DiMIQ z podstawnikiem glicynowym oraz L- i D-prolinowym wykazywały najwyższą cytotoksyczność w stosunku do linii komórkowych KB o wartościach IC50 w zakresie od 0,42 do 0,73 μΜ. Aktywność cytotok syczną pochodnych dipeptydowych była podobna lub niższa od działania na komórki rakowe niepodstawionego DiMIQ (wartości IC50 między 1,54-4,65 μM). W celu zmniejszenia toksyczności DiMIQ i/lub jego pochodnych wobec normalnych (zdrowych) komórek zaprojektowano, otrzymano i zbadano w testach biologicznych inną grupę pochodnych DiMIQ - z podstawnikiem guanylowym. Związki te opisano w zgłoszeniu patentowym WO2015147666A1 oraz publikacji naukowej Sidoryk K. et al. (Eur J Med Chem. 2015,105, 208). Pochodne guanylowe wykazywały wysoką aktywność cytotoksyczną in vitro, a niektóre z nich bardzo wysoką selektywność między komórkami normalnymi, a nowotworowymi liniami komórkowymi A549 i MCF-7.

Kwasy hydroksy cynamonowe (HCA) są najczęściej występującymi kwasami fenolowymi. Występujące w tej grupie kwasy takie jak kawowy, felurowy, synapowy, kumarowy mają zdolność B1 okowania kancerogenów, powstających w wyniku przemian związków rakotwórczych. Hamują powstawanie nitrozoamin. Oprócz działania przeciwnowotworowego (Zaremba-Czogalla M. et al. Materials (Basel). 2020, 13(24), 5813; Rocha LD et al. Cancer and Clinical Oncology 2012, 1(2), 109) związanego z hamowaniem proliferacji komórek (Yamaguchi M. et al. Oncol Rep. 2015, 34(6), 3304), wpływają na poziom wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu (ROS), peroksydację lipidów i przepuszczalność błony mitochondrialnej, co indukuje apoptozę (Espindola KMM et al. Front Oncol. 2019, 9, 541). Wykazują również działanie antyangiogenne i hamują metylację DNA. Kwas kawowy (3,4-dihydroksycynamonowy, przykład związku z grupy HCA) interkaluje z DNA grasicy cielęcej (ct-DNA). Analiza parametrów termodynamicznych sugeruje, że główną rolę w wiązaniu odgrywają wiązania wodorowe i siły van der Waalsa. Dodatkowe badania potwierdzają, że kwas kawowy oddziałuje z mniejszym rowkiem ct-DNA(Sarwar T et al. Int J Biol Macromol. 2017, 98, 319). Badania estrowych pochodnych kwasu kawowego wykazują ich działanie cytotoksyczne wobec komórek raka trzustki AsPC-1 i BxPC-3, przy niskiej toksyczności wobec prawidłowych komórek NHDF (fibroblasty ludzkiej skóry) (Zaremba-Czogalla M. et al. Materials (Basel). 2020, 13(24), 5813). Ponadto niektóre estrowe pochodne HCA w połączeniu z kurkuminą i/lub kwasem karnozowym wykazują synergiczną aktywność przeciwko komórkom białaczkowym AML (Trachtenberg A et al. Front Pharmacol., 2019, 10, 507).

Stosowanie terapii skojarzonej jest obecnie „złotym standardem” w przypadku wielu typów nowotworów. Główną przeszkodą do pokonania w terapii skojarzonej są różnice w farmakokinetyce leków podawanych w określonych schematach czasowych, co w praktyce może prowadzić do suboptymalnych stężeń leków (Szumilak M. et al. Molecules. 2021,26( 9), 2601; Eras A. et al. Front Chem. 2022, 10, 889083).

Leczenie niektórych typów nowotworów wciąż wymaga przezwyciężenia wielu ograniczeń, głownie z uwagi na niezadawalające efekty indeksów przeżywalności. W przypadku raka trzustki (siódme miejsce wśród częstości występowania) wprowadzenie terapii wielolekowej Folfirinox nie przyniosło zadowalających efektów w wydłużeniu czasu przeżycia chorych. Systematyczny wzrost zachorowalności na nowotwory złośliwe oraz wciąż wysoka śmiertelność (Global Burden of Disease 2019 Cancer Collaboration JAMA Oncol. 2022, 8(3), 420) zachęcają do intensywnej pracy w poszukiwaniu nowych, skutecznych terapii i nowatorskich metod diagnostycznych.

Problemy te próbuje się rozwiązać otrzymując różne koniugaty związków przeciwnowotworowych, jednocześnie skierowane w te same lub różne szlaki sygnałowe oraz różne struktury w komórkach nowotworowych. Jest to nowe, obiecujące podejście do projektowania nowych, skutecznych leków przeciwnowotworowych.

Według wynalazku cel ten został osiągnięty przez wprowadzenie grupy hydroksycynamonowej do rdzenia indolo[2,3-b]chinoliny za pomocą wiązania amidowego. Otrzymany koniugat wykazuje działanie quasi-synergistycznie przeciwko liniom komórkowym nowotworów, szczególnie raka trzustki. W otrzymanych nowych związkach oba fragmenty haptoforowe potencjalnie wpływają na właściwości przeciwnowotworowe cząsteczki hybrydowej, poprzez oddzielne działanie przeciwnowotworowe oraz zdolność wiązania z DNA i stabilizacji kompleksów DNA-topoizomeraza.

Przedmiotem wynalazku są amidowe koniugaty kwasów hydroksycynamonowych (HCA) ora z 9-amino-5,11-dimetylo-5H-indolo[2,3-b]chinoliny, inaczej pochodne N-(hydroksy)cynamoilo-9-amino-5,11-dimetylo-5H-indolo[2,3-b]chinoliny. Są to związki o strukturze hybrydowej z różnymi podstawnikami hydroksycynamonowymi bezpośrednio związanymi poprzez atom azotu w pozycji C-9 z 9-amino-5,11-dimetylo-5H-indolo[2,3-b]chinoliną (9-amino-DiMIQ) oraz ich farmaceutycznie dopuszczalne sole addycyjne z kwasami.

Koniugaty według wynalazku przedstawiono na Rysunku wzorem (I), w którym grupa acylowa pochodzi od kwasu hydroksycynamonowego, zwana również grupą hydroksycynamoilową. Wynalazkiem są również oprócz określonych powyżej koniugatów ich farmaceutycznie dopuszczalne sole addycyjne z kwasami.

Wynalazkiem jest zatem związek hybrydowy powstający w wyniku połączenia 9-amino-5,11-dimetylo-5H-indolo[2,3-b]chinoliny, określonej wzorem (II), w pozycji C-9 wiązaniem amidowym z kwasem hydroksycynamonowym (HCA), mający postać koniugatu, oraz jego farmaceutycznie dopuszczalna sól addycyjna z kwasem.

W pochodnych według wynalazku grupa acylowa pochodzi od kwasu hydroksycynamonowego, korzystnie pochodzi od kwasów: orto-kumarowego, meta-kumarowego, para-kumarowego, 2,4-dihydroksycynamonowego, kawowego, 3,4,5-trihydroksycynamonowego.

Wynalazek obejmuje także farmaceutycznie akceptowalne sole związków o wzorze (I). Są to sole addycyjne utworzone z kwasami mineralnymi lub z kwasami organicznymi.

Przykłady odpowiednich kwasów mineralnych stanowią kwas: chlorowodorowy, bromowodorowy, siarkowy, azotowy lub fosforowy. Przykłady odpowiednich kwasów organicznych stanowią kwas: maleinowy, fumarowy, bursztynowy, itakonowy, cytrakonowy, szczawiowy, benzoesowy, p-aminobenzoesowy, askorbinowy, octowy, propionowy, winowy, salicylowy, cytrynowy, glukonowy, mlekowy, migdałowy, cynamonowy, aspartamowy, metanosulfonowy, etanodisulfonowy, benzenosulfonowy, toluenosulfonowy, glikolowy, glutaminowy, stearynowy lub palmitynowy.

Cenne pod względem aktywności terapeutycznej są pochodne o wzorze (I): 9-[((4-hydroksy)cynamoilo)amino]-5,11-dimetylo-5H-indolo[2.3-b]chinolina i jej farmaceutycznie akceptowalne sole, 9-[((2-hydroksy)cynamoilo)amino]-5,11-dimetylo-5H-indolo[2.3-b]chinolina i jej farmaceutycznie akceptowalne sole, 9-[((3-hydroksy)cynamoilo)amino]-5,11-dimetylo-5H-indolo[2.3-b]chinolina i jej farmaceutycznie akceptowalne sole, 9-[((2,4-dihydroksy)cynamoilo)amino]-5,11-dimetylo-5H-indolo[2.3-b]chinolina i jej farmaceutycznie akceptowalne sole, 9-[((3,4-dihydroksy)cynamoilo)amino]-5,11-dimetylo-5H-indolo[2.3-b]chinolina i jej farmaceutycznie akceptowalne sole.

Szczególnie cenne pod względem aktywności terapeutycznej są: dichlorowodorek 9-[((2-hydroksy)cynamoilo)amino]-5,11-dimetylo-5H-indolo[2.3-b] chinoliny, dichlorowodorek 9-[((3-hydroksy)cynamoilo)amino]-5,11-dimetylo-5H-indolo[2.3-b] chinoliny, dichlorowodorek 9-[((4-hydroksy)cynamoilo)amino]-5,11-dimetylo-5H-indolo[2.3-b] chinoliny.

Wynalazkiem jest również sposób otrzymywania określonych powyżej koniugatów przedstawionych wzorem (I), w którym O-zabezpieczony kwas hydroksycynamonowy lub jego halogenek kwasowy poddaje się reakcji sprzęgania (N-acylowanie) z 9-amino-5,11-dimetylo-5H-indolo[2,3-b]chinoliną lub jej solą. Następnie tak otrzymaną pochodną poddaje się oczyszczaniu i odbezpiecza się grupy funkcyjne z fragmentu hydroksycynamoilowego (fragment cząsteczki pochodzący od kwasu hydroksycynamonowego) i ewentualnie otrzymany związek (I) w znany sposób przeprowadza się w farmaceutycznie dopuszczalną sól addycyjną z kwasem.

W reakcji sprzęgania 9-amino-dimetylo-5H-indolo[2,3-b]chinolinę (wzór II) przeprowadza się w Ozabezpieczony amid, czyli koniugat kwasu hydroksycynamonowego oraz 9-amino-5,11-dimetylo-5H-indolo[2,3-b]chinoliny, a następnie tak otrzymany związek poddaje się oczyszczaniu i odbezpiecza grupy zabezpieczające funkcje hydroksylowe znanymi metodami solwolizy, katalitycznej deprotekcji. W rezultacie otrzymuje się koniugat z wolną/wolnymi grupami hydroksylowymi przedstawiony wzorem (I), który ewentualnie przeprowadza się w jego farmaceutycznie dopuszczalną sól addycyjną z kwasem.

Bardziej szczegółowo, wynalazek dotyczy sposobu otrzymywania pochodnych przedstawionych wzorem (I), który polega na tym, że:

(i) kwas hydroksycynamonowy, przedstawiony na Rysunku wzorem (III), zabezpiecza się na grupie hydroksylowej/grupach hydroksylowych w pierścieniu fenylowym fragmentu hydroksycynamoilowego, (ii) tak O-zabezpieczoną pochodną kwasu hydroksycynamonowego otrzymaną w etapie (i) ewentualnie przeprowadza się w halogenek kwasowy, korzystnie chlorek, (iii) następnie 9-amino-5,11-dimetylo-5H-indolo[2,3-b]chinolinę (wzór II) lub jej sól, korzystnie chlorowodorek, poddaje się reakcji sprzęgania z otrzymaną w etapie (i) O-zabezpieczoną pochodną kwasu hydroksycynamonowego lub z otrzymanym w etapie (ii) jej halogenkiem kwasowym, (iv) po czym otrzymany w etapie (iii) O-zabezpieczony amid stanowiący koniugat kwasu hydroksycynamonowego i 9-amino-5,11-dimetylo-5H-indolo[2,3-b]chinoliny, poddaje się oczyszczaniu i odbezpiecza się grupy funkcyjne z fragmentu hydroksycynamoilowego znanymi metodami, (v) i ewentualnie tak otrzymany w etapie (iv) koniugat z wolną/wolnymi grupami hydroksylowymi przedstawiony wzorem (I) w znany sposób przeprowadza się w farmaceutycznie dopuszczalną sól addycyjną z kwasem

Przebieg i warunki sposobu otrzymywania związków o wzorze (I) zilustrowano na Schemacie 1.

Wyjściową pochodną o wzorze (II) wytwarza się przez klasyczną modyfikację metody Graebe-Ullmanna, opisaną w polskim opisie patentowym PL144539B1 oraz Holt S., Petrow V. J. Chem. Soc. 1948, 922. Synteza zaprojektowanych koniugatów wymaga zastosowania jako bloków/elementów budulcowych zabezpieczonych kwasów hydroksycynamonowych (HCA), w których grupy hydroksylowe w acylującej reszcie cynamoilowej są zabezpieczone w znany ze stanu techniki sposób.

Zabezpieczone pochodne kwasów hydroksycynamonowych (HCA) stanowią pochodne O-acetylowe oraz O-allilowe otrzymywane w standardowych warunkach reakcji. O-acylowe pochodne HCA wytwarza się korzystnie w obecności bezwodnika octowego oraz pirydyny. Produkt reakcji wydziela się przez dodanie wody do mieszaniny reakcyjnej, zakwaszeniu, filtracji i ewentualnej krystalizacji produktu. W ten sposób otrzymuje się pochodne O-acetylowe HCA (wydajność do 95%).

Otrzymywanie pochodnych O-allilowych HCA obejmuje trzy etapową procedurę, w której w pierwszym etapie prowadzi się estryfikacje alkoholem alkilowym, korzystnie metanolem i etanolem (Bukowski N. et al. Bioconjug Chem. 2014, 25(12), 2189). Produkt po wydzieleniu poddaje się reakcji allilowania wolnej grupy/wolnych grup hydroksylowych w pochodnej estrowej HCA. Allilowanie prowadzi się korzystnie wobec bromku allilu w acetonie w obecności zasady nieorganicznej lub organicznej (np. K2CO3). Po wydzieleniu ester zabezpieczony poprzez eter/etery allilowe poddaje się hydrolizie - w warunkach zasadowych, korzystnie w układach: wodny roztwór NaOH/metanol, wodny roztwór KOH/etanol, otrzymując pochodne HCA zabezpieczone grupą/grupami allilowymi (wydajność od 75 do 80%).

Metody sprzęgania amin w celu utworzenia wiązań amidowych są dobrze znane w chemii organicznej, zwłaszcza, że wiązania amidowe odgrywają główną rolę w składzie i funkcjach układów biologicznych jako kluczowe wiązanie chemiczne łączące aminokwasy w peptydy i białka. Prace przeglądowe opisują klasyczne (Valeur E. & Bradley M. Chem. Soc. Rev. 2009, 38(2), 606) i nieklasyczne (De Figueiredo et al. Chemical Reviews 2016, 116(19), 12029) podejście do tworzenia wiązań amidowych. Klasyczne metody sprzęgania wykorzystują m.in. karbodiimidy (np. DCC, DIC, EDC), karbodiimidy z dodatkami (HOBt, HOAt), 1H-benzotriazole - w tym uroniowe/aminiowe (HATU, HBTU, HCTU, TBTU, TATU itp.), fosfoniowe (np. BOP, PyBOP) i sole iminiowe (BOMI, BDMP), reagenty generujące halogenki acylowe (np. DAST, DCMT). Halo-uroniowe, halo-fosfoniowe, halo-sulfoniowe, halo-dioksolowe, halo-tiazoliowe, halo-pirydyniowe odczynniki sprzęgające itp. Inne skuteczne odczynniki sprzęgające to m.in. CDI i COMU - popularny w ostatnich latach związek, należący do trzeciej generacji uroniowych odczynników sprzęgających (na bazie 2-cyjano-2-(hydroksyimino)octanu etylu (Oxyma) i grupy morfolinowej). Liczba różnych odczynników do aktywacji grup karboksylowych w celu utworzenia wiązania amidowego przekracza aktualnie sto związków.

Zabezpieczone kwasy HCA lub halogenki kwasowe obejmują szczególnie: kwas (2-alliloksy)cynamonowy, kwas (3-alliloksy)cynamonowy, kwas (4-alliloksy)cynamonowy, kwas (2,4-dialliloksy)cynamonowy, kwas (3,4-dialliloksy)cynamonowy, kwas (2-acetoksy)cynamonowy, kwas (3-acetoksy)cynamonowy, kwas (4-acetoksy)cynamonowy, kwas (2,4-diacetoksy)cynamonowy, kwas (3,4-diacetoksy)cynamonowy, chlorek (3,4-diacetoksy)cynamonowy, chlorek (2-acetoksy)cynamoilu, chlorek (3-acetoksy)cynamoilu, chlorek (4-acetoksy)cynamoilu, chlorek (2,4-diacetoksy)cynamoilu, chlorek (3,4-diacetoksy)cy namoilu. Chlorki HCA otrzymuje się z odpowiednich kwasów przy użyciu odczynnika dobrze znanego specjalistom, wybranego z grupy: chlorek tionylu, chlorek oksalilu itp. Chlorki HCA powstają również in situ w obecności POCl3, jak w protokole opisanym przez Quelever et al. (J. Comb. Chem. 2004, 6(5), 695).

Reakcję sprzęgania w etapie (iii) korzystnie prowadzi się w obecności czynnika sprzęgającego wybranego z grupy: DCC, EDC, TBTU.

Reakcja z pochodnymi HCA zawierającymi allilową grupę zabezpieczającą prowadzi do zabezpieczonych koniugatów z wydajnością 68-75%. Sprzęganie 5,11-dimetylo-5H-indolo[2.3-b]chinolin-9-ylo-aminy z kwasami hydroksycynamonowymi zabezpieczonymi poprzez O-acetyl przebiega z niższą wydajnością. Sprzęganie zabezpieczonych kwasów HCA przeprowadza się zgodnie z jedną z dobrze znanych procedur w N,N-dimetyloformamidzie, N,N-dimetyloacetamidzie lub ich mieszaninach z chloroformem, dichlorometanem, dichloroetanami jako rozpuszczalnikami. Reakcja z chlorkami kwasowymi przebiega w obecności amin organicznych jak trietyloamina, DMAP itp., korzystnie pirydyna. (Shimma et al. Bioorg. Med. Chem. 2000, 8(7), 1697) w rozpuszczalnikach: chloroform, dichlorometan, dichloroetan, N,N -dimetyloformamid, N,N-dimetyloacetamid, węglowodory, węglowodory aromatyczne (toluen, ksylen) i ich mieszaniny.

Reakcję sprzęgania w etapie (iii) również korzystnie prowadzi się stosując halogenek kwasowy, korzystnie chlorek kwasu hydroksycynamonowego, korzystnie w obecności pirydyny.

Zabezpieczone koniugaty wydziela się i/lub oczyszcza znanymi metodami. Wydzielanie może obejmować wytrącanie surowego produktu i suszenie pod zmniejszonym ciśnieniem lub odparowanie mieszaniny reakcyjnej do sucha z uzyskaniem surowego produktu. Wydzielenie czystych produktów może wymagać oczyszczenia metodą chromatografii kolumnowej lub preparatywnej chromatografii płytkowej lub/oraz oczyszczanie produktów innymi metodami znanymi powszechnie specjalistom, np. przez rekrystalizację. Acetylowe grupy zabezpieczające HCA usuwa się zgodnie z jedną ze znanych metod, np. w warunkach zasadowych, poprzez traktowanie węglanem potasu lub amoniakiem. Allilowe grupy zabezpieczające usuwa się jedną z powszechnie uznanych metod (Greene's Protective Groups in Organie Synthesis, wydanie 5. Peter G. M. Wuts. ISBN: 978-1-118-05748-3; Rozdział 3.), m.in. przy użyciu układów tetrakis(trifenylofosfmo)palladu, DMSO-I2, DMSO-Nal. Odbezpieczenie przeprowadza się w DMF, DMA, alkoholach i ich mieszaninach z chloroformem, dichlorometanem, dichloroetanami. Zabezpieczenia typu eterów allilowych usuwa się korzystnie tetrakis(trifenylofosfino)palladem. Odczynnik ten jest stosowany korzystnie w obecności akceptora wolnych rodników (np. trietylosilanu) w standardowo rzadko stosowanej ilości katalizatora, tj. nawet w ilości równomolowej.

Surowe końcowe koniugaty przedstawione wzorem (I) rozdziela się przez zatężenie mieszaniny reakcyjnej, a następnie oczyszcza typową procedurą. Oczyszczanie może obejmować wytrącanie surowego produktu lub odparowanie mieszaniny reakcyjnej do sucha i/lub oczyszczanie surowego produktu metodą chromatografii kolumnowej. Otrzymaną nową pochodną o wzorze (I) można, w razie potrzeby, oczyścić metodą krystalizacji.

Koniugaty o wzorze (I) i ich sole mogą występować w postaci niesolwatowanej lub w postaci solwatów z farmaceutycznie dopuszczalnymi rozpuszczalnikami, takimi jak woda, alkohole i inne. Wynalazek obejmuje wszystkie postaci związków, zarówno solwatowane, jak i wolne od rozpuszczalników.

Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie medyczne amidowych koniugatów kwasów hydroksycynamonowych (HCA) oraz 9-amino-5,11-dimetylo-5H-indolo[2,3-b]chinoliny o wzorze (I) lub ich farmaceutycznie dopuszczalnej soli addycyjnej z kwasem jako substancji aktywnych w kompozycjach farmaceutycznych przeznaczonych do stosowania w leczeniu nowotworów. Okazało się, że związki według wynalazku wykazują właściwości przeciwnowotworowe i mogą stanowić obiecującą grupę potencjalnych terapeutyków do zastosowania w leczeniu chorób nowotworowych u człowieka, zwłaszcza nowotworu trzustki, nowotworów piersi, nowotworów szyjki macicy, chłoniaków, mięsaków i gruczolaków.

Zatem obecny wynalazek dotyczy również kompozycji farmaceutycznej zawierającej substancję czynną oraz farmaceutycznie dopuszczalny i zgodny nośnik i/lub substancje pomocnicze, przy czym substancję czynną stanowi koniugat o wzorze (I) zdefiniowany powyżej lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól addycyjna z kwasem.

Kompozycję farmaceutyczną zawierającą terapeutycznie skuteczną ilość koniugatu o wzorze (I) lub jego farmaceutycznie dopuszczalną sól podaje się choremu wymagającemu leczenia w dogodnej postaci farmaceutycznej jednostki dawkowania, odpowiedniej dla rodzaju środka drogą, np. dożylnie, domięśniowo, podskórnie lub doustnie. Dla celów terapii przeciwnowotworowej stosowanemu środkowi farmaceutycznemu można nadać różnorodne postaci farmaceutyczne, dobrze znane specjalistom, np. wg Remington’s Pharmaceutical Sciences, wyd. 18, Mack Publ. Co.

Dobór dawki leku i schematu dawkowania zależy od rodzaju choroby, wieku, wagi i stanu zdrowia chorego i może być określony przez specjalistę w oparciu o znane schematy leczenia i profilaktyki nowotworów.

Stwierdzono cenne potencjalne właściwości przeciwnowotworowe nowych amidowych koniugatów przedstawionych wzorem (I), wykazane w badaniach in vitro na wybranych liniach komórek nowotworowych, w tym ludzkiego raka trzustki BxPC-3 (linia normalna) i AsPC-1 (linia metastatyczna). Wy kazano efekt quasi-synergii wywołany przez koniugaty względem komórek raka trzustki BxPC-3. Stwierdzono bowiem, że koniugaty charakteryzują się większym potencjałem hamowania wzrostu niż DiMIQ i odpowiednie pochodne HCA podawane zarówno oddzielnie, jak i w ich kombinacji. Ponadto, związki według wynalazku wykazują również wysoką aktywność antyproliferacyjną wobec hormonozależnego raka piersi (MCF-7) i komórek raka szyjki macicy (HeLa). Najwyższą aktywnością cytotoksyczną spośród badanych koniugatów o wzorze (I) charakteryzują się związki:

dichlorowodorek 9-[((4-hydroksy)cynamoilo)amino]-5,1 l-dimetylo-5H-indolo[2.3-b]chinoliny (1) dichlorowodorek 9-[((2-hydroksy)cynamoilo)amino]-5,1 l-dimetylo-5H-indolo[2.3-b]chinoliny (2) dichlorowodorek 9-[((3-hydroksy)cynamoilo)amino]-5,1 l-dimetylo-5H-indolo[2.3-b]chinoliny (3)

Związki 1, 2, wykazywały szczególnie wysoką aktywność cytotoksyczną wobec komórek BxPC-3 (IC50 805,0 nM, 347,53 nM) oraz AsPC-1 (IC50 2641,5 nM, 377,85 nM). Wykazano, że kombinacje DiMIQ (6) z pochodnymi HCA: (4-hydroksy)cynamonianem metylu (Kwi), (2-hydroksy)cynamonianem metylu (Kw2) nie wykazują synergii działania. Koniugaty tych związków niespodziewanie wykazują efekt quasi-synergii in vitro, czyli są skuteczniejsze niż każdy ze związków stosowany osobno (wyższa cytotoksyczność względem komórek nowotworowych). Dla DiMIQ (6) z Kwi oraz z Kw2, koniugatu 1 i koniugatu 2 w stężeniach 500 nM (0,5 μM) żywotność komórek BxPC-3 spadała odpowiednio z 71,78% do 52,35% i 39,03%.

Wynalazek ilustrują przykłady wykonania nieograniczające jego zakresu.

PRZYKŁADY

Metody analityczne

Chromatografię cienkowarstwową (TLC) wykonywano na płytkach z foli aluminiowej pokrytej żelem krzemionkowym 60 F254 firmy MERCK. W rozdziałach metodą chromatografii kolumnowej wykorzystywano żel krzemionkowy 60 (230-400) mesh firmy MERCK, stosując jako eluent układ heksan : octan etylu, dichlorometan : metanol, chloroform : metanol

Stosowane skróty:

AcOEt - octan etylu

HCA - kwas/y hydroksycynamonowe

K2CO3 - węglan potasu

NaOH - wodorotlenek sodu

KOH - wodorotlenek potasu

Nal - jodek sodu

I2 - jod

DMF - N,N-dimetyloformamid,

DMA - N,N-dimetyloacetamid

DMSO - dimetylosulfotlenek

BDMP - heksachloroantymonian - 5-(1H-benzotriazol-1-iloksy)-3,4-dihydro-1-metylo-2H-piroliowy

BOMI - heksachloroantymonian benzotriazol-1-iloksy-N,N-dimetylometanoiminiowy

BOP - heksafluorofosforan benzotriazolilo-N-oksytridimetyloaminofosfoniowy

CDI - karbonylodiimidazol

COMU - heksafluorofosforan (1-cyjano-2-etoksy-2-oksoetylidenoaminoksy)dimetylaminomorfolino-karbeniowy

DAST - trifluorek (dietyloamino)siarki

DCC - dicykloheksylokarbodiimid

DCMT - 2,4-dichloro-6-metoksy-1,3,5-triazyna

DIC - diizopropylokarbodiimid

DIPEA - N,N-diizopropyloetyloamina

EDC - 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimid

HATU - heksafluorofosforan O-(7-azabenzotriazol-1-ilo)-1,1,3,3-tetrametylouroniowy

HBTU - heksafluorofosforan O-(benzotriazol-1-ilo)-1,1,3,3-tetrametylouroniowy

HCl - chlorowodór

HCTU - heksafluorofosforan (2-(6-chlorobenzol-1-ilo))-1,1,3,3-tetrametylouroniowy

HOAt - 1-hydroksy-7-azabenzotriazol

HOBt - 1-hydroksy-1H-benzotriazol

PyBOP - heksafluorofosforan benzotriazolilo-N-oksytripirolidynofosfoniowy

SiO2 - dwutlenek krzemu, żel krzemionkowy, silikażel

TATU - tetrafluoroboran O-(7-azabenzotriazol-1-ilo)-1,1,3,3-tetrametylouroniowy

TBTU - tetrafluoroboran O-(benzotriazol-1-ilo)-1,1,3,3-tetrametylouroniowy

Przykład 1

Otrzymywanie 9-[((2-allioksy) cynamoilo)amino]-5,11 -dimetylo-5H-indolo[2.3-b]chinoliny

Do roztworu kwasu (2-alliloksy)cynamonowego (188 mg, 0,915 mmola, 1,2 eq.) w DMF (4 mL) dodano TBTU (1,2 eq.) oraz DIPEA (3 eq.). Mieszano w temp. pokojowej przez 15 minut. Następ nie dodano roztwór 5,11-dimetylo-5H-indolo[2,3-b]chinolin-9-ylo-aminy (200 mg, 0.766 mmola, 1 eq.) w 2 mL DMF i kontynuowano mieszanie przez 24 godz. Surowy produkt wytrącono wodą, odsączono, przemyto wodą i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Następnie oczyszczono go metodą szybkiej chromatografii na żelu krzemionkowym używając układ eluujący chlorek metylenu/metanol (15:1 do 1:1). Otrzymano 9-[((2-alliloksy)cynamoilo)amino]-5,11-dimetylo-5H-indolo[2.3-b]chinolinę w postaci pomarańczowego ciała stałego. Wydajność 234 mg (68%); t.t. 196-198°C; 1H NMR (500 MHz, DMSO) δ 10,30 (s, 1H, NH), 8,77 (d, 1H, J = 1,7 Hz), 8,30 (d, 1H, J = 7,4 Hz), 7,95 (d, 1H, J = 8,6 Hz), 7,93 (d, 1H, J = 15,8 Hz), 7,85 (t, 1H, J = 7,1 Hz), 7,70 (dd, 1H, J = 8,5 Hz, J = 1,9 Hz), 7,61 (dd, 1H, J = 7,6 Hz, J = 1,3 Hz), 7,54-7,50 (m, 2H), 7,35 (m, 1H), 7,10 (d, 1H, J = 8,3 Hz), 7,02 (t, 1H, J = 7,5 Hz), 6,90 (d, 1H, J = 15,8 Hz), 6,15-6,12 (m, 1H), 5,47 (m, 1H), 5,33 (m, 1H), 4,70-4,69 (m, 2H), 4,24 (s, 3H), 3,09 (s, 3H); HRMS (ES+) m/z: [M+H]+: obliczono dla C29H26N3O2: 448,2025, zmierzono: 448,2025.

Przykład 2

Otrzymywanie 9-[((2,4-diallioksy)cynamoilo)amino]-5,11 -dimetylo-5H-indolo[2.3-b]chinoliny

Do roztworu kwasu (2,4-dialliloksy)cynamonowego (240 mg, 0,92 mmola, 1,2 eq.) w DMF (4 mL) dodano TBTU (1,2 eq.) oraz DIPEA (3 eq.). Mieszano w temp. pokojowej przez 15 minut. Następnie dodano roztwór 5,11-dimetylo-5H-indolo[2.3-b]chinolin-9-ylo-aminy (200 mg, 0,766 mmola, 1 eq.) w 2 mL DMF i kontynuowano mieszanie przez 24 godz. Surowy produkt wytrącono wodą, odsączono, przemyto wodą i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Następnie oczyszczono go metodą szybkiej chromatografii na żelu krzemionkowym używając układ eluujący chlorek metylenu/metanol (20:1 do 2:1). Otrzymano 9-[((2,4-dialliloksy)cynamoilo)amino]-5,11-dimetylo-5H-indolo[2.3-b]chinolinę w postaci pomarańczowego ciała stałego. Wydajność 277 mg (72%); t.t. 220-222°C; ¹H NMR (500 MHz, DMSO) δ 10,17 (s, 1H, NH), 8,77 (brs, 1H), 8,34 (d, 1H, J = 8,0 Hz), 7,97 (d, 1H, J = 8,6 Hz), 7,87 (t, 1H, J = 7,6 Hz)), 7,81 (d, 1H, J = 15,7 Hz), 7,70 (d, 1H, J = 8,2 Hz), 7,60-7,52 (m, 3H), 6,77 (d, 1H, J = 15,7 Hz), 6,66-6,62 (m, 2H), 6,14-6,05 (m, 2H), 5,47-5,40 (m, 2H), 5,34-5,27 (m, 2H), 4,70-4,69 (m, 2H), 4,62-4,61 (m, 2H), 4,25 (s, 3H), 3,11 (s, 3H); HRMS (ES+) m/z: [M+H]+: obliczono dla C32H30N3O3: 504,2287, zmierzono: 504,2286.

Przykład 3

Otrzymywanie 9-[((3,4-diallioksy)cynamoilo)amino]-5,11 -dimetylo-5H-indolo[2.3-b]chinoliny

Do roztworu kwasu (3,4-dialliloksy)cynamonowego (240 mg, 0,92 mmola, 1,2 eq.) w DMF (4 mL) dodano TBTU (1,2 eq.) oraz DIPEA (3 eq.). Mieszano w temp. pokojowej przez 15 minut. Następnie dodano roztwór 5,11-dimetylo-5H-indolo[2.3-b]chinolin-9-ylo-aminy (200 mg, 0,766 mmola, 1 eq.) w 2 mL DMF i kontynuowano mieszanie przez 24 godz. Surowy produkt wytrącono wodą, odsączono, przemyto wodą i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem. Następnie oczyszczono go metodą szybkiej chromatografii na żelu krzemionkowym używając układ eluujący chlorek metylenu/metanol (20:1 do 2:1). Otrzymano 9-[((3,4-dialliloksy)cynamoilo)amino]-5,11-dimetylo-5H-indolo[2.3-b]chinolinę w postaci pomarańczowego ciała stałego. Wydajność 217 mg (75%); t.t. 213-215°C; ¹H NMR (500 MHz, DMSO) δ 10,16 (s, 1H, NH), 8,76 (d, 1H, J = 1,4 Hz), 8,33 (d, 1H, J = 7,7 Hz), 7,96 (d, 1H, J = 8,6 Hz), 7,86 (m, 1H ), 7,71 (dd, 1H, J = 8,5 Hz, J = 1,7 Hz), 7,54-7,51 (m, 3H), 7,24 (d, 1H, J = 1,4 Hz), 7,16 (dd, 1H, J = 8,3 Hz), J = 1,5 Hz), 7,04 (d, 1H, J = 8,5 Hz), 6,74 (d, 1H, J = 15,6 Hz), 6,09-6,06 (m, 2H), 5,47-5,43 (m, 2H), 5,30-5,26 (m, 2H), 4,65-4,64 (m, 2H), 4,62-4,61 (m, 2H), 4,26 (s, 3H), 3,12 (s, 3H); HRMS (ES+) m/z: [M+H]+: obliczono dla C32H30N3O3: 504,2287, zmierzono: 504,2283.

Przykład 4

Otrzymywanie 9-[((4-acetyloksy)cynamoilo)amino]-5,11-dimetylo-5H-indolo[2.3-b]chinoliny

5,11-dimetylo-5H-indolo[2,3-b]chinolin-9-ylo-aminę (50 mg, 0,19 mmola, 1 eq.) rozpuszczono w chlorku metylenu (4 mL) oraz suchej pirydynie (1 eq.) i ochłodzono do -20°C. Do mieszanego, na łaźni lód-chlorek sodu, roztworu dodawano porcjami roztwór chlorku (4-acetyloksyjcynamoilu (43 mg, 0,19 mmola, 1 eq.) w chlorku metylenu (2 mL) w czasie 15 minut, utrzymując temperaturę reakcji poniżej -5°C. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temp. pokojowej przez 24 godziny. Do mieszaniny dodano SiO2, a następnie całość odparowano do sucha. Surowy produkt naniesiony na silikażel oczyszczono metodą szybkiej chromatografii na SiO2 za pomocą układu chloroform/metanol (10:1 do 5:1). Otrzymano

9-[((4-acetyloksy)cynamoilo)amino]-5,11-dimetylo-5H-indolo[2.3-b]chinolinę w postaci ciemno-żółtego ciała stałego. Wydajność 30 mg (35%); t.t. 238-240°C (rozkład); ¹H NMR (500 MHz, DMSO) δ 10,30 (s, 1H, NH), 8,79 (s, 1H), 8,37 (d, 1H, J = 7,9 Hz), 8,02 (d, 1H, J = 8,4 Hz), 7,91 (t, 1H, J = 7,6 Hz), 7,74 (d, 1H, J = 8,3 Hz), 7,68 (d, 2H, J = 8,4 Hz), 7,61 (d, 1H, J = 15,7 Hz), 7,59-7,52 (m, 2H), 7,22 (d, 2H, J = 8,4 Hz), 6,85 (d, 1H, J = 15,7 Hz), 4,29 (s, 3H), 3,15 (s, 3H), 2,29 (s, 3H); HRMS (ES+) m/z: [M+H]+: obliczono dla C28H24N3O3: 450,1818, zmierzono: 450,1810.

Przykład 5

Otrzymywanie 9-[((3-acetyloksy)cynamoilo)amino]-5,11 -dimetylo-5H-indolo[2.3-b]chinoliny

5,1 l-dimetylo-5H-indolo[2,3-b]chinolin-9-ylo-aminę (150 mg, 0,57 mmola, 1 eq.) rozpuszczono w chlorku metylenu (8 mL) oraz suchej pirydynie (1 eq.) i ochłodzono do -20°C. Do mieszanego, na łaźni lód-chlorek sodu, roztworu dodawano porcjami roztwór chlorku (3-acetyloksy)cynamoilu (129 mg, 0,57 mmola, 1 eq.) w chlorku metylenu (2 mL) w czasie 15 minut, utrzymując temperaturę reakcji poniżej -5°C. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temp. pokojowej przez 24 godziny. Do mieszaniny dodano SiO2, a następnie całość odparowano do sucha. Surowy produkt naniesiony na silikażel oczyszczono metodą szybkiej chromatografii na SiO2 za pomocą układu chloroform/metanol (10:1 do 5:1). Otrzymano 9-[((3-acetyloksy)cynamoilo)amino]-5,11-dimetylo-5H-indolo[2.3-b]chinolinę w postaci ciemno-żółtego ciała stałego. Wydajność 94 mg (36%); t.t. 235-237°C (rozkład); ¹H NMR (500 MHz, DMSO) δ 10,56 (s, 1H, NH), 8,95 (brs, 1H), 8,60 (brs, 1H), 8,30 (brs, 1H), 8,09 (brs, 1H), 7,89 (m, 1H), 7,79 (brs, 1H), 7,70 (d, 1H, J = 8,3 Hz), 7,63 (d, 1H, J = 15,6 Hz), 7,55-7,49 (m, 2H), 7,41 (s, 1H), 7,20 (d, 1H, J = 7,3 Hz), 6,91 (d, 1H, J = 15,6 Hz), 4,41 (s, 3H), 3,13 (s, 3H), 2,31 (s, 3H); HRMS (ES+) m/z: [M+H]+: obliczono dla C28H24N3O3: 450,1818, zmierzono: 450,1816.

Przykład 6

Otrzymywanie 9-[((2,4-diacetyloksy)cynamoilo)amino]-5,11 -dimetylo-5H-indolo[2.3-b]chinoliny

5,11-dimetylo-5H-indolo[2,3-b]chinolin-9-ylo-aminę (150 mg, 0,57 mmola, 1 eq.) rozpuszczono w chlorku metylenu (8 mL) oraz suchej pirydynie (1 eq.) i ochłodzono do -20°C. Do mieszanego, na łaźni lód-chlorek sodu, roztworu dodawano porcjami roztwór chlorku (2,4-diacetyloksy)cynamoilu (162 mg, 0,57 mmola, 1 eq.) w chlorku metylenu (2 mL) w czasie 15 minut, utrzymując temperaturę reakcji poniżej -5°C. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temp. pokojowej przez 24 godziny. Do mieszaniny dodano SiO2, a następnie całość odparowano do sucha. Surowy produkt naniesiony na silikażel oczyszczono metodą szybkiej chromatografii na SiO2 za pomocą układu chloroform/metanol (10:1 do 5:1). Otrzymano 9-[((2,4-diacetyloksy)cynamoilo)amino]-5,11-dimetylo-5H-indolo[2.3-b]chinolinę w postaci ciemno-żółtego ciała stałego. Wydajność 172 mg (58%); t.t. 245-247°C (rozkład); ¹H NmR (500 MHz, DMSO) δ 10,53 (s, 1H, NH), 8,87 (s, 1H), 8,44 (d, 1H, J = 7,6 Hz), 8,11 (d, 1H, J = 7,3 Hz), 7,95 (t, 1H, J = 7,3 Hz)), 7,79-7,77 (m, 2H), 7,64-7,57 (m, 2H), 7,55 (d, 1H, J = 15,7 Hz), 7,19 (d, 1H, J = 8,3 Hz), 7,14 (brs, 1H), 6,95 (d, 1H, J = 15,7 Hz), 4,33 (s, 3H), 3,19 (s, 3H), 2,41 (s, 3H), 2,29 (s, 3H); HRMS (ES+) m/z: [M+H]+: obliczono dla C30H25N3O5: 508,1872, zmierzono: 508,1868.

Przykład 7

Otrzymywanie 9-[((3,4-diacetyloksy)cynamoilo)amino]-5,11 -dimetylo-5H-indolo[2.3-b]chinoliny

5,11-dimetylo-5H-indolo[2,3-b]chinolin-9-ylo-aminę (100 mg, 0,38 mmola, 1 eq.) rozpuszczono w chlorku metylenu (6 mL) oraz suchej pirydynie (1 eq.) i ochłodzono do -20°C. Do mieszanego, na łaźni lód-chlorek sodu, roztworu dodawano porcjami roztwór chlorku (3,4-diacetyloksy)cynamoilu (106 mg, 0,38 mmola, 1 eq.) w chlorku metylenu (2 mL) w czasie 15 minut, utrzymując temperaturę reakcji poniżej -5°C. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temp. pokojowej przez 24 godziny. Do mieszaniny dodano SiO2, a następnie całość odparowano do sucha. Surowy produkt naniesiony na silikażel oczyszczono metodą szybkiej chromatografii na SiO2 za pomocą układu chloroform/metanol (10:1 do 5:1). Otrzymano 9-[((3,4-diacetyloksy)cynamoilo)amino]-5,11-dimetylo-5H-indolo[2.3-b]chinolinę w postaci ciemno-żółtego ciała stałego. Wydajność 88 mg (45%); t.t. 273-275°C (rozkład); ¹H NMR (500 MHz, DMSO) δ 10,63 (s, 1H, NH), 8,83 (s, 1H), 8,56 (d, 1H, J = 8,3 Hz), 8,29 (d, 1H, J = 8,7 Hz), 8,04 (t, 1H, J = 7,7 Hz), 7,78-7,75 (m, 2H), 7,58-7,51 (m, 4H), 7,36 (d, 1H, J = 8,2 Hz), 6,80 (d, 1H, J = 15,7 Hz), 4,44 (s, 3H), 3,24 (s, 3H), 2,33 (s, 3H), 2,31 (s, 3H); HRMS (ES+) m/z: [M+H]+: obliczono dla C30H25N3O5: 508,1872, zmierzono: 508,1872.

Przykład 8

Otrzymywanie dichlorowodorku 9-[((2-hydroksy)cynamoilo)amino]-5,11 -dimetylo-5H-indolo[2.3-b]chinoliny

9-[((2-allioksy)cynamoilo)amino]-5,11-dimetylo-5H-indolo[2.3-b]chinoliny (144 mg, 0,32 mmola), trietylosilan (51 μl, 0,32 mmola) i tetrakis(trifenylofosfino)pallad(0) (185 mg, 0,16 mmola) rozpuszczono w DMF (6 ml) w ciemnej kolbie chronionej przed światłem. Mieszano w temp. pokojowej przez 5 godzin. Po zakończeniu reakcji rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem na wyparce obrotowej. Otrzymany olej naniesiono na żel krzemionkowy i oczyszczono chromatograficznie na kolumnie z SiO2, stosując jako eluent układ chloroform-metanol (20:1 do 2:1). Otrzymano 9-[((2-hydroksy)cynamoilo)amino]-5,11-dimetylo-5H-indolo[2.3-b]chinolinę w postaci czerwonej substancji stałej. Wydajność 64 mg (50%); t.t. 265-267°C (rozkład); ¹H NMR (500 MHz, DMSO) δ 10,22-10,21 (m, 2H, OH, NH),

8,79 (d, 1H, J = 1,4 Hz), 8,32 (d, 1H, J = 8,2 Hz), 7,96 (d, 1H, J = 8,5 Hz), 7,84 (m, 1H), 7,80 (d, 1H,

J = 15,8 Hz), 7,74 (dd, 1H, J = 8,5 Hz, J = 1,8 Hz), 7,53 (d, 1H, J = 8,5 Hz), 7,51 (m, 1H), 7,49 (m, 1H),

7,21 (m, 1H), 6,96 (d, 1H, J = 15,7 Hz), 6,94 (d, 1H, J = 7,7 Hz), 6,86 (t, 1H, J = 7,4 Hz), 4,26 (s, 3H),

3,12 (s, 3H); obliczono dla C26H22N3O2: 408,1712, zmierzono: 408,1711. Otrzymany związek przekształcono w dichlorowodorek stosując roztwór 2M gazowego HCl w AcOEt.

Przykład 9

Otrzymywanie dichlorowodorku 9-[((2,4-dihydroksy)cynamoilo)amino]-5,11 -dimetylo-5H-indolo [2.3-b] chinoliny

9-[((2,4-diallioksy)cynamoilo)amino]-5,11-dimetylo-5H-indolo[2.3-b]chinolinę (105 mg, 0,21 mmola), trietylosilan (34 μl, 0,21 mmola) i tetrakis(trifenylofosfino)pallad(0) (241 mg, 0,21 mmola) rozpuszczono w DMF (5 ml) w ciemnej kolbie chronionej przed światłem. Mieszano w temp. pokojowej przez 1 godzinę. Po zakończeniu reakcji rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem na wyparce obrotowej. Otrzymany olej naniesiono na żel krzemionkowy i oczyszczono chromatograficznie na kolumnie z SiO2, stosując jako eluent układ chloroform-metanol (20:1 do 2:1). Otrzymano 9-[((2,4-dihydroksy)cynamoilo)amino]- 5,11-dimetylo-5H-indolo[2.3-b]chinolinę w postaci czerwonej substancji stałej. Wydajność 30 mg (34%); t.t. 258-260°C (rozkład); ¹H NMR (500 MHz, DMSO) δ 10,10 (m, 2H, OH, NH), 9,81 (brs, 1H, OH), 8,80 (d, 1H, J = 1,3 Hz), 8,34 (d, 1H, J = 7,5 Hz), 7,96 (d, 1H, J = 7,5 Hz), 7,85 (m, 1H),

7,74-7,73 (dd, 1H, J = 8,6 Hz, J = 1,7 Hz), 7,71 (d, 1H, J = 15,7 Hz), 7,54-7,50 (m, 2H), 7,30 (d, 1H,

J = 8,5 Hz), 6,76 (d, 1H, J = 15,7 Hz), 6,42 (d, 1H, J = 2,2 Hz), 6,31 (dd, 1H, J = 8,4 Hz, J = 2,2 Hz),

4,27 (s, 3H), 3,13 (s, 3H); obliczono dla C26H22N3O3: 424,1661, zmierzono: 424,1660. Otrzymany związek przekształcono w dichlorowodorek stosując roztwór 2M gazowego HCl w AcOEt.

Przykład 10

Otrzymywanie dichlorowodorku 9-[((4-hydroksy)cynamoilo)amino]-5,11 -dimetylo-5H-indolo[2.3-b]chinoliny

9-[((4-acetyloksy)cynamoilo)amino]-5,11-dimetylo-5H-indolo[2.3-b]chinolinę (20 mg, 0,044 mmola) rozpuszczono w DMF (1 mL). Do mieszającego się roztworu dodano K2CO3 (7,4 mg, 0,053 mmola). Mieszanie w temperaturze pokojowej kontynuowano przez 2 godziny. Następnie rozpuszczalnik odparowano, a pozostałość oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym za pomocą dichlorometanu-metanolu (20:1 do 1:1) jako eluentów. Otrzymano 9-[((4-hydroksy)cynamoilo)amino]-5,11-dimetylo-5H-indolo[2.3-b]chinolinę w postaci pomarańczowej substancji stałej. Wydajność 14 mg (78%); m.p. 240-242°C (rozkład); ¹H NMR (500 MHz, DMSO) δ 10,64 (s, 1H, NH), 10,08 (s, 1H, OH), 8,84 (s, 1H), 8,54 (d, 1H, J = 8,1 Hz), 8,27 (d, 1H, J = 8,7 Hz), 8,05 (m, 1H), 7,78-7,76 (m, 2H), 7,55 (d, 1H, J = 8,7 Hz), 7,44 (d, 2H, J = 8,3 Hz), 7,47 (d, 1H, J = 15,6 Hz), 6,86 (d, 2H, J = 8,3 Hz), 6,71 (d, 1H, J = 15,6 Hz), 4,47 (s, 3H), 3,22 (s, 3H); HRMS (ES+) m/z: [M+H]+: obliczono dla C26H22N3O2: 408,1712, znaleziono: 408,1715. Otrzymany związek przekształcono w dichlorowodorek stosując roztwór 2M gazowego HCl w AcOEt.

Przykład 11

Otrzymywanie dichlorowodorku 9-[((3-hydroksy)cynamoilo)amino]-5,11 -dimetylo-5H-indolo[2.3-b]chinoliny

9-[((3-acetyloksy)cynamoilo)amino]-5,11-dimetylo-5H-indolo[2.3-b]chinolinę (60 mg, 0,133 mmola) rozpuszczono w DMF (3 mL). Do mieszającego się roztworu dodano K2CO3 (55 mg, 0,40 mmola). Mieszanie w temperaturze pokojowej kontynuowano przez 4 godziny. Następnie rozpuszczalnik odparowano, a pozostałość oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym za pomocą dichlorometanu-metanolu (10:1 do 1:1) jako eluentów. Otrzymano 9-[((3-hydroksy)cynamoilo)amino]-5,11-dimetylo-5H-indolo[2.3-b]chinolinę w postaci pomarańczowej substancji stałej. Wydajność 43 mg (84%); m.p. 263-265°C (rozkład); ¹H NMR (500 MHz, DMSO) δ 10.75 (s, 1H, NH), 9.76 (s, 1H, OH), 8.88 (s, 1H), 8.57 (d, 1H, J = 8.2 Hz), 8.30 (d, 1H, J = 8.7 Hz), 8.06 (m, 1H), 7.82-7.79 (m, 2H), 7.60 (d, 1H, J = 8.6 Hz), 7.48 (d, 1H, J = 15.6 Hz), 7.24 (t, 1H, J = 8.0 Hz), 7.03-7.02 (m, 2H), 6.85-6.82 (m, 2H), 4.47 (s, 3H), 3.25 (s, 3H); HRMS (ES+) m/z: [M+H]+: obliczono dla C26H22N3O2:

408,1712, znaleziono: 408,1713. Otrzymany związek przekształcono w dichlorowodorek stosując roztwór 2M gazowego HCl w AcOEt.

Przykład 12

Otrzymywanie dichlorowodorku 9-[((3,4-dihydroksy)cynamoilo)amino]-5,11 -dimetylo-5H-indolo[2.3-b] chinoliny

9-[((3,4-diacetyloksy)cynamoilo)amino]-5,11-dimetylo-5H-indolo[2.3-b]chinolinę (60 mg, 0,118 mmola) rozpuszczono w DMF (3 mL). Do mieszającego się roztworu dodano K2CO3 (33 mg, 0,24 mmola). Mieszanie w temperaturze pokojowej kontynuowano przez 5 godzin. Następnie rozpuszczalnik odparowano, a pozostałość oczyszczono metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym za pomocą dichlorometanu-metanolu (10:1 do 1:1) jako eluentów. Otrzymano 9-[((3,4-dihydroksy)cynamoilo)amino]-5,11-dimetylo-5H-indolo[2.3-b]chinolinę w postaci pomarańczowej substancji stałej. Wydajność 40 mg (80%); m.p. 203-205°C (rozkład); ¹H NMR (500 MHz, DMSO) δ 10.38 (s, 1H, NH), 9.51 (brs, 1H, OH), 9.30 (brs, 1H, OH), 8.80 (s, 1H), 8.33 (d, 1H, J = 8.1 Hz), 7.97 (d, 1H, J = 8.6 Hz), 7.87 (m, 1H), 7.76 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 7.54-7.51 (m, 2H, H-7), 7.42 (d, 1H, J = 15.5 Hz ), 7.06 (s, 1H), 6.90 (d, 1H, J = 7.5 Hz), 6.81 (d, 1H, J = 8.0 Hz), 6.70 (d, 1H, J = 15.5 Hz), 4.27 (s, 3H ), 3.12 (s, 3H); HRMS (ES+) m/z: [M+H]+: obliczono dla C26H22N3O3: 424,1661, znaleziono: 424.1659. Otrzymany związek przekształcono w dichlorowodorek stosując roztwór 2M gazowego HCl w AcOEt.

Badania biologiczne

Aktywność cytotoksyczna in vitro

Wybrane amidowe koniugaty pochodnych kwasów hydroksycynamonowych (HCA) i 9-amino5,11-dimetylo-5H-indolo[2,3-b]chinoliny, inaczej pochodne N-(hydroksy)cynamoilo-9-amino-5,11-dimetylo-5H-indolo[2,3-b]chinoliny, według wynalazku badano pod kątem aktywności biologicznej względem wybranych linii komórek nowotworowych. W badaniach zastosowano komórki ludzkiego raka trzustki BxPC-3 (linia normalna) i AsPC-1 (linia metastatyczna) oraz komórki raka piersi (MCF-7) i komórek raka szyjki macicy (HeLa), a także kontrolne zdrowe fibroblasty ludzkie (NHDF).

Hodowla komórek

Hodowlę komórkową in vitro przeprowadzono w warunkach aseptycznych. Komórki namnażano w inkubatorze Innova CO-180 (New Brunswick Scientific, Edison, NJ, USA) zasilanym 5% CO2 w temperaturze 37°C. Wzrost komórek monitorowano za pomocą mikroskopu Nikon Eclipse. Linie komórkowe raka trzustki: BxPC-3 (z guza pierwotnego) i AsPC-1 (z wodobrzusza) hodowano w podłożu RPMI-1640 wzbogaconym 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 2 mM glutaminą i mieszaniną antybiotyk-lek przeciwgrzybiczy. Komórki HeLa i MCF7 hodowano w pożywce DMEM, NHDF hodowano w alfa-MEM. Obie pożywki do hodowli komórkowych uzupełniono 10% FBS, 2 mM glutaminą i mieszaniną antybiotyk-lek przeciwgrzybiczy.

Pomiar cytotoksyczności koniusatów

Pomiar cytotoksyczności związków według wynalazku względem komórek nowotworowych i kontrolnych wykonano za pomocą testu MTT. Wszystkie użyte komórki należały do adherentnych linii komórkowych i rosły jako monowarstwy w 96-dołkowych płytkach (5000 komórek na dołek). Komórki wysiano w odpowiedniej pożywce hodowlanej i inkubowano przez 24 godziny. Następnie zastąpiono ją świeżą pożywką uzupełnioną badanymi związkami o stężeniu w zakresie 125-4000 nM. Jako kontrolę rozpuszczalnika pożywkę rozcieńczano równoważną objętością DMSO. Związki przed rozcieńczeniem w pożywce rozpuszczono w DMSO, stosując sonikację w 55°C. Inkubację prowadzono przez dalsze 72 godziny. Następnie pożywkę zawierającą badane substancje usuwano i dodawano roztwór MTT (50 μl na dołek 10-krotnego rozcieńczonego w pożywce roztworu podstawowego o stężeniu 0,5 mg/ml). Po 3 godzinach inkubacji roztwór MTT zastąpiono DMSO (50 pl/studzienkę) w celu rozpuszczenia purpurowych kryształów formazanu. Absorbancję mierzono przy 560 nm przy referencyjnej długości fali 670 nm na czytniku mikropłytek Asys UVM 340 (Cambridge, Wielka Brytania). Wyniki wyrażono jako procent żywych komórek w porównaniu z kontrolą (żywotność komórek nietraktowanych związkami badanymi przejęto jako 100%) stosując wzór:

Żywotność komórek (%) = (AT/AC) x 100 gdzie,

AT = Absorbancja traktowanych komórek,

AC = Absorbancja komórek nietraktowanych badanymi związkami.

Na podstawie uzyskanych wyników zależności stężeń badanych związków i stopnia przeżywalności komórek, przy użyciu programu GraphPad Prism wyznaczono wartości IC 50 (ang. inhibitory concentration 50 - stężenie powodujące 50-procentową redukcję przeżywalności komórek).

PL 248245 Β1

Zaobserwowano, że dwa z zaprojektowanych i otrzymanych związków (1 i 2) wykazują wyższą lub podobną aktywność cytotoksyczną ICso wobec obu testowanych linii komórkowych raka trzustki (BxPC-3 i AsPC-1) jak 11-dimetylo-5H-indolo[2,3-b]chinolina (DiMIQ 6). Potwierdzono, że komórki reagowały w sposób zależny od dawki na stosowane stężenia (250-4000 nM). Najciekawsze wyniki hamowania wzrostu komórek zaobserwowano dla stężeń 2000 nM i 4000 nM w porównaniu z referencyjnym DiMIQ (6) (Fig. 1).

Wartości ICso przedstawiono w Tabeli 1.

Tabela 1

Aktywność cytotoksyczną in vitro nowych koniugatów w teście MTT - ICso

Związek	ICso(nM)	ICsu(nM) NHDF	SI
AsPC-1	BxPC-3	AsPC-1	BxPC-3
1	2641,54286.66	805,0463,63	2301,334157,85	0,87	2,86
2	336,5±85,01 lub 377,854107,97	347,53452,39	1714,33±53,01	4,54 lub 5,09	4,93
DiMIQ (6)	1622,5 ±131,98	888,77449,52	2332,334354,03	1,44	2,62

Stwierdzono, że w przypadku koniugatu 2 jego cytotoksyczność wobec zdrowych komórek kontrolnych była niższa w porównaniu z komórkami nowotworowymi (Fig. 2), co znajduje odzwierciedlenie w obliczonych wskaźnikach selektywności (Tabela 1). Im wyższa wartość SI, tym związek działa bardziej selektywnie i teoretycznie jest bezpieczniejszy jako potencjalny lek przeciwnowotworowy.

Zależne od dawki hamowanie wzrostu komórek nowotworowych zaobserwowano również w przypadku hormonozależnej linii raka piersi MCF-7 i linii raka szyjki macicy HeLa (Fig. 3). Podobnie jak w przypadku komórek raka trzustki, najlepszy efekt cytotoksyczny obserwuje się dla związków 1 i 2. Ponadto związek 3, mniej aktywny przeciwko liniom komórkowym BxPC- i AsPC-1 niż DiMIQ (6), wykazuje punktowo lepszą od DIMIQ aktywność wobec komórek HeLa w stężeniu 2000 nM i porównywalną w wyższym stężeniu 4000 nM. W stężeniu 2000 nM koniugaty 1, 2, 3 powodowały lepszy efekt spadku żywotności komórek rakowych HeLa od efektu wywoływanego przez DiMIQ (6). W przypadku MCF-7 tylko koniugaty 2 i 3 wykazywały istotną aktywność w hamowaniu wzrostu komórek nowotworowych.

Pomiar synergistycznego działania DIMIQ (6) z (4-hydroksy)cynamonian metylu (Kw1) oraz DiMIQ (6) (2-hvdroksy)cynamonian metylu (Kw2) oraz guasi-synergizmu ich koniugatów

Linię komórkową raka gruczołakoraka trzustki BxPC-3 oraz stężenie związków 500 nM wybrano jako przykład reprezentatywny. W badaniu zmierzono hamowanie wzrostu komórek indukowane przez koniugaty 1 i 2, DiMIQ (6), (4-hydroksy)cynamonian metylu (Kw1), (2-hydroksy)cynamonian metylu (Kw2) oraz obie kombinacje DiMIQ z Kw1 i Kw2. Pochodne Kw1 i Kw2 wybrano jako proste pochodne HCA wchodzące skład koniugatów 1 oraz 2, i badane wcześniej przeciwko liniom raka trzustki (Zaremba-Czogalla M. et al. Materials (Basel) 2020, 13(24), 5813). Jak wykazano same związki Kw1 oraz Kw2 w stężeniu 500 nM nie wpływały istotnie na żywotność komórek nowotworowych (Fig. 4).

Podawanie pochodnych Kw1 lub Kw2 razem z wysoce cytotoksycznym DiMIQ (6) wywoływało obniżenie żywotności komórek nowotworowych BxPC-3 bez żadnego efektu dodatkowego, czyli na tym samym poziomie jak dla związku 6. Efekt quasi-synergii wywoływało podanie koniugatów 1 i 2 tj. związków o znacznej aktywność przeciwko komórkom nowotworowym BxPC-3, AsPC-1, MCF-7 i HeLa. Ich podanie w stężeniu 500 nM skutkowało obniżeniem żywotności komórek rakowych do 52,35% i 39,03%. Natomiast dla samego DiMIQ (6) lub podawanego razem ze związkami Kw1 lub Kw2 wynosiło 71,78%.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Amidowe koniugaty kwasów hydroksycynamonowych oraz 9-amino-5,11-dimetylo-5H-indolo[2,3-b]chinoliny przedstawione wzorem (I), w którym grupa acylowa pochodzi od kwasu hydroksycynamonowego, oraz ich farmaceutycznie dopuszczalne sole addycyjne z kwasami.
2. Koniugaty według zastrz. 1, znamienne tym, że grupa acylowa pochodzi od kwasów: ortokumarowego, meta-kumarowego, para-kumarowego, 2,4-dihydroksycynamonowego, kawowego, 3,4,5-trihydroksycynamonowego.
3. Koniugaty według zastrz. 1, znamienne tym, że stanowi je 9-[((4-hydroksy)cynamoilo)amino]-5,11-dimetylo-5H-indolo[2.3-b]chinolina i jej farmaceutycznie akceptowalne sole.
4. Koniugaty według zastrz. 1, znamienne tym, że stanowi je 9-[((2-hydroksy)cynamoilo)amino]-5,11-dimetylo-5H-indolo[2.3-b]chinolina i jej farmaceutycznie akceptowalne sole.
5. Koniugaty według zastrz. 1, znamienne tym, że stanowi je 9-[((3-hydroksy)cynamoilo)amino]-

-5,11-di metylo-5H-indolo[2.3-b]chinolina i jej farmaceutycznie akceptowalne sole.
6. Koniugaty według zastrz. 1, znamienne tym, że stanowi je 9-[(2,4-dihydroksy)cynamo- ilo)amino]-5,11-dimetylo-5H-indolo[2.3-b]chinolina i jej farmaceutycznie akceptowalne sole.
7. Koniugaty według zastrz. 1, znamienne tym, że stanowi je 9-[(3,4-dihydroksy)cynamo- ilo)amino]-5,11-dimetylo-5H-indolo[2.3-b]chinolina i jej farmaceutycznie akceptowalne sole.
8. Koniugaty według zastrz. 1, znamienne tym, że stanowi je dichlorowodorek 9-[((2-hydroksy)cynamoilo)amino]-5,11-dimetylo-5H-indolo[2.3-b]chinoliny.
9. Koniugaty według zastrz. 1, znamienne tym, że stanowi je dichlorowodorek 9-[((3-hydro- ksy)cynamoilo)amino]-5,11-dimetylo-5H-indolo[2.3-b]chinoliny.
10. Koniugaty według zastrz. 1, znamienne tym, że stanowi je dichlorowodorek 9-[((4-hydro- ksy)cynamoilo)amino]-5,11-dimetylo-5H-indolo[2.3-b]chinoliny.
11. Sposób otrzymywania amidowych koniugatów kwasów hydroksycynamonowych oraz 9-amino-5,11-dimetylo-5H-indolo[2,3-b]chinoliny przedstawionych wzorem (I), znamienny tym, że (i) kwas hydroksycynamonowy zabezpiecza się na grupie hydroksylowej/grupach hydroksylowych w pierścieniu fenylowym fragmentu hydroksycynamoilowego, (ii) tak O-zabezpieczoną pochodną kwasu hydroksycynamonowego otrzymaną w etapie (i) ewentualnie przeprowadza się w halogenek kwasowy, korzystnie chlorek, (iii) następnie 9-amino-5,11-dimetylo-5H-indolo[2,3-b]chinolinę przedstawioną wzorem (II) lub jej sól, korzystnie chlorowodorek, poddaje się reakcji sprzęgania z otrzymaną w etapie (i) O-zabezpieczoną pochodną kwasu hydroksycynamonowego lub z otrzymanym w etapie (ii) jej halogenkiem kwasowym, (iv) po czym otrzymany w etapie (iii) O-zabezpieczony amid stanowiący koniugat kwasu hydroksycynamonowego i 9-amino-5,11-dimetylo-5H-indolo[2,3-b]chinoliny, poddaje się oczyszczaniu i odbezpiecza się grupy funkcyjne z fragmentu hydroksycynamoilowego, (v) i ewentualnie tak otrzymany w etapie (iv) koniugat z wolną/wolnymi grupami hydroksylowymi przedstawiony wzorem (I) przeprowadza się w farmaceutycznie dopuszczalną sól addycyjną z kwasem.
12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że reakcję sprzęgania w etapie (iii) prowadzi się w obecności czynnika sprzęgającego wybranego z grupy: dicykloheksylokarbodiimid, 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodiimid, tetrafluoroboran O-(benzotriazol-1-ilo)-1,1,3,3-tetrametylouroniowy.
13. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że reakcję sprzęgania w etapie (iii) prowadzi się stosując chlorek kwasu hydroksycynamonowego w obecności pirydyny.
14. Koniugaty kwasów hydroksycynamonowych oraz 9-amino-5,11-dimetylo-5H-indolo[2,3-b]chinoliny przedstawione wzorem (I) lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole addycyjne z kwasami do zastosowania w leczeniu choroby nowotworowej u człowieka, zwłaszcza nowotworu trzustki, nowotworów piersi, nowotworów szyjki macicy, chłoniaków, mięsaków i gruczolaków.
15. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję czynną oraz farmaceutycznie dopuszczalny i zgodny nośnik i/lub substancje pomocnicze, znamienna tym, że substancję czynną stanowi amidowy koniugat kwasu hydroksycynamonowego oraz 9-amino-5,11-dimetylo-5Hindolo[2,3-b]chinoliny zdefiniowany w zastrz. 1 lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól addycyjna z kwasem.